ES2267560T3 - Secuencias de adn para mejorar la eficacia de alimentacion y la tasa de crecimiento en cerdos. - Google Patents
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Abstract
El uso de un vector en la elaboración de un medicamento para mejorar las eficacias de alimentación y/o las tasas de crecimiento y/o reducir la acumulación de grasa en cerdos, en el que el vector estimula la producción del factor liberador de la hormona de crecimiento (GHRF) y comprende: - una secuencia de ADN que codifica un promotor para la expresión génica; - una secuencia de ADN que codifica un péptido señal del GHRF; y - una secuencia de ADN que codifica el péptido GHRF (1-44) porcino. y en el que el vector se formula para su administración mediante inyección intramuscular.
Description
Secuencias de ADN para mejorar la eficacia de
alimentación y la tasa de crecimiento en cerdos.
La presente invención se refiere a la
administración de un péptido hormonal endógeno, más en particular, a
la administración de un péptido hormonal endógeno con material
genético para mejorar la eficacia de alimentación y la tasa de
crecimiento de cerdos.
Se han hecho muchas aproximaciones para
estimular la tasa de crecimiento del ganado y para potenciar la
eficacia de la conversión del alimento. Estas incluyen el uso de
antibióticos, compuestos químicos y el uso de compuestos biológicos
tales como hormonas de crecimiento (GH) nativas o recombinantes o
factores liberadores de la hormona de crecimiento (GHRF). Muchas de
estas aproximaciones o bien tienen efectos secundarios o son
demasiado caras para implementarse en granjas o haciendas.
Aunque en el pasado se han usado de forma
rutinaria suplementos de antibióticos para mejorar el rendimiento
de crecimiento y la conversión del alimento, sus beneficios están
ahora disminuyendo debido a las mejoras en la gestión de las
granjas modernas y al peligro potencial de expandir la resistencia a
antibióticos a otros animales, incluyendo al hombre.
En los primeros intentos de mejora biológica se
usaban inyecciones de extractos de pituitaria, a partir de los
cuales se aisló y purificó posteriormente la GH de pituitaria.
La GH produce diversos efectos en los tejidos
del organismo, llevando en último extremo a un aumento en la tasa
de crecimiento y en la ganancia de peso. In vivo, GH estimula
la síntesis de proteínas, la degradación de depósitos grasos y el
crecimiento epifisario. Estos efectos están mediados a través de la
regulación al alza de las somatomedinas, por ejemplo, factor de
crecimiento similar a la insulina I (IGF-I). La
producción y liberación de GH de la pituitaria está bajo el control
de dos péptidos hormonales hipotalámicos. La inhibición por
somatostatina y la estimulación por GHRF regulan los niveles de GH
en plasma. Cuando los animales envejecen, hay cambios perjudiciales
en el eje GHRF \rightarrow GH \rightarrow
IGF-1). Por ello, en animales más viejos incluyendo
el hombre, desciende la tasa de producción de GH y disminuye la
respuesta de IGF-I a GH y a GHRF. Estas conducen a
la osteoporosis, disminuye el músculo magro y aumenta el depósito
de grasa dorsal. Por lo tanto, la GH extraída de la pituitaria se ha
usado para suplementar el descenso natural de GH y potenciar el
crecimiento. Sin embargo, este tratamiento se ve afectado por los
riesgos de transmisión accidental de patógenos. Además, el principal
inconveniente es el alto coste que implica. Puesto que GH es una
proteína, es digerida fácilmente por las enzimas intestinales y debe
ser administrada mediante inyección. Además, GH tiene que darse
diariamente debido a su corta semivida en suero. Esto eleva el
coste del tratamiento, haciendo que sólo sea viable para terapia
humana.
El desarrollo de la tecnología de ADN
recombinante y el uso de microbios, tales como E. coli, para
producir GH de mamíferos significó que las preparaciones de GH
homogéneas podrían producirse en grandes cantidades para el
tratamiento reduciendo de este modo los costes. Adicionalmente, los
avances recientes en la estabilización de proteínas mediante
sustituciones por manipulación genética en la estructura primaria y
el desarrollo de formulaciones de liberación lenta han reducido la
frecuencia de dosificación a semanal o bisemanal. Como descienden
los costes del tratamiento, puede usarse comercialmente para
estimular la producción ganadera. Por ejemplo, la GH bovina
recombinante se está usando actualmente para estimular la producción
de leche en un tercio del ganado lechero de los Estados Unidos de
América.
Se ha demostrado que el tratamiento de cerdos
con GH porcina aumenta la tasa de crecimiento, aumenta las proteínas
de la carne mientras que reduce la proporción de grasa. Los
beneficios de la GH porcina en el rendimiento de crecimiento de los
cerdos y los aspectos de seguridad y económicos se han revisado en
Palmer J. Holden (Porcine somatotropine (pST), Biotechnology
Information Series (Bio4), Iowa State University, 1993). Resumiendo
los datos de veinte estudios, se ha descrito que los cerdos a los
que se les inyecta GH porcina crecen el 15% más rápido mientras que
consumen el 21% menos de alimento, con más proteína muscular y
reduciendo la grasa dorsal. Sin embargo, estas ganancias en la
productividad se hacen a un coste sustancial. En primer lugar,
debido a su corta semivida en suero y a su rápida eliminación del
torrente circulatorio, debería inyectarse GH diariamente para que
fuera eficaz. Por lo tanto debe administrarse a los cerdos hasta 4
mg por día de proteína GH porcina durante uno o dos meses que dura
el periodo final de engorde para mantener los niveles de GH en el
plasma y mejorar el rendimiento productivo. De este modo, cada cerdo
puede requerir eventualmente hasta 400 mg de GH. En segundo lugar,
unas dosis elevadas pueden ser tóxicas y se ha demostrado que causan
algunos efectos secundarios adversos, tales como dificultades
respiratorias, tales como se describe en la patente de EE.UU. Nº
5.134.120. Además, el régimen de tratamiento descrito hasta el
momento en la bibliografía es demasiado laborioso y traumático para
el animal. Incluso aunque las patentes de EE.UU. 5.015.626 y
5.134.120 describen el uso de la GH porcina para aumentar la
calidad de la carne y potenciar la ganancia de peso,
respectivamente, la tecnología actual de promotores de crecimiento
basados en péptidos de GH aún tiene que ser más rentable para poder
aplicarse a la ganadería comercial.
