ES2267809T3 - Plantas transgenicas que contienen señuelos moleculares de proteinas en su interior. - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico aislado seleccionado entre el grupo constituido por: (a) la secuencia de ácido nucleico aislado de la SEC ID Nº: 1 o un fragmento activo de la misma, en el que dicho fragmento es al menos 200 nucleótidos consecutivos; y (b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de (a), en el que el ácido nucleico, cuando se acopla con un gen informador y se utiliza para transformar plantas de N. tabacum, es capaz de promover la expresión de dicho gen informador a un nivel que es al menos 1, 5 veces mayor cuando se expresa en plantas Nic+/nic- que cuando se expresa en plantas nic-/nic-.

Description

Plantas transgénicas que contienen señuelos moleculares de proteínas en su interior.
Campo de la invención
La presente invención describe un procedimiento para la producción de plantas transgénicas tales como plantas de tabaco transgénicas con un contenido de proteínas alterado en su interior, que conduce a fenotipos alterados tales como niveles de nicotina reducidos, junto con plantas transgénicas producidas de este modo y semillas para dichas plantas.
Antecedentes de la invención
La producción de tabaco con niveles de nicotina disminuidos es de interés, dadas las preocupaciones con respecto a la naturaleza adictiva de la nicotina. Adicionalmente, las plantas de tabaco con niveles extremadamente bajos de producción de nicotina, o sin producción de nicotina, son atractivas como destinatarias de transgenes que expresan productos de valor comercial tales como productos farmacéuticos, componentes cosméticos, o aditivos alimentarios. Se han diseñado diversos procedimientos para la retirada de la nicotina del tabaco. Sin embargo, la mayoría de estos procedimientos retiran otros ingredientes del tabaco además de la nicotina, afectando de este modo de forma adversa al tabaco. Las técnicas clásicas de genotecnia vegetal han producido plantas de tabaco con niveles más bajos de nicotina (aproximadamente el 8%) que los encontrados en plantas de tabaco de tipo silvestre. Son deseables plantas de tabaco y tabaco que tengan incluso más reducciones en el contenido de nicotina.
La nicotina se forma principalmente en las raíces de la planta de tabaco y se transporta posteriormente a las hojas, donde se almacena (Tso, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants, págs. 233-34, Dowden, Hutchinson y Ross, Stroudsburg, Pa (1972)). La nicotina se produce mediante la condensación de dos precursores, ácido nicotínico y N-metilpirrolinio, que surgen de dos vías biosintéticas diferentes (véase Figura 1) (Bush y Saunders (1977) Proc. Am. Chem. Soc. Symp., New Orleans, págs. 389-425; Hashimoto y Yamada (1994) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 45, 257-285; Walter y Dermer (1981) en: The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise, P.K. Stumpf y E.E. Conn, eds. Academia Press, págs. 317-395). El ciclo del piridin nucleótido sintetiza ácido nicotínico (Wagner y col. (1986) Planta 167, 226-232; Wagner y Wagner (1985) Planta 165, 532-537), mientras que los cationes de N-metilpirrolinio se sintetizan a partir de ornitina o arginina mediante pudrición (Leete (1980) En: Encyclopedia of Plant Physiology, Secondary Plant Products, Vol. 8, E.A. Bell y B.V. Charlwood, eds, Springer-Verlag, págs. 65-91; Tiburcio y Galston (1986) Phytochemistry, 25, 107-110). Experimentos de injerto recíproco han demostrado que la nicotina se sintetiza en las raíces y se transporta a través del xilema a las hojas y otros órganos de las plantas (Dawson (1941) Science, 94, 396-397).
Dos loci reguladores (Nic1 y Nic2) regulan la producción de nicotina. Legg y col. ((1969) J. Hered, 60, 213-217) incorporaron genes de variedades cultivadas de puro cubano de bajo contenido de alcaloides en variedades cultivadas Burley 21. Estos investigadores demostraron que las líneas de bajo contenido de alcaloides se diferenciaban de las variedades cultivadas convencionales en dos loci, Nicl (identificado originalmente como A) y Nic2 (identificado originalmente como B). Estos dos loci no están unidos y la acción génica es semi-dominante y principalmente aditiva (Legg y col. (1969) J. Hered, 60, 213-217). Collins y col. ((1974) Crop Sci., 14, 77-80) prepararon líneas de reproducción doble haploide de tabaco de estos cuatro genotipos de alcaloide. El genotipo de las variedades cultivadas convencionales es Nic1/Nic1 Nic2/Nic2 y el de las líneas bajas en nicotina es nic1/nic1 nic2/nic2. Nic1/Nic1 nic2/nic2 es un intermediario superior y nic1/nic1 Nic2/Nic2 es un intermediario inferior (Legg y Collins (1971) Can. J. Genet. Cytol. 13, 287-291). Estas líneas son similares en días para iniciar la floración, número de hojas, tamaño de la hoja, y altura de la planta. Los análisis enzimáticos de raíces de mutantes Nic sencillos y dobles muestran que las actividades de dos enzimas, quinolinato fosforriboxil transferasa (QPTasa) y metil transferasa de la pudrición (PMTasa), son directamente proporcionales a los niveles de biosíntesis de nicotina (Saunders y Bush (1979) Plant Physiol 64:236). Tanto Nic1 como Nic2 afectan a las actividades de PMTasa y QPTasa en las raíces, y de este modo, regulan la síntesis de nicotina (Leete (1983) En: Alkaloids: Chemical and Biological Perspectives, S.W. Pelletier, ed. John Wiley and Sons, págs. 85-152).
Hibi y col. ((1994) Plant Cell, 6, 723-735) aislaron el ADNc que codifica PMTasa, PMT, y demostraron que los niveles de transcripción de PMT están regulados por Nic1 y Nic2. El ADNc de QPTasa y los clones genómicos (NtQPT1) también se han aislado y los niveles de transcripción de NtQPT1 también están regulados por Nic1 y Nic2 (Song, W., Mendu, N., y Conkling, M.A. (1999) Plant Cell, en preparación). Por tanto, parece que los genes Nic regulan el contenido de nicotina regulando los niveles de transcripción de genes que codifican las dos enzimas limitantes de velocidad, PMTasa y QPTasa. Además, Nic1 y Nic2 han demostrado ser reguladores positivos de la transcripción de NtQPT1 y que secuencias promotoras cadena arriba del sitio de comienzo de la transcripción contienen las secuencias de actuación en cis necesarias para la activación por el producto del gen Nic de la transcripción de NtQPT1. Puesto que la expresión de QPTasa y PMTasa están reguladas de forma coordinada por los productos del gen Nic, es probable que los productos del gen Nic regulen también directamente la transcripción del gen PMT.
Un enfoque para reducir el nivel de un producto biológico, tal como nicotina, es reducir la cantidad de una enzima requerida (es decir, QPTasa y PMTasa) en la vía biosintética que conduce a ese producto. Donde la enzima afectada se produce de forma natural en una cantidad limitante de la velocidad (en relación con las otras enzimas requeridas en la vía), cualquier reducción en la abundancia de esta enzima disminuirá la producción del producto final. Si la cantidad de la enzima normalmente no es limitante de la velocidad, su presencia en una célula debe reducirse a niveles limitantes de la velocidad para disminuir la producción de la vía. A la inversa, si la cantidad producida de forma natural de la enzima es limitante de la velocidad, entonces cualquier aumento en la actividad de la enzima dará como resultado un aumento en el producto final de la vía biosintética. La modificación de los niveles de nicotina en plantas de tabaco mediante la regulación antisentido de la expresión de la metil transferasa de la pudrición (PMTasa) se propone en las Patentes de Estados Unidos 5.369.023 y 5.260.205 de Nakatani y Malik. La solicitud PCT WO 94/28142 de Wahad y Malik describe ADN que codifica PMT y el uso de construcciones de PMT con sentido y antisentido. Adicionalmente, la solicitud PCT WO 98/56923 de Conkling y col. describe ADN que codifica una enzima quinolato fosforribosil transferasa (QPRTasa) de una planta, construcciones que comprenden dicho ADN, y procedimientos de alteración de la expresión de QPRTasa para aumentar o disminuir la producción de nicotina en plantas. A pesar de los esfuerzos y éxitos previos, sigue existiendo una necesidad de nuevos enfoques para reducir la producción de productos génicos en plantas (por ejemplo, nicotina).
Sumario de la invención
Un primer aspecto de la presente invención es un elemento sensible al producto del gen Nic (por ejemplo, una secuencia de ADN que se une a un producto del gen Nic) tal como (a) ácidos nucleicos aislados que tienen una secuencia de acuerdo con SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma constituido por al menos 200 nucleótidos consecutivos; y (b) una secuencia de ácido nucleico que es al menos idéntica al 90% a la secuencia de ácido nucleico de (a), en la que el ácido nucleico, cuando se acopla a un gen informador y se utiliza para transformar plantas de N. tabacum, es capaz de promover la expresión de dicho gen informador a un nivel que es al menos 1-5 veces mayor cuando se expresa en plantas Nic^{+}/nic^{-} que cuando se expresa en plantas nic^{-}/nic^{-}.
Un segundo aspecto de la presente invención es una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende/contiene un elemento regulador de actuación en cis tal como un elemento sensible a un producto del gen Nic como se ha descrito anteriormente, junto con el uso de dicho ácido nucleico recombinante para la producción de una planta transgénica o célula huésped como se describe en este documento. La construcción puede ser un vector, tal como una partícula de transferencia balística de ácido nucleico o un vector de Agrobacterium. Las células vegetales que contienen dichas construcciones, y preferiblemente múltiples copias de las mismas, también son un aspecto de la invención.
Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento para fabricar una planta de tabaco transgénica que tiene el contenido de nicotina y/o nitrosaminas específicas del tabaco (TSNA) reducido. El procedimiento comprende introducir una construcción de ácido nucleico exógeno que comprende un elemento sensible al producto del gen Nic como se ha descrito anteriormente en dicha al menos una célula de plantas de tabaco para producir al menos una célula de plantas de tabaco transformada. La al menos una célula de plantas de tabaco transformada contiene el ácido nucleico exógeno en una cantidad o número de copias suficiente para reducir el nivel de nicotina y/o TSNA de una planta de tabaco regenerada a partir de esta célula o células en comparación con el nivel de nicotina y/o TSNA que estaría presente en ausencia del ácido nucleico exógeno. El procedimiento puede incluir además generar una planta de tabaco a partir de las células de la planta transformada, y (opcionalmente) recoger hojas, tallos, o semillas de tabaco de la planta de tabaco. Por tanto, las plantas de tabaco, incluyendo las hojas, tallos y semillas, generadas a partir de dicho procedimiento también son aspectos de la presente
invención.
Un aspecto adicional de la presente invención es una planta de tabaco que tiene niveles reducidos de nicotina y/o TSNA en su interior, comprendiendo la planta células que contienen un ácido nucleico exógeno, ácido nucleico exógeno que comprende un elemento sensible al producto del gen Nic como se ha descrito anteriormente. El ácido nucleico exógeno está contenido en las células en un número de copias suficiente para reducir el nivel de nicotina de esa planta de tabaco en comparación con el nivel de nicotina que estaría presente en esa planta en ausencia del ácido nucleico exógeno. De nuevo, las hojas, tallos, y semillas de dicha planta son también aspectos de la presente invención.
También se describen pero no se reivindican productos del Tabaco incluyendo, aunque sin limitación, materiales para fumar (por ejemplo, cigarrillos, puros, tabaco de pipa), rapé, tabaco de mascar, chicle, pastillas que se preparan a partir de dichas plantas de tabaco transgénicas, que son también realizaciones de la invención. Preferiblemente estos productos del tabaco se fabrican a partir de hojas y tallos de tabaco recogidos que se han cortado, secado, curado y/o fermentado de acuerdo con técnicas convencionales en la preparación del tabaco. Sin embargo, también pueden implementarse técnicas modificadas en la curación y el procesamiento del tabaco para rebajar más los niveles de TSNA. En algunas realizaciones, el tabaco que se fabrica básicamente sin nicotina y/o TSNA se prepara a partir de una variedad de tabaco Burley (por ejemplo, Burley 21), tabaco Oriental, o tabaco curado al aire caliente. Debe entenderse, sin embargo, que la mayoría de las variedades de tabaco pueden fabricarse para que estén libres de nicotina y/o TSNA de acuerdo con las realizaciones descritas en este documento.
Realizaciones adicionales que no se reivindican incluyen productos del tabaco que se han mezclado cuidadosamente para que se obtengan los niveles deseados de nicotina y/o TSNA. Por ejemplo, tabaco que tiene un nivel reducido de nicotina y/o TSNA, preparado como se ha descrito anteriormente, puede mezclarse con tabaco convencional para obtener prácticamente cualquier cantidad de nicotina y/o TSNA. Además, pueden mezclarse dos o más variedades de tabaco que tienen un nivel de nicotina y/o TSNA reducido para conseguir una cantidad deseada de nicotina y/o TSNA. De esta manera, las diferencias en variedad, aroma, así como cantidades de nicotina y/o TSNA pueden ajustarse de forma gradual. Estos productos de tabaco mezclado pueden incorporarse en kits y programas para el cese del uso del tabaco diseñados para reducir o eliminar la dependencia de nicotina y el potencial carcinogénico. Dichos kits y programas son también realizaciones de la invención.
También se describe pero no se reivindica la reducción de la cantidad de TSNA y metabolitos de las mismas en seres humanos que fuman, consumen o ingieren tabaco de otra manera. Este procedimiento se practica proporcionando un producto del tabaco que tiene una cantidad de TSNA reducida, como se ha descrito anteriormente, a dichos seres humanos, rebajando de este modo el potencial carcinogénico de dicho producto en dichos seres humanos.
Además se describe pero no se reivindica un procedimiento para fabricar una planta que tiene un contenido aumentado o reducido de una proteína de interés en su interior, en el que la proteína de interés se regula mediante un elemento de actuación en cis seleccionado entre el grupo constituido por (i) un elemento activador de actuación en cis que se une a un compuesto activador, compuesto activador que aumenta la expresión de dicha proteína de interés en dicha planta, y (ii), un elemento represor de actuación en cis que se une a un compuesto represor, compuesto represor que disminuye la expresión de dicha proteína de interés en dicha planta. El procedimiento comprende introducir una construcción de ácido nucleico exógeno que comprende dicho elemento de actuación en cis en al menos una célula vegetal para producir al menos una célula vegetal transformada, conteniendo la al menos una célula vegetal transformada el ácido nucleico exógeno en un número de copias suficiente para aumentar o reducir el nivel de dicha proteína de interés en una planta regenerada a partir de dichas células en comparación con la cantidad de dicha proteína de interés que estaría presente en ausencia de dicho ácido nucleico exógeno.
También se describe pero no se reivindica una planta (y partes de la misma) que tiene niveles aumentados o reducidos de una proteína de interés en su interior, comprendiendo la planta células que contienen un ácido nucleico exógeno, ácido nucleico exógeno que comprende un elemento de actuación en cis seleccionado entre el grupo constituido por (i) un elemento activador de actuación en cis que se une a un compuesto activador, compuesto activador que aumenta la expresión de dicha proteína de interés en dicha planta, y (ii), un elemento represor de actuación en cis que se une a un compuesto represor, compuesto represor que disminuye la expresión de dicha proteína de interés en dicha planta; conteniendo las células el ácido nucleico exógeno en un número de copias suficiente para aumentar o reducir el nivel de la proteína de interés en la planta en comparación con la cantidad de la proteína de interés que estaría presente en ausencia del ácido nucleico exógeno.
También se describe un procedimiento general para disminuir la expresión de una proteína de interés en una célula huésped (procariota o eucariota), en el que la transcripción de la proteína de interés se potencia mediante un elemento activador de actuación en cis que se une a un compuesto activador, compuesto activador que aumenta la expresión de la proteína de interés en la célula huésped. El procedimiento comprende las etapas de (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico recombinante señuelo que comprende el elemento activador de actuación en cis; y (b) introducir la construcción señuelo en la célula huésped en una cantidad suficiente para unirse al compuesto activador y reducir la expresión de la proteína de interés.
También se describe un procedimiento general para aumentar la expresión de una proteína de interés en una célula huésped, en el que la transcripción de la proteína de interés se reduce mediante un elemento represor de actuación en cis que se une a un compuesto represor, compuesto represor que disminuye la expresión de dicha proteína de interés en dicha célula huésped. El procedimiento comprende las etapas de (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico recombinante señuelo que comprende dicho elemento activador de actuación en cis; y (b) introducir dicha construcción señuelo en la célula huésped en una cantidad suficiente para unirse a dicho compuesto represor y aumentar la expresión de dicha proteína de interés.
Los anteriores y otros aspectos de la presente invención se explican con más detalle en las figuras en este documento y la memoria descriptiva que se muestra a continuación.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa la vía biosintética que conduce a la biosíntesis de nicotina. Las actividades de enzimas que se sabe están reguladas por Nic1 y Nic2 son QPTasa (quinolinato fosforribosil transferasa) y PMTasa (metil transferasa de la pudrición). QPTasa y PMTasa son las etapas enzimáticas limitantes de velocidad en la biosíntesis de nicotina y por tanto, los niveles de nicotina son directamente proporcionales a las actividades de QPTasa y PMTasa.
La Figura 2 muestra una representación esquemática del gen NtQPT1 y las quimeras del promotor de NtQPT1-uidA. Se indica el sitio de comienzo de la transcripción (+1) y la flecha indica la transcripción de NtQPT1. Los diez exones se presentan como barras rayadas en diagonal. Las series de deleción del promotor se muestran también como barras sólidas truncadas desde el extremo 5' del promotor. Se indican los tamaños de los fragmentos del promotor fusionados con el gen uidA, que codifica \beta-glucuronidasa (GUS), (es decir, \Delta2,0, \Delta1,4, etc) en kilopares de bases (kb). Las fusiones quiméricas promotor de NtQPT1-uidA se clonaron en pBI101.
La Figura 3 muestra la actividad de \beta-glucuronidasa (GUS) en raíces, hojas, y tallos de plantas de tabaco transgénicas que llevan el promotor 35S de CaMV (Ca MV 35S), la GUS sin promotor (pBI101), y deleciones 5' anidadas del promotor TobRD2 (gen que codifica NtQPT1) fusionado con GUS. Se indican los tamaños de los fragmentos del promotor fusionados con el gen uidA (es decir, \Delta2,0, \Delta1,4, etc) en kilopares de bases (kb). Para cada construcción se ensayaron al menos 20 transformantes independientes.
