ES2267904T3 - Polipeptido secretado y transmembrana y acidos nucleicos que lo codifican. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado, el cual codifica un polipéptido que es un mitógeno para las células de soporte del oído interno de la rata, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de residuos aminoácidos 1 ó 22ñ5 a 125, inclusive, de la FIGURA 2 o del polipéptido de longitud completa o maduro codificado por el inserto de ADNc (DNA57700-1408) del Depósito de la ATCC Nº 203583; el cual es complementario de la misma, en donde dicha identidad de secuencia se determina usando
Description
Polipéptido secretado y transmembrana y ácidos
nucleicos que lo codifican.
La presente invención se refiere de forma
general a la identificación y aislamiento de ADN original y a la
producción recombinante de nuevos polipéptidos.
Las proteínas extracelulares tienen papeles
importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y
mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas
células individuales, por ejemplo, la proliferación, migración,
diferenciación, o interacción con otras células, está típicamente
gobernado por información recibida de otras células y/o del entorno
inmediato. Esta información se transmite a menudo mediante
polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores
de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación,
neuropéptidos, y hormonas), los cuales, a su vez, son recibidos e
interpretados por diversos receptores o proteínas unidas a
membranas celulares. Estos polipéptidos secretados o moléculas
señalizadoras normalmente pasan a través de la vía secretora celular
para alcanzar su sitio de acción en el entorno extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas
aplicaciones industriales, incluyendo como fármacos, agentes
diagnósticos, biosensores y bioreactores. La mayoría de los fármacos
proteicos disponibles en la actualidad, tales como los agentes
trombolíticos, interferones, interleucinas, eritropoyetinas,
factores estimuladores de colonias, y otras varias citocinas, son
proteínas secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana,
también tienen potencial como agentes terapéuticos o de
diagnóstico. Tanto la industria como el mundo académico están
realizando esfuerzos para identificar nuevas proteínas nativas
secretadas. Muchos esfuerzos se centran en el examen de bibliotecas
de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias
codificantes de nuevas proteínas secretadas. Los ejemplos de
procedimientos y técnicas de examen se describen en la literatura
[ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 93:7108-7113 (1996); Patente estadounidense
nº 5.536.637)].
Las proteínas unidas a membrana y los receptores
pueden jugar papeles importantes en, entre otras cosas, la
formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos
multicelulares. El destino de muchas células individuales, por
ejemplo, la proliferación, migración, diferenciación, o interacción
con otras células, está típicamente gobernado por información
recibida de otras células y/o del entorno inmediato. Esta
información se transmite a menudo mediante polipéptidos secretados
(por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia,
factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y
hormonas), los cuales, a su vez, son recibidos e interpretados por
diversos receptores o proteínas unidas a membranas celulares. Tales
proteínas unidas a membrana y receptores celulares incluyen, pero
no se limitan a, los receptores de citocinas, las quinasas de
receptores, las fosfatasas de receptores, los receptores implicados
en las interacciones célula-célula, y las moléculas
adhesinas celulares, tales como las selectinas e integrinas. Por
ejemplo, la transducción de señales que regula el crecimiento y
diferenciación celular está regulada, en parte, por la fosforilación
de varias proteínas celulares. Las quinasas de tirosina de
proteínas, enzimas que catalizan ese proceso, pueden actuar también
como receptores del factor de crecimiento. Los ejemplos incluyen el
receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor
del factor de crecimiento del nervio.
Las proteínas unidas a membrana y las moléculas
de receptor tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo
como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Por ejemplo, las
inmunoadhesinas del receptor pueden emplearse como agentes
terapéuticos para bloquear interacciones
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana
pueden usarse también en la búsqueda de péptidos o moléculas
pequeñas inhibidores potenciales de la interacción receptor/ligando
relevante.
Tanto la industria como el mundo académico están
realizando esfuerzos para identificar nuevas proteínas receptoras o
unidas a membrana. Muchos esfuerzos se centran en el examen de
bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las
secuencias codificantes de nuevas proteínas receptoras o unidas a
membrana.
Tanto la industria como el mundo académico están
realizando esfuerzos para identificar nuevas proteínas secretadas
nativas. Muchos esfuerzos se centran en el examen de bibliotecas de
ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias
codificantes de nuevas proteínas secretadas. En la presente
invención nosotros describimos la identificación y caracterización
de nuevos polipéptidos secretados, denominados en la presente
invención como polipéptidos PRO982.
Se ha identificado un clon de ADNc
(DNA57700-1408) que codifica un nuevo polipéptido
designado en la presente solicitud como "PRO982".
En una realización, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada, tal y como se define en las
reivindicaciones, que comprende ADN que codifica un polipéptido
PRO982.
En un aspecto, tal y como se define en las
reivindicaciones, la invención concierne a una molécula de ácido
nucleico aislada que comprende (a) ADN que codifica un polipéptido
que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de
secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de
identidad de secuencia, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, lo más
preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de
secuencia con la secuencia de residuos aminoácidos desde el 1 o
22\pm5 hasta el 125, inclusive, de la Figura 2 (SEC. ID. Nº: 2),
o el complementario del ADN de (a).
En un aspecto específico, la invención
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el
ADN que codifica un polipéptido PRO982, con o sin la secuencia señal
N-terminal y/o la metionina iniciadora, o es
complementario a tal molécula de ácido nucleico codificante. De
forma tentativa, se ha identificado que el péptido señal se
extiende desde la posición de aminoácido 1 hasta aproximadamente la
posición de aminoácido 21 en la secuencia de la Figura 2 (SEC. ID.
Nº: 2)
En otra realización, la invención proporciona el
polipéptido PRO982 aislado codificado por cualquiera de las
secuencias de ácido nucleico aisladas definidas más arriba en la
presente invención.
En un aspecto específico, la invención
proporciona el polipéptido PRO982 de secuencia nativa aislado, el
cual, en una realización incluye la secuencia de aminoácidos que
comprende los residuos desde 1 ó 22\pm5 hasta 125 de la Figura 2
(SEC. ID. Nº: 2).
En otro aspecto, la invención se refiere a un
polipéptido PRO982 aislado, que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad
de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de
identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente
el 90% de identidad de secuencia, lo más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la secuencia
de aminoácidos desde el residuo 1 ó 22\pm5 hasta 125, inclusive,
de la Figura 2 (SEC. ID. Nº: 2).
En aún otro aspecto, la invención se refiere a
un polipéptido PRO982 aislado, que comprende la secuencia de
residuos aminoácidos del 1 ó 22\pm5 al 125, inclusive, de la
Figura 2 (SEC. ID. Nº: 2).
En otras realizaciones de la presente invención,
la invención proporciona vectores que comprenden el ADN que
codifica cualquiera de los polipéptido descritos en la presente
invención. También se proporcionan células huésped que comprenden
cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las células huésped
pueden ser células CHO, E. coli, o levadura. Se proporciona
además un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos
descritos en la presente invención, y comprende: cultivar células
huésped en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido
deseado, y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.
En otras realizaciones, la invención proporciona
moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos
descritos en la presente invención fusionado con un polipéptido o
secuencia de aminoácidos heterólogos. Los ejemplos de tales
moléculas quiméricas comprenden cualquier de los polipéptidos
descrito en la presente invención fusionado con una secuencia
etiqueta de epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina.
En otra realización, la invención proporciona
uyn anticuerpo, el cual específicamente se une a los polipéptidos
PRO982. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un
anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo
de cadena sencilla.
En otras realizaciones, tal y como se define en
las reivindicaciones, la invención proporciona una molécula de
ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido PRO.
En otros aspectos, tal y como se define en las
reivindicaciones, la molécula de ácido nucleico aislada comprende
una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 80% de identidad
de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de
identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente
el 82% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 83% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 86% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 88%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 89% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 91%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 92% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 94%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 97%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 98% de identidad de secuencia, y aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de
secuencia respecto (a) una molécula de ADN que comprende la
secuencia codificante del polipéptido PRO982 que tiene una secuencia
de aminoácidos de longitud completa tal y como se describe en la
presente invención, el ADNc del polipéptido tal y como se describe
en la presente invención, o la secuencia codificante del polipéptido
PRO982 que carece del péptido señal tal y como se describe en la
presente invención, o (b) el complemento de la molécula de ADN de
(a).
En otra realización, tal y como se define en las
reivindicaciones, la invención proporciona un polipéptido PRO
aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido
nucleico aisladas identificadas más arriba en la presente
invención.
En un cierto aspecto, la invención concierne a
un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia,
preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de
secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de
identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 83% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 86% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 88%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 89% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 91%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 92% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 94%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 97%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 98% de identidad de secuencia, y aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de
secuencia respecto un polipéptido PRO que tiene una secuencia de
aminoácidos de longitud completa tal y como se describe en la
presente invención, una secuencia de aminoácidos que carece de
péptido señal tal y como se describe en la presente invención, un
dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el
péptido señal, tal y como se describe en esta, o cualquier otro
fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de
longitud completa, tal y como se descubre en la presente
invención.
En un aspecto adicional, la invención concierne
a un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia,
preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de
secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de
identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 83% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 86% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 88%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 89% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 91%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 92% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 94%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95% de identidad de secuencia, aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de
secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 97%
de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente el 98% de identidad de secuencia, y aún más
preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de
secuencia respecto de una secuencia de aminoácidos codificada por
cualquiera de los ADNc de proteína humana depositados con la ATCC
tal y como se describe en la presente invención.
En un aspecto específico, la invención
proporciona un polipéptido PRO aislado sin la secuencia señal
N-terminal y/o la metionina de iniciación, y está
codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica tal
secuencia de aminoácidos tal y como se describe en la presente
invención más arriba. También se describen en la presente invención
los procesos para producir los mismos, en donde esos procesos
comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector, el
cual comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada
en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido PRO, y
recuperar el polipéptido PRO del cultivo de células.
Aún en otra realización, la invención se refiere
a un anticuerpo anti-PRO.
Aún en otra realización adicional, la invención
se refiere a una composición de una sustancia que comprende un
polipéptido PRO, o un anticuerpo anti-PRO, en
combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un
portador farmacéuticamente aceptable.
Otra realización de la presente invención está
orientada al uso, tal y como se define en las reivindicaciones, de
un polipéptido PRO para la preparación de un medicamento útil en el
tratamiento de una condición que responde al polipéptido PRO.
La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótido
(SEC. ID. Nº: 1) de una secuencia nativa de ADNc de PRO982, en
donde la SEC. ID. Nº 1 es un clon denominado en la presente
invención "DNA57700-1408)".
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC. ID. Nº: 2) derivada de la secuencia codificante de la SEC.
ID. Nº: 1 mostrada en la Figura 1.
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO"
tal y como se usan en la presente invención, y cuando están
seguidos inmediatamente por una designación numérica, se refieren a
varios polipéptidos, en donde la designación completa (es decir,
PRO/número) se refiere a secuencias de polipéptido específicas, tal
y como se describe en la presente invención. Los términos
"polipéptido PRO/número" y "PRO/número", en donde el
término "número" se proporciona como una designación numérica,
tal y como se usa en la presente invención, abarca los polipéptidos
de secuencia nativa y las variantes del polipéptido (las cuales se
definen adicionalmente en la presente invención). Los polipéptidos
PRO descritos en la presente invención pueden aislarse a partir de
una variedad de fuentes, tal como tipos de tejido humano o a partir
de otras fuentes, o prepararse mediante procedimientos recombinantes
o sintéticos.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de
aminoácidos que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la
naturaleza. Tales polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden
aislarse de la naturaleza o pueden producirse mediante medios
recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PRO de
secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas o
secretadas del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una
secuencia de dominio extracelular) que existen de forma natural,
formas variantes que ocurren de forma natural (por ejemplo, formas
cortadas y empalmadas de forma alternativa) y variantes alélicas
del polipéptido que ocurren naturalmente. En varias realizaciones de
la invención, los polipéptidos PRO de secuencia nativa descubiertos
en la presente invención son polipéptidos maduros o de secuencia
nativa de longitud completa que comprenden las secuencias de
aminoácido de longitud completa mostradas en las figuras anexas.
Los codones de inicio y detención se muestran en letra negrita y
subrayados en las figuras. No obstante, aunque el polipéptido PRO
descrito en las figuras anexas se muestra que empieza con residuos
metionina, designados en la presente invención como la posición 1 de
aminoácido en las figuras, es concebible y posible que otros
residuos metionina, ubicados cadena arriba o cadena abajo respecto
del aminoácido en la posición 1 en las figuras, pudieran emplearse
como el residuo aminoácido inicial de los polipéptidos PRO.
El "dominio extracelular" o "ECD" del
polipéptido PRO se refiere a una forma del polipéptido PRO que
carece esencialmente de los dominios transmembrana y citoplasmático.
Ordinariamente, el ECD del polipéptido PRO tendrá menos del 1% de
tales dominios transmembrana y/o citoplasmático, y preferiblemente
tendrá menos del 0,5% de tales dominios. Se entenderá que
cualesquier dominios transmembrana identificados para los
polipéptidos PRO de la presente invención se identifican de acuerdo
con los criterios empleados rutinariamente en la técnica para
identificar ese tipo de dominios hidrofóbicos. Los límites exactos
de un dominio transmembrana pueden variar, pero lo más
probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en
cualquier extremo del dominio tal y como se ha identificado
inicialmente en la presente invención. Por tanto, opcionalmente, un
dominio extracelular de un polipéptido PRO podría contener desde
aproximadamente 5 o menos residuos aminoácidos en cualquier extremo
del límite del dominio transmembrana/dominio extracelular tal y como
se identifica en los ejemplos o en la memoria, y tales
polipéptidos, con o sin el péptido señal asociado, y el ácido
nucleico que lo codifica, se contemplan en las presente
invención.
La ubicación específica de los "péptidos
señal" de los varios polipéptidos PRO descubiertos en la
presente invención se muestran en la presente memoria y/o en las
figuras adjuntas. Debe destacarse, sin embargo, que el límite
C-terminal de un péptido señal podría variar, aunque
lo más probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en
cualquier extremo del límite C-terminal del péptido
señal tal y como se ha identificado inicialmente en la presente
invención, en donde el límite C-terminal del péptido
señal podría identificarse de acuerdo con los criterios empleados
rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de elemento
de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al.,
Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) y von Heinje et
al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690
(1986)). Más aún, se reconoce también que, en ciertos casos, el
corte de una secuencia señal de un polipéptido secretado no es
completamente uniforme, resultando en más de una especie secretada.
Estos polipéptidos, cuando el péptido señal se corta dentro de no
más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del
límite C-terminal del péptido señal tal y como se ha
identificado en la presente invención, y los polinucleótidos que
los codifican, son contemplados por la presente invención.
"Variante de polipéptido PRO" significa un
polipéptido PRO activo, tal y como se define más arriba o más
abajo, que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia de
aminoácidos con polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud
completa tal y como se descubre en la presente invención, una
secuencia de polipéptido PRO que carece de péptido señal tal y como
se descubre en la presente invención, un dominio extracelular de un
polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal y como se descubre
en la presente invención, o cualquier otro fragmento de una
secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal y como se
descubre en la presente invención. Tales variantes de polipéptido
PRO incluyen, por ejemplo, los polipéptidos PRO en los que se
añaden, o suprimen, uno o más residuos aminoácidos en los extremos
N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos
nativa de longitud completa. Ordinariamente, una variante de
polipéptido PRO tendrá al menos aproximadamente el 80% de identidad
de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos
aproximadamente el 81% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 83% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 86% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 87% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 88% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 89% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 92% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 93% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 94% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de identidad de
secuencia de aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos
aproximadamente el 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con
una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud
completa tal y como se descubre en la presente invención, una
secuencia de polipéptido PRO que carece de péptido señal tal y como
se descubre en la presente invención, un dominio extracelular de un
polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal y como se descubre
en la presente invención, o cualquier otro fragmento específicamente
definido de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa
tal y como se descubre en la presente invención. Ordinariamente,
las variantes de polipéptido PRO son de al menos aproximadamente 10
aminoácidos de longitud, a menudo de al menos aproximadamente 20
aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 30
aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 40
aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente
50 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente
60 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente
70 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos
aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos
aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos
aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, más a menudo de al
menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, más a menudo de
al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, más a menudo
de al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, o más.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia
de aminoácidos" con respecto las secuencias de polipéptido PRO
identificadas en la presente invención se definen como el porcentaje
de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son
idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia de polipéptido
PRO específica, después de alinear las secuencias e introducir
discontinuidades, si es necesario, para conseguir el máximo
porcentaje de identidad de secuencia, y no considerando
cualesquiera sustituciones conservadoras como parte de la identidad
de secuencia. El alineamiento para los propósitos de determinar el
porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede
conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los
conocimientos de la técnica, por ejemplo, usando programas de
ordenador disponibles públicamente tales como los programas BLAST,
BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquéllos
formados en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados
para medir el alineamiento, incluyendo cualesquier algoritmos
necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de la
longitud completa de las secuencias que se están comparando. Sin
embargo, para los propósitos en la presente invención, los valores
del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generaron usando
el programa de comparación de secuencias ALIGN-2,
en donde el código fuente completo del programa
ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El
programa de ordenador para comparación de secuencias
ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc., y el
código fuente mostrado en la Tabla 1 ha sido registrado con la
documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington
D.C., 20559, en donde está registrado con el número de registro
estadounidense de derechos de autor TXU510087. El programa
ALIGN-2 está disponible públicamente a través de
Genentech, Inc., South San Francisco, California, o podría
compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1
siguiente. El programa ALIGN-2 debería compilarse
para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX
V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia son
ajustados por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en que se emplea
ALIGN-2 para la comparación de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una
determinada secuencia de aminoácidos A respecto, con, o contra una
determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede
alternativamente describirse como una determinada secuencia de
aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad de
secuencia de aminoácidos respecto, con, o contra una determinada
secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:
100 veces la
fracción
X/Y
en donde X es el número de residuos
aminoácidos valorados como emparejamientos idénticos por el programa
de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese
alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total
de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud
de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la secuencia de
aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A
respecto B no igualará el % de identidad de secuencia de
aminoácidos de B respecto A. Como ejemplos de cálculos del % de
identidad de secuencia de aminoácidos que usan este procedimiento,
las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad de
secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada
"Proteína de Comparación" respecto la secuencia de aminoácidos
denominada "PRO", en donde "PRO" representa la secuencia
de aminoácidos de un polipéptido PRO hipotético, y la "Proteína
de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido con el que se compara el polipéptido "PRO" de
interés, y "X", "Y" y "Z" representan cada uno
diferentes residuos aminoácidos
hipotéticos.
A menos que específicamente se afirme lo
contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de
aminoácidos usados en la presente invención se obtienen como se ha
descrito en el parágrafo inmediatamente precedente usando el
programa de ordenador ALIGN-2. Sin embargo, los
valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos pueden
obtenerse también tal y como se describe más abajo usando el
programa de ordenador WU-BLAST-2
(Altschul et al., Methods in Enzymology
266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de
búsqueda de WU-BLAST2 se ajustan a los valores por
defecto. Aquéllos no ajustados a valores por defecto, es decir, los
parámetros ajustables, se ajustan con los valores siguientes:
extensión de solapamiento'' = 1, fracción de solapamiento = 0,125,
nivel de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Cuando
se emplea WU-BLAST2, un valor de % de identidad de
secuencia de aminoácidos se determina dividiendo (a) el número de
residuos aminoácidos idénticos emparejados entre la secuencia de
aminoácidos del polipéptido PRO de interés, que tiene una secuencia
derivada del polipéptido PRO nativo, y la secuencia de aminoácidos
de comparación de interés (es decir, la secuencia con la que se
está comparando el polipéptido PRO de interés, el cual podría ser
una variante PRO del polipéptido) tal como es determinada por
WU-BLAST2, por (b) el número total de residuos
aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la
afirmación ``un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos A que tiene o teniendo al menos el 80% de identidad de
secuencia de aminoácidos respecto la secuencia de aminoácidos B'',
la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos a
comparar de interés, y la secuencia de aminoácidos B es la
secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés.
El porcentaje de identidad de secuencia de
aminoácidos podría determinarse también usando el programa de
comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res.
25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de
secuencias podría descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en
donde la totalidad de esos parámetros de búsqueda se ajustan a
valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, desenmascarar = sí,
hebra = todas, ocurrencias esperadas = 10, mínima longitud de
complejidad baja minimum = 15/5, valor e de múltiples pasadas =
0.01, constante para múltiples pasadas = 25, descarte para el
alineamiento discontinuo final = 25 y matriz de puntuación =
BLOSUM62.
En las situaciones en que se emplea
NCBI-BLAST2 para la comparación de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una
determinada secuencia de aminoácidos A respecto, con, o contra una
determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede
alternativamente describirse como una determinada secuencia de
aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad de
secuencia de aminoácidos respecto, con, o contra una determinada
secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:
100 veces la
fracción
X/Y
en donde X es el número de residuos
aminoácidos valorados como emparejamientos idénticos por el programa
de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en ese
alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total
de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud
de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la secuencia de
aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A
respecto B no igualará el % de identidad de secuencia de
aminoácidos de B respecto
A.