El descubrimiento de los factores liberadores de
la hormona de crecimiento (GHRF) prometía proporcionar un
procedimiento mejor para potenciar el crecimiento. GHRF es una
hormona peptídica secretada por el hipotálamo y estimula
específicamente la síntesis y liberación de GH por las células
somatotropas de la glándula pituitaria anterior. Estimulando la
producción endógena de GH, la dosis eficaz requerida es mucho menor
que la de GH, lo que proporciona así un modo más fisiológico de
tratamiento a un coste potencialmente menor. Sin embargo, parece
que sigue sin haber aun un tratamiento satisfactorio, a nuestro
mejor entendimiento, y rentable para el ganado. Por ejemplo, el uso
de inyecciones de proteína GHRF humana dos veces al día para
estimular el crecimiento de ovejas fue descrito en la patente EP Nº
0.289.186. Sin embargo, las inyecciones prolongadas del GHRF humano
inducen respuesta inmune en la oveja con la formación de anticuerpos
neutralizantes frente a la proteína humana. Esto reduce la eficacia
de este tratamiento, y los costes laborales y de material hacen que
esta aproximación no sea rentable. Las inyecciones del péptido GHRF
se han usado para producir una estimulación más mantenida de la
producción de GH en el cerdo. Aunque en algunos ensayos se han
conseguido producir una ganancia de peso corporal y un menor
contenido graso de la carne, el mismo problema de la rápida
eliminación significa que se requieren dosis más frecuentes. Por
tanto, se requiere una nueva aproximación para suplementar los
niveles de GH que potencien el crecimiento.
Desde que se demostró por primera vez que los
vectores plasmídicos de ADN inyectados por vía intramuscular son
captados por las células del músculo esquelético y expresados
durante muchos meses in vivo, la terapia génica basada en
músculo esquelético se ha mantenido como una gran promesa para el
suministro sistémico de proteínas terapéuticas. Esta producción de
proteínas recombinantes por el músculo esquelético, que pueden
secretarse al sistema circulatorio para alcanzar lugares adecuados
distantes se adapta de forma ideal al tratamiento de enfermedades
que surgen a partir de deficiencias de proteínas en el suero. Los
vectores plasmídicos, aunque mucho menos eficaces para la expresión
de proteínas que los vectores basados en virus, tienen las ventajas
de ser probablemente menos inmunogénicos y no se integran en el
genoma del hospedador. Por tanto, se piensa que generalmente son
seguros. Sobre esta base, los vectores plasmídicos se adecuan mejor
a situaciones en las que la proteína terapéutica es eficaz en bajas
concentraciones. De este modo, la infección de vectores plasmídicos
que expresan el gen de GHRF puede ser un procedimiento ideal para
aplicar un suplemento crónico de GHRF a una dosis suficiente eficaz
para potenciar el rendimiento productivo de los animales. Además, la
producción de GHRF persistente podría reducir drásticamente la
frecuencia del tratamiento, reduciendo además los costes a un nivel
económicamente viable.
Recientemente, se ha demostrado que un plásmido
que contiene el ADNc del GHRF humano (hGHRF) bajo el control del
promotor mínimo de la actina \alpha del músculo esqueleto de pollo
es capaz de producir una elevación en los niveles de GH del plasma
cuando se inyecta en el músculo de ratón
(Draghia-Akli y col., Nature Biotechnology, 15,
págs. 1285-1289 y patente WO99/05300). Además, se
describió un aumento del crecimiento de aproximadamente el 15%, 3
semanas después de la inyección. Sin embargo, estos procedimientos
provocan una respuesta inmune que se ponen de manifiesto por un
aumento de los niveles séricos de anticuerpos neutralizantes
anti-hGHRF a los 21 y 28 días tras la inyección del
gen del hGHRF. Se ha demostrado que el factor limitante en el nivel
de expresión génica in situ a partir de los plásmidos
inyectados es el grado extremadamente bajo de captación de los
plásmidos de ADN por las fibras musculares. Para mejorar los niveles
de expresión del hGHRF, Draghia-Akli y
colaboradores, inyectaron primero bupivacaína, una bien conocida
sustancia miotóxica, antes de inyectar el plásmido de ADN en el
músculo en regeneración. Aunque se demostró que esto mejoraba el
nivel de expresión aumentando la captación del plásmido en las
fibras muscula-
res, no es una técnica deseable ni aceptable para ser aplicada a animales de granja criados para el consumo humano.
res, no es una técnica deseable ni aceptable para ser aplicada a animales de granja criados para el consumo humano.
