ES2268105T3 - Gen env mutado, glicoproteina env mutada y uso de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Gen env mutado que codifica para una glicoproteína de cubierta mutada del virus VIH-1 de un aislado primario, caracterizado porque dicho gen presenta con relación al gen env de un aislado primario de primo-infección, denominado de referencia, al menos dos mutaciones a nivel de los sitios de glicosilación conservados de un aislado primario a otro, consistiendo cada mutación en la sustitución de un codón AAC o AAT que codifica para una asparagina por un codón CAG o CAA que codifica para una glutamina, siendo las dos mutaciones seleccionadas al menos de entre las siguientes: (a) al menos dos mutaciones en la parte del gen env que codifica para la región C3 de la proteína Env, (b) al menos una mutación en la parte que codifica para la región C3, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3, (c) al menos una mutación en la parte que codifica para la región C2, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de los codones 862-864 y 970-972, (d) al menos una mutación en la parte que codifica para la región C2 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de los codones 667-669, 679-681, 700-702, 763-765, 844-846, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3, pudiendo la posición de al menos uno cualquiera de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos, o el gen env mutado consiste en una cualquiera de las secuencia SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 9 o SEC. ID nº: 10, o sus secuencias complementarias.
Description
Gen ENV mutado, glicoproteína ENV mutada y uso
de los mismos.
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) es una afección vírica que presenta una importancia mayor en
América, Europa, África y Asia. Los individuos infectados presentan
una inmunodepresión importante, y la enfermedad puede ser todavía
mortal aunque se hayan hecho progresos gracias a la triterapia. La
transmisión de la enfermedad se efectúa lo más frecuentemente
mediante contacto sexual, y mediante uso de estupefacientes por vía
intravenosa. La enfermedad es transmisible de la madre al hijo. Uno
de los agentes causales de esta enfermedad es el retrovirus
VIH-1. El genoma del VIH-1 se
caracterizó de manera completa por Wain-Hobson et
al., 1985 (22); Ratner et al., 1985 (23); Muesing et
al., 1985 (24); Sanchez-Pescador et al.,
1985 (25). Las tres partes más importantes del genoma del
VIH-1 son los genes gag, pol y env. La
secuencia del gen env codifica la proteína Env que se
sintetiza en forma de un precursor glicosilado, la gp 160, que se
rompe mediante una endoproteasa celular en dos subunidades, la
proteína de superficie gp 120 y la proteína transmembranaria gp 41.
Estas dos subunidades siguen enlazadas de manera no covalente, y la
glicoproteína nativa anclada a la membrana citoplásmica o a la
cubierta vírica es muy probablemente un trímero o eventualmente un
tetrámero del complejo gp 120/gp 41, estabilizado mediante
interacciones a nivel de los dominios extracelulares de las
subunidades gp 41 (McInerney T.L et al., 1998 (5)). Debido a
su complejidad estructural, la proteína Env es muy difícil de
purificar en su conformación nativa.
El desarrollo de una vacuna contra el
VIH-1 focalizó esfuerzos internacionales sostenidos
desde el descubrimiento del virus en 1983. Hoy en día, tras
prácticamente 20 años de búsqueda activa, no solamente no existe una
vacuna verosímil, sino que numerosos equipos buscan todavía
identificar enfoques vacunales razonablemente utilizables. Las
estrategias clásicas, a saber el uso de cepas atenuadas o de virus
inactivados han sido excluidas; siendo los riesgos relacionados con
el uso de un retrovirus replicativo demasiado importantes para
prever un uso en el ser humano. Como no existe ningún caso
documentado de curación natural de la infección en el ser humano,
los factores inmunitarios de la protección no se han podido
identificar con seguridad. Para un cierto número de infecciones
víricas, como por ejemplo el virus de la rubéola o el virus de la
gripe, el principal factor de protección es la inducción de una
respuesta humoral neutralizante, es decir de anticuerpos cuya unión
sobre la partícula vírica bloquea la entrada en la célula diana. Por
eso, los esfuerzos para el desarrollo de una vacuna contra el
VIH-1 se han concentrado inicialmente sobre este
enfoque dirigido a inducir anticuerpos neutralizantes. En tales
estrategias vacunales, la glicoproteína de cubierta vírica (Env)
constituye un inmunógeno de elección, porque es la principal,
incluso la única, diana de la respuesta neutralizante. Sin embargo,
los ensayos de vacunación realizados con las proteínas de cubierta
han dado lugar hasta ahora a resultados muy decepcionantes. En
efecto, con tales inmunógenos, es posible inducir títulos
neutralizantes elevados frente a cepas de laboratorio en los modelos
animales del chimpancé y del macaco, así como en voluntarios sanos.
Sin embargo, estos anticuerpos neutralizantes eficaces contra las
cepas adaptadas al cultivo sobre líneas linfocitarias T
transformadas (cepas de laboratorio o TCLA) no protegen de la
infección mediante los virus primarios que están implicados en la
transmisión del VIH-1 (Moore J.P. y D.D. Ho, 1995
(1)).
La distinción entre las cepas adaptadas al
laboratorio y los aislados primarios obtenidos mediante cultivo de
corta duración sobre las células T primarias apareció en 1995, y se
hizo más clara con el descubrimiento de los correceptores del
VIH-1, cuyos dos principales son los receptores de
quimioquinas CCR5 y CXCR4. La gran mayoría de los virus primarios
usan el correceptor CCR5 durante su entrada en la célula diana,
además del receptor CD4 común a todos los virus. La adaptación a las
líneas T linfoides se traduce en una pérdida de la capacidad para
usar CCR5, y la adquisición de la capacidad para usar CXCR4, si el
virus no la posee todavía (Trkola A. et al., 1996 (2)). La
otra diferencia fundamental entre los dos tipos de virus es de orden
inmunológico: los aislados primarios son, de manera general, mucho
más resistentes que las cepas de laboratorio a la neutralización
mediante los anticuerpos y formas solubles del CD4. En efecto,
epítopos tal como el sitio de unión al receptor CD4 y el bucle V3
son poco accesibles sobre las proteínas Env de los aislados
primarios, mientras que están expuestos en la superficie de los
virus adaptados al cultivo. Por consecuencia, los anticuerpos
específicos de estos determinantes antigénicos neutralizan
eficazmente las cepas adaptadas pero no los aislados primarios (1).
Además, la resistencia de los aislados primarios a la neutralización
es independiente del uso diferencial de correceptores entre las
cepas adaptadas y primarias. Los pocos aislados primarios que sólo
usan el CXCR4 como correceptor son tan difíciles de neutralizar como
aquéllos que usan el CCR5. Por otra parte, en los modelos animales,
es efectivamente posible obtener una protección contra las cepas
adaptadas de laboratorio, pero esta protección sigue estando
limitada a la cepa autóloga y a un número pequeño de variantes
cercanas. La respuesta neutralizante sigue siendo ineficaz contra
las cepas heterólogas, incluso si se trata de variantes adaptadas al
cultivo. Esta protección limitada se debe probablemente a la
inducción de anticuerpos dirigidos contra el bucle V3, que es una
región hipervariable de la proteína de cubierta. Usando mezclas de
inmunógenos que proceden de distintos aislados, fue posible ampliar
la especificidad de la respuesta inmunitaria; sin embargo, nunca se
pudo inducir una protección con amplio espectro, que cubre varios
subtipos (Girard, M. et al., 2000 (3)).
