ES2267559T3

ES2267559T3 - Glicoconjugados, glicoamino, acidos sus intermediarios y el uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2267559T3
Application number: ES00957619T
Authority: ES
Inventors: Samuel J. Danishefsky; Jennifer R. Allen; Govindaswami Ragupathi; Philip O. Livingston; Lawrence Williams
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: EP1210355B1; ATE325803T1; US8623378B2; US20140271817A1; DE60027905D1; JP2012132025A; AU6921300A; WO2001014395A2; US20110206757A1; JP2003507485A; US7879335B1; HK1048819A1; JP5111705B2; WO2001014395A3; US9464116B2; DE60027905T2; HK1048819B; EP1210355A2

Abstract

Un glicopéptido multi-antigénico que comprende un esqueleto peptídico constituido de 3 a 25 residuos aminoacil, en donde uno o más de dichos aminoácidos son sustituidos con una fracción n- alquilo glucosídica que tiene la estructura: en donde cada aparición de A es independientemente un carbohidrato determinante que tiene la estructura: en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, x, y y z son independientemente 0, 1, 2 o 3, con la condición de que x, y y z no sean simultáneamente 0; en donde R0 es hidrógeno, un grupo de cadena líneal o ramificada alquilo, acilo, arilalquilo o aril; en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR1, NH2, NHCORi, F, CH2OH, CH2ORi, un alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, grupo (mono-, di- o tri) hidroxialquilo, (mono-, di- o tri) aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde Ri es hidrógeno, CHO, COORii, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada o una fracción sacárido que tiene la estructura: en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada una independientemente 0, 1 o 2; en donde R10, R11, R12, R13, R14 y R15 son cada uno independientemente hidrógeno, OH, ORiii, NH2, NHCORiii, P, CH2OH, CH2ORiii, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri) aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R16 es hidrógeno, COOH, COORii, CONHRii, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde Riii es hidrógeno, CHO, COORiv, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde Rii y Riv son cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde cada aparición de n es independientemente 0-8, por lo cual, si para cada aparición de n, n = 0, al menosuna aparición de A tiene una estructura diferente a partir de otras apariciones de A; y en donde la fracción glucosídica n-alquilo es ya sea a- o a-ligado a un aminoácido; y al menos una aparición de A es un Globo-H determinante que tiene la estructura; en donde cada aparición de R'' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R" es hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno.

Description

Glicoconjugados, glicoamino, ácidos, sus intermediarios, y el uso de los mismos.

Esta solicitud reivindica prioridad bajo \NAK 119(e) del Código de Estados Unidos para la solicitud provisional 60/150,088, presentada el 20 de agosto de 1999, titulada "Synthesis y Bioconjugation of the n-Pentenyl Glycoside of the Tumor-Associated Antigen Fucosyl GM1", los contenidos totales de los cuales son incluidos por referencia en ésta.

La presente invención fue apoyada por los National Institutes of Health Grant Numbers: AI16943 y CA28824. Por consiguiente, el gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.

El mejoramiento de terapéuticos existentes y el desarrollo de terapéuticos novedosos para tratar y/o prolongar la supervivencia de pacientes de cáncer ha sido el sujeto de la continua investigación en la comunidad científica. Aunque ciertos de estos esfuerzos han sido dirigidos a más "tradicional" quimioterapéuticos (por ejemplo, Paclitaxel y otra molécula pequeña y/o un producto natural con base a terapias) que actúan matando células de cáncer malignas, también esto ha sido un objetivo de mucho tiempo (Lanzavechis, Science, 260, 937-944; Pardoll et al., Curr. Opin. Immunol. 1993, 5, 719-725; Livingston et al., Curr. Opin. Immunol. 1992, 4, 2; Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1993, 90, 3539; M.H. Taoet et al., Nature, 1993, 362, 755; T. Boon, Int. J. Cancer 1993, 54, 177) desarrollar una vacuna anti-cáncer para inducir una respuesta anticáncer. Aunque las vacunas para cáncer han sido percibidas distantes como un modo de tratamiento subsiguiente a la detección de la enfermedad (por ejemplo, proporcionando un repuesta inmunológica mejorada), sería más deseable desarrollar una vacuna sintética selectiva que pudiera ser capaz de proporcionar una protección mejorada contra recurrencia del tumor y metástasis cuando la carga tumoral se ha vuelto mínima a través de cirugía, radiación u otro tratamiento quimioterapéutico.

En general, inmunoterapia en el tumor se basa en la teoría que los tumores poseen antígenos específicos que pueden ser reconocidos cuando se presentan a o se procesan por un sistema inmune capacitado apropiadamente. El objetivo para el desarrollo de una vacuna anticáncer efectiva es romper la tolerancia que el sistema inmune tiene para estos antígenos expresados principalmente o exclusivamente por el tumor, por la presentación de glicoconjugados como versiones de antígenos inmunoestimulatorios, para inducir una respuesta inmune efectiva. En un esfuerzo para lograr este objetivo, antígenos de carbohidrato de cáncer identificado tal como TF, Tn, sTN, KH-1, Le^{y} y Globo-H ha sido caracterizado cuidadosamente como siendo sobre-expresado en la superficie de células malignas en una variedad de cánceres (seno, colon, próstata, ovarios, hígado, pulmón de célula pequeña y adenocarcinomas). Además, ellos han sido inmunocaracterizado por anticuerpos monoclonales y por consiguiente tienen marcadores serológicos relevantes disponibles para estudios inmunológicos. Tales estudios han sugerido que los pacientes inmunizados en una posición adyuvante con vacunas basadas en carbohidrato- produce anticuerpos reactivos con células de cáncer humanas, y que la producción de tales anticuerpos prohíbe la recurrencia del tumor y se correlaciona con un diagnóstico más favorable (Ver, Livingston et al., J. Cancer Res. 1989, 49, 7045; Ragupathi, G. Cancer Immunol. Immunother. 1996, 43, 152). Adicionalmente, el aislamiento y la identificación estructural cuidadosa de antígenos de carbohidrato específicos sobre expresados en células de cáncer ha proporcionado un armazón para un ataque utilizando una inmunoterapia en tumor basada en carbohidratos (Para revisiones ver (a) Hakomori, S.; Zhang. Y. Chem. Biol. 1997, 4, 97; (b) Tayokuni, T.; Singhal, A. K. Chem. Soc. Rev. 1995, 24, 23 y referencias en estas).

Una mayor desventaja en utilizar epítopes de carbohidrato, sin embargo, es que ellos generalmente no están fácilmente disponibles por aislamiento de fuentes naturales. Por ejemplo, las inmensas dificultades asociadas con su purificación a partir de fuentes naturales los hace virtualmente no disponibles como materiales iniciales homogéneos para un programa clínico. De esta manera, la incorporación de estos epítopes que ocurren naturalmente en proteínas excipientes o cualquier contexto molecular favorable vía conjugación para causar una respuesta inmunológica terapéuticamente útil es ineficaz en el mejor de los casos, y a menudo virtualmente imposible. Por consiguiente, para estudiar con eficacia estas vacunas como agentes terapéuticos, el material suficiente únicamente puede ser obtenido por síntesis química total.

En un esfuerzo para solucionar este problema, uno de los esfuerzos de investigación continua es el desarrollo de vacunas anti-cáncer que incorporan fracciones de carbohidratos sintéticas completamente (Para una revisión, ver Danishefsky, S.J.; Allen, J.R. Angew Chem. Int. Ed 2000, 39, 836-863). Una estrategia para el desarrollo de vacunas anti-cáncer sintéticas involucra la síntesis total del epítope de carbohidrato y su subsiguiente bioconjugación covalente con la proteína excipiente. Las construcciones de vacunas luego están sujetas a apropiados estudios de inmunización en ratones, con el objetivo último de avanzada en pruebas clínicas humanas. Esta estrategia ha resultado en muchos tumores sintéticos completamente asociados con vacunas a base de carbohidrato que están en varios estadios de tratamiento avanzado pre-clínico y clínico. De hecho, un vacuna de Globo-H está experimentando evaluación clínica para el tratamiento de carcinomas en próstata y en seno en el nivel de la fase II (ver, por ejemplo, Ragupathi et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125) mientras una vacuna basada en el antígeno Lewis^{y}, ya probada en cáncer de ovarios, esta esperando una evaluación de seguimiento más extensa (ver, Kudryashov et al. Cancer Immunol. Immunother. 1998, 45, 281).

WO 96134005 revela un procedimiento para la síntesis de estructuras de oligosacáridos que incluyen oligosacáridos de ceramidas.

Slovin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96, 5710 revela un Globo-H hexasacárido sintético como una vacuna para pacientes con cáncer de próstata.

Ragupathi et al, Angew. Chem. Int. Ed. (1999), 38, 563 revela un Globo H ceramida y un Globo-H glucósido de alilo.

Allen et al, Chem. Eur. J. (2000), 6, 1366 revela un Globo-H KLH conjugada.

Aunque varias construcciones sintéticas han sido desarrolladas en los años recientes, como se describe arriba, y en otras referencias descritas en ésta, sigue siendo una necesidad para las investigaciones posteriores desarrollar construcciones novedosas capaces de causar una respuesta inmune más sostenida o efectiva (y preferiblemente selectiva). Claramente, en un esfuerzo por lograr este objetivo, sería útil desarrollar métodos sintéticos mejorados y/o novedosos para acceder a componentes antigénicos no disponibles sintéticamente hasta ahora (por ejemplo, componentes antigénicos más complejos tales como fucosil GM1, epítopes agrupados y estructuras similares), o para acceder a estructuras no-naturales derivadas de estructuras que ocurren naturalmente para estudios inmunológicos y terapéuticos adicionales.

Resumen de la invención

En reconocimiento de la necesidad de desarrollar novedosas construcciones y métodos sintéticos mejorados adicionalmente, la presente invención, en un aspecto, proporciona novedosos glucósidos n-alquenil y glicoconjugados, glicoaminoácidos n-alquilo, y métodos para la síntesis de éstos. En otro aspecto, la presente invención proporciona novedosos glicopéptidos agrupados y métodos para la síntesis de éstos. En aún otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de cáncer, preferiblemente para la prevención de la recurrencia de cáncer, y métodos para la inducción de anticuerpos en un sujeto que comprende la administración a un sujeto en necesidad, una cantidad efectiva de cualquiera de los glicoconjugados inventivos según se revela en ésta.

La metodología sintética general revelada en esta involucra la realización de la incorporación de un grupo protector glucósido n-alquenil en el extremo reductor de un aceptor del carbohidrato permite incrementar el acoplamiento de eficiencias y accesibilidad a carbohidratos complejos. De esta manera, la presente invención también proporciona el reconocimiento que por ciertos carbohidratos protegidos, las fracciones n-alquenil pueden servir como precursores útiles que pueden ser utilizados últimamente para la síntesis de glicopéptidos complejos.

De esta manera, en un aspecto, la presente invención proporciona metodologías sintéticas novedosas para la síntesis de carbohidratos complejos que comprende (1) proporcionando un carbohidrato aceptor que tiene un extremo reductor grupo alquenil; (2) proporcionando un compuesto donante apropiado y (3) acoplamiento de dicho donante y aceptor bajo condiciones para generar un alquenilglucósido. Utilizando este método, se proporcionan glucósidos alquenil antigénicos complejos, como se describe arriba, muchos de los cuales nunca antes han sido proporcionados, los cuales luego pueden ser conjugados o reaccionados adicionalmente, según lo descrito en ésta, para generar glicoconjugados y estructuras de glicopéptidos.

En general, la presente invención proporciona compuestos y/o conjugados novedosos que tienen la estructura general:

1

en donde R es hidrógeno; alquilo sustituido o no sustituido; alquenil; aril; -CH_{2}CH(CO_{2}R')(NHR''), en donde R' o R'' son cada uno independientemente hidrógeno, grupo protector, alquilo sustituido o no sustituido, un ligador, aril, péptido, proteína o lípido; o NHR''', en donde R''' es una proteína, péptido, o lípido ligado a N directamente o a través de un ligador en cruz; en donde n es 0-8; en donde

A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

2

en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector nitrógeno; con la condición de que cuando A es \alpha-O-ligado, entonces n es al menos 1.

Adicionalmente, la presente invención proporciona métodos para la síntesis de glicoaminoácidos n-alquilo novedosos, como se describe en más detalle abajo para Globo-H y sus subsiguientes empleos para generar glicopéptidos novedosos y construcciones sintéticas de éstos.

En general, el método inventivo para la producción de estos glicoaminoácidos novedosos comprende: 1) suministro de una fracción alquenil glucosídica, como se describe en esta; 2) dicha fracción alquenil glucosídica que se somete a condiciones oxidativas para generar un aldehído; 3) dicho aldehído que se somete a condiciones de olefinación para generar un éster de enamida; 4) dicho éster de enamida resultante que se somete a condiciones suficientes para hidrogenar dicho éster de enamida para generar un glicoaminoácido protegido y 5) desprotección de dicho glicoaminoácido protegido bajo condiciones apropiadas para generar un glicoaminoácido deseado.

En particular, un método para la síntesis de un glicoaminoácido, la estructura de la que se publica en ésta, se proporciona, que comprende las etapas de:

(a): proporcionar un alquenilglucósido que tiene la estructura:

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3

(b): la reacción de dicho alquenilglucósido bajo las condiciones apropiadas para generar un éster de enamida que tiene la estructura:

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4

(c): la reacción de dicho éster de enamida bajo condiciones apropiadas para generar un glicoaminoácido que tiene la estructura:

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: en donde, para cada una de la estructuras de arriba, n es 0-8, en donde A es un Globo-H determinante, como se describe en ésta, como toda o parte del carbohidrato determinante A.

En general, en modalidades preferidas, la etapa de reacción de un n-alquenilglucósido bajo condiciones apropiadas para generar un éster de enamida comprende la reacción un n-alquenilglucósido primero bajo condiciones oxidativas y segundo bajo condiciones de olefinación en la presencia de una base (por ejemplo, tetrametilguanidina) y fosfonato para generar un éster de enamida.

Adicionalmente, la etapa de reacción dicho éster de enamida bajo condiciones apropiadas para generar un glicoaminoácido comprende la reacción de dicho éster de enamida bajo condiciones de hidrogenación.

En otro aspecto de la presente invención, glicopéptidos multi-antigénicos proporcionados que comprenden un esqueleto peptídico constituido de al menos tres glicoaminoácidos, en donde uno o más de dichos aminoácidos están sustituidos con una fracción glucosídica n-alquilo que tiene la estructura:

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6

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en donde cada aparición de A es independientemente un carbohidrato determinante que tiene la estructura:

7

en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, x, y y z son independientemente 0, 1, 2 o 3, con la condición de que x, y y z no sean simultáneamente 0; en donde R_{0} es hidrógeno, un grupo alquilo, acilo, arilalquilo o aril de cadena líneal o ramificada; en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} son cada uno independientemente hidrógeno, OR, OR^{i}, NH_{2}, NHCOR^{i}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{i}, un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R^{i} es hidrógeno, CHO, COOR^{ii}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada o una fracción sacárido que tiene la estructura:

8

en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada uno independientemente 0,1 o 2; en donde R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14} y R_{15} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{iii}, NH_{2}, NHCOR^{iii}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{iii}, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R_{16} es hidrógeno, COOH, COOR^{ii}, CONHR^{ii}, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde R^{iii} es hidrógeno, CHO, COOR^{iv}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde R^{ii} y R^{iv} con cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada;

en donde cada aparición de n es independientemente 0-8, por lo cual, si por cada aparición de n, n=0, al menos una aparición de A tiene una estructura diferente de las otras apariciones de A; y en donde la fracción glucosídica n-alquilo es \alpha- o \beta- ligado a un residuo de aminoácido del esqueleto y al menos una aparición de A es un Globo H determinante que tiene la estructura:

9

en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector nitrógeno. Se apreciará que estos glicopéptidos agrupados inventivos no sean limitados a n-alquilo donde n es más grande que o igual a 1; más bien glicopéptidos agrupados multi-antigénicos pueden ser ligados vía el acoplamiento tradicional directo (n=0) o vía n-alquilo (tal como pentil) o cualquier combinación de éstos. En otras modalidades, cada aparición de A puede ser la misma, sin embargo, luego son utilizados los acoplamientos n-alquenil (n es mayor que 1). En modalidades preferidas, cada aparición de A es independientemente seleccionada del grupo que consiste de Globo-H, fucosil GM1, KH-1, glicoforina, STn, (2,3) ST, Le^{y}, N3, Tn, 2,6-STn y TF.

En ciertas modalidades, agrupaciones antigénicas triméricas son deseables y de esta manera la presente invención también proporciona construcciones adheridas a un ligador vía una proteína excipiente que tiene la siguiente estructura:

10

en donde el ligador es un ácido carboxílico libre, (carboxamido)alquilo carboxamida, MBS, carboxamida primaria, mono o dialquil carboxamida, mono- o diarilcarboxamida, (carboxi)alquilo carboxamida de cadena líneal o ramificada, (alcoxicarbonil)alquilo-carboxamida de cadena líneal o ramificada, (carboxi)arilalquilcarboxamida de cadena líneal o ramificada, (alcoxicarbonil)alquilcarboxamida de cadena líneal o ramificada, un fragmento oligoester que comprende desde 2 a aproximadamente 20 residuos hidroxiacil, un fragmento peptídico que comprende desde 2 a aproximadamente 20 residuos amino aril, o un alquilo o aril carboxílico éster de cadena líneal o ramificada; en donde el excipiente es una proteína o lípido; en donde m es 1, 2 o 3; en donde R_{A}, R_{B} y R_{C} son cada uno independientemente H o metil; y en donde R_{D}, R_{E} y R_{F} son cada uno independientemente una fracción alquilo glucosídica que tiene la estructura:

11

en donde cada aparición de A es independientemente seleccionada de un dominio carbohidrato que tiene la estructura:

12

en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, x, y y z son independientemente 0, 1, 2 o 3, con la condición de que x, y y z no sean simultáneamente 0; en donde el dominio carbohidrato es ligado al respectivo residuo aminoacil o hidroxiacil por sustitución de un grupo lateral sustituyente seleccionado del grupo que consiste de OH; COOH y NH_{2}; en donde R_{0} es hidrógeno, un grupo alquilo, acilo, arilalquilo o aril de cadena líneal o ramificada; en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{i}, NH_{2}, NHCOR^{i}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{i}, un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R^{i} es hidrógeno, CHO, COOR^{ii}, o un grupo alquilo arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada o una fracción sacárido que tiene la estructura:

13

en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada uno independientemente 0, 1 o 2; en donde R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14} y R_{15} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{iii}, NH_{2}, NHCOR^{iii}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{iii}, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R_{16} es hidrógeno, COOH, COOR^{ii}, CONHR^{ii}, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde R^{iii} es hidrógeno, CHO, COOR^{iv}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde R^{ii} y R^{iv} son cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde cada aparición de n es independientemente 0-8, por lo cual, si para cada aparición de n, n=0, al menos una aparición de A tiene una estructura diferente de otras apariciones de A; y en donde la fracción glucosídica n-alquilo es \alpha- o \beta-ligado a un aminoácido y al menos una aparición de A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

14

en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector nitrógeno.

En modalidades preferidas, cada aparición de A es seleccionada del grupo que consiste de Globo-H, fucosil GM1, KH-1, glicoforina, STN, (2,3) ST, Le^{y}, N3, Tn, 2,6 STn y TF con la condición de que al menos una aparición de A es Globo-H. En solamente un ejemplo preferido, la presente invención proporciona un glicopéptido antigénico trimérico novedoso que incorpora Globo-H. Le^{y} y Tn, para generar un compuesto antigénico trimérico novedoso.

Como se detalla en ésta, en otro aspecto de la presente invención, cualquiera de los compuestos inventivos puede ser conjugado para generar un glicoconjugado, y puede ser administrado preparado o con un adyuvante inmunológico para el tratamiento de la recurrencia de cáncer o puede ser administrado solo o con un adyuvante inmunológico para inducir anticuerpos en un sujeto.

Definiciones

Ciertos compuestos de la presente invención, y las definiciones de grupos funcionales específicos también se describen con más detalle abajo. Para propósitos de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook de Chemistry y Physics, 75th Ed., cubierta interior, y grupos funcionales específicos se definen según lo descrito en ésta. Adicionalmente, los principios de orgánica química general, así como las fracciones funcionales específicas y reactividad, son descritos en "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, Los contenidos totales del cual se incorpora en ésta por referencia.

Se apreciará que los compuestos, según lo descrito en ésta, puedan ser sustituidos con cualquier número de sustituyentes o fracciones funcionales. En general, el término "sustituido" ya sea precedido por el término "opcionalmente" o no, y sustituyentes contenidos en fórmulas de esta invención, se refiere a la reposición de radicales de hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente específico. Cuando más que una posición en cualquier estructura dada pueda ser sustituida con más de un sustituyente seleccionado de un grupo específico, el sustituyente puede ser ya sea el mismo o diferente en cada posición. Como se utiliza en ésta, el término "sustituido" se contempla para incluir todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un amplio aspecto, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes de compuestos orgánicos acíclico y cíclico, ramificado y no ramificado, carbocíclico y heterocíclico, aromático y no aromático. Para propósitos de esta invención, los heteroátomos tales como nitrógeno pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos descritos en esta que satisfacen las valencias de los heteroátomos. Además, esta invención no pretende ser limitada de cualquier manera por los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. Las combinaciones de sustituyentes y las variables visualizadas por esta invención son preferiblemente aquellas que resultan de la formación de compuestos estables útiles en el tratamiento de cáncer, o en la inducción de anticuerpos, como se describe en ésta. El término "estable", como se utiliza en ésta, preferiblemente se refiere a los compuestos que poseen estabilidad suficiente para permitir la fabricación y que mantiene la integridad del compuesto por un periodo suficiente de tiempo para ser útil para los propósitos detallados en ésta.

El término "alifático", como se utiliza en ésta, incluye cadena saturada e insaturada, líneal (i.e., no ramificado), hidrocarburos ramificado, cíclico, o alifático policíclico, que son opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales. Como se apreciará por alguien de ordinaria habilidad en el oficio, "alifático" tiene el propósito en esta para incluir, pero no se limita a, fracciones alquilo, alquenil, alquinil, cicloalquil, cicloalquenil, y cicloalquinil. De esta manera, como se utiliza en ésta, el término "alquilo" incluye grupos alquilo líneal, ramificado y cíclico. Una convención análoga aplica a otros términos genéricos tales como "alquenil", "alquinil" y similares. Además, como se utiliza en ésta, los términos "alquilo", "alquenil", "alquinil" y similares abarcan grupos sustituidos y no sustituidos.

El término "alquilamino" se refiere a un grupo que tiene la estructura -NHR' en donde R' es alquilo, como se define es ésta. Los ejemplos de alquilamino incluyen, pero no se limitan a, metilamino, etilamino, iso-propilamino y similares.

Algunos ejemplos de sustituyentes de las fracciones alifáticas arriba-descritas (y otras) de compuestos de la invención incluye, pero no se limita a: F, Cl, Br, I, OH, NO_{2}, CN, C(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, C(O)-aril, C(O)-heteroaril, CO_{2}-alquilo, CO_{2}-aril, CO2-heteroaril, CONH_{2}, CONH-C_{1}-C_{6}-alquilo, CONH-aril, CONH-heteroaril, OC(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, OC(O)-aril,OC(O)-heteroaril, OCO_{2}-alquilo, OCO_{2}-aril, OCO_{2}-heteroaril, OCONH_{2}, OCONH-C_{1}-C_{6}-alquilo, OCONH-aril, OCONHheteroaril, NHC(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, NHC(O)-aril, NHC(O)-heteroaril, NHCO_{2}-alquilo, NHCO_{2}-aril, NHCONH-heteroaril, SO_{2}-C_{1}-C_{6}-alquilo, SO_{2}-aril, C_{3}-C_{6}-cicloalquil, CF_{3}, CH_{2}CF_{3}, CHCl_{2}, CH_{2}OH, CH_{2}CH_{2}OH, CH_{2}NH_{2}, CH_{2}SO_{2}CH_{3}, aril, heteroaril, bencil, benciloxi, ariloxi, heteroariloxi, C_{1}-C_{6}-alcoxi, metoximetoxi, metoxietoxi, amino, bencilamino, arilamino, heteroarilamino, C_{1}-C_{3}-alquilo-amino, tio, aril-tio, heteroariltio, bencil-tio, C_{1}-C_{6}-alquilo-tio, o metiltiometil. Ejemplos adicionales de sustituyentes aplicables usualmente, se ilustran por las modalidades específicas mostradas en los Ejemplos que son descritos en ésta.

En general, los términos "aril" y "heteroaril", como se utilizan en ésta, se refiere a fracciones insaturadas estables mono- o policíclico, heterocíclico, policíclico, y poliheterocíclico que tienen preferiblemente átomos de carbono 3-14, cada uno de los cuales puede ser sustituido o no sustituido. Los sustituyentes incluyen, pero no se limita a, cualquiera de los sustituyentes previamente mencionados, i.e., los sustituyentes enumerados para fracciones alifáticas, o para otras fracciones según se revela en ésta, resultando en la formación de un compuesto estable. En ciertas modalidades de la presente invención, "aril" se refiere a un sistema de anillo mono- o bicíclico carbocíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos que incluyen, pero no limita a, fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, indenil y similares. En ciertas modalidades de la presente invención, el término "heteroaril", como se utiliza en ésta, se refiere a un radical aromático cíclico que tiene de cinco a diez átomos del anillo de los cuales un átomo del anillo es seleccionado de S, O y N; cero, uno o dos átomos del anillo son heteroátomos adicionales independientemente seleccionados de S, O y N; y los átomos del anillo remanente son carbono, el radical siendo unido al resto de la molécula vía cualquiera de los átomos del anillo, tales como, por ejemplo, piridil, pirazinil, pirimidinil, pirrolil, pirazolil, imidazolil, tiazolil, oxazolil, isooxazolil, tiadiazolil, oxadiazolil, tiofenil, furanil, quinolinil, isoquinolinil, y similares.

Se apreciará que los grupos aril y heteroaril incluyendo los grupos aril bicíclico) pueden ser no sustituidos o sustituidos, en donde la sustitución incluye reposición de uno, dos o tres de los átomos de hidrógeno sobre estos independientemente con cualquier o más de la siguientes fracciones que incluyen, pero no limitan a: F, Cl, Br, I, OH, NO_{2}, CN, C(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, C(O)-aril, C(O)-heteroaril, CO_{2}-alquilo, CO_{2}-aril, CO_{2}-heteroaril, CONH_{2}, CONH-C_{1}-C_{6}-alquilo, CONH-aril, CONH-heteroaril, OC(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, OC(O)-aril, OC(O)-heteroaril, OCO_{2}-alquilo, OCO_{2}-aril, OCO_{2}-heteroaril, OCONH_{2}, OCONH-C_{1}-C_{6}-alquilo, OCONH-aril, OCONH-heteroaril, NHC(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, NHC(O)-aril, NHC(O)-heteroaril, NHCO_{2}-alquilo, NHCO_{2}-aril, NHCONH-heteroaril, SO_{2}-C_{1}-C_{6}-alquilo, SO_{2}-aril, C_{3}-C_{6}-cicloalquil, CF_{3}, CH_{2}CF_{3}, CHCl_{2}, CH_{2}OH, CH_{2}CH_{2}OH, CH_{2}NH_{2}, CH_{2}SO_{2}CH_{3}, aril, heteroaril, bencil, benciloxi, ariloxi, heteroariloxi, C_{1}-C_{6}-alcoxi, metoximetoxi, metoxietoxi, amino, bencilamino, arilamino, heteroarilamino, C_{1}-C_{3}-alquilo-amino, tio, aril-tio, heteroariltio, bencil-tio, C_{1}-C_{6}-alquilo-tio, o metiltiometil. Ejemplos adicionales de sustituyentes aplicables usualmente, se ilustran por las modalidades específicas mostradas en los Ejemplos que están descritos en ésta.