Descripción detallada de realizaciones preferidas
El término "plantas" como se usa en este documento se refiere a plantas vasculares. Plantas ejemplares incluyen, aunque sin limitación, maíz (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa sp.), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa) colza (Brassica napus), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), Batata (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Cofea sp) coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus sp), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa sp), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale) macadamia (Macadamia integrifolia), almendro (Prunus amygdalus), remolacha (Beta vulgaris), manzano (Malus pumila), zarzamora (Rubus), fresa (Fragaria), nogal (Juglans regia), vid (Vitis vinifera), albaricoquero (Prunus armeniaca), cerezo (Prunus), melocotonero (Prunus persica), ciruelo (Prunus domestica), peral (Pyrus communis), sandía (Citrullus vulgaris) lenteja de agua (Lemna), avena, cebada, verduras, plantas decorativas, coníferas, céspedes, (por ejemplo, para fines ornamentales, recreativos o de forraje). Las verduras incluyen especies de Solanáceas (por ejemplo, tomates, Lycopersicon esculentum) lechuga (por ejemplo, Lactuea sativa), zanahorias (Caucus carota), coliflor (Brassica oleracea), apio (Apium graveolens), berenjena (Solanum melongena), espárrago (Asparagus officinalis), okra (Abelmoschus esculentus), judías verdes (Phaseolus vulgaris), haba de lima (Phaseolus limensis), guisante (Lathyrus sp.), miembros del género Cucurbita tales como calabaza Hubbard (C. hubbard), calabaza Butternut (C. moschata), calabacín (C. pepo), calabaza de cuello curvo (C. crookneck), C. argyrosperma, C. argyrosperma sp sosoria, C. digitata, C. ecuadorensis, C, foetidissima, C. lundelliana, y C. martinetzii, y miembros del género Cucumis tales como pepino (cucumis sativus), cantalupo (C. cantalupensis), y melón (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron sp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa sp.), tulipanes (Tulipa sp.), narcisos (Narcissus sp.), petunia (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherima), y crisantemo. Las coníferas que pueden emplearse para poner en práctica la presente invención, incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino taeda (Pinus taeda) pino elliotii (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus contorta), y pino monterrey (Pinus radiata); abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); tuya de Canadá (Tsuga canadensis); picea blanca (Picea glauca); secoya (Sequoia sempervirens); auténticos abetos tales como pinabeto del pacífico (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como tuya gigante (Thuja plicata) y ciprés de Nootka (Chamaecyparis nootkatensis). Los céspedes incluyen, aunque sin limitación, céspedes de zoysia, céspedes de grama bent, céspedes de festuca, céspedes de grama azul, céspedes de grama de San Agustín, céspedes de grama bermuda, céspedes de hierba búfalo, céspedes de raigrás, y céspedes de pasto ovillo. También se incluyen plantas que sirven principalmente como modelos de laboratorio, por ejemplo, Arabidopsis. Las plantas preferidas para uso en los presentes procedimientos incluyen (aunque sin limitación) legumbres, especies de solanaceas (por ejemplo, tomates), verduras de hoja tales como lechuga y repollo, céspedes, y plantas cultivadas (por ejemplo, tabaco, trigo, sorgo, cebada, centeno, arroz, maíz, algodón, yuca, y similares), y plantas de laboratorio (por ejemplo, Arabidopsis). Aunque puede usarse cualquier planta para realizar la presente invención, las plantas de tabaco son particularmente preferidas.
Las partes de la planta que pueden recogerse de las plantas de la presente invención (por ejemplo, cortarse o cosecharse) incluyen, por ejemplo, frutos, flores, semilla, raíces, tubérculos, hojas, tallos, corteza, madera, etc. Nótese que cuando se hace referencia a una proteína particular que se aumenta o reduce en una planta, la cantidad de esa proteína puede alterarse por toda la planta, o solamente en una parte particular.
En conjunto, en una realización ilustrativa de la invención, la nicotina se produce en plantas de tabaco mediante la condensación de ácido nicotínico y un catión de N-metilpirrolinio. La vía biosintética que da como resultado la producción de nicotina se ilustra en la Figura 1. Dos loci reguladores (Nic1 y Nic2) actúan como reguladores co-dominantes de la producción de nicotina. Los análisis de enzimas de raíces de mutantes Nic sencillos y dobles muestran que las actividades de dos enzimas, quinolato fosforribosil transferasa (QPTasa) y metil transferasa de la pudrición (PMTasa), son directamente proporcionales a los niveles de biosíntesis de nicotina. Una comparación de la actividad enzimática en tejidos de tabaco (raíz y callos) con diferentes capacidades de síntesis de nicotina muestra que la actividad QPTasa y PMTasa están estrictamente correlacionadas con el contenido de nicotina (Wagner y Wagner, Planta 165:532 (1985)). Saunders y Bush (Plant Physiol 64:236 (1979) demostraron que el nivel de QPTasa en las raíces de mutantes bajos en nicotina es proporcional al nivel de nicotina en las hojas.
La presente invención se basa, en una realización preferida, en un ácido nucleico aislado (por ejemplo, SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma constituido por al menos 200 nucleótidos consecutivos) que es o contiene al menos un elemento regulador de actuación en cis, que existe cadena arriba de las secuencias codificantes de quinolato fosforribosil transferasa (QPTasa) y metil transferasa de la pudrición (PMTasa) de la planta.
Por tanto, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos abarcados tienen una estructura que promueve una interacción con uno o más factores de transcripción (por ejemplo, Nic1 y Nic2), que están implicados en el inicio de la transcripción de QPTasa y/o PMTasa. Por consiguiente, se dice que dichos ácidos nucleicos son o contienen secuencias de unión a al menos un factor de transcripción (por ejemplo, Nic1 y Nic2), que también se denominan "elementos reguladores de actuación en cis". Introduciendo múltiples copias de estos elementos reguladores de actuación en cis (por ejemplo, secuencias que interaccionan con Nic1 y/o Nic2) en una célula vegetal, la capacidad del factor de transcripción para iniciar la transcripción del gen fijado como objetivo (por ejemplo, genes QPTasa y/o PMTasa) puede reducirse o inhibirse.
Puesto que las actividades de QPTasa y PMTasa están estrictamente correlacionadas con el contenido de nicotina, la construcción de plantas de tabaco transgénicas en las que los niveles de QPTasa o PMTasa están rebajados en las raíces de la planta (en comparación con los niveles en plantas de tipo silvestre), como se ha descrito anteriormente, da como resultado plantas que tienen niveles reducidos de nicotina. Sin el deseo de limitarse por ninguna teoría particular, se contempla que la creación de plantas de tabaco, tabaco, y productos de tabaco que tienen una cantidad reducida de nicotina también tendrán una cantidad reducida de TSNA. Esto es, retirando la nicotina de las plantas de tabaco, tabaco, y productos de tabaco, se retira eficazmente el sustrato alcaloide para la formación de TSNA. Se descubrió que la reducción de nicotina en el tabaco se relacionaba directamente con la reducción de TSNA. Inesperadamente, los procedimientos descritos en este documento no sólo producen tabaco con un potencial adictivo reducido sino que, de forma concomitante, producen un tabaco que tiene un potencial carcinogénico más bajo.
Se debe hacer hincapié en que la frase "una cantidad reducida" pretende referirse a una cantidad de nicotina y/o de TSNA en una planta de tabaco transgénica, tabaco, o un producto de tabaco que es menor que la que se encontraría en una planta de tabaco, tabaco, o producto de tabaco de la misma variedad de tabaco procesada de la misma manera, que no se hizo transgénica para nicotina y/o TSNA reducidas. Por tanto, en algunos contextos, se usa tabaco de tipo silvestre de la misma variedad que se ha procesado de la misma manera como un control mediante el cual medir si se ha obtenido una reducción en nicotina y/o TSNA mediante los procedimientos de la invención descritos en este documento.
El tabaco de tipo silvestre varía de forma significativa en la cantidad de TSNA y nicotina dependiendo de la variedad y de la manera en que se cultiva, recoge, y cura. Por ejemplo, una hoja de tabaco Burley tiene 30.000 partes por millón (ppm) de nicotina y 8.000 partes por billón (ppb) de TSNA; una hoja de Burley curado al aire caliente tiene 20.000 ppm de nicotina y 300 ppb de TSNA; y una hoja de Oriental curado tiene 10.000 ppm de nicotina y 100 ppb de TSNA. Una planta de tabaco o parte de la misma que tiene una cantidad de nicotina y/o TSNA reducida, de acuerdo con la invención, puede tener nicotina y/o TSNA no detectables, o puede contener algunas cantidades detectables de una o más TSNA y/o nicotina siempre que la cantidad de nicotina y/o TSNA sea menor que la descubierta en una planta de control de la misma variedad. Esto es, una realización de hoja de tabaco Burley de la invención que tiene una cantidad reducida de nicotina puede tener entre 0 y 30.000 ppm de nicotina, y 0 y 8.000 ppb de TSNA, deseablemente entre 0 y 20.000 ppm de nicotina y 0 y 6.000 ppb de TSNA, más deseablemente entre 0 y 10.000 ppm de nicotina y 0 y 5.000 ppb de TSNA, preferiblemente entre 0 y 5.000 ppm de nicotina y 0 y 4.000 ppb de TSNA, más preferiblemente entre 0 y 2.500 ppm de nicotina y 0 y 2.000 ppb de TSNA y aún más preferiblemente entre 0 y 1.000 ppm de nicotina y 0 y 1.000 ppb de TSNA. Las realizaciones de hoja de Burley preparadas mediante los procedimientos descritos en este documento también pueden tener entre 0 y 1000 ppm de nicotina y 0 y 500 ppb de TSNA y algunas realizaciones de hoja de Burley preparadas mediante los procedimientos descritos en este documento tienen una cantidad prácticamente no detectable de nicotina o TSNA.
De forma similar, una realización de hoja de tabaco curado al aire caliente de la invención que tiene una cantidad reducida de nicotina puede tener entre 0 y 20.000 ppm de nicotina y 0 y 300 ppb de TSNA, deseablemente entre 0 y 15.000 ppm de nicotina y 0 y 250 ppb de TSNA, más deseablemente entre 0 y 10.000 ppm de nicotina y 0 y 200 ppb de TSNA, preferiblemente entre 0 y 5.000 ppm de nicotina y 0 y 150 ppb de TSNA, más preferiblemente entre 0 y 2.500 ppm de nicotina y 0 y 100 ppb de TSNA y aún más preferiblemente entre 0 y 1.000 ppm de nicotina y 0 y 50 ppb de TSNA. Las realizaciones de tabaco curado al aire caliente preparadas mediante los procedimientos descritos en este documento pueden tener también entre 0 y 500 ppm de nicotina y 0 y 25 ppb de TSNA y algunas realizaciones de tabaco curado al aire caliente preparadas mediante los procedimientos descritos en este documento tienen una cantidad prácticamente no detectable de nicotina o TSNA.