Frente a esta situación, varios equipos se han
centrado en la inducción de una inmunidad celular específica del
VIH-1. En efecto, es posible obtener, en humanos
vacunados, al igual que en los modelos animales, respuestas
celulares a base de linfocitos T CD8^{+} citotóxicos (CTL) capaces
de exterminar las células infectadas o bloquear en ellas la
replicación del VIH-1 mediante secreción de factores
de supresión. Sin embargo, no se consigue inducir respuestas CTL en
más de 30 hasta 40% de los vacunados, y las respuestas obtenidas
siguen estando frecuentemente dirigidas contra un número de epítopos
demasiado restringido.
Una tercera vía, todavía poco explorada, es la
inducción de una inmunidad mucosal. Un número relativamente pequeño
de resultados indica que una transudación de inmunoglobulinas IgG
neutralizantes y una secreción de IgA podría tener un papel en la
exclusión del virus a través de los epitelios.
Las particularidades del VIH-1,
a saber, la replicación en las células del sistema inmunitario y el
fallo inicial de la respuesta inmunitaria antivírica en los sujetos
infectados, subrayan la necesidad de desarrollar nuevos enfoques que
deben tener como objetivo inducir anticuerpos que se unan a los
epítopos de neutralización conservados entre los distintos subtipos
y presentes sobre las glicoproteínas de cubierta de los virus
primarios.
Para ello, se han fijado varios requisitos para
la obtención de una vacuna preventiva eficaz. Es absolutamente
necesario usar glicoproteínas de cubierta que proceden de aislados
primarios y no de cepas de laboratorio TCLA. Se debe asegurar la
presentación de esta proteína al sistema inmunitario en su
conformación nativa oligomérica. Se debe identificar nuevos epítopos
de neutralización de amplio espectro debido a la extraordinaria
capacidad de adaptación de los virus primarios para mutar a fin de
resistir la neutralización mediante un anticuerpo. En efecto, en el
modelo del ratón SCID humanizado, un intento terapéutico que
consiste en la administración de una mezcla de tres anticuerpos
IgG1b12, 2G12 y 2F5 seleccionó, en el espacio de una semana, una
subpoblación vírica resistente a la neutralización con cada uno de
los tres anticuerpos (Poingnard P. et al., 1999 (5)).
La proteína de cubierta de VIH-1
está fuertemente glicosilada (50% de la masa total). Los azúcares
presentes en su superficie aseguran entre otros una protección
frente a la respuesta neutralizante (Reitter J.N. et al.,
1998 (6)). Numerosos estudios han mostrado el papel que desempeñan
estos restos en la capacidad infecciosa o en la protección. Sin
embargo, estos estudios, lejos de ser sistemáticos, han tenido
siempre en cuenta los sitios de glicosilación bien
independientemente unos de otros, o bien sobre elementos
estructurales particulares tales como los bucles variables V1, V2,
V3 o los extremos N-terminales y
C-terminales de la proteína
(6-8).
En 1998, se propuso un modelo de estructura de
gp120 por Kwong después de la cristalización de una molécula
suprimida de la mayoría de estos bucles variables, y complejada con
CD4 y el Fab (fragmento de unión a antígeno) del anticuerpo de 17b
(Kwong P.D. et al., 1998 (9)). Curiosamente, se han realizado
pocos trabajos sobre la disposición de los sitios potenciales de
glicosilación en la superficie de la molécula oligomérica. Se pueden
citar los trabajos de Zhu X. et al., 2000 (10) que propone un
modelo para la forma totalmente glicosilada de gp 120, y los
trabajos de Whyatt R. et al., 1998 (11) concomitantes con los
trabajos de cristalización.
Así, según el documento
WO-A-99/24464, se han identificado,
a partir de la estructura cristalizada de la proteína Env del
VIH-1 en la que se han suprimido los bucles V1/V2,
los distintos sitios de glicosilación susceptibles de interaccionar
a nivel de un mismo epítopo de neutralización, y se han obtenido
mutantes correspondientes. Sin embargo, éstos se han obtenido sólo a
partir de cepas de laboratorio, con respecto a las cuales se
mencionó anteriormente que ya no son apropiadas para la búsqueda de
una vacuna eficaz.
Y, con la excepción de Kwong, (Kwong P.D. et
al., 2000 (12)), todos los resultados se obtuvieron
esencialmente sobre cepas TCLA. Ahora, los virus adaptados en
cultivo tienen diferencias epitópicas muy marcadas con relación a
los virus primarios, y los estudios de Zhu y de Whyatt no reflejan
la realidad exacta de la estructura antigénica de gp120 nativa del
VIH-1.
Ante todo los inventores han emitido y
verificado la hipótesis de que, a nivel del trímero de heterodímeros
presentes en la superficie de las células infectadas o del virus,
los sitios potenciales de glicosilación más conservados están
agrupados a fin de proteger elementos conformacionales importantes
para el virus.
Para ensayar esta hipótesis, realizaron un
trabajo importante. Se posicionaron todos los sitios potenciales de
glicosilación presentes sobre las secuencias de cubiertas de 13
aislados primarios de primo-infección por
VIH-1 (133, 146, 153, 159, 160, 374, 384, Qz, 120,
309, 355, 373, 426) y, a título comparativo, sobre 5 cepas TCLA (MN,
HXB2, OYI, RF, SF2). Las doce secuencias primarias de
primo-infección (con la excepción de Qz) se aislaron
y se caracterizaron en el laboratorio a partir de PBMC (células
mononucleares de sangre periférica) de pacientes en fase de
primo-infección, hospitalizados en el Hospital de la
Croix Rousse de Lyon (Ataman-Önal Y. et al., 1999 (13)). La
elección de primo-infecciones se justifica por el
hecho de que el virus presente en esta etapa de la enfermedad se
asemeja mucho al virus que inició la infección. Después, los sitios
potenciales de glicosilación que se conservaban en las 13 secuencias
de referencia se localizaron, y se seleccionaron las secuencias
correspondientes. Estos sitios corresponden al motivo proteico
N.X.T/S, en el que N significa asparagina, X representa cualquier
aminoácido con excepción de la prolina, T significa treonina y S
significa serina. Los resultados de este estudio se ilustran
mediante la tabla 1.
\newpage
Después, los inventores seleccionaron los sitios
de glicosilación muy conservados, y posicionaron estos sitios
conservados sobre la estructura 3D de gp120 (#PDB database: 1G9M)
con la ayuda del programa PDB-View
(Glaxo-Welcome). Los sitios enterrados en la
molécula o presentes en el dominio interno de gp120, dominio que
interactúa con gp41 y que por lo tanto está poco o nada expuesto en
la superficie del oligómero, se eliminaron del estudio. Cada
secuencia se analizó independientemente. Este análisis mostró que
los sitios conservados tenían una disposición comparable en la
superficie de la molécula, cualquiera que sea la secuencia de los
aislados primarios.
Después, los inventores definieron "grupos"
o "agrupamientos de glicosilación" que correspondían a
agrupamientos de sitios conservados en la superficie de gp120 desde
un aislado primario a otro. Estando estos grupos definidos, se
estableció una lista de mutantes de deglicosilación que tiene en
cuenta estos resultados.
Uno de los grupos de glicosilación corresponde a
una región situada próxima al motivo GPGS del bucle V3 (grupo
g14).
Otro grupo (g112/g122) reúne parcialmente los
sitios de glicosilación que definen el epítopo neutralizante 2G12
(Trkolla A. et al., 1996 (14)).
Un tercer grupo está yuxtapuesto con respecto a
una cavidad en la que están alojados aminoácidos que intervienen en
la unión a los correceptores (grupo 1112).
Un cuarto grupo está situado a nivel de 4
láminas beta antiparalelas localizadas en la unión de los dos
dominios principales de gp120 (bridging-sheet).