El término "cicloalquil", como se utiliza en ésta, se refiere específicamente a los grupos que tienen de tres a siete, preferiblemente tres a diez átomos de carbono. Apropiados cicloalquilos incluyen, pero no se limitan a ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclohexil, cicloheptil y similares. Que, como en el caso de otras fracciones alifáticas, heteroalifáticas o heterocíclicas, pueden opcionalmente ser sustituidas. F, Cl, Br, I, OH, NO_{2}, CN, C(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, C(O)-aril, C(O)-heteroaril, CO_{2}-alquilo, CO_{2}-aril, CO_{2}-heteroaril, CONH_{2}, CONH-C_{1}-C_{6}-alquilo, CONH-aril, CONH-heteroaril, OC(O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, OC(O)-aril, OC(O)-heteroaril, OCO_{2}-alquilo, OCO_{2}-aril, OCO_{2}-heteroaril, OCONH_{2}, OCONH-C_{1}-C_{6}-alquilo, OCONH-aril, OCONH-heteroaril, NHC (O)-C_{1}-C_{6}-alquilo, NHC(O)-aril, NHC(O)-heteroaril, NHCO_{2}-alquilo, NHCO_{2}-aril, NHCONH-heteroaril, SO_{2}-C_{1}-C_{6}-alquilo, SO_{2}-aril, C_{3}-C_{6}-cicloalquil, CF_{3}, CH_{2}CF_{3}, CHCl_{2}, CH_{2}OH, CH_{2}CH_{2}OH, CH_{2}NH_{2}, CH_{2}SO_{2}CH_{3}, aril, heteroaril, bencil, benciloxi, ariloxi, heteroariloxi, C_{1}-C_{6}-alcoxi, metoximetoxi, metoxietoxi, amino, bencilamino, arilamino, heteroarilamino, C_{1}-C_{3}-alquilo-amino, tio, aril-tio, heteroariltio, bencil-tio, C_{1}-C_{6}-alquilo-tio, o metiltiometil. Ejemplos adicionales de sustituyentes aplicables usualmente, se ilustran por las modalidades específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en ésta.

Los términos "halo" y "halógeno" como se utiliza en esta se refiere a un átomo seleccionado de flúor, cloro, iodo y bromo.

Se apreciará que ejemplos adicionales de sustituyentes aplicables usualmente se ilustran por las modalidades específicas mostradas en los Ejemplos que son descritas en ésta, pero no se limita a estos Ejemplos.

Descripción de los dibujos

Comparativo de la Figura 1 describe el Fucosil GM1, derivados y construcciones de éstos.

Comparativo de la Figura 2 describe la síntesis del trisacárido 4 ABC y representa el donante 5 tioetil.

Comparativo de la Figura 3 describe la síntesis de hexasacárido 6a y la síntesis de Fucosil GM1, pentil glucósido 1b. Reactivos: (a) MeOTf, CH_{2}Cl_{2}:Et_{2}O (2:1), 0ºC, 23%; (b) (i) DMDO, CH_{2}Cl_{2}; (ii) PhOH, ZnCl_{2}, -78ºC, 65%; (c) TBAF, AcOH, THF; (d) NaOMe, MeOH; (e) NaOH, THF; (f) Na/NH_{3}, THF -78ºC, luego McOH; (g) Ac_{2}O, piridina, DMAP, CH_{2}Cl_{2}, 46% 5 etapas.

Comparativo de la Figura 4 describe la síntesis de trisacárido aceptor 15. Reactivos: (a) Ag_{2}CO_{3}, cat. I_{2}, PnOH, CH_{2}Cl_{2}, 75%; (b) NaOMe, MeOH; (c) Acetona, cat. PPTS, 44% 2 etapas; (d) BaBr, NaH, DMF; 84%; (e) 80% AcOH: H_{2}O, 90%; (f) 3, TMSOTf, EtCN, tamiz molecular, -40ºC, 77%.

Comparativo de la Figura 5 describe la síntesis de Fucosil GM1 Glucósido Pentenil. Reactivos: (a) MeOTf, CH_{2}Cl_{2}: Et_{2}O, 0ºC, 70%; (b) TBAF, AcOH, THF; (c) NaOMe, MeOH; (d) NaOH, THF; (e) Na/NH_{3}, THF, -78ºC, luego MeOH; (f) Ac_{2}O, piridina, DMAP, CH_{2}Cl_{2}, 45% 5 etapas, (g) etapas c-d, 96%.

Comparativo de la Figura 6 describe la síntesis de Fucosil GM1 KLH conjugado 1c.

Figura 7 describe Globo-H, derivados y construcciones de éstos.

Figura 8 describe un esquema sintético para una síntesis de segunda de generación de globo-H y construcciones de éstos.

Figura 9 describe un análisis retrosintético de Globo-H y conjugados de éstos.

Figura 10 describe la síntesis del glucósido 25 y donante 28 tioetil. Reactivos: (a) HBr, Ac_{2}O, AcOH, 96%; (b) PentOH, Ag_{2}CO_{3}, CH_{2}Cl_{2}, tamiz molecular 4Å, 75%; c) NaOMe, MeOH; luego Dowex-H^{+}; (d) BnBr, Bu_{2}SnO, Bu_{4}NI, C_{6}H_{6}, dos etapas 54%; e) PhCH(OMe)_{2}, CSA, CH_{3}CN, 72%; (f) BnBr, NaH, DMF, Et_{4}NI, 97%; (g) NaCNBH_{3}, HCl, Et_{2}O, THF, 79%; (h) DMDO, CH_{2}Cl_{2}; (i) HF/piridina, dos etapas 85%; (j) BnBr, NaH, DMF, 95%; (k) Cp_{2}Zr(OTf)_{2}, tolueno/THF 5:1, 80% (\alpha), \alpha:\beta10:1; (I) DDQ, CH_{3}CN, H_{2}O, 84%.

Figura 11 describe la síntesis de Globo-H Glucósido Pentenil (16c).

Figura 12 describe la conjugación de Globo-H con la proteína excipiente KLH.

Figura 13 describe la inmunoconjugación de antígenos tumorales Globo-H y Fucosil GM1 y el desarrollo de la secuencia glicoaminoácido.

Figura 14 describe la síntesis de derivados de aminoácido lactosa peracetilado.

Figura 15 describe la síntesis de un péptido que contiene el antígeno Tn, antígeno Lewis^{y}, y el antígeno MBr1. Reactivos: (a) TBAF, THF; (b) AcSCH_{2}C(O)(CH_{2})_{3}NH_{2}, reactivo BOP, iPr2NEt, 54%, 2 etapas; (c) TFA, CH_{2}Cl_{2}; (d) reactivo BOP, iPr2NEt, 86%, 2 etapas; (e) 52, reactivo BOP, iPr2NEt, 64%, 2 etapas; (f) Ac2O, Et_{3}N, cat. DMAP, 95%, 2 etapas.

Figura 16 describe la preparación del glicopéptido 54 desprotegido completamente.

Figura 17 describe la síntesis de \alpha-Tn pentenil glucósido 40.

Descripción detallada de la invención

Como se discutió arriba, el deseo de desarrollar métodos mejorados para la preparación de vacunas sintéticas completamente se ha dirigido para incrementar los esfuerzos de investigación dirigidos hacia la síntesis de antígenos de carbohidrato complejos que ocurren naturalmente, así como estructuras complejas novedosas (por ejemplo, glicopéptidos) incorporando estas estructuras antigénicas. Como es frecuente el caso durante el curso de cualquier empresa sintética grande, mejorando los métodos sintéticos son a menudo desarrollados para que puedan ser aplicados universalmente. En particular, estudios sintéticos de estructuras antigénicas que ocurren naturalmente se han dirigido para el desarrollo de metodologías novedosas capaces del desarrollo de vacunas sintéticas con base en carbohidratos no disponibles hasta ahora. Para una revisión, ver Danishefsky, S.J.; Allen, J.R., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000, 39, 836-863, y la referencias citadas en ésta.

Significantemente, la presente invención proporciona metodologías mejoradas para la síntesis de carbohidratos complejos y compuestos terapéuticos relacionados (por ejemplo, glicoconjugados y/o glicopéptidos). En particular, en el contexto de estudios sintéticos desarrollados por la síntesis total del glucósido n-pentenil de Globo-H, metodologías generalizadas se desarrollaron para la síntesis mejorada de las estructuras de carbohidratos complejos. Este método sintético general involucra la realización que la incorporación de un grupo protector glucósido n-alquenil en el terminal reductor de un aceptor carbohidrato, permite para incrementar las eficiencias y accesibilidad del acoplamiento para carbohidratos complejos. Sin embargo en otro aspecto, la presente invención también proporciona el reconocimiento que para ciertos carbohidratos protegidos, las fracciones n-alquenil pueden servir como precursores útiles que pueden ser utilizados finalmente para la síntesis de glicopéptidos complejos.

Además, la presente invención también proporciona el reconocimiento para la presencia de la fracción n-alquenil, ya sea o no en el contexto de un antigénico glucósido n-pentenil o glicopéptido, es ventajoso para el desarrollo de terapéuticos con base en carbohidratos mejorados (por ejemplo, vacunas sintéticas completamente) puesto que síntesis más eficientes de precursores de conjugación pueden ser preparados (y finalmente conjugado), y el carbohidrato n-alquenil también sirve como un precursor para la síntesis de glicoaminoácidos n-alquilo novedosos, como se describe en ésta. La habilidad para acceder fácilmente a estos glicoaminoácidos da ocasión a la última síntesis de glicopéptidos agrupados complejos. Significantemente, las metodologías proporcionan mediante la presente invención, como se describe arriba y en más detalle en ésta, permiten la eficiente preparación de estructuras glicopéptido complejas que tienen más de un tipo de carbohidrato determinante.

Ejemplos específicos, particularmente con respecto a un esquema sintético novedoso para la síntesis del n-pentenil glucósido de Globo-H son descritos con más detalle abajo, junto con ciertas metodologías generales desarrolladas durante el curso de esta síntesis. Se apreciará por alguien de ordinaria habilidad en el oficio que estos ejemplos no tienen la intención de ser limitante; en cambio todos los equivalentes tienen la intención de ser incorporados en el alcance de la presente invención.

Compuestos y Métodos Inventivos para la Síntesis de estos

Como es mencionado, la síntesis total de las estructuras antigénicas complejas se ha dirigido a un desarrollo significativo en metodologías para síntesis de carbohidratos complejos.

En un aspecto de la presente invención, derivados novedosos de Globo-H son proporcionados y una metodología sintética general novedosa para la síntesis de éstos. Los derivados de Globo-H se representan abajo:

15

en donde cada aparición de R' es hidrógeno o un grupo protector, en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno; en donde R es hidrógeno, alquilo o alquenil sustituido o no sustituido, en donde la fracción alquenil tiene cuatro o más carbonos; - NHR''', en donde R''' es una proteína, péptido o lípido ligado a N directamente o a través de un ligador en cruz; una fracción aminoacil; un residuo aminoacil de un péptido; un residuo aminoacil de una proteína; de donde la fracción aminoacil o residuo o -NHR''' es ligada a O vía una cadena de polimetileno que tiene la estructura -(CH_{2})_{n} donde, si dicha fracción carbohidrato es ligada a O vía un \alpha-acoplamiento, r es un número entero entre 2 y 9, o, de manera alterna, si dicha fracción carbohidrato es ligada a O vía un \beta-acoplamiento, r es un número entero entre 1 y 9; o en donde R es sustituido con una fracción que tiene la estructura:

16

En ciertas modalidades preferidas, cada aparición de R' es hidrógeno. En ciertas otras modalidades preferidas de la presente invención, R es n-alquenil, que incluye, pero no limita a alilo, propenil, butenil y pentenil. En una modalidad preferida particularmente, R es n-pentenil. En ciertas otras modalidades preferidas, R es una fracción aminoacil, un residuo aminoacil de un péptido, o un residuo aminoacil de una proteína, como se describe arriba, en donde r es preferiblemente 4. En aún otras modalidades preferidas, se proporciona un compuesto según lo descrito arriba, con la condición de que el compuesto no sea la estructura glicosfingolípido.

Como se describe con más detalle en ésta en el Ejemplo 2, una metodología similar a esas descritas para fucosil GM1 comparativo es empleada para la síntesis de Globo-H y los derivados de éste. De esta manera, en otro aspecto de la presente invención, un método para la síntesis mejorada de Globo-H, y derivados de éste, dicho método que comprende las etapas de:

(a): proporcionar un donante tioetil que tiene la estructura:

17

: en donde P es un grupo protector; y

(b): proporcionar un trisacárido aceptor que tiene la estructura:

18

: en donde n es 0-8, y en donde P es un apropiado grupo protector; y

(c): la reacción de dicho donante tioetil y dicho trisacárido aceptor bajo condiciones para generar un hexasacárido protegido y subsiguientemente la desprotección del hexasacárido protegido bajo condiciones apropiadas para generar un n-alquenil Globo-H.

Se apreciará que para cada uno de los métodos según se detalla en ésta, el arsenal completo de los grupos protectores conocidos en el oficio de síntesis orgánica pueda ser utilizado, por ejemplo, como se publica en "Activating Agents y Protecting Groups: Handbook de Reagents for Organic Synthesis" Roush, W.R. y Pearson, A.J., Eds., John Wiley & Sons: 1999; y "Protective Groups en Organic Synthesis" Greens, T.W. y Wuts, P.G., John Wiley & Sons, New York: 1999, los contenidos totales de los cuales están incluidos por referencia en ésta. En solamente algunos ejemplos, grupos protectores apropiados utilizados en esta incluyen, pero no se limita a, Bn (bencil), TIPS (triisopropilsilil), y Ac (acetato). En una modalidad preferida de la presente invención, dicho tioetil donante y dicho trisacárido aceptor están reaccionados bajo la estimulación MeOTf, como se describe en ésta. Se apreciará por alguien de ordinaria habilidad en el oficio sin embargo, que una variedad de condiciones conocidas en el oficio de síntesis orgánica pueden ser utilizadas para realizar el acoplamiento de estas fracciones.

También será apreciado que las fracciones n-alquenil novedosas proporcionadas en esta puedan ser subsiguientemente modificadas para generar compuestos útiles (por ejemplo, derivados alquilo y glicoaminoácidos) o construcciones de estos (por ejemplo, glicopéptidos y conjugado derivados).

Además para proporcionar unas metodologías sintéticas mejoradas para Globo-H, como se describe arriba, en un aspecto más general, la presente invención proporciona metodologías sintéticas novedosas para la síntesis de carbohidratos complejos que comprende (1) proporcionar un carbohidrato aceptor que tiene un grupo alquenil terminal reductor; (2) proporcionar un compuesto donante apropiado y (3) el acoplamiento de dicho donante y aceptor bajo condiciones para generar un alquenilglucósido. Utilizando este método, se proporcionan los glucósidos alquenil antigénicos complejos, como se describe arriba, muchos de los cuales nunca antes han sido proporcionados, que luego pueden ser conjugados o adicionalmente reaccionados, como se describe en ésta, para generar glicoconjugados y estructuras glicopéptido.

De esta manera, en general, la presente invención proporciona compuestos novedosos y/o conjugados que tiene la estructura general:

19

en donde R es hidrógeno; alquilo sustituido o no sustituido; alquenil; aril; -CH_{2}CH(CO_{2}R')(NHR''), en donde R' o R'' son cada uno independientemente hidrógeno, grupo protector, alquilo sustituido o no sustituido, un ligador, aril, péptido, proteína o lípido; o NHR''', en donde R''' es una proteína, péptido, o lípido, ligado a N directamente o a través de un ligador en cruz; en donde n es 0-8; en donde A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

20

En ciertas modalidades preferidas de la presente invención, R es alilo, n es 2 y de esta manera el compuesto inventivo es una fracción n-pentenil. En ciertas otras modalidades de la presente invención, R es NHR''', y la proteína R''' es KLH o Albúmina Serina de Bovino. En aún otras modalidades de la presente invención, R es NHR''', y el lípido R''' es PamCys. Será apreciado que la proteína o lípido pueden ser ligados a N directamente o a través de un ligador en cruz y de esta manera R''' incorpora proteínas, péptidos y lípidos, así como fracciones (ligador en cruz-proteína), (ligador en cruz-péptido) y (ligador en cruz-lípido). En ciertas modalidades preferidas, el ligador en cruz es MMCCH (4-(maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil hidrazida).

En aún otras modalidades, el compuesto inventivo es un glicoaminoácido y de esta manera R es CH_{2}CH (CO_{2}R') (NHR''), compuesto que tiene la estructura:

21

En ciertas modalidades preferidas, los glicoaminoácidos de la presente invención se derivan de n-pentenil glucósidos y de esta manera A es 3. En ciertas otras modalidades preferidas, R' y R'' son un grupo protector, cada uno independientemente seleccionado del grupo que consiste de t-butil, TSE, Boc, Fmoc y acetil.

Según lo descrito arriba, específicamente en el contexto de la síntesis de segunda generación del antígeno MBr1 (GloboH) incorporando la fracción n-alquenil terminal reductora (específicamente n-pentenil) ofrece ciertos beneficios. Primero, el acoplamiento n-pentenil glucósido anomérico sirve como un ligador efectivo para inmunoconjugación con un proteína excipiente KLH y también proporciona algunas ventajas en términos de convergencia sintética. En el contexto de carbohidratos protegidos, las fracciones n-alquenil también son capaces de actuar como donantes para glicosilación (ver, por ejemplo, Fraser -Reid et al., SynLett, 1992, 927).

En este contexto, la presente invención adicionalmente proporciona métodos para la síntesis de n-alquilo glicoaminoácidos, según se describe con más detalle abajo para Globo-H y su subsiguiente uso para generar glicopéptidos y construcciones sintéticas de éstos.

En general, el método inventivo para la producción de estos glicoaminoácidos comprende: 1) proporcionar una fracción alquenil glucosídica, como se describe en esta; 2) dicha fracción alquenil glucosídica que se somete a condiciones oxidativas para generar un aldehído; 3) dicho aldehído que se somete a condiciones de olefinación para generar un éster de enamida; 4) dicho éster de enamida resultante que se somete a condiciones suficientes para hidrogenar dicho éster de enamida para generar un glicoaminoácido protegido y 5) la desprotección de dicho glicoaminoácido protegido bajo condiciones apropiadas para generar un deseado glicoaminoácido.

En particular, se proporciona, un método novedoso para la síntesis de un glicoaminoácido, la estructura del cual se publica en ésta, que comprende las etapas de:

(a): proporcionar un alquenilglucósido que tiene la estructura:

22

(b): la reacción de dicho alquenilglucósido bajo condiciones apropiadas para generar un éster de enamida que tiene la estructura:

23

24

: en donde, para cada una de la estructuras arriba, n es 0-8, en donde A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

25

: en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y

: en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno.

En general, en las modalidades preferidas, la etapa de la reacción de un n-alquenilglucósido bajo condiciones apropiadas para generar un éster de enamida comprende la reacción de un n-alquenilglucósido primero bajo condiciones oxidativas y segundo bajo condiciones de olefinación en la presencia de una base (por ejemplo, tetrametillguanidina) y fosfonato para generar un éster de enamida. Se apreciará que otras condiciones oxidativas conocidas en el oficio de síntesis orgánica puedan ser empleadas, que incluyen, pero no limitan a OsO_{4} y periodato, o OsO_{4} y Pb (OAc)_{4}. Adicionalmente, otras bases conocidas pueden ser utilizadas en la presente invención, que incluyen, pero no limitan a, t-butóxido de litio o litio hexametil disiliazida.

En modalidades preferidas, la reacción de dicho éster de enamida bajo condiciones apropiadas para generar un glicoaminoácido que comprende la reacción de dicho éster de enamida bajo condiciones de hidrogenación y la subsiguiente reacción bajo condiciones de desprotección para generar un glicoaminoácido. Es particularmente preferido que las condiciones de hidrogenación empleada sean condiciones de hidrogenación asimétricas. En una modalidad preferida, la hidrogenación asimétrica puede ser obtenida mediante el empleo de un catalizador precursor etil DuPHOS, como se describe con más detalle en esta (ver, Burk et al. Accts. Chem. Res. 2000, 33, 3631; Burk et al. Pure & Appl. Chem. 1996, 68, 37).

Se apreciará que la habilidad para generar los glicoaminoácidos, como se describe en ésta, finalmente facilite la síntesis de glicopéptidos agrupados novedosos, un motivo comúnmente encontrado sobre la superficie de células de cáncer (estructuras similares a mucina) que son deseables para los usos descritos en esta como vacunas anticáncer. Por ejemplo, estudios inmunológicos indican que, en general, el agrupamiento de antígenos en glicopéptidos resulta en una respuesta inmune terapéuticamente más que con péptidos glicosilados individualmente (ver, Lo-Man, R. et al., Cancer Res., 1999, 59, 1520; Reddish et al., Glycoconjugate J. 1997, 14, 549).

A la fecha, el agrupamiento de antígenos \alpha-O-ligado ha sido logrado con el mismo antígeno a través del esqueleto del péptido vía el acoplamiento alilo tradicional, como se describe en la Patente US números 09/083,776 y 09/276,595 pendiente de trámite, los contenidos totales de los cuales son incluidos por referencia en ésta. Sin embargo, la presente invención eficientemente proporciona péptidos que tienen diferentes antígenos simultáneamente en un formato agrupado. De esta manera, en un aspecto, la presente invención proporciona un glicopéptido multi-antigénico que comprende un esqueleto peptídico constituido de al menos tres glicoaminoácidos, en donde uno o más de dichos aminoácidos son sustituidos con una fracción n-alquilo glucosídica que tiene la estructura:

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27

en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, x, y y z son independientemente 0, 1, 2 o 3, con la condición de que x, y y z no sean simultáneamente 0; en donde R_{0} es hidrógeno, un grupo alquilo, acilo, arilalquilo o aril de cadena líneal o ramificada; en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{i}, NH_{2}, NHCOR^{i}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{i}, un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R^{i} es hidrógeno, CHO, COOR^{ii}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada o una fracción sacárido que tiene la estructura:

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28

en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada uno independientemente 0, 1 o 2; en donde R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14} y R_{15} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{iii}, NH_{2}, NHCOR^{iii}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{iii}, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R_{16} es hidrógeno, COOH, COOR^{ii}, CONHR^{ii}, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificado; en donde R^{iii} es hidrógeno, CHO, COOR^{iv}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde R^{ii} y Riv son cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada;

en donde cada aparición de n es independientemente 0-8, por lo cual, si por cada aparición de n, n=0, al menos una aparición de A tiene una estructura diferente de otras apariciones de A; y en donde la fracción n-alquilo glucosídica es \alpha- o \beta- ligado a un residuo de aminoácido del esqueleto y al menos una aparición de A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

29

en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector nitrógeno. Se apreciará que estos glicopéptidos agrupados inventivo no se limiten a n-alquilo donde n es mayor que o igual a 1; más bien los glicopéptidos agrupados multi-antigénico pueden ser ligados vía el acoplamiento directo tradicional (n=0) o vía n-alquilo (tal como pentil) o cualquier combinación de éstos. En modalidades preferidas, cada aparición de A es independientemente seleccionada del grupo que consiste de Globo-H, fucosil GM1, KH-1, glicoforina, STN, (2,3) ST, Le^{y}, N3, Tn, 2.6-STn, y TF en donde al menos una aparición de A es Globo-H.

También será apreciado de la estructura como se publicó arriba, que, además de proporcionar las estructuras o multi-antigénicas, la presente invención adicionalmente proporcione las estructuras agrupadas que tienen acoplamientos n-alquilo. De esta manera, en aún otro aspecto de la presente invención, glicopéptidos agrupados n-alquilo ligado (donde n es mayor que o igual a 1) son proporcionados, glicopéptidos que pueden incorporar estructuras antigénicas múltiples o pueden también incorporar todas las mismas estructuras antigénicas.

En general, la creación de los glicopéptidos inventivos comprende el tratamiento de un glicoaminoácido primero con un agente de desprotección para revelar el ácido carboxílico correspondiente y luego el acoplamiento de dicho ácido carboxílico bajo condiciones apropiadas con una fracción espaciadora y un grupo protector para generar una amida protegida. Un segundo glicoaminoácido luego puede ser acoplado bajo condiciones estándar (por ejemplo, promotor BOP u otros conocidos reactivos de acoplamiento conocidos en el oficio de acoplamientos de péptidos) estos acoplamientos pueden ser continuados hasta que se obtenga una longitud del péptido deseado. También será apreciado que los métodos de síntesis en fase sólida de un péptido, conocidos en el oficio también se puedan emplear en el método de la presente invención para generar los glicopéptidos inventivos.

Mientras el glicopéptido de la presente invención no pretende ser limitado en tamaño, en ciertas modalidades preferidas, agrupaciones antigénicas triméricas son deseables y de esta manera la presente invención también proporciona construcciones adheridas a un ligador vía una proteína excipiente que tiene la siguiente estructura:

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en donde el ligador es un ácido carboxílico libre, (carboxamido)alquilo carboxamida, MBS, carboxamida primaria, mono o dialquil carboxamida, mono- o diarilcarboxamida, (carboxi)alquilo carboxamida de cadena líneal o ramificada, (alcoxicarbonil)alquilo-carboxamida de cadena líneal o ramificada, (carboxi)arilalquilcarboxamida de cadena líneal o ramificada, (alcoxicarbonil)alquilcarboxamida de cadena líneal o ramificada, un fragmento de oligoester que comprende desde 2 a aproximadamente 20 residuos hidroxiacil, un fragmento peptídico que comprende desde 2 a aproximadamente 20 residuos aminoacil, o un alquilo de cadena líneal o ramificada o aril carboxílico éster; en donde el excipiente es una proteína o lípido; en donde m es 1, 2 o 3; en donde R_{A}, R_{B} y R_{C} son cada uno independientemente H o metil; y en donde R_{D}, R_{E} y R_{F} son cada uno independientemente un fracción alquilo glucosídica que tiene la estructura:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\newpage

en donde cada aparición de A es independientemente seleccionado desde un dominio carbohidrato que tiene la estructura:

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en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, x, y y z son independientemente 0, 1, 2 o 3, con la condición de que x, y y z no sean simultáneamente 0; en donde el dominio carbohidrato es ligado al residuo aminoacil o hidroxiacil respectivo por la sustitución de un grupo lateral sustituyente seleccionado del grupo que consiste de OH, COOH y NH_{2}; en donde R_{0} es hidrógeno, un grupo alquilo, acilo, arilalquilo o aril de cadena líneal o ramificada; en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{i}, NH_{2}, NHCOR_{1}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{i}, un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R^{i} es hidrógeno, CHO, COOR^{i}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada o una fracción sacárido que tiene la estructura:

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en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada uno independientemente 0, 1 o 2; en donde R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14} y R_{15} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{iii}, NH_{2}, NHCOR^{iii}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{iii}, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R_{16} es hidrógeno, COOH, COOR^{ii}, CONHR^{ii}, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde R^{iii} es hidrógeno, CHO, COOR^{iv}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde R^{ii} y R^{iv} son cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde cada aparición de n es independientemente 0-8, por lo cual, si para cada aparición de n, n=0, al menos una aparición de A tiene una estructura diferente de otras apariciones de A; y en donde la fracción n-alquilo glucosídica es \alpha- o \beta-ligado a un aminoácido y al menos una aparición de A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

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En ciertas modalidades, cada aparición de A es independientemente seleccionada del grupo que consiste de Globo- H, fucosil GM1, KH-1, glicoforina, STN, (2,3)ST, Le^{y}, N3, Tn, 2,6-STn, y TF en donde al menos una aparición de A es Globo-H. En solamente un ejemplo preferido, la presente invención proporciona un glicopéptido antigénico trimérico novedoso, que incorpora Globo-H, Le^{y} y Tn, para generar un compuesto antigénico trimérico novedoso, según lo descrito con más detalle en el Ejemplo 3 en ésta.