"Polinucleótido variante de PRO" o
"secuencia de ácido nucleico variante de PRO" significa una
molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO activo
tal y como se define más abajo, y la cual tiene al menos
aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico
con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de
polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa tal y como
se descubre en la presente invención, una secuencia de polipéptido
PRO de secuencia nativa y longitud completa que carece del péptido
señal tal y como se descubre en la presente invención, un dominio
extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal
y como se descubre en la presente invención, o cualquier fragmento
de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal y como
se descubre en la presente invención. Ordinariamente, un
polinucleótido variante de PRO tendrá al menos aproximadamente el
80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 82% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 83% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 84% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 86% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 88% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 89% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 91% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 92% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 94% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 96% de identidad de secuencia de ácido nucleico,
más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad de
secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico y
aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad
de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico
que codifica una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y
longitud completa tal y como se descubre en la presente invención,
una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud
completa que carece del péptido señal tal y como se descubre en la
presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido PRO,
con o sin el péptido señal, tal y como se descubre en la presente
invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de
polipéptido PRO de longitud completa tal y como se descubre en la
presente invención. Las variantes no abarcan la secuencia de
nucleótidos
nativa.
nativa.
Ordinariamente, los polinucleótidos variantes de
PRO son al menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, a
menudo al menos de aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, más a
menudo al menos de aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, más
a menudo al menos de aproximadamente 120 nucleótidos de longitud,
más a menudo al menos de aproximadamente 150 nucleótidos de
longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 180 nucleótidos
de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 210
nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente
240 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de
aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos
de aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, más a menudo al
menos de aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, más a menudo
al menos de aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, más a
menudo al menos de aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o
más.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia
de ácido nucleico" con respecto las secuencias de ácido nucleico
que codifican PRO identificadas en la presente invención se define
como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que
son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de secuencia de
ácido nucleico PRO de interés, después de alinear las secuencias e
introducir discontinuidades, si es necesario, para conseguir el
máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento para
los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de
secuencia de ácido nucleico puede conseguirse de varias formas que
se hallan dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo,
usando programas de ordenador disponibles públicamente tales como
los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign
(DNASTAR). Sin embargo, para los propósitos en la presente
invención, los valores del % de identidad de secuencia de
aminoácidos se generaron usando el programa de comparación de
secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente
completo del programa ALIGN-2 se proporciona en la
Tabla 1 siguiente. El programa de ordenador para comparación de
secuencias ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc.,
y el código fuente mostrado en la Tabla 1 ha sido registrado con la
documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington
D.C., 20559, en donde está registrado con el número de registro
estadounidense de derechos de autor TXU510087. El programa
ALIGN-2 está disponible públicamente a través de
Genentech, Inc., South San Francisco, California, o podría
compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1
siguiente. El programa ALIGN-2 debería compilarse
para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX
V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia son
ajustados por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en que se emplea
ALIGN-2 para la comparación de secuencias de ácido
nucleico, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una
determinada secuencia de ácido nucleico C respecto, con, o contra
una determinada secuencia de ácido nucleico D (la cual puede
alternativamente describirse como una determinada secuencia de
ácido nucleico C que tiene o comprende un determinado % de identidad
de secuencia de ácido nucleico respecto, con, o contra una
determinada secuencia de ácido nucleico D) se calcula como
sigue:
100 veces la
fracción
W/Z
en donde W es el número de
nucleótidos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa
de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese
alineamiento del programa de C y D, y en donde Z es el número total
de nucleótidos en D. Se apreciará que, cuando la longitud de la
secuencia de ácido nucleico C no es igual a la secuencia de ácido
nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C
respecto D no igualará el % de identidad de secuencia de ácido
nucleico de D respecto C. Como ejemplos de cálculos del % de
identidad de secuencia de ácido nucleico que usan este
procedimiento, las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de
identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido
nucleico denominada "ADN de Comparación" respecto la secuencia
de ácido nucleico denominada "ADN-PRO", en
donde "ADN-PRO" representa una secuencia de
ácido nucleico hipotética que codifica PRO, y "ADN de
Comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una
molécula de ácido nucleico con la que se compara la molécula de
ácido nucleico "ADN-PRO" de interés, y
"N", "L" y "V" representan cada uno diferentes
nucleótidos
hipotéticos.
A menos que específicamente se afirme lo
contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de
ácido nucleico usados en la presente invención se obtienen como se
ha descrito en el parágrafo inmediatamente precedente usando el
programa de ordenador ALIGN-2. Sin embargo, los
valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico pueden
obtenerse también tal y como se describe más abajo usando el
programa de ordenador WU-BLAST-2
(Altschul et al., Methods in Enzymology
266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de
búsqueda de WU-BLAST2 se ajustan a los valores por
defecto. Aquéllos no ajustados a valores por defecto, es decir, los
parámetros ajustables, se ajustan con los valores siguientes:
extensión de solapamiento'' = 1, fracción de solapamiento = 0,125,
nivel de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Cuando
se emplea WU-BLAST2, un valor de % de identidad de
secuencia de ácido nucleico se determina dividiendo (a) el número de
nucleótidos idénticos emparejados entre la secuencia de ácido
nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido PRO de interés, que tiene una secuencia derivada de la
secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de
secuencia nativa, y la molécula de ácido nucleico de comparación de
interés (es decir, la secuencia con la que se está comparando la
molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de
interés, la cual podría ser una variante del polinucleótido de PRO)
tal como es determinada por WU-BLAST2, por (b) el
número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que
codifica el polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la
afirmación ``una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de ácido nucleico A que tiene o teniendo al menos el
80% de identidad de secuencia de ácido nucleico respecto la
secuencia de ácido nucleico B'', la secuencia de ácido nucleico A es
la molécula de ácido nucleico de interés a comparar, y la secuencia
de ácido nucleico B es la secuencia de ácido nucleico de la molécula
de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés.
El porcentaje de identidad de secuencia de ácido
nucleico podría determinarse también usando el programa de
comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
(1997)). El programa de comparación de secuencias podría
descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en
donde la totalidad de esos parámetros de búsqueda se ajustan a
valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, desenmascarar = sí,
hebra = todas, ocurrencias esperadas = 10, mínima longitud de
complejidad baja minimum = 15/5, valor e de múltiples pasadas =
0.01, constante para múltiples pasadas = 25, descarte para el
alineamiento discontinuo final = 25 y matriz de puntuación =
BLOSUM62.
En las situaciones en que se emplea
NCBI-BLAST2 para la comparación de secuencias de
ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de
una determinada secuencia de ácido nucleico C respecto, con, o
contra una determinada secuencia de ácido nucleico D (la cual puede
alternativamente describirse como una determinada secuencia de
ácido nucleico C que tiene o comprende un determinado % de identidad
de secuencia de ácido nucleico respecto, con, o contra una
determinada secuencia de ácido nucleico D) se calcula como
sigue:
100 veces la
fracción
W/Z
en donde W es el número de
nucleótidos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa
de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en ese
alineamiento del programa de C y D, y en donde Z es el número total
de nucleótidos en D. Se apreciará que, cuando la longitud de la
secuencia de ácido nucleico C no es igual a la secuencia de ácido
nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C
respecto D no igualará el % de identidad de secuencia de ácido
nucleico de D respecto
C.
En otras realizaciones, los polinucleótido de
variantes de PRO son moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido PRO activo, y que son capaces de hibridarse,
preferiblemente en condiciones de hibridación y lavado rigurosas,
con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido PRO de
longitud completa tal y como se descubre en la presente invención.
Los polipéptidos variantes de PRO pueden ser aquéllos que están
codificados por un polinucleótido variante de PRO.
El término "positivos", en el contexto de
comparación de secuencia realizada tal y como se ha descrito más
arriba, incluye los residuos en las secuencias comparadas que no son
idénticos pero que tienen propiedades similares (por ejemplo, de
resulta de sustituciones conservadoras, consultar la Tabla 6 más
adelante). Para los propósitos en la presente invención, el valor
del % de positivos se determina dividiendo (a) el número de
residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo entre la
secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés, que tiene
una secuencia derivada de la secuencia del polipéptido PRO nativo, y
la secuencia de aminoácidos de interés de la comparación (es decir,
la secuencia de aminoácidos con la que se está comparando la
secuencia del polipéptido PRO), tal y como se determina en la matriz
BLOSUM62 de WU-BLAST-2, por (b) el
número total de residuos aminoácidos del polipéptido PRO de
interés.
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, el valor del % de positivos se calcula como se describió
en el parágrafo inmediatamente precedente. Sin embargo, en el
contexto de las comparaciones de identidad de secuencia de
aminoácidos realizadas tal y como se ha descrito más arriba para
ALIGN-2 y
NCBI-BLAST-2, incluye los residuos
aminoácidos en las secuencias comparadas que no sólo son idénticos,
sino que también tienen propiedades similares. Los residuos
aminoácidos que puntúan un valor positivo respecto un residuo
aminoácido de interés, son aquéllos que, o son idénticos al residuo
aminoácido de interés, o son una sustitución preferida (tal y como
se definen en la Tabla 6 más abajo) del residuo aminoácido de
interés.
Para las comparaciones de secuencias de
aminoácidos que usan ALIGN-2 o
NCBI-BLAST2, el % de positivos de una determinada
secuencia de aminoácidos A respecto, con, o contra una determinada
secuencia de aminoácidos B (la cual puede alternativamente
describirse como una determinada secuencia de aminoácidos A que
tiene o comprende un cierto % de positivos respecto, con, o contra
una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como
sigue:
100 veces la
fracción
X/Y
en donde X es el número de residuos
aminoácidos que puntúan un valor positivo, tal y como se ha definido
más arriba por el programa de alineamiento de secuencias
ALIGN-2 o NCBI-BLAST2 en ese
alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total
de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud
de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la secuencia de
aminoácidos B, el % de positivos de A respecto B no igualará el % de
positivos de B respecto
A.
"Aislado", cuando se usa para describir los
varios polipéptidos descubiertos en la presente invención,
significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o
recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los
componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que
típicamente interferirían con los usos terapéuticos y diagnósticos
del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos
proteicos y no proteicos. En las realizaciones preferidas, el
polipéptido se purificará hasta (1) un grado suficiente para obtener
al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos
N-terminal o interna mediante el uso de un
"sequenator" de copa rotatoria, o (2) hasta su homogeneidad
mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o
reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de
plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ
dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente
del entorno natural del polipéptido no estará presente. No
obstante, ordinariamente, el polipéptido aislado se preparará al
menos mediante un paso de purificación.
Un ácido nucleico que codifica un polipéptido
PREO "aislado", u otro ácido nucleico que codifica un
polipéptido, es una molécula de ácido nucleico que está identificada
y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante
con la que está ordinariamente asociada en la fuente natural del
ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica un polipéptido es distinta que la
forma o disposición en la cual se halla en la naturaleza. Por tanto,
las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un
polipéptido se distinguen de la molécula de ácido nucleico
específica que codifica el polipéptido tal como ésta existe en las
células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica el polipéptido incluye las moléculas de ácido
nucleico que codifican el polipéptido incluidas en células que
normalmente el polipéptido cuando, por ejemplo, la molécula de ácido
nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las
células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia operativamente unida en un determinado organismo huésped.
Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas
incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de
operador, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células
eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y
potenciadores.
El ácido nucleico está "operativamente
unido" cuando se coloca en relación funcional con otro secuencia
de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una
pre-secuencia o líder secretor está unida
operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una
pre-proteína que participa en la secreción del
polipéptido; un promotor o un potenciador está unido operativamente
a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la
secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido
operativamente a una secuencia codificante si está ubicado de forma
que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente
unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son
contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas en la fase
de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque se
contiguos. La unión se consigue mediante ligación en los sitios de
restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se usan
adaptadores o conectores de oligonucleótido de acuerdo con la
práctica convencional.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, los
anticuerpos monoclonales anti-PRO sencillos
(incluyendo los anticuerpos agonistas, antagonistas y
neutralizantes), las composiciones de anticuerpo
anti-PRO con especificidad poliepitópica, los
anticuerpos anti-PRO de cadena sencilla, y los
fragmentos de anticuerpos anti-PRO (ver más abajo).
El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se usa en la
presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de
una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir,
los anticuerpos individuales que constituyen la población son
idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma
natural, las cuales pueden estar presentes en cantidades
menores.
La "rigurosidad" de las reacciones de
hibridación es fácilmente determinable por alguien con formación
ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que
depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado, y
de la concentración de sal. En general, las sondas más largas
requieren temperaturas más elevadas para una hibridación apropiada,
mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más
bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN
desnaturalizado para hibridarse de nuevo cuando hay hebras
complementarias presentes en un entorno por debajo de su temperatura
de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la
sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa
que puede usarse. Como resultado, se concluye que temperaturas
relativas más elevadas tenderán a hacer más rigurosas las
condiciones de reacción, mientras que temperaturas más bajas las
harán menos. Para detalles adicionales y explicación de la
rigurosidad de las reacciones de hibridación, consultar Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience Publishers, (1995).
Las "condiciones de rigurosidad" o
"condiciones de rigurosidad elevadas", tal y como se definen en
la presente invención, pueden identificarse como aquéllas que: (1)
emplean una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el
lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015
M/0,1% de dodecilsulfato sódico a 50ºC; (2) emplean un agente
desnaturalizante durante la hibridación, tal como la formamida, por
ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero
bovino/0,1% de Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/tampón fosfato
sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75
mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 0,75 M,
citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), 0,1% de
pirofosfato sódico, 5x solución de Denhardt, ADN de esperma de
salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de
dextrano 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2x SSC (cloruro
sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguidos por un
lavado con elevada rigurosidad consistente en 0,1x SSC que contiene
EDTA a 55ºC.
Las "condiciones de rigurosidad moderada"
pueden identificarse como se describe en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold
Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y
condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica
y % de SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo
de condiciones de rigurosidad moderada es la incubación durante la
noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5x SSC
(NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH
7,6), 5x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20
mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado,
seguida por el lavado de los filtros en 1x SSC a aproximadamente
37-50ºC. El especialista capacitado reconocerá cómo
ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc, según sea necesario
para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y
similares.
El término "marcado con epítopo", cuando se
usa en la presente invención, se refiere a un polipéptido quimérico
que comprende un polipéptido PRO fusionado a un "polipéptido
etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene bastantes residuos como
para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un
anticuerpo, aunque es lo bastante corto como para no interferir con
la actividad del polipéptido al que se fusiona. El polipéptido
etiqueta preferiblemente también es bastante único, de forma que el
anticuerpo sustancialmente no reaccione de forma cruzada con otros
epítopos. Los polipéptidos etiqueta apropiados generalmente tiene al
menos seis residuos aminoácidos y usualmente entre aproximadamente
8 y 50 residuos aminoácidos (preferiblemente entre aproximadamente
10 y 20 residuos amino-
ácidos).
ácidos).
Tal y como se usa en la presente invención, el
término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a
anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína
heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras del
dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada, la cual es
distinta del sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un
anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de
dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una
molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de
aminoácido contigua que comprende al menos el sitio de unión de un
receptor o ligando. La secuencia de dominio constante de
inmunoglobulina en la inmunoadhesina podría obtenerse a partir de
cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos
IgG-1, IgG-2,
IgG-3,
o IgG-4, la IgA (incluyendo la IgA-1 y la IgA-2), la IgE, la IgD o la IgM.
o IgG-4, la IgA (incluyendo la IgA-1 y la IgA-2), la IgE, la IgD o la IgM.
"Activo" o "actividad" para los
propósitos en la presente invención se refiere a la(s)
forma(s) de un polipéptido PRO que retienen una actividad
biológica y/o inmunológica de PRO nativo o que ocurre naturalmente,
en donde actividad "biológica" se refiere a una función
biológica (bien inhibidora o estimuladora) causada por un PRO
nativo o que ocurre naturalmente, y distinta de la capacidad de
inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico
poseído por un PRO nativo o que ocurre naturalmente, y una actividad
"inmunológica" se refiere a la capacidad para inducir la
producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por
un PRO nativo o que ocurre naturalmente.
El término "antagonista" se usa en el
sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o
completamente bloquea, inhibe, o neutraliza una actividad biológica
de un polipéptido PRO nativo tal y como se descubre en la presente
invención. De forma similar, el término "agonista" se usa en el
sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una
actividad biológica de un polipéptido PRO nativo tal y como se
descubre en la presente invención. Las moléculas agonistas o
antagonistas apropiadas incluyen específicamente los anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de la secuencia de
aminoácidos de polipéptidos PRO nativos, péptidos, oligonucleótidos
antisentido, pequeñas moléculas orgánicas, etc, agonistas o
antagonistas. Los procedimientos para identificar agonistas o
antagonistas de un polipéptido PRO pueden comprender poner en
contacto un polipéptido PRO con una molécula agonista o antagonista
candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades
biológicas normalmente asociadas con el polipéptido PRO.
"Tratamiento" se refiere a ambos,
tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas, en
donde el objetivo es prevenir o retardar (aliviar) la condición
patológica o trastorno tratado. Los que necesitan el tratamiento
incluyen los que ya padecen el trastorno así como aquéllos proclives
a padecer el trastorno o aquéllos en los que debe prevenirse el
trastorno.
Administración "crónica" se refiere a la
administración de los agentes de modo continuo en oposición a un
modo agudo, con objeto de mantener el efecto (actividad) terapéutica
inicial durante un período de tiempo prolongado. La administración
"intermitente" es un tratamiento que no se aplica
consecutivamente sin interrupción, sino que, en cambio, es de
naturaleza cíclica.
"Mamífero", para los propósitos de
tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un
mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos y de
granja, y los animales de zoo, deportes o mascotas, tales como los
perros, gatos, terneras, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos,
etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y la consecutiva en cualquier orden.
"Portadores", tal y como se usa en la
presente invención incluye los portadores, excipientes o
estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos
para la célula o mamífero que se está exponiendo a los mismos, en
las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador
fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado.
Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen los
tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos;
los antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; los polipéptidos
de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); las
proteínas, tales como la albúmina de suero bovino, la gelatina, o
las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como la
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros
carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como el
sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el TWEEN, el
polietilenglicol (PEG), y el PLURONICS^{TM}.
"Fragmentos de anticuerpo" comprende una
porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable
o unidora de antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de
fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2} y Fv; los diacuerpos; los anticuerpos lineales
(Zapata et al., Protein Eng. 8(10):
1057-1062[1995]); las moléculas de anticuerpo
de cadena sencilla; y los anticuerpos multiespecíficos formados a
partir de fragmentos de anticuerpo.
La digestión con papaína de anticuerpos produce
dos fragmentos unidores de antígeno idénticos, denominados
fragmentos "Facb", cada uno con un único sitio de unión de
antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una denominación que
refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con
pepsina proporciona un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos
sitios de combinación de antígeno y es todavía capaz de entrecruzar
el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión de
antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no
covalente. Es en esta configuración que los tres CDR de cada dominio
variable interaccionan para definir un sitio de unión de antígeno
sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}.
Colectivamente, los seis CDR confieren especificidad de unión de
antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable
sencillo (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR
específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y
unir antígeno, aunque con una afinidad inferior a la del sitio de
unión entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi
terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más
cisteínas procedentes de la región bisagra del anticuerpo. Los
fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se
produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de
bisagra entre ellos. Se conocen también otros acoplamientos químicos
de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden
asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa
y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios
constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales
de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas
pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por
ejemplo, IGG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L}
del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única
cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende
además un eslabón polipeptídico entre los dominios V_{H} y
V_{L}, el cual permite al sFv formar la estructura deseada para la
unión de antígeno. Para una revisión sobre los sFv, consultar
Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.
113, Eds. Rosenburg y Moore, Springer-Verlag, Nueva
York, pp. 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de
antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena
pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) en la misma cadena polipeptídica
(V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un eslabón
que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos
dominios sobre la misma cadena, los dominios están forzados a
emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos
sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen más
detalladamente en, por ejemplo, EP-404.097;
WO93/11.161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90:6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha
identificado y separada y/o recuperado a partir de un componente de
su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno
natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos
y terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir los enzimas, las
hormonas, y otros solutos proteicos y no proteicos. En las
realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más
del 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el
procedimiento de Lowry, y más preferiblemente más del 99% en peso,
(2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de
la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna
mediante el uso de un "sequenator" de copa rotatoria, o (3)
hasta su homogeneidad mediante SDS-PAGE, en
condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el
anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto
que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no
estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislado
se preparará al menos mediante un paso de purificación.
La palabra "marca" cuando se usa en la
presente invención se refiere a un compuesto o composición
detectable, el cual está conjugado directa o indirectamente al
anticuerpo con objeto de generar un anticuerpo "marcado". La
marca podría ser detectable por sí misma (por ejemplo, marcas con
radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca
enzimática, podría catalizar la alteración química de un compuesto o
composición de sustrato que es detectable.
Por "fase sólida" se quiere indicar una
matriz no acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la
presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas en la
presente invención incluyen aquéllas formadas parcial o enteramente
por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos
(por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol
polivinílico, y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo
del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una
placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por
ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término
incluye también una fase sólida discontinua de partículas
discretas, tales como las descritas en la patente estadounidense nº
4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña
compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o
tensioactivos, la cual es útil para suministrar un fármaco (tal
como un polipéptido PRO o un anticuerpo contra el mismo) a un
mamífero. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos
en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos
de las membranas biológicas.
Una "molécula pequeña" se define aquí como
que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 500
dalton.