Además, una realización de tabaco Oriental curado de la invención que tiene una cantidad reducida de nicotina puede tener entre 0 y 10.000 ppm de nicotina y 0 y 100 ppb de TSNA, deseablemente entre 0 y 7.000 ppm de nicotina y 0 y 75 ppb de TSNA, más deseablemente entre 0 y 5.000 ppm de nicotina y 0 y 50 ppb de TSNA, preferiblemente entre 0 y 3.000 ppm de nicotina y 0 y 25 ppb de TSNA, más preferiblemente entre 0 y 1.500 ppm de nicotina y 0 y 10 ppb de TSNA y aún más preferiblemente entre 0 y 500 ppm de nicotina y nada de TSNA. Las realizaciones de tabaco Oriental curado preparadas mediante los procedimientos descritos en este documento también pueden tener entre 0 y 250 ppm de nicotina y nada de TSNA y algunas realizaciones de tabaco Oriental curado preparadas mediante los procedimientos descritos en este documento tienen una cantidad prácticamente no detectable de nicotina o TSNA.
La presente invención proporciona procedimientos y construcciones de ácido nucleico para producir dichas plantas transgénicas, así como dichas plantas transgénicas. Dichos procedimientos incluyen el desarrollo de casetes transgénicos que reducirán (o eliminarán) la biosíntesis de nicotina. Las plantas de tabaco se transforman con una cantidad excesiva de secuencias de ADN (elementos de actuación en cis) a partir de los promotores de genes que codifican, aunque sin limitación, QPTasa y PMTasa que están regulados en la biosíntesis de nicotina. Estos elementos de actuación en cis se integran preferiblemente en el genoma de la planta para permitir que se transfieran a sucesivas generaciones. Típicamente, las proteínas de unión a ADN de Nic1 y Nic2 que interaccionan con estas secuencias de ADN de actuación en cis se expresan a niveles relativamente bajos en la célula, de este modo el exceso de elementos de actuación en cis transgénicos competirá con los elementos endógenos asociados con los genes que codifican, aunque sin limitación, QPTasa y PMTasa por Nic1 y Nic2 disponibles. Por consiguiente, estas secuencias de ADN de actuación en cis (y las de otros elementos de actuación en cis) se denominan en este documento "señuelos" o "señuelos moleculares". La competencia disminuye la ocupación de las proteínas de unión a ADN de actuación en trans en sus elementos afines de actuación en cis, regulando negativamente de este modo la síntesis de enzimas de la biosíntesis de nicotina.
La presente invención también proporciona moléculas de ADN de elementos de actuación en cis de QPTasa o PMTasa, y vectores que comprenden esas moléculas de ADN, así como células de plantas transgénicas y plantas transformadas con esas moléculas y vectores de ADN. Las células y plantas transgénicas de tabaco de la presente invención se caracterizan por un contenido de nicotina más bajo que las células y plantas de tabaco no transformadas de control.
Las plantas de tabaco con niveles bajos de producción de nicotina, o básicamente sin producción de nicotina, son atractivas como destinatarias de transgenes que expresan productos de valor comercial tales como productos farmacéuticos, componentes cosméticos, o aditivos alimentarios. El tabaco es atractivo como una planta destinataria para un trasgén que codifica un producto deseable, puesto que el tabaco se manipula genéticamente de forma fácil y produce mucha biomasa por acre (0,4047 hectáreas); las plantas de tabaco con recursos dedicados a la producción de nicotina reducidos, tendrán por consiguiente más recursos disponibles para la producción de productos de transgenes. Los procedimientos para transformar tabaco con transgenes que producen los productos deseados se conocen en la técnica; puede utilizarse cualquier técnica adecuada con las plantas de tabaco bajas en nicotina de la presente invención.
Las plantas de tabaco de la presente invención con expresión de QPTasa y PMTasa reducida y niveles de nicotina reducidos serán deseables en la producción de productos de tabaco que tienen contenido de nicotina y/o TSNA reducido. Las plantas de tabaco descritas en este documento son adecuadas para técnicas de cultivo y recolección convencionales (por ejemplo, cortando o no la parte superior, embolsando o no las flores, cultivo en un suelo rico en abono o sin abono) y las hojas y tallos recogidos son adecuados para uso en cualquier producto de tabaco tradicional incluyendo, aunque sin limitación, tabaco de pipa, de puro y de cigarrillo, y tabaco de mascar en cualquier forma incluyendo tabaco en rama, tabaco picado, o tabaco cortado.
También se contempla que el tabaco bajo en nicotina y/o TSNA descrito en este documento puede procesarse y mezclarse con tabaco convencional para crear una amplia gama de productos de tabaco con cantidades variables de nicotina y/o nitrosaminas. Estos productos de tabaco mezclados pueden usarse en programas para el cese de productos de tabaco para cambiar lentamente a un consumidor de un producto alto en nicotina y TSNA a un producto bajo en nicotina y TSNA. Por ejemplo, un fumador puede empezar el programa fumando cigarrillos mezclados que tienen 10 mg de nicotina y 1,5 mg de nitrosamina, cambiar gradualmente a fumar cigarrillos con 7 mg de nicotina y 1 mg de nitrosamina, seguidos de cigarrillos que tienen 5,0 mg de nicotina y 0,5 mg de nitrosamina, seguidos de cigarrillos que tienen 2,0 mg de nicotina y 0,25 mg de nitrosamina, seguidos de cigarrillos que tienen 1,0 mg de nicotina y nada de TSNA hasta que el consumidor decida fumar solamente los cigarrillos que no tienen prácticamente nicotina ni nitrosaminas o dejar por completo de fumar. Por consiguiente, los cigarrillos mezclados descritos en este documento proporcionan la base para un enfoque para reducir el potencial carcinogénico en un ser humano de manera escalonada.
1. Ácidos nucleicos que codifican elementos de actuación en cis tales como elementos sensibles al producto del gen Nic
Pueden aislarse elementos sensibles al producto del gen Nic explorando la región promotora de genes que se activan de forma transcripcional por el producto del gen Nic de la misma manera a como se describe en este documento, o pueden identificarse por hibridación con la SEC ID Nº: 1 de este documento y posteriormente seleccionando la capacidad de unirse al producto del gen Nic de la manera que se describe a continuación.
Las secuencias de ácido nucleico empleadas para realizar la presente invención incluyen la SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma constituido por al menos 200 nucleótidos consecutivos. Esta definición pretende abarcar variaciones alélicas naturales del ADN de la SEC ID Nº: 1 o dichos fragmentos. Por tanto, también pueden usarse secuencias de ADN que sean al menos un 90% idénticas a la SEC ID Nº:1, o el complemento de las mismas, y que, cuando se acoplan en un gen informador son capaces de promover la expresión de dicho informador a niveles al menos 1,5 veces más altos en plantas Nic^{+}/nic^{-} en comparación con plantas nic^{-}/nic^{-}. Las condiciones que permitan otras secuencias de ADN con similitud de secuencia con la SEC ID Nº: 1 pueden determinarse de manera rutinaria. Por ejemplo, la hibridación de dichas secuencias puede realizarse en condiciones de rigurosidad reducida o incluso condiciones rigurosas (por ejemplo, condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, SDS al 0,1% a 60ºC o incluso 70ºC a ADN con la secuencia dada en este documento como SEC ID Nº:1 usando un ensayo de hibridación in situ convencional. Véase J. Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory)). En general, dichas secuencias serán al menos similares en un 65%, similares en un 75%, similares en un 80%, similares en un 85%, similares en un 90%, o incluso similares en un 95%, o más, con la secuencia dada en este documento como SEC ID Nº: 1. Las determinaciones de la similitud de secuencia se hacen con las dos secuencias alineadas para un emparejamiento máximo; se permite que los huecos en cualquiera de las dos secuencias se emparejen para maximizar el emparejamiento. Se prefieren longitudes de hueco de 10 o menos, se prefieren más longitudes de hueco de 5 o menos, se prefieren aún más longitudes de hueco de 2 o menos.
La secuencia de ADN de la presente invención puede estar esencialmente constituida por la secuencia proporcionada en este documento (SEC ID Nº:1).
El uso de la frase "similitud de secuencia sustancial" en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, significa que las secuencias de ADN, ARN o aminoácidos que tienen variaciones de secuencia ligeras y sin consecuencias a partir de las secuencias exactas descritas y reivindicadas en este documento, se consideran equivalentes a las secuencias de la presente invención. En este aspecto, "variaciones de secuencia ligeras y sin consecuencias" significa que secuencias "similares" (es decir, las secuencias que tienen similitud de secuencia sustancial con el ADN, ARN, o proteínas descritas y reivindicadas en este documento) serán funcionalmente equivalentes a las secuencias descritas y reivindicadas en la presente invención. Las secuencias funcionalmente equivalentes funcionarán básicamente de la misma manera para producir básicamente las mismas composiciones que las composiciones de ácidos nucleicos y aminoácidos descritas y reivindicadas en este documento.
Las secuencias de ADN proporcionadas en este documento pueden transformarse en diversas células huésped, como se describe a continuación. Diversas células huésped, que tienen propiedades de cultivo y manejo deseables, están disponibles fácilmente en la técnica.
El uso de la frase "aislado" o "básicamente puro" en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones como un modificador de ADN, ARN, polipéptidos o proteínas significa que el ADN, ARN, polipéptidos o proteínas así denominadas se han separado de sus entornos celulares in vivo a través de los esfuerzos de los seres humanos. Como se usa en este documento, una "secuencia de ADN nativa" o "secuencia de ADN natural" significa una secuencia de ADN que puede aislarse de células o tejido no transgénico. Las secuencias de ADN nativas son las que no se han alterado artificialmente, tal como por mutagénesis sitio-dirigida. Una vez que se identifican las secuencias de ADN nativas, las moléculas de ADN que tienen secuencias nativas de ADN pueden sintetizarse o producirse químicamente usando procedimientos de ADN recombinante como se conocen en la técnica. Como se usa en este documento, una secuencia de ADN de una planta nativa es la que puede aislarse de células o tejido de plantas no transgénicas. Como se usa en este documento, una secuencia de ADN de tabaco nativa es la que puede aislarse de células o tejido de tabaco no transgénico.