Un quinto grupo está presente en la parte
"silenciosa" de gp120 (grupo 113).
Los controles consisten en el gen de cubierta
totalmente deglicosilado para V1 (6) o bien en una supresión total
de los bucles V1V2.
Paralelamente, y a fin de validar la noción de
"agrupamiento" de glicosilación, se definieron dos mutantes
suplementarios (g123 y g1123), que corresponden a deglicosilaciones,
no en el seno de un mismo agrupamiento, sino en cada
"agrupamiento" distinto (una mutación por
"agrupamiento").
Se efectuó al menos una mutación sobre las
secuencias seleccionadas obtenidas a partir del paciente 133 (PHI
133, número de acceso AF041126). Cada mutación consiste en la
sustitución de la asparagina del sitio potencial de glicosilación
(NXS/T) por una glutamina, usando un kit de mutagénesis dirigida
según las instrucciones del fabricante (Quickchange
Site-directed Mutagenesis Kit, Stratagène). Cada
mutante se clonó en el vector de expresión pCI (Promega), y se
secuenció totalmente a fin de verificar la integridad de la
secuencia después de la mutagénesis. La purificación de los
plásmidos mutantes se efectuó gracias al kit Nucleobond PC500
(Macherey-Nagel).
La figura 1 esquematiza la definición de los
agrupamientos y la proximidad de cada sitio sobre la molécula de
gp120 cristalizada.
La tabla 2 recapitula la naturaleza y el
posicionamiento de cada mutación para un mutante determinado. En la
tabla 2, las secuencias de aminoácidos de referencia son las
secuencia de la proteína Env del aislado VIH-1 133
no mutada suprimida, y la secuencia de la proteína Env del aislado
VIH-1 133 no mutada completa. Las posiciones que
corresponden a los aminoácidos se dan en la tabla 2. La secuencia de
aminoácidos de la proteína Env del aislado VIH-1 133
no mutada completa se identifica en SEC. ID nº: 11, y la secuencia
nucleotídica que corresponde al gen env del aislado
VIH-1 133 no mutada (completa) se identifica en SEC.
ID nº: 1. Las secuencias nucleotídicas SEC. ID nº 2 a nº 10, y las
SEC. ID nº 12 a nº 20, que se enumeran a continuación, corresponden
respectivamente a las secuencias de los genes env mutados completos
y truncados del aislado VIH-1 133, y a las
secuencias de las proteínas Env mutadas completas y truncadas del
aislado VIH-1 133. La secuencia de gp160 se da con
referencia a SEC. ID nº: 11. La secuencia de gp120 empieza en el
aminoácido 1 y termina en el aminoácido 498 con referencia a la SEC.
ID nº: 11. La secuencia de gp140 (que corresponde a gp120 más los
dominios extracelulares de gp41) empieza en el aminoácido 1 y
termina en el aminoácido 669 con referencia a la secuencia SEC. ID
nº: 11.
Se entiende claramente que, en función del
aislado primario, la posición de los sitios de glicosilación
conservados puede variar de 1 hasta 8 aminoácidos, y la invención
engloba estas variaciones de posicionamiento.
La tabla 3 siguiente presenta algunos ejemplos
de variaciones de los sitios de glicosilación, y establece una
recapitulación de todos los sitios potenciales de glicosilación en
los genes env de los aislados primarios 133, 146, 153, 159, 160, 374
y 384. Las posiciones de aminoácidos se indican para las secuencias
suprimidas según Kwong et al., 1998. Cada línea de la tabla
corresponde a un sitio potencial, y la correspondencia entre las
distintas posiciones se determinó mediante alineación de las
secuencias suprimidas. Los sitios de glicosilación conservados en
todas las secuencias están subrayados.
Los inventores estudiaron a continuación las
características antigénicas y funcionales de cada uno de estos
mutantes, y seleccionaron los mutantes que presentan las mejores
características para los fines de una vacuna preventiva. Se
seleccionaron los mutantes g12, g112 y g14. Los resultados se
presentan en los ejemplos y las figuras siguientes.
La secuencia SEC. ID nº: 2 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g12 (gen env).
La secuencia SEC. ID nº: 3 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g12 truncada, que codifica
gp120.
La secuencia SEC. ID nº: 4 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g12 truncada, que codifica
gp140.
La secuencia SEC. ID nº: 5 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g112 (gen env).
La secuencia SEC. ID nº: 6 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g112 truncada, que codifica
gp120.
La secuencia SEC. ID nº: 7 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g112 truncada, que codifica
gp140.
La secuencia SEC. ID nº: 8 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g14 (gen env).
La secuencia SEC. ID nº: 9 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g14 truncada, que codifica
gp120.
La secuencia SEC. ID nº: 10 representa la
secuencia nucleotídica del mutante g14 truncada, que codifica
gp140.
La secuencia SEC. ID nº: 12 representa la
secuencia de aminoácidos del mutante g12 (proteína Env).
La secuencia SEC. ID nº: 13 representa la
secuencia de aminoácidos de gp120 del mutante g12.
La secuencia SEC. ID nº: 14 representa la
secuencia de aminoácidos de gp140 del mutante g12.
La secuencia SEC. ID nº: 15 representa la
secuencia de aminoácidos del mutante g112 (proteína Env).
La secuencia SEC. ID nº: 16 representa la
secuencia de aminoácidos de gp120 del mutante g112.
La secuencia SEC. ID nº: 17 representa la
secuencia de aminoácidos de gp140 del mutante g112.
La secuencia SEC. ID nº: 18 representa la
secuencia de aminoácidos del mutante g14 (proteína Env).
La secuencia SEC. ID nº: 19 representa la
secuencia de aminoácidos de gp120 del mutante g14.
La secuencia SEC. ID nº: 20 representa la
secuencia de aminoácidos de gp140 del mutante g14.
Las secuencias de gp120 y gp140 se obtienen
truncando el gen, o bien insertando un codón de terminación y/o un
desplazamiento de marco de lectura sin supresión del gen. Las formas
de gp120 y gp140 son solubles, y por lo tanto más fáciles de
purificar y de administrar que la proteína Env completa.
Así, la presente invención tiene por objeto un
gen env mutado que codifica una glicoproteína de cubierta mutada del
virus VIH-1, presentando dicho gen con relación al
gen env de un aislado primario de primo-infección,
denominado de referencia, al menos dos mutaciones a nivel de los
sitios de glicosilación conservadas de un aislado primario a otro,
consistiendo cada mutación en la sustitución de un codón AAC o AAT
que codifica una asparagina por un codón CAG o CAA que codifica una
glutamina, siendo las dos mutaciones al menos seleccionadas de entre
las siguientes:
- (a)
- al menos dos mutaciones en la parte del gen env que codifica para la región C3 de la proteína Env,
- (b)
- al menos una mutación en la parte que codifica para la región C3, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3,
- (c)
- al menos una mutación en la parte que codifica para la región C2, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de los codones 862-864 y 970-972,
- (d)
- al menos una mutación en la parte que codifica para la región C2 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de los codones 667-669, 679-681, 700-702, 763-765, 844-846, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3,
pudiendo la posición de al menos uno cualquiera
de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos,
o el gen env mutado consiste en cualquiera de
las secuencias SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 9 o SEC. ID nº: 10, o sus
secuencias complementarias.
Una de las ventajas de los múltiples mutantes
(al menos dos mutaciones) según la invención reside en la
disminución de la probabilidad de tener mutaciones compensatorias
que llevarían a encontrar nuevamente un fenotipo salvaje.
Las mutaciones preferidas según la invención son
las siguientes.