Composiciones, Construcciones Farmacéuticas y Usos de las mismas

Según lo descrito arriba, la presente invención proporciona compuestos y metodologías sintéticas útiles en el desarrollo de agentes terapéuticos novedosos, particularmente para vacunas contra el cáncer completamente sintéticas. En general, los compuestos y glicopéptidos preparados según se revela en esta pueden ser conjugados a una proteína excipiente o un lípido para generar glicoconjugados útiles para el tratamiento y prevención, (preferiblemente la prevención de la recurrencia), del cáncer en un sujeto que sufre de éste. Además, los glicoconjugados preparados por el procedimiento revelado en esta son útiles antígenos en terapias adyuvantes como vacunas capaces de inducir anticuerpos inmunoreactivos con varias células tumorales. Tales terapias adyuvantes pueden reducir la rata de recurrencia de ciertos cánceres, e incrementar los índices de supervivencia después de la cirugía. Pruebas clínicas sobre pacientes tratados para cáncer quirúrgicamente, quienes luego se tratan con vacunas preparadas a partir de un antígeno de diferenciación de superficie celular encontrado en pacientes carentes del anticuerpo previo a la inmunización, puede ser observado un incremento significativamente alto en el intervalo libre de la enfermedad. Cf. P.O. Livingston, et al., J. Clin. Oncol., 1994, 12, 1036.

De esta manera, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para tratar el cáncer, preferiblemente para prevenir la recurrencia de cáncer, que comprenden cualquiera de los compuestos de la presente invención revelados en ésta, como un ingrediente activo, opcionalmente, aunque típicamente en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adicionalmente pueden comprender otros ingredientes activos terapéuticamente.

Este método de tratamiento comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva terapéuticamente de cualquiera de los gliconjugados revelados en ésta, opcionalmente en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. El método puede ser aplicado en donde el cáncer es un tumor sólido o un tumor epitelial. Como se mencionó arriba, los métodos para el tratamiento de cáncer (preferiblemente para la prevención de recurrencia de cáncer) son proporcionados, así como métodos para la inducción de anticuerpos en un sujeto humano, en donde los anticuerpos son capaces de unir específicamente con células tumorales humanas, lo cual comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de cualquier de los glicoconjugados revelados arriba para inducir anticuerpos. En ciertas modalidades, el carbohidrato antígeno es ligado a un excipiente efectivo ya sea directamente o a través de un ligador en cruz, cuyo excipiente es una proteína o lípido. En ciertas modalidades, la proteína excipiente es albúmina serina de bovino, polilisina o KLH. En ciertas otras modalidades, el lípido es PamCys.

Además, la presente invención proporciona el método de inducción de anticuerpos relacionado que adicionalmente comprende la co-administración de un adyuvante inmunológico, o una combinación de adyuvantes inmunológicos. En ciertas modalidades, el adyuvante es un adyuvante de saponina (ver, por ejemplo, Marciani et al., Vaccine, 2000, 18, 3141, US Patent No.: 6,080,725 y 5,977,081, los contenidos totales de los cuales son incluidos por referencia en esta). Un ejemplo de un adyuvante de saponina preferido incluye, pero no se limita a, GPI-0100, (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Frederick, MD) que es un adyuvante semisintético derivado por la modificación seleccionada de saponinas naturales. En ciertas otras modalidades preferidas, el adyuvante es bacteria o liposomas. En ciertos ejemplos, el adyuvante incluye pero no se limita a, células de Salmonella minnesota, bacilo Calmette-Guerin o QS21.

Se apreciará que la magnitud de la dosis terapéutica de los compuestos de la invención varíe con la naturaleza y severidad de la condición a ser tratada y con el compuesto particular y su ruta de administración. En general, el rango de dosis diaria para actividad anticáncer se sitúa en el rango de 0.0001 a 1.0 mg/kg de peso corporal en un mamífero, aunque la presente invención no pretende ser limitada por este rango.

Cualquier ruta apropiada de administración puede ser empleada para suministrar a un mamífero, especialmente un humano, con una dosificación efectiva de un compuesto revelado en ésta. Por ejemplo, se pueden emplear vía oral, rectal, tópica, parenteral, ocular, pulmonar, nasal, etc. Formas de dosificación incluyen tabletas, grageas, dispersiones, suspensiones, soluciones, cápsulas, cremas, ungüentos, aerosoles, etc. En modalidades preferidas, la dosificación efectiva es empleada utilizando una jeringa de inyección.

Las composiciones inventivas incluyen aquellos tipos de administración apropiados oral, rectal, tópica (que incluyen dispositivos transdérmicos, aerosoles, cremas, ungüentos, lociones y polvos sueltos), parenteral (que incluyen subcutánea, intramuscular, y intravenosa), ocular (oftálmica), pulmonar (inhalación nasal o bucal) o nasal. Aunque la ruta más apropiada en cualquier caso dado dependerá en su mayor parte sobre la naturaleza y severidad de la condición para ser tratada y sobre la naturaleza del ingrediente activo. Ellos pueden ser convenientemente presentado en una forma de dosificación por unidad y preparados por cualquiera de los métodos conocidos en el campo farmacéutico.

En preparación de formas de dosificación oral, cualquier medio farmacéutico poco común puede ser utilizado, tal como agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, preservativos, agentes de coloración, y similares en el caso de preparaciones líquidas orales (por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones); o excipientes tales como almidones, azucares, celulosa microcristalina, diluentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes, etc., en el caso de preparaciones sólidas orales son preferidas sobre preparaciones líquidas orales tal como polvos, cápsulas y tabletas. Sí se desea, las cápsulas pueden ser cubiertas por técnicas acuosas o no acuosas estándar. Además de las formas de dosificación descritas arriba, los compuestos de la invención pueden ser administrados por instrumentos y dispositivos de liberación controlada.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención apropiadas para administración oral pueden ser preparadas como unidades discretas tal como cápsulas, bolsitas o tabletas cada una conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo en forma de polvo o gránulos o como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso o en una emulsión aceite-en-agua o agua-en- aceite. Tales composiciones pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos conocidos en el campo farmacéutico. En general, las composiciones se preparan por la mezcla uniforme y a fondo del ingrediente activo con excipientes líquidos, excipientes sólidos divididos finamente, o ambos y luego, si es necesario, moldeando el producto en la forma deseada. Por ejemplo, una tableta puede ser preparada por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden ser preparadas por compresión en una máquina apropiada del ingrediente activo en una forma de caída libre tal como un polvo o granulo opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluente inerte o superficie activa o agente dispersante. Las tabletas moldeadas pueden hacerse por moldeo en una máquina apropiada, de una mezcla del compuesto pulverizado humidificado con un diluente líquido inerte.

Se apreciará por alguien ordinaria habilidad en el oficio, sin embargo, que la ruta más apropiada para su administración dependerá en su mayor parte sobre la naturaleza y severidad de la condición para ser tratada y sobre la naturaleza del ingrediente activo. Según se discutió arriba, los terapéuticos inventivos pueden ser convenientemente presentados en una forma de dosificación por unidad y preparados por cualquiera de los métodos conocidos en el campo farmacéutico.

Como se discutió arriba, en una modalidad de la presente invención, los glucósidos n-alquenil inventivos pueden ser conjugados ya sea directamente o a través de un ligador en cruz a un apropiado excipiente (por ejemplo, KLH) para generar a tumor antígeno sintético. En general, una estrategia de conjugación típica que puede ser empleada involucra un acoplamiento reductivo de un glucósido que termina en un glicoaldehido, con la proteína excipiente pretendida, o el lípido, es de suponer que en los residuos \varepsilon-aminoácido de lisinas sin protección. (M.A. Bernstein; L.D. Hall, Carbohydr. Res. 1980, 78, C1; R.V. Lemieux Chem. Soc. Rev. 1978, 7, 423).

De esta manera, en otro aspecto, la presente invención proporciona construcciones sintéticas, a través de estructuras antigénicas novedosas, como se describe en ésta, son conjugados a proteínas excipientes, péptidos o lípidos. También será apreciado por alguien de ordinaria habilidad en el oficio que, en la generación de una construcción sintética, más de una fracción n-alquenil o fracción glicopéptido finalmente puede ser conjugada a una proteína excipiente para generar la vacuna sintética. De esta manera, además a las estructuras glicopéptido conjugado como se proporcionan en ésta, las construcciones que tienen la estructura general según se representa abajo también se proporcionan:

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en donde A es un dominio carbohidrato que tiene la estructura:

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en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada uno independientemente 0, 1 o 2; en donde R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14} y R_{15} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{iii}, NH_{2}, NHCOR^{iii}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{iii}, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R_{16} es hidrógeno, COOH, COOR^{ii}, CONHR^{ii}, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde R^{iii} es hidrógeno, CHO, COOR^{iv}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde R^{ii} y R^{iv} son cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada;

en donde n es 0-8; en donde el excipiente es una proteína o lípido, que incluyen, pero no limitan a Albúmina Serina de Bovino, KLH y PamCys, en donde dicha proteína o lípido es ligado directamente o a través de un ligador en cruz; y en donde m esta en el rango de 20-600 y el carbohidrato determinante es Globo-H. En ciertas modalidades preferidas, n es 4. En ciertas otras modalidades, m está en el rango de 200-600.

Se apreciará que puesto que ciertos de los compuestos inventivos producidos terminan en un acoplamiento alquenil, en un protocolo típico de acuerdo con la presente invención, primero se requiere la conversión a un aldehído. De esta manera, en solamente una modalidad ejemplar, un tumor antígeno globo-H sintético inventivo es preparado desde un glucósido n-alquenil globo-H. Según lo descrito en el Ejemplo 2, este procedimiento involucra la exposición del glucósido n-alquenil globo-H a condiciones oxidativas, en este caso ozonólisis, seguida por estimulación reductiva para producir un aldehído intermedio para generar una vacuna del glicoconjugado. Subsiguiente análisis del carbohidrato hidrolítico revela aproximadamente 350 residuos de carbohidrato /molécula de proteína excipiente, según se describe en el Ejemplo 2.

Adicionalmente, una vez que una vacuna sintética ha sido derivatizada y caracterizada, estudios inmunológicos en ratón se pueden llevar a cabo para evaluar la potencia y/o especificidad de las vacunas tumorales novedosas, según se describe en el Ejemplo 4 en ésta.

Equivalentes

Los ejemplos representativos que siguen son pretendidos para ayudar a ilustrar la invención, y no tienen la intención de, no se construyeron para, limitar el alcance de la invención. Ciertamente, varias modificaciones de la invención y adicionalmente muchas modalidades de éstos, además para aquellos mostrados y descritos en ésta, llegaran a ser evidentes por aquellos de habilidad en el oficio de los contenidos completos de este documento, que incluyen los ejemplos que siguen y las referencias para el científico y la literatura de la patente citada en ésta. En solamente un ejemplo ilustrativo, los grupos protectores juegan un papel importante en la síntesis de los dominios carbohidrato y conjugados sintéticos, como se describe en esta; sin embargo se apreciará por alguien de ordinaria habilidad en el oficio para que la presente invención abarque el uso de varios grupos protectores alternos conocidos en el oficio. Aquellos grupos protectores usados en el descubrimiento que incluyen los Ejemplos abajo son ilustrativos simplemente.

Los siguientes ejemplos contienen información adicional importante, ejemplificación y orientación que pueden ser adaptados a la práctica de esta invención en sus modalidades diversas y los equivalentes de éstos.

Ejemplificación

A. Ejemplo comparativo 1

Síntesis de fucosil GM1 pentenil glucósido 1) Discusión de la Síntesis

Como se discutió arriba, en un aspecto de la invención, se proporciona la síntesis de fucosil GM1 pentenil glucósido. En una modalidad de la presente invención, esta se obtuvo de manera análoga a la metodología empleada en la síntesis del antígeno MBr1, Globo-H (ver, Park et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488). Por ejemplo, como se muestra en la Figura 2, primero se emprendio, la síntesis del trisacárido ABC inicial del conocido protegido lactal derivado 2 (Kwon, O.; Danishefsky, S.J. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1588). La sialilación selectiva del hidroxil ecuatorial C3' en 2 prosigue suavemente con el donante 3 fosfito (Sim et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 2260; Chappell et al., Tetrahedron 1997, 53, 11109) para producir el glical 4 como el único isómero observable en el 75% de la producción. Además, se empleó propionitrilo como el solvente debido a la necesidad para realizar la reacción a bajas temperaturas. El empleo de temperaturas elevadas en acetonitrilo como el solvente resulta en selectividad anomérica menguada, regioselectividad y rendimiento químico más bajo. El trisacárido DEF clave se sintetizó como previamente se describió en la síntesis de Globo-H (Park et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488). El donante 5 tioetil requisito se muestra en la Figura 2. Basado en previas experiencias, se esperaba que este donante específico favoreciera la \beta-glicosidación por medio de la participación sulfonamido bajo la orientación cerca del "hidroxil proximal" dirigiendo el efecto (ver asterisco) (ver también, Park et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488; Kwon et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1588), y el resultado confirma esta expectación. En un experimento dirigido a "prueba de principio", la reacción de 5 con 5.0 equivalentes de MeOTf (Lonn, H. Carbo. Res. 1985, 134, 105; Lonn, H. J. Carbohydr. Chem. 1987, 6, 301) en la presencia de 4 dando el deseado hexasacárido 6 en el 23% de la producción, como se muestra en la Figura 3. Aunque la desprotección directa de este compuesto no se obtuvo para producir el deseado compuesto, en un esfuerzo para encontrar un hexasacárido que fue apropiado para la desprotección global, se consideró la reposición del terminal reductor glical. Tal reposición también sería potencialmente útil como un ligador capaz de ser modificado para permitir la conjugación a una proteína excipiente o lípido.

En solamente un ejemplo, el uso de un n-pentenil glucósido se consideró (Para una revisión de n-pentenil glucósidos, ver Fraser-Reid et al., Synlett, 1992, 927; Udodong et al. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 7886; Merritt et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 8334; Fraser-Reid et al. 1990, 55, 6068; Mootoo et al. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2662; Mootoo et al. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8540 y referencias en esta). Los N-pentenil glucósidos son estables a un rango de reacción condiciones y reactivos, pero son fácilmente activados por las reacciones de glicosidación por el tratamiento con un halógeno oxidante. Como un resultado de su estabilidad y las condiciones neutrales requeridas para su activacíon, los pentenil glucósidos han sido demostrados por ser acoplamientos valiosos para estudios mecánicos y sintéticos. Adicionalmente, un grupo pentenil terminal, o más generalmente un grupo alquenil terminal, también podría proporcionar manipulación por bioconjugación. De esta manera, en una modalidad, el glical 6a se sometió a epoxidación bajo procedimientos estándar con 3,3-dimetildioxirano (Figura 3). La reacción con alcohol pentenil y cloruro de cinc anhidro (Gordon et al. Carbohydrate Res. 1990, 206, 361) suministra el glucósido 7 en un 65% de la producción. Ladeed, con el pentenil glucósido en lugar de, desprotección global de 7 fue posible. La secuencia mostrada en la Figura 3 suministra a la lactona hexasacárido peracetilada 8 en el 46% de la producción (5 etapas). La extracción de los acetatos con metóxido de sodio seguido por la saponificación del metil éster resultante produce el objetivo, fucosil GM1 pentenil glucósido, 1b. La asignación de la estructura 1b se baso en análisis ^{1}H y ^{13}C NMR de 1b, en conjunción con la caracterización de intermediarios en la vía a la estructura final, y se sustenta por espectrometría de masas de alta resolución.

En aún otra modalidad, en un esfuerzo para producir cantidades significantes de este epítope para la evaluación pre-clínica, y eventualmente clínica, una ruta sintética más eficiente se desarrolló utilizando un glucósido en el terminal reductor en el aceptor, en lugar de un glical. Como se muestra en la Figura 4, pentenil lactósido se investigó primero. Para este propósito, la lactosa octaacetato se convirtió en un conocido bromuro 9 (Reithal, Y. J. Am. Chem. Soc. 1952, 74, 4210; Dasgupta et al. Carbohydr. Res. 1994, 264, 155). La reacción de este compuesto con alcohol pentenil bajo estimulación por carbonato de plata entrega el deseado pentenil glucósido, 10, sobre una escala de 100 g (Rodriguez, et al. Aust. J. Chem. 1990, 43, 665). Un acoplamiento análogo para producir 9 utilizando triflato de plata como promotor resulta en únicamente un 17% de producción del producto deseado. La extracción de los acetatos produciendo el lactósido 11. Otra vez, los grupos hidroxil C3' y C4' se comprometieron, esta vez como el dimetil cetal 12. Esta reacción, según lo conducido actualmente, se acompañó por la formación de pequeñas cantidades de 4,6-acetonido (Catelani et al. Carb. Res. 1988, 182, 297). La perbencilación de 12 para dar 13 seguido por la extracción de acetonido con ácido acético acuoso produciendo el deseado aceptor AB 14. La sialilación utilizando donante 3 fosfito (Figura 2) continuando en la producción comparable para dar el trisacárido aceptor, 15.

Finalmente, volviendo al deseado fucosil GM1, el acoplamiento del donante 5 con un exceso 2.0 molar del aceptor 15 que contiene el ligador pentenil continuando con la estimulación de MeOTf (1.5 equivalentes x 2) en una producción excelente (70%; ver Figura 5). La desprotección global bajo condiciones idénticas como en la Figura 4, produciendo el caracterizado hexasacárido 1b.

La atención luego fue dirigida al objetivo final de desarrollar un glicoconjugado. El sintético 1b se sometió a la conjugación de una proteína excipiente KLH, como se representa en la Figura 6. El protocolo inició con ozonólisis, por consiguiente la producción del derivado aldehído no-caracterizado. Esta etapa fue seguida por el acoplamiento a KLH utilizando aminación reductiva bajo la agencia de cianoborohidruro de sodio. Presumiblemente el acoplamiento del carbohidrato ha ocurrido con el grupo \varepsilon-amino de residuos de lisina en el KLH. El análisis de carbohidratos hidrolítico revela aproximadamente 331 residuos de carbohidratos por molécula de KLH para generar 1c.

2) Experimentales

Peracetil pentenil-\beta-D-lactósido (10). A una suspensión enfriada (baño de hielo) de octaacetato de lactosa (100.0 g, 147.7 mmol), ácido acético glacial (30 mL) y anhídrido acético (30 mL) se le adicionó 100 mL de HBr al 30% en AcOH gota a gota durante un periodo de 60 minutos. La mezcla de reacción se agita por 1 hora y el baño de hielo se retiró. Bajo agitación por un adicional de 2 horas a temperatura ambiente, la reacción se convierte en una solución amarilla homogénea. La solución se diluyó con H_{2}O (1000 mL) y se extrajo con CHCl_{3} (3x400 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con H_{2}O (2x1000 mL), NaHCO_{3} saturado (3x500 mL), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El \alpha-bromo producto 9 formó el azeótropo con benceno anhidro y se secó bajo alto vacío para producir 98.8 g (96%) del bromuro de lactosil que se utilizó sin purificación adicional. A una suspensión de Ag_{2}CO_{3} (100 g, 362.6 mmol), tamiz molecular activado recientemente (15 g) y un cristal de I_{2} en 400 mL CH_{2}Cl_{2} se le adicionó alcohol pentenil (5.0 equiv., 73.4 mL) y luego el bromuro de lactosil 9 (98.8 g, 141.4 mmol) en 400 mL de CH_{2}Cl_{2}. Después de la agitación en la oscuridad a temperatura ambiente por 16 horas, la reacción se filtró a través de un tapón de celite con CH_{2}Cl_{2} adicional y se concentró a un aceite de color amarillo que se purificó mediante cromatografía de columna instantánea (10% EtOAc/hexanos->50% EtOAc/hexanos) para producir 74.7 g (75%) del pentenil lactósido 10 como una espuma de color blanco. [\alpha]^{22}_{D} -48.9º (c 7.5, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 2941, 1751, 1369, 1224, 1054 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 5.60 (m, 1H), 5.17 (d, 1H, J=2.7 Hz), 5.02 (m, 1H), 4.93 (dd, 1H, J=7.9, 10.3 Hz), 4.85 (d, 1H, J=1.6 Hz), 4.78 (m, 2H), 4.71 (dd, 1H, J=9.6, 7.9 Hz), 4.30 (m, 3H), 3.93 (m, 3H), 3.66 (m, 3H), 3.45 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 1.98 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.91 (m, 2H), 1.89 (s, 3H), 1.88 (s, 6H, 2xCH_{3}), 1.87 (s, 3H), 1.79 (s, 3H), 1.49 (m, 2H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 170.33, 170.28, 170.09, 170.00, 169.74, 69.54, 169.01, 137.72, 115.00, 101.01, 100.51, 76.27, 72.76, 72.48, 71.64, 70.94, 70.58, 69.23, 69.01, 66.52, 61.97, 60.73, 29.75, 28.49, 20.80, 20.75, 20.64, 20.57, 20.45; HRMS (FAB) calc. para C_{31}H_{44}O_{18}Na [M+Na]^{+} 727.2425, encontrado 727.2418.

Pent-4-enil 3',4'-O-acetonido-\beta-D-lactósido (12). Peractetilado pentenil lactósido, 10, (18.2 g, 25.8 mmol) se disolvió en 300 mL de MeOH anhidro y se le adicionó 2.0 mL de NaOMe (25% en MeOH). La reacción se agitó a rt por 16 horas y se neutralizo con Dowex-H+ (pH 5-6). La reacción se filtró con adicional MeOH y se concentró a un sólido de color blanco (10.6 g, cuantitativos) que se utilizaron sin purificación adicional. Pentenil-\beta-D-lactósido 11:^{1}H NMR (D_{2}O, 400 MHz) \delta 5.81 (m, 1H), 5.00 (dd, 1H, J=17.3, 1.9 Hz), 4.92 (dd, 1H, J=8.9 Hz), 4.74 (m, 1H), 439 (d, 1H, J=8.0 Hz), 4.35 (d, 1H, J=7.8 Hz), 3.72-3.42 (m, 12H), 3.21 (m, 1H0, 2.06 (m, 2H), 1.63 (m, 2H); ^{13}C NMR (D_{2}O, 100 MHz) \delta 14127, 117.31, 105.42, 104.54, 80.85, 77.84, 77.24, 76.92, 75.33, 75.00, 73.44, 72.47, 71.03, 63.52, 62.56, 31.83, 30.48. Al pentenil lactósido 11 (10.6 g, 25.8 mmol) se le adicionó 200 mL acetona, 26 mL de dimetoxipropano y ácido p-toluenosulfónico (491 mg, 0.1 equiv.). La suspensión se agita a temperatura ambiente durante la noche hasta ese punto donde la reacción fue homogénea. La reacción se concentró y purificó por cromatografía de columna instantánea (100% EtOAc - > 2% MeOH en EtOAc) para dar 5.1 g (44%) del 3,4-acetonido como un sólido de color blanco y 127 g del 4,6-acetonido como un sólido de color blanco. 3,4-acetonido, 12: [\alpha]^{22}_{D} 79.0º (0.96c, MeOH); IR 3422, 2980, 2933, 2870, 1242, 1073 cm^{-1}; ^{1}H NMR (MeOH, 400 MHz) \delta 5.83 (m, 1H), 5.00 (dd, 1H, J=17.1, 3.4 Hz), 4.92 (dd, 1H, J=10.2, 2.0 Hz), 4.34 (d, 1H, J=8.2 Hz), 4.25 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.17 (dd, 1H, J=5.5, 2.1 Hz), 4.02 (dd, 1H, J=72, 5.5 Hz), 3.91 (m, 3H), 3.81-3.73 (m, 5H), 3.55-3.47 (m, 3H), 3.42 (m, 1H), 3.38 (m, 1H), 3.21 (m, 1H), 2.13 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 1.45 (s, 3H), 130 (m, 3H); ^{13}C NMR (MeOH, 100 MHz) \delta 139.42, 115.20, 111.04 (O-C-O), 104.16, 104.09, 80.94, 80.77, 76.29, 76.25, 75.27, 75.00, 74.76, 74.39, 62.36, 61.82, 31.18 (CH_{3}), 30.02, 28.41, 26.51 (CH_{3}); HRMS (Fab) calc. para C_{20}H_{34}O_{11}Na [M+Na]^{+} 473.1998, encontrado 473.1985. 4,6-acetonido: [\alpha]^{22}_{D} -216.0º (c 1.14, MeOH); IR 3364, 2926, 2870, 1380 cm^{-1}; ^{1}H NMR (MeOH, 400 MHz) \delta 5.79 (m, 1H), 4.98 (dd, 1H, J=17.0, 1.8), 4.90 (dd, 1H, J=10.2, 1.0), 4.35 (d, 1H, J-7.8 Hz), 4.24 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.13 (m, 2H), 3.86-3.82 (m, 3H), 3.76 (dd, 1H, J=12.9, 1.4 Hz), 3.61-3.49 (m, 5H), 3.44 (s, 1H), 3.35 (m, 1H), 3.19 (t, 1H), 2.11 (m, 2H), 1.66 (m, 2H), 1.43 (s, 3H), 1.35 (s, 3H); ^{13}C NMR (MeOH, 100 MHz) \delta 139.48, 115.20, 104.68, 104.26, 100.17 (O-C-O), 79.86, 76.40, 76.35, 74.81, 73.34, 71.46,70.25, 69.95, 68.04, 63.67, 61.69, 31.23 (CH_{3}), 30.08, 29.56, 18.69 (CH_{3}). Pent-4-enil 2, 3, 6, 2', 6'-penta-O -bencil-3', 4'-O -acetonido-\beta-D-lactósido (13). El acetonido 12 (3.40 g, 7.54 mmol) formó el azeótropo con benceno anhidro, disuelto en DMF anhidro (60 mL, 0.12 M) y se enfrió a 0ºC. Se adicionó Bencil bromuro (pasado a través de alúmina básica, 10.0 equiv. 8.97 mL), seguido por NaH sólido (95%, 7.5 equiv., 1.76 g) en una porción. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante la noche y luego se vertió en H_{2}O fría congelada (500 mL) y se extrajo con CHCl_{3} (200 mL, 2x100 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera (500 mL), se secaron sobre MgSO_{4} y se concentró a un aceite de color amarillo que fue purificado por cromatografía de columna instantánea (5% EtOAc/hexanos \rightarrow 20% EtOAc/hexanos) para producir 5.70 g (84%) de the producto como un aceite viscoso. [\alpha]^{22}_{D} 196.0º (1.09c, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3062, 3029, 2868, 1367, 1093, 1055 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.39-7.20 (m, 25H), 5.78 (m, 1H), 4.98 (dd, 1H, J=17.1, 3.4 Hz), 4.93 (dd, 1H, J=10.2, 2.0 Hz), 4.89 (d, 1H, J=10.6 Hz), 4.86 (d, 1H, J=10.9 Hz), 4.75 (d, 1H, J=11.7 Hz), 4.70 (d, 1H, J=10.6 Hz), 4.68 (d, 1H, J=10.8 Hz), 4.63 (d, 1H, 11.8 Hz), 4.53 (d, 1H, J=12.1 Hz), 4.46 (d, 1H, J=12.1 Hz), 4.39 (d, 1H, J=6.3 Hz), 4.36 (d, 1H, J=2.0 Hz), 434 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.28 (d, 1H, J=12.0 Hz), 4.07 (dd, 1H, J=5.5, 1.4 Hz), 3.99 (m, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.76.(dd, 1H, J=11.9, 4.2 Hz), 3.70 (dd, 1H, J=10.8, 1.6 Hz), 3.65 (m, 2H), 3.55-3.47 (m, 3H), 335 (m, 2H), 3.30 (dd, 1H, J=7.9, 0.8 Hz), 2.31 (m, 2H), 1.72 (m, 2H), 1.36 (s, 3H), 1.31 (s, 3H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 138.92, 138.54, 138.43, 13831, 138.19, 138.00, 128.22, 128.16, 128.08, 127.99, 127.95, 121.17, 127.63, 127.49, 127.40, 127.34, 127.20, 114.83, 109.66, 103.56, 101.76, 82.89, 81.75, 80.53, 79.26, 76.30, 75.32, 74.96, 74.91, 73.51, 73.28, 73.12, 73.08, 71.86, 69.16, 68.82, 68.18, 30.15, 28.87, 27.89, 26.34; HRMS (FAB) calc. para [M+Na]^{+} C_{55}H_{64}O_{11}Na 923.4346, encontrado 923.4330.