2. Construcciones y vectores de transferencia de ácido nucleico
Las construcciones de ácido nucleico o "casetes" de la presente invención incluyen un elemento de actuación en cis tal como un elemento sensible al producto del gen Nic como se ha descrito anteriormente, típicamente como una construcción recombinante en un ácido nucleico lineal o circular que sirve como un vector de transferencia para introducir el producto del gen Nic en células vegetales.
La construcción o casete puede proporcionarse en una construcción de ADN que tiene también al menos un sistema de replicación. Por conveniencia, es común tener un sistema de replicación funcional en Escherichia coli, tal como ColE1, pSC101, pACYC184, o similares. De esta manera, en cada etapa después de cada manipulación, la construcción resultante puede clonarse, secuenciarse, y determinarse la exactitud de la manipulación. Además, o en lugar del sistema de replicación en E. coli, puede emplearse un sistema de replicación de amplia gama de huéspedes, tal como los sistemas de replicación de los plásmidos de incompatibilidad P-1, por ejemplo, pRK290. Además del sistema de replicación, frecuentemente estará presente al menos un marcador, que puede ser útil en uno o más huéspedes, o diferentes marcadores para huéspedes individuales. Es decir, puede emplearse un marcador para selección en un huésped procariota, mientras que puede emplearse otro marcador para la selección en un huésped eucariota, particularmente la planta huésped. Los marcadores pueden ser protección contra un biocida, tal como antibióticos, toxinas, metales pesados, o similares; pueden proporcionar complementación, otorgando prototrofia a un huésped auxotrófico; o pueden proporcionar un fenotipo visible a través de la producción de un nuevo compuesto en la
planta.
Las construcciones de ácido nucleico de la presente invención pueden incluir una o más regiones de unión a la matriz en posición 5', 3', o 5' y 3' al elemento(s) de actuación en cis para potenciar la estabilidad y/o heredabilidad de las mismas, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.773.689 de Thompson y col., 5.773.695 de Thompson y col., 6.245.974 de Michalowski y col., 6.239.328 de Thompson y col., 6.100.448 de Thompson y col., y 6.037.525 de Thompson y col.
Los diversos fragmentos que comprenden las diversas construcciones, casetes, marcadores, y similares pueden introducirse de forma consecutiva mediante escisión con enzimas de restricción de un sistema de replicación apropiado, e inserción de la construcción o fragmento particular en el sitio disponible. Después de la unión y clonación la construcción de ADN puede aislarse para manipulación adicional. Todas estas técnicas se ejemplifican ampliamente por Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).
Los vectores que pueden usarse para transformar tejido de plantas con construcciones de ácido nucleico de la presente invención, incluyen vectores balísticos y vectores de Agrobacterium, así como vectores adecuados para transformación mediada por ADN. Esto se describe con más detalle a continuación.
Las moléculas y vectores de construcciones de ácido nucleico usadas para producir las células y plantas transformadas de esta invención pueden comprender además un gen marcador seleccionable dominante. Los marcadores seleccionables dominantes adecuados para uso en tabaco incluyen, inter alia, genes de resistencia a antibióticos que codifican neomicin fosfotransferasa (NPTII), higromicin fosfotransferasa (HPT), y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Otro marcador seleccionable dominante bien conocido adecuado para uso en tabaco es un gen de dihidrofolato reductasa mutante que codifica dihidrofolato reductasa resistente a metotrexato. Los vectores de ADN que contienen genes de resistencia a antibióticos adecuados, y los antibióticos correspondientes, están disponibles en el
mercado.
3. Transformación, regeneración y propagación de plantas
Las células transformadas se seleccionan de la población circundante de células no transformadas poniendo la población mezclada de células en un medio de cultivo que contiene una concentración apropiada del antibiótico (u otro compuesto normalmente tóxico para las células) contra el que el producto del gen marcador seleccionable dominante elegido confiere resistencia. De este modo, solamente las células vegetales que se han transformado sobrevivirán y se multiplicarán.
Los procedimientos para fabricar plantas recombinantes de la presente invención, en general, implican primero proporcionar una célula vegetal capaz de regeneración (la célula vegetal residiendo típicamente en un tejido capaz de regeneración). La célula vegetal se transforma después con una construcción de ADN que comprende un casete de la presente invención (como se describe en este documento) y se regenera una planta recombinante a partir de la célula vegetal transformada. Como se explica a continuación, la etapa de transformación se realiza mediante técnicas como se conocen en la técnica, incluyendo aunque sin limitación bombardear la célula de la planta con micropartículas que llevan el casete de transcripción, infectar la célula con un Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido Ti que lleva el casete, o cualquier otra técnica adecuada para la producción de una planta
transgénica.
Las micropartículas que llevan una construcción de ADN de la presente invención, micropartícula que es adecuada para la transformación balística de una célula vegetal, son también útiles para fabricar plantas transformadas de la presente invención. La micropartícula se propulsa dentro de una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada, y se regenera una planta a partir de la célula vegetal transformada. Puede usarse cualquier metodología y aparato de transformación balística de células adecuados para poner en práctica la presente invención. Los aparatos y procedimientos ejemplares de la presente invención se describen en Sandford y Wolf, Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050, y en Christou y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.015.580. Cuando se usan procedimientos de transformación balística, el casete puede incorporarse dentro de un plásmido capaz de replicarse en o integrarse dentro de la célula a transformar. Ejemplos de micropartículas adecuadas para uso en dichos sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 micrómetros (\mum). La construcción de ADN puede depositarse sobre la micropartícula mediante cualquier técnica adecuada, tal como mediante precipitación.
Se conocen numerosos sistemas de vector Agrobacterium útiles para realizar la presente invención. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.459.355 describe un procedimiento para transformar plantas susceptibles, incluyendo dicotiledóneas, con una cepa de Agrobacterium que contiene el plásmido Ti. La transformación de plantas leñosas con un vector de Agrobacterium se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.795.855. Además, la Patente de Estados Unidos Nº 4.940.838 de Schilperoort y col. describe un vector de Agrobacterium binario (es decir, uno en el que el Agrobacterium contiene un plásmido que tiene la región vir de un plásmido Ti pero no región T, y un segundo plásmido que tiene una región T pero no región vir) útil para realizar la presente invención.
Puesto que típicamente deben estar presentes en el genoma un gran número de copias de secuencias señuelo, pueden insertarse en tándem copias del elemento(s) de actuación en cis en un vector de Agrobacterium, pero el procedimiento preferido de transformación de plantas es mediante bombardeo de partículas que introduce múltiples copias del ADN transgénico en el genoma de la planta. La cantidad exacta del elemento de actuación en cis (ya esté cada uno individualmente presente en un vector tal como un plásmido, ya se cuenten múltiples copias en un único vector o plásmido, o combinaciones de los mismos) que debe insertarse en las células huésped (y la progenie o células hijas de las mismas) para obtener niveles aumentados o disminuidos de la proteína de interés en las células y plantas de la invención, dependerá en parte del elemento particular, pero en general será al menos 20, 30, ó 50 hasta aproximadamente 500, 1.000 ó 2.000, o más.
Pueden transformarse especies de plantas con la construcción de ADN de la presente invención mediante la transformación mediada por ADN de protoplastos de células vegetales y posterior regeneración de la planta a partir de los protoplastos transformados de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. La fusión de protoplastos de tabaco con liposomas que contienen ADN o mediante electroporación se conoce en la técnica. (Shillito y col., "Direct Gene Transfer to Protoplast of Dicotyledonous and Monocotyledonous Plants by a Number of Methods, Including Electroporation", Methods in Enzymology 153, 313-36 (1987)).
Como se usa en este documento, "transformación" se refiere a la introducción de ADN exógeno en las células, para producir células transgénicas transformadas de forma estable con el ADN exógeno. Por "transformadas de forma estable" se entiende que el ácido nucleico exógeno se pasa a las células hijas o progenie de las células transformadas inicialmente, y preferiblemente se pasan a o es heredado por las plantas de la progenie de las plantas transformadas (incluyendo plantas de la progenie reproducidas sexual y asexualmente).
A las células transformadas se les induce a regenerar plantas intactas a través de la aplicación de técnicas de cultivo celular y tisular que se conocen bien en la técnica. El procedimiento de regeneración de la planta se elige para que sea compatible con el procedimiento de transformación. Después de la regeneración de plantas transgénicas a partir de células transformadas, la secuencia de ADN introducida se transfiere fácilmente a otras variedades de la planta a través de prácticas convencionales de reproducción de plantas y sin experimentación indebi-
da.
Por ejemplo, para analizar la segregación del ADN transgénico, pueden cultivarse hasta su pleno desarrollo plantas transformadas regeneradas (R_{0}), ensayarse para los niveles de la proteína de interés, y autorreproducirse para producir plantas R_{1}. Un porcentaje de las plantas R_{1} que llevan el ADN transgénico son homocigóticas para el ADN transgénico. Para identificar plantas R_{1} homocigóticas, se cultivan hasta pleno desarrollo plantas R_{1} transgénicas y se autorreproducen. Las plantas R_{1} homocigóticas producirán progenie R_{2} donde cada planta de la progenie lleva el ADN transgénico; la progenie de las plantas R_{1} heterocigóticas segregará 3:1.
La nicotina sirve como un pesticida natural que ayuda a proteger a las plantas de tabaco del daño por plagas. Puede ser deseable por lo tanto, transformar adicionalmente plantas bajas en o sin nicotina producidas mediante los presentes procedimientos con un transgén (tal como Bacillus thuringiensis) que conferirá protección adicional contra
insectos.
Una planta preferida para uso en la presente invención es cualquier especie del género Nicotiana, o tabaco, incluyendo N. tabacum, N. rustica y N. glutinosa. Puede usarse cualquier cepa o variedad de tabaco.