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La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican
polipéptidos denominados en la presente solicitud como polipéptidos
PRO. En particular, se han identificado y aislado ADNc que
codifican varios polipéptidos PRO, tal y como se descubre con más
detalle en los Ejemplos siguientes. Se destaca que a las proteínas
producidas en rondas de expresión distintas se les podría asignar
números PRO diferentes, pero el número UNQ es único para cualquier
ADN dado y la proteína codificada, y no cambiará. Sin embargo, por
motivo de simplicidad, en la presente memoria la proteína codificada
por las moléculas de ácido nucleico nativas de longitud completa
descubiertas en la presente invención, así como todos los homólogos
nativos adicionales y variantes incluidas en la anterior definición
de PRO, se denominarán como "PRO/número", con independencia de
su origen o modo de preparación.
Tal y como se descubre en los Ejemplos
siguientes, se han depositado varios clones de ADNc en la ATCC. Las
secuencias de nucleótidos reales de esos clones pueden ser
fácilmente determinadas por el especialista capacitado mediante la
secuenciación del clon depositado usando procedimientos rutinarios
en la técnica. La secuencia de aminoácidos predicha puede
determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos usando
conocimientos rutinarios. Para los polipéptidos PRO y los ácidos
nucleicos codificantes descritos en la presente invención, los
solicitantes han identificado la que se cree que es la pauta de
lectura que mejor puede identificarse con la información de
secuencia disponible en ese momento.
Que se sepa, la secuencia
DNA57700-1408 codifica un factor nuevo denominado en
la presente invención como PRO982; usando el programa de ordenador
para alineamiento de secuencias WU-BLAST2, no se
revelaron identidades de secuencia con ninguna proteína
conocida.
Además de los polipéptidos PRO de secuencia
nativa y longitud completa descritos en la presente invención, se
contempla que pueden prepararse variantes de PRO. Las variantes de
PRO pueden prepararse introduciendo los cambios de nucleótido
apropiados en el ADN de PRO, y/o mediante la síntesis del
polipéptido PRO deseado. Los especialistas en la técnica apreciarán
que los cambios de aminoácido pueden alterar los procesos
post-traducción del PRO, tales como cambiar el
número o posición de los sitios de glicosilación o alterar las
características de anclaje a membrana.
Las variaciones en el PRO de secuencia de
longitud completa y nativo, o en varios dominios del PRO descrito
en la presente invención, pueden hacerse, por ejemplo, usando
cualquiera de las técnicas e instrucciones para mutaciones
conservadoras y no conservadoras detalladas, por ejemplo, en la
patente estadounidense nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una
sustitución, supresión o inserción de uno o más codones que
codifican el PRO, la cual resulta en un cambio en la secuencia de
aminoácidos del PRO en comparación con el PRO de secuencia nativa.
Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un
aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los
dominios del PRO. La guía para determinar qué residuo aminoácido
podría insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar
negativamente la actividad deseada podría hallarse comparando la
secuencia del PRO con la de moléculas de proteína conocidas
homólogas, y minimizando el número de cambios en la secuencia de
aminoácidos hechos en regiones de elevada homología. Las
sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de remplazar
un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades
estructurales y/o químicas similares, tales como la sustitución de
una leucina con una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos
conservadoras. Las inserciones y supresiones pueden opcionalmente
estar en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación
permitida podría determinarse haciendo sistemáticamente inserciones,
supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia, y
ensayando las variantes resultantes según la actividad exhibida por
la secuencia nativa madura o de longitud completa.
En la presente invención se proporcionan
fragmentos de polipéptido PRO. Tales fragmentos pueden estar
truncados en el extremo N-terminal o
C-terminal, o pueden carecer de residuos internos,
por ejemplo, cuando se comparan con la proteína nativa de longitud
completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos aminoácidos que no
son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido
PRO.
Los fragmentos de PRO pueden prepararse mediante
cualquiera de un cierto número de técnicas convencionales. Los
fragmentos de péptido deseados pueden sintetizarse químicamente. Una
estrategia alternativa implica generar fragmentos de PRO mediante
digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con un
enzima que se sabe corta las proteínas en sitios definidos por
determinados residuos aminoácidos, o digiriendo el ADN con enzimas
de restricción apropiados y aislando el fragmento deseado. Aún otra
técnica apropiada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN,
que codifica un fragmento de polipéptido deseado, mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la PCR, en los
cebadores de 5' y 3' se emplean oligonucleótidos que definen los
extremos deseados del fragmento de ADN. Preferiblemente, los
fragmentos de polipéptido PRO comparten al menos una actividad
biológica y/o inmunológica con el polipéptido PRO nativo descubierto
en la presente invención.
En realizaciones concretas, las sustituciones
conservadoras de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el
encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si tales
sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica,
entonces, en los productos examinados se introducen cambios más
sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en la
Tabla 6, o como se describe con más detalle más abajo en referencia
a las clases de aminoácidos.
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Se consiguen modificaciones sustanciales en la
función o identidad inmunológica del polipéptido PRO seleccionando
sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre
mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área
de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o
hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio
diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que
ocurren de forma natural se dividen en grupos en base a propiedades
comunes de la cadena lateral:
- (1)
- hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
- (2)
- hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
- (3)
- ácidos: asp, glu;
- (4)
- básicos: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras supondrán
intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Tales residuos sustituidos pueden introducirse también en los sitios
de sustitución conservadora o, más preferiblemente, en los sitios
restantes (no conservados).
Las variaciones pueden hacerse usando
procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (dirigida a un sitio), el barrido con
alanina, y la mutagénesis mediante PCR. La mutagénesis dirigida a un
sitio [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331
(1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], la
mutagénesis mediante casete [Wells et al., Gene,
34:315 (1985)], la mutagénesis mediante selección de restricción
[Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A,
317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden emplearse con el
ADN clonado para producir ADN variante de PRO.
También puede emplearse el análisis con
aminoácido de barrido para identificar uno o más aminoácidos a lo
largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido
preferidos están los aminoácidos neutros y relativamente pequeños.
Tales aminoácidos incluyen la alanina, la glicina, la serina, y la
cisteína. La alanina es típicamente el aminoácido de barrido
preferido de entre este grupo porque elimina la cadena lateral más
allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación
de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells,
Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina
es también típicamente preferida porque es el aminoácido más común.
Además, frecuentemente se halla tanto enterrada como expuesta
[Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.);
Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución con
alanina no rinde cantidades adecuadas de variante, puede usarse un
aminoácido isotérico.
Las modificaciones covalentes de PRO se incluyen
dentro del ámbito de esta invención. Un tipo de modificación
covalente incluye hacer reaccionar residuos aminoácidos apuntados de
un polipéptido PRO con un agente de derivatización orgánico que es
capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los
residuos N- o C-terminales del PRO. La
derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para
entrecruzar PRO con una matriz o superficie de soporte insoluble en
agua para su uso en el procedimiento para purificar anticuerpos
anti-PRO y viceversa. Los agentes entrecruzadores
comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo los ésteres de
disuccinimidilo tales como el
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales
tales como el bis-N-maleimido-1,8-octano, y agentes tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
tales como el bis-N-maleimido-1,8-octano, y agentes tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminilo y asparaginilo respectivamente a los
correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, la hidroxilación de
prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos
serilo o treonilo, la metilación de los grupos
\alpha-amino de las cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina [T. E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco,
pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina
N-terminal, y la amidación de cualquier grupo
carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido PRO, incluida dentro del ámbito de esta invención,
comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido.
"Alterar el patrón de glicosilación nativo" se pretende, para
los propósitos en la presente invención, que signifique suprimir uno
o más grupos carbohidratos hallados en el PRO de secuencia nativa
(bien suprimiendo el sitio de glicosilación subyacente o suprimiendo
la glicosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos), y/o
añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en
el PRO de secuencia nativa. Además, la frase incluye los cambios
cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que
implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos
grupos carbohidrato presentes.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO podría conseguirse alterando la secuencia de
aminoácidos. La alteración podría hacerse, por ejemplo, mediante la
adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina
en el PRO de secuencia nativa para sitios de glicosilación unidos a
O). La secuencia de aminoácidos de PRO podría alterarse
opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente
mutando el ADN que codifica el polipéptido PRO en bases
preseleccionadas de tal forma que se generen codones que se
traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios para incrementar el número de
grupos carbohidrato sobre los polipéptidos PRO es mediante
acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos al polipéptido.
Tales procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, en
WO87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y
Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306
(1981).
La supresión de grupos carbohidratos presentes
sobre el polipéptido PRO podría conseguirse química o
enzimáticamente, o mediante sustitución por mutación de codones que
codifican residuos aminoácidos que sirven como dianas para la
glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son
conocidas en la técnica y son descritas, por ejemplo, por
Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52
(1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131
(1981). El corte enzimático de grupos carbohidratos sobre
polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de
endo- y exoglucosidasas, tal como describen Thotakura et al.,
Meth. Enzyvol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de PRO
comprende unir el polipéptido PRO a una de una variedad de
polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG),
polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en
las patentes estadounidenses nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
El PRO de la presente invención podría también
modificarse de manera que forme una molécula quimérica que
comprenda el PRO fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia
de aminoácidos.
En una realización, una molécula quimérica tal
comprende una fusión del PRO con un polipéptido marca que
proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un
anticuerpo anti-marca. La marca del epítopo se
coloca generalmente en el extremo amino o
carboxilo-terminal del PRO. La presencia de tales
formas del PRO marcadas con epítopo puede detectarse usando un
anticuerpo contra el polipéptido marca. También, la provisión de la
marca del epítopo permite que el PRO sea fácilmente purificado
mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo
anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se
une a la marca del epítopo. Varios polipéptidos marca y sus
anticuerpos respectivos son bien conocidos en la técnica. Los
ejemplos incluyen las marcas poli-histidina
(poli-hys) o
poli-histidina-glicina
(poli-hys-gly); el polipéptido marca
HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol.
Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la marca
c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y
9E10 contra los mismos [Evan et al., Molecular and
Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la
glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo
[Paborsky et al., Protein Engineering,
(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos marca
incluyen el péptido-Flag [Hopp et al.,
BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el
péptido del epítopo KT3 [Martin et al., Science,
255:192-194 (1992)]; un péptido del epítopo de la
\alpha-tubulina [Skinner et al., J.
Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la marca
del péptido de la proteína del gen 10 del T7
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica podría comprender una fusión del PRO con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para
una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada
como "inmunoadhesina"), una fusión tal podría ser con la región
Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig preferiblemente incluyen
la sustitución de una forma soluble (con el dominio transmembrana
suprimido o inactivado) de un polipéptido PRO en lugar de al menos
una región variable dentro de una molécula de Ig. En una
realización particularmente preferida, la fusión con inmunoglobulina
incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o bisagra, CH1, CH2 y CH3
de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones con
inmunoglobulina consultar también la patente estadounidense nº
5.428.130 concedida el 27 de junio de 1995.
La descripción a continuación se refiere
principalmente a la producción de PRO mediante el cultivo de
células transformadas o transfectadas con un vector que contiene
ácido nucleico de PRO. Se contempla, por supuesto, que pudieran
emplearse procedimientos alternativos para preparar el PRO, los
cuales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia
de PRO, o porciones de la misma, pueden producirse mediante síntesis
de péptido directa usando técnicas en fase sólida [consultar, por
ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase
Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, Calif.
(1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in
vitro podría realizarse usando técnicas manuales o de forma
automatizada. La síntesis automatizada podría realizarse, por
ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems
(Foster City, California) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Varias porciones del PRO pueden sintetizarse
químicamente por separado y combinarse usando procedimientos
químicos o enzimáticos para producir el PRO de longitud
completa.
El ADN que codifica el PRO podría obtenerse a
partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que
se cree posee el ARNm de PRO, y expresándolo hasta un nivel
detectable. En consecuencia, el ADN de PRO humano puede obtenerse
convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada a partir tejido
humano, tal y como se describe en los ejemplos. El gen que codifica
el PRO podría obtenerse también de una biblioteca genómica o
mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, la
síntesis automatizada de ácido nucleico).
Las bibliotecas pueden examinarse con sondas
(tales como anticuerpos contra el PRO u oligonucleótidos de al
menos aproximadamente 20-80 bases) diseñados para
codificarlo. El examen de la biblioteca genómica o de ADNc con la
sonda seleccionada podría realizarse usando procedimientos
estándares, tal y como se describe en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Nueva York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un procedimiento alternativo
para aislar el gen que codifica el PRO es usar la metodología de la
PCR [Sambrook et al., ver más arriba; Dieffenbach et
al., PCR Primer: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1995)].
Los ejemplos siguientes describen técnicas para
examinar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótido
seleccionadas como sondas deberían tener la longitud suficiente y
ser suficientemente inequívocas como para que los falsos positivos
estén minimizados. El oligonucleótido está preferiblemente marcado,
de forma que pueda detectarse a partir de su hibridación con ADN en
la biblioteca que se está examinando. Los procedimientos de marcado
son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de marcas
radiactivas como el ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el
marcado con enzima. Las condiciones de hibridación, incluyendo las
de rigurosidad moderada y elevada rigurosidad, se proporcionan en
Sambrook et al., ver más arriba.
Las secuencias identificadas en tales
procedimientos de verificación de biblioteca pueden compararse y
alinearse con otras secuencias conocidas, depositadas y disponibles
en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de
datos de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (a nivel
de aminoácido o de nucleótido) dentro de regiones definidas de la
molécula o a lo largo de la longitud completa de la secuencia
pueden determinarse usando procedimientos conocidos en la técnica y
tal y como se describe en la presente invención.
El ácido nucleico que tenga la secuencia que
codifica la proteína podría obtenerse examinando bibliotecas
seleccionadas de ADNc o genómicas usando, para la primera vez, la
secuencia de aminoácidos deducida descubierta en la presente
invención, y, si es necesario, usando procedimientos de extensión
convencionales, tal y como se describe en Sambrook et al.,
ver más arriba, para detectar precursores e intermedios de
procesamiento del ARNm que pueden no haberse transcrito de forma
inversa en el ADNc.
Las células huéspedes se transfectan o
transforman con vectores de expresión o clonación descritos en la
presente invención para la producción de PRO, y se cultivan en medio
nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir
promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que
codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo,
tales como el medio, temperatura, pH y similares, pueden ser
seleccionadas por el especialista capacitado sin experimentación
innecesaria. En general, los principios, protocolos, y técnicas
prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células
pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical
Approach, ed. M. Butler (IRL Press, 1991) y en Sambrook et
al., ver más arriba.
Los procedimientos para la transfección de
células eucariotas y la transformación de células procariotas son
conocidos por el especialista con formación ordinaria, por ejemplo,
el del CaCl_{2}, el del CaPO_{4}, el mediado por liposomas y la
electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la
transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas
para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro
cálcico, según se describe en Sambrook et al., ver más
arriba, o la electroporación se usan generalmente para los
procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens es
usa para la transformación de ciertas células de plantas, según se
describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y en
WO89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de
mamífero sin tales paredes celulares, pueden emplearse el
procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van
der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los
aspectos general de los sistemas de transfección de células
huéspedes de mamífero han sido descritos en la patente
estadounidense nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras
típicamente se realizan de acuerdo con el procedimiento de Van
Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979).
Sin embargo, también pueden usarse otros procedimientos para
introducir ADN en las células, tales como mediante microinyección
nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con
células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno,
poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de
mamífero, consultar Keown et al., Methods in
Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et
al., Nature, 336:348-352 (1988).
Las células huéspedes apropiadas para clonar o
expresar el ADN en los vectores de ésta incluyen las procariotas,
levaduras, o las células eucariotas superiores. Las procariotas
apropiadas incluyen, pero no se limitan a, las eubacterias, tales
como los organismos Gram-negativos o
Gram-positivos, por ejemplo, enterobacteriaceas
tales como E. coli. Hay varias cepas de E. coli
disponibles públicamente, tales como la cepa MM294 de E. coli
K12 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la cepa
W3110 de E. coli (ATCC 27.325) y la K5 772 (ATCC 53.635).
Otras células huéspedes procariotas apropiadas incluyen las
enterobacteriaceas tales como Escherichia, por ejemplo,
E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo,
Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo,
Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como
B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B.
licheniformis 41P descubierta en DD-266.710,
publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como
P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son
ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3 110 es un huésped o
huésped progenitor particularmente preferido porque es una cepa
huésped común para las fermentaciones de producto de ADN
recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades
mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, podría modificarse
la cepa W31 10 para efectuar una mutación genética en los genes que
codifican proteínas endógenas del huésped, incluyendo los ejemplos
de tales huéspedes la cepa 1A2 de E. coli W3110, la cual
tiene el genotipo completo tont; la cepa 9E4 de E. coli
W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3; la
cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), la cual tiene el
genotipo completo ton4 ptr3 phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT
kan^{r}; la cepa 37D6 de E. coli W3110, la cual tiene
el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG
kan^{r}; la cepa 40B4 de E. coli W3110, la cual es la
cepa 37D6 con una mutación por supresión de degP y no
resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene
una proteasa periplásmica mutante, descubierta en la patente
estadounidense nº 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990.
Alternativamente, son apropiados los procedimientos de clonación
in vitro, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de
polimerasa de ácido nucleico.
Además de las procariotas, los microbios
eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son
vectores de clonación o expresión apropiados para vectores que
codifican el PRO. Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo huésped eucariotas inferior comúnmente usado. Otros
incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse,
Nature, 290: 140[1981]; EP 139.383 publicada el 2 de
mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (patente
estadounidense nº 4.943.529; Fleer et al.,
Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como,
por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683,
CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol.,
154(2):737-742 [1983]), K. fragilis
(ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K.
wvickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K.
drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al.,
Bio/Technology, 8:135 [1990]), K. thennotolerans y
K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia
pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic
Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida;
Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa
(Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales
como Schwarniiomyces occidentalis (EP 394.538 publicada el
31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por
ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium
(WO91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes de
Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
112:284-289 [1983]; Tilburn et al.,
Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:
1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes,
EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras
metilotróficas son apropiadas en la presente invención e incluyen,
pero no se limitan a, levaduras capaces de crecer en metanol,
seleccionadas de entre los géneros consistentes en Hatuenula,
Candida, Kloeckera, Pichia,
Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una
lista de especies específicas que son ilustrativas de esta clase de
levaduras puede hallarse en C. Anthony, The Biochemistiy of
Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huéspedes apropiadas para la
expresión de PRO glicosilado se derivan de organismos
multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen
las células de insectos tales como la S2 de Drosophila S2 y
la Sf9 de Spodoptera, así como células de plantas. Los
ejemplos de células huéspedes de mamífero útiles incluyen las
células de ovario de hámster chino (CHO) y las COS. Más
específicamente, los ejemplos incluyen la CVI de riñón de mono
transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la
línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 subclonadas para
su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J.
Gen Virol., 36:59 (1977)); las células de ovario de hámster
chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasmn, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather,
Bio. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células
pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); las células hepáticas
humanas (Hep02, HB 8065); y las del tumor mamario de ratón (MMT
060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se
considera que se halla dentro de las capacidades de la técnica.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico) que codifica el PRO podría insertarse en un vector
replicable para su clonación (amplificación del ADN) o para su
expresión. Hay varios vectores disponibles públicamente. El vector
podría, por ejemplo, estar en forma de plásmido, cósmido, partícula
viral, o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada podría
insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En
general, el ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de
restricción apropiado usando técnicas bien conocidas en la técnica.
Los componentes del vector generalmente incluyen, pro no están
limitados a, una o más de una secuencia señal, un origen de
replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un
promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La
construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de estos
componentes emplea técnicas de ligación estándares que son conocidas
por el especialista capacitado.
El PRO podría producirse de forma recombinante
no sólo directamente sino también como un polipéptido de fusión con
un polipéptido heterólogo, el cual podría ser una secuencia señal u
otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el
extremo N-terminal de la proteína o polipéptido
maduros. En general, la secuencia señal podría ser un componente
del vector, o éste podría ser parte del ADN que codifica el PRO que
se inserta en el vector. La secuencia señal podría ser una secuencia
señal procariota seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de la
fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o líderes de la enterotoxina
II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia
señal podría ser, por ejemplo, la líder de la invertasa de
levadura, la líder del factor alfa (incluyendo las líderes del
factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces,
descrita ésta última en la patente estadounidense nº 5.010.182), o
la líder de la fosfatasa ácida, la líder de la glucoamilasa de
C. albicans (EP 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o
la señal descrita en WO90/13646 publicada el 15 de noviembre de
1990. En la expresión en células de mamífero, las secuencias señal
de mamífero pueden usarse para dirigir la secreción de la proteína,
tales como las secuencias señal procedentes
de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como las líderes secretoras virales.
de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como las líderes secretoras virales.
Ambos, los vectores de expresión y de clonación,
contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector
se replique en una o más células huéspedes seleccionadas. Tales
secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
apropiado para la mayoría de las bacterias
Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
apropiado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma,
adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de
mamífero.
Los vectores de expresión y clonación
típicamente contienen un gen de selección, también denominado
marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican
proteínas que (a) confieren resistencia frente a los antibióticos u
otras toxinas, por ejemplo, la ampicilina, neomicina, metotrexato, o
tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c)
aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo,
por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de
D-alanina para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
apropiados para las células de mamífero, son aquéllos que permiten
la identificación de las células competentes para captar el ácido
nucleico que codifica el PRO, tales como el de la DHFR o la quinasa
de timidina. Una célula huésped apropiada cunado se emplea la DHFR
del tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad
DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen
de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen
trp1 presente en el plásmido YRp7 de levadura [Stinchcomb
et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al.,
Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157
(1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable
para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de
crecer en triptófano, por ejemplo, las ATCC nº 44076 o
PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de clonación y expresión usualmente
contienen un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido
nucleico que codifica el PRO para dirigir la síntesis del ARNm. Los
promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes son
bien conocidos. Los promotores apropiados para su uso con huéspedes
procariotas incluyen los sistemas promotor de la
b-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature,
275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544
(1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano
(trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP
36.776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en
sistemas bacterianos incluyen también una secuencia
Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN
que codifica el PRO.