Por tanto, un objeto de esta invención es
proporcionar una aproximación rentable para estimular la tasa de
crecimiento de cerdos y para potenciar la eficacia de conversión del
alimento mediante la administración de un péptido hormona GHRF
endógeno. Como mínimo, es un objeto de la presente invención
proporcionar al público una elección útil.
Por lo tanto, se proporciona el uso de un vector
en la fabricación de un medicamento para potenciar la eficacia del
alimento y/o las tasas de crecimiento y/o reducir la acumulación de
grasa en cerdos, en el que el vector estimula la producción del
factor de liberación de la hormona de crecimiento (GHRF) y
comprende:
- -
- una secuencia de ADN que codifica un promotor para la expresión génica;
- -
- una secuencia de ADN que codifica un péptido señal de GHRF; y
- -
- una secuencia de ADN que codifica el péptido porcino GHRF (1-44),
y en el que el vector se formula para la
administración a través de inyección intramuscular.
Entre las realizaciones particularmente
preferidas de esta invención están las variantes del promotor, que
es un promotor de actina. Según ciertas realizaciones preferidas de
esta invención, el promotor de la actina es un promotor de la
actina de músculo esquelético. La secuencia de ADN que codifica un
promotor de la actina de músculo esquelético especialmente
preferida comprende una copia completa de la secuencia de ADN del
promotor de la actina de músculo esquelético.
Según otras realizaciones preferidas de esta
invención, la secuencia del gen exógeno incluye además una secuencia
de ADN que codifica la región no traducida tres prima (3') que
contiene la señal de poliadenilación del gen del promotor o de
GHRF.
Según aún otras realizaciones preferidas de esta
invención, la secuencia del gen exógeno además incluye una secuencia
de ADN que codifica un gen de resistencia a un antibiótico.
El GHRF y su péptido señal codificados por
dichas secuencias de ADNc pueden ser los correspondientes fragmentos
naturales o recombinantes o sintéticos, o biológicamente activos o
sus análogos con actividades similares con la condición de que el
vector comprenda las secuencias de ADN incluidas dentro del alcance
del vector de la reivindicación 1. Es una realización
particularmente preferida de esta invención que la secuencia de ADN
del promotor, la secuencia de ADNc que codifica un péptido señal de
GHRF y la secuencia de ADNc que codifica GHRF sean específicas de
especie.
Dicho elemento exógeno para estimular la
producción de GHRF, que es una secuencia de ADN, preferiblemente se
mezcla con un vehículo adecuado para su administración subcutánea.
Según ciertas realizaciones preferidas de esta invención, la
secuencia de ADN exógena se administra por vía intramuscular.
Dicho elemento exógeno para estimular la
producción de GHRF, que es una secuencia de ADN administrada a un
animal, preferiblemente se encuentra en el intervalo de 1 a 100
\mug por kg de peso del animal.
Otro aspecto de esta invención es proporcionar
una secuencia de un gen exógeno para estimular la producción
endógena de GHRF que potencie la eficacia de la alimentación y/o las
tasas de crecimiento y/o reduzca la acumulación de grasa en cerdos,
en la que la secuencia del gen exógeno comprende una secuencia de
ADN que codifica un promotor para la expresión génica, una
secuencia de ADNc que codifica un péptido señal de GHRF y una
secuencia de ADN complementaria (ADNc) que codifica el péptido
porcino GHRF (1-44).
Aún otro aspecto de esta invención es
proporcionar un procedimiento de fabricación de un medicamento para
potenciar la eficacia del alimento y/o las tasas de crecimiento y/o
reducir la acumulación de grasa de animales, que comprende
proporcionar una secuencia de ADN que codifica un promotor para la
expresión génica, unido a una secuencia de ADNc que codifica un
péptido señal de GHRF y unido a una secuencia de ADNc que codifica
el péptido porcino GHRF (1-44), para forman una
secuencia génica y mezclar dicho péptido con un vehículo
adecuado.
Otros objetos, características, ventajas y
aspectos de la presente invención serán aparentes para los expertos
a partir de la siguiente descripción. Se comprenderá, sin embargo,
que la siguiente descripción y los ejemplos específicos, mientras
que sean indicación de las realizaciones preferidas de la invención,
se dan sólo a modo de ilustración.
Ahora se explicará una realización preferida de
la presente invención a modo de ejemplo y en referencia a las
figuras acompañantes en las que:
La Figura 1 muestra las representaciones
esquemáticas de pUPAGRF, el casete de expresión pGHRF, con el
reordenamiento del promotor, la región codificadora de pGHRF y la
señal de poliadenilación, mientras que el plásmido control pUPAX se
produce por supresión de la región codificadora pGHRF.
La Figura 2 muestra las etapas principales
implicadas en la construcción del plásmido pUPAGRF proporcionándose
las enzimas claves usadas.
La Figura 3 representa el esquema que muestra la
construcción del plásmido pUPAX a partir de pUPAGRF.
La Figura 4 muestra los efectos de la inyección
del gen pGHRF en el peso corporal medio de ratones C57BL/6J durante
un periodo de cuatro semanas en cuatro grupos de tratamiento,
plásmido pUPAGRF a dosis de 30, 100 y 200 \mul ó 100 \mul de
pUAPX control, con la inyección y la ponderación realizadas de 2:00
a 4:00 pm.
La Figura 5 muestra la diferencia en el
porcentaje de ganancia de peso de los ratones inyectados con el gen
pGHRF.
La Figura 6 muestra los efectos de la dosis del
gen pGHRF en la ganancia de peso en el cerdo
Landrace/Yorkshire/
Duroc (LYD) macho.
Duroc (LYD) macho.