Cualquier tejido de plantas capaz de propagación clonal posterior, ya sea mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con un vector de la presente invención. El término "organogénesis", como se usa en este documento, significa un procedimiento mediante el cual brotes y raíces se desarrollan secuencialmente a partir de centros meristemáticos; el término "embriogénesis", como se usa en este documento, significa un procedimiento por el cual brotes y raíces se desarrollan juntos de forma coordinada (no secuencialmente), ya sea a partir de células somáticas o de gametos. El tejido particular elegido variará dependiendo del sistema de propagación clonal disponible para, y más apropiado para, las especies particulares que se transforman. Tejidos diana ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, tejido de callos, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemos apicales, yemas axilares, y meristemos radiculares), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristemo del cotiledón y meristemo del hipocótilo).
Las plantas de la presente invención pueden tomar diversas formas. Las plantas pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; las plantas pueden ser transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete); las plantas pueden comprender injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, una raíz madre transformada injertada en un vástago sin transformar en especies de cítricos). Las plantas transformadas pueden propagarse por diversos medios, tales como mediante propagación clonal o técnicas de cultivo clásicas. Por ejemplo, plantas transformadas de primera generación (o T1) pueden autorreproducirse para dar plantas transformadas homocigóticas de segunda generación (o T2), y las plantas T2 propagarse adicionalmente mediante técnicas de cultivo clásicas. Un marcador seleccionable dominante (tal como nptII) puede asociarse con la construcción para ayudar en el cultivo.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, para ayudar a asegurar que una cantidad suficiente de señuelos o elementos de actuación en cis se insertan en las células y se retienen durante muchas divisiones celulares para producir una planta transgénica con niveles alterados de proteína o proteínas en su interior, se usa la transformación biolística como se ha descrito anteriormente, se usa ADN circular o plásmidos para llevar los segmentos de señuelo de actuación en cis como se ha descrito anteriormente, el ADN circular o plásmidos que se usan son relativamente pequeños (por ejemplo, están constituidos por menos de 10.000 o menos de 6.000 pares de bases), y se inserta en las células huésped una alta proporción molar del elemento de actuación en cis con respecto al marcador seleccionable (por ejemplo, 10 a 1).
Como se usa en este documento, un cultivo comprende una pluralidad de plantas de la presente invención, y del mismo género, plantadas juntas en un campo agrícola. Por "campo agrícola" se entiende una parcela común de tierra o un invernadero. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un cultivo de plantas que tienen niveles alterados de una proteína de interés, (por ejemplo, actividad QPTasa y PMTasa y que tienen por tanto niveles de nicotina reducidos), en comparación con un cultivo similar de plantas no transformadas de la misma especie y variedad.
Aunque la invención describe procedimientos para reducir los niveles de nicotina en tabaco transgénico, este procedimiento puede emplearse también para copiar el fenotipo de mutaciones en activadores y represores transcripcionales de actuación en trans sin clonar sus respectivos loci genómicos. Se pueden analizar las regiones promotoras de un gen, usando tecnología conocida por los especialistas en la técnica, para definir regiones del promotor que respondan a factores de transcripción. Típicamente, esto se hace por análisis de deleción del promotor. Las deleciones anidadas del promotor se fusionan con un gen informador y la expresión del gen informador se controla en organismos transgénicos. El aislamiento de factores de transcripción usando tecnologías actuales es muy difícil; la presente invención evita la necesidad de clonar los factores de transcripción afines para aplicaciones en las que es deseable alterar cualquier serie de genes que están regulados de forma coordinada por uno o más activadores transcripcionales. A la inversa, el procedimiento podría regular positivamente la expresión de cualquier serie de genes que están regulados de forma coordinada por uno o más represores transcripcionales.
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención podría emplearse para alterar la expresión génica y regular negativamente la expresión de una proteína de interés que esté bajo el control de un elemento activador de actuación en cis en diversas células huésped, incluyendo células vegetales (particularmente de plantas vasculares tales como monocotiledóneas y dicotiledóneas), animales (aves, mamíferos), hongos, o bacterias, tanto in vivo como in vitro. En bacterias y hongos, pueden usarse plásmidos multicopia para aumentar las copias de señuelo molecular presentes en la célula.
Los ejemplos que siguen se muestran para ilustrar la presente invención, y no deben interpretarse como limitantes de la misma.
Ejemplo 1 Localización de Elemento de actuación en cis en Promotor de NtQPT1
Para caracterizar la secuencia mínima requerida para el elemento de actuación en cis NtQPT1, se aisló la región promotora del gen NtQPT1, se truncó en el extremo 5', y se fusionó con el gen que codifica \beta-glucuronidasa (GUS) para evaluar la función como un potenciador específico de la producción de nicotina. El gen NtQPT1 se aisló y secuenció. El comienzo de la transcripción se determinó comparando la secuencia de ADNc de TobRD2 con la secuencia del locus genómico. La secuencia situada en posición 5' del sitio de comienzo de la transcripción se definió como secuencia promotora. Usando cebadores de PCR y el promotor como plantilla, se hicieron truncamientos en el extremo 5' del promotor para determinar la secuencia potenciadora de actuación en cis mínima (véase Figura 2). Los truncamientos se fusionaron con el gen uidA, que codifica GUS. El gen de fusión se insertó en un vector y se transformó mediante procedimientos convencionales de transformación balística en Nicotiana tabacum Burley
21.
La actividad de GUS se ensayó dividiendo las plantas en raíces, tallos, y hojas. Cada tejido de la planta, transformado con una construcción de truncamiento de NtQPT1 diferente, se trituró con un mortero y maza de mortero, las proteínas se extrajeron con tampón NaPO_{4}, pH 7,0, se añadió X-Glc (100 \mug/ml), y el ensayo se realizó a 37ºC durante 30 min. La actividad de GUS se midió a 595 nm). Para cada construcción se ensayaron al menos 20 transformantes independientes. Se determinó la media y la desviación típica. La actividad de GUS en los truncamientos se comparó con una fusión CaMV 35S-GUS y un control con GUS sin promotor (pBI101). La actividad máxima de GUS, que representa la expresión de NtQPT1, se obtuvo cuando se fusionó de -586 a -2000 pb al gen uidA (Figura 3). Los promotores más cortos de -1 a -586 no mantuvieron niveles altos de expresión de uidA. Por lo tanto, el elemento de actuación en cis de NtQPT1 se sitúa entre -586 y -2000 pb en posición 5' del sitio de comienzo de la
transcripción.
Ejemplo 2 Localización del Sitio de Unión al Producto del Gen Nic en el promotor de NtQPT1
La serie de deleción del promotor de NtQPT1 fusionada con el gen informador uidA (que codifica GUS) se utilizó para transformar plantas de N. tabacum homocigóticas nic^{-}/nic^{-}. Los transformantes R_{0} que tenían el ADN transgénico en un único locus se cruzaron con plantas homocigóticas nic^{-}/nic^{-} o Nic^{+}/Nic^{+} para dar progenie homocigótica (nic^{-}/nic^{-}) y heterocigótica (Nic^{+}/nic^{-}) que llevan el transgén (promotor de NtQPT1-GUS) en la misma posición cromosómica. La actividad de GUS se cuantificó en múltiples progenies de múltiples transformantes independientes y se comparó entre los fenotipos Nic^{+} y nic^{-} (Tabla 1). Se determinó que las proporciones mayores de 1,5 contenían los elementos de actuación en cis que respondían a la activación por el producto del gen
Nic.
TABLA 1 Regulación de la Expresión de GUS dirigida por el promotor de NtQPT1, por los Productos del Gen Nic en Tabaco
1
Estos experimentos demostraron que la unión de los productos del gen Nic se sitúa entre aproximadamente -1000 y -600 ó -700 pb del promotor de NtQPT1 como se determinó mediante la actividad de GUS en plantas Nic^{+}/nic^{-} y nic^{-}/nic^{-}.
Ejemplo 3 Regulación de la Expresión Génica de NtQPT1 Usando Señuelos Moleculares
La secuencia de nucleótidos situada entre -1000 y -600 ó -700 pb del promotor de NtQPT1 se inserta en series en tándem en un vector lanzadera de Agrobacterium de plantas y posteriormente se utiliza para transformar tabaco mediante procedimientos conocidos por un especialista en la técnica. Las plantas transformadas de forma estable con dicho vector se ensayan para el nivel de expresión de NtQPT1 y para evaluar el contenido de nicotina y/o TSNA. Estos experimentos demostrarán que el tabaco transformado con señuelos moleculares que interaccionan con productos del gen Nic mostrarán una cantidad reducida de nicotina y/o TSNA. Las plantas con múltiples inserciones en tándem del señuelo molecular que tienen expresión de NtQPT1 reducida y niveles de nicotina reducidos se usan para la expresión de productos de valor comercial y la producción de productos de tabaco que tienen contenido de nicotina y/o TSNA reducido.
Ejemplo 4 Regulación de la Unión a ASF-1 Usando un Señuelo Molecular TGACG
La secuencia de nucleótidos TGACG se inserta en series en tándem en un vector lanzadera de Agrobacterium de plantas y se utiliza para transformar una planta tal como guisante mediante procedimientos conocidos por un especialista en la técnica. Las plantas transformadas de forma estable con dicho vector tienen reducida la actividad de unión del factor de unión a ADN de actuación en trans ASF-1 que reconoce el motivo de secuencia TGACG que se encuentra en genes de plantas tales como genes de histona (Mikami y col., (1987) FEBS Lett. 223:273); genes de las enzimas para la biosíntesis de agropina (Velten y col., EMBO J. 3:2723-30); el gen de la octopina sintasa (Ellis y col., EMBO J. 6:3203) y el gen de la manopina sintasa (DeRita y Gelvin, (1987) Mol. Gen. Genet. 207:233); así como el gen de CaMV35S, el gen de la histona H3 y el gen de la nopalina sintasa.