Pent-4-enil 2,3,6,2',6'-penta-O-bencil-\beta-D-lactósido (14). El acetonido 13 (5.7 g, 6.32 mmol) se disolvió en 80% AcOH en H_{2}O (60 mL) y se calentó a 75ºC por 3 horas. La reacción se enfrió a rt, se diluyó con H_{2}O (500 mL) y se extrajo con CHCl_{3} (200 mL, 2x100 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con H_{2}O (500 mL), NaHCO_{3} saturado (3x300 mL), se secaron sobre MgSO_{4} y se concentró a un aceite que se purificó por cromatografía de columna instantánea (25% EtOAc/hexanos) para producir 5.21 g (96%) de un sólido de color blanco. [\alpha]^{22}_{D} 194.1º (1.13c, CHCl_{3}); IR (película CHCl_{3}) 3444, 3028, 2868, 1091, 1058 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.41-7.20 (m, 25H), 5.74 (m, 1H), 4.96-4.88 (m, 3H), 4.82 (d, 1H, J=10.9 Hz), 4.72 (d, 1H, J=11.4 Hz), 4.70 (d, 1H, J=10.9 Hz), 4.64 (d, 1H, J=10.9 Hz), 4.58 (d, 1H, J=11.6 Hz), 4.52 (d, 1H, J=10.9), 4.38-4.28 (m, 5H), 3.93-3.85 (m, 3H), 3.71 (m, 2H), 3.55-3.40 (m, 4H), 3.36 (m, 3H), 3.28 (m, 2H), 2.48 (d, OH, 1H, J=3.2 Hz), 2.40 (s, OH, 1H), 2.09 (m, 2H), 1.66 (m, 2H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 139.09, 138.53, 139.29, 138.17, 138.01, 137.91, 128.44, 128.35, 128.24, 127.89, 127.82, 127.77, 127.63, 127.55, 127.19, 114.86, 103:57, 102.53, 82.76, 81.71, 79.96, 76.57, 75.17, 75.02, 74.89, 74.80, 73.45, 73.40, 73.12, 72.79, 69.22, 68.71, 68.60, 68.24, 30.17, 28.88; HRMS (FAB) calc. Para C_{52}H_{60}O_{11}Na [M+Na]^{+} 883.4033, encontrado 883.4017.

Trisacárido 15. El donante fosfito 3 (1.0 g, 1.35 mmmol) y lactosil aceptor 14 (2.5 g, 2.90 mmol) se combinaron, formó el azeótropo con benceno anhidro y se colocaron bajo alto vacío por 2 horas. La mezcla se disolvió en CH_{3}CH_{2}CN anhidro (se destiló a partir de CaH_{2}), se adicionó tamiz molecular activado recientemente y la reacción se enfrió a -40ºC. Una porción de TMSOTf (0.1 equiv., 27 \muL) se adicionó y la reacción se dejó en agitación a -40ºC durante la noche. La reacción luego se calentó a -30ºC y se le adicionó otro 0.1 equivalente de TMSOTf. Se dejo bajo agitación por un adicional de 2 horas a -30ºC, la reacción se apagó mediante la adición de NaHCO_{3} sólido y se filtró a través de un tapón de celite con la ayuda de EtOAc. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (2x400 mL) y se secó sobre MgSO_{4}. La evaporación de la capa orgánica dio un aceite turbio que se sometió a cromatografía de columna instantánea utilizando un cuidadoso gradiente de elución con el fin de recuperar el aceptor y producto trisacárido (20% EtOAc/hexanos \rightarrow 75% EtdAc/hexanos). El producto (1.35g, 75%) se obtuvo como una espuma de color blanco y 0.95 g de aceptor inicial se recuperó. : [\alpha]^{22}_{D} 238º (c 1.30, CHCl_{3}); IR (película CHCl_{3}) 3106, 2866, 1744, 1689, 1368, 1222, 1055 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.40-7.17 (m, 25H), 5.79 (m, 1H), 538 (m, 1H), 527 (dd, 1H, J=8.0, 2.0 Hz), 5.08 (d, 1H, J=10.0 Hz), 4.95 (m, 3H), 4.86 (d, 1H, J=10.9 Hz), 4.75 (d, 1H, J=5.7 Hz), 4.72 (d, 1H, J=10.8 Hz), 4.68 (d, 1H, J=11.0 Hz), 4.56 (d, 1H, J=11.9 Hz), 4.54 (d, 1H, J=7.6 Hz), 4.44 (d, 1H, J=12.2 Hz), 4.39 (m, 1H), 4.32-4.25 (m, 3H), 4.06-3.88 (m, 6H), 3.79 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.65 (m, 3H), 3.54-3.44 (m, 5H), 3.35 (m, 2H), 2.66 (d, OH, 1H, J=3.3 Hz), 2.47 (dd, 1H, J=13.0, 4.7 Hz), 2.12 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 2.02 (m, 1H), 1.98 (s, 3H), 1.95 (s, 3H),1.85 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.71 (s, 3H) ; ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 170.77, 170.53, 170.23, 169.92, 169.87, 168.32, 139.09, 138.90, 138.61, 138.45, 138.34, 138.05, 128.27, 128.21, 137.99, 127.51, 127.42, 127.11, 114.81, 103.48, 102.29, 98.32, 82.90, 81.80, 78.37, 76.50, 76.30, 75.31, 75.01, 74.89, 74.82, 73.23, 72.97, 72.66, 72.37, 69.16, 69.03, 68.69, 68.43, 68.36, 67.81, 67.08, 62.21, 52.99, 49.17, 36.41, 30.17, 28.89, 23.11, 21.08, 20.77, 60.67, 60.47; HRMS (FAB) calc. para C_{72}H_{87}NO_{23}Na (M+Na+) 1356.5566, encontrado 1356.5557.

Hexasacárido 7 (R=Bn). El donante tioetil 5 (311 mg, 0.243 mmol) y el aceptor 15 (627 mg, 0.487 mmol) se combinaron, formaron el azeótropo con benceno anhidro (5x5 mL) y se coloca bajo alto vacío por 5 horas. La mezcla luego se disolvió en 1.6 mL CH_{2}Cl_{2} y 3.2 mL Et_{2}O (0.05M total), tratado con tamiz molecular preparado recientemente y se enfrió a 0ºC. Se adicionó Metil triflato en una porción (1.5 equiv., 41 \muL) y la reacción se agita a 0ºC durante la noche. En la mañana, otros 20 \muL de MeOTf se le adicionaron y la reacción se dejó agitar por un adicional de 2 horas a 5ºC. La reacción se apagó por la adición de NaHCO_{3} sólido, se filtró a través de celite con EtOAc, se concentró y purifico por cromatografía de columna instantánea (gradiente de elución 25% EtOAc/hexanos -> 50% -> 75% EtOAc/hexanos) para dar 437 mg (70%) de hexasacárido como una espuma de color blanco y 300 mg de trisacárido aceptor recuperado: [\alpha]^{22}_{D} -29.4º (c 3.25, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3285, 3028, 2940, 2865, 1794, 1749, 1690, 1220, 1090 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.74 (d, 2H, J=7.5 Hz), 7.34-7.08 (m, 43H), 5.75 (m, 1H), 5.52 (d, 1H, J=4.7 Hz), 5.29 (app s, 1H), 5.23 (dd, 1H, J=9.5, 1.4 Hz), 5.15 (m, 1H), 5.02 (d, 1H, J=9.8 Hz), 4.97-4.87 (m, 5H), 4.84 (d, 1H, J=10.9 Hz), 4.81-4.70 (m, 5H), 4.63 (d, 1H, J=11.6 Hz), 4.57 (m, 3H), 4.44 (d, 1H, J=7.2 Hz), 4.40 (d, 1H, J=12.2 Hz), 4.30 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.10 (m, 2H), 3.98-3.81 (m, 12H), 3.82 (s, 3H), 3.78-3.68 (m, 7H), 3.64-3.45 (m, 8H), 3.27 (m, 3H), 3.17 (dd, 1H), 2.80 (d, OH, 1H, J=2.1 Hz), 2.19 (dd, 1H, J=13.0, 4.5 Hz), 2.10 (m, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.81 (s, 3H), 1.68 (m, 2H), 1.08 (d, 3H, J=5.4 Hz), 1.00-0.92 (m, 42H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 170.61, 170.34, 170.26, 169.66, 167.18, 155.48, 138.95, 138.65, 138.63, 138.56, 138.42, 138.38, 138.27, 138.05, 132.17, 129.02, 128.59, 128.46, 128.18, 128.05, 127.91, 127.63, 127.51, 127.24, 127.09, 114.80, 103.42, 102.76, 102.45, 100.16, 99.58, 98.76, 82.87, 81.53, 79.06, 77.32, 77.24, 77.16, 75.12, 75.07, 74.95, 74.80, 73.92, 73.27, 73.04, 72.93, 72.19, 69.23, 69.14, 69.09, 67.89, 67.53, 61.76, 61.58, 61.12, 56.39, 53.60, 49.19, 35.36, 30.17, 29.89, 23.13, 20.97, 20.75, 20.62, 20.53, 17.85, 17.53, 17.33, 16.72, 11.80, 11.74; HRMS (FAB) calc. para C_{136}H_{178}N_{2}O_{39}SSi_{2} (M+Na4) 2574.1163, encontrado 2574.1130.

Compuesto 1b. A una solución del hexasacárido (130 mg, 0.0509 mmol) en THF (2.0 mL) se le adicionó AcOH glacial (10.0 equiv., 29 \muL) y TBAF (1.0 M THF, 10.0 equiv., 0.509 mL). La reacción se agita a rt durante la noche, se vertió en agua helada y se extrajo con EtOAc (3x50 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con NaHCO_{3} saturado (50 mL) y salmuera (50 mL), se secaron sobre MgSO_{4} y se concentró a un aceite que se purificó a través de un tapón pequeño de silica gel con EtOAc. El triol resultante se disolvió en MeOH anhidro (2.5 mL) y se le adicionó metóxido de sodio (0.250 mL de una solución a 25% en MeOH). La reacción se agita a rt por 18 horas y luego se adicionaron 0.5 mL de THF y 0.5 mL de H2O. La agitación a rt por un adicional de 24 horas fue seguida por la neutralización con Dowex-H^{+}, filtración con lavados de MeOH y concentración. El material crudo se dejó secar bajo alto vacío por 1 día. Al sólido de color blanco resultante se le adicionó THF (0.5 mL) y NH_{3} líquido condensado (\sim10 mL) a -78ºC. Se le adicionó sodio (-50 mg) y la solución azul resultante se agita a -78ºC por 1.5 horas. La reacción se apagó con MeOH anhidro (\sim5 mL), se llevo a rt y se concentró con una corriente de N_{2} seco a un volumen de - 2 mL. La reacción se neutralizo con Dowex-H^{+}, se filtró con lavados de MeOH y se concentró a un sólido de color blanco. El sólido de color blanco se disolvió en 1.0 mL piridina y 1.0 mL CH_{2}Cl_{2} y se enfrió a 0ºC. Se le adicionó un cristal de DMAP seguido por anhídrido acético (1.0 mL). El baño de hielo se retiró y la reacción se agita a rt durante la noche. La concentración seguida por purificación mediante cromatografía de columna instantánea (gradiente de elución 75% EtOAc/hexanos -> 100% EtOAc -> 5% MeOH/EtOAc) dio 44 mg (46%) de 8 como un sólido de color blanco: ^{1}H NMR (MeOH, 400 MHz) \delta 8.02 (d, 1H, J=9.9 Hz), 7.87 (d, 1H, J=9.2 Hz), 5.76 (m, 1H), 5.49 (m, 1H), 539 (d, 1H, J=2.9 Hz), 5.34-5.31 (m, 2H), 5.22 (d, 1H, J=3.4 Hz), 5.19 (d, 1H, J=4.1 Hz), 5.17 (d, 1H, J=3.5 Hz), 5.12-5.05 (m, 3H), 4.97 (dd, 1H, J=16.8, 1.7 Hz), 4.91 (dd, 1H, J=10.0, 1.7 Hz), 4.81-4.75 (m, 3H), 4.65-4.60 (m, 2H), 4.52 (d, 1H, J=7.9 Hz), 4.48-4.44 (m, 2H), 4.37 (dd, 1H, J=10.0, 2.5 Hz), 4.28 (dd, 1H, J=12.5, 2.4 Hz), 4.22-4.18 (m, 2H), 4.14-3.99 (m, 9H), 3.96-3.92 (m, 2H), 3.89 (d, 1H, J=2.9 Hz), 3.88-3.77 (m, 4H), 3.72-3.62 (m, 3H), 3.51-3.45 (m, 1H), 2.74 (dd, 1H, J=11.3, 4.5 Hz), 2.19 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1:98 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), .91 (s, 3H), 180 (s, 3H), 1.61 (m, 2H), 1.14 (d, 3H, J=6.4 Hz), 3 ocultos bajo acetatos (2 Pn, 1 C3ax); ^{13}C NMR (MeOH, 100 MHz) \delta 174.64, 173.64, 172.98, 172.89, 172.63, 172.56, 172.48, 172.44, 172.34, 172.27, 172.04, 171.99, 171.76, 171.73, 171.62, 171.35, 171.25, 139.23, 115.47, 104.62, 103.26, 101.86. 101.63, 100.78, 97.31, 78.22, 76.53, 75.08, 74.69, 74.29, 73.91, 73.53, 72.94, 72.71, 72.56, 72.16, 72.06, 71.89, 71.74, 70.19, 69.87, 69.33, 69.11, 69.92, 65.96, 65.65, 63.68, 63.52, 62.69, 54.01, 53.09, 50.60, 40.19, 31.09, 29.96, 24.17, 24.06, 22.73, 21.76, 21.59, 21.46, 21.20, 21.06, 20.89, 20.75, 20.63, 20.55, 16.52.

El peracetato (40 mg) se disolvió en MeOH anhidro (2.0 mL) y se adicionaron 150 \muL de metóxido de sodio (25% solución en MeOH). La reacción se agita a rt por 18 horas y luego 0.5 mL de THF y se adicionó 0.5 mL de H_{2}O. La reacción se agita por otras 24 horas a rt. La neutralización con Dowex-H^{+} (-pH 6-7) fue seguida por filtración con lavados de MeOH, concentración y purificación utilizando Gel P-2 (eluente H_{2}O) para producir 24 mg (96%) de un sólido de color blanco: IR 3346, 2940, 2882, 1657, 1620, 1376, 1069 cm^{-1}; ^{1}H NMR (D_{2}O, 400 MHz) \delta 5.86 (m, 1H), 5.18 (d, 1H, J=4.0 Hz), 5.04 (dd, 1H, J=17.22, 1.7 Hz), 4.97 (dd, 1H, J=10.6 Hz), 4.63 (d, 1H, J=7.6 Hz), 4.57 (d, 1H, J=7.7), 4.46 (d, 1H, J=7.9 Hz), 4.43 (d, 1H, J=8.1 Hz), 4.15 (m, 1H), 4.09-4.02 (m, 3H), 3.94-3.84 (m, 5H), 3.80-3.63 (m, 18H), 3.60-3.53 (m, 6H), 3.47 (dd, 1H, J=10.3, 1.8), 3.32 (t, 1H), 3.26 (t, 2H), 2.62 (dd, 1H, J=13.4, 4.3 Hz), 2.09 (m, 2H), 1.98 (s, 6H), 1.86 (m, 1H), 1.67 (m, 2H), 1.15 (d, 3H, J=6.5 Hz) ; ^{13}C NMR (D_{2}O, 100 MHz) \delta 176.29, 175.43, 175.16, 139.97, 115.99, 104.38, 103.77, 103.30, 103.22, 102.25, 100.35, 79.67, 78.12, 77.65, 77.03, 76.06, 75.94, 75.62, 75.44, 75.24, 74.85, 74.19, 74.01, 73,45, 73.01, 71.15, 70.72, 70.32, 69.87, 69.64, 69.25, 67.93, 64.01, 62.29, 62.07, 61.63, 61.29, 52.79, 52.70, 50.04, 38.45, 30.53, 29.17, 23.89, 23.23, 16.53; HRMS (FAB) calc. para C_{48}H_{79}N_{2}O_{33}Na_{2} [M-H+2Na]^{+} 1257.4360, encontrado 1257.4337.

Hexasacárido glical 6a. El donante tioetil 5 (120 mg, 0.0938 mmol) y aceptor 4 (122 mg, 0.108 mmol) se combinaron, formaron el azeótropo con benceno anhidro (5x5mL) y se coloca bajo alto vacío durante la noche. La mezcla se disolvió en una mezcla 2:1 de Et_{2}O:CH_{2}Cl_{2} (2.7 mL total), se adicionó tamiz molecular y la mezcla se agita a rt por 1 h. La reacción se enfrió a 0ºC y se le adicionó 1.0 equiv. de MeOTf (0.020 mL). Después de 4 horas a 0ºC otro equivalente de MeOTf se le adicionó (0.020 mL) y la reacción continua agitándose por otras 4 h a 10ºC. La reacción se apagó con NaHCO_{3} sólido, se filtró a través de celite con un adicional EtOAc (100 ml) y se concentró. La mezcla resultante se purificó mediante cromatografía de columna instantánea para dar 50 mg (23%) del hexasacárido glical 6 y 85 mg del aceptor inicial, 4: Rf 0.35 (66% EtOAc/hexanos); ^{1}H NMR (500 MHz, C_{6}D_{6}) \delta 8.31 (d, 2H), 7.62 (d, 2H), 7.52 (m, 4H), 7.45 (d, 2H), 7.40-7.15 (m, 31H), 6.47 (d, 1H, J=6.3 Hz), 6.28 (appsonnt s, 1H), 6.09 (d, 1H, J =3.8 Hz), 5.72 (m, 1H), 5.55 (dd, 1H, J=9.3, 1.2 Hz), 5.51 (d, 1H, J=3.5 Hz), 5.22 (d, 1H, J=10.8 Hz), 5.15 (s, 1H), 5.13-5.06 (m, 3H), 5.05 (d, 1H, J=8.1 Hz), 5.02 (m, 1H), 4.98 (d, 1H, J=10.8 Hz), 4.85 (d, 1H, J=10.6 Hz), 4.82 (d, 1H, J=- 9.4 Hz), 4.73-4.66 (m, 8H), 4.55-4.34 (m, 10H), 4.38-4.32 (m, 5H), 4.30 (d, 1H), 4.18 (s, 3H), 4.21-4.12 (m, 6H), 4.06 (m, 2H), 3.99 (m, 4H), 3.85 (d, 1H), 3.74 (dd, 1H), 3.61 (m, 2H), 3.52 (t, 1H), 2.63 (dd, 1H, J=13.9, 5.0), 2.48 (dd, 1H, J=13.4 Hz), 2.35 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.57 (d, 3H, J=6.3), 1.31-1.20 (m, 42H); ^{13}C NMR (100 MHz, CDCl_{3}) \delta 169.71, 169.39, 169.18, 168.70, 168.12, 166.99, 154.75, 143.47, 137.81, 137.71, 137.51, 137.42, 137.07, 131.65, 128.25, 127.52, 128.32, 127.26, 127.23, 127,19, 127.10, 126.98, 126.91, 126.83, 126.73, 126.62, 126.53, 126.36, 126.29, 101.67, 101.35, 98.69, 98.32, 98.26, 97.33, 80.48, 78.05, 77.06, 76.20, 75.50, 74.64, 74.22, 73.87, 73.49, 72.90, 72.38, 72.26, 71.93, 71.47, 71.20, 70.34, 70.17, 69.99, 69.13, 68.62, 68.10, 67.92, 67.01, 66.88, 66.68, 65.52, 60.92, 60.61, 55.51, 52.59, 48.31, 34.87, 28.68, 22.19, 19.95, 19.77, 19.68, 19.59, 16.93, 16.88, 15.79, 10.86, 10.78; HRMS (FAB) calc. para C_{124}H_{162}N_{2}O_{37}Si_{2}SNa [M+Na]^{+} 2382.0013, encontrado 2382.0001.

Imido-hexasacárido 6b. Realizando la reacción de arriba con 10 equiv. MeOTf adicionado en una porción, bajo condiciones idénticas de otra manera produce el 28% del siguiente compuesto, que es mucho menos polar que el N-acetilado hexasacárido progenitor 6a. R_{f} 0.35 (25% EtOAc/hexanos); ^{1}H NMR (500 MHz, C_{6}D_{6}) \delta 8.31 (d, 2H), 7.66 (d, 2H), 7.53 (t, 4H), 7.48 (d, 2H), 7.42-7.16 (m, 31H), 6.46 (d, 1H), 6.21 (app s, 1H), 6.15 (d, 1H, J=4.3 Hz), 5.81 (d, 1H, J=9.2 Hz), 5.72 (dt, 1H, J=12.8, 2.4 Hz), 5.40 (m, 1H), 5.38 (d, 1H, J=3.5 Hz), 5.20 (d, 1H, J=10.2 Hz), 5.12 (t, 2H), 5.00 (m, 3H). 4.84 (d, 1H, J-6.2 Hz), 4.81 (d, 1H, J=4.5 Hz), 4.73 (m, 2H). 4.70 (m, 2H), 4.67 (d, 1H, J=2.6 Hz), 4.65 (m, 1H), 4.59 (m, 3H). 4.53-4.46 (m, 6H), 4.40 (m, 5H), 4.36 (d, 1H, J=3.1 Hz), 4.30 (d, 1H, J=3.4 Hz), 4.26 (m, 3H), 4.23 (app 5, 1H), 420 (m, 3H). 4.11 (m, 2H), 4.04 (d, 1H, J=5.9 Hz), 3.99 (s, 3H), 3.92 (d, 1H, J=3.2 Hz), 3.87 (d, 1H, J=2.9 Hz), 3.82 (d, 1H, J=6.5 Hz), 3.70 (m, 1H), 3.64 (s, 3H), 3.60 (d, 1H), 3.28 (t, 1H), 2.94 (dd, 1H, J=13.7, 4.5 Hz), 2.36 (t. 1H, J=133 Hz), 2.14 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.81 (s, 3H), 1.60 (s, 3H), 1.53 (d, 3H, J=6.5 Hz), 1.32-1.23 (m, 42H): ^{13}C NMR (100 MHz, CHCl_{3}) \delta 170.43, 169.30, 169.20, 168.98, 168.03, 164.74, 155.82, 144.74, 139.09, 138.75, 138.52, 138.48, 131.40, 131.39, 138.25, 138.17, 132.56, 129.22, 128.85, 128.39, 128.35, 128.30, 128.25, 128.01, 127.79, 127.71, 127.60, 127.55, 127.50, 127.48, 127.34, 102.57, 102.24, 99.69, 99.11, 98.25, 81.35, 79.09, 87.22, 75.64, 75.40, 74.90, 74.60, 74.15, 73.95, 73.50, 73.33, 72.94, 72.84, 72.52, 71.37, 71.17, 70.47, 70.17, 69.66, 69.05, 68.47, 68.11, 67.96, 67.71, 67.55, 61.91, 61.54, 61.05, 57.70, 56.50, 53.65, 52.75, 31.94, 29.71, 21.70, 20.97, 20.89, 20.64, 20.46, 20.44, 17.57, 16.81, 15.38, 14.13, 11.89, 11.80; LRMS (FAB) C_{125}H_{164}N_{2}O_{37}SSi_{2}Na 2373 [M+Na]^{+}.