La Figura 7 muestra el cambio en el grosor medio
de la grasa dorsal en los cerdos Landrace/Yorkshire tras la
inyección del gen pGHRF.
Preferiblemente, el sistema de expresión de GHRF
específico de músculo se construye en un vector plasmídico. La
secuencia de ADN complementario (ADNc) que codifica el péptido señal
de GHRF y el GHRF en sí se diseñaron a partir de la estructura
peptídica primaria publicada y se optimizó para el uso de codones en
mamíferos. Este ADNc se sintetiza usando la química convencional de
síntesis de oligonucleótidos. El GHRF y su péptido señal codificado
por las secuencias de ADNc pueden ser los correspondientes
fragmentos naturales o recombinantes o sintéticos, o biológicamente
activos o sus análogos con actividades similares. La secuencia líder
de GHRF codifica un péptido señal en los péptidos nacientes de GHRF
que dirigirá la exportación de dichos péptidos GHRF fuera de las
células del músculo y la secreción a la circulación general en una
forma activa.
Las secuencias de ADN de los elementos
promotores/potenciadores y las regiones no traducidas tres prima
(3') que contienen la señal de poliadenilación del promotor/gen
GHRF se clonan separadamente mediante una reacción en cadena de la
polimerasa. Como ejemplo, se usa el promotor/potenciador de la
actina \alpha de músculo esquelético (sk\alphaa), pero esto no
debería considerarse como una restricción para la elección del
promotor/potenciador. Se usa una copia completa, pero no una
subfracción mínima, de este promotor de la actina, como describen
Draghia-Akli y otros. La razón es que estudios
in vivo, que usan la inyección directa de genes, han
demostrado que el promotor completo de la actina \alpha de
músculo esquelético daba el nivel más elevado de expresión génica
en músculo de ratón, cuando se comparaba con otras versiones
truncadas, (Reecy y otros, Animal Biotechnology 2:
101-120, 1998).
Como una realización preferida de esta
invención, las secuencias de ADN del promotor de la actina, la
secuencia de ADNc que codifica un péptido señal de GHRF y la
secuencia de ADNc que codifica GHRF son específicas de especie.
Estos segmentos de ADN se insertan en un
plásmido pUC en el siguiente orden: promotor de la actina; ADNc del
péptido señal de GHRF humano; ADNc de GHRF porcino
(1-44); región no traducida 3' de la actina. El
plásmido pUC también contiene un gen de resistencia a antibiótico,
por ejemplo, resistencia a ampicilina, que permite la selección
cuando se transforma en bacterias E. coli, así como un origen
de replicación ColEI que confiere un elevado número de copias del
plásmido.
A continuación, la E. coli transformada
con el plásmido de expresión de GHRF se cultiva en un fermentador
en condiciones de selección con ampicilina. Tras recoger las células
y liberar los plásmidos mediante lisis alcalina, el ADN plasmídico
se separa del ARN, del ADN bacteriano y de otros contaminantes
celulares mediante cromatografía en columna. La integridad del ADN
plasmídico purificado se verifica mediante digestión con enzimas de
restricción/electroforesis en gel de agarosa y secuenciación de ADN.
La pureza se determina midiendo la absorbancia a DO_{260/280} y
mediante electroforesis en gel de agarosa.
El ADN plasmídico ensayado se disuelve en un
vehículo fisiológicamente aceptable, se comprueban los niveles de
pirógeno, se ajusta la dosis y se administra a animales mediante
inyección intramuscular. Como una realización preferida de esta
invención, la cantidad total de dicho ADN plasmídico administrado
por animal deberían de estar en el intervalo de 1 a 100 \mug por
kg de peso corporal del ganado.
Tras la inyección en el músculo de los animales,
las células del músculo captan el vector de expresión del plásmido,
que es ADN. Entonces, el vector de expresión plasmídico dirigirá a
la célula para que produzca péptidos GHRF. Estos péptidos se
liberan al sistema circulatorio y estimulan la producción de GH
cuando alcanzan la glándula pituitaria. Esto da lugar a la
elevación de GH en el sistema circulatorio, lo que mejora el
rendimiento productivo, dando lugar a una tasa de crecimiento más
rápida, masa corporal magra más elevada y mejor conversión del
alimento. Además, la carne producida es más magra y con menos grasa,
y por tanto, con un valor en el mercado más alto.
Además, se evita el control de retroalimentación
negativa normal de GH por la hormona somatostatina, ya que el GHRF
liberado esta bajo el control de un promotor constitutivo específico
del músculo. Esto permite la producción continua de GH.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar
adicionalmente, sin limitar, las realizaciones de la presente
invención.
La construcción de la expresión pGFRH se diseñó
para proporcionar una producción y secreción óptima del péptido
pGHRF cuando se transfectó en células musculares de mamífero (Figura
1).
El promotor de la actina alfa de músculo
esquelético (sk\alphaa) es un promotor bien caracterizado que ha
sido mostrado para proporcionar una elevada expresión génica muy
específica en células diferenciadas de la fibra muscular (Reecy y
col., Gene 180: 23-26 1996). Además, posee un
elevado grado de identidad de secuencia y comparte muchos sitios
consenso de unión a factores de transcripción en comparación con los
promotores de la sk\alphaa humana, bovina y de pollo. Esto
sugiere que este promotor está muy conservado entre mamíferos y
aves. Esto se apoya en estudios in vitro que demuestran la
capacidad del promotor de la sk\alphaa para conferir expresión
génica específica de músculo en ratones, ratas y porcinos. Por
tanto, se ha elegido este promotor de 2 kb para dirigir la expresión
específica en músculo del ADNc de pGHRF.