Ejemplo 5 Regulación de la Expresión Espacial y Temporal de Beta-Faseolina Usando Señuelos Moleculares
La secuencia de nucleótidos correspondiente a UAS1 (-295 a -109) del gen de beta-faseolina, se inserta en series en tándem en un vector lanzadera de Agrobacterium de plantas y se utiliza para transformar una planta leguminosa mediante procedimientos conocidos por un especialista en la técnica. Las plantas transformadas de forma estable con dicho vector tienen reducida la actividad de unión del factor de unión a ADN de actuación en trans PvALF, que reconoce las secuencias CATGCAAA y CATGCATG situadas en UAS1 (Bobb y col. (1997) Nucleic Acids Res 25(3):641-7). Las plantas con unión de PvALF reducida podrían tener expresión reducida de la expresión de beta-faseolina específica de semillas principalmente en cotiledones y brotes meristemáticos (Bustos y col. (1991) EMBO J. 10(6):1469-1479).
La transformación de series en tándem de secuencias de nucleótidos correspondientes a la caja de vicilina (GCCACCTCAA; SEC ID Nº: 2) y el sitio B (CACACGTCAA: SEC ID Nº: 3) del gen de beta faseolina en una planta leguminosa da como resultado la actividad de unión reducida de los factores de unión a ADN de actuación en trans ROM1 y ROM2 que lleva al inicio prematuro de la expresión de beta-faseolina. Las proteínas ROM1 y ROM2 funcionan como represores de la expresión de beta-faseolina y de la subunidad L de fitohemaglutinina para bloquear el inicio de la maduración de la semilla. (Patente de Estados Unidos Nº: 6.160.202 de Bustos; Chern y col. (1996) Plant Cell 8:305-321; Chern y col. (1996) Plant J. 10:135-148).
Ejemplo 6 Regulación de la Expresión Génica de Plantas Usando Señuelos Moleculares
La transformación de plantas de tabaco con series en tándem del elemento de actuación en cis específico de raíces del promotor RB7 del tabaco (Patente de Estados Unidos Nº: 5.459.252 de Conkling y col.; Yamamoto y col. (1991) Plant Cell 12:3399-3406), que codifica un gen estructural, da como resultado la actividad de unión reducida del factor de unión a ADN de actuación en trans del elemento de actuación en cis RB7.
Así mismo, se usan series en tándem similares de los siguientes elementos cis para transformar plantas para reducir la actividad de unión de los factores de unión a ADN de actuación en trans correspondientes: el elemento de repetición de actuación en cis AATT y su factor de actuación en trans PABF correspondiente (véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.834.236 y 6.191.258); el elemento regulador positivo poli(dA-dT) y la proteína de unión y el elemento de repetición negativo CCAA y la proteína de unión (Wang y col. (1992) Mol. Cell Biol. 12:3399-3406); el elemento regulador de la punta de la raíz del promotor del fitocromo AI de tabaco (Adam y col. (1995) Plant Mol. Biol. 29:983-993); el elemento sensible a anaerobiosis del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 4 de maíz (Geffers y col. (2000) Plant Mol. Bio. 43:11-21); y la región reguladora específica de semilla de un gen de oleosina de Arabidopsis (véase la Patente de Estados Unidos Nº: 5.792.922).
Ejemplo 7 Tabaco que Tiene Niveles de Nicotina y/o TSNA Reducidos Generado Usando Señuelos Moleculares
Se fijan múltiples copias de un fragmento de aproximadamente 300 ó 400 nucleótidos de largo del promotor de NtQPT1 (por ejemplo, que incluye la secuencia de nucleótidos situada entre -1000 y -600 ó -700 pb del promotor de NtQPT1, tal como SEC ID Nº: 1) a micropartículas (por ejemplo, mediante precipitación) que son adecuadas para la transformación balística de una célula vegetal (por ejemplo, esferas de oro de 1 a 5 \mum). Las micropartículas se propulsan dentro de células de plantas de tabaco (por ejemplo, Burley 21 LA) para producir células vegetales transformadas, y las plantas se regeneran a partir de las células vegetales transformadas. Burley 21 LA es una variedad de Burley 21 con niveles de nicotina considerablemente reducidos en comparación con Burley 21 (es decir, Burley 21 LA tiene un 8% de los niveles de nicotina de Burley 21, véase Legg y col., Can J Genet Cytol, 13:287-91 (1971); Legg y col., J Hered, 60:213-217 (1969)).
\newpage
Puede usarse cualquier metodología y aparato de transformación balística de células adecuado. Se describen ejemplos de aparatos y procedimientos adecuados en Sanford y Wolf, Patente de Estados Unidos Nº 4.945.050, y en Christou y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.015.580.
Opcionalmente, el ácido nucleico transformado puede incluir un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, un marcador que permite selección positiva o negativa de transformantes) o los señuelos moleculares pueden co-transferirse con un gen marcador seleccionable. De esta manera, los transformantes positivos pueden identificarse fácilmente.
Las células, tejidos, y plántulas transformadas se cultivan en medio Murashige-Skoog (MS) (con o sin el compuesto de selección, por ejemplo, antibiótico, dependiendo de si se usó un marcador seleccionable). Se permite autorreproducirse a un centenar de transformantes independientes de Burley 21 LA (To). La progenie de las plantas autorreproducidas (T_{1}) germina. Los niveles de nicotina de la progenie T_{1} se miden cualitativamente usando una técnica de micro-ensayo. Se recogen aproximadamente \sim200 mg de hojas frescas de tabaco y se pican en 1 ml de solución de extracción (Solución de extracción: 1 ml de Ácido acético en 100 ml de H_{2}O). El homogeneizado se centrifuga durante 5 min a 14.000 x g y se retira el sobrenadante a un tubo limpio, al cual se añaden los siguientes reactivos: 100 \mul de NH_{4}OAC (5 g/100 ml H_{2}O + 50 \mul de Brij 35); 500 \mul de Bromuro de Cianógeno (Sigma C-6388, 0,5 g/100 ml de H_{2}O + 50 \mul de Brij 35); 400 \mul de Anilina (0,3 ml de Anilina tamponada en 100 ml de NH_{4}OAC + 50 \mul de Brij 35). Se prepara y se diluye una solución madre patrón de nicotina de 10 mg/ml en solución de extracción para crear una serie patrón para calibración. Se lee la absorbancia a 460 nm y se determina el contenido de nicotina de las muestras de ensayo usando la curva patrón de calibración.
A la progenie T_{1} que tiene menos del 10% de los niveles de nicotina del progenitor Burley 21 LA se le permite autorreproducirse para producir la progenie T_{2}. Después se identifica la progenie T_{2} homocigótica. Los niveles de nicotina en la progenie T_{2} homocigótica y heterocigótica se determinan también cualitativamente usando el micro-ensayo. Las muestras de hojas de la progenie T_{2} homocigótica también pueden enviarse al Southern Research and Testing Laboratory en Wilson, NC para análisis cuantitativo de niveles de nicotina usando Cromatografía de Gases/Detección de Ionización de Llama (GC/FID). La progenie T_{2} homocigótica tendrá niveles de nicotina que están considerablemente reducidos en comparación con el tabaco no transformado (por ejemplo, \sim70 ppm). Puesto que los niveles de nicotina en dichas plantas están considerablemente reducidos, los niveles de TSNA en dichas plantas están reducidos de forma concomitante.
Estos experimentos demostrarán que el tabaco transformado con señuelos moleculares que interaccionan con productos del gen Nic mostrarán una cantidad reducida de nicotina y/o TSNA. Las plantas con múltiples inserciones en tándem del señuelo molecular que tienen expresión de NtQPT1 reducida y niveles de nicotina reducidos se usan para la expresión de productos de valor comercial y la producción de productos de tabaco que tienen contenido reducido de nicotina y/o TSNA.
Ejemplo 8 Tabaco mezclado bajo en Nicotina y TSNA
El siguiente ejemplo describe varias maneras para crear productos de tabaco que tienen cantidades específicas de nicotina y/o TSNA a través de mezclado. Algunos enfoques de mezclado comienzan con tabaco preparado a partir de variedades que tienen cantidades extremadamente bajas de nicotina y/o TSNA. Mezclando tabaco preparado a partir de una variedad baja en nicotina/TSNA (por ejemplo, niveles indetectables de nicotina y/o TSNA) con un tabaco convencional (por ejemplo, Burley, que tiene 30.000 partes por millón (ppm) de nicotina y 8.000 partes por billón (ppb) de TSNA; Curado al Aire Caliente, que tiene 20.000 ppm de nicotina y 300 ppb de TSNA; y Oriental, que tiene 10.000 ppm de nicotina y 100 ppb de TSNA), pueden fabricarse productos de tabaco que tengan prácticamente cualquier cantidad deseada de nicotina y/o TSNA. Se pueden incorporar productos de tabaco que tengan diversas cantidades de nicotina y/o TSNA en kits y programas de cese del uso del tabaco, para ayudar a los usuarios de tabaco a reducir o eliminar su dependencia de la nicotina y reducir el potencial
carcinogénico.
Por ejemplo, un producto de tabaco de etapa 1 puede estar comprendido por aproximadamente el 25% de tabaco bajo en nicotina/TSNA y el 75% de tabaco convencional; un producto de tabaco de etapa 2 puede estar comprendido por aproximadamente el 50% de tabaco bajo en nicotina/TSNA y el 50% de tabaco convencional; un producto de tabaco de etapa 3 puede estar comprendido por aproximadamente el 75% de tabaco bajo en nicotina/TSNA y el 25% de tabaco convencional; un producto de tabaco de etapa 4 puede estar comprendido por aproximadamente el 100% de tabaco bajo en nicotina/TSNA y el 0% de tabaco convencional. Un kit de cese de uso de tabaco puede comprender una cantidad de producto de tabaco de cada una de las mezclas mencionadas anteriormente para satisfacer a un consumidor durante un programa de un único mes. Esto es, si el consumidor es un fumador de un paquete diario, por ejemplo, un kit de un único mes podría proporcionar 7 paquetes de cada etapa, un total de 28 paquetes de cigarrillos. Cada kit de cese del uso de tabaco podría incluir un conjunto de instrucciones que guíen específicamente al consumidor a través del procedimiento etapa a etapa. Por supuesto, los productos de tabaco que tienen cantidades específicas de nicotina y/o TSNA podrían proporcionarse en cantidades de tamaño conveniente (cajas de puros, paquetes de cigarrillos, latas de rapé, y bolsas o rollos de chicle) de modo que los consumidores podrían seleccionar la cantidad de nicotina y/o TSNA que desean individualmente. Hay muchas maneras de obtener diversas mezclas de tabaco bajo en nicotina/bajo en TSNA usando las enseñanzas descritas en este documento y lo siguiente pretende solamente guiar a un especialista en la técnica a un posible enfoque.