3) Estudios de conjugación

Según se describe en esta y como se muestra en la Figura 6, el grupo pentenil en FucGM1 se convirtió en un grupo aldehído por ozonólisis y se ligó a los grupos -NH_{2} de KLH por el método aminación reductiva en la presencia de cianoborohidruro de sodio como se describió para globo H (ver, Ragupathi G, Park TK, Zhang S, Kim IJ, Graeber L, Adluri S, Lloyd KO, Danishefsky SJ y Livingston PO. La Inmunización de ratones con conjugados de globo H hexasacárido completamente sintético resulta en anticuerpo contra células de cáncer humanas: un inmunológico química combinado se acerca al moldeo de una vacuna anticáncer. Angewandle Chem. Int. Ed Engl. 36: 125-128. 1997). En el caso de un método ligador en cruz el grupo aldehído obtenido a través de ozonólisis primero se reaccionó con hidrazida de MMCCH (4-(maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil hidrazida) y reaccionado con KLH tiolado según se describe en Ragupathi G, Koganty RR, Qiu D, Lloyd KO y Livingston PO. Un método novedoso y eficiente para la preparación de una vacuna sintética de carbohidrato conjugado: La síntesis de sialil Tn-KLH conjugado utilizando un brazo ligador 4-(4-N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxil hidrazida (MMCCH). Glycoconjugate J., 15: 217-221, 1998). Por ejemplo, 4 mg de FucGM1 pentenil glucósido en metanol se agita a -78ºC en un baño de etanol/hielo-seco y se paso gas ozono a través de la solución por 10 min bajo agitación vigorosa. El exceso de ozono luego se desplazó con nitrógeno durante un periodo de 5 min. Se adicionó sulfuro de metilo (100 \mul) y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente por 2 horas y se distribuye igualmente en dos viales. El solvente se retiró bajo una corriente de nitrógeno. El sólido de color blanco resultante se utilizó directamente en las etapas subsiguientes de conjugación.

a) Conjugación Directa de FucGM1-aldehído con KLH

Dos mg de FucGM1-aldehído se disolvieron en 1 ml de solución salina reguladora de fosfato 0.1M (PBS) pH 7.2 y 4 mg de KLH en PBS. Dos mg de cianoborohidruro de sodio se adicionaron y la mezcla se incubó bajo agitación suave a 37ºC por 48 h. Después de 16 h, un adicional de 1.0 mg cianoborohidruro de sodio se le adicionó y la incubación continúo. El aldehído FucGM1 no- reactivo se retiró completamente con múltiples lavados utilizando un Amicon Centriprep con valor límite de peso molecular 30000 dalton, con 6-7 cambios de PBS a 4ºC.

b) Conjugación de FucGM1-aldehído a través de MMCCH a tiolado KLH Preparación de FucGM1-MMCCH

Dos mg de FucGM1-aldehído se disolvieron en 1 ml de solución reguladora de acetato de sodio 0.1M pH 5.5, y se adicionaron 4 mg de MMCCH en 100 \mul de dimetil sulfóxido (DMSO). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente por 15 min con agitación suave. Al final de 15 min, se adicionaron 2 mg de cianoborohidruro de sodio sólido y la incubación continuo a temperatura ambiente por 2 h. El MMCCH no-reactivo se extrajo en una columna Sephadex G10 equilibrada previamente con solución reguladora de fosfato de sodio 0.1 M pH 6.0 que contiene EDTA 5 mM y se eluyó con la misma solución reguladora. Las fracciones positivas para FucGM1 por TLC con orcinol se combinaron.

Adición de los grupos sulfhidril a KLH

Se disolvió 2-Iminotiolano (2 mg) en solución reguladora de tiolación (trietanolamina 50 mM, NaCl 0.15 M, EDTA 5 mM, pH 8.0) se adicionó a 4 mg de KLH y se incubó con agitación a temperatura ambiente por 2 h. El 2-iminotiolano no-reactivo se removió por columna Sephadex G15 equilibrada previamente con solución reguladora de fosfato de sodio 0.1 M pH 7.2 que contiene EDTA 5 mM y se eluyó con la misma solución reguladora. Se combinaron las fracciones positivas para KLH con ensayo proteína BioRad reactivo de tinción. Una pequeña porción se utilizó para estimar los grupos sulfhidril en el KLH tiolado utilizando reactivos de Ellman y cisteina como estándar como se describió anteriormente (Riddles PW, Blackeley RL, Zemor B Ellman's reactivo: 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico)-a reexaminación, Anal Biochem 94: 75-81, 1979). El KLH se estimó por un método de tinción utilizando reactivo de tinción BloRad de acuerdo a las instrucciones de fabricación.

Conjugación de FucGM1-MMCCH a KLH tiolado

El producto FucGM1-MMCCH y KLH tiolado se mezclaron y se ajustó a pH 7.2 con fosfato de sodio 0.1M solución reguladora pH 8.0. La mezcla de reacción luego se incubó a temperatura ambiente durante la noche. El contenido de la reacción FucGM1- MMCCH-KLH completa se transfirió a un concentrador 30 Centriprep (Amicon: molecular límite 30000 Dalton) y el FucGM1-MMCCH no-reactivo se retiró completamente con lavados múltiples. El conjugado se chequeo por HPTLC para la ausencia de FucGM1 no-reactivo como se mencionó arriba. Los índices del epítope de dos lotes de conjugados se determinaron mediante la estimación del contenido de proteínas por ensayo de proteína de enlace por tinción BioRad y carbohidrato por un ensayo HPAEC-PAD. El índice de epítope de FucGM1-KLH (por método directo) y FucGM1-MMCCH-KLH fue 149/1 y 1527/1 respectivamente.

B. Ejemplo 2

Síntesis de Globo-H y conjugados de estos: 1) Discusión de Síntesis

En aún otra modalidad de la presente invención, una síntesis mejorada de Globo-H se proporciona la utilización de la metodología sintética novedosa según se presenta en ésta. La síntesis previa de globo-H descrito por los inventores actuales (Park et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488; Bilodeau et al. J. Am Chem. Soc. 1995, 177, 7840; Kim et al. J. Org. Chem. 1995, 60, 7716) utilizado todos los bloques de construcción de glical (Danishefsky et al. Angew. Chem. 1996, 108, 1482; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1380) para la rápida construcción de éste oligosacárido complejo. Estas investigaciones cuentan con un acoplamiento [3+3] altamente convergente para generar el hexasacárido centro contenido en el blanco final. En esta estrategia, un glical terminal flexible se mantuvo durante toda la construcción de hexasacárido. El glical luego se utilizó para instalar la cadena lateral ceramida presente en la ruta para globo-H glicolípido 16a o su glucósido alilo 16b. La síntesis de 16a sirve para facilitar la prueba de estructura e inmunocaracterización de globo-H. El glucósido alilo 16b se empleó para la inmunoconjugación a bioproteínas excipientes. Los protocolos previos fueron efectivos en la producción de cantidades adecuadas de material sintético para la prueba de estructura, inmunocaracterización, conjugación, vacunación de ratón y pruebas clínicas humanas fase I. Sin embargo, metodologías sintéticas mejoradas se desearon para permitir la eficiente bioconjugación y también proporcionar un material apropiado para propósitos clínicos.

Dificultades asociadas con la estrategia glucósido alilo invitaron a una solución alternativa la cual, en términos generales, se describió en ésta, y más específicamente se describió arriba para fucosil GM1, y adicionalmente abajo para Globo-H (Figura 7). De esta manera, se concibió que un hexasacárido pudiera ser construido conteniendo un glucósido que permitiría el acoplamiento a una proteína excipiente, ya en el lugar (ver Figura 8). Ciertamente este grupo ya habría sido incluido en la reducción terminal del aceptor en la etapa de acoplamiento [3+3]. Para la implementación exitosa de esta nueva variación significante de la síntesis de globo-H (y otro tumor complejo asociado con antígenos), sería preferible que 1) el trisacárido aceptor conteniendo la construcción del glucósido sería sintetizable fácilmente; 2) la construcción del glucósido sería compatible con el acoplamiento [3+3]; 3) la construcción, en contraste para el glucósido alilo, sobreviviría a la desprotección global; y 4) la conjugación eficiente sería implementable.

Un análisis retrosintético inicial se muestra en la Figura 9. Para convergencia máxima, el aceptor ABC se visualizó conteniendo el ligador pentenil glucosídico antes discutido. Adicionalmente, el mismo sector donante trisacárido DEF sería utilizado como se describió previamente. El núcleo hexasacárido luego sería ensamblado vía una reacción de acoplamiento convergente [3+3] ABC+DEF utilizando un protocolo de glicosidación sulfonamido (Griffith et al. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 5811; Griffith et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 5863). Resultados previos malos indicaron que la presencia de un hidroxilo libre en C4 de la galactosa terminal reductora (Figura 9, ver asterisco) en el donante DEF sería necesario dirigir la formación del \beta-acoplamiento requerido en la glicosidación sulfonamido (Park et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488; Kwon et al. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 1588). La secuenciación del acoplamiento [3+3] se espero para tomar lugar según se mostro, debido a la alta reactividad del grupo hidroxilo C3 ecuatorial (ver negrilla) en el aceptor con respecto al grupo hidroxilo C4 axial necesario en el trisacárido donante. Importante para la estrategia descrita en esta es que, una vez que el hexasacárido sea ensamblado, únicamente las manipulaciones del grupo protector serían requeridas para alcanzar la pro-vacuna antígeno.

En general, la síntesis del sector trisacárido DEF es bastante conciso, precisando seis transformaciones iniciando a partir de 6-O-TIPS galactal y tri-O -bencil fluoro fucosa (Park et al. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 11488; Bilodeau et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 7840; Kim et al. J. Org. Chem. 1995, 60, 7716). Para propósitos de una estrategia de segunda-generación, el componente trisacárido aceptor puede ser diseccionado en un derivado de lactosa que contiene el deseado NPG soportando un hidroxilo diferenciado en C4' y un donante C-anillo apropiado (Figura 9). El donante galactosa monosacárido también requiere protección diferencial en C3, para un acoplamiento ABC+DEF eventual, y necesita atención cuidadosa para permitir eficientemente a el acoplamiento \beta-glucosídico requerido la unión de los dominios AB+C.

Como se mostró en la Figura 10, la síntesis del aceptor ABC requisito se condujo tomando ventaja de la lactosa octaacetato disponible fácilmente, 17. La conversión de 17 a el conocido donante \alpha-bromo 18 (Reithal, Y. J. Am. Chem. Soc. 1952, 74, 4210; Dasgupet et al. Carbohydr, Res. 1994, 264, 155) se siguió por la glicosilación mediada por carbonato de plata con alcohol pentenil como aceptor, para dar 19 (Pent=CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH=CH_{2}) en el 75% de producción sobre una escala de 100 g (Rodriguez et al. Aust. J. Chem. 1990, 43, 665). Un tratamiento similar de 18 con triflato de plata como promotor resulta en el 17% de producción del producto deseado. De esta manera, con la formación de 19, en una etapa temprana de la síntesis, el ligador se instaló exitosamente para ser usado para una etapa tardía de bioconjugación.

Las etapas subsiguientes se diseñaron para generar un sitio aceptor libre en C4' de 19 para un eventual acoplamiento AB + C dando el trisacárido ABC (Figura 10). El retiro de los grupos protectores éster en 19 para dar un pentenil lactósido fue seguido por una monobencilación mediada por hidruro de estaño para dar selectivamente el bencil éter C3' (David et al. J. Chem. Soc. Perkins Trans. I 1981, 1797; Maranduba et al. Carbohydr. Res. 1986, 151, 105). En una segunda etapa, los hidroxilos C4' y C6' se comprometieron como un acetal bencilideno para dar el compuesto 20 como el producto observable solo (Jannson et al. J. Org. Chem. 1998, 53, 5629; Koeman et al. Tetrahedron 1993, 49, 5291; Qiu et al. Liebigs Ann. 1992, 217). Finalmente, la perbencilación de los grupos hidroxilo remanentes en 20 y la división reductiva regioselectiva del bencilideno con cianoborohidruro de sodio y HCl anhidro dio el alcohol C4' 21 (Gsongg, P.J. Pure Appl. Chem. 1984, 56, 845). De esta manera, iniciando desde lactosa octaacetato 17, el pentenil glucósido aceptor AB 21 se obtuvo en 7 etapas y en el 20% de la producción total.

Con grandes cantidades del pentenil glucósido protegido 21 disponibles, la atención se vuelve para el acoplamiento AB+C para formar el trisacárido aceptor 24. La síntesis previa de glical 27 (Figura 10) requiere una preparación cuidadosa del donante \beta-fluoro activado altamente 23 desde glical 22. El éter PMB C3 contenido en 22 estratégicamente se incorporó para permitir el eventual acoplamiento ABC+DEF bajo la desprotección selectiva de este grupo. En el curso de este trabajo, se descubrió que \alpha-23 podría ser formada convenientemente en alta producción y a gran escala. Por consiguiente, el \alpha-donante 23 se preparó a partir del glical protegido diferencialmente 22 mediante epoxidación, exposición a HF: piridina para producir el derivado cis fluoro-hidrin y la subsiguiente conversión de C2-hidroxil resultante a su bencil éter. La \alpha: \beta selectividad anomérica se demostró por ser 10:1 y la producción total de la transformación de 22 en 3 fue del 76%.

La efectividad del acoplamiento AB+C utilizando previamente el \beta-23 preparado y los \beta-23 preparados recientemente con el aceptor AB 21 luego fue investigado. La optimización sintética del glical trisacárido 27 como un caso modelo (ver 23+26- >27) también se examinó puesto que su sensibilidad presumida por la demanda excesiva de los promotores de acoplamiento. En estas investigaciones se descubrió que la reactividad reducida de los donantes \alpha-fluoro podría ser atenuada por la conducción de los acoplamientos con promotores altamente fluorofílicos en solventes escogidos prudentemente, como se resume en la Tabla 1. El procedimiento de acoplamiento previo utilizando el donante \beta-fluoro 23 predominantemente y glical 26 para dar glical trisacárido 27 empleando las condiciones de acoplamiento Muykiyama (Mukaiyama et al. Chem. Lett. 1981, 431; Nicolaou et al. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 3693; Nicolaou et al. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991, 870) y continuando en el 54% de producción con selectividad anomérica modesta (entrada 1, Tabla 1). Las investigaciones utilizando otros promotores con \alpha-23 son mostradas en las entradas 2 y 3, pero produjo poca satisfacción en términos de eficiencia total. Sin embargo, la preparación de glical 27 se extendió con éxito para incluir el \alpha-donante 23 descrito utilizando estimulación fuertemente con Cp_{2}Zr (OTf)_{2}
fluorofílicos (73% de producción, entrada 4). De manera gratificante, estas condiciones glicosidación optimizadas para la formación de 27 se aplicaron con éxito al acoplamiento AB+C empleando pentenil glucósido 21 para proporcionar el trisacárido 24 en producción que rivaliza con la reacción de la patente (80% de producción, entrada 6). El acoplamiento Muykiyama de \beta-23 con 21 produce el 42% de trisacárido 24 (entrada 5). Satisfecho con los eventos que conducen para suavizar la formación de grandes cantidades de 24, el acoplamiento [3+3] sería investigado. La descarga del grupo PMB solo en 24 podría ocasionar una excelente producción (92%), de esta manera completando el ensamble del deseado pentenil aceptor ABC 25.

TABLA 1 Condiciones de acoplamiento utilizados para generar el trisacárido ABC

38

La etapa clave y las transformaciones finales que completa la síntesis de 16c como se muestran en la Figura 11. El tratamiento del donante DEF 28 conocido (ver Figura 10) con MeOTf (Lönn, H. Carbohydr. Res. 1985, 134, 105; Lönn, H. J. Carbohydr. Chem. 1987, 6, 301). En la presencia del aceptor 25 suavemente proporciona el hexasacárido 29 en el 60% de producción. La configuración del centro anomérico nuevo de 29 se confirmó para ser \beta-configurado. La producción del acoplamiento [3+3] utilizando el trisacárido aceptor 25 fue comparable a la del procedimiento [3+3] que utiliza el aceptor basado en glical que corresponde a 27. La enorme ventaja de usar 15, sin embargo, se manifiesta en las etapas que siguen.

La desprotección empezó con el sometimiento de 29 a TBAF con el fin de retirar los silil éteres y el carbonato cíclico. Los grupos protectores bencil y sulfonamido sobre el penta-ol resultante luego se dividieron bajo la acción reductora del metal disolvente. Este protocolo fue seguido por la peracetilación para dar el peracetato hexasacárido aislable 30. Como en las primeras etapas, el acoplamiento pentenil se probó altamente confiable bajo las condiciones de desprotección mencionadas. Es otra vez notable por contraste que el correspondiente glucósido alilo (en última instancia a la producción de 16b) no es estable a las condiciones reductor metal requiere para la desprotección global y por consiguiente debe estar instalada subsiguiente a la desprotección. La desacetilación de 30 con metóxido produciendo el pentenil glucósido de globo-H completamente desprotegido, 16c, notablemente equilibrado para la bioconjugación. Considerablemente, en la variación de segunda generación, progresa hacia 16d a partir de la construcción de hexasacárido 29 se simplifico enormemente debido a la necesidad para la adicional funcionalización de permitir la conjugación sea eliminada.

Hacia el objetivo de facilitar la evaluación clínica de globo-H sintética, 16c ha sido conjugado a una proteína excipiente KLH para propósitos de crear una vacuna funcional. La primera etapa de este procedimiento involucra la ozonólisis de la olefina pendiente, seguido por la estimulación reductiva, para dar el aldehído intermedio 31 no-caracterizado, según se muestra, en la Figura 12. La afinación reductiva con KLH y cianoborohidruro de sodio en solución reguladora de fosfato produciendo una vacuna de glicoconjugado 16d (n=3). La adherencia covalente del carbohidrato a las proteínas es de suponer que ocurre a través de los grupos \varepsilon-amino sobre los residuos de lisina expuestos en KLH. El análisis de carbohidrato hidrolítico de 16d revela aproximadamente 350 residuos de carbohidrato por molécula de proteína excipiente.

2) Experimentales

Peracetil pentenil-\beta-D-lactósido (19). A una suspensión de lactosa octaacetato enfriada (baño de hielo) (100.0 g, 147.7 mmol), ácido acético glacial (30 mL) y anhídrido acético (30 mL) se le adicionó 100 mL de HBr al 30% en AcOH gota a gota sobre un periodo de 60 minutos. La mezcla de reacción se agita por 1 hora y el baño de hielo se retiró. Bajo agitación por un adicional de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla se convierte en una solución amarilla homogénea. La solución se diluyó con H_{2}O (1000 mL) y se extrajo con CHCl_{3} (3x400 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con H_{2}O (2x1000 mL), NaHCO_{3} saturado (3x500 mL), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró. El producto formó el azeótropo con benceno anhidro y se secó bajo alto vacío para producir 98.8 g (96%) del bromuro de lactosil que se utilizó sin purificación adicional. A una suspensión de Ag_{2}CO_{3} (100 g, 362.6 mmol), tamiz molecular activado recientemente (15 g) y un cristal de I_{2} en 400 mL CH_{2}Cl_{2} se le adicionó alcohol pentenil (5.0 equiv., 73.4 mL) y luego el bromuro de lactosil (98.8 g, 141.4 mmol) en 400 mL de CH_{2}Cl_{2}. Después se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente por 16 horas, la reacción se filtró a través de un tapón de Celite con CH_{2}Cl_{2} adicional y se concentró a un aceite de color amarillo que se purificó por cromatografía de columna instantánea (10% EtOAc/ hexanos\rightarrow50% EtOAc/hexanos) para producir 74.7 g (75%) del pentenil lactósido como una espuma de color blanco. [\alpha]_{22}^{D} -48.9º (c 7.5, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 2941, 1751, 1369, 1224, 1054 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 5.60 (m, 1H), 5.17 (d, 1H, J=2.7 Hz), 5.02 (m, 1H), 4.93 (dd, 1H, J=7.9, 10.3 Hz), 4.85 (d, 1H, J=1.6 Hz), 4.78 (m, 2H), 4.71 (dd, 1H, J=9.6, 7.9 Hz), 4.30 (m, 3H), 3.93 (m, 3H), 3.66 (m, 3H), 3.45 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 1.98 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.91 (m, 2H), 1.89 (s, 3H), 1.88 (s, 6H, 2xCH_{3}), 1.87 (s, 3H), 1.79 (s, 3H), 1.49 (m, 2H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 170.33, 170.28,170.09, 170.00, 169.74, 69.54, 169.01, 137.72, 115.00, 101.01, 100.51, 76.27, 72.76, 72.48, 71.64, 70.94, 70.58, 69.23, 69.01, 66.52, 61.97, 60.73, 29.75, 28.49, 20.80, 20.75, 20.64, 20.57, 20.45. FAB-HRMS calc. para C_{31}H_{44}O_{18}Na^{+}; 727.2425. Encontrado; 727.2418.

Pent-4-enil 3'-O-bencil-4',6'-O-benzilidenil-\beta-D-lactósido (20). Pentenil lactósido peracetilado, 8, (18.2 g, 25.8 mmol) se disolvieron en 300 mL de MeOH anhidro y se adicionaron 2.0 mL de NaOMe (25% en MeOH). La reacción se agita a rt por 16 horas y se neutraliza con Dowex-H+ (pH 5-6). La reacción se filtró con MeOH adicional y se concentró a un sólido de color blanco, 19a, (10.6 g, cuantitativos) que se utilizaron sin purificación adicional: ^{1}H NMR (D_{2}O, 400 MHz) \delta 5.81 (m, 1H), 5.00 (dd, 1H, J=17.3, 1.9 Hz), 4.92 (dd, 1H, J=8.9 Hz), 4.74 (m, 1H), 4.39 (d, 1H, J=8.0 Hz), 435 (d, 1H, J=7.8 Hz), 3.72-3.42 (m, 12H), 3.21 (m, 1H0, 2.06 (m, 2H), 1.63 (m, 2H); ^{13}C NMR (D_{2}O, 100 MHz) \delta 141.27, 117.31, 105.42, 104.54, 80.85, 77.84. 77.24, 76.92, 75.33, 75.00, 73.44. 72.47, 71.03, 63.52, 62.56, 31.83, 30,48. El hepta-ol 19a (1.14 g, 2.8 mmol) y óxido dibutiltin (0.76 g, 3.1 mmol) se calentaron a reflujo en benceno (70 mL) con agua azeotrópica extracción por 15 h. La mezcla se duplico en concentración, se enfrió a temperatura ambiente, y se adicionaron bencil bromuro (0.69 ml, 5.8 mmol) y Bu_{4}NI (1.03 g, 2.8 mmol). La mezcla se calentó a reflujo 3.5 h, se enfrió, se adicionó silica gel al frasco, y el solvente se evaporó. El residuo se aplicó a una columna de silica gel, estaño por productos se eliminó por enjuague con hexanos, y la elución (5% MeOH en CH_{2}Cl_{2}) dio el 3'-Obencill éter puro (0.76 g, 54%) como una espuma de color blanco: [\alpha]_{22}^{D} +36.7º (c 2.73, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3371, 2924, 2880, 1372, 1157, 1074 cm^{-1}; ^{1}H NMR (MeOH-d_{4}, 400 MHz) \delta 7.46-7.40 (m, 2H), 7.35-7.20 (m, 3H), 5.92-5.72 (m, 1H), 5.08-4.93 (m, 2H), 4.76 (d, 1H, J=11.8 Hz), 4.65 (d, 1H, J=11.8 Hz), 4.38 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.28 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.02 (d, 1H, J=2.9 Hz), 3.95-3.63 (m, 6H), 3.61-3.48 (m, 4H), 3.43-3.20 (m, 3H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.78-1.65 (m, 2H); ^{13}C NMR (MeOH-d_{4}, 100 MHz) \delta 139.77, 139.47, 129.29, 129.08, 128.64, 115.19, 105.02, 104.23, 82.17, 80.74, 76.88, 76.40, 76.35, 74.71, 72.55, 71.81, 70.23, 67.02, 62.44, 61.91, 31.22, 30.07. FAB-HRMS calc. para C_{24}H_{36}O_{11}Na^{+}; 523.2155. Encontrado; 523.2137.

El 3'-O-bencil éter (0.6 g, 1.20 mmol) se disolvieron en acetonitrilo y DMF (5:2, 7 mL), y se adicionaron banzaldehido dimetilacetal (0.47 mL, 3.1 mmol) y CSA (14 mg, 60 Pmol). Después de la agitación 16 h a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con NaHCO_{3} saturado. Los extractos orgánicos se secaron (MgSO_{4}), se evaporaron, y se siguió con la adición de éter (100 mL) al residuo resultante, el puro 20 se recuperó por filtración (0.51 g, 72%): [\alpha]_{22}^{D} +111º (c 2.21, MeOH); IR (CHCl_{3} película) 3440, 2872, 1368, 1163, 1109, 1048, 1005 cm^{-1}; ^{1}H NMR (MeOH-d_{4}, 400 MHz) \delta 7.55-7.11 (m, 10H), 5.82-5.69 (m, 1H), 5.45 (s, 1H), 4.98-4.83 (m, 2H), 4.64 (d, 2H, J=3.0 Hz), 4.40 (d, 1H, J=7.9 Hz), 4.23 (d, 1H, J=3.4 Hz), 4.18 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.15-3.98 (m, 2H), 3.87-3.66 (m, 4H), 3.55-3.10 (m, 7H), 2.20-2.10 (m, 2H), 1.65-1.53 (m, 2H); ^{13}C NMR (MeOH-d_{4}, 100 MHz) \delta 139.76, 139.49, 139.47, 129.86, 129.30, 129.07, 129.03, 128.72, 127.35, 115.19, 104.69, 104.28, 102.03, 80.63, 80.17, 7637, 76.28, 74.77, 74.73, 72.84, 70.86, 70.25, 68.17, 61.70, 31.22, 30.07. FAB-HRMS calc. para C_{31}H_{40}O_{11}Na^{+}; 611.2468. Encontrado; 611.2465.

Tent-4-enil 2,2',3,3',6,6'-hexa-O-bencil-\beta-D-lactósido (21). El tetraol 20 (0.51 g, 0.87 mmol) y Et_{4}NI (0.12 g, 0.43 mmol) se secaron (destilación azeotrópica con benceno), se disolvió en DMF (5 mL) y se enfrió a 0ºC. Se le adicionó bencil bromuro (0.83 mL, 7.0 mmol) seguido por NaH (0.22 g, 60%, 5.6 mmol) y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante 14 h. La mezcla se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua, la capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. La purificación del residuo por cromatografía sobre silica gel (4:1\rightarrow2:1 hexanos:acetato de etilo) dio pentabencil lactósido puro como una espuma de color blanco (0.80 g, 97%): [\alpha]_{22}^{D} +129º (c 1.63, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3030, 2866, 1453, 1365, 1096, 1063, 1028, 911 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.50-7.05 (m, 30H), 5.80-5.65 (m, 1H), 5.38 (s, 1H), 5.10 (d, 1H, J=10.6 Hz), 4.99-4.60 (m, 9H), 4.47 (d, 1H, J=12.1 Hz), 4.38 (d, 1H, J=7.8 Hz), 430 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.25 (d, 1H, J=12.1 Hz), 4.12 (d, 1H, J=13 Hz), 3.94 (d, 1H, J=3.4 Hz), 3.92-3.60 (m, 6H), 3.54 (dd, 1H, J=8.8 Hz, 9.2 Hz), 3.46 (dd, 1H, J=2.6 Hz, 7.0 Hz), 3.40-3.23 (m, 3H), 2.85 (s, 1H), 2.22-2.00 (m, 2H), 1.75-1.60 (m, 2H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 138.92, 138.63, 138.51, 138.04, 128.80, 128.52, 128.31, 128.24, 128.17, 128.13, 128.06, 128.03, 128.00, 127.69, 127.65, 127.54, 127.49, 127.38, 127.30, 126.52, 114.84, 103.59, 102.83, 101.30, 83.01, 81.81, 79.60, 78.76, 77.65, 75.73, 75.22, 75.05, 74.97, 73.61, 72.91, 71.56, 69.27, 68.90, 68.27, 66.28, 30.18, 28.89, FABHRMS calc. para C_{59}H_{64}O_{11}Na^{+}; 971.4346. Encontrado; 971.4375.