Según las mutaciones (a), se efectúa al menos
una mutación a nivel de los codones 976-978,
991-993 de la parte que codifica para la región C3,
y se efectúa al menos una mutación a nivel de los codones
1039-1041 ó 1060-1062 de la parte
que codifica para la región C3, pudiendo la posición de al menos uno
cualquiera de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro
nucleótidos. Preferentemente, el gen consiste en una secuencia
seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº:
21, SEC. ID nº: 22 y SEC. ID nº: 23, o sus secuencias
complemen-
tarias.
tarias.
Según las mutaciones (b), se efectúa al menos
una mutación a nivel de los codones 976-978,
991-993, 1039-1041 ó
1060-1062 de la parte que codifica para la región
C3, y se efectúa al menos una mutación a nivel del codón
880-882 de la parte que codifica para la región V3,
pudiendo la posición de al menos uno cualquiera de dichos codones
variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos; según esta variante,
el gen comprende al menos tres mutaciones, a saber, al menos dos
mutaciones en la parte que codifica para la región C3, y al menos
una mutación en la parte que codifica para la región V3:
- preferentemente, estas mutaciones se efectúan a nivel de los codones 976-978, 991-993 y 880-882, pudiendo la posición de al menos uno cualquiera de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos; ventajosamente, la secuencia del gen así mutado consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 3 y SEC. ID nº: 4, o sus secuencias complementarias, o
- se efectúa al menos una mutación a nivel del codón 976-978 ó 991-993, se efectúa al menos una mutación a nivel del codón 880-882, y se efectúa el menos una mutación a nivel del codón 1039-1041 ó 1060-1062; preferentemente, las mutaciones se efectúan a nivel de los codones 976-978, 991-993, 880-882, 1039-1041 y 1060-1062; ventajosamente, la secuencia del gen así mutado consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 6 y SEC. ID nº: 7, o sus secuencias complementarias,
- entendiéndose que la posición de al menos uno cualquiera de dichos codones antes citados puede variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos.
Según las mutaciones (c), se efectúa al menos
una mutación a nivel del codón 805-807 de la parte
que codifica para la región C2, pudiendo la posición de al menos uno
cualquiera de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro
nucleótidos.
Según las mutaciones (d), se efectúa al menos
una mutación a nivel del codón 880-882 de la parte
que codifica para la región V3, pudiendo la posición de al menos uno
cualquiera de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro
nucleótidos.
La secuencia del gen mutado puede asimismo
consistir en una secuencia seleccionada de entre las secuencias
identificadas en SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 9 y SEC. ID nº: 10, o
sus secuencias complementarias.
La invención se refiere asimismo a una
glicoproteína Env mutada del virus VIH-1, dicha
glicoproteína presenta con relación a una proteína Env nativa de un
aislado primario de primo-infección, denominado de
referencia, al menos dos mutaciones a nivel de los sitios de
glicosilación conservados de dicha proteína de referencia, de un
aislado primario a otro, consistiendo cada mutación en la
sustitución de una asparagina por una glutamina, siendo las dos
mutaciones seleccionadas al menos entre las siguientes:
- (a')
- al menos dos mutaciones en la región C3 de la proteína Env,
- (b')
- al menos una mutación en la región C3, y al menos una mutación en la región V3,
- (c')
- al menos una mutación en la región C2, y al menos una mutación en la región V3 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel del aminoácido 288 ó 324,
- (d')
- al menos una mutación en la región C2 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de uno cualquiera de los aminoácidos 223, 227, 234, 255, 282, y al menos una mutación en la región V3,
pudiendo la posición de dichos sitios de
glicosilación conservados de un aislado primario de
primo-infección a otro variar de uno hasta ocho
aminoácidos,
o la glicoproteína Env mutada consiste en
cualquiera de las secuencia SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 19 o SEC. ID
nº: 20.
La posición de los aminoácidos de los sitios de
glicosilación mutados se da con referencia a la secuencia de la
proteína Env nativa.
Las mutaciones preferidas según la invención son
las siguientes.
Según las mutaciones (a'), se efectúa al menos
una mutación en el sitio de glicosilación a nivel del aminoácido 326
ó 331, y se efectúa al menos una mutación en el sitio de
glicosilación a nivel del aminoácido 347 ó 354, pudiendo la posición
de dichos sitios de glicosilación conservados de un aislado primario
de primo-infección a otro variar de uno hasta ocho
aminoácidos. Preferentemente, la glicoproteína consiste en una
secuencia seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC.
ID nº: 21, SEC. ID nº: 22 y SEC. ID nº: 23.
Según las mutaciones (b'), se efectúa al menos
una mutación a nivel del aminoácido 326 ó 331, y se efectúa al menos
una mutación a nivel del aminoácido 294, pudiendo la posición de al
menos uno cualquiera de dichos sitios de glicosilación conservados
de un aislado primario de primo-infección a otro
variar de uno hasta ocho aminoácidos; según una variante, la
glicoproteína comprende al menos tres mutaciones, preferentemente al
menos dos mutaciones en la región C3, y al menos una mutación en la
región V3:
- preferentemente, estas mutaciones se efectúan a nivel de los aminoácidos 326, 331 y 294; ventajosamente una glicoproteína Env mutada de la invención consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº: 12, SEC. ID nº: 13 y SEC. ID nº: 14; o
- se efectúa al menos una mutación a nivel del aminoácido 326 ó 331, se efectúa el menos una mutación a nivel del aminoácido 347 ó 354, y se efectúa al menos una mutación a nivel del aminoácido 294; ventajosamente, las mutaciones se efectúan a nivel de los aminoácidos 326, 331, 294, 347 y 354; aún mejor, una glicoproteína Env mutada de la invención consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº: 15, SEC. ID nº: 16 y SEC. ID nº: 17,
- entendiéndose que la posición de dichos sitios de glicosilación conservados de un aislado primario de primo-infección a otro puede variar de uno hasta ocho aminoácidos.
Según las mutaciones (c'), se efectúa al menos
una mutación a nivel del aminoácido 269 de la región C2.
Según las mutaciones (d'), se efectúa al menos
una mutación a nivel del aminoácido 294 de la región V3.
Una glicoproteína Env mutada de la invención
puede consistir en una secuencia seleccionada de entre las
secuencias identificadas en SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 19 y SEC. ID
nº: 20.
La invención tiene también por objeto una
composición farmacéutica que comprende:
- (i)
- al menos un gen mutado que codifica una glicoproteína de cubierta mutada gp120 del virus VIH-1, siendo dicho gen mutado seleccionado de entre uno cualquiera de los genes descritos anteriormente, y poniéndose bajo el control de secuencias de regulación que permiten su expresión en una célula hospedante,
- un vehículo farmacéuticamente aceptable, y
- de manera facultativa, un agente adicional que facilita la penetración de dicho gen mutado en dicha célula y/o que permite seleccionar como diana a dicha célula, o
- (ii)
- al menos el gen mutado identificado en (i) clonado en un vector vírico recombinante.
Entre las secuencias de regulación, se puede
citar el promotor intermedio/precoz del CMV humano
("intermediate/early CMV human promotor"), y el gen rev del
VIH-1.