\newpage
El promotor de la sk\alphaa porcina fue
empalmado delante de un marco de lectura abierto que comprendía la
secuencia de ADN que codifica el péptido señal del GHRF humano y el
péptido GHRF porcino maduro.
Puesto que no se disponía de la secuencia de ADN
que codifica el GHRF, diseñamos ésta mediante traducción inversa de
la estructura peptídica conocida, con la optimización para las
preferencias de codones de mamíferos. Una modificación adicional de
la presente invención implica la adición de la región no traducida
3' del gen de la actina \alpha de músculo esqueleto porcino
después del extremo 3' de la región codificadora. Esto sirve para
potenciar la expresión del producto pGHRF estabilizando y
prolongando la semivida de las transcripciones del ARNm. El
procedimiento de construcción del plásmido de expresión pGHRF se
detalla a continuación y se resume en la Figura 2.
Región poli A: Se purificó el ADN
genómico a partir de riñón de cerdo y se usó para la amplificación
de secuencias de genes porcinos. Por PCR se amplificó un fragmento
de 750 pb del extremo 3' del gen de la sk\alphaa. Esta región
abarca los nucleótidos número 2.464 a 3.204 de la secuencia
publicada (Nº de acceso a Genbank U16368) y contiene la región no
traducida 3' y la posible señal de poliadenilación. A continuación,
el producto se cortó con las enzimas de restricción Xba I y
Sac II (usando sitios de corte introducidos con los cebadores
de PCR) y se clonó en el vector plasmídico pBluescriptKS+ para
obtener pS\alphaApA.
Región codificadora del GHRF: La región
codificadora de GHRF es un marco de lectura abierto (ORF) que
comprende la "secuencia líder" de ADN que codifica un péptido
señal para GHRF humano seguido de un ADNc del GHRF porcino
(1-44) en fase. La secuencia líder, que contiene el
exón 2 completo y parte del exón 3 del gen del GHRF humano (número
de acceso a Genbank L10034-5) se amplificó por PCR a
partir del ADN genómico humano. El ADNc del GHRF porcino se
construyó con dos oligonucleótidos con las secuencias
siguientes:
Estos oligonucleótidos contenían un solapado que
se usó para hibridarlos entre sí y, a continuación, rellenarlos con
la Polimerasa Vent. El producto hibridado se amplificó a
continuación por PCR con la Polimerasa Vent. Los productos de la
secuencia líder y el ADNc del GHRF porcino se fosforilaron ambos con
la polinucleótidoquinasa de T4 y, a continuación, se purificaron
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Entonces, los
productos se unieron con la ADN ligasa de T4 y el producto de
ligamiento de 265 pb se purificó adicionalmente usando un gel de
poliacrilamida. Este producto ORF se reamplificó a continuación por
PCR con cebadores que contenían lugares para las enzimas de
restricción Xma I y Xba I. Entonces, la ORF se cortó
con las enzimas Xma I y Xba I y se purificó para
obtener un fragmento de 245 pb. Este fragmento se clonó a
continuación en pS\alphaApA para obtener pPGRFpA.
Región promotora: El promotor/potenciador
completo de 2 kb de la actina \alpha de músculo esquelético
porcino (sk\alphaa) se amplificó por PCR a partir del ADN
genómico porcino. A continuación, se hizo una reacción en cadena de
la polimerasa anidada (PCR) en el 1/50 de la primera reacción de PCR
para obtener un producto de PCR que se extendía desde el pb -1.909
al +76 del gen de la sk\alphaa porcina (Reecy y col., Gene
180:23-28, 1996). Los extremos de este producto se
hicieron romos con la ADN polimerasa de T4 y después se cortaron con
la Eco RI. El fragmento promotor purificado a partir del gel
se clonó en los lugares Eco RI y Eco RV de pPGRFpA
para obtener la construcción intermedia pS\alphaAPGRFpA.
Para obtener la construcción final, este casete
de expresión se escindió a continuación con las enzimas de
restricción flanqueantes Kpn I y Sac I y se ligó en el
plásmido pUC19 y se denominó pUPAGRF. Se hizo una segunda
construcción quitando la región codificadora completa de pGHRF del
plásmido pUPAGRF por digestión parcial con Xho I (Figura 3).
Este segundo plásmido, pUPAX, se usó como control en los ensayos con
animales.
Los plásmidos se transformaron por separado en
E. coli K-12 (cepa DH5\alpha) y se
cultivaron en un fermentador usando medios de cultivo suplementados
con ampicilina a 150 \mug/ml. Cuando los cultivos alcanzaron la
fase estacionaria, las células bacterianas se recogieron y se
lisaron mediante lisis alcalina clásica. Los plásmidos se
recuperaron mediante centrifugación y se separaron de los
contaminantes celulares ADN, ARN y proteínas mediante cromatografía
de intercambio aniónico. La pureza se ensayó midiendo la absorbancia
a 260 y 280 nm. La integridad del plásmido de ADN purificado
también se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa.
Finalmente, la identidad se confirmó mediante digestión con enzimas
de restricción y secuenciación de ADN.
\newpage
El plásmido de ADN se precipitó y se redisolvió
en solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de pirógenos y
la concentración se calculó leyendo la absorbancia a 260 nm. Después
de pasar los ensayos de pirógenos, en este momento, el ADN estaba
listo para la inyección en animales.