El bencilideno (0.63 g, 0.66 mmol) se disolvió en THF (6.6 mL) y se agita con 4\ring{A}MS activado recientemente (0.25 g) 10 min a temperatura ambiente. En una porción de NaCNBH_{3} (0.21 g, 3.3 mmol) se le adicionó seguido por HCl anhidro (2.0 M Et_{2}O), gota a gota hasta que la mezcla no burbujeara más (approx. 2 mL). Después de la agitación y 10 min adicionales, la mezcla se paso a través de un tapón de Celite lavando con acetato de etilo, el filtrado se lavó con NaHCO_{3} saturado y salmuera, se secó (MgSO_{4}) y las capas orgánicas se evaporaron. La purificación por cromatografía de columna (9:1 hexanos:acetato de etilo) dio 21 puro como sólido de color blanco (0.49 g, 79%): [\alpha]_{22}^{D} +200º (c 1.05, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3474, 3062, 3029, 2869, 1453, 1364, 1094, 1028 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.40-7.06 (m, 30H), 5.80-5.66 (m, 1H), 5.02-4.85 (m, 3H), 4.81 (d, 1H, J=11.0 Hz), 4.75-4.54 (m, 6H), 4.67 (d, 1H, J=12.2 Hz), 4.42-4.26 (m, 5H), 3.94 (s, 1H), 3.92-3.81 (m, 2H), 3.71 (dd, 1H, J=10.7 Hz, 4.1 Hz), 3.64 (d, 1H, J=10.6 Hz), 3.57 (dd, 1H, J=9.4 Hz, 5.5 Hz), 3.55-3.42 (m, 3H), 3.38 (dd, 1H, J=5.2 Hz, 9.6 Hz), 3.36-3.21 (m, 4H), 2.32 (s, 1H), 2.15-2.02 (m, 2H), 1.74-1.60 (m, 2H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 139.04, 138.54, 138.52, 138.23, 138.09, 137.96, 137.81, 128.33, 128.15, 127.93, 127.66, 127.50, 114.80, 103.50, 102.43, 82.79, 81.68, 80.99, 79.27, 76.52, 75.22, 75.10, 74.99, 74.83, 73.37, 72.99, 72.67, 71.86, 69.10, 68.32, 68.16, 66.00, 30.11, 28.83. FAB-HRMS calc. para C_{59}H_{66}O_{11}Na^{+}; 973.4503. Encontrado; 973.4513.

Donante \alpha-Fluoro (23). Una solución de 3-O-PMB-4,6-Di-O-bencil-galactal (2.24 g, 5.02 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml) bajo N_{2} a 0ºC fue tratado con dimetildioxirano (0.11 M, 47 ml), y la mezcla se agitó hasta que todo el glical se consumió (-1 h, TLC EtOAc 30% en hexano) Nota: Elevada temperatura y/o exceso de DMDO impulsará la oxidación del grupo PMB y de la producción más baja de la reacción. Los solventes se evaporaron bajo vacío a 0ºC y el residuo se mantuvo bajo alto vacío. El frasco que contiene el epóxido galactal se cargó con tamiz molecular 4 \ring{A} preparado recientemente (2 g), THF seco (50 ml) y se enfrió a 0ºC. El complejo HF/Pyr (0.79 ml, -5 equiv.) se adicionó gota a gota por medio de una jeringa. La mezcla de reacción se dejó durante la noche para que alcanzara la temperatura ambiente lentamente y se apagó con Et_{3}N (1.27 g, - 2.5 equiv.) para alcanzar un pH - 7. La mezcla se filtró a través de una almohadilla de MgSO4 anhidro y se enjuago tres veces con 50 ml de EtOAc. El filtrado se lavó con agua (50 ml) y solución saturada de NaHCO_{3} (50 ml), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró a sequedad. cromatografía de columna instantánea (EtOAc/hexanos, 2/1) dio 2.06 g de fluorohidrin (85% de producción) como una mezcla de anómeros \alpha:\beta=10:1. ^{19}F NMR (CDCl_{3}, 376 MHz, C_{6}F_{6} como estándar externo) \delta 9.7 (dd, \alpha, J=54.4, 25.0 Hz) 20.0 (dd, \beta, J=53.9, 13.1 Hz); ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.38 - 7.24 (m, 12H), 6.90 (d, 2H, J=8.7 Hz), 5.70 (dd, 1H, J=54.4, 2.8 Hz), 4.89 y 4.57 (dos d, 2H, J=11.3 Hz), 4.70 y 4.54 (AB q, 2H, J=11.2 Hz), 4.54 y 4.46 (AB q, 2H, J=11.8 Hz), 4.17 (AMX octet, 1H, J=2.8, 10.1, 25.0 Hz), 4.13 (br t, 1H, J=6.8 Hz), 4.06 (d, 1H, J=1.5 Hz), 3.81 (s, 3H), 3.74 (dd, 1H, J=2.6, 10.1 Hz), 3.60 (m, 2H). La mezcla de arriba (8.29 g, 17.2 mmol) se disolvieron en DMF seco (100 ml) que contiene tamiz molecular 4 \ring{A} preparado recientemente (3 g) bajo N_{2} a 0ºC, tratado con bencil bromuro (4.41 g, 25.8 mmol, 1.5 equiv.) y finalmente con NaH (1.24 g, 60% de dispersión en aceite, 30.86 mmol, 1.8 equiv.), y se agita durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se apagó con ácido acético glacial (0.93 g, 0.9 equiv.) y la mezcla se filtró a través de una almohadilla de MgSO4 anhidro con EtOAc (4x50 ml). La solución orgánica se lavó con agua (4 x 50 ml), se secó (MgSO4) y se concentró in vacuo. cromatografía de columna instantánea del residuo (hexano/EtOAc, 4/1) dio 9.36 g (95%) del compuesto de título como líquido incoloro con la misma proporción de anómeros \alpha:\beta=10:1 como el fluorohidrin inicial. ^{19}F NMR (CDCl_{3}, 376 MHz, C_{6}F_{6} como estándar externo) \delta 11.5 (dd, \alpha, J=53.7, 25.2 Hz), 22.8 (dd, \beta, J=53.4, 13.0 Hz). Para propósito analítico 50 mg de \alpha-anómero puro fue obtenido utilizando HPLC preparativa. [\alpha]_{22}^{D} -54.5º (c 0.55, CHCl_{3}); ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 500 MHz), \delta 7.38-7.24 (m. 17H), 6.88 (d, 2H, J=8.6 Hz), 5.58 (dd, 1H, J=53.7,2.7 Hz), 4.93 (d, 2H, J=11.34 Hz), 4.56 (d, 2H, J=11.34 Hz), 4.85 (AB q, 2H, J=11.78 Hz), 4.72 (AB q, 2H, J =11.78 Hz), 4.73 (AH q, 2H, J=11.3 Hz), 4.68 (AB q, 2H, J=11.3 Hz), 4.47 (AB q, 2H, J=11.84 Hz), 4.41 (AB q, 2H, J=11.84 Hz), 4.09 (br t, 1H, J=6.5 Hz), 4.02 (AMX m, 1H, J=2.7, 10.05, 25.2 Hz), 3.98 (app s, 1H), 3.92 (dd, 1H, J=2.64, 10.05 Hz), 3.81 (s, 3H), 3.54 y 3.52 (ABX m, 2H, J=9.3, 6.05, 7.0 Hz); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 125 MHz) \delta 159.20, 138.35, 138.08, 137.71, 130.43, 129.18, 128.39, 128.25, 128.14, 127.92, 127.8, 127.78, 127.66, 113.81, 106.25 (d, J=229.0 Hz), 78.09, 75.65 (d, J=23.5 Hz), 74.79 (ArCH_{2}), 74.29, 73.70 (ArCH_{2}), 73.45 (ArCH_{2}), 72.71 (ArCH_{2}), 71.70 (d, J=2.7 Hz) 68.26, 55.24 (CH_{3}O); MS (NH_{3}) 586 ([M+NH_{4}]^{+}).

Trisacárido PMB (24). Una mezcla de lactósido (21) (402 mg, 0.423 mmol) y fluoro donante (23) (485 mg, 0.846 mmol, 2 equiv.) formó el azeótropo con benceno anhidro (3x10 ml) y adicionalmente se secó con alto vacío por 3 h. La mezcla de arriba se disolvió en tolueno (3.8 ml) y se transfirió vía cánula a un frasco que contiene tamiz molecular 4 \ring{A} preparado recientemente (0.68 g) bajo N_{2}, tratado con 2,6-di-ter-butilpiridina (143 \mul) y enfriada a -20ºC.
(Cp)_{2}Zr(OTf)2 (225 mg, 0.381 mmol, 0.9 equiv.) se suspendió en THF (0.38 ml) y se adicionó vía una cánula a la mezcla de reacción. La reacción se agitó por 72 h a 7ºC en oscuridad. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (10 ml) y se filtró a través de una almohadilla de MgSO_{4} anhidro con EtOAc (3x 10 mL). El filtrado se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 10 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se concentró a sequedad. La cromatografía instantánea de columna (2% Et_{2}O/CH_{2}Cl_{2}) dio 509 mg (80%) del deseado \alpha-producto (24) y 51 mg (8%) de \beta-producto. [\alpha]_{22}^{D} +24.6º (c 3.90, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3062, 3029, 2919, 2868, 1612, 1513, 1496, 1364, 1303, 1248, 1028 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.40-6.95 (m, 49 H), 6.69 (d, 1H, J=8.5 Hz), 5.73 (m, 1H), 5.00-4.93 (m, 2H), 4.92-4.84 (m, 2H), 4.82-4.73 (m, 2H), 4.72-4.63 (m, 5H), 4.61 (d, 1H, J=13.0 Hz), 4.48-4.35 (m, 5H), 4.34-4.24 (m, 4H), 4.16 (d, 2H, J=6.8 Hz), 4.07 (dd, 1H, J=8.8 Hz), 4.02-3.80 (m, 8H), 3.78-3.60 (m, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.60-335 (m, 6H), 3.35-3.18 (m, 4H), 3.12-3.04 (m, 1H), 2.06 (m, 2H), 1.65 (m, 2H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 158.76, 139.66, 139.45, 139.26, 139.16, 139.09, 138.92, 138.57, 138.52, 131.39, 129.30, 128.95, 128.70, 128.60, 129.30, 128.08, 127.95, 115.35, 114.02, 104.05, 103.35, 101.25, 83.14, 82.17, 79.91, 79.71, 77.77, 77.04, 75.69, 75.58, 75.46, 75.33, 74.17, 73.75, 73.54, 73.48, 72.65, 72.54, 69.91, 69.71, 68.80, 68.33, 68.19, 55.11, 30.14, 28.86; FAB-HRMS calc. para C_{94}H_{102}O_{17}Na^{+}; 1525.7014. Encontrado; 1525.6996.

Trisacárido aceptor (25). Una solución de trisacárido PMB (24) (445 mg, 0.296 mmol) en cloruro de metileno (10 ml) a 0ºC fue tratado con solución reguladora de fosfato (1.5 ml, pH=7.4) y DDQ (89 mg, 1.3 equiv.) y se agitó a 0ºC por 5 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (50 ml), se lavó con solución saturada de NaHCO_{3} (2 x 20 ml) y agua (20 ml), se secó sobre MgSO_{4}, y se concentró a sequedad. El material crudo se purificó por cromatografía de columna instantánea (4% de éter en cloruro de metileno) para dar el 344 mg (84%) de trisacárido desprotegido (25) como un aceite incoloro. [\alpha]_{22}^{D} +28.2º (c 5.70, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3570, 3062, 3029, 2913, 2868, 1496, 1453, 1364, 1208, 1095 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.77-7.06 (m, 45H), 5.73 (m, 1H), 5.01 (dd, 1H, J=5.5, 3.3 Hz), 4.95 (dd, 1H, J=5.8, 2.6 Hz), 4.90 (m, 1H), 4.78 (d, 1H, J=10.9 Hz), 4.75 (d, 1H, J=11.4 Hz), 4.70-4.59 (6d, 6H), 4.47-4.37 (m, 5H), 4.28 (m, 3H), 4.19 (s, 2H), 4.08-3.91 (m, 6H), 3.85 (m, 2H), 3.69 (m, 5H), 3.66 (1H, d, J=11.0 Hz), 3.50-3.19 (m, 9H), 3.10 (dd, 1H), 2.07 (m, 2H), 1.79 (d, 1H, OH), 1.65 (d, 2H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 139.36, 138.72, 138.63, 138.52, 138.41, 138.29, 138.19, 138.07, 137.98, 128.35, 128.20, 128.06, 127.97, 127.66, 127.54, 127.08, 114.82, 103.55, 102.67, 99.58, 82.93, 81.67, 81.55, 79.32, 77.61, 76.90, 75.13, 75.02, 74.96, 74.80, 73.08, 72.99, 72.91, 72.01, 69.95, 69.22, 69.15, 68.34, 67.73, 67.57, 60.35, 30.19, 28.92; FAB-HRMS calc. para C_{86}H_{94}O_{16}Na^{+}; 1405.6439. Encontrado; 1405.6385.

Hexasacárido (29). El donante tioetil 28 (543 mg, 0.425 mmol) y aceptor 25 (587 mg, 0.425 mmol) se combinaron, formaron el azeótropo con benceno anhidro (5x5 mL) se coloca bajo alto vacio por 5 horas. La mezcla luego se disolvió en 3.5 mL CH_{2}Cl_{2} y 7.0.mL de Et_{2}O, tratado con tamiz molecular preparado recientemente y se enfrió a 0ºC. El Metil triflato (3.0 equiv., 144 \muL) se adicionó en una porción y la reacción se agitó a 0ºC por 3 horas. Otros 144 \muL de MeOTf se adicionaron y la reacción se dejó agitar por un adicional de 2 horas a 5ºC. La reacción se apagó por la adición de NaHCO_{3} sólido, se filtró a través de Celite con EtOAc, se concentró y purificó por HPLC (17% EtOAc/hexanos) para dar 663 mg (60%) de hexasacárido como una espuma de color blanco. [\alpha]_{22}^{D} -9.7º (c 1.00, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 3533, 3343, 3087, 3030, 2940, 2865, 1790, 1496, 1453, 133, 1095 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.76 (d, 2H, J=7.5 Hz), 7.45-7.00 (m, 63H), 5.84 (m, 1H), 5.20 (s, 1H), 5.11 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.09 (d, 1H, J=3.6 Hz), 5.05 (d, 1H, J=3.3 Hz), 5.03 (m, 1H), 4.92 (m, 2H), 4.86 (d, 1H, J=6.0 Hz), 4.82 (m, 2H), 4.78 (1H, d, J=2.2 Hz), 4.74-4.61 (m, 8H), 4.53-4.44 (4d, 4H), 4.38-4.30 (m, 4H), 4.18-3.82 (m, 20B). 3.76-3.66 (m, 5H), 3.66-3.60 (m, 2H). 3.58-3.52 (m, 2H), 3.48-3.40 (m, 2H), 3.38-3.32 (m, 2H), 3.29-3.25 (m, 3H), 3.06 (dd, 1H, J=10.2 Hz), 2.86 (s, 1H), 2.74 (m, 1H), 2.16 (m, 2H), 1.74 (m, 2H), 1.23 (s, 3H, J=6.5 Hz), 1.16-1.07 (m, 42H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 155.49, 140.71, 139.37, 138.96, 138.72, 137.70, 138.66, 138.55, 138.42, 138.37, 138.10, 138.07, 138.04, 137.88, 132.07, 128.89, 128.64, 128.50, 128.27, 128.16, 128.04, 127.86, 127.68, 127.53, 127.34, 127.20, 114.79, 103.49, 103.14, 102.61, 99.63, 99.12, 97.79, 82.26, 81.61, 81.34, 80.45, 79.36, 78.95, 78.26, 77.82, 77.64, 77.45, 77.24, 77.16, 76.83, 76.45, 75.39, 75.23, 75.12, 74.98, 74.89, 74.78, 73.94, 73.13, 72.94, 72.92, 72.52, 71.91, 71.81, 71.25, 71.11, 69.35, 69.23, 69.18, 68.18, 68.11, 68.01, 67.77, 67.54, 61.98, 61.72, 56.03, 30.16, 28.88, 18.01, 18.00, 17.95, 17.92, 11.85, 11.82; LRMS (FAB) calc. para C_{150}H_{185}NO_{32}SSi_{2}Na^{+}2624.

Peracetato de globo-H pentenil glucósido (30). A una solución del hexasacárido (585 mg, 0.224 mmol) en THF (10 mL) se le adicionó TBAF (1.0 M THF, 10 equiv., 2.24 mL). La reacción se agita a rt por 3 días, se vertió en agua helada y se extrajo con EtOAc (3x50 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con NaHCO_{3} saturado (50 mL) y salmuera (50 mL), se secó sobre MgSO_{4} y se concentró en un aceite que se purificó a través de un tapón pequeño de silica gel con EtOAc. El triol resultante se disolvió en MeOH anhidro (8 mL) y se le adicionó metóxido de sodio (0.25 mL de a 25% solución en MeOH). La reacción se agitó a rt por 18 horas, se neutralizó con Dowex-H^{+}, se filtró con lavados de MeOH y se concentró. Al sólido de color blanco resultante se le adicionó THF (2.0 mL) y NH_{3} condensado líquido (\sim25 mL) a -78ºC. Se le adicionó sodio (\sim500 mg) y la solución azul resultante se agita a -78ºC por 2 horas. La reacción se apagó con MeOH anhidro (\sim10 mL), se llevo a rt y se concentró bajo una corriente de N_{2} seco a un volumen de \sim5 mL. La reacción se neutralizo con Dowex-H^{+}, se filtró con lavados de MeOH y se concentró a un sólido de color blanco. El sólido de color blanco se disolvió en 5.0 mL piridina y 5.0 mL CH_{2}Cl_{2} y se enfrió a 0ºC. Un cristal de DMAP se le adicionó seguido por anhídrido acético (5.0 mL). El baño de hielo se retiró y la reacción se agita a rt durante la noche. La concentración seguida por purificación mediante cromatografía de columna instantánea (gradiente de elución 75% EtOAc/hexanos \rightarrow 100% EtOAc \rightarrow 5% MeOH/EtOAc) dio 168 mg (42%) de 30 como un sólido de color blanco: [\alpha]_{22}^{D} 4.37º (c 1.85, CHCl_{3}); IR (CHCl_{3} película) 2939, 1747, 1370, 1229, 1066 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 7.66 (d, 1H, J=6.5 Hz), 5.77 (m, 1H), 5.58 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.47 (d, 1H, J=3.5 Hz), 5.39 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.29 (dd, 1H, J=10.9, 3.0 Hz), 5.24-5.06 (m, 5H), 5.04-5.02 (m, 1H), 4.99-4.85 (m, 4H), 4.74 (dd, 1H, J=10.9, 2.9 Hz), 4.53-4.40 (m, 5H), 4.36 (m, 1H), 4.26 (dd, 1H, J=10.6, 3.4 Hz), 4.18-4.03 (m, 6H), 3.99-3.96 (m, 2H), 3.87-3.81 (m, 3H), 3.77-3.74 (m, 1H), 3.51-3.45 (m, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.16 (s, 3H), 2.15 (s, 3x3H), 2.13-2.11 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.08 (s, 2x3H), 2.08 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 2x3H), 2.00 (s, 3H), 1.97 (s, 2x3H), 1.89 (s, 3H), 1.65 (m, 2H), 1.62 (s, 3H), 1.14 (d, 3H, J=6.5 Hz); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 172.31, 171.55, 170.78, 170.61, 170.57, 170.48, 170.41, 170.30, 170.08, 169.75, 169.61, 169.57, 169.44, 168.96, 137.76, 115.07, 102.05, 101.29, 100.45, 99.23, 98.74, 9429, 77.24, 77.16, 76.07, 73.68, 73.40, 73.17, 72.63, 72.34, 71.85, 71.77, 71.56, 71.34, 70.83, 70.71, 70.19, 70.08, 69.32, 69.03, 68.88, 68.09, 68.01, 67.59, 67.32, 64.48, 29.80, 28.54, 23.12, 20.90, 20.88, 20.82, 20.74, 20.73, 20.72, 20.71, 20.64, 20.62, 20.55, 20.54, 20.49, 15.91; FAB-HRMS calc. para C_{77}H_{107}NO_{47}Na^{+};1820.5911. Encontrado; 1820.5994.

Globo-H, pentenil glucósido (16c). El peracetato (20 mg, 0.011 mmol) se disolvió en MeOH anhidro (2.0 mL) y se le adicionó 100 \muL de metóxido de sodio (25% solución en MeOH). La reacción se agita a rt por 18 horas, se neutralizo con Dowex-H^{+} (\simpH 6-7), se filtró con lavados de MeOH, se concentró y se purificó utilizando silica gel RP (H_{2}O \rightarrow 1% MeOH/H_{2}O) luego Gel P-2 (eluente H_{2}O) para producir 12 mg (99%) de un sólido de color blanco. [\alpha]_{22}^{D} 3.00º (c 1.00, MeOH); IR 3374, 2930, 1641, 1372, 1070 cm^{-1}; ^{1}H NMR (MeOH, 400 MHz) \delta 5.79 (m, 1H), 5.18 (d, 1H, J=3.9 Hz), 4.98 (dm, 1H, J=7.2 Hz), 4.91 (m, 1H), 4.87 (m, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.49 (d, 1H, J=1.4 Hz), 4.41-4.36 (m, 2H), 4.24-4.20 (m, 4H), 4.10 (d, 1H, J=2.5 Hz), 4.06-4.00 (m, 3H), 3.94 (s, 1H), 3.87-3.45 (m, 22H), 3.35-3.31 (m, 2H), 3.19 (t, 1H, J=8.8 Hz), 2.10 (m, 2H), 1.96 (s, 3H), 1.66 (m, 2H), 1.19 (d, 3H, J=6.5 Hz); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 174.53, 139.53, 115.27, 105.50, 105.44, 104.30, 103.96, 102.81, 101.07, 81.29, 80.59, 80.04, 79.16, 78.00, 76.81, 76.57, 76.49, 76.45, 76.39, 75.57, 74.89, 74.69, 73.58, 72.64, 72.49, 71.56, 70.65, 70.63, 70.38, 7031, 69.70, 68.13, 62.63, 62.59, 61.94, 61.62, 53.11, 49.90, 31.29, 30.14, 23.55, 16.76. FAB-HRMS calc. para C_{43}H_{73}NO_{30}Na^{+}; 1106.4115. Encontrado; 1106.4105.

C. Ejemplo 3

Preparación de glicoaminoácidos y glicopéptidos inventivos 1) Discusión de métodos sintéticos

En general, fue deseado para incorporar los dos antígenos descritos arriba, fucosil GM1 y globo-H en glicopéptidos. Como se muestra en la Figura 13, se contempló una transformación utilizando hidrogenación catalítica asimétrica de ésteres de amida glicosilados. La nueva estrategia anticipa una olefinación Homer-Emmons del aldehído protegido con una apropiada glicina protegida derivada de fosfonato para dar un éster de enamida. La subsiguiente hidrogenación catalítica asimétrica esperanzadoramente produciría un glicoaminoácido puro diastereoméricamente.

En solamente un ejemplo, un glicoaminoácido inventivo, fue preparado, con base en unos derivados de lactosa peracetilado. Específicamente, se preparó la lactosa requerida derivada del sustrato éster de enamida. La lactosa requerida derivada del sustrato éster de enamida se preparó de acuerdo con la Figura 14. La ozonólisis del NPG 32 (Allen et al., Chem. Eur. J. 2000, 6, 1366) seguida por estimulación reductiva dio el derivado aldehído correspondiente. El aldehído crudo luego se sometió a olefinación Homer-Emmons utilizando tetrametilguanidina y fosfonato 33. El fosfonato 33, con protección N-Boc y 2-(trimetilsilil) etil éster (TSE) (Schmidt et al., Synthesis 1984, 53; Kawai et al., Chem. Lett. 1990, 577) fue escogido debido a la necesidad para los glicoaminoácidos resultantes para ser ortogonalmente apropiados para acoplamientos péptido en la presencia de grupos protectores de acetato carbohidrato. El éster de enamida 34 fue obtenido como un isómero geométrico sólo el 88% de producción para el procedimiento de la etapa-2.

En una modalidad preferida, se detallan las condiciones para hidrogenación asimétrica de éster de enamida 34. El isómero ligando (S, S) del catalizador precursor etil DuPHOS fue utilizado, el cual ha sido bien caracterizado en estos tipos de sistemas para dar el isómero-(S) en el producto aminoácido. El glicoaminoácido protegido se obtuvo un 98% de la producción y se determinó para haber sido formado con una proporción diastereomérica (dr) de >20:1. Notablemente, los protones t-Boc son casi línea base resuelta y, en la reacción asimétrica, el isómero menor no podría ser detectado. El análisis de 13C también apoya la conclusión que el isómero menor no se forma dentro del límite de la detección NMR. La hidrogenación de 34 con un catalizador aquiral (Pd/C, MeOH) produjo una mezcla 1:1 de R y S configurados 35, proporcionando una comparación para la determinación de la proporción diastereomérica. Esta reacción también indica que la transferencia de quiralidad para producir 35 ocurre desde el ligando quiral y no deriva el carbohidrato del sustrato control. Una etapa final para ser realizada previa al movimiento para síntesis y ensamble de antígenos tumorales fue aquella de demostración de la capacidad de desprotección de los grupos de bloqueo contenido en la cadena lateral del aminoácido. En el evento, la reacción de 35 con TBAF en THF dio el ácido 36, preparado convenientemente para el acoplamiento del péptido, en una producción del 93%.

Con la metodología general demostrada en el modelo de lactosa, en otras modalidades preferidas, hexasacáridos avanzados 37 y 38, así como otros antígenos de interés, se investigaron. Como se mostró en la Tabla 2, la oleafinación del n-pentenil glucósido peracetilado del Globo-H, 37, bajo las mismas condiciones como aquellas usadas en la Figura 14, proporciona el correspondiente éster de enamida 41 en una producción del 72% como un isómero sencillo y proporciona el hexasacárido fucosil GM1 16 en una producción del 10-22%. Notablemente, a través del uso del sistema catalizador (S, S)-Et-DuPHOS-Rh+, la hidrogenación de 41 y 42 continuando en una producción excelente del producto 45 y 46 como diastereómeros sencillos por análisis H NMR. Los compuestos 45 y 46 representan el primer ejemplo de glicoaminoácidos sintéticos que contienen los oligosacáridos Globo-H y fucosil GM1
complejos.

Transformaciones similares sobre otros dos antígenos prometedores clínicamente para generar sus glicoaminoácidos correspondientes también se realizaron en ciertas otras modalidades. Como se discutió previamente, el oligosacárido Lewis^{y} (Le^{y}) ha sido identificado como un importante antígeno para causar anticuerpos contra carcinomas de colon, hígado, próstata y ovarios (Lloyd et al., Am. J. Clin. Path. 1987, 87, 129; Lloyd et al., Cancer Biol. 1991, 2, 421; Yin et al., Int. J. Cancer, 1996, 65, 406). Previamente, una vacuna conjugada Le^{y} -KLH (Danishefsky et al. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 5701) y un glicopéptido agrupado Le^{y} (de configuración natural \alpha-O -ligado) glicoconjugado adherido a ya sea un glicolípido o un KLH han sido preparados, y han iniciado pruebas clínicas humanas contra cáncer de ovarios con estas vacunas se han iniciado (Kudryashov et al., Cancer Immunol. Immunother. 1998, 45, 281; Sabbatini et al., Int. J. Cancer 2000, 87, 79).