Si se desea, dichas células hospedantes, o un
compartimiento celular determinado de dichas células hospedantes, se
pueden seleccionar como dianas y, para ello, es posible acoplar al
principio activo, a saber, el ADN mutado de la invención, al menos
un agente de selección de diana. Mediante la expresión agente de
selección de diana, se entiende una molécula química o biológica que
permite seleccionar como diana a dicha célula hospedante in
vivo. Puede, entre otros, tratarse de un ligando específico, de
un anti-ligando naturalmente presente a nivel de la
célula hospedante o del compartimiento celular a seleccionar como
diana, en particular presente en la superficie de dicha célula
hospedante, y se puede citar, a título de ejemplo, los anticuerpos
como ligandos y los antígenos como antiligandos. Así, si un
anticuerpo se acopla al principio activo y es específico de un
antígeno de superficie de la célula hospedante, actuará como agente
de selección de diana de dicha célula hospedante vía la formación
específica de un complejo anticuerpo/antígeno.
Mediante la expresión agente que facilita la
penetración de dicho gen mutado en una célula hospedante, se
entiende, entre otros, agentes tales como bupivacaína y
cardiotoxina.
Mediante la expresión vehículo farmacéuticamente
aceptable, se entienden, entre otros, los liposomas, virosomas,
nanopartículas, micropartículas (por ejemplo: perlas de oro),
iscomas.
Para el vector vírico recombinante, se pueden
citar, a título de ejemplo, el MVA (Modified Vaccinia Ankara), los
alfavirus, SFV (Semliki Forest Virus), los adenovirus y AAV
(Adeno-Associated Virus).
Las composiciones farmacéuticas definidas
anteriormente son composiciones de vacuna de ADN particularmente
ventajosas, en particular con relación a las composiciones de vacuna
"clásicas" a base de proteína recombinante. En efecto, el uso
de proteínas recombinantes con fines vacunales es un sistema
laborioso y costoso, especialmente porque exige importantes etapas
de purificación de los antígenos recombinantes. Además, una de las
dificultades encontradas es obtener una persistencia de la vacuna
durante un periodo de tiempo suficientemente largo para mantener una
buena memoria inmunitaria. Por el contrario, el método de vacunación
mediante el ADN, cuyas ventajas son inherentes a las propiedades
intrínsecas del ADN, es sencillo y poco costoso, y se efectúa
simplemente mediante inyección intramuscular o intradérmica. Además,
conviene observar que:
- -
- las vacunas de ADN son no infecciosas/no replicativas,
- -
- debido al hecho de que la inmunización mediante ADN se hace en forma de transfección in vivo, el antígeno vírico se expresa en las células mamíferas en su conformación nativa,
- -
- al igual que en el caso de una infección vírica, se induce una amplia respuesta inmune, tanto humoral como celular, y
- -
- además, las vacunas de ADN se pueden combinar fácilmente debido a su homogeneidad físico-química.
Pero la invención no se limita a una composición
vacunal de ADN tal como se ha definido anteriormente, y se refiere
asimismo a una composición farmacéutica que comprende:
- -
- al menos una glicoproteína de cubierta mutada gp120 del virus VIH-1, siendo dicha glicoproteína mutada seleccionada de entre cualquiera de las glicoproteínas descritas anteriormente,
- -
- un vehículo y/o excipiente y/o adyuvante y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
- Dicha composición vacunal preparada es inyectable, es decir en disolución líquida o en suspensión. Opcionalmente, la preparación se puede asimismo emulsionar. La molécula antigénica, es decir la glicoproteína mutada, se puede mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente o principio activo. Ejemplos de excipientes favorables son agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol o equivalentes, y sus combinaciones. Si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tal como agentes humectantes o emulsionantes, agentes que tamponan el pH o adyuvantes tal como hidróxido de aluminio, dipéptido muramilo o sus variaciones, polímeros catiónicos, nanopartículas de polímeros catiónicos o sus variantes (poli(ácido láctico), poli(ácido láctico)-coglicósido).
La vacuna se administra convencionalmente
mediante inyección, por ejemplo intramuscular.
Mediante la expresión "vehículo
farmacéuticamente aceptable", se entienden los soportes y
vehículos administrables al ser humano o al animal, tales como los
descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª ed., Mack
Publishing Co. El vehículo farmacéuticamente aceptable es,
preferentemente, isotónico, hipotónico o presenta una baja
hipertonicidad, y tiene una fuerza iónica relativamente baja. Las
definiciones de los excipientes y adyuvantes farmacéuticamente
aceptables se dan asimismo en Remington's Pharmaceutical Sciences
antes citado.
La presente solicitud da a conocer asimismo un
procedimiento para inducir una respuesta humoral y/o celular
mejorada contra el virus VIH-1 en un animal mamífero
según el cual:
- -
- se administra a un animal mamífero, mediante inyección intramuscular o intradérmica, una cantidad suficiente para ser eficaz de una composición vacunal de ADN, que comprende al menos el gen mutado que codifica una proteína mutada de la invención tal como se ha definido anteriormente, o
- -
- se administra a un animal mamífero, mediante inyección intramuscular o intradérmica, una cantidad suficiente para ser eficaz de una composición vacunal que comprende al menos la proteína mutada de la invención tal como se ha definido anteriormente.
En el caso de vacunas de ADN, la concentración
de ácido nucleico en la composición usada para una administración
in vivo es de aproximadamente 100 \mug/ml hasta 10 mg/ml,
preferentemente 1 mg/ml.
La cantidad de proteína administrada depende de
la adición o no de un adyuvante, pero estará generalmente
comprendida entre 10 y 50 \mug/ml de proteína.
La vacuna se administra a una dosis determinada,
en una o varias inyecciones por vía intramuscular o intradérmica,
seguida(s) de una dosis de recuerdo, si es necesario. El
efecto inmunizante de la vacuna se monitoriza midiendo los
anticuerpos anti-VIH-1 en el
individuo o el animal vacunado.
La administración de ácido(s)
nucleico(s) o proteína(s) de interés o de su(s)
fragmento(s), solos o en combinación, se usa para la
profilaxis y/o la terapia. Cuando se administra uno o varios
ácido(s) nucleico(s) o sus fragmentos, o una o varias
proteína(s) o sus fragmentos, una de sus características es
la de no presentar la virulencia del VIH-1, sino que
tienen la propiedad de inducir una respuesta inmunitaria humoral y/o
celular en el individuo o animal al que se le ha administrado.
Cuando se trata de proteína(s), éstas se pueden obtener
mediante técnicas sintéticas o de recombinación genética, o mediante
modificación de proteína(s) natural(es) por
tratamientos químicos o físicos.
La o las proteína(s) o sus fragmentos,
que son candidatos para la formulación de una vacuna, se identifican
y se analizan en un ensayo funcional para asegurarse que hayan
perdido su toxicidad, y para verificar su capacidad inmunógena (i)
realizando un ensayo in vitro de proliferación de linfocitos
T CD4+ específicos del antígeno administrado (ensayo de células T),
o un ensayo in vitro de citotoxicidad de los linfocitos CD8+
específicos del antígeno administrado, y (ii) midiendo, entre otros,
el porcentaje de anticuerpos que circulan dirigidos contra la
proteína natural, y su capacidad para neutralizar aislados
primarios. Estas formas modificadas se usan para inmunizar el ser
humano mediante procedimientos estándares con adyuvantes
apropiados.
La invención se refiere asimismo:
- -
- a un procedimiento para obtener anticuerpos según el cual se inmuniza un animal mamífero no humano, tal como ratón o rata o mono, con al menos un gen mutado que codifica una glicoproteína de cubierta mutada del virus VIH-1, siendo dicho gen mutado seleccionado de entre uno cualquiera de los genes descritos anteriormente, y estando puesto bajo el control de secuencias de regulación que permiten su expresión in vivo, y
- -
- a un procedimiento para obtener anticuerpos según el cual se inmuniza un animal mamífero no humano, tal como ratón o rata o mono, con al menos una glicoproteína de cubierta mutada del virus VIH-1, siendo dicha glicoproteína mutada seleccionada de entre cualquiera de las glicoproteínas descritas anterior-mente.