Los ejemplos de secuencias promotoras apropiadas
para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para
la quinasa de 3-fosfoglicerato [Hitzeman et al.,
J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glicolíticos
[Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968);
Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la
enolasa, la deshidrogenasa del
gliceraldehído-3-fosfato, la
hexoquinasa, la piruvatodescarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la
isomerasa de la glucosa-6-fosfato,
la mutasa del 3-fosfoglicerato, la quinasa de
piruvato, la triosafosfatoisomerasa, la isomerasa de la
fosfoglucosa, y la glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, los cuales son
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de que su
transcripción está controlada por las condiciones de crecimiento,
son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, del
isocitocromo C, de la fosfatasa C, de los enzimas degradantes
asociados con el metabolismo del nitrógeno, de la metalotioneína,
de la deshidrogenasa del
gliceraldehído-3-fosfato, y de los
enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa.
Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en
levadura se describen adicionalmente en EP 73.657.
La transcripción del PRO a partir de vectores en
células huéspedes de mamífero se controla, por ejemplo, mediante
promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del
polioma, del virus de la viruela aviar
(UK-2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989),
adenovirus (tal como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino,
virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de
la hepatitis-B y el virus 40 de los simios (SV40),
a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el
promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de
promotores de choque térmico, a condición de que tales promotores
sean compatibles con los sistemas de células huéspedes.
La transcripción de un ADN que codifica el PRO
por parte de eucariotas superiores podría incrementarse insertando
una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son
elementos del ADN que actúan en cis, usualmente de aproximadamente
10 a 300 p.b., que actúan sobre un promotor para incrementar su
transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias
potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa,
albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). No
obstante, típicamente, se usará un potenciador procedente de un
virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del
SV40 en el lado tardío del origen de replicación (p.b.
100-270), el potenciador del promotor temprano del
citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del
origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. El
potenciador se podría ayustar dentro del vector en una posición 5'
ó 3' respecto la secuencia codificante del PRO, pero preferiblemente
está ubicado en un sitio 5' respecto el promotor.
Los vectores de expresión usados en células de
levadura eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales,
humanos, o células nucleadas procedentes de otros organismos
multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales
secuencias están disponibles comúnmente a partir de las regiones
5', y, ocasionalmente, 3' no traducidas de los ADN virales o ADNc
eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no
traducida del ARNm que codifica el PRO.
Aún otros procedimientos, vectores y células
huéspedes apropiados para la adaptación a la síntesis del PRO en
cultivo de células recombinantes de vertebrados se describen en
Gething et al., Nature, 293:620-625
(1981); Mantei et al., Nature,
281:40-46 (1979); EP-117.060; y
EP-117.058.
La amplificación y/o expresión del gen podría
medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional, transferencia Northern para
cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia en
punto (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una
sonda convenientemente marcada, en base a las secuencias
proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden
emplearse anticuerpos que reconocen duplexes específicos, incluyendo
los duplexes de ADN, los duplexes de ARN, y los duplexes híbridos
ADN-ARN o los duplexes ADN-proteína.
A su vez, los anticuerpos pueden marcarse y podría llevarse a cabo
el ensayo en el que el dúplex está unido a una superficie, de forma
que, a partir de la formación del dúplex sobre la superficie, pueda
detectarse la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
La expresión del gen, podría medirse
alternativamente mediante procedimientos inmunológicos, tales como
la tinción inmunohistoquímica de células o de secciones de tejido, y
el ensayo del cultivo de células o de los fluidos corporales, para
cuantificar directamente la expresión de un producto del gen. Los
anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo
de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y
pueden prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los
anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia nativa del
polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las
secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención, o contra
una secuencia exógena fusionada al ADN del PRO y que codifica un
epítopo de anticuerpo específico.
La formas del PRO pueden recuperarse a partir
del medio de cultivo o a partir de lisados de células huéspedes. Si
están unidas a membrana, pueden liberarse de la membrana usando una
solución de detergente apropiada (por ejemplo,
Triton-X 100) o mediante corte enzimático. Las
células empleadas en la expresión del PRO pueden romperse mediante
varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, rotura
mecánica, o agentes para lisar células.
Podría desearse purificar el PRO de proteínas o
polipéptidos de la célula recombinante. Los siguientes
procedimientos son ilustrativos de procedimientos de purificación
apropiados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio
iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa;
cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio
catiónico tal como la DEAE; cromatoenfoque;
SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico;
filtración con gel usando, por ejemplo, Sephadex
G-75; columnas de Proteína-A y
Sepharose para retirar contaminantes tales como la IgG; y columnas
quelantes de metales para unir formas marcadas con epítopo del PRO.
Pueden emplearse varios procedimientos de purificación de proteínas,
y tales procedimientos son conocidos en la técnica y se describen,
por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);
Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag, Nueva York (1982). El(los)
paso(s) de purificación seleccionados dependerán, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del PRO
concreto producido.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementos) que codifican el PRO tienen varias aplicaciones en el
campos de la biología molecular, incluyendo los usos como sondas de
hibridación, en el mapeado de genes y cromosomas, y en la
generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico del PRO será
útil también para la preparación de polipéptidos PRO mediante las
técnicas recombinantes descritas en la presente invención.
El gen del PRO de secuencia nativa y longitud
completa, o porciones del mismo, pueden usarse como sondas de
hibridación con una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc del PRO
de longitud completa o para aislar aún otros ADNc (por ejemplo, los
que codifican variantes del PRO que ocurren de forma natural, o PRO
procedentes de otras especies) que tienen una deseada identidad de
secuencia con la secuencia del PRO nativo descubierta en la
presente invención. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de
aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de
hibridación pueden derivarse de al menos una región parcialmente
novedosa de la secuencia de nucleótidos nativa de longitud
completa, en donde esas regiones pueden determinarse sin
experimentación improcedente, o a partir de secuencias genómicas
que incluyeran promotores, elementos potenciadores e intrones del
PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de
examen comprenderá aislar la región codificante del gen PRO usando
la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada
de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden
marcarse con una diversidad de marcas, incluyendo los radionúcleos
tales como el ^{32}P o ^{35}S, o con marcas enzimáticas tales
como una fosfatasa alcalina acoplada con la sonda a través de
sistemas de acoplamiento de avidina-biotina. Las
sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del
gen PRO de la presente invención pueden usarse para examinar
bibliotecas de ADNc, ADN genómico, o ARNm humano con miembros de
tales bibliotecas con los que se hibrida la sonda. Las técnicas de
hibridación se describen con más detalles en los Ejemplos
siguientes.
Cualesquiera secuencias EST descubiertas en la
presente solicitud pueden emplearse de forma similar como sondas,
usando los procedimientos descubiertos en la presente
invención.
Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos
de PRO incluyen los oligonucleótidos antisentido o con sentido que
comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra sencilla (bien
ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm (con sentido)
de PRO o ADN (antisentido) de PRO. Los oligonucleótidos antisentido
o con sentido acordes con la presente invención, comprenden un
fragmento de la región codificante del ADN de PRO. Un fragmento tal
generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos,
preferiblemente desde aproximadamente 14 hasta 30 nucleótidos. La
capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o con sentido,
basado en una secuencia de ADNc que codifica una proteína
determinada se describen en, por ejemplos, Stein y Cohen (Cancer
Res., 48:2659, 1988) y van der Krol et al.
(BioTechniques, 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos antisentido o con
sentido a secuencias de ácido nucleico dianas resulta en la
formación de duplexes que bloquean la transcripción o traducción de
la secuencia diana por uno de varios medios, incluyendo la
degradación potenciada de los duplexes, la terminación prematura de
la transcripción o traducción, o mediante otros medios. Por tanto,
los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para bloquear la
expresión de proteínas PRO. Los oligonucleótidos antisentido o con
sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen esqueletos
azúcar-fosfodiéster modificados (u otros enlaces
azúcar, tales como los descritos en WO91/06629) y en donde tales
enlaces azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales
oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estables in
vivo (es decir, son capaces de resistir la degradación
enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser
capaces de unir secuencias de nucleótidos diana.
Otros ejemplos de oligonucleótidos con sentido o
antisentido incluyen aquéllos oligonucleótidos que están unidos
covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en
WO-90/110.048, y otros grupos que incrementan la
afinidad del oligonucleótido por una secuencia diana de ácido
nucleico, tal como la poli-(L-lisina). Más aún,
pueden unirse agentes intercaladores, tales como la elipticina, y
agentes alquilantes o complejos de metal, a los oligonucleótidos
con sentido o antisentido para modifican la especificidades de unión
del oligonucleótido con sentido o antisentido por la secuencia
nucleotídica diana.
Los oligonucleótidos antisentido o con sentido
pueden introducirse dentro de una célula que contuviera la
secuencia de ácido nucleico diana mediante cualquier procedimiento
de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, la transfección
de ADN mediada por CaPO_{4}^{-}, la electroporación, o usando
vectores de transferencia de genes tales como el virus de
Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un
oligonucleótido antisentido o con sentido se inserta en un vector
retroviral apropiado. Una célula que contiene la secuencia de ácido
nucleico diana se pone en contacto con el vector retroviral
recombinante, bien in vivo o ex vivo. Los vectores
retrovirales apropiados incluyen, pero no se limitan a, aquéllos
derivados del retrovirus M-MuLV de ratón, el N2 (un
retrovirus derivado del M-MuLV), o los vectores de
copia doble denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13.641).
Los oligonucleótidos con sentido o antisentido
pueden introducirse también en una célula que contuviera la
secuencia nucleotídica diana mediante la formación de un conjugado
con una molécula unidora de ligando, tal y como se describe en
WO91/04.753. Las moléculas unidoras de ligando apropiadas incluyen,
pero no se limitan a, los receptores de superficie celular, los
factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se
unen a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la
conjugación de la molécula unidora de ligando no interfiere
sustancialmente con la capacidad de la molécula unidora de ligando
para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o para
bloquear la entrada del oligonucleótido con sentido o antisentido,
o su versión conjugada, dentro de la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido con sentido
o antisentido podría introducirse dentro de una célula que
contuviera la secuencia de ácido nucleico diana mediante la
formación de un complejo oligonucleótido-lípido,
tal y como se describe en WO-90/10.448. El complejo
lípido-oligonucleótido con sentido o antisentido
preferiblemente es disociado dentro de la célula por una lipasa
endógena.
Las moléculas de ARN o ADN con sentido o
antisentido tienen generalmente al menos 5 bases de longitud,
aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de
longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25
bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud,
aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de
longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50
bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud,
aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de
longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75
bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud,
aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de
longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100
bases de longitud, o más.
Las sondas pueden emplearse también en técnicas
de la PCR para generar un conjunto de secuencias para la
identificación de secuencias codificantes del PRO estrechamente
relacionadas.
Las secuencias de nucleótido que codifican un
PRO pueden usarse también para construir sondas de hibridación para
mapear el gen que codifican ése PRO y para el análisis genético de
individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos
proporcionadas en la presente invención pueden mapearse sobre un
cromosoma y regiones específicas de un cromosoma usando técnicas
conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de
conexión genética respecto marcadores cromosómicos conocidos, y el
examen mediante hibridación con bibliotecas.
Cuando las secuencias codificantes para el PRO
codifican un proteína que se une a otra proteína (por ejemplo,
cuando el PRO es un receptor), el PRO puede usarse en ensayos para
identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la
interacción de unión. Mediante tales procedimientos, pueden
identificarse inhibidores de la interacción de unión
receptor/ligando. Las proteínas implicadas en tales interacciones de
unión pueden usarse también para examinar en busca de péptidos o
moléculas pequeñas inhibidores o agonistas de la interacción de
unión. También, el receptor PRO puede usarse para aislar ligandos
correlativos. Los ensayos de cribado pueden diseñarse para hallar
compuestos líderes que imiten la actividad biológica de un PRO
nativo o de un receptor para PRO. Tales ensayos de cribado
incluirán ensayos capaces de cribado con elevado rendimiento de
bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente apropiados para
identificar moléculas pequeñas candidatas a fármaco. Las moléculas
pequeñas contempladas incluyen los compuestos orgánicos o
inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden realizarse en una
variedad de formatos, incluyendo los ensayos de unión
proteína-proteína, los ensayos de cribado
bioquímico, los inmunoensayos y los ensayos basados en células, los
cuales están bien caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican el PRO o su
formas modificadas pueden usarse también para generar animales
transgénicos o animales "noqueados" ("knock out")
los cuales, a su vez, sin útiles en el desarrollo y cribado de
reactivos terapéuticos útiles. Un animal transgénico (por ejemplo,
un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un
transgén, transgén que fue introducido en el animal o en un ancestro
del animal en un estadio prenatal, por ejemplo, un estado
embrionario. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma
de una célula a partir de la que se desarrolla el animal
transgénico. En una realización, el ADNc que codifica el PRO puede
usarse para clonar el ADN genómico que codifica el PRO de acuerdo
con técnicas establecidas, y las secuencias genómicas pueden usarse
para generar animales transgénicos que contienen células que
expresan el ADN que codifica el PRO. Los procedimientos para genera
animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones
o ratas, han pasado a ser convencionales en la técnica y se
describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses nº
4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, para la incorporación del
transgén de PRO se apuntaría a células concretas con potenciadores
específicos de tejidos. Los animales transgénicos que incluyen una
copia de un transgén que codifica el PRO introducido en la línea
germinal del animal en un estadio embrionario pueden usarse para
examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica
el PRO. Tales animales pueden usarse como animales de ensayo para
reactivos que se cree confieren protección frente a, por ejemplo,
condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo
con este aspecto de la invención, un animal se trata con el
reactivo, y una incidencia reducida de la condición patológica, en
comparación con los animales sin tratar portadores del transgén,
indicaría una potencial intervención terapéutica para la condición
patológica.
Alternativamente, pueden usarse homólogos no
humanos del PRO para construir un animal "noqueado" de PRO que
tiene un gen codificante de PRO defectuoso o alterado a consecuencia
de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el
PRO y el ADN genómico alterado que codifica el PRO introducido en
una célula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, podría usarse
el ADNc que codifica el PRO para clonar el ADN genómico que
codifica el PRO de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción
del ADN genómico que codifica el PRO puede suprimirse o
reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador
seleccionable, el cual puede usarse para monitorizar la
integración. Típicamente, se incluyen varios kilobases de ADN
flanqueante inalterado (en ambos, los extremos 5' y 3') [ver, por
ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una
descripción de los vectores de recombinación homólogos]. El vector
se introduce en una línea de células madre embrionarias (por
ejemplo, mediante electroporación), y se seleccionan las células en
las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el
ADN endógeno [ver, por ejemplo, Li et al., Cell,
69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a
continuación en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o
rata) para formar quimeras de agregación [consultar, por ejemplo,
Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A
Practical Approach, ed. E.J. Robertson, (IRL, Oxford, 1987), pp.
113-1521. Un embrión quimérico puede entonces
implantarse en un animal criador hembra pseudoembarazada, y el
embrión puede llevarse a término para crear un animal
"noqueado". La progenie que alberga el ADN recombinado
homólogamente en sus células germinales puede identificarse
mediante técnicas estándares y usarse para criar animales en los
que todas las células del animal contienen el ADN recombinado
homólogamente. Los animales noqueados pueden caracterizarse, por
ejemplo, por su capacidad para defenderse de ciertas condiciones
patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a
la ausencia del polipéptido PRO.
EL ácido nucleico que codifica los polipéptidos
de PRO podría usarse también en terapia génica. En las aplicaciones
de terapia génica, los genes se introducen en las células con objeto
de conseguir la síntesis in vivo de un producto genético
terapéuticamente efectivo, por ejemplo, mediante la sustitución de
un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la
terapia génica convencional, en la que se consigue un efecto
duradero mediante un único tratamiento, y la administración de
agentes terapéuticos de genes, lo que implica la administración una
única vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Los
ARN y los ADN antisentido pueden usarse para bloquear la expresión
in vivo de ciertos genes. Ya se ha observado que los
oligonucleótidos cortos antisentido pueden ser importados dentro de
las células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas
concentraciones intracelulares causadas por su captación reducida a
causa de la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 83:4143-4146 [1986]). Los
oligonucleótidos pueden modificarse para potenciar su captación,
por ejemplo, sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados
negativamente por grupos no cargados.
Hay una variedad de técnicas disponibles para
introducir ácidos nucleicos dentro de células viables. Las técnicas
varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere dentro de
células cultivadas in vitro, o in vivo en las células
del huésped previsto. Las técnicas apropiadas para la transferencia
in vitro del ácido nucleico dentro de células de mamífero
incluyen el uso de liposomas, la electroporación, la microinyección,
la fusión de células, el DEAE-dextrano, el
procedimiento de precipitación con fosfato cálcico, etc. Las
técnicas de transferencia de genes in vivo actualmente
preferidas incluyen la transfección con vectores virales
(típicamente retrovirales) y la transfección mediada por
liposoma-proteína de cubierta viral (Dzau et
al., Trends in Biotechnology, 11:205-210
[1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente
de ácido nucleico con un agente que apunta a las células diana, tal
como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de
superficie de una célula o para la célula diana, un ligando para un
receptor sobre la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas,
las proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie
de una célula asociada con la endocitosis pueden usarse para apuntar
y/o facilitar la captación, por ejemplo, proteínas de la cápside o
fragmentos de las mismas trópicas para un determinado tipo de
célula, los anticuerpos para proteínas que experimentan
internalización al ciclarse, proteínas que apuntan a la localización
intracelular y potencian la vida media intracelular. Las técnica de
la endocitosis mediada por receptor es descrita, por ejemplo, por
Wu et al., J. Biol. Chem.,
262:4429-4432 (1987); y Wagner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414
(1990). Para una revisión de los protocolos de marcado de genes y de
terapia génica consultar Anderson et al., Science,
256:808-813 (1992).
Los polipéptidos PRO descritos en la presente
invención pueden emplearse también como marcadores de peso
molecular para propósitos de electroforesis de proteínas, y las
secuencias de ácido nucleico aisladas pueden usarse para expresar
recombinantemente esos marcadores.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
los polipéptidos PRO, o fragmentos de los mismos, descritas en la
presente invención son útiles para la identificación del cromosoma.
En este sentido existe una continua necesidad de identificar nuevos
marcadores de cromosomas, puesto que actualmente hay relativamente
pocos reactivos marcadores de cromosoma basados en datos de
secuencia. Cada molécula de ácido nucleico de PRO de la presente
invención puede usarse como marcador cromosómico.
Los polipéptidos PRO y las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención pueden usarse también para tipado
de tejidos, en donde los polipéptidos PRO de la presente invención
pueden expresarse de forma diferencial en un tejido en comparación
con otro. Las moléculas de ácido nucleico hallarán un uso para
generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Souther, y
análisis Western.
Los polipéptidos PRO descritos en la presente
invención pueden emplearse también como agentes terapéuticos. Los
polipéptidos PRO de la presente invención pueden formularse de
acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones
útiles farmacéuticamente, en donde el producto PRO de ésta se
combina en mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente
aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para su
almacenamiento mezclando el ingrediente activo, que tiene el grado
de pureza deseado, con portadores, excipientes o estabilizadores
opcionales y fisiológicamente aceptables (Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, ed. A. Osol, (1980)), en
forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los
portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos
para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e
incluyen tampones tales como el fosfato, citrato y otros ácidos
orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico;
polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como la albúmina de suero, la gelatina o
las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la
polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como la glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; los monosacáridos, disacáridos y
otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas;
agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el
sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el Tween^{TM},
Pluronics^{TM} o PEG.
Las formulaciones a usarse para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estériles, antes o a continuación de la liofilización y
reconstitución.
Las composiciones terapéuticas en la presente
invención generalmente se colocan en un contenedor que tiene un
puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución
intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una
aguja de inyección hipodérmica.
La ruta de administración es de acuerdo con
procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión
mediante ruta intravenosa, intraperitoneal, intracerebral,
intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional,
administración tópica, o mediante sistemas de liberación
continua.
Las dosis y concentraciones de fármacos deseadas
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo del uso concreto previsto. La determinación de la
dosis apropiada o de la ruta de administración se halla
perfectamente dentro de la capacitación del médico ordinario. Los
experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la
determinación de dosis efectivas para la terapia humana. El
escalado entre especies de dosis efectivas puede realizarse
siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell,
W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en
Toxicokinetics and New Drug Development, eds. Yacobi et
al., Pergamon Press, New York 1989, pp.
42-96.
Cuando se emplea la administración in
vivo de un polipéptido PRO, o de un agonista o antagonista del
mismo, las cantidades de dosis normal pueden variar desde
aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del
mamífero o más por día, preferiblemente aproximadamente de 1
\mug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de
administración. En la literatura se proporciona guía sobre dosis
particulares y procedimientos de administración; ver, por ejemplo,
las patentes estadounidenses nº 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212.
Se anticipa que formulaciones diferentes serán efectivas para
diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que
la administración dirigida a un órgano o tejido podría necesitar,
por ejemplo, su suministro en un forma diferente a la de otro órgano
o tejido.