Los resultados iniciando con Le^{y} n-pentenil glucósido 39 y el \alpha-ligado n-pentenil glucósido del antígeno Tn 40 (GaINAc) son presentadas en la Tabla 2. El pentasacárido 39 fue disponible como un intermedio en la síntesis del glicopéptido Le^{y} chister y consecuentemente ilustra la ventaja potencial de su estrategia. De esta manera, si la inmunogenicidad se retiene en las construcciones artificiales, estos glicoaminoácidos derivada NPG ofrecen una ruta sintética mucho más corta para vacuna de glicoconjugados que sus homólogos nativos. Como se mostró en la Tabla 2, la olefinación de 39 y 40 fue sin incidentes y los ésteres de enamida 43 y 44 se obtuvieron en las producciones del 85% y 75% respectivamente, otra vez como isómeros sencillos. La hidrogenación asimétrica, como antes, también produjo los glicoaminoácidos puros diastereiméricamente 47 y 48 en excelentes producciones.

TABLA 2

39

Con los glicoaminoácidos como se describe arriba en cuestión, de esta manera serían deseables para generar glicopéptidos novedosos. Específicamente, en una modalidad, se proporciona, un glicopéptido novedoso que incorpora globo-H, Le^{y}, y Tn. Específicamente, el C-terminal se modifica para incluir una manipulación de conjugación para la proteína excipiente KLH. La unidad mercaptoacetamida se ha probado para ser efectiva para este propósito. Como se muestra en la Figura 15, el glicoaminoácido Tn 48 se trató con TBAF para revelar el ácido carboxílico correspondiente. El acoplamiento con un espaciador di-amino terminado en una mercaptoacetamida protegida (AcSCH_{2}C(O) (CH_{2})_{3}NH_{2}) bajo la agencia del reactivo BOP (benzotriazol-1-oxitris (dimetilamino) fosfonio hexafluorofosfato) dio la amida correspondiente en el 50% de la producción para las 2 etapas. El retiro del grupo Boc N-terminal dio la amina 49 como su sal trifluoroacetato. El siguiente antígeno, Le^{y}, se preparó para el acoplamiento mediante la reacción de 47 con TBAF para dar el ácido 50. El acoplamiento de la amina 49 con ácido Le^{y} 50, otra vez con el promotor BOP, dio El di-péptido Tn-Le^{y} 51 en el 86% de la producción. Por último, el glicoaminoácido Globo-H 45 fue tratado con TBAF para dar su ácido correspondiente 52. El retiro del grupo protector Boc en 51 seguido por el acoplamiento con ácido 52 dio el tripéptido Tn-Le^{y}-Globo-H en el 64% de producción. Finalmente, el grupo Boc N-terminal se retiró y la amina resultante capsulada como su acetato para dar el tripéptido 53 en el 95% de la producción. Con todos los componentes en lugar, los grupos protectores éster se eliminaron con hidrazina en metanol desgasificado para dar el glicopéptido desprotegido completamente 54 (Figura 16) en excelente producción. Como se discute abajo, los glicopéptidos inventivos preparados como se detalla en esta también pueden ser conjugados a una proteína excipiente o lípido apropiados.

2) General Experimental

Los catalizadores DuPHOS-Rh+ se adquirieron de Strem Chemical Co., Newburyport, MA. Todos los otros materiales comerciales (adquiridos de Aldrich-Sigma) se utilizaron sin purificación adicional. Los siguientes solventes se obtuvieron de un sistema de solvente seco (pasado a través de una columna de alúmina): THF, dietil éter (Et_{2}O), CH_{2}Cl_{2}, tolueno y benceno. Todas las reacciones se llevaron a cabo bajo una atmósfera de N_{2} seco, a menos que se indique de otra forma. Los espectros NMR (^{1}H y ^{13}C) se registraron en un Bruker AMX-400 MHz o Bruker Advance DRX-500 MHz y referenciados al solvente residual a menos que se indique de otra forma. El espectro IR se registró con un espectrómetro Perkin-Elmer 1600 series-FTTR y la rotaciones ópticas se midieron con un polarímetro digital Jasco DIP-370 utilizando una celda de longitud de la senda de 10-cm. Los análisis espectrales de masas de baja resolución se llevaron a cabo con un espectrómetro de masas JOEL JMS-DX-303 HF. La TLC analítica se llevo a cabo sobre placas F254 de silica gel 60 E. Merck y la cromatografía de columna instantánea se realizó utilizando los solventes indicados sobre silica gel 60 (40-63 mm) E. Merck o silica gel (10-40 mm).Sigma H-tipo

Procedimiento para la síntesis de 40 (como se muestra en la Figura 17)

Donante tricloroacetimidato. La mezcla de azidonitratos como se muestra en la Figura 17 (1.66 g, 4.41 mmol) se disolvió en CH_{3}CN (15 mL) y se enfrió a 0ºC. A la solución de agitación se le adicionó base de Hunig (1.2 equiv., 0.925 mL) y benceno-tiol (3.0 equiv., 1.35 mL). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC por 1 hora y el baño de hielo se retiró. Después de 1 hora adicional a temperatura ambiente, la reacción se concentró bajo una corriente de nitrógeno seco. El material resultante se disolvió en una cantidad mínima de CHCl_{3} y se sometió a cromatografía de columna instantánea (50% EtOAc/hexanos) para producir los hemiacetales (1.41, 97%). (Nota 1: realizar esta instantánea en cabina, Nota 2: aislar ambos anómeros, que se separan en TLC/instantánea). La mezcla de hemiacetales (1.41 g mg, 4.25 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (8.5 mL) y se adicionó tricloroacetonitrilo (4.25 mL), seguido por K_{2}CO_{3} (5.0 equiv., 2.93 g). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y se filtró a través de un tapón de celite con adicional cloruro de metileno. La concentración de la capa orgánica, seguida por una cromatografía de columna instantánea (10->25% EtOAc/hexanos) dio el \beta-trichloroacetimidato (1.30 mg, 77%) como un aceite de color amarillo. (Nota: \alpha-anómero eluye primero, luego el \beta-anómero).

Pentenil glucósido de \alpha-Tn. El donante-TCA como se muestra en la Figura 17 (1.30 g, 2.72 mmol) se disolvió en THF (0.2M, 13.6 mL) y alcohol pentenil (5.0 equiv., 1.2 mL) y se enfrió a -10ºC (acetona-baño de hielo). Una porción de TMSOTf (0.1 equiv., 0.049 mL) se adicionó y la reacción se agitó por 1 hora. Se adicionó NaHCO_{3} sólido y la reacción se filtró a través de celite, se concentró y se sometió a cromatografía de columna instantánea (25% EtOAc/hexanos). (Nota 1: Los anómeros diastereoméricos no se separan. Su proporción se determina por ^{1}H NMR. Nota 2: Los materiales iniciales y productos co-eluyen por TLC - gradiente TLC (10% primero, luego 50%) puede ser utilizado para visualizar el progreso de la reacción.) Los glucósidos aislados se trataron en 10 mL de AcSH y se agitaron a rt por 2 días. La evaporación del solvente por una corriente de nitrógeno seco seguido por una cromatografía de columna instantánea (5% acetona/tolueno \rightarrow 10% acetona/tolueno) dio 620 mg del \alpha-glucósido (55%) y una cantidad indeterminada de \beta-glucósido. (Nota: mezclas de Acetato de etilo/hexanos también separarán los anómeros, pero la mezcla acetona/tolueno se determinó por ser mejor.)

Procedimiento General por olefinación, 41. La preparación de enamida 41 (Globo-H) es representativa de este procedimiento. El n-pentenil glucósido 37 (58 mg, 0.0322 mmol) se disolvió en 10:10:1 MeOH: CH_{2}Cl_{2}: piridina (3 mL, típicamente 0.05 M-0.01 M) y se enfrió a -78ºC. Una corriente de ozono seco se paso a través de la mezcla de reacción hasta un persitente color azul claro. La fuente de ozono se retiró y la reacción se agitó a -78ºC por 15 minutos adicionales, durante este tiempo una corriente de nitrógeno seco se aplicó para retirar el exceso de ozono. Se adicionó sulfuro de dimetilo (50 equivs, 0.118 mL) a la mezcla fria, el baño de hielo se retiró y la reacción se dejó agitar por 4 horas. La reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (10 mL), se lavó con agua (50 mL), y se extrajo otra vez con adicional CH_{2}Cl_{2} (2x10 mL). La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO_{4} anhidro y se concentró. El aldehído crudo no se purifico típicamente, pero formó el azeótropo seco con benceno anhidro (3x3 mL) y se utilizó directamente en la siguiente etapa.

Fosfonato 33 (1.20 equivs., 14 mg) se disolvieron en THF anhidro (03 mL), se enfría a -78ºC y tetrametil guanidina (TMG) (1.25 equivs, 0.005 mL) se le adicionó gota a gota. La reacción se agita a -78 por 30 minutos, seguido por la adición del aldehído crudo (0.0322 mmol) en THF adicional (2x0.3 mL, típicamente 0.1-0.01 M volumen de reacción total). La reacción se dejó agitar a rt durante la noche (10-15h), se extrajo con EtOAc (10 mL), se lavó con 0.05 M HCl acuoso (50 mL) y de nuevo se extrajo con adicional EtOAc (2x10 mL). (Nota: Todo el TMG debe ser retirado previo a la hidrogenación asimétrica). La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO_{4}, se concentró y purificó por cromatografía de columna instantánea (75% EtOAc/hexanos \rightarrow 100% EtOAc) para producir el deseado éster de enamida 41 como un isómero sencillo. 72%, espuma de color blanco; R_{f} 0.85 (100% EtOAc); IR (CDCl_{3} película) 3373, 2956, 2951, 1748, 1370, 1069 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 6.65 (d, 1H, J=6.4 Hz), 6.44 (m,1H), 6.07 (bs, 1H), 5.56 (d, 1H, J=3.1 Hz), 5.44 (d, 1H, J=3.4 Hz), 5.37 (d, 1H, J=3.3 Hz), 5.27 (dd, 1H, J=10.9, 3.0 Hz), 5.22 (d, 1H, J=2.6 Hz), 5.20-5.17 (m, 2H), 5.15 (d, 1H, J=2.1 Hz), 5.13 (d, 1H, J=4.9 Hz), 5.09 (dd, 1H, J=10.7, 7.3 Hz), 5.03 (ad, 1H, J=11.1, 3.3 Hz), 4.96 (dd, 1H, J=9.6, 3.5 Hz), 4.92 (dd, 1H, J=11.2, 3.4 Hz), 4.85 (dd, 1H, J=9.6, 8.0 Hz), 4.73 (dd, 1H, J=10.9, 2.5 Hz), 4.50-4.38 (m, 6H), 4.34 (t, 1H, J=6.2 Hz), 4.26-421 (m, 3H), 4.16-4.02 (m, 8H), 3.98 (d, 1H, J=2.0 Hz), 3.94 (t, 1H, J=6.4 Hz), 3.86-3.72 (m, 6H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.48-3.46 (m, 1H), 2.94-2.89 (m, 1H), 2.17-2.14 (m, 1H), 2.11-2.08 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.038 (s, 3H), 2.033 (s, 6H), 1.99 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.967 (s, 3H), 1.962 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.92 (s, 9H), 1.89 (s, 3H), 1.857 (s, 3H), 1.854 (s, 3H), 1.78 (s, 3H), 1.63-1.59 (m, 2H), 1.34 (s, 9H), 1.04 (d, 3H, J=6.5 Hz), 0.93-0.90 (m, 2H), -0.06 (s, 9H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 125 MHz) \delta 172.20, 171.44, 170.94, 170.65, 170.52, 170.48, 170.44, 170.36, 170.29, 170.21, 170.17, 169.97, 169.63, 169.49, 169.31, 168.85, 164.78, 153.19, 134.70, 126.80, 102.35, 101.99, 101.26, 100.25, 99.12, 998.66, 94.21, 80.24, 76.88, 75.98, 73.61, 73.36, 73.08, 72.80, 72.56, 72.37, 71.81, 71.68, 71.46, 71.28, 70.78, 70.69, 70.67, 70.37, 70.06, 70.01, 68.92, 68.82, 67.99, 67.95, 67.54, 67.28, 66.94, 64.42, 62.14, 61.67, 61.29, 61.09, 60.92, 56.16, 28.12, 27.98, 24.52, 23.80, 23.03, 20.81, 20.73, 20.70, 20.68, 20.64, 20.60, 20.59, 20.54, 20.46, 20.40, 17.37, 17.24, 15.85, 15.48, 14.01, -1.58; HRMS (FAB) calc. Para C_{88}H_{128}N_{2}O_{51}SiNa 2079.7145, encontrado 2079.7174.

Enamida Lactosa 34. 88%, espuma de color blanco; R_{f} 0.45 (66% EtOAc/hexanos); IR (CDCl_{3} película) 3407, 3146, 2954, 2898, 1752, 1654, 1233, 1167, 1055 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 6.34 (m, 1H), 6.03 (bs, 1H), 5.22 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.07 (t, 1H, J=9.4 Hz), 4.99 (dd, 1H, J=10.3, 7.9 Hz), 4.83 (dd, 1H, J=10.5, 3.3 Hz), 4.77 (t, 1H, J=9.3 Hz), 4.37-4.33 (m, 3H), 4.20-4.11 (m, 3H), 4.08-4.00 (m, 3H), 3.82-3.65 (m, 5H), 3.49-3.46 (m, 1H), 3.39-3.34 (m, 1H), 2.16-2.14 (m, 1H), 2.11-2.09 (m, 1H), 2.04 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.92 (s, 6H), 1.84 (s, 3H), 1.62-1.59 (m, 2H), 1.34 (s, 9H), 0.94-0.89 (m, 2H). 0.05 (s, 9H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 170.29, 170.21, 170.03, 169.94, 169.66, 169.50, 168.97, 164.77, 153.20, 134.70, 100.97, 100.31, 80.23, 76.17, 72.69, 72.51, 71.56, 70.87, 70.52, 68.95, 68.83, 66.47, 63.54, 61.18, 60.66, 33.81, 28.05, 27.92, 24.47, 20.73, 20.68, 20.57, 20.51, 20.39, 17.21, -1.60; HRMS (FAB) calc. Para C_{43}H_{67}NO_{21}SiNa 986.4013, encontrado 986.4029.

Enamida Lewis^{y} 43.85%, espuma de color blanco; R_{f} 0,45 (75% EtOAc/hexanos); IR (CDCl_{3} película) 3371, 2965, 2956, 1746, 1371, 1231, 1069 cm^{-1}; ^{1}H NMR(CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 7.94 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.48 (t, 1H), 7.36 (t, 2H), 6.21 (t, 1H), 5.71 (m, 1H), 538 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.29 (dd, 1H, J=10.8, 8.8 Hz), 5.22-5.19 (m, 4H), 5.05-4.78 (m, 10H), 4.43 (dd, 1H, J=14.1, 8.0 Hz), 4.36 (dd, 1H, J=9.7, 5.1 Hz), 4.27 (m, 1H). 4.15-4.30 (m, 5H), 3.86 (dd, 1H. J=10.1, 33 Hz), 3.78-3.71 (m, 3H), 3.62 (dd, 1H, J=9.8, 1.7 Hz), 330 (d, 1H, J=9.6 Hz), 3.18-3.08 (m, 1H), 3.04 (bm, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.04 (s, 6H), 2.01 (s, 3H), 1.99 (s, 9H), 1.98 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.55-1.52 (m, 2H), 1.32 (s, 9H), 1.01-1.00 (m, 6H), 0.91-0.88 (m, 2H), -0.07 (s, 9H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 172.56, 172.40, 172.28, 172.11, 172.06, 172.04, 171.87, 171.77, 171.57, 171.43, 171.20, 171.06, 166.69, 166.32, 154.76, 136.48, 135.14, 131.29, 130.76, 130.19, 127.93, 102.82, 101.83, 101.72, 97.65, 97.11, 81.66, 75.40, 74.80, 74.55, 74.32, 74.01, 72.87, 72.65, 72.35, 72.28, 71.14, 70.66, 69.73, 69.28, 69.15, 69.02, 68.34, 66.43, 65.38, 64.92, 63.36, 62.05, 61.80, 59.87, 29.66, 29.62, 29.48, 25.83, 24.02, 22.51, 22.46, 22.31, 22.14, 22.12, 22.09, 22.0o3, 18.75, 17.30, 17.00, 15.63, -0.04; HRMS calc. Para C_{79}H_{112}N_{2}O_{41}SiNa, encontrado x.

Enamida Tn 44. 75%, espuma de color blanco; R_{f} 0.80 (100% EtOAc); IR (CDCl_{3} película) 3340, 3071, 2954, 1715, 1663, 1498,1369, 1218, 1162, 1049 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 6.38 (bs, 1H), 6.15 (bs, 1H), 5.26 (d, 1H, J=2.7 Hz), 5.02 (dd, 1H, J=11.5, 3.2 Hz), 4.79 (s, 1H), 4.48-4.42 (m, 1H), 4.16-4.12 (m, 2H), 4.03 (m, 1H), 3.99-3.92 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 1H), 3.40-3.35 (m, 1H), 2.26-2.16 (m, 2H), 2.03 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.84 (s, 3H), 1.67 (s, 3H), 1.33 (s, 9H), 0.94-0.9 (m, 2H), -0.06 (s, 9H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 170.28, 170.11, 170.06, 164.70, 134.6, 108.73, 97.26, 80.31, 67.95, 67.05, 66.35, 63.51, 61.67, 47.46, 27.87, 27.49, 22.78, 20.43, 17.05, -1.74; HRMS (FAB) calc. Para C_{30}H_{51}N_{2}O_{13}SiNa 675.3160, encontrado 675.3124.

Fucosil GM1 Enamida 42. 10-22%; R_{f} 0.25 (10%MeOH/EtOAc); ^{1}H NMR (MeOH, 500 MHz) \delta 7.94 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.48 (t, 1H), 7.36 (t, 2H), 6.21 (t, 1H), 5.71 (m, 1H), 538 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.29 (dd, 1H, J=10.8, 8.8 Hz), 5.22-5.19 (m, 4H), 5.05-4.78 (m, 10H), 4.43 (dd, 1H, J=14.1, 8.0 Hz), 436 (dd, 1H, J=9.7, 5.1 Hz), 4.27 (m, 1H), 4.15-4.03 (m, 5H), 3.86 (dd, 1H, J=10.1, 3.3 Hz), 3.78-3.71 (m, 3H), 3.62 (dd, 1H, J=9.8, 1.7 Hz), 3.39-337 (m, 1H), 3.30 (bd, 1H, J=9.6 Hz), 3.18-3.08 (m, 1H), 3.04 (hm, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.04 (s, 6H), 2.01 (s, 3H), 1.99 (s, 9H), 1.98 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.5-1.52 (m, 2H), 1.32 (s, 9H), 1.01-1.00 (m, 6H), 0.91-0.88 (m, 2H), -0.07 (s, 9H).

Procedimiento general para hidrogenación asimétrica. Bajo una atmósfera inerte desoxigenada, [(COD) Rh-((S, S)-Et-DuPHOS)]+OTf (0.005 mmol, 5 mol%) y el deseado éster de enamida (0.100 mmol) se disolvió en THF anhidro desoxigenado (10 mL, 0.01 M) en un tubo Fischer-Porter. El recipiente de reacción se presurizó con 50 psi de H_{2} después tres ciclos vacío/H_{2} y se agitó a 25ºC por 24-36 horas, o hasta que la reacción viró de color naranja suave a marrón. El recipiente se despresurizó, la mezcla se concentró y purificó a través de un tapón pequeño de silica gel para producir el glicoaminoácido.

Lactosa glicoaminoácido 35. 98%; R_{f} 0.45 (66% EtOAc/hexanos); ^{1}H NMR (C_{6}D_{6}, 500 MHz) \delta 5.54 (dd, 1H, J=10.4, 8.0 Hz), 5.48 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.39 (t, 1H, J=9.2 Hz), 5.21 (dd, 1H, J=6.2, 1.1 Hz), 5.12 (d, 1H, J=3.1 Hz), 5.09 (d, 1H, J=3.3 Hz), 4.54-4.51 (m, 2H), 4.33 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.19-4.06 (m, 6H), 3.74-3.58 (m, 2H), 3.49-3.40 (m, 1H), 3.33 (d, 1H, J=10.9 Hz), 3.23-3.16 (m, 2H), 1.96 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.45 (s, 9H), 0.91-0.88 (m, 2H), - 0.10 (s, 9H); ^{13}C NMR (C_{6}D_{6}, 100 MHz) \delta 173.26, 170.44, 170.41, 170.18, 170.09, 169.35, 156.05, 102.98, 101.06, 79.73, 77.59, 74.13, 73.21, 72.73, 71.94, 71.19, 70.10, 69.58, 67.28, 63.76, 63.01, 61.25, 54.41, 34.76, 32.76, 28.62, 28.80, 25.75, 22.45, 21.18, 20.93, 20.84, 20.76, 20.57, 20.46, 20.15, 17.83, -1.29; HRMS (FAB) calc. para C_{42}H_{67}NO_{22}SiNa 988.3870, encontrado 988.3821.

Glicoaminoácido Globo-H 45. 98%; IR (CDCl_{3} película) 3373, 2956, 2951, 1748, 1370, 1069 cm^{-1}; ^{1}H NMR (C_{6}D_{6}, 500 MHz) \delta 6.54 (d, 1H, J=6.5 Hz), 5.89 (d, 1H, J=3.5 Hz), 5.86 (d, 1H, J=3.1 Hz), 5.74-5.69 (m, 3H). 5.50-5.46 (m, 2H). 5.39-5.34 (m, 2H), 5.31 (dd, 1H, J=13.4, 0.7 Hz), 5.26 -5.19 (m, 2H), 5.15 (d, 1H, J=8.1 Hz), 5.09-5.06 (m, 3H), 4.82 (dd, 1H, J=10.9, 2.5 Hz), 4.74-4.72 (m, 1H), 4.70-4.69 (m, 1H), 4.66 (t, 1H), 4.58-4.49 (m, 3H), 4.45-4.41 (m, 2H), 4.37-4.33 (m, 2H), 4.24-4.22 (m, 2H), 4.20-4.12 (m, 3H), 4.04-4.01 (m, 2H), 3.91-3.86 (m, 3H), 3.71-3.69 (m, 2H),3.64-3.57 (m, 2H), 4.43 (t, 1H), 3.28-3.27 (m, 1H), 3.23-3.21 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.30 (s, 3H). 2.19 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.84 (s, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.71 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.61 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 1.45 (s, 9H), 1.26-1.22 (m, 2H), 1.08 (d, 3H, J=6.5 Hz), 0.89 (t,2H), -0.10 (s, 9H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 125 MHz) \delta 172.87, 172.28, 171.52, 170.77, 170.61, 170.56, 170.45, 170.40, 170.29, 170.07, 169.75, 169.58, 169.44, 168.95, 155.38, 102.00, 101.29, 100.38, 99.21, 98.77, 94.31, 73.65, 73.34, 73.10, 72.61, 72.38, 71.84, 71.65, 71.58, 71.30, 70.81, 70.68, 70.17, 70.06, 69.59, 69.09, 68.85, 68.05, 67.99, 67.56, 67.30, 64.46, 63.64, 62.16, 61.74, 61.35, 61.12, 60.96, 56.11, 53.45, 32.30, 29.65, 28.96, 28.29, 28.10, 23.11, 21.69, 20.88, 20.85, 20.80, 20.76, 20.72, 20.67, 20.62, 20.55, 20.48, 17.31, 15.88, -1.55; HRMS (FAB) calc. Para C_{88}H_{130}N_{2}O_{51}SiNa 2081.7302, encontrado 2081.7247.

Glicoaminoácido Lewis^{y} 42. 99%; IR (CDCl_{3} película) cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 8.24 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.27-7.18 (m, 3H), 5.83 (dd, 1H, J=10.1, 8.0), 5.78 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.76 (d, 1H, J=3.0 Hz), 5.74-5.71 (m, 2H), 5.69 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.66 (d, 1H, J=3.3Hz), 5.55 (d, 1H, J=3.3 Hz), 5.50 (m, 1H), 5.47 (d, 1H, J=3.8 Hz), 5.41-5.27 (m, 5H), 4.93 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.86 (d, 1H, J=8.6 Hz), 4.77-4.70 (m, 2H), 4.62 (d, 1H, J=7.8 Hz), 4.56-4.53 (m, 1H), 4.47-4.35 (m, 5H), 4.34-4.25 (m, 4H), 4.11-4.00 (m, 5H), 3.92-3.89 (m, 1H), 3.75-3.65 (m, 3H), 3.64-3.61 (t, 1H), 3.28-2.24 (m, 1H), 2.22 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.78 (s, 3H), 1.73 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.66 (s, 3H), 1.65 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.63 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.50 (d, 3H, J=6.5 Hz), 1.46 (s, 9H), 1.38 (d, 3H, J=6.5 Hz), 1.33-1.27 (m, 2H), 1.22-1.21 (m, 2H), 0.91-0.80 (m, 4H), -0.12 (s, 9H); ^{13}C NMR (C_{6}D_{6}, 100 MHz) \delta 172.86, 171.05, 170.59, 170.52, 170.46, 170.37, 170.26, 170.01, 169.97, 169.90, 165.44, 155.61, 133.24, 130.40, 101.59, 100.98, 100.71, 97.09, 96.21, 79.22, 76.42, 74.77, 74.04, 73.69, 72.03, 71.65, 71.14, 70.14, 69.20, 68.66, 68.55, 68.20, 67.99, 67.25, 65.67, 64.36, 63.23, 62.41, 61.33, 60.94, 58.23, 53.84, 39.12, 32.25, 29.30, 28.41, 22.88, 22.01, 20.93, 20.66, 20.58, 20.47, 20.40, 20.18, 20.02, 17.40, 16.36, 15.94, -1.62; HRMS (FAB) calc. Para C_{79}H_{114}N_{2}O_{41}SiNa 1797.6558, encontrado 1797.6528.

Glicoaminoácido Tn 43. 99%; IR (CDCl_{3} película) 3362, 2954, 2990, 2871, 1749, 1716, 1683, 1668, 1520, 1369, 1249, 1164, 1047 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 5.66 (d, 1H, J=9.3 Hz), 5.24 (d, 1H, J=2.8 Hz), 5.03 (dd, 1H, J=11.4, 3.3 Hz), 4.98 (d, 1H, J=8.1), 4.73 (d, 1H, J=3.3 Hz), 4.48-4.42 (m, 1H), 4.17-4.07 (m, 3H), 4.05-3.93 (m, 3H), 3.59-3.54 (m, 1H), 3.33-3.27 (m, 1H), 2.04 (s, 1H), 1.93 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.73-1.70 (m, 1H), 1.57-.150 (m, 3H), 1.31 (s, 9H). 0.91-0.87 (m, 2H), -0.06 (s, 9H); ^{13}C NMR (C_{6}D_{6}, 100 MHz) \delta 173.44, 171.04, 170.57, 170.35, 169.89, 156.06, 98.59, 79.82, 69.29, 68.30, 68.07, 67.43, 64.01, 62.33, 54.33, 48.63, 32.87, 29.05, 28.76, 23.24, 22.82, 20.89, 20.66, 20.47, 17.85, -1.28; HRMS (FAB) calc. para C_{30}H_{53}N_{2}O_{13}SiNa 677.3316, encontrado 677.3352.

Procedimiento general para desprotección N-Boc. El glicoaminoácido deseado (0.100 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (3.0 mL) con agitación. Se adicionó ácido trifluoroacético (TFA) (3.0 mL) gota a gota y la reacción se agitó a rt por 1 hora. La mezcla luego se concentró con una corriente de N_{2} seco y se formó el azeótropo con benceno anhidro (2x5 mL) para dar la amina crudo como su sal TFA que se utiliza típicamente sin purificación adicional.