Por anticuerpos se entienden anticuerpos
policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos transmembránicos
y anticuerpos humanizados, o fragmentos de dichos anticuerpos. La
producción de anticuerpos policlonales y monoclonales es parte de
los conocimientos generales del experto en la técnica. Se puede
citar a título de referencia Köhler G. y Milstein C. (1975):
Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined
specificity, Nature 256: 495-497, y Galfre G.
et al. (1977) Nature, 266: 522-550
para la producción de anticuerpos monoclonales, y Roda A., Bolelli
G.F.: Production of high-titer antibody to bile
acids, Journal of Steroid Biochemistry, vol. 13, p.
449-454 (1980) para la producción de anticuerpos
policlonales. Para la producción de anticuerpos monoclonales, el
inmunógeno se puede acoplar a hemocianina extraída de lapa
californiana (péptido KLH) como soporte para la inmunización, o a
albúmina sérica (péptido SA). Los animales se someten a una
inyección de inmunógeno usando adyuvante completo de Freund. Los
sueros y los sobrenadantes de cultivo de hibridoma que proceden de
los animales inmunizados se analizan para determinar su
especificidad y su selectividad usando técnicas clásicas, tales como
por ejemplo ensayos ELISA o de transferencia Western. Se seleccionan
los hibridomas que producen los anticuerpos más específicos y más
sensibles. Se pueden producir asimismo anticuerpos monoclonales
in vitro mediante cultivo celular de los hibridomas
producidos, o mediante recuperación de líquido ascítico, tras
inyección intraperitoneal de los hibridomas en el ratón.
Independientemente del modo de producción, como sobrenadante o como
ascitis, después se purifican los anticuerpos. Los métodos de
purificación usados son esencialmente la filtración sobre gel de
intercambio iónico, y la cromatografía de exclusión o la
cromatografía de afinidad (proteína A o G). Se detecta
sistemáticamente un número suficiente de anticuerpos en ensayos
funcionales para identificar los anticuerpos más productivos. La
producción in vitro de anticuerpos, de fragmentos de
anticuerpos o de derivados de anticuerpos, tales como anticuerpos
quiméricos producidos mediante ingeniería genética, es bien conocida
por el experto en la
técnica.
técnica.
Mediante la expresión "anticuerpo
transmembránico" se entiende un anticuerpo en el que al menos la
región funcional capaz de reconocer y unirse a su antígeno
específico se expresa en la superficie de las células dianas para
permitir dicho reconocimiento y unión. Más particularmente, los
anticuerpos consisten en polipéptidos de fusión que comprenden
aminoácidos que definen dicha región funcional y una secuencia de
aminoácidos (polipéptido transmembránico), que permiten el anclaje
en el seno de la doble capa lipídica membranaria de la célula diana,
o en la superficie externa de esta bicapa. Las secuencias nucleicas
que codifican numerosos polipéptidos transmembránicos se describen
en la bibliografía.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos, por ejemplo murinos, son anticuerpos quiméricos que
comprenden una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no
humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se
sustituyen restos de una región hipervariable del receptor por
restos de una región hipervariable de una especie donante
(anticuerpo donante) no humana, tal como ratón, rata, conejo o
primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad
deseadas. En algunos casos, los restos (FR) de la región Fv de la
inmunoglobulina humana se sustituyen por restos correspondientes no
humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender
restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el
anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para mejorar
los rendimientos del anticuerpo. Generalmente, el anticuerpo
humanizado comprenderá al menos y preferentemente dos dominios
variables, en los que todos o más o menos todos los bucles
hipervariables corresponden a una inmunoglobulina no humana, y todas
o más o menos todas las regiones FR serán las de una inmunoglobulina
humana. Los anticuerpos humanizados, opcionalmente, podrán asimismo
comprender al menos una parte de una región constante (Fc) de una
inmunoglobulina, tal como una inmunoglobulina humana (Jones et
al., Nature 321: 522-525 (1986);
Reichmann et al., Nature 332: 323-329
(1988); y Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2:
593-596 (1992).
Mediante la expresión "fragmento de
anticuerpo" se entiende los fragmentos F(ab)2, Fab,
Fab', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology
159: 5821-5833 y Bird et al., 1988,
Science 242: 423-426) de un anticuerpo
nativo, y por "derivado" se entiende, entre otros, un derivado
quimérico de un anticuerpo nativo (véase, por ejemplo, Arakawa et
al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 y
Chaudray et al., 1989, Nature 339:
394-397).
Estos anticuerpos se pueden incorporar en una
composición farmacéutica, en particular cuando se trata de
anticuerpos neutralizantes, para responder a una infección vírica
mediante VIH-1.
Finalmente, la invención se refiere a un
procedimiento de evaluación de un agente terapéutico, según el cual
se administra a un animal no humano al menos un gen mutado que
codifica una glicoproteína de cubierta mutada del virus
VIH-1 tal como se describe anteriormente, y se
realiza:
- -
- una determinación de anticuerpos específicos de gp120 mutada, y/o
- -
- una determinación de los anticuerpos neutralizantes específicos de la glicoproteína mutada o nativa que inducirán una disminución de la capacidad infecciosa del virus, y/o
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- una determinación de la respuesta inmune celular inducida contra gp120 mutada, por ejemplo mediante un ensayo de activación in vitro de células de linfocitos T "auxiliares" específica(s) de la glicoproteína muta-da.
Para una mejor comprensión de la parte
experimental que sigue, es aconsejable repasar brevemente el
mecanismo de infección del VIH-1. Durante la
infección, gp120 se une al receptor CD4. Tras esta interacción,
gp120 sufre una reorganización estructural liberando epítopos
denominados "CD4 inducidos" que permiten la unión del
correceptor. La unión del CD4, y después la del correceptor, son
sucesos prerrequeridos para el anclaje del péptido de fusión de gp41
en la membrana celular, y por lo tanto la infección de la
célula.
La figura 1 esquematiza la definición de los
agrupamientos y la proximidad de cada sitio en la molécula de gp120
cristalizada.
La figura 2 representa la detección de gp160
(\boxempty) y de gp120 (\boxslash) en cada lisado celular para
cada uno de los mutantes producidos, y para los controles.
La figura 3A representa la antigenicidad
evaluada mediante ELISA en los lisados celulares con respecto a un
conjunto de sueros VIH positivos, y la figura 3B representa la
antigenicidad evaluada mediante ELISA en los sobrenadantes de
cultivo con respecto al conjunto de sueros VIH positivos.
La figura 4A representa la cantidad de CD4
detectada en los lisados celulares, y la figura 4B representa la
cantidad de CD4 detectada en los sobrenadantes de cultivo.
La figura 5A representa el reconocimiento del
epítopo F105 evaluado mediante ELISA en los sobrenadantes de
cultivo, y la figura 5B representa el reconocimiento del epítopo
F105 evaluado mediante ELISA en los lisados celulares.
La figura 6A representa el reconocimiento del
epítopo CG10 en presencia de CD4 evaluado mediante ELISA, en los
lisados celulares, y la figura 6B representa el reconocimiento del
epítopo CG10 solo (\blacksquare) y en presencia de CD4
(\boxempty), evaluado mediante ELISA, en los sobrenadantes de
cultivo.
La figura 7A representa el reconocimiento del
epítopo 17b solo (\boxempty) y en presencia de CD4 (\boxslash),
evaluado mediante ELISA, en los lisados celulares, y la figura 7B
representa el reconocimiento del epítopo 17b solo (\boxempty) y en
presencia de CD4 (\boxslash), evaluado mediante ELISA, en los
sobrenadantes de cultivo.