Cuando se desea la administración de liberación
continua de un polipéptido PRO en una formulación con
características de liberación apropiadas para el tratamiento de
cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración del
polipéptido PRO, se contempla la microencapsulación del polipéptido
PRO. La microencapsulación de proteínas recombinantes para su
liberación continua se ha realizado de forma exitosa con la hormona
del crecimiento humana (rhGH), el interferón- (rhIFN-), la
interleucina-2, y la MN rgp120. Johnson et
al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda,
Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora
et al., Bio/Technology, 8:755-758
(1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization
Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems",
en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, eds.
Powell y Newman, (Plenum Press: Nueva York, 1995), pp.
439-462; WO-97/03.692,
WO-96/40.072, WO-96/07.399; y la
patente estadounidense nº 5.654.010.
Las formulaciones de liberación continua de
estas proteínas se desarrollaron usando polímero de ácido
poli-láctico-glicólico (PLGA) debido
a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos
láctico y glicólico, pueden eliminarse rápidamente dentro del
cuerpo humano. Más aún, la degradabilidad de este polímero puede
ajustarse desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y
composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer," en: M. Chasin y R. Langer (Eds.),
Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel
Dekker: Nueva York, 1990), pp. 1-41.
Esta invención abarca procedimientos para
examinar compuestos para identificar aquéllos que imitan el
polipéptido PRO (agonistas) o impiden el efecto del polipéptido PRO
(antagonistas). Los ensayos de examen para candidatos a fármacos
antagonista se diseñan para identificar compuestos que se unen o
complejan con los polipéptidos PRO codificados por los genes
identificados en la presente invención, o interfieren de otro modo
con la interacción de los polipéptidos codificados con otras
proteínas celulares. Tales ensayos de examen incluirán ensayos
capaces de cribar bibliotecas químicas con elevado rendimiento,
haciéndolos especialmente apropiados para identificar moléculas
pequeñas candidatas a fármaco.
Los ensayos pueden realizarse en una variedad de
formatos, incluyendo los ensayos de unión
proteína-proteína, los ensayos de examen
bioquímicos, los inmunoensayos, y los ensayos basados en células,
los cuales están bien caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos para antagonistas son comunes
en que requieren el contacto del candidato a fármaco con un
polipéptido PRO codificado por un ácido nucleico identificado en la
presente invención, en condiciones y durante un tiempo suficiente
para permitir que estos dos componentes interacciones.
En los ensayos de unión, la interacción es la
unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la
mezcla de reacción. En una realización determinada, el polipéptido
PRO codificado por el gen identificado en la presente invención, o
el fármaco candidato, se inmoviliza sobre una fase sólida, por
ejemplo, sobre una placa de microvaloración, mediante enlaces
covalentes o no covalentes. La unión no covalente se consigue
generalmente recubriendo la superficie sólida con una solución del
polipéptido PRO y secándola. Alternativamente, puede usarse un
anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal,
específico para el polipéptido PRO a inmovilizar para anclarlo
sobre una superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el
componente no inmovilizado, el cual podría marcarse mediante una
marca detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la
superficie recubierta que contiene el compuesto anclado. Cuando se
ha completado la reacción, los componentes sin reaccionar se
retiran, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos
anclados sobre la superficie sólida. Cuando el componente
originalmente no inmovilizado lleva una marca detectable, la
detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que
ha ocurrido la complejación. Cuando el componente originalmente no
unido no lleva una marca, la complejación puede detectarse, por
ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se una específicamente al
complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona pero no
se une a un determinado polipéptido PRO codificado por un gen
identificado en la presente invención, su interacción con el
polipéptido puede ensayarse mediante procedimientos bien conocidos
para detectar interacciones proteína-proteína. Tales
ensayos incluyen las estrategias tradicionales, tales como, por
ejemplo, el entrecruzamiento, la
co-inmunoprecipitación, y la
co-purificación a través de gradientes o columnas
cromatográficas. Además, las interacciones
proteína-proteína pueden monitorizarse usando un
sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y
colaboradores (Fields y Song, Nature (London),
340:245-246 (1989); Chien et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) tal
como es descrito por Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 5789-5793 (1991). Muchos activadores de
la transcripción, tales como el GAL4 de levadura, consisten en dos
dominios moleculares físicamente discretos, uno actúa como dominio
unidor de ADN, y el otro funciona como dominio de activación de la
transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las
publicaciones precedentes (generalmente denominado como el
"sistema de dos híbridos") saca provecho de esta propiedad, y
emplea dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana está
fusionada con el dominio unidor de ADN del GAL4, y la otra en la que
las proteínas activadoras candidatas están fusionadas con el
dominio de activación. La expresión de un gen informador
GAL1-lacZ bajo control de un promotor activado por
GAL4 depende de la reconstitución de la actividad GAL4 vía la
interacción proteína-proteína. Las colonias que
contienen polipéptidos que interactúan se detectan con un sustrato
cromogénico para la \beta-galactosidasa. Hay un
equipo completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
usando la técnica de dos híbridos, disponible comercialmente de
Clontech. Este sistema puede extenderse también para mapear dominios
proteicos implicados en interacciones de proteínas específicas, así
como para determinar con precisión los residuos aminoácidos que son
cruciales para estas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO identificado
en la presente invención y otros componentes intra- o extracelulares
pueden ensayarse como sigue: usualmente se prepara una mezcla de
reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o
extracelular en condiciones y durante un período que permite la
interacción y la unión de los dos productos. Para ensayar la
capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la
reacción se realiza en ausencia y en presencia del compuesto de
ensayo. Además, podría añadirse un placebo a una tercera mezcla de
reacción para servir como control positivo. La unión (formación de
complejo) entre el compuesto de ensayo y el componente intra- o
extracelular presente en la mezcla se monitoriza tal y como se
describió en la presente invención más arriba. La formación de un
complejo en la(s) reacción(es) de control pero no en
la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo indica que
el compuesto de ensayo interfiere con la interacción del compuesto
de ensayo y su pareja de reacción.
Para ensayar en busca de antagonistas, el
polipéptido PRO podría añadirse a una célula junto con el compuesto
a examinar, y la capacidad de inhibir la actividad de interés en
presencia del polipéptido PRO indica que el compuesto es un
antagonista del polipéptido PRO. Alternativamente, los antagonistas
pueden detectarse combinando el polipéptido PRO y un antagonista
potencial con receptores del polipéptido PRO, o receptores
recombinantes, unidos a membrana, en condiciones apropiadas para un
ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido PRO puede
marcarse, tal como mediante radiactividad, de tal forma que el
número de moléculas de polipéptido PRO unidas al receptor pueden
usarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El
gen que codifica el receptor puede identificarse mediante numerosos
procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, por
ejemplo, cribado del ligando y clasificación mediante FACS. Coligan
et al., Current Protocols in Immun.,
1(2):capítulo 5 (1991). Preferiblemente, se emplea la
clonación y expresión, en donde se prepara ARN poliadenilado a
partir de células que responden al polipéptido PRO, y una biblioteca
de ADNc, creada a partir de este ARN, se divide en grupos y se usa
para transfectar células COS u otras células que no responden al
polipéptido PRO. Las células transfectadas, que se hacen crecer
sobre portaobjetos de vidrio, se exponen a polipéptido PRO marcado.
El polipéptido PRO puede marcarse mediante una variedad de medios,
incluyendo la yodación o la inclusión de un sitio de reconocimiento
para una proteína quinasa específica para el sitio. A continuación
de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis
autorradiográfico. Se identifican los grupos positivos, y se
preparan subgrupos y se transfectan de nuevo usando un proceso
interactivo de submuestreo y re-examen, que
eventualmente proporcionará un único clon que codifica el receptor
putativo.
Como una estrategia alternativa para la
identificación del receptor, el polipéptido PRO marcado puede
unirse mediante fotoafinidad con una membrana de célula o
preparaciones de extractos que expresan la molécula del receptor.
El material entrecruzado se separa mediante PAGE y se expone con
película para rayos-X. El complejo marcado que
contiene el receptor puede cortarse, separarse en fragmentos de
péptido, y someterse a microsecuenciación de proteínas. La
secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microsecuenciación
se usaría para diseñar un conjunto de sondas oligonucleotídicas
degeneradas para examinar una biblioteca de ADNc para identificar el
gen que codifica el receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, las células de
mamífero, o una preparación de membrana, que expresan el receptor
se incubarían con polipéptido PRO marcado en presencia del compuesto
candidato. La capacidad del compuesto para potenciar o bloquear
esta interacción podría medirse a continuación.
Los ejemplos más específicos de antagonistas
potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con el polipéptido PRO, y, en concreto,
anticuerpos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli- y
monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena
sencilla, anticuerpos anti-idiopáticos, y versiones
quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como
anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente,
un antagonista potencial podría ser una proteína estrechamente
relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PRO que
reconoce el receptor pero no causa efecto alguno, inhibiendo
competitivamente, por tanto, la acción del polipéptido PRO.
Otro antagonista potencial del polipéptido PRO
es una construcción de ARN o ADN antisentido preparada usando la
tecnología del antisentido, en donde, por ejemplo, una molécula de
ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la
traducción del ARNm hibridizando el ARNm apuntado, e impidiendo la
traducción en proteína. La tecnología antisentido puede usarse para
controlar la expresión del gen a través de la formación de hélice
triple o mediante ADN o ARN antisentido, basándose ambos
procedimientos en la unión de un polinucleótido al ADN o ARN. Por
ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia del polipéptido,
la cual codifica los polipéptidos PRO maduro en la presente
invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido
de aproximadamente desde 10 hasta 40 pares de bases de longitud. Se
diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario de una
región del gen implicado en la transcripción (triple hélice, ver Lee
et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et
al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al.,
Science, 251:1360 (1991)), impidiendo de ese modo la
transcripción y la producción del polipéptido PRO. El
oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida con el ARNm in
vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el
polipéptido PRO (antisentido, Okano, Neurochem., 56:560
(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene
Expression (CRC Press, Boca Raton, Fla., 1988). Los
oligonucleótidos descrito más arriba pueden suministrarse también a
células, de tal forma que el ARN o ADN antisentido pudieran
expresarse in vivo para inhibir la producción del
polipéptido PRO. Cuando se usa ADN antisentido, se prefieren los
oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por
ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia
nucleotídica del gen diana.
\newpage
Los antagonistas potenciales incluyen las
moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión
del receptor, o de factores de crecimiento u otro sitio de unión
relevante del polipéptido PRO, bloqueando de ese modo la actividad
biológica normal del polipéptido PRO. Los ejemplos de moléculas
pequeñas incluyen, pero no se limitan a, los péptidos o moléculas
parecidas a péptidos pequeños, preferiblemente los péptidos
solubles, y los compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos
sintéticos.
Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar el corte específico del ARN. Los ribozimas
actúan mediante hibridación específica para la secuencia con el ARN
diana complementario, seguida por corte endonucloelítico. Los
sitios de corte del ribozima dentro de un potencial ARN diana pueden
identificarse mediante técnicas conocidas. Para detalles
adicionales ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-471 (1994), y la publicación del PCT Nº
WO97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de
triple hélice usadas para inhibir la transcripción deberían ser de
hebra única y estar compuestas por desoxinucleótidos. La composición
de bases de estos oligonucleótidos se diseña de tal forma que
promueve la formación de la triple hélice a través de reglas de
emparejamiento de Hoogsteen, las cuales requieren generalmente
tramos bastante grandes de purinas o pirimidinas en una hebra del
dúplex. Para más detalles, ver, por ejemplo, la publicación del PCT
Nº WO 97/33551, ver más arriba.
Estas moléculas pequeñas pueden identificarse
mediante uno o más de los ensayos de verificación descritos en la
presente invención más arriba y/o mediante cualquiera otra técnica
de verificación bien conocida por los especialistas en la
técnica.
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-PRO. Los anticuerpos de ejemplo
incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados,
biespecíficos y heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-PRO pueden
comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para
preparar anticuerpos policlonales son conocidos por el especialista
capacitado. Los anticuerpos policlonales pueden generarse en un
mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente
inmunizador y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente
inmunizador y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante
múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente
inmunizador podría incluir el polipéptido PRO o una proteína de
fusión del mismo. Podría ser útil conjugar el agente inmunizador a
una proteína que se sabe es inmunogénica en el mamífero que se está
inmunizando. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen,
pero no se limitan a la hemocianina de lapa con forma de ojo de
cerradura, la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, y el
inhibidor de la tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que
pueden emplearse incluyen el adyuvante completo de Freund y el
adyuvante MLD-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa
dicorinomicolato sintética). El protocolo de inmunización podría
ser seleccionado por alguien formado en la técnica sin
experimentación innecesaria.
Los anticuerpos anti-PRO podría,
alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales pueden prepararse usando procedimientos de hibridoma,
tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature,
256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un ratón, hámster,
u otro animal huésped apropiado, se inmuniza típicamente con un
agente inmunizador para elicitar linfocitos que producen o son
capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al
agente inmunizador. Alternativamente, los linfocitos pueden
inmunizarse
in vitro.
in vitro.
El agente inmunizador típicamente incluye el
polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, o
se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean
células de origen humano, o se usan células del bazo o de nódulo
linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los
linfocitos se fusionan a continuación con una línea celular
inmortalizada usando un agente de fusión apropiado, tal como el
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic
Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares
inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas,
particularmente, células de mieloma de origen de roedor, bovino y
humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o
ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de
cultivo apropiado que inhibe el crecimiento o supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
progenitoras carecen del enzima fosforibosiltransferasa de
hipoxantina guanina (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los
hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina
("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de
células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan una expresión
de nivel elevado estable, y son sensibles a un medio tal como el
medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
las líneas de mieloma de ratón, las cuales pueden obtenerse, por
ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,
Ca, y de la American Type Culture Collection, Manassas, Va. También
se han descrito líneas celulares de mieloma humanas y de
heteromielomas de ratón-humanos para la producción
de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol.,
133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.,
Nueva York, (1987) pp. 51-631.
El medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma puede entonces ensayarse para la presencia de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO. Preferiblemente,
la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales
producidos por las células de hibridoma se determina mediante
inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro,
tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente
unida a enzima (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en el
campo. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede
determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de
Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de
dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándar
[Goding, ver más arriba]. Los medios de cultivo apropiados para
este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado
por Dulbecco y el medio RPMI-1640.
Alternativamente, las células del hibridoma pueden cultivarse in
vivo como ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de
cultivo o del fluido de ascites mediante procedimientos
convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por
ejemplo, la Proteína A-Sepharose, la cromatografía
con hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la
cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
también mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los
descritos en la patente estadounidense nº 4.816.567. El ADN que
codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede
aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que
son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesada y ligera de anticuerpos de ratón). Las células de
hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal
ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de
expresión, los cuales se transfectan entonces dentro de células
tales como las células COS de simio, las células del ovario de
hámster chino (CHO), o células de mieloma, que de otro modo no
producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El
ADN podría modificarse también, por ejemplo, sustituyendo la
secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena ligera
y pesada humana en lugar de las secuencias de ratón homólogas
[patente estadounidense nº 4.816.567; Morrison et al., ver
más arriba], o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica
la inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia que codifica
un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Tal polipéptido que no
es de inmunoglobulina puede sustituirse con los dominios constantes
de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse con los
dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un
anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo bivalente
quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
y cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada se
trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc con objeto
de impedir que la cadena cruzada se entrecruce. Alternativamente,
los residuos cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo
aminoácido o se suprimen con objeto de impedir el entrecruzado.
Los procedimientos in vitro son también
apropiados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente,
fragmentos Fab, puede realizarse usando técnicas de rutina
conocidas en el campo.
Los anticuerpos anti-PRO de la
invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o
anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, de ratón) son inmunoglobulinas o cadenas de
inmunoglobulina quiméricas, o fragmentos de las mismas (tales como
Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de
anticuerpos unidoras de antígeno), las cuales contienen una
secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los
anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región
determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen
por residuos procedentes de una CDR de una especie no humana
(anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tiene la
especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los
residuos estructurales de Fv de la inmunoglobulina human son
sustituidos por los residuos no humanos correspondientes. Los
anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no
se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o en
las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado
comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y
típicamente dos, de los dominios variables, en el cual la todas o
sustancialmente todas de las regiones FR son las de una secuencia
consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado
óptimamente también contendrá al menos una porción de una región
constante de inmunoglobulina (Fc), típica la de una inmunoglobulina
humana [Jones et al., Nature,
321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature,
332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct.
Biol., 2:593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un
anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos
introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos
residuos aminoácidos no humanos se denominan a menudo como residuos
"importados", los cuales se tomas típicamente de un dominio
variable "importado". La humanización puede realizarse
esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores
[Jones et al., Nature, 321:522-525
(1986); Riechmann et al., Nature,
332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante la
sustitución de CDR o secuencias de CDR de roedores en lugar de las
correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. De acuerdo con
esto, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos
(patente estadounidense nº 4.816.567), en donde sustancialmente
menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por
la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la
práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos
humanos en los que algunos residuos de la CDR, y posiblemente
algunos residuos de la FR, son sustituidos por residuos procedentes
de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos pueden producirse
también usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo
las bibliotecas de exhibición sobre fagos [Hoogenboom y Winter,
J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J.
Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al.
y Boemer et al. también están disponibles para la
preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al.,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.
77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol.,
147(1):86-95 (1991)]. De forma similar, los
anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la introducción de
loci de inmunoglobulina human en animales transgénicos, por
ejemplo, ratones en los que se han desactivado parcial o
completamente los genes de inmunoglobulina endógenos. A partir del
desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, los
cuales se parecen estrechamente en todos los aspectos a los
observados en humanos, incluyendo la reordenación y ensamblado de
genes, y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe,
por ejemplo, en las patentes estadounidenses nº 5.545.807;
5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las
siguientes publicaciones científicas: Marks et al.,
Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et
al., Nature, 368:856-859(1994);
Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild
et al., Nature Biotechnology, 14:845-51
(1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996);
Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol.,
13:65-93 (1995).
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen
especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En
el caso presente, una de las especificidades de unión es por el
PRO, la otras es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por
una proteína o receptor, o subunidad del receptor, de la superficie
celular.
Los procedimientos para construir anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena
ligera de inmunoglobulina, en donde la dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Milsteinand Cuello, Nature,
305:537-539 (1983)]. Debido al surtido aleatorio de
cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas
(quadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de
anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura
biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se
consigue usualmente mediante pasos de cromatografía de afinidad. Se
describen procedimientos similares en WO93/08829, publicada el 13
de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991).
Los dominios variables de anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias
del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente
lo es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina,
comprendiendo al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se
prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada
(CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena
ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que
codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se
desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores
de expresión distintos, y se co-transfectan en un
organismo huésped apropiado. Para más detalles sobre la generación
de anticuerpos biespecíficos consultar, por ejemplo, Suresh et
al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otra estrategia descrita en
WO96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos
puede manipulares para maximizar el porcentaje de heterodímeros que
se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz
preferida comprende al menos un parte de la región CH3 de un dominio
constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas
laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera
molécula de anticuerpo se remplazan con cadenas laterales mayores
(por ejemplo, tirosina o triptófano). En la interfaz de la segunda
molécula de anticuerpo se crean "cavidades" de tamaño idéntico
o similar al de la(s) cadena(s) lateral(es)
grande(s) sustituyendo cadenas laterales de aminoácido
grandes con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del
heterodímero respecto otros productos finales no deseados, tales
como los homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse
como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de
anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos
F(ab')_{2}). Las técnicas para generar anticuerpos
biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo se han descrito
en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden
prepararse usando enlaces químicos. Brennan et al.,
Science, 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde
se cortan proteolíticamente anticuerpos intactos para generar
fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en
presencia del agente arsenito sódico, complejador de ditioles, para
estabilizar los ditioles vicinales e impedir la formación de
disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se
convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB).
Entonces, uno de los derivados Fab'-TNB se
reconvierte al Fab'-tiol mediante reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden
usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Los fragmentos Fab' pueden recuperarse
directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp.
Med., 175:217-225 (1992) describen la producción
de una molécula F(ab')_{2} de anticuerpo biespecífico
completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secreto de E.
coli por separado y se sometió in vitro a acoplamiento
químico directo para formar el anticuerpo biespecífico. El
anticuerpos biespecífico así formado fue capaz de unirse a células
que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células T humanos
normales, así como de disparar la actividad lítica de los linfocitos
citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.