Procedimiento general para la desprotección éster TSE. El deseado glicoaminoácido (0.100 mmol) se disolvió en THF (1.0-3.0 mL) y se enfrió a 0ºC. Una solución de TBAF 1.0 M en THF (0.250 mmol, 2.5 equivs.) se le adicionó gota a gota, se retira el baño de hielo y la reacción se agita a rt por 1-2 hora, se discrimina por TLC. (Nota: prolongar la reacción más tiempo, i.e. >10 h, puede resultar en desacetilación.) La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (10 mL), se lavó con 0.05M HCL acuoso (50 mL), y se extrajo otra vez con adicional CH_{2}Cl_{2} (2x10 mL). La capa orgánica combinada se secó sobre Mg_{2}SO_{4} anhidro y se concentró. El ácido crudo típicamente se utilizó sin purificación adicional. El ácido 36: ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz) \delta 5.22 (d, 1H, J=2.8 Hz), 5.07 (t, 1H, J=9.3 Hz), 4.98 (dd, 1H, J=10.4, 5.9 Hz), 4.84 (dd, 1H, J=10.4, 3.5 Hz), 4.75 (dd, 1H, J=9.5, 8.0 Hz), 4.42-4.35 (m, 2H), 4.34-4.31 (m, 1H), 4.15-4.14 (m, 1H), 4.03-3.94 (m, 4H), 3.77-3.65 (m, 5H), 3.49-3.45 (m, 1H), 3.37-3.33 (m, 1H), 3.10-3.07 (m, 1H), 2.03 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.96 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.84 (s, 3H), 1.51-1.46 (m, 4H), 1.32 (s, 9H).

Procedimiento general para el acoplamiento del péptido promovido por el reactivo BOP. Los deseados amina y ácido (cantidades equimolares) formaron el azeótropo juntos con benceno anhidro y se secó bajo alto vacío. La mezcla se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (0.1-0.05M), se adicionó el reactivo BOP (1.25 equivs) y la solución se enfrió a 0ºC durante 15 minutos. La adición gota a gota de la base de Hunig (15 equivs.) fue seguida por el retiro del baño de hielo. La reacción se agitó a rt por 2-4 h, según se discriminó por TLC, la concentración de la mezcla de reacción fue seguida por purificación mediante cromatografía de columna instantánea. En casos donde el bi-producto HMPA fue difícil de retirar, el péptido se sometió a purificación sephadex (LH-20, MeOH).

N-Boc Tn con mercaptoacetamida espaciadora. 54%, aceite incoloro; R_{f} 0.35 (MeOH/EtOAc 10%); IR (CDCl_{3} película) 3303, 3078, 2974, 2935, 2872, 1748, 1703, 1692, 1658, 1535, 1440, 1369, 1245, 1166 cm^{-1}; ^{1}H NMR (MeOH, 400 MHz) \delta 5.40 (d, 1H, J=2.9 Hz), 5.13 (dd, 1H, J=11.6, 3.2 Hz), 4.42 (dd, 1H, J=11.5, 3.5 Hz), 4.23 (t, 1H, J=6.7 Hz), 4.14-4.05 (m, 2H), 3.96 (m, 1H), 3.74-3.69 (m, 1H), 3.60 (s, 2H), 3.49-4.44 (m, 1H), 3.26-3.13 (m, 5H), 2.36 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.67-1.59 (m, 6H), 1.43 (s, 9H); ^{13}C NMR (CDCl_{3}, 100 MHz) \delta 195.59, 172.53, 170.78, 170.54, 170.39, 170.30, 168.51, 155.62, 97.59, 79.95, 68.29, 67.96, 67.26, 66.38, 61.83, 60.28, 54.58, 47.62, 36.47, 35.97, 33.02, 31.92, 30.18, 29.14, 28.37, 28.17, 23.07, 22.35, 20.68, 20.64; HRMS (MALDI) calc. Para C_{32}H_{52}N_{4}O_{14}SNa 771.3093, encontrado 771.3070.

Dipéptido Le^{Y}/Tn 51. 86%, película blanca; R_{f} 0.65 (20% MeOH/EtOAc); ^{1}H NMR (MeOH, 400 MHz) \delta 8.06 (d, 2H, J=7.4 Hz), 7.63 (t, 1H), 7.51 (t, 2H), 5.55 (d, 1H, J=3.3 Hz), 5.40 (d, 1H, 2.7 Hz), 5.38 (d, 1H, J=2.7 Hz), 5.32 (d, 1H, J=3.3 Hz), 5.29 (d, 1H, J=4.1 Hz), 5.26 (d, 1H), 5.21-5.12 (m, 5H), 5.01 (q, 1H), 4.93 (m, 2H), 4.90 (m, 2H), 4.79 (d, 1H, J=10.8 Hz), 4.71 (d, 1H), 4.64 (d, 1H), 4.50-4.01 (m, 15H), 3.88-3.60 (m, 7H), 3.60 (s, 2H), 3.51-3.42 (m, 2H), 3.20-3.13 (m, 5H), 2.36 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.11 (s. 3H), 2.09 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 6H), 1.97 (s, 6H), 1.95 (s, 3H), 1.94 (s, 9H), 1.91 (s, 3H), 1.68-1.63 (m, 8H), 1.44 (s, 9H), 1.15 (d, 3H, J=6.3 Hz), 1.14 (d, 3H, J=6.3 Hz); ^{13}C NMR (MeOH, 100 MHz) \delta 196.26, 175.39, 174.30, 173.75, 173.22, 172.80, 172.72, 172.56, 172.51, 172.44, 172.39, 172.30, 172.19, 172.12, 171.85, 171.75, 171.64, 170.76, 166.77, 158.24, 134.92, 131.29, 131.10, 129.99, 103.53, 102.80, 101.77, 99.12, 97.81, 97.30, 80.90, 78.50, 75.88, 75.11, 74.65, 74.32, 73.01, 72.70, 72.56, 72.47, 72.18, 71.91, 70.86, 69.84, 69.62, 69.42, 69.09, 68.90, 67.84, 66.43, 65.43, 63.50, 63.21, 62.57, 61.68, 56.42, 55.96, 54.89, 38.21, 37.74, 37.12, 33.89, 32.72, 30.42, 30.21, 30.01, 28.92, 23.72, 23.44, 22.93, 22.73, 21.32, 21.13, 20.97, 20.86, 20.74, 20.60, 16.67, 16.29; HRMS (MALDI) calc. Para C_{101}H_{144}N_{6}O_{52}SiNa. 2327.8421, encontrado 2327.8536.

Tripéptido N-Boc Globo-H/Le^{y}/Tn. 64%, película blanca; R_{f} 0.45 (10% MeOH/EtOAc); ^{1}H NMR (MeOH, 400 MHz) \delta 8.05 (d, 2H, J=7.4 Hz), 7.63 (t, 1H), 7.50 (t, 2H), 5.64 (d, 1H, J=2.8 Hz), 5.55 (d, 1H, J=3.6 Hz), 5.43 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.40 (d, 1H, J=2.4 Hz), 5.37 (d, 1H, J=2.5 Hz), 5.32-5.25 (m, 7H), 5.23-5.12 (m, 10H), 5.08-5.05 (m, 2H), 5.00 (d, 1H, J=7.5 Hz), 4.96 (d, 1H, J=3.1 Hz), 4.94 (m, 2H), 4.90 (m, 2H), 4.86 (m, 2H), 4.82-4.77 (m, 3H), 4.72-4.70 (m, 3H), 4.64-4.59 (m, 3H), 4.51-4.35 (m, 9H), 4.32-3.92 (m, 31H), 3.86-3.67 (m, 13H), 3.60 (s, 2H), 3.59 (m, 1H), 3.51 (m, 1H), 3.47-3.44 (m, 2H), 3.24-3.18 (m, 5H), 2.36 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.138 (s, 3H), 2.133 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.116 (s, 3H), 2.115 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.096 (s, 3H), 2.090 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (s, 6H), 2.04 (s, 3H), 2.039 (s, 3H), 2.031 (s, 9H), 2.02 (s, 6H), 2.00 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.96 (s, 3H), 1.94 (s, 18H), 1.93 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.86 (s, 3H), 1.67-1.52 (m, 16H), 1.43 (s, 9H), 1.32 (d, 3H), 1.16-1.13 (m, 6H).

Tripéptido Globo-H/Le^{y}/Tn N-Ac encapsulado 53. 95%, película blanca; R_{f} 0.35 (10% MeOH/EtOAc); ^{1}H NMR (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 8.00 (d, 2H, J=7.3 Hz), 7.59 (t, 1H), 7.47 (t, 2H), 6.70 (d, 1H, J=6.3 Hz), 6.61 (d, 1H, J=9.8 Hz), 5.56 (d, 1H, J=2.9 Hz), 5.47 (d, 1H, J=2.1 Hz), 5.44 (d, 1H, J=3.4 Hz), 5.37 (d, 1H, J=3.2 Hz), 5.34 (d, 1H, J=2.7 Hz), 5.32-5.28 (m, 7H), 5.28 (d, 1H), 5.22-5.19 (m, 3H), 5.15-5.10 (m, 6H), 5.08 (m, 1H), 5.06 (m, 1H), 5.01-4.87 (m, 13H), 4.85-4.82 (m, 1H), 4.55-4.35 (m, 15H), 4.26-4.23 (m, 4H), 4.15-4.02 (m, 20H), 3.98-3.93 (m, 5H), 3.88-3.72 (m, 12H), 3.66 (m, 1H), 3.59-3.58 (m, 1H), 3.52 (s, 2H), 3.49-3.38 (m, 5H), 3.20 (m, 6H), 3.02-2.98 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.139 (s, 6H), 2.133 (s, 6H), 2.12 (s, 6H), 2.11 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.08 (s, 12H), 2.07 (s, 3H), 2.06 (s, 12H), 2.05 (s, 3H), 2.046 (s, 3H), 2.041 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.019 (s, 3H), 2.015 (s, 9H), 1.98 (s, 3H), 1.97 (s, 6H), 1.955 (s, 3H), 1.951 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.76-1.57 (m, 10H), 1.44-1.41 (m, 4H), 1.38-1.30 (m, 4H), 1.23-1.20 (m, 2H), 1.13-1.09 (m, 9H).

Tripéptido Globo-H/Le^{Y}/Tn Desprotegido Completamente 54. 98%, película blanca; ^{1}H NMR (D_{2}O, 500 MHz) \delta 5.30 (s, 1H, J=2.8 Hz), 5.25 (d, 1H, J=3.7 Hz), 5.13 (d, 1H, J=3.5 Hz), 4.91-4.87 (m, 3H), 4.75-4.74 (m, 1H), 4.63 (d, 1H, J=7.4 Hz), 4.57-4.48 (m, 3H), 4.41-4.38 (m, 2H), 4.31 (m, 1H), 4.29-4.24 (m, 6H), 4.18-4.12 (m, 3H), 4.05-3.56 (m, 58H), 3.50-3.46 (m, 3H), 3.32-3.24 (m, 5H), 2.06 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 6H), 1.82-1.65 (m, 14H), 1.47-1-42 (m, 6H), 1.29 (d, 3H, J=6.5 Hz), 1.25 (d, 3H, J=7.4 Hz), 1.23 (d, 3H, J=7.0Hz); ^{13}C NMR (D_{2}O, 125 MHz) \delta 175.11, 174.85, 174.81, 174.68, 174.44, 174.25, 174.13, 171.64, 164.59, 104.37, 103.71, 103.25, 102.78, 102.39, 102.44, 100.83, 100.59, 99.80, 99.67, 98.96, 97.34, 82.76, 79.18, 78.65, 77.55, 76.74, 76.50, 75.88, 75.78, 75.45, 75.24, 75.18, 75.00, 74.90, 73.96, 73.47, 73.35, 72.50, 72.32, 72.24, 72.09, 71.31, 71.24, 70.53, 70.44, 70.40, 70.16, 70.11, 69.90, 69.57, 69.50, 69.12, 68.93, 68.87, 68.66, 68.42, 68.22, 68.12, 68.08, 67.29, 67.17, 61.85, 61.68, 61,37, 61.34, 61.20, 60.74, 60.48, 60.19, 56.57, 54.02, 52.02, 50.41, 41.31, 37.09, 31.07, 30.79, 28.69, 28.64, 28.36, 22.72, 22.64, 22.40, 22.36, 22.25, 22.05, 22.01, 21.97, 21.93, 21.87, 21.84, 15.84, 15.70.

3) Preparación de Policarbohidrato (globo H, Le^{y}, Tn) grupo-K LH conjugado utilizando el método ligador en cruz bifuncional

El grupo policabohidrato (globo H, Le^{y}, Tn) se conjuga como se describe abajo utilizando éster maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) que es un reactivo heterobifuncional. A pH neutro, este liga en cruz a los grupos amino con succinimida y luego con los grupos tiol con maleimida. El grupo tiol se proporciona por el residuo cisteina del esqueleto del péptido de grupo y los grupos amino por la cadena lateral N-terminal y lisina del KLH. Después el acoplamiento MBS al KLH el MBS no-reactivo se purifica por columna y se liga en cruz a la cisteina el grupo policarbohidrato sintético. El antígeno no-ligado se retira pasando la mezcla de reacción a través de un filtro CentriPrep 30 con un límite de peso molecular 30,000. La proporción del epítope luego se calculó mediante la estimación del contenido de la proteína por método estándar y carbohidrato por el método de cromatografía de intercambio aniónico de pH alto con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD).

D. Ejemplo 4

Estudios inmunológicos

Se apreciará que los glicoconjugados y glicopéptidos inventivos, como se provee en ésta, son útiles para el tratamiento de cáncer y son útiles para la inducción de una respuesta de anticuerpo en un sujeto. Protocolos típicos para el empleo de tales glicoconjugados y glicopéptidos son descritos con más detalle abajo, y son también detallados en ciertos referentes incorporados en ésta.

1) Inmunización de Ratones

Grupos de ratones (CB6F1 hembras; 6 semanas de vida) obtenidos de Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, son inmunizados subcutaneamente con grupo-KLH Policarbohidrato (globo H, Le^{y}, Tn) que contiene el equivalente a
3 \mug del total de carbohidrato (la cantidad del KLH varia dependiendo de la densidad del epítope) únicamente mezclado con 10 \mug de adyuvante inmunológico QS-21, un derivado saponina de la corteza del árbol Quillaja saponaria Molina (Ragupathi et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125) (Aquila, Worcester, MA) a 0, 1 y 2 semanas y purgando 10 días después de la tercera inmunización. La presencia del anticuerpo es analizada por un ensayo inmunosorbente ligado de enzima (ELISA) como se describió previamente (Ragupathi et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125) utilizando el apropiado antígeno blanco (por ejemplo, globo H-ceramida, Le^{y} ceramida y/o Tn(c)-pamcis como antígeno diana). La reactividad de la superficie celular luego puede ser analizada, por ejemplo, la reactividad de la superficie celular de anticuerpos anti- globo H, Le^{y}, y Tn es analizada en líneas celulares positivas globo H, Le^{y}, Tn mediante ensayos citométricos de flujo.

2) Análisis Serológico

ELISA: Ensayos inmunoabsorbentes de Enzima-ligado (ELISAs) son realizados según se describe en (Ragupathi G, Park TK, Zhang S, Kim I-J, Graber L, Adluri S, Lloyd KO, Danishefsky SJ, Livingston PO. Inmunización de ratones con unos antígenos globo H completamente sintéticos resulta en anticuerpos contra células de cáncer humanas; Una estrategia química-inmunológica combinada para la formación de una vacuna anticáncer. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 125). Antisuero diluido serialmente se adiciona a los pozos cubiertos con antígeno (0.1 \mug) y se incubó por 1 h a temperatura ambiente. IgM o IgG conjugado de cabra anti-ratón con fosfatasa alcalina sirve como anticuerpos secundarios. La absorbancia se mide a 414 nm. El título del anticuerpo se define como el dirtión de suero más alto, mostrando una absorbancia de 0.1 o mayor que la de los sueros de ratón normal.

3) Citometría de flujo

Células apropiadas (por ejemplo, células de las línes celulares de cáncer de seno globo H y Le^{y}-positivas MCF-7 y línea celular de cáncer de colon LS-C) se utilizan como blanco. Suspensiones de células sencillas de 2 X 10^{5} células/tubo se lavaron en PBS con 3% de suero de becerro fetal y 0.01 M NaN_{3} y se incubó con 20 \mul de 1:20 antisuero diluido o mAb VK-9 por 30 min sobre hielo. Después se lavaron las células dos veces con 3% FCS en PBS, se adicionan 20 \mul de 1:15 IgM de cabra anti-ratón o IgG-marcador con fluoresceina-isotiocianato (FTTC), se mezclan y se incuba por 30 min. Después de lavar, la población positiva y la intensidad de fluorescencia promedio de la células teñidas son analizadas por citometría de flujo (EPICS-Perfil II).

Claims

1. Un glicopéptido multi-antigénico que comprende un esqueleto peptídico constituido de 3 a 25 residuos aminoacil, en donde uno o más de dichos aminoácidos son sustituidos con una fracción n-alquilo glucosídica que tiene la estructura:

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40

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41

en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, x, y y z son independientemente 0, 1, 2 o 3, con la condición de que x, y y z no sean simultáneamente 0; en donde R_{0} es hidrógeno, un grupo de cadena líneal o ramificada alquilo, acilo, arilalquilo o aril; en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR_{1}, NH_{2}, NHCOR^{i}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{i}, un alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, grupo (mono-, di- o tri) hidroxialquilo, (mono-, di- o tri) aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R^{i} es hidrógeno, CHO, COOR^{ii}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada o una fracción sacárido que tiene la estructura:

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42

en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada una independientemente 0, 1 o 2; en donde R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14} y R_{15} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{iii}, NH_{2}, NHCOR^{iii}, P, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{iii}, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri) aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R_{16} es hidrógeno, COOH, COOR^{ii}, CONHR^{ii}, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde R^{iii} es hidrógeno, CHO, COOR^{iv}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde R^{ii} y R^{iv} son cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada;

en donde cada aparición de n es independientemente 0-8, por lo cual, si para cada aparición de n, n=0, al menos una aparición de A tiene una estructura diferente a partir de otras apariciones de A; y en donde la fracción glucosídica n-alquilo es ya sea \alpha- o \beta-ligado a un aminoácido; y al menos una aparición de A es un Globo-H determinante que tiene la estructura;

43

en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno.

2. Un glicopéptido como se reivindica en la reivindicación 1, que se conjuga a una proteína o lípido excipiente.

3. El glicopéptido de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho glicopéptido es una construcción que tiene la estructura:

44

en donde el ligador es ya sea un ácido carboxílico libre, (carboxamido)alquilo carboxamida, MBS, carboxamida primaria, mono- o dialquil carboxamida, mono- o diarilcarboxamida, (carboxi)alquilo carboxamida de cadena líneal o ramificada, (alcoxicarbonil)alquilo-carboxamida de cadena líneal o ramificada, (carboxi)arilalquilcarboxamida de cadena líneal o ramificada, (alcoxicarbonil)alquilcarboxamida de cadena líneal o ramificada, un fragmento oligoester que comprende desde 2 a aproximadamente 20 residuos hidroxiacil, un fragmento peptídico que comprende desde 2 a aproximadamente 20 residuos aminoacil, o un éster alquilo o arilcarboxílico de cadena líneal o ramificada; en donde el excipiente es una proteína o lípido; en donde m es 1, 2 o 3; en donde R_{A}, R_{B} y R_{C} son cada una independientemente H o metil; y en donde R_{D}, R_{E} y R_{F} son cada una independientemente una fracción alquilglucosídica que tiene la estructura:

45

46

en donde a, b, c, d, e, f, g, h, i, x, y y z son independientemente 0, 1, 2 o 3, con la condición de que x, y y z no sean simultáneamente 0; en donde el dominio de carbohidrato se liga al residuo aminoacil o hidroxiacil respectivo por sustitución de un sustituyente de grupo lateral seleccionado del grupo que consiste de OH, COOH y NH_{2}; en donde R_{0} es hidrógeno, un grupo alquilo, acilo, arilalquilo o aril de cadena líneal o ramificada; en donde R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7}, R_{8} y R_{9} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{i}, NH_{2}, NHCOR^{i}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{i}, un grupo alquilo, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde R^{i} es hidrógeno, CHO, COOR^{ii}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada o una fracción sacárido que tiene la estructura:

47

en donde Y y Z son independientemente NH o O; en donde k, l, r, s, t, u, v y w son cada uno independientemente 0, 1 o 2; en donde R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14} y R_{15} son cada uno independientemente hidrógeno, OH, OR^{iii}, NH_{2}, NHCOR^{iii}, F, CH_{2}OH, CH_{2}OR^{iii}, o un grupo alquilo sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada, (mono-, di- o tri)hidroxialquilo, (mono-, di- o tri)aciloxialquilo, arilalquilo o aril; en donde R_{16} es hidrógeno, COOH, COOR^{ii}, GONHR^{ii}, un grupo alquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; en donde R^{iii} es hidrógeno, CHO, COOR^{iv}, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y en donde R^{ii} y R^{iv} son cada uno independientemente H, o un grupo alquilo, arilalquilo o aril sustituido o no sustituido de cadena líneal o ramificada; y

en donde cada aparición de n es independientemente 0-8, por lo cual, si por cada aparición de n, n=0, al menos una aparición de A tiene una estructura diferente de otras apariciones de A; y en donde la fracción n-alquilo glucosídica es ya sea \alpha- o \beta-ligado a un aminoácido; y al menos una aparición de A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

48

4. El compuesto de la reivindicación 1 o la construcción de la reivindicación 3, en donde cada aparición de A es independientemente Globo-H, fucosil GM1, KH-1, glicoforina, Le^{y}' N3, Tn, 2,6-STn, (2,3)ST, o TF, con la condición de que al menos una aparición de A sea Globo-H.

5. La construcción de la reivindicación 3, en donde dicho compuesto tiene tres apariciones de A que comprenden Tn, Globo-H y Le^{y}.

6. El compuesto de la reivindicación 1 o la construcción de la reivindicación 3, en donde al menos una aparición de A sea un carbohidrato determinante que tiene la estructura:

49

en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector; y en donde cada aparición de R'' es independientemente hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno.

7. Una composición farmacéutica que comprende:

: un compuesto o construcción de la reivindicación 3, y

: un excipiente farmacéuticamente apropiado.

8. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 7 para tratar el cáncer en un sujeto.

9. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 8 para prevenir la recurrencia de cáncer en un sujeto.

10. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 8 o 9, en donde el cáncer es un tumor sólido.

11. Un compuesto o construcción de la reivindicación 3 para emplear en la inducción de anticuerpos en un sujeto, en donde los anticuerpos son capaces de ser unidos específicamente a células tumorales.

12. Un compuesto o construcción como se reivindica en la reivindicación 11 o una composición farmacéutica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en donde se co-administran uno o más adyuvantes inmunológicos.

13. Un compuesto, construcción o composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 11 en donde al menos uno de dicho o más adyuvantes inmunológicos es un adyuvante de saponina.

14. Un compuesto, construcción o composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 13 en donde dicho adyuvante de saponina es GPI-0100.

15. Un compuesto o construcción como se reivindica en la reivindicación 11 o una composición farmacéutica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en donde al menos uno de dicho o más adyuvantes inmunológicos está constituido de bacterias o de liposomas.

16. Un compuesto, construcción o composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 15 en donde el adyuvante inmunológico es células de Salmonella minnesota, bacilo Calmette-Guerin o QS21.

17. Un compuesto o construcción como se reivindica en la reivindicación 11 o una composición farmacéutica como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en donde el sujeto esta en remisión clínica, o donde el sujeto ha sido tratado por cirugía, tiene una enfermedad no-resectable limitada.

18. El empleo de un compuesto o construcción de la reivindicación 3 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en un sujeto.

19. Un compuesto que tiene la estructura:

50

en donde R es hidrógeno; alquilo sustituido o no sustituido; aril; -CH_{2}CH(CO_{2}R')(NHR''), en donde R' o R'' son cada uno independientemente hidrógeno, grupo protector, alquilo sustituido o no sustituido, un ligador, aril, péptido, proteína o lípido; o NHR''', en donde R''' es un péptido, o lípido ligado a N directamente o de un ligador en cruz; en donde n es 0-8; y en donde A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

51

en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno; con la condición de que cuando A es \alpha-O-ligado, entonces n es al menos 1.

20. El compuesto de la reivindicación 19, en donde R es NHR''', y en donde el lípido R''' es PamCys, por lo cual dicho compuesto es un glicoconjugado.

21. El compuesto de la reivindicación 19, en donde R es CH_{2}CH (CO_{2}R')(NHR'') y el glicoaminoácido resultante tiene la estructura:

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22. El compuesto de la reivindicación 21 en donde n es 3.

23. El compuesto de la reivindicación 21, en donde R' y R'' son cada uno hidrógeno o un grupo protector.

24. El compuesto de la reivindicación 23, en donde R' y R'' son cada uno grupos protectores independientemente seleccionados del grupo que consiste de Fmoc, acetil, Boc, t-butil y TSE.

25. El compuesto de la reivindicación 19, 21 o 22, en donde A tiene la estructura:

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26. Un método para la síntesis de un glicoaminoácido como se reivindica en la reivindicación 21 que comprende las etapas de:

(a): proporcionando un alquenilglucósido que tiene la estructura:

54

: y la reacción de dicho alquenilglucósido bajo condiciones apropiadas para generar un éster de enamida que tiene la estructura:

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(b): la reacción de dicho éster de enamida bajo condiciones apropiadas para generar un glicoaminoácido que tiene la estructura:

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: en donde, para cada una de las estructuras de arriba, n es 0-8, en donde A es un Globo-H determinante que tiene la estructura:

57

: en donde cada aparición de R' es independientemente hidrógeno o un grupo protector, y en donde R'' es hidrógeno o un grupo protector de nitrógeno.

27. El método de la reivindicación 26, en donde la etapa de la reacción de un alquenilglucósido bajo condiciones apropiadas para generar un éster de enamida que comprende la reacción de un alquenilglucósido primero bajo condiciones de división oxidativa y segundo bajo condiciones de olefinación en la presencia de base y fosfonato para generar un éster de enamida.

28. El método de la reivindicación 27, en donde dichas condiciones de división oxidativa comprenden ozonólisis, y en donde la base es tetrametillguanidina.

29. El método de la reivindicación 27, en donde dichas condiciones de división oxidativa son OsO_{4} y periodato, o O_{8}O_{4} y Pb(OAc)_{4}, y en donde la base es t-butóxido de litio o hexametildisilazida de litio.

30. El método de la reivindicación 27, en donde la etapa de la reacción de dicho éster de enamida bajo condiciones apropiadas para generar un glicoaminoácido comprende la reacción de dicho éster de enamida bajo condiciones de hidrogenación y reacción subsiguiente bajo condiciones de desprotección para generar un glicoaminoácido.

31. El método de la reivindicación 30, en donde dicha hidrogenación es obtenida vía hidrogenación asimétrica.

32. El método de la reivindicación 31, en donde dicha hidrogenación asimétrica se obtiene por la utilización de un precursor del catalizador etil DuPHOS.