La figura 8 ilustra la neutralización del virus
FR (virus primario X4) sobre células Hela P4PCCR5 con el suero de
ratones inmunizados con distintos constructos (Ejemplo 4).
La figura 9 ilustra la infección, mediante
pseudopartículas que portan las glicoproteínas mutadas identificadas
en la tabla 2, de células GHOST-CCR5 y
GHOST-CXCR4.
La figura 10 ilustra la neutralización de las
pseudopartículas que portan las glicoproteínas mutadas con un suero
humano CRI/LY neutralizante.
Se cotransfectan células 293T (células
epiteliales de riñón) con cada uno de los constructos
PCI-env, y el plásmido de expresión
PCI-rev, con la ayuda del kit
Lipofectamine-Plus (Gibco-BRL) según
las instrucciones del fabricante. Rev es una proteína de regulación
del VIH-1 que tiene un papel importante en la
expresión de la proteína de cubierta. Cuarenta y ocho horas tras la
transfección, el sobrenadante de cultivo y las células se recuperan
y se ensayan mediante transferencia Western con un anticuerpo
policlonal de oveja anti-gp120 (Biogenesis) diluido
al 1/5000. Para ello, las muestras se depositan sobre un gel
desnaturalizante de acrilamida al 8%. Después de la separación, las
muestras se transfieren sobre una membrana de PVDF (ImmobilonP,
Amersham) según las instrucciones del fabricante. Para los lisados,
la normalización de las muestras se efectúo con un anticuerpo
monoclonal anti-Actina diluido al 1/5000 (A4700,
Sigma) y un anticuerpo monoclonal anti-Rev 2D4D10
diluido al 1/5000 (bioMérieux). Para los sobrenadantes, la
normalización se efectúo según el porcentaje de albúmina sérica del
medio de cultivo. La revelación de las manchas se efectúa con la
ayuda del kit ECF (Amersham), y las bandas reveladas se cuantifican
en un aparato Typhoon 8600 gracias al programa de ordenador
ImageQuant. Todos los constructos expresan una proteína que
reacciona con el policlonal anti-gp120. La migración
de las proteínas mutantes está afectada por la pérdida de una o
varias glicosilaciones. La disminución de gp120 detectada en el
lisado celular se asocia con el aumento del número de mutaciones
(figura 2). A veces, la banda específica está totalmente ausente
(mutantes g1112, g122, g13, g113, g14, g123, g1123 y DV1V2). Está
asimismo ausente del sobrenadante de cultivo correspondiente: se
puede pensar que el grado de ruptura está afectado. Moulard (15) ha
descrito este fenómeno que asocia con una mala translocación en el
RE y/o un defecto de plegamiento que impide la accesibilidad del
sitio de ruptura. Por el contrario, para el mutante g14, se detecta
una cantidad importante de gp120 en el sobrenadante (aproximadamente
8x más que la proteína nativa, con cantidad de proteína
normalizada), mientras que ésta no se detecta en el lisado celular.
Por lo tanto, parece ser que las mutaciones presentes sobre este
clon afectan las interacciones que unen entre sí las subunidades de
la cubierta, y no el grado de ruptura de gp160. El grado de ruptura
para los mutantes individuales es generalmente comparable a aquel
observado para la cubierta nativa (excepto para el mutante g21). Es
interesante observar que, en comparación, el mutante que corresponde
a la desglicosilación total del bucle V1 parece poco afectado por la
pérdida de 3
glicosilaciones.
glicosilaciones.
Cuarenta y ocho horas después de la
transfección, las células 293T que expresan los distintos mutantes
se subcultivan al 1/10, y se ponen en contacto con células
GHOST-CCR5 o -CxCR4 al 50% de densidad.
Después de 16 horas de cocultivo, las células se
fijan 15 minutos con glutaraldehído al 0,5%, y después los núcleos y
los citoplasmas se tiñen en May-Grünwald/Giemsa.
La observación y el recuento de los sincitios
formados se aprecian mediante observación con microscopio óptico
invertido.
Para las células GHOST-CCR5, la
capacidad para inducir sincitios disminuye cuando aumenta el número
de mutaciones. Es nula para los clones que no están rotos (g113,
g1123 y quizá g1112). Este resultado confirma los resultados
anteriores, y dan una indicación sobre el mantenimiento de la
funcionalidad de las distintas cubiertas después de la mutación. Los
constructos no inducen la formación de sincitios en células
indicadoras CXCR4 tal como se pudo demostrar por Pollakis (16)
después de la desglicosilación parcial del bucle V3 de gp160
ADA.
Los resultados se presentan en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los lisados y los sobrenadantes se ensayaron en
ELISA de captura con un conjunto de sueros VIH+ que proceden del
hospital de la Croix-Rousse en Lyon. Este conjunto
de sueros está constituido de 2 muestras subtipo B y de una muestra
subtipo C. Todos los resultados de ELISA corresponden a la media de
2 experimentos realizados por duplicado. El formato del ensayo es el
siguiente:
- -
- Anticuerpo de captura: D7324 (dirigido contra el sitio de ruptura alterno situado en la región C5; Aalto) a 1 \mug/ml en PBS1x o 12G10B11 (dirigido contra gp41, bioMérieux) a 5 \mug/ml en PBS1x; incubación toda la noche a 6ºC,
- -
- Saturación mediante PBS1x-Tween al 0,1%-leche desnatada en polvo al 3%; incubación durante 1 hora a 22ºC,
- -
- Lisados diluidos al 1/10 en PBS-NP40 al 1%-BSA 20 \mug/ml, o sobrenadantes puros; incubación durante 2 horas a 22ºC,
- -
- Conjunto de sueros VIH+ diluido al 1/100 en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA 20 \mug/ml; incubación durante 1 hora a 22ºC,
- -
- Conjugado de anticuerpo anti-Fc de IgG humana acoplado a peroxidasa (Jackson) diluido al 1/5000 en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA 20 \mug/ml; incubación durante 30 minutos a 22ºC,
- -
- Revelación mediante una mezcla de 20 mg OPD (Pierce) y 10 ml de Color2 (BioMérieux); incubación durante 15 minutos a 22ºC antes de la lectura a 492 nm en un lector de placas (Biorad).
Entre cada incubación, se efectúan 4 lavados con
PBS1x-Tween al 0,1% mediante un lavador de placas
Biorad.
Los sobrenadantes se capturan mediante el
anticuerpo D7324; los lisados se capturan mediante D7324, o mediante
12G11B10. Este último se usó principalmente porque el epítopo D7324
está poco expuesto en moléculas gp160 no escindidas, y la señal
detectada depende entonces del grado de ruptura de los distintos
mutantes.
Los resultados muestran que la pérdida de
capacidad antigénica está correlacionada con el número de
mutaciones. Los resultados sobre en lisados (revestimiento de
12G11B10) y en los sobrenadantes coinciden y confirman la ausencia
de gp120 en los sobrenadantes para los mutantes g113 y g1123.