Para ensayar la capacidad de la construcción
pUPAGRF para potenciar el rendimiento productivo, inyectamos este
plásmido en el músculo cuádriceps del ratón.
A partir de una colonia de cría de ratones
C57BL/6J, se seleccionaron cuarenta y ochos ratones de
14,5-18 g de peso corporal y se asignaron de forma
aleatoria a cuatro grupos de doce. Cada grupo de 12 ratones
recibieron una única inyección de 100 \mul de PBS que contenían
100 \mug de plásmido control, o el plásmido de expresión del GHRF
(pUPAGRF) a 30, 100 ó 200 \mug, respectivamente. Los ratones se
pesaron, se marcaron en el dedo del pie para su identificación y, a
continuación, recibieron una única inyección en mitad del músculo
cuádriceps izquierdo. Los ratones se mantuvieron con un ciclo de
día/noche de 12 horas en condiciones ambientales controladas,
entorno de enfermedad mínima y recibieron pienso para ratas y agua
convencionales. Los pesos corporales se registraron dos veces por
semana. Los ratones se anestesiaron con ketamina/xilacina (0,15 ml
por 100 g de peso corporal) para obtener muestras de sangre y
tejido. La sangre se recogió mediante punción cardiaca con una
jeringa de insulina de 1 ml que contenía 30 \mul de EDTA 0,5 M
como anticoagulante. La sangre recogida se mantuvo en hielo hasta
que se obtuvo el plasma sedimentando las células a 6.000 g durante
10 min. El músculo cuádriceps completo, que incluía el lugar de
inyección se diseccionó y se congeló rápidamente en nitrógeno
líquido. También se diseccionó el lóbulo derecho del hígado y se
congeló inmediatamente. Todas las muestras se almacenaron a -80ºC
hasta que se analizaron posteriormente.
Los ratones de los cuatro grupos de tratamiento
mostraron un rápido crecimiento y aumentaron de peso corporal
durante el periodo de cuatro semanas tras la inyección. El día 21
del periodo de post-inyección (P.I.) los valores
del peso corporal no eran significativamente diferentes entre todos
los grupos. Aunque los ratones que recibieron 30 \mug de pUPAGRF
mostraban la mayor ganancia de peso mientras que el grupo de la
dosis más elevada (200 \mug) se mantenía por detrás (Figura 4),
el día 25 P.I. hubieron diferencias significativas entre las dosis
más elevadas y el control. A los 25 días P.I, los pesos corporales
medios de los grupos de 200, 100 y 30 \mug eran de 26,3, 26,5 y
24,7 g, respectivamente, mientras que el grupo control era de 24,5
g (p<0,032, factor sencillo de ANOVA). Los pesos corporales
medios a los 28 días P.I. fueron de 26,8 y 26,6 g para los ratones
tratados con los 200 y 100 \mug, frente a 24,5 y 25,0 g para los
tratados con 30 \mug y los controles, respectivamente. Una vez
más, había una diferencia significativa con respecto a los ratones
tratados con el control (p<0,0045).
Los efectos de las inyecciones de pUPAGRF en el
porcentaje de ganancia de peso se muestran en la Figura 5. Cuatro
semanas después de las inyecciones del plásmido, los ratones
tratados con el control mostraban unos porcentajes de ganancia del
48,7%, del 56,6% para los de 30 y 100 \mug de pUPAGRF, mientras
que para los de 200 \mug era del 68,4%. Estos resultados indican
que una única inyección de un plásmido que produce pGHRF es capaz
de producir una mejora significativa en la tasa de crecimiento de
ratones jóvenes. A dosis de hasta 100 \mug, se observó un aumento
de aproximadamente el 8% mientras que una dosis de 200 \mug fue
capaz de producir un aumento del 19% en el porcentaje de ganancia
de peso. Estos resultados son comparables a las observaciones de
Draghia-Akli en la regeneración del músculo de
ratón, aunque sus procedimientos de inyección requerían una
inyección previa del miotóxico bupivacaína para potenciar la
captación y la expresión del plásmido.
A continuación, se ensayó la capacidad del
tratamiento con el gen pGHRF para mejorar el rendimiento productivo
en cerdos de granja.
En este estudio se usaron cerdos de criadero de
un cruce triple de Landrace/Yorkshire/Duroc (LYD). Los cerdos
machos jóvenes, de 10 semanas de edad, se asignaron de forma
aleatoria a tres pocilgas adyacentes en una granja criadero. Los
cerdos recibieron la preparación plasmídica mediante una única
inyección en el músculo glúteo con una jeringa con aguja del 16 de
1½ pulgadas (3,81 cm). Los cerdos de las pocilgas A y B fueron
inyectados con 1 mg y 4 mg de pUPAGRF, respectivamente, mientras
que los de la pocilga C recibieron 4 mg del plásmido control pUPAX.
Los cerdos tuvieron libre acceso a agua y comida, y se pesaron
semanalmente.
Los cerdos que recibieron una única inyección de
1 mg de pUPAGRF mostraron una ganancia de peso de 62,53 a 87,17 kg
(aumento del 37,8%) en el periodo de 6 semanas del experimento. Los
cerdos inyectados con 4 mg crecieron de un peso medio de 60,20 kg a
98,28 kg (ganancia del 44,1%). Aquellos del grupo control crecieron
de 58,59 a 89,33 kg (una ganancia del 34,4%) en el mismo periodo.