También se han descrito varias técnicas para
preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos
directamente a partir del cultivo de células recombinante. Por
ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando
cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5):1547-1553 (1992). Se unieron péptidos
de cremallera de leucinas, procedentes de las proteínas Fos y Jun, a
las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante la fusión
de genes. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región
bisagra para formar monómeros, y a continuación se
re-oxidaron para formar los heterodímeros de
anticuerpo. Este procedimiento puede utilizarse también para la
producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de
"diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha
proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de
anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio
variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable
de cadena ligera (V_{L}) mediante un conector que es demasiado
corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre
la misma cadena. En consecuencia, los dominios V_{H} y V_{L} de
un fragmento están forzados a emparejarse con los dominios V_{L} y
V_{H} complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos
sitios unidores de antígeno. También se ha descrito otra estrategia
para construir fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el
uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Ver, Gruber et
al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Se contemplan
anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse
anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol.,
147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo pueden
unirse a dos epítopos diferentes sobre un determinado polipéptido
PRO en la presente invención. Alternativamente, un brazo de
polipéptido anti-PRO pueden combinarse con un brazo
que se une a una molécula disparadora sobre un leucocito, tal como
una molécula de receptor de célula T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28,
o B7), o a receptores de Fc para la IgG (Fc\gammaR), tales como
los Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII
(CD16) con objeto de concentrar los mecanismos de defensa celular
sobre la célula que expresa el polipéptido PRO concreto. Los
anticuerpos biespecíficos pueden usarse también para localizar
agentes citotóxicos sobre células que expresan un determinado
polipéptido PRO. Estos anticuerpos poseen un brazo unidor de PRO y
un brazo que se une a un agente citotóxico o a un quelante de
radionúcleo, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo
biespecífico de interés une el polipéptido PRO y además une el
factor de tejido (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados se hallan
también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos
covalentemente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo,
para dirigir células del sistema inmune contra células no deseadas
[patente estadounidense nº 4.676.980], y para el tratamiento de la
infección por VIH [WO91/00360; WO92/200373; EP 03089]. Se contempla
que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando
procedimientos conocidos en la química sintética de proteína,
incluyendo aquéllos que implican agentes entrecruzadores. Por
ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de
intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos
de agentes apropiados para este propósito incluyen el iminotiolato
y el metil-4-mercaptobutirimidato y
aquéllos descubiertos, por ejemplo, en la patente estadounidense nº
4.676.980.
Podría ser deseable modificar el anticuerpo de
la invención en relación a la función efectora, con objeto de
potenciar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo para tratar el
cáncer. Por ejemplo, pueden introducirse residuo(s) cisteína
en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces
disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico
generado de este modo podría tener una capacidad de internalización
mejorada, y/o una capacidad de matar células mediada por el
complemento y una citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC)
incrementadas. Ver Caron et al., J. Exp Med., 176:
1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148:
2918-2922 (1992). También pueden prepararse
anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor
potenciada usando entrecruzadores heterobifuncionales tal y como se
describe en Wolff et al., Cancer Research, 53:
2560-2565 (1993). Alternativamente, puede diseñarse
un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y podría de ese modo
tener capacidades de lisis por complemento y ADCC potenciadas. Ver
Stevenson et al., Anti-Cancer Drug
Design, 3: 219-230 (1989).
La invención también se refiere a
inmunoconjugados que comprende un anticuerpo conjugado con un agente
citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por
ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano,
fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo
radioactivo (por ejemplo, un radioconjugado).
Más arriba se han descrito agentes
quimioterapéuticos útiles para la generación de tales
inmunoconjugados. Las toxinas activas enzimáticamente y los
fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de
la difteria, fragmentos activos no unidores de la toxina de la
difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina,
la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las
proteínas de Aleurites fordii, la proteína diantina, las
proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y
PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia,
la curcina, la crotina, el inhibidor de Saponaria
officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la
fenomicina, la enomicina, y la tricotecenes. Hay disponibles una
variedad de radionúcleos para la producción de anticuerpos
radioconjugados. Los ejemplos incluyen el ^{212}Bi, ^{131}I,
^{131}In, ^{90}Y, y ^{186}Re. Los conjugados del anticuerpo y
del agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes
bifuncionales acopladores de proteína, tales como el
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)
propionato (SPDP), el iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de
imidoésteres (tales como el dimetiladipimidato HCl), ésteres activos
(tales como el disuccinimidilsuberato), aldehídos (tales como el
glutaraldehído), y compuestos biz-azido (tales como
la bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina),
derivados bis-diazonio (tales como la
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como el
toluen-2,6-diisocianato), y
compuestos de fluor bis-activos (tales como el
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se
describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987).
El ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triamino-pentaacético(MX-DTPA)
marcado con carbono-14 es un agente quelante de
ejemplo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver
WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo podría estar
conjugado a un "receptor" (tal como al estreptoavidina) para
su utilización en el pre-apuntamiento a tumor, en
donde la conjugado anticuerpo-receptor se administra
al paciente, seguido por la retirada del conjugado no unido de la
circulación usando un agente de eliminación, y la administración a
continuación de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que está
conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un
radionucleótido).
Los anticuerpos descubiertos en la presente
invención pueden formularse también como inmunoliposomas. Los
liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en
Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688
(1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA,
77:4030 (1980); y en las patentes estadounidenses nº 4.485.045 y
4.544.545. En la patente estadounidense nº 5.013.556 se descubren
liposomas con tiempo de circulación mejorado.
Pueden generarse liposomas particularmente
útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa,
con una composición que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y
fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG
(PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de
filtros con tamaño de poro definido para obtener liposomas con el
diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente
invención se pueden conjugar con los liposomas tal y como se
describe en Martin et al., J. Biol. Chem.,
257:286-288 (1982) a través de una reacción de
intercambio de disulfuro. Opcionalmente, un agente quimioterapéutico
(tal como la doxorubicina) está contenido dentro del liposoma. Ver
Gabizon et al., J. National Cancer Inst.,
1(19):1484 (1989).
Los anticuerpos que específicamente se unen a un
polipéptido PRO identificado en la presente invención, así como
otras moléculas identificadas por los ensayos de verificación
descritos en la presente invención más arriba, pueden administrarse
para el tratamiento de varios trastornos en forma de composiciones
farmacéuticas.
Si el polipéptido PRO es intracelular y se usan
anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren los
anticuerpos que se internalizan. Sin embargo, también pueden usarse
lipofecciones o liposomas para suministrar el anticuerpo, o un
fragmento de anticuerpo, dentro de las células. Cuando se usan
fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más
pequeño que se une específicamente al dominio unidor de la proteína
diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región
variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas peptídicas
que retienen la capacidad de unirse a la secuencia proteica diana.
Tales péptidos pueden sintetizarse química y/o producirse mediante
tecnología de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:7889-7893 (1993). La formulación en la presente
invención pueden contener también más de un compuesto activo según
sea necesario para la indicación concreta que se esté tratando,
preferiblemente aquéllos con actividades complementarias que no se
afecten negativamente entre ellas. Alternativamente, o además, la
composición podría comprender un agente que potencia su función, tal
como, por ejemplo, un agente citotóxico, una citocina, un agente
quimioterapéutico, o un agente inhibidor del crecimiento. Tales
moléculas están convenientemente presentes en combinación en
cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos pueden atraparse
también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas
de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo,
respectivamente, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de suministro de drogas coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones,
nanopartículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales
técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences,
ver más
arriba.
arriba.
Las formulaciones a usarse para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto puede
conseguirse fácilmente mediante filtración a través de membranas de
filtración estéril.
Pueden prepararse preparaciones de liberación
continua. Los ejemplos de preparaciones de liberación continua
apropiadas incluyen las matrices semipermeables de polímeros
hidrofóbicos sólidos que contiene el anticuerpo, matrices que se
hallan en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continua
incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente
estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros de ácido
L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
el etilenvinilacetato no degradable, los copolímeros degradables de
ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT^{TM}
(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros tales como el etilenvinilacetato y el ácido
láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante
más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante
períodos de tiempo más breves. Cuando los anticuerpos encapsulados
permanecen en el cuerpo durante un período prolongado, pueden
desnaturalizarse o agregarse a resultas de la exposición a humedad a
37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y en posibles
cambios en su inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales
para la estabilización que dependen del mecanismo implicado. Por
ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la
formación de enlaces S-S intermoleculares a través
del intercambio tio-disulfuro, podría conseguirse la
estabilización mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo,
liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el
contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando
composiciones específicas de matriz de polímero.
Los anticuerpos anti-PRO de la
invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, pueden usarse
anticuerpos anti-PRO en ensayos de diagnóstico para
el PRO, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas,
tejidos, o suero. Pueden usarse varias técnicas de ensayo
diagnóstico conocidas en el campo, tales como los ensayos de unión
competitiva, ensayos en sandwich directos o indirectos, y ensayos de
inmunoprecipitación realizados en fases homogéneas o heterogéneas
[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC
Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos
usados en los ensayos de diagnóstico pueden marcarse con un grupo
detectable. El grupo detectable debería ser capaz de producir, bien
directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el
grupo detectable podría ser un radioisótopo, tal como el ^{3}H,
^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente
o quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, la
rodamina, o la luciferina, o un enzima, tal como la fosfatasa
alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de
rábano silvestre. Para la conjugación del anticuerpo al grupo
detectable podría emplearse cualquier procedimiento conocido en la
técnica, incluyendo aquéllos procedimientos descritos por Hunter
et al., Nature, 144:945 (1962); David et al.,
Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol.
Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and
Cytochem., 30:407 (1982).
Los anticuerpos anti-PRo son
útiles también para la purificación mediante afinidad del PRO a
partir del cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales.
En este proceso, los anticuerpos contra el PRO se inmovilizan sobre
un soporte apropiado, tal como la resina Sephadex o el papel de
filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El
anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una muestra
que contiene el PRO a purificar, y luego se lava el soporte con un
solvente apropiado que retirará sustancialmente todo el material en
la muestra excepto el PRO, el cual está unido al anticuerpo
inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente
apropiado que liberará el PRO del anticuerpo.
Los ejemplos siguientes se ofrecen sólo con
propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el ámbito de
la presente invención en modo alguno.
Los reactivos disponibles comercialmente
mencionados en los ejemplos se usaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La
fuente de aquellas células identificadas en los ejemplos
siguientes, y a lo largo de la memoria, mediante números de acceso
de la ATCC, es la American Type Culture Collection, Manassas,
Va.
Las secuencias del dominio extracelular (ECD)
(incluyendo la secuencia de señal de secreción, si había alguna) de
aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de
datos pública Swiss-Prot se usaron para buscar las
bases de datos de EST. Las bases de datos de EST incluyen bases de
datos públicas (por ejemplo, Dayhoff, GenBank) y bases de datos de
propiedad (por ejemplo, LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo
Alto, Ca). La búsqueda se realizó usando el programa de ordenador
BLAST o BLAST-2 (Altschul et al., Methods
in Enzymology, 266:460-480 (1996)) como una
comparación de las secuencia de proteína de ECD con una traducción
en 6 pautas de las secuencias de la EST. Aquéllas comparaciones con
una puntuación de 70 (o en algunos casos de 90) o superior que no
codifican proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en
secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil
Green, University of Washington, Seattle, Wa).
Usando esta pantalla de homología de dominio
extracelular, se ensamblaron secuencias de ADN consenso en relación
a las otras secuencias de la EST identificadas usando phrap. Además,
las secuencias de ADN consenso obtenidas a menudo (pero no siempre)
se extendieron usando ciclos repetidos de BLAST o
BLAST-2 y phrap para extender la secuencia consenso
tan lejos como fuera posible usando las fuentes de secuencias de EST
discutidas más arriba.
En base a las secuencias consenso obtenidas tal
y como se ha descrito más arriba, se sintetizaron a continuación
oligonucleótidos y se usaron para identificar mediante PCR una
biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y para su
uso como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de
longitud completa para un polipéptido PRO. Los cebadores hacia
adelante y hacia atrás generalmente oscilan desde 20 hasta 30
nucleótidos, y a menudo se diseñan para proporcionar un producto de
PCR de aproximadamente 100-1000 p.b. de longitud.
Las secuencias sonda típicamente son de 40-50 p.b.
de longitud. En algunos casos, se sintetizaron oligonucleótidos
adicionales cuando la secuencia consenso es mayor de aproximadamente
1-1,5 k.p.b. Con objeto de examinar varias
bibliotecas en busca de un clon de longitud completa, el ADN de las
bibliotecas se examinó mediante amplificación con PCR, siguiendo el
consejo de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, con el par de cebadores de PCR. A continuación se usó
una biblioteca positiva para aislar clones que codifican el gen de
interés usando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de
cebadores.
Las bibliotecas de ADNc usadas para aislar los
clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándares
usando reactivos disponibles comercialmente, tales como los de
Invitrogen, San Diego, Ca. El ADNc se cebó con
oligo-dT que contenía un sitio NotI, unido con
extremos romos a adaptadores "hemiquinasados" de SalI,
cortados con NotI, calibrados apropiadamente mediante electroforesis
en gel, y clonados en una orientación definida dentro de un vector
de clonación apropiado (tal como el pRKB o pRKD; el pRK5B es un
precursor del pRKSD que no contiene el sitio SfiI; ver, Holmes
et al., Science, 253:1278-1280 (1991))
en los únicos sitios XhoI y NotI.
Ejemplos
2
Se aisló ARNm a partir de un tejido humano de
interés usando reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, Ca.
(Fast Track 2). Este ARN se usó para generar una biblioteca de ADNc
cebada con oligo-dT en el vector pRK5D usando
reactivos y protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, Md.
(Super Script Plasmid System). En este procedimiento, el ADNc de
doble hebra se ajustó en tamaño a más de 1000 p.b. y el ADNc
enlazado con SalI/NotI se clonó en el vector cortado con XhoI/NotI.
El pRK5D es un vector de clonación que tiene un sitio de inicio de
la transcripción sp6 seguido por un sitio de enzima de restricción
SfiI que precede los sitios de clonación XhoI/NotI del ADNc.
Se generó una segunda biblioteca de ADNc con
objeto de representar preferentemente los extremos 5' de los clones
primarios de ADNc. El ARN de sp6 se generó a partir de la biblioteca
primaria (descrita más arriba), y este ARN se usó para generar una
biblioteca de ADNc cebada aleatoriamente en el vector
pSST-AMY.0 usando reactivos y protocolos de Life
Technologies (Super Script Plasmid System, mencionado más arriba).
En este procedimiento el ADNc de doble hebra se ajustó en tamaño a
500-1000 p.b., se enlazó con adaptadores de romo a
NotI, se cortó con SfiI, y se clonó en el vector cortado con
SfiI/NotI. El pSST-AMY.0 es un vector de clonación
que tiene un promotor de la deshidrogenasa de alcohol precediendo
los sitios de clonación del ADNc y la secuencia de la amilasa de
ratón (la secuencia madura sin la señal de secreción), seguido por
el terminador de la deshidrogenasa de alcohol de levadura, después
de los sitios de clonación. Por tanto, los ADNc clonados en este
vector que están fusionados en pauta con la secuencia de la amilasa
conducirán a la secreción de la amilasa desde colonias de levadura
apropiadamente transfectadas.
El ADN de la biblioteca descrita en el parágrafo
2 anterior se congeló sobre hielo al cual se le añadió la bacteria
DHIOB electrocompetente (Life Technologies, 20 ml). La mezcla de
bacteria y vector se electroporó entonces según recomienda el
fabricante. De forma subsiguiente, se añadió medio SOC (Life
Technologies, 1 ml) y se incubó la mezcla a 37ºC durante 30
minutos. Los transformantes se sembraron entonces sobre 20 placas
LB estándares de 150 mm que contenían ampicilina, y se incubaron
durante 16 horas (37ºC). Las colonias positivas se rascaron de las
placas y se aisló el ADN del precipitado bacteriano usando
protocolos estándares, por ejemplo, el gradiente en CsCl. El ADN
purificado se usó entonces en los protocolos de levaduras
siguientes.
Los procedimientos de levaduras se dividieron en
tres categorías: (1) transformación de levadura con el vector de
plásmido/ADNc combinado; (2) detección y aislamiento de clones de
levadura que secretan amilasa; y (3) amplificación mediante PCR del
inserto directamente de la colonia de levaduras y purificación del
ADN para su secuenciación y análisis ulterior.
La cepa de levadura usada fue la
HD56-5A (ATCC-90785). Esta cepa
tiene el siguiente genotipo: MAT alfa, ura3-52,
leu2-3, leu2-112,
his3-11, his3-15, MAL^{+},
SUC^{+}, GAL^{+}. Preferiblemente, pueden emplearse mutantes de
levadura que tienen vías post-traducción
deficientes. Tales mutantes pueden tener alelos de translocación
deficientes en sec71, sec72, sec62, siendo el sec7l truncado el más
preferido. Alternativamente, también pueden emplearse
preferiblemente antagonistas (incluyendo nucleótidos antisentido y/o
ligandos) que interfieren con la operación normal de estos genes,
otras proteínas implicadas en esta vía
post-traducción (por ejemplo, SEC61p, SEC72p,
SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p), o la formación de
complejo de estas proteínas, en combinación con la levadura que
expresa amilasa.
La transformación se realizó en base al
protocolo esbozado por Gietz et al., Nucl. Acid. Res.,
20:1425 (1992). Las células transformadas se inocularon a
continuación desde agar en caldo del medio complejo YEPD (100 ml)
y se cultivaron durante la noche a 30ºC. El caldo YEPD se preparó
según se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast
Genetics. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p.
207 (1994). El cultivo de la noche se diluyó entonces hasta
aproximadamente 2 x 10^{6} células/ml (aproximadamente OD_{600}
= 0,1) en medio YEPD recién preparado (500 ml) y se dejaron crecer
de nuevo hasta 1 x 10^{7} células/ml (aproximadamente OD_{600} =
0,4-0,5).
Las células se recolectaron entonces y se
prepararon para la transformación mediante transferencia al
interior de botellas de rotor GS3 en un rotor GS3 de Sorval a 5.000
r.p.m. durante 5 minutos. Se descartó el sobrenadante, y a
continuación se resuspendió en agua estéril, y se centrifugó de
nuevo en tubos falcon de 50 ml a 3.500 r.p.m. en una centrífuga
GS-6KR de Beckman. Se descartó el sobrenadante y las
células se lavaron a continuación con LiAc/TE (10 ml,
Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5,
Li_{2}OOCCH_{3} 100 mM), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5
ml).
La transformación tuvo lugar mezclando las
células preparadas (100 \mul) con ADN fresco, desnaturalizado, de
hebra única, de esperma de salmón (Lofstrand Labs, Gaithersburg,
Md.) y ADN transformante (1 \mug, vol. < 10 \mul) en tubos de
microfuga. Se agitó la mezcla brevemente con un rotor vórtex, a
continuación se le añadió un 40% de PEG/TE (600 \mul, 40%
polyethylene glycol-4000, Tris-HCl
10 mM, EDTA 1 mM, Li_{2}OOCCH_{3} 100 mM, pH 7,5). Esta mezcla
se agitó suavemente y se incubó a 30ºC con agitación durante 30
minutos. A continuación, se sometieron las células choque térmico
de 42ºC durante 15 minutos, y el recipiente de reacción se
centrifugó en una microfuga a 12.000 r.p.m. durante
5-10 segundos, se decantó y se resuspendió en TE
(500 \mul, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5),
seguida por re-centrifugación. Las células se
diluyeron entonces en TE (1 ml) y se extendieron alícuotas (200
\mul) sobre el medio selectivo preparado previamente en placas de
cultivo (VWR) de 150 mm.
Alternativamente, en vez de múltiples pequeñas
reacciones, la transformación se realizó usando una única reacción
a gran escala, en donde las cantidades de reactivo se escalaron de
forma acorde.
El medio selectivo usado fue un agar de dextrosa
completo que carecía de uracilo (SCD-Ura), preparado
tal y como se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast
Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p.
208-210 (1994). Los transformantes se cultivaron a
30ºC durante 2-3 días.
La detección de colonias secretoras de amilasa
se realizó incluyendo almidón rojo en el medio de cultivo
selectivo. El almidón estaba acoplado al colorante rojo (Reactive
Red-120, Sigma) de acuerdo con el procedimiento
descrito por Biely et al., Anal. Biochem.,
172:176-179 (1988). El almidón acoplado se incorporó
en las placas de agar SCD-Ura en una concentración
final del 0,15% (p/v), y se tamponó con fosfato potásico hasta un pH
de 7,0 (50-100 mM de concentración final).
Las colonias positivas se recolectaron y se
extendieron a lo largo de medio selectivo reciente (sobre placas de
150 mm) con objeto de obtener colonias únicas bien aisladas e
identificables. Las colonias bien aisladas que eran positivas para
la secreción de la amilasa se detectaron mediante la incorporación
directa de almidón rojo en el agar de SCD-Ura
tamponado. Las colonias positivas se determinaron por su capacidad
para romper el almidón, lo que resultaba en un halo claro alrededor
de la colonia positiva que podía visualizarse directamente.
Cuando se aislaba una colonia positiva, una
porción de ésta se recogía mediante un palillo y se diluía en agua
estéril (30 \mul) en una placa de 96 pocillos. En ese momento, las
colonias positivas o se congelaban y almacenaban para su
subsiguiente análisis, o se amplificaban inmediatamente. Una
alícuota de células (5 \mul) se usó como plantilla para la
reacción de la PCR en un volumen de 25 \mul que contenía: 0,5
\mul Klentaq (Clontech, Palo Alto, Calif.); 4,0 \mul dNTP 10 mM
(Perkin Elmer-Cetus); 2,5 \mul de tampón Kentaq
(Clontech); 0,25 \mul del oligo hacia adelante 1; 0,25 \mul del
oligo hacia atrás 2; 12,5 \mul de agua destilada. La secuencia del
oligonucleótido hacia adelante 1 fue:
La secuencia del oligonucleótido hacia atrás 2
fue:
\newpage
La PCR se realizó entonces como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
| a. | Desnaturalización | 92ºC | 5 minutos |
| b. 3 ciclos de | desnaturalización | 92ºC | 30 segundos |
| emparejamiento | 59ºC | 30 segundos | |
| extensión | 72ºC | 60 segundos | |
| c. 3 ciclos de | desnaturalización | 92ºC | 30 segundos |
| emparejamiento | 57ºC | 30 segundos | |
| extensión | 72ºC | 60 segundos | |
| d. 25 ciclos de | desnaturalización | 92ºC | 30 segundos |
| emparejamiento | 55ºC | 30 segundos | |
| extensión | 72ºC | 60 segundos | |
| e. | pausa | 4ºC |
Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos
se emparejaban respectivamente con la región promotora de la ADN y
la región amilasa, y amplificaban una región de 307 p.b. del vector
pSST-AMY.0 cuando no había inserto alguno presente.