Para obtener un producto de tabaco de etapa 1, que es una mezcla baja en nicotina/TSNA al 25% puede mezclarse tabaco preparado a partir de un tabaco de aproximadamente 0 ppm de nicotina/TSNA con Burley, Curado al Aire Caliente, u Oriental convencionales en una proporción 25%/75% respectivamente para obtener un producto de tabaco Burley que tiene 22.500 ppm de nicotina y 6.000 ppb de TSNA, un producto Curado al aire caliente que tiene 15.000 ppm de nicotina y 225 ppb de TSNA, y un producto de Oriental que tiene 7.500 ppm de nicotina y 75 ppb de TSNA. De forma similar, para obtener un producto de etapa 2, que es una mezcla baja en nicotina/TSNA al 50% puede mezclarse tabaco preparado a partir de un tabaco de aproximadamente 0 ppm de nicotina/TSNA con Burley, Curado al Aire Caliente, u Oriental convencionales en una proporción 50%/50% respectivamente para obtener un producto de tabaco Burley que tiene 15.000 ppm de nicotina y 4.000 ppb de TSNA, un producto Curado al aire caliente que tiene 10.000 ppm de nicotina y 150 ppb de TSNA, y un producto de Oriental que tiene 5.000 ppm de nicotina y 50 ppb de TSNA. Además, puede prepararse un producto de etapa 3, que es una mezcla baja en nicotina/TSNA al 75%/25% mezclando tabaco preparado a partir de un tabaco de aproximadamente 0 ppm de nicotina/TSNA con Burley, Curado al Aire Caliente, u Oriental convencionales en una proporción 75%/25% respectivamente para obtener un producto de tabaco Burley que tiene 7.500 ppm de nicotina y 2.000 ppb de TSNA, un producto Curado al aire caliente que tiene 5.000 ppm de nicotina y 75 ppb de TSNA, y un producto de Oriental que tiene 2.500 ppm de nicotina y 25 ppb de TSNA.
Debe comprenderse que los productos de tabaco son a menudo una mezcla de muchos tipos diferentes de tabaco, que se cultivaron en muchas partes diferentes del mundo en diversas condiciones de cultivo. Como resultado, la cantidad de nicotina y TSNA será distinta de un cultivo a otro. No obstante, usando técnicas convencionales se puede determinar fácilmente una cantidad media de nicotina y TSNA por cultivo usado para crear una mezcla deseada. Ajustando la cantidad de cada tipo de tabaco que compone la mezcla un especialista en la técnica puede equilibrar la cantidad de nicotina y/o TSNA con otras consideraciones tales como apariencia, aroma, y el tiro. De esta manera, pueden crearse diversos tipos de productos de tabaco que tienen un nivel variable de nicotina y/o nitrosamina, así como, de apariencia, aroma y tiro.
<110> Conkling, Mark A.
\hskip1cm
Li, Yan 
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<120> PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE CONTIENEN SEÑUELOS MOLECULARES QUE ALTERAN EL CONTENIDO DE PROTEÍNAS EN SU INTERIOR.
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<130> 5051 471
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<150> US 60/229.198
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<151> 30-08-2000
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<160> 4
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 456
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<212> ADN
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<213> Nicotiana tabacum 
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<400> 1
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3 
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<210> 2
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia Sintética de Oligonucleótidos
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccacctcaa 
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10 
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<210> 3
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia Sintética de Oligonucleótidos
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
cacacgtcaa 
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10 
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<110> Conkling, Mark A.
\hskip1cm
Li, Yan 
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<120> PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE CONTIENEN SEÑUELOS MOLECULARES QUE ALTERAN EL CONTENIDO DE PROTEÍNAS EN SU INTERIOR.
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<130> 5051 471WO
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<140> PCT/US01/26788
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<141> 28-08-2001
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<150> US 60/229.198
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<151> 30-08-2000
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<160> 3
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 456
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<212> ADN
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<213> Nicotiana tabacum 
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<400> 1
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4 
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<210> 2
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 2
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gccacctcaa 
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10 
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<210> 3
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 3
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cacacgtcaa 
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10

Claims (15)

1. Un ácido nucleico aislado seleccionado entre el grupo constituido por:
(a)
la secuencia de ácido nucleico aislado de la SEC ID Nº: 1 o un fragmento activo de la misma, en el que dicho fragmento es al menos 200 nucleótidos consecutivos; y
(b)
una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de (a),
en el que el ácido nucleico, cuando se acopla con un gen informador y se utiliza para transformar plantas de N. tabacum, es capaz de promover la expresión de dicho gen informador a un nivel que es al menos 1,5 veces mayor cuando se expresa en plantas Nic+/nic- que cuando se expresa en plantas nic-/nic-.
2. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico es un ADN.
3. Una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que, opcionalmente la construcción es un vector de Agrobacterium y donde dicho ácido nucleico aislado está unido a dicha construcción de ácido nucleico recombinante y dicha construcción de ácido nucleico recombinante no contiene una secuencia codificante de NtQPT1, y opcionalmente la construcción de ácido nucleico recombinante es lineal o circular.
4. El ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además una micropartícula, en la que dicha micropartícula es adecuada para la transformación de una célula vegetal.
5. Una célula vegetal transformada con el ácido nucleico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
6. Un procedimiento para fabricar una planta de tabaco transgénica que tiene una cantidad reducida de nicotina, que comprende:
(i)
introducir un ácido nucleico constituido esencialmente por un elemento sensible al producto del gen Nic en al menos una célula de planta de tabaco, para producir al menos una célula de planta de tabaco transformada
conteniendo dicha al menos una célula de planta de tabaco transformada dicho ácido nucleico en un número de copias suficiente para reducir la cantidad de nicotina en una planta de tabaco regenerada a partir de dicha célula en comparación con la cantidad de nicotina que estaría presente en ausencia de dicho ácido nucleico; y donde dicho elemento sensible al producto del gen Nic se selecciona entre el grupo constituido por
(a)
la secuencia de ácido nucleico aislada de la SEC ID Nº:1 o un fragmento activo de la misma, en la que dicho fragmento comprende 20 a 455 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1;
(b)
una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1;
(c)
un ácido nucleico aislado que híbrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1 y es sensible al producto del gen Nic,
en el que el ácido nucleico, cuando se acopla con un gen informador y se utiliza para transformar plantas de N. tabacum, es capaz de promover la expresión de dicho gen informador a un nivel que es al menos 1,5 veces mayor cuando se expresa en plantas Nic+/nic- que cuando se expresa en plantas nic-/nic-.
(ii)
regenerar dicha al menos una célula de planta de tabaco transformada para obtener dicha planta de tabaco en la que el elemento sensible al producto del gen Nic es capaz de unirse a o es sensible de otra manera a un producto del gen Nic.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además:
(i)
recoger hojas de tabaco de dicha planta de tabaco, en la que dichas hojas de tabaco tienen una cantidad de nicotina reducida en comparación con la cantidad de nicotina que estaría presente en dicha planta de tabaco en ausencia de dicho ácido nucleico; y/o
(ii)
recoger semilla de tabaco de dicha planta de tabaco, en la que dicha semilla de tabaco comprende dicho ácido nucleico en un número de copias suficiente para reducir la cantidad de nicotina de una planta de tabaco reproducida a partir de dicha semilla en comparación con la cantidad de nicotina que estaría presente en ausencia de dicho ácido nucleico.
8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el ácido nucleico está incluido en una construcción de ácido nucleico recombinante, en la que dicho ácido nucleico recombinante no contiene una secuencia codificante de NtQPT1 y además en la que dicha construcción de ácido nucleico recombinante es circular o lineal.
9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicho ácido nucleico es ADN.
10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicha etapa de introducción comprende transformación balística o transformación con Agrobacterium.
11. Una planta de tabaco producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 u hoja o semilla de tabaco recogida de dicha planta.
12. Una planta de tabaco que tiene una cantidad reducida de nicotina en su interior, en la que dicha planta comprende células que comprenden un ácido nucleico exógeno, en el que dicho ácido nucleico exógeno está constituido esencialmente por un elemento sensible al producto del gen Nic; estando contenido dicho ácido nucleico exógeno en dichas células en un número de copias suficiente para reducir la cantidad de nicotina en dicha planta de tabaco en comparación con la cantidad de nicotina que estaría presente en dicha planta en ausencia de dicho ácido nucleico exógeno, y en el que dicho elemento sensible al producto del gen Nic se selecciona entre el grupo constituido por:
(a)
la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 o un fragmento activo de la misma, en el que dicho fragmento comprende de 20 a 455 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1;
(b)
una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de (a); y
(c)
un ácido nucleico aislado que híbrida con el complemento de la SEC ID Nº: 1 y es sensible a un producto del gen Nic,
en la que el ácido nucleico, cuando se acopla a un gen informador y se utiliza para transformar plantas de N. tabacum, es capaz de promover la expresión de dicho gen informador a un nivel que es al menos 1,5 veces mayor cuando se expresa en plantas Nic+/nic- que cuando se expresa en plantas nic-/nic-.
13. Una planta de tabaco de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el ácido nucleico está incluido en una construcción de ácido nucleico recombinante, en la que dicho ácido nucleico recombinante no contiene una secuencia codificante de NtQPT1 y además en la que dicha construcción de ácido nucleico recombinante es circular o lineal.
14. Una planta de tabaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en la que dicho ácido nucleico exógeno es un ADN.
15. Hoja o semilla de tabaco recogida de una planta de tabaco o semilla de tabaco que germina en una planta de tabaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
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