Así, después de 6 semanas, los cerdos inyectados con el plásmido de
expresión de pGHRF mostraban una mayor ganancia de porcentaje de
peso que los inyectados con el plásmido control. Además, parece que
hay una tendencia a una respuesta dependiente de dosis puesto que
la dosis de 4 mg causaba un aumento más de dos veces mayor en
comparación con la dosis de 1 mg. En términos de rendimiento de
conversión de alimento, el grupo de 1 mg de dosis, aunque mostraba
una modesta ganancia en la tasa de crecimiento, consumía un 10%
menos de alimento (tabla 1). Además, no hubo diferencia en la
cantidad de alimento consumido entre el control y el grupo de la
dosis más elevada, por ello, pUPAGRF a ambos dosis de 1 mg y 4 mg,
fueron capaces de proporcionar una mejora de la conversión del
alimento.
| control | 1 mg | 4 mg | |
| media de consumo de alimento diario por cerdo (kg) | 3,960 | 3,563 | 3,963 |
| % del control | 100,00 | 89,98 | 100,08 |
| % del cambio relativo al control | 0,00 | -10,02 | 0,08 |
Se realizaron estudios para determinar los
efectos de la inyección de 2 mg del plásmido pUPAGRF en cerdos
Landrace/Yorkshire (LY) en la acumulación de grasa dorsal. Se
asignaron veinte cerdos LY de aproximadamente 32 semanas de edad y
peso medio de 55 kg a dos grupos de diez, cada uno con 5 machos y 5
hembras. A un grupo se le administraron 2 mg del plásmido pUPAGRF
mediante inyección intramuscular. El segundo grupo se trató de
forma similar con el plásmido pUPAX, y sirvió como control.
Semanalmente se determinó el grosor de la grasa dorsal en
posiciones laterales con respecto a la última vértebra torácica
usando un medidor de ultrasonidos de Renco. Se tomaron tres medidas
en las posiciones PI, PII y PIII, que estaban a 45 mm, 65 mm y 80 mm
lateralmente desde el centro de la columna vertebral sobre la
última vértebra con costilla, respectivamente y se promediaron para
obtener una media del espesor de la grasa dorsal.
Los resultados se resumen en la Figura 7. En los
machos, tanto los cerdos tratados como los controles mostraron un
aumento gradual del espesor de la grasa dorsal conforme los animales
crecían, aunque los que recibieron el plásmido que expresaba pGHRF
mostraban una ganancia reducida de la grasa dorsal. Los cerdos
hembras control también mostraron una ganancia gradual en la grasa
dorsal, que se suprimió con el tratamiento con pGHRF. La Tabla 2
muestra las ganancias relativas en el espesor de la grasa dorsal
durante el periodo experimental. A los 60 días tras la inyección,
el tratamiento con pGHRF redujo la cantidad de acumulación de grasa
dorsal tanto en cerdos LY machos como hembras.
| LY macho | LY hembra | |||
| Control | pGHRF | Control | pGHRF | |
| Ganancia relativa en el espesor de la grasa dorsal | 51,3% | 34,9% | 24,2% | 5,1% |
Estos resultados de los ejemplos muestran que el
tratamiento con el gen pGHRF es capaz de producir beneficios en el
rendimiento productivo tanto en el ratón como en el cerdo. Las
ganancias en las tasas de crecimiento son comparables con las de
los tratamientos con GH, incluso con un régimen de tratamiento
muchos más rentable. La cantidad del ADN usado por animal es al
menos 100 veces menor que la de la inyección de hormona de
crecimiento descrita en la bibliografía. Además, los datos en
cerdos muestran que se dan reducciones en la cantidad de alimento
necesaria así como en el espesor de la grasa dorsal. Por tanto, esta
invención será beneficiosa para la industria ganadera porque
potencia la eficacia del alimento y la tasa de crecimiento del
ganado.
<110> LeaderGene Limited
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Tratamiento génico para mejorar el
rendimiento del alimento y la tasa de crecimiento del ganado
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 9815608
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/IB00/01317
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<170> PatentIn. versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (40)
1. El uso de un vector en la elaboración de un
medicamento para mejorar las eficacias de alimentación y/o las tasas
de crecimiento y/o reducir la acumulación de grasa en cerdos, en el
que el vector estimula la producción del factor liberador de la
hormona de crecimiento (GHRF) y comprende:
- -
- una secuencia de ADN que codifica un promotor para la expresión génica;
- -
- una secuencia de ADN que codifica un péptido señal del GHRF; y
- -
- una secuencia de ADN que codifica el péptido GHRF (1-44) porcino.
y en el que el vector se formula para su
administración mediante inyección intramuscular.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
el promotor para la expresión génica en un promotor de actina.
3. El uso según la reivindicación 2, en el que
el promotor de actina es un promotor de la actina de músculo
esquelético.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que
la secuencia de ADN codifica un promotor de la actina de músculo
esquelético que comprende una copia completa de la secuencia de ADN
del promotor de la actina de músculo esquelético.
5. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector además incluye una
secuencia de ADN derivada de una región no traducida tres prima (3')
que contiene una señal de poliadenilación del gen del promotor o del
GHRF.
6. El uso según la reivindicación 5 en el que
dicha región no traducida 3' es del gen de la actina \alpha de
músculo esquelético porcina.
7. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el vector además incluye una
secuencia de ADN que codifica un gen de resistencia a
antibiótico.
8. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el GHRF y su péptido señal
codificados por dichas secuencias de ADN son los correspondientes
fragmentos naturales o recombinantes o sintéticos, o biológicamente
activos o sus análogos con actividades similares.
9. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la secuencia de ADN del promotor,
la secuencia de ADN que codifica un péptido señal de GHRF y la
secuencia de ADN que codifica el GHRF son específicas de una
especie.