Típicamente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5' de estos
oligonucleótidos contenían sitios de hibridación para los cebadores
de secuenciación. Así pues, el producto total de la reacción de la
PCR de un vector vacío tenía 343 p.b. Sin embargo, el ADNc fusionado
con la secuencia señal resultó en secuencias de nucleótidos
considerablemente más largas.
A continuación de la PCR, se examinó una
alícuota de la reacción (5 \mul) mediante electroforesis en gel
de agarosa, en un gel de agarosa al 1%, usando un sistema de
tamponado Tris-Borato-EDTA (TBE) tal
y como se describe en Sambrook et al., ver más arriba. Los
clones que resultaban en un producto de la PCR intenso y único,
mayor de 400 p.b. se analizaron además mediante secuenciación del
ADN después de su purificación con una columna 96 Qiaquick de
limpieza de la PCR (Qiagen Inc., Chatsworth, Calif.).
Se identificaron varias secuencias de ácido
nucleico que codificaban polipéptidos mediante la aplicación de un
algoritmo propietario de hallazgo de secuencias señal desarrollado
por Genentech, Inc. (South San Francisco, Ca.) a partir de la EST
así como a partir de fragmentos de la EST agrupados y ensamblados
procedentes de bases de datos públicas (por ejemplo, GenBank) y/o
de bases de datos privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc.,
Palo Alto, Ca.). El algoritmo de secuencia de señal computa una
puntuación de señal de secreción en base al carácter de los
nucleótidos del ADN que rodean el primer, y opcionalmente el
segundo, codón de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia
o fragmento de secuencia considerado. Los nucleótidos que siguen la
primer ATG deben codificar al menos 35 aminoácidos inequívocos sin
ningún codón de detención. Si el primer ATG tiene los aminoácidos
requeridos, no se examina el segundo. Si ninguno cumple los
requisitos, la secuencia candidata no se puntúa. Con objeto de
determinar si la secuencia de EST contiene una secuencia de señal
auténtica, las secuencias de ADN y la correspondiente de
aminoácidos que rodean el codón ATG se puntúan usando un conjunto
de siete sensores (parámetros de evaluación) que se sabe están
asociados con las señales de secreción. El uso de este algoritmo
resultó en la identificación de numerosas secuencias de ácido
nucleico que codifican polipéptidos.
El uso del algoritmo de secuencias señal
descrito en el Ejemplo 3 anterior permitió la identificación de una
única secuencia EST de Incyte, denominada en la presente invención
como secuencia nº 43.715 del grupo EST de Incyte. Esta secuencia
EST se comparó con una variedad de bases de datos de EST, las cuales
incluyen bases de datos de EST públicas (por ejemplo, GenBank) y
una base de datos de ADN de EST propietaria (Lifeseq®, Incyte
Pharmaceuticals, Palo Alto, Ca.) para identificar las homologías
existentes. La búsqueda de homología se realizó usando el programa
de ordenador BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in
Enzymology, 266:460-480 (1996)). Aquellas
comparaciones que resultaban en una puntuación de BLAST de 70 (o en
algunos casos de 90) o superior que no codificaban proteínas
conocidas se agruparon y ensamblaron en una secuencia ADN consenso
con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington,
Seattle, WA). La secuencia consenso obtenida de las mismas se
denomina en la presente invención DNA56009.
A la luz de una homología de secuencia observada
entre la secuencia DNA56009 y la secuencia EST de Merck nº
AA024389, se obtuvo y secuenció el clon AA024389 de EST de Merck. La
secuencia, denominada DNA57700-1408 (SEC. Nº ID.:
1) se muestra en la Figura 1. Es la secuencia de ADN de longitud
completa para el PRO982.
El clon de longitud completa mostrado en la
Figura 1 contiene una única pauta de lectura abierta, con un sitio
aparente de inicio de la traducción en las posiciones de nucleótido
26-28, y finalizando en el codón de detención que
se halla en las posiciones de nucleótido 401-403
(SEC. Nº ID.: 1). El precursor de polipéptido predicho tiene 125
aminoácidos de longitud, y tiene un peso molecular estimado de
aproximadamente 14.198 daltones, y un pI estimado de
aproximadamente 9,01. El análisis de la secuencia PRO982 de longitud
completa mostrada en la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 2) evidencia la
presencia de un péptido señal desde aproximadamente el aminoácido 1
hasta aproximadamente el aminoácido 21, y un potencial dominio de
anafilatoxina desde aproximadamente el aminoácido 50 hasta
aproximadamente el aminoácido 59. Un análisis de la base de datos
Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35) evidenció la homología entre
la secuencia de aminoácidos de PRO982 y las siguientes secuencias
de Dayhoff: RNTMDCV_1; A48151; WAP_RAT; S24596; A53640; MT4_HUMAN;
U93486_1; SYNBILGFG-1; P_R49917; y P_R41880. El
clon DNA57700-1408 se ha depositado en la ATCC el 12
de enero de 1999 y se le ha asignado el nº de depósito de ATCC
203583.
Este ensayo muestra que el polipéptido de la
invención actúa como un potente mitógeno para las células de
soporte del oído interno, las cuales son progenitoras de las células
del órgano de Corti y, por tanto, es útil para inducir la
regeneración de las células del órgano de Corti y para tratar la
pérdida auditiva en los mamíferos. El ensayo se realizó como sigue.
Se alicuotaron células epiteliales utriculares UEC-4
de rata en placas de 96 pocillos con una densidad de 3000
células/pocillo en 200 \mul de medio que contenía suero, a 33ºC.
Las células se cultivan durante la noche y a continuación se cambian
a un medio sin suero a 37ºC. Entonces se añaden varias diluciones
de los polipéptidos PRO (o nada para un control) a los cultivos y
se incuban las células durante 24 horas. Transcurridas las 24 horas
de incubación, se añade ^{3}H-timidina (1
\muCi/pocillo), y las células se cultivan a continuación durante
24 horas adicionales. Los cultivos se lavan entonces para eliminar
la marca radiactiva no incorporada, se recolectan las células, y se
determinan las c.p.m. por pocillo. Un c.p.m. de al menos el 30% o
superior en los cultivos tratados con el polipéptido PRO, en
comparación con los cultivos de control, se considera un positivo en
el ensayo.
El siguiente polipéptido dio positivo en este
ensayo: PRO982.
Este ensayo muestra que el polipéptido de la
invención actúa para inducir la proliferación de células
fibroblastos de mamífero en cultivo y, por tanto, funciona como un
factor de crecimiento útil en los sistemas de mamíferos. El ensayo
se realizó como sigue. Se sembraron células fibroblastos
BHK-21 en un medio de cultivo estándar a 2500
células/pocillo, en un volumen total de 100 \mul. El polipéptido
PRO, el \beta-FGF (control positivo) o nada
(control negativo) se añaden a continuación a los pocillos en
presencia de 1 \mug/ml de heparina, para un volumen total de 200
\mul. A continuación se cultivan las células a 37ºC durante de 6
a 7 días. Después de la incubación, se elimina el medio, se lavan
las células con PBS, y a continuación se añade una mezcla de
reacción de sustrato de la fosfatasa ácida (100 \mul/pocillo).
Entonces se incuban las células a 37ºC durante 2 horas. A
continuación se añaden 10 \mul por pocillo de NaOH 1 N para
detener la reacción de la fosfatasa ácida. Las placas se leen
entonces a una OD 405 nm. Una actividad fosfatasa ácida que es
superior en al menos el 50% respecto el control negativo es un
positivo en el ensayo.
El siguiente polipéptido dio positivo en este
ensayo: PRO982.
El procedimiento siguiente describe el uso de
una secuencia de nucleótidos que codifica el PRO como una sonda de
hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante de
longitud completa o madura del PRO, según se describe en la
presente invención, se emplea como una sonda para examinar en busca
de ADN homólogos (tales como aquéllos que codifican las variantes
del PRO que ocurren de forma natural) en bibliotecas de ADNc de
tejido humano o en bibliotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y lavado de los filtros que
contenían cualquiera de las bibliotecas de ADN se realizó en las
siguientes condiciones de elevada rigurosidad. La hibridación de la
sonda marcada radiactivamente derivada del PRO sobre los filtros se
realizó en una solución de formamida al 50%, 5x SSC, SDS al 0,1%,
pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2x de
solución de Denhardt, y dextrano sulfato al 10%, a 42ºC durante 20
horas. El lavado de los filtros se realiza eun una solución acuosa
de 0,1x SSC y SDS al 0,1%, a 42ºC.
\newpage
Los ADN que tienen una identidad de secuencia
deseada con la secuencia nativa de ADN codificante, de longitud
completa, pueden entonces identificarse usando técnicas estándares
conocidas en el campo.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de PRO mediante expresión recombinante en E.
coli.
La secuencia de ADN que codifica el PRO se
amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los
cebadores deberían contener sitios para enzimas de restricción que
se correspondan con los sitios para enzimas de restricción en el
vector de expresión seleccionado. Pueden emplearse una variedad de
vectores de expresión. Un ejemplo de un vector apropiados es el
pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al.,
Gene, 2:95 (1977)) el cual contiene genes para la resistencia
a la ampicilina y tetraciclina. El vector se digiero con enzima de
restricción y se desfosforila. La secuencias amplificadas mediante
la CPR se ligan a continuación en el vector. El vector incluirá
preferiblemente secuencias que codifican un gen de resistencia a
antibiótico, un promotor de trp, un líder de polihis (incluyendo
los primeros seis codones de la STII, la secuencia polihis, y el
sitio de corte para la enteroquinasa), la región codificante del
PRO, el terminador de la transcripción lambda, y un gen argU.
A continuación se usa la mezcla de ligación para
transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los
procedimientos descritos en Sambrook et al., ver más arriba.
Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer
sobre placas LB y a continuación se seleccionan las colonias
resistentes al antibiótico. El ADN del plásmido puede aislarse y
confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación del
ADN.
Los clones seleccionados pueden dejarse crecer
durante la noche en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB
suplementado con antibióticos. El cultivo nocturno podría de forma
subsiguiente usarse para inocular un cultivo a mayor escala. Las
células se dejan crecer entonces hasta una densidad óptica deseada,
durante lo cual la expresión del promotor está activada.
Después de cultivar las células durante varias
horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación.
El precipitado de células obtenido mediante la centrifugación puede
solubilizarse usando varios agentes conocidos en la técnica, y la
proteína PRO solubilizada puede entonces purificarse usando una
columna quelante de metales en condiciones que permiten la unión
intensa de la proteína.
La PRO podría expresarse en E. coli en
una forma marcada con poli-His, usando el siguiente
procedimiento. El ADN que codifica la PRO se amplifica inicialmente
usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán
sitios para enzimas de restricción que se corresponden con los
sitios para enzimas de restricción sobre el vector de expresión
seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio
de la traducción eficiente y fiable, la purificación rápida en una
columna de quelación de metales, y la extracción proteolítica con
enteroquinasa. Las secuencias marcadas con poli-His,
amplificadas mediante la PCR, se ligan a continuación en un vector
de expresión, el cual se usa para transformar un huésped E.
coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE
rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes se
cultivan primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina, a
30ºC, con agitación, hasta que se alcanza una O.D. 600 de
3-5. Entonces, los cultivos se diluyen
50-100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57
g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato
sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de
levadura de Difco, 5,36 g de SF HyCase de Sheffield en 500 ml de
agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, 0,55% (p/v) de glucosa, y
MgSO_{4} 7 mM) y se hacen crecer durante aproximadamente
20-30 horas a 30ºC con agitación. Se retiran
muestras para verificar la expresión mediante análisis con
SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga
para precipitar las células. Los precipitados de células se
congelan hasta su purificación y plegado de nuevo.
La pasta de E. coli procedente de
fermentaciones de 0,5 a 1 l (6-10 g de precipitados)
se resuspende en 10 volúmenes (p/v) en tampón guanidina 7 M, Tris
20 mM, pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato sódico
para conseguir respectivamente una concentración final de 0,1 M y
0,02 M, y la solución se agita durante la noche a 4ºC. Este paso
resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos
cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se
centrifuga a 40.000 r.p.m. en una ultracentrífuga Beckman durante
30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3-5
volúmenes de tampón de columna quelante de metal (guanidina 6 M,
Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22
micrómetros para clarificarlo. El extracto clarificado se carga
sobre 5 ml de columna quelante de metal Qiagen
Ni-NTA equilibrada en el tampón de columna quelante
de metal. Se lava la columna con tampón adicional que contiene
imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se
eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que
contienen la proteína deseada se juntan y almacenan a 4ºC. La
concentración de proteína se estima por su absorbancia a 280 nm
usando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia
de aminoácidos.
Las proteínas se pliegan de nuevo diluyendo la
muestra lentamente en tampón de replegado recién preparado
consistente en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína
5 mM, glicina 20 mM, y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se
escogen de forma que la concentración final de proteína esté entre
50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado se agita
suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de
replegado se detiene mediante la adición de TFA hasta una
concentración final del 0,4% (aproximadamente pH 3). Antes de la
purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a
través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añade acetonitrilo
hasta una concentración final del 2-10%. La proteína
replegada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros
RI/H usando un tampón móvil de 0,1% de TFA, con elución con un
gradiente de acetonitrilo desde el 10% hasta el 80%. Las alícuotas
de fracciones con absorbancia A280 se analizan en geles de
poliacrilamida y SDS, y las fracciones que contienen proteína
replegada homogénea se juntan. Generalmente, las especies
correctamente replegadas de la mayoría de las proteínas eluyen con
las concentraciones más bajas de acetonitrilo, puesto que esas
especies son las más compactas, con sus interiores hidrofóbicos
apantallados de la interacción con la resina de fase reversa. Las
especies agregadas usualmente se eluyen a concentraciones de
acetonitrilo más elevadas. Además de distinguir las formas mal
plegadas de proteínas de la forma deseada, el paso de fase inversa
también retira la endotoxina de las
muestras.
muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido PRO
plegado deseado se juntan, y el acetonitrilo se retira usando una
débil corriente de nitrógeno dirigida hacia la solución. Las
proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8, con cloruro sódico
0,14 M y 4% de manitol, mediante diálisis o filtración en gel usando
resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de
formulación y esterilizadas mediante filtración.
Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en
EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la
cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal y
como se ha descrito más arriba.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
de PRO, potencialmente glicosilada, mediante expresión en células de
mamífero.
El vector pRK5 (ver EP 307.247, publicada el 15
de marzo de 1989), se emplea como vector de expresión.
Opcionalmente, el ADN del PRO se liga en el pRK5 con enzimas de
restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN del
PRO usando procedimientos de ligación tales como los descritos en
Sambrook et al., ver más arriba. El vector resultante se
denomina pRK5-PRO.
En una realización, las células huéspedes
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se hacen crecer hasta confluencia en placas de cultivo de
tejidos, en un medio tal como el DMEM suplementado con suero fetal
bovino y, opcionalmente, con componentes nutrientes y/o
antibióticos. Aproximadamente 10 \mug de ADN de
pRK5-PRO DNA se mezclan con aproximadamente 1 \mug
de ADN que codifica el gen VA RNA [Thimmappaya et al.,
Cell, 31:543 (1982)], y se disuelven en 500 \mul de
Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A
esta mezcla se le añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH
7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1.5 mM, y se deja que se forme un
precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y
añade a las células 293, y se deja reposar durante aproximadamente
cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml
de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación se
lavan las células 293 con medio libre de suero, se añade medio
reciente, y se incuban las células durante aproximadamente 5
días.
Aproximadamente 24 horas después de la
transfección, el medio de cultivo se retira y remplaza con medio de
cultivo (solo) o con medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de
^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de
^{35}S-metionina. Después de una incubación de 12
horas, se recolecta el medio acondicionado, se concentra sobre un
filtro giratorio, y se carga sobre un gel con un 15% de SDS. El gel
procesado pueden secarse y exponerse a una película durante un
período de tiempo seleccionado para revelar la presencia polipéptido
PRO. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden
experimentar una incubación adicional (en medio libre de suero) y el
medio se ensaya en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el PRO podría
introducirse transitoriamente en células 293 usando el procedimiento
del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Se cultivan células 293 hasta
la máxima densidad en un frasco rotatorio y se añaden 700 \mug de
ADN de pRK5-PRO. Las células se concentran primero
a partir del frasco rotatorio mediante centrifugación y se lavan con
PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba sobre
el precipitado de células durante cuatro horas. Las células se
tratan con 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con medio
de cultivo de células, y se introducen de nuevo en el frasco
rotatorio que contiene medio de cultivo de células, 5 \mug/ml de
insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de
aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y
filtra para retirar las células y los desechos. La muestra que
contiene el PRO expresado puede entonces concentrarse y purificarse
mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis
y/o cromatografía en columna.
En otra realización, el PRO puede expresarse en
células CHO. El pRK5-PRO puede transferirse dentro
de células CHO usando reactivos conocidos tales como el CaPI_{4} o
el DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito más
arriba, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio
sustituirse con medio de cultivo (solo) o con medio que contiene
una marca radiactiva tal como la ^{35}S-metionina.
Después de determinar la presencia de polipéptido PRO, el medio de
cultivo podría remplazarse con medio libre de suero.
Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6
días, y a continuación se recolecta el medio acondicionado. El
medio que contiene el PRO expresado puede entonces concentrarse y
purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO marcado con epítopo también podría
expresarse en células CHO huéspedes. El PRO podría subclonarse fuera
del vector pRK5. El inserto del subclon puede experimentar PCR para
fusionarlo en pauta con una marca de epítopo seleccionada, tal como
una marca poli-his en un vector de expresión
Baculovirus. El inserto de PRO marcado con poli-his
puede subclonarse a continuación en un vector dirigido por el SV40,
el cual contiene un marcador de selección, tal como el DHFR, para la
selección de clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden
transfectar (tal y como se describió más arriba) con el vector
dirigido por SV40. El marcado podría realizarse, tal y como se ha
descrito más arriba, para verificar la expresión. El medio de
cultivo que contiene el PRO marcado con poli-His y
expresado puede entonces concentrarse y purificarse mediante
cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante
cromatografía de afinidad Ni^{2+}-quelado.
El PRO podría expresarse también en células CHO
y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria, o en
células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza
usando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresan como
una construcción de IgG (inmunoadhesina) en la que las secuencias
codificantes de las formas solubles (por ejemplo, dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas están fusionadas a una
secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, los
dominios CH2 y CH2, y/o es una forma marcada con
poli-His.
A continuación de la amplificación mediante PCR,
los ADN respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO
usando técnicas estándares, tal y como se describe en Ausubel et
al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16,
John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión en CHO se
construyen para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3'
respecto el ADN de interés para permitir la transferencia
conveniente de ADNc. El vector usado para la expresión en células
CHO es como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids
Res., 24:9 (1774-1779 (1996), y usa el
promotor/potenciador temprano del SV40 para dirigir la expresión
del ADNc de interés y de la reductasa de dihidrofolato (DHFR). La
expresión de la DHFR permite la selección para el mantenimiento
estable del plásmido a continuación de la transfección.
Doce microgramos del ADN de plásmido deseado se
introducen en aproximadamente 10 millones de células CHO usando los
reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfecto
(Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se
cultivan como se describe en Lucas et al., ver más arriba.
Aproximadamente 3 x 10^{7} células se congelan en una ampolla
para cultivo y producción adicional tal y como se describe más
abajo.
Las ampollas que contienen el ADN del plásmido
se descongelan colocándolas en un baño de agua y se mezcla mediante
agitación con vórtice. Los contenidos se pipetean dentro de un tubo
de centrífuga que contiene 10 ml de medio y se centrifugan a 1000
r.p.m. durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se
resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a través de
0,2 \mum, con 5% de suero fetal bovino filtrado a través de 0,2
\mum). A continuación, las células se reparten en un frasco
rotatorio de 100 ml que contiene 90 ml de medio selectivo. Después
de 1-2 días, las células se transfieren a un frasco
rotatorio de 250 ml lleno con 150 ml de medio de cultivo selectivo,
y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se
sembraron frascos rotatorios de 250 ml, 500 ml y 2000 ml con 3 x
10^{5} células/ml. El medio de las células se cambia con medio
fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de
producción. Aunque podría emplearse cualquier medio para CHO
apropiado, en realidad podría emplearse un medio de producción
descrito en la patente estadounidense nº 5.122.469, concedida el 16
de junio de 1992. Un frasco rotatorio de producción de 3 l se
siembra a 1,2 x 10^{6} células/ml. El día 0, el número de células
está determinado. El día 1 se muestrea el frasco rotatorio y se
inicia la aspersión con aire filtrado. El día 2, se muestrea el
frasco rotatorio, la temperatura se cambia hasta 33ºC, y se toman 30
mL de glucosa a 500 g/l y 0,6 mL de antiespumante al 10% (por
ejemplo, una emulsión al 35% de polidimetilsiloxano, Dow Corning
365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de la producción, el pH se
ajusta según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Después
de 10 días, o hasta que la visibilidad desciende por debajo del
70%, el cultivo de células se recolecta mediante centrifugación y
filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado, o se
almacena a 4ºC o se carga inmediatamente sobre columnas para su
purificación.