10. El uso según una cualquiera de la
reivindicaciones 2 a 8, en el que el promotor de la actina y el
péptido señal del GHRF son endógenas para los cerdos.
11. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 en el que el péptido señal del GHRF es un
péptido señal del GHRF humano.
12. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 11 en el que el promotor de la actina de
músculo esquelético es un promotor de la actina de músculo esqueleto
porcino.
13. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el vector se mezcla con un
vehículo adecuado antes de su administración.
14. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el medicamento se formula de tal
modo que la cantidad de dicho vector administrado por animal está en
el intervalo de 1 a 100 \mug por kg de peso corporal del
cerdo.
15. Un vector para estimular la producción
endógena del GHRF para potenciar la eficacia de alimentación y/o las
tasas de crecimiento y/o reducir la acumulación de grasa en cerdos
que comprende:
- -
- una secuencia de ADN que codifica un promotor para la expresión génica;
- -
- una secuencia de ADN que codifica un péptido señal del GHRF; y
- -
- una secuencia de ADN que codifica el péptido GHRF (1-44) porcino.
16. El vector según la reivindicación 15, en el
que el promotor para la expresión génica es un promotor de la
actina.
17. El vector según la reivindicación 16, en el
que el promotor de la actina es un promotor de la actina de músculo
esquelético.
18. El vector según la reivindicación 17, en el
que la secuencia de ADN que codifica un promotor de la actina de
músculo esquelético comprende una copia completa de la secuencia de
ADN del promotor de la actina de músculo esquelético.
19. El vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 18 en el que el vector además incluye una
secuencia de ADN derivada de una región de poliadenilación no
traducida 3' de gen del promotor o del GHRF.
20. El vector según la reivindicación 19, en el
que dicha región no traducida 3' es del gen de la actina \alpha de
músculo esquelético porcino.
21. El vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, en el que el vector además incluye una
secuencia de ADN que codifica un gen de resistencia a
antibiótico.
22. El vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 21, en el que el GHRF y su péptido señal
codificados por las secuencias de ADN son los correspondientes
fragmentos naturales o recombinantes o sintéticos, o biológicamente
activos o sus análogos con actividades similares.
23. El vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22, en el que la secuencia de ADN del promotor
de la actina, la secuencia de ADN que codifica un péptido señal del
GHRF y la secuencia de ADN que codifica el GHRF son específicas de
una especie.
24. El vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 23, en el que el promotor de la actina y el
péptido señal del GHRF son endógenos para cerdos.
25. El vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 24 en el que el péptido señal del GHRF es un
péptido señal del GHRF humano.
26. El vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 25 en el que el promotor de la actina de
músculo esquelético es un promotor de la actina de músculo
esquelético porcino.
27. Un procedimiento de fabricación de un vector
para potenciar la eficacia de alimentación y/o las tasas de
crecimiento y/o reducir la acumulación de grasa en cerdos,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- -
- proporcionar una secuencia de ADN que codifica un promotor para la expresión génica;
- -
- unir una secuencia de ADN que codifica un péptido señal del GHRF; y
- -
- unir una secuencia de ADN que codifica el péptido GHRF (1-44) porcino para formar dicho vector.
28. El procedimiento según la reivindicación 27,
en el que el promotor para la expresión génica es un promotor de la
actina.
29. El procedimiento según la reivindicación 28,
en el que el promotor de la actina es un promotor de la actina de
músculo esquelético.
30. El procedimiento según la reivindicación 29,
en el que la secuencia de ADN que codifica un promotor de la actina
de músculo esquelético comprende un conjunto completo de la
secuencia de ADN del promotor de la actina de músculo
esquelético.
31. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 30 en el que el procedimiento además comprende
la etapa de unión de una secuencia de ADN derivada de una región de
poliadenilación no traducida 3' del gen proveedor o del GHRF.
32. El procedimiento según la reivindicación 31
en el que dicha región no traducida 3' es la del gen de la actina
\alpha de músculo esquelético porcino.
33. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 32, en el que el procedimiento además
comprende la etapa de unir una secuencia de ADN que codifica un gen
de resistencia a ampicilina.
34. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 33, en el que las secuencias de ADN de la
secuencia del vector se unen por ligamiento.
35. El procedimiento según la reivindicación 33,
en el que las secuencias de ADN del vector se unen de forma
secuencial en el siguiente orden: promotor para la expresión génica;
secuencia de ADN que codifica el péptido señal del GHRF; secuencia
de ADN que codifica el GHRF porcino; secuencia de ADN que codifica
la región de poliadenilación no traducida 3' de dicho promotor;
secuencia de ADN que codifica el gen de resistencia a
antibiótico.
36. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 35, en el que el GHRF y su péptido señal
codificados por las secuencias de ADN son los correspondientes
fragmentos naturales o recombinantes o sintéticos, o biológicamente
activos o sus análogos con actividades similares.
37. El procedimiento según una cualquiera de la
reivindicaciones 27 a 36, en el que la secuencia de ADN del
promotor, la secuencia de ADN que codifica un péptido señal del GHRF
y la secuencia de ADN que codifica el GHRF son específicos de
especie.
38. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 36 en el que el promotor de la actina y el
péptido señal del GHRF son endógenos para cerdos.
39. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 38 en el que el péptido señal del GHRF es un
péptido señal del GHRF humano.
40. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 39 en el que el promotor de la actina de
músculo esquelético es un promotor de la actina de músculo
esquelético porcino.
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