Para las construcciones marcadas con
poli-His, las proteínas se purificaron usando una
columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación,
se añade imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de
5 mM. El medio acondicionado se bombea sobre una columna de 6 ml de
Ni-NTA equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón
que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de
4-5 ml/minutos a 4ºC. Después de cargarla, la
columna se lava con tampón de equilibrio adicional y la proteína se
eluye con tampón de equilibrio que contiene imidazol 0,25 M. La
proteína altamente purificada se desala de forma subsiguiente en un
tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y un
4% de manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine
(Pharmacia) y se almacena a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purifican a partir del medio condicionado como
sigue. El medio condicionado se bombea sobre una columna de 5 ml de
Proteína A (Pharmacia), la cual se ha equilibrado en tampón fosfato
sódico 20 mM, pH 6,8. Después de cargarla, la columna se lava
extensivamente con tampón de equilibrio antes de la elución con
ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen
275 \muL de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente
purificada se desala de forma subsiguiente en tampón de
almacenamiento tal y como se ha descrito más arriba para las
proteínas marcadas con poli-His. La homogeneidad se
verifica mediante geles de poliacrilamida-SDS y
mediante secuenciación de aminoácidos N-terminal
usando la degradación de Edman.
Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en
EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la
cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal y
como se ha descrito más arriba.
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de PRO en levaduras.
Primero, se construyen vectores de expresión en
levadura para la producción intracelular o secreción del PRO a
partir del promotor de ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el PRO y el
promotor se inserta en sitios de enzimas de restricción apropiados
en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular
del PRO. Para la secreción, el ADN que codifica el PRO puede
clonarse en el plásmido seleccionado, junto con ADN que codifica el
promotor de ADH2/GAPDH, un péptido señal del PRO nativo u otro
péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, un factor alfa de
levadura o una secuencia señal/líder secretora de invertasa, y
secuencias de eslabones (si se precisan) para la expresión del
PRO.
Las células de levadura, tales como la cepa
AB110 de levadura, pueden entonces transformarse con los plásmidos
de expresión descritos más arriba y cultivarse en medios de
fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura
transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y separación mediante
SDS-PAGE, seguida por tinción de los geles con
colorante azul de Coomassie.
El PRO recombinante puede a continuación
aislarse y purificarse retirando las células de levadura del medio
de fermentación mediante centrifugación, y concentrando entonces el
medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que
contiene el PRO podría purificarse adicionalmente usando resinas de
cromatografía en columna seleccionadas.
Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en
EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la
cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal y
como se ha descrito más arriba.
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante del PRO en células de insecto infectadas con
baculovirus.
La secuencia que codifica el PRO se fusiona
cadena arriba de una marca de epítopo contenida dentro de un vector
de expresión en baculovirus. Tales marcas de epítopo incluyen las
marcas poli-His y las marcas de inmunoglobulina
(como las regiones Fc de IgG). Pueden emplearse una variedad de
plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos
disponibles comercialmente, tales como el pVL1393 (Novagen). En
resumen, la secuencia que codifica el PRO o la porción deseada de
la secuencia codificante del PRO, tal como la secuencia que
codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la
secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es
extracelular, se amplifica mediante la PCR con cebadores
complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador 5' podría
incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados)
flanqueadores. El producto se digiere a continuación con esos
enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de
expresión.
El baculovirus recombinante se genera
co-transfectando el plásmido anterior y el ADN de
virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina
(disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después
de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus
liberados se recolectan y usan para amplificaciones adicionales. La
infección viral y la expresión de la proteína se realizan como
describieron O'Reilley et al., Baculovirus expression
vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press
(1994).
El PRO marcado con poli-His
expresado puede entonces purificarse, por ejemplo, mediante
cromatografía de afinidad Ni^{2+}-quelato como
sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9 infectadas
con virus recombinante tal como describieron Rupert et al.,
Nature, 362:175-179 (1993). En resumen, se lavan
las células Sf9, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de
Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol;
0,1% de NP-40; KCl 0,4 M), y se sonican dos veces
durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se clarifican
mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en
tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH
7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara
una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (disponible
comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava
con 25 ml de agua, y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El
extracto de células filtrado se carga sobre la columna a 0,5 ml por
minuto. Se lava la columna con tampón de carga hasta una A_{280}
de línea base, momento en el que se inicia la recogida de
fracciones. A continuación, se lava la columna con un segundo tampón
de lavado (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; 10% de glicerol, pH 6,0), el
cual eluye la proteína unida no específicamente. Después de alcanzar
de nuevo la línea base de A_{280}, se revela la columna con un
gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el segundo tampón de lavado.
Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante
SDS-PAGE y tinción con plata, o transferencia
Western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa
alcalina (Qiagen).
Las fracciones que contienen el PRO marcado con His_{10} eluido se juntan y dializan frente a tampón de carga.
Las fracciones que contienen el PRO marcado con His_{10} eluido se juntan y dializan frente a tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del PRO
marcado con IgG (o marcado con Fc) puede realizarse usando técnicas
de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, la
cromatografía en columna de Proteína A o Proteína
G.
G.
Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en
EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la
cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal y
como se ha descrito más arriba.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unir específicamente el PRO.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en la técnicas y se describen, por
ejemplo, en Goding, ver más arriba. Los inmunogenes que pueden
emplearse incluyen el PRO purificado, proteínas de fusión
conteniendo el PRO, y células que expresan el PRO recombinante sobre
la superficie celular. La selección del inmunogén puede realizarla
el especialista capacitado sin experimentación innecesaria.
Los ratones, tales como los Balb/c, se inmunizan
con el inmunogén del PRO emulsionado en adyuvante de Freund
completo, y se inyectan subcutánea o intraperitonealmente en un
cantidad desde 1-100 microgramos. Alternativamente,
el inmunogén se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, Mo.) y se inyecta en las plantas
de las patas posteriores de los animales. Los ratones inmunizados se
estimulan a continuación de 10 a 12 días más tarde con inmunogén
adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de
entonces, durante varias semanas, los ratones pueden estimularse con
inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse
periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado
retro-orbital para ensayo en ensayos ELISA para
detectar anticuerpos anti-PRO.
Una vez se ha detectado un nivel de título de
anticuerpos apropiado, los animales "positivos" para los
anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de
PRO. Tres o cuatro días más tarde, se sacrifican los animales y se
recogen las células del bazo. Las células del bazo se fusionan a
continuación (usando polietilenglicol al 35%) con una línea celular
de mieloma de ratón seleccionada, tal como la P3X63AgU.1,
disponible en la ATCC, Nº CRL 1597. Las fusiones generan células de
hibridoma que pueden sembrarse en placas de cultivo de 96 pocillos
que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para
inhibir la proliferación de las células no fusionadas, de los
híbridos de mieloma, y de los híbridos de células del bazo.
Las células de hibridoma se examinan en un ELISA
en busca de reactividad contra el PRO. La determinación de células
de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos
monoclonales deseados contra el PRO se halla dentro de las
capacidades de la técnica.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singeneicos para
producir ascites que contienen los anticuerpos monoclonales
anti-PRO. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden cultivarse en frascos de cultivo de tejidos o
botellas rotatorias. La purificación de los anticuerpos producidos
en los ascites puede conseguirse usando la precipitación con sulfato
amónico, seguida por cromatografía por exclusión en gel.
Alternativamente, puede emplearse la cromatografía de afinidad
basada en la unión del anticuerpo a la Proteína A o Proteína G.
Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes
pueden purificarse mediante una variedad de técnicas estándares en
el campo de la purificación de proteínas. Por ejemplo, el
polipéptido pro-PRO, el polipéptido PRO maduro, o
el polipéptido pre-PRO se purifica mediante
cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para
el polipéptido PRO de interés. En general, se construye una columna
de afinidad acoplando covalentemente el anticuerpo
anti-polipéptido PRO a una resina cromatográfica
activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de suero inmune, bien mediante precipitación con sulfato
amónico o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ.). De igual modo, los
anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido de ascites
en ratón mediante precipitación con sulfato amónico o mediante
purificación sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina
parcialmente purificada se une covalentemente a una resina
cromatográfica tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr
(Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina,
se bloquea la resina, y la resina derivada se lava de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
Una columna de inmunoafinidad de este tipo se
utiliza en la purificación del polipéptido PRO mediante la
preparación de una fracción a partir de células que contienen el
polipéptido PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva
mediante solubilización de la célula entera, o de una fracción
subcelular obtenida vía centrifugación diferencial, mediante la
adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos
en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO soluble que
contiene una secuencia señal podría secretarse en cantidad útil en
el medio en el que se cultivan las células.
Una preparación que contiene polipéptido PRO
soluble se introduce en una columna de inmunoafinidad, y se lava la
columna en condiciones que permiten la absorbancia preferente del
polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en
presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en
condiciones que interrumpe la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por
ejemplo, un tampón con pH bajo, tal como aproximadamente pH
2-3, o una concentración elevada de un agente
caotrópico tal como la urea o el ion tiocianato), y se recoge un
polipéptido
PRO.
PRO.
Esta invención es particularmente útil para
examinar compuestos usando polipéptidos PRO, o fragmentos unidores
de los mismos, en cualquiera de una variedad de técnicas de examen
de fármacos. El polipéptido PRO o fragmento empleado en un ensayo
tal podría estar libre en solución, fijado sobre un soporte sólido,
unido sobre una superficie celular, o ubicado intracelularmente. Un
procedimiento de examen de fármacos utiliza células huéspedes
eucariotas o procariotas son están transformadas establemente con
ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o
fragmento. Los fármacos se examinan respecto tales células
transformadas en ensayos de unión competitiva. Tales células, bien
en forma viable o fijada, pueden usarse para ensayos de unión
estándares. Se podría medir, por ejemplo, la formación de complejos
entre el polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se está
ensayando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la
formación de complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o
receptores diana causada por el agente que se está ensayando.
Por tanto, la presente invención proporciona
procedimientos para examinar en busca de fármacos o cualesquier
otros agentes que pueden afectar una enfermedad o trastorno asociada
con el polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden poner en
contacto un agente tal con un polipéptido PRO o fragmento del mismo
y ensayar (i) la presencia de un complejo entre el agente u el
polipéptido PRO o fragmento, o (ii) la presencia de un complejo
entre el polipéptido PRO o el fragmento y la célula, mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica. En tales ensayos de
unión competitiva, el polipéptido PRO o fragmento están típicamente
marcados. Después de la incubación apropiada, el polipéptido PRO o
fragmento libres se separan del presente en forma unida, y la
cantidad de marca libre o no complejada es una medida de la
capacidad del agente concreto para unir el polipéptido PRO o para
interferir con el complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para examinar fármacos proporciona
el examen con elevado rendimiento en busca de compuestos que tienen
una afinidad de unión apropiada por un polipéptido, y se describe en
detalle en WO84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984.
Explicada resumidamente, se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal
como puntas de plástico o alguna otra superficie, un número elevado
de diferentes compuestos de ensayo que son péptidos pequeños. Tal y
como se aplicó a un polipéptido PRO, los compuestos de ensayo
peptídicos se hacen reaccionar con el polipéptido PRO y se lavan.
El polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien
conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado puede
depositarse también directamente sobre placas para su uso en las
técnicas de examen de fármacos mencionadas más arriba. Además,
pueden usarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el
péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.
Esta invención también contempla el uso de
ensayos de examen de fármacos competitivos, en los que anticuerpos
neutralizantes capaces de unirse específicamente al polipéptido PRO,
compiten con un compuesto de ensayo por la unión al polipéptido PRO
o a fragmentos del mismo. De esta forma, los anticuerpos pueden
usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte
uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales de polipéptido biológicamente
activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de moléculas
pequeñas con las que interaccionan, por ejemplo, agonistas,
antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede
usarse para diseñar drogas que son formas más activas o estables
del polipéptido PRO, o que potencian o interfieren con la función
del polipéptido PRO in vivo (cf., Hodgson,
Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).
En una estrategia, la estructura tridimensional
del polipéptido PRO, o de una complejo polipéptido
PRO-inhibidor, se determina mediante cristalografía
de rayos X, mediante modelado con ordenador o, más típicamente,
mediante una combinación de las dos estrategias. Para elucidar la
estructura y para determinar los sitios activos de la molécula
deben determinarse tanto la forma como las cargas del polipéptido.
Menos frecuentemente, podría conseguirse información útil en
relación a la estructura del polipéptido PRO mediante modelado en
base a la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la
información estructural relevante se usa para diseñar moléculas
análogas similares al polipéptido PRO o para identificar inhibidores
eficientes. Los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos
pueden incluir moléculas que tienen una actividad o actividad
mejorada, tal como muestran Braxton y Wells, Biochemistry,
31:7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores,
agonistas o antagonistas de péptidos nativos, tal como muestran
Athauda et al., J. Biochem.,
113:742-746 (1993).
Es posible también aislar un anticuerpo
específico para una diana, seleccionado mediante ensayo funcional,
tal y como se ha descrito más arriba, y a continuación resolver su
estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, proporciona
un núcleo de fármaco (pharmacore) a partir del cual puede
basarse el diseño subsiguiente de fármacos. Es posible prescindir
del todo de la cristalografía de la proteína mediante la generación
anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-ids) contra un anticuerpo funcional,
farmacológicamente activo. Al igual que la imagen especular de una
imagen especular, el sitio de unión de los anti-ids
se esperaría que fuera un análogo del receptor original. El
anti-id podría entonces usarse para identificar y
aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o
biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como núcleo
del fármaco.
Gracias a la presente invención, podría
disponerse de cantidad suficiente del polipéptido PRO para realizar
tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el
conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO
proporcionado en la presente invención, proporcionará una guía a los
que emplean técnicas de modelado con ordenador en lugar de, o
además de la cristalografía de rayos X.
Los materiales siguientes se han depositado en
la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD, EE.UU. (ATCC):
| Material | Depósito ATCC Nº | Fecha del depósito |
| DNA57700-1408 | 203583 | 12 de enero de 1999 |
Este depósito se realizó de acuerdo con las
disposiciones del Tratado de Budapest sobre el "Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorgani1smos para el Propósito del
Procedimiento de Patentes y las Regulaciones del mismo" (Tratado
de Budapest). Este asegura el mantenimiento de un cultivo viable del
depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. La ATCC
hará asequibles los depósitos en los términos del Tratado de
Budapest, y estarán sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y
la ATCC, el cual asegura la disponibilidad permanente y no
restringida de la progenie de los cultivos al público a partir de la
concesión de la pertinente patente estadounidense o a partir de
hacerse pública cualquiera solicitud de patente estadounidense o
extranjera, cualesquiera que suceda primero, y asegura la
disponibilidad de la progenie a cualquiera que detente el derecho a
la misma, según determine el Comisionado de Patentes y Marca
Registradas de los Estados Unidos de acuerdo con el artículo 35 de
la Constitución de los Estados Unidos, sección 122, y las
reglamentaciones del Comisionado relativas a la misma (incluyendo
la nº 37 de la CFR, sección 1.14, con particular referencia a la 886
OG 638).
El cesionario de la presente invención ha
aceptado que si un cultivo de los materiales en depósito muere, o
se pierde, o se destruye, cuando se cultiva en condiciones
apropiadas, será remplazado con prontitud, a partir de la
notificación, con otro del mismo. La disponibilidad del material
depositado no debe considerarse como una licencia para practicar la
invención en contravención de los derechos garantizados bajo la
autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes sobre
patentes.
La memoria escrita precedente se considera que
es suficiente para permitir a alguien capacitado en la técnica
practicar la invención. La presente invención no debe limitarse en
su alcance por la construcción depositada, puesto que la
realización depositada se pretende como una única ilustración de
ciertos aspectos de la invención. El depósito de material en la
presente invención no constituye la admisión de que la descripción
escrita contenida en la presente invención es inadecuada para
permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención,
incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe considerarse como
limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones
específicas que representa. Es más, varias modificaciones de la
invención, además de las mostradas y descritas en la presente
invención, serán evidentes para los especialistas en la técnica a
partir de la descripción precedente, y se hallan dentro del ámbito
de las reivindicaciones anexas.
<110> Genentech, Inc.
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<120> Polipéptidos secretados y
transmembrana y ácidos nucleicos que codifican los mismos
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<130> CMD/FP6063325
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2002-07-19
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<211> 662
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Listado de
secuencias
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transmembrana y ácidos nucleicos que codifican los mismos
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<210> 21
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<210> 22
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<210> 23
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<210> 24
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<400> 24
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<210> 25
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<211> 43
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Sonda de oligonucleótidos
sintética
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<400> 25
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\hskip-.1em\dddseqskiptgtaaaacga cggccagtta aatagacctg caattattaa tct
\hfill43
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<210> 26
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<211> 41
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Sonda de oligonucleótidos
sintética
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<400> 26
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\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgaccac ctgcacacct gcaaatccat t
\hfill41
Claims (29)
1. Ácido nucleico aislado,
- el cual codifica un polipéptido que es un mitógeno para las células de soporte del oído interno de la rata, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de residuos aminoácidos 1 ó 22\pm5 a 125, inclusive, de la Figura 2 o del polipéptido de longitud completa o maduro codificado por el inserto de ADNc (DNA57700-1408) del Depósito de la ATCC Nº 203583;
- el cual es complementario de la misma,
en donde dicha identidad de
secuencia se determina usando el programa de ordenador
ALIGN-2.
2. Ácido nucleico según la Reivindicación
1, en donde el nivel de identidad es de al menos el 90%.
3. Ácido nucleico según la Reivindicación
2, en donde el nivel de identidad es de al menos el 95%.
4. Ácido nucleico según la Reivindicación
1, el cual codifica un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de los residuos aminoácidos 1 ó 22\pm5 a 125,
inclusive, de la Figura 2 y/o el polipéptido de longitud completa o
maduro codificado por el inserto de ADNc
(DNA57700-1408) del Depósito de la ATCC Nº 203583;
o el cual es complementario de la misma.
5. Ácido nucleico según la Reivindicación
1, el cual comprende la secuencia codificante de longitud completa
de la secuencia mostrada en la Figura 1, o el complemento de la
misma.
6. Ácido nucleico según la Reivindicación
1, el cual comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la
Figura 1, o el complemento de la misma.
7. Ácido nucleico aislado, el cual tiene al
menos un 80% de identidad, bien con la secuencia codificante de
longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la
Figura 1, excluyendo opcionalmente la secuencia codificante para la
secuencia señal, bien con la complementaria de la misma, en donde el
ácido nucleico codifica o es complementario de un ácido nucleico
que codifica un polipéptido que es un mitógeno para las células de
soporte del oído interno de la rata, y en donde dicha identidad de
secuencia se determina usando el programa de ordenador
ALIGN-2.
8. Ácido nucleico según la Reivindicación
7, en donde el nivel de identidad es de al menos el 90%.
9. Ácido nucleico según la Reivindicación
8, en donde el nivel de identidad es de al menos el 95%.
10. Vector que comprende el ácido nucleico
de cualquier reivindicación precedente.
11. Vector según la Reivindicación 10 unido
operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula
hospedadora transformada con el vector.
12. Célula hospedadora que comprende el
vector según la Reivindicación 10 ó Reivindicación 11.
13. Célula hospedadora según la
Reivindicación 12 en donde dicha célula es una célula CHO, una E.
coli, o una célula de levadura.
14. Proceso para producir un polipéptido que
comprende cultivar la célula hospedadora según la Reivindicación 12
ó Reivindicación 13 en condiciones apropiadas para la expresión de
dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido del cultivo de
células.
15. Polipéptido aislado que tiene al menos
un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de residuos
aminoácidos 1 ó 22\pm5 a 125, inclusive, de la Figura 2, y/o el
polipéptido de longitud completa o maduro codificado por el inserto
de ADNc (DNA57700-1408) del Depósito de la ATCC Nº
203583, en donde dicha identidad de secuencia se determina usando
el programa de ordenador ALIGN-2, y en donde dicho
polipéptido aislado es mitógeno para las células de soporte del oído
interno de la rata.
16. Polipéptido según la Reivindicación 15,
el cual consiste en los residuos aminoácidos 1 ó 22\pm5 a 125,
inclusive, de la Figura 2.
17. Polipéptido según la Reivindicación 15,
en donde el nivel de identidad es de al menos el 90%.
18. Polipéptido según la Reivindicación 15,
en donde el nivel de identidad es de al menos el 95%.
19. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 15 a
18 fusionado con una secuencia de aminoácidos heteróloga.
20. Molécula quimérica según la
Reivindicación 19, en donde dicha secuencia de aminoácidos
heteróloga es una secuencia de marca de epítopo.
21. Molécula quimérica según la
Reivindicación 19, en donde dicha secuencia de aminoácidos
heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.
22. Anticuerpo que se une específicamente al
polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 16.
23. Anticuerpo según la Reivindicación 22,
el cual es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, o un
anticuerpo de cadena sencilla.
24. Polipéptido de una cualquiera de las
reivindicaciones 15-18, para su uso en el
tratamiento de la pérdida auditiva en mamíferos.
25. Uso del polipéptido de una cualquiera de
las reivindicaciones 15-18 en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la pérdida auditiva.
26. Uso del polipéptido de una cualquiera de
las reivindicaciones 15-18 en la preparación de un
medicamento para inducir la regeneración de células del órgano de
Corti.
27. Composición que comprende el polipéptido
de una cualquiera de las reivindicaciones 15-18 en
combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
28. Uso del polipéptido de una cualquiera de
las reivindicaciones 15-18 en un procedimiento in
vitro para inducir la regeneración de las células del órgano de
Corti.
29. Uso del polipéptido de una cualquiera de
las reivindicaciones 15-18 en un procedimiento in
vitro para inducir la proliferación de fibroblastos de
mamíferos.
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