2G12 es un anticuerpo monoclonal humano obtenido
mediante electrofusión de PBL VIH+ y células CB-F7
(17). Tiene un poder neutralizante de amplio espectro sobre aislados
primarios y algunos virus TCLA. El epítopo reconocido por este
anticuerpo es discontinuo y cubre principalmente las regiones V3 y
V4, así como algunos azúcares presentes en estas regiones. El
reconocimiento de 2G12 se evaluó mediante ELISA en los lisados
celulares y en los sobrenadantes de los distintos mutantes. El
formato del ensayo es el mismo que el anterior, excepto para el
anticuerpo de detección que es el 2G12 (1 \mug/ml). No se detecta
ninguna señal positiva, incluso para la proteína
133-nativa. Este resultado confirma aquellos
resultados obtenidos en RIPA y en ELISA por el equipo de D. Brand
(Tours) en la cubierta 133. Parren, en 1998, describió un aislado
primario resistente a los tres anticuerpos neutralizantes 2G12, 2F5
y B12. Sus resultados indican que esta resistencia se debe
probablemente a un cambio global de la estructura oligomérica de la
cubierta.
La glicoproteína de cubierta tiene la capacidad
de unirse a CD4 con una afinidad elevada. Esta capacidad de unión es
primordial en el proceso de infección.
- Unión del CD4 soluble (CD4). Se uso el formato
ELISA siguiente:
- -
- Revestimiento D7324 (sobrenadante) o 12G11B10 (lisado).
- -
- Saturación.
- -
- Lisado diluido al 1/10 o sobrenadante puro.
- -
- CD4 (NIAID) diluido al 1 \mug/ml en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA 20 \mug/ml; incubación durante 2 horas a 22ºC.
- -
- Anticuerpo policlonal anti-CD4 biotinilado diluido con 1 \mug/ml en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA 20 \mug/ml; incubación durante 1 hora a 22ºC.
- -
- Estreptavidina-peroxidasa (Jackson) diluido al 1/10000 en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA 20 \mug/ml; incubación durante 30 minutos a 22ºC.
- -
- Revelación con una mezcla de 20 mg de OPD (Pierce) y 10 ml de Color2 (bioMérieux).
- -
- Lectura a 492 nm.
La cantidad de CD4 detectada varía de la misma
manera en los lisados y en los sobrenadantes (figura 4). La
intensidad de la señal es función del número de sitios
desglicosilados, a excepción de los mutantes g12 y g14 que
corresponden a mutaciones dobles. Los clones que corresponden a
proteínas de cubierta, para las cuales está reducida la capacidad
antigénica o el grado de ruptura, tienen una señal baja (g122, g13,
g113, g123 y g1123).
Se describe que este anticuerpo monoclonal
humano tiene una importante actividad neutralizante tanto en
aislados primarios (clado A-D) como en cepas de
laboratorio. El epítopo es discontinuo y cubre el sitio de unión a
CD4. El reconocimiento se realiza preferentemente sobre los
oligómeros en la superficie de las células infectadas o de los
virus, a expensas de los "desechos" que impiden una respuesta
neutralizante eficaz.
No se observó ninguna señal positiva
independientemente de los clones ensayados. Esto está de acuerdo con
los resultados previos de D. Brand en la cubierta 133. IgG1b12 se
describe como muy sensible a sustituciones a nivel de los bucles V1
y V2. También se describe que ciertos aminoácidos en las regiones C2
y C3 tienen un papel importante en el reconocimiento del epítopo b12
(18). Una de las particularidades de la cubierta 133 es que tiene
una secuencia proteica atípica en comparación con otras proteínas de
cubierta del mismo subtipo.
El anticuerpo monoclonal humano F105 se une en
la vecindad del sitio de unión a CD4. El CD4 puede inhibir su unión.
El anticuerpo F105 neutraliza las cepas TCLA. Algunos autores han
descrito una neutralización para algunos aislados primarios (19),
pero los resultados son muy controvertidos.
La unión de este anticuerpo se ensayó sobre los
lisados y los sobrenadantes. El formato del ensayo es el mismo que
aquel utilizado con 2G12. El anticuerpo F105 (NIBSC) se usa con una
concentración de 1 \mug/ml. Se observa una señal importante para
el clon g12 (hasta 4,5 x la señal de la proteína nativa a una
cantidad de proteína equivalente). La mutación nº 294 presente en
g12 (pero no en g2) se sitúa a nivel del bucle V3; se sabe que la
unión de F105 a glicoproteínas, a las que se les ha suprimido V3,
mejora. Otras mutaciones parecen tener un papel importante en el
reconocimiento de la proteína mediante el anticuerpo. Este es el
caso de la mutación nº 255, que está presente en los clones g13 y
g113. Se localiza en un péptido de C2 descrito como importante para
escapar de la neutralización por F105 (20). No hay señal para los
mutantes g1112 y los de la serie g22/g122.
La unión de CD4 induce cambios de conformación,
y permite la formación de novo de epítopos, cuya emergencia
condiciona la unión del correceptor.
- -
- Reconocimiento del epítopo CG10 (figura 6). CG10 es un anticuerpo monoclonal murino capaz de neutralizar ciertas cepas TCLA. Se unión en la proximidad de la "lámina de puente" en competición con el 17b. Su unión depende estrictamente del CD4 (21).
El ensayo ELISA usado tiene el siguiente
formato:
- Revestimiento: D7324 (sobrenadantes) o 12G11B10 (lisados).
- Saturación.
- Lisados diluidos al 1/10 o sobrenadantes puros.
- Adición (o no) de CD4 a 1 \mug/ml diluido en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA 20 \mug/ml; incubación durante 2 horas a 22ºC.
- CG10 (donación de Francisco Veas, UMR 5087, Montpellier) a 1 \mug/ml diluido en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA de 20 \mug/ml; incubación durante 1 hora a 22ºC.
- Conjugado de anticuerpo anti-IgG de ratón acoplado con peroxidasa (Jackson) diluido al 1/5000 en PBS1x-Tween al 0,1%-BSA 20 \mug/ml.
- Revelación: 20 mg de OPD (Pierce), y 10 ml de Color2 (bioMérieux).
- Lectura a 492 nm.
Los resultados mediante ELISA muestran un buen
reconocimiento del epítopo CG10 en presencia de CD4 y para la
mayoría de las proteínas de cubierta, con excepción de los mutantes
g122, g13, g113, g123 y g1123. La señal se correlaciona bien con el
porcentaje de unión al CD4 (véase figura 5). El uso de CG10 solo
conduce a una ausencia de señal.
- -
- Reconocimiento del epítopo 17b (véase figura 7). El epítopo 17b es un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra un epítopo CD4 inducido. Tiene una actividad neutralizante limitada tanto para los aislados primarios como para las cepas TCLA. Aunque la exposición del epítopo no depende estrictamente de la unión del CD4, ésta, sin embargo, mejora su presencia. El formato de ELISA usado es el mismo que para CG10. El anticuerpo 17b se usa a una concentración de 1 \mug/ml. La detección se realiza con un anticuerpo anti-Fc IgG humano acoplado con peroxidasa y diluido al 1/5000 (Jackson). En el experimento, se observa que ciertos mutantes tienen un buen reconocimiento de este anticuerpo, y especialmente los mutantes g12/g112, g3 y g4/g14. Para g12, la señal es de aproximadamente 3 x mayor que aquella observada para la proteína nativa a una cantidad de proteína equivalente. Las mutaciones presentes en g12/g112 se refieren al bucle V3 y al comienzo de la región C3. Según Wyatt (11), V2 y V3 cubrirían parcialmente el epítopo 17b, y es la fijación del CD4 lo que permitiría una retirada del bucle V2. Se puede imaginar que la desglicosilación del bucle V3 (NB: el bucle V3 de la secuencia 133 tiene un solo sitio potencial de glicosilación), y de los sitios situados en su base permitirían al mismo tiempo desenmascarar parcialmente el bucle V3 y un aumento de su flexibilidad, lo que podría como consecuencia conducir a una mejor accesibilidad del epítopo 17b.
Los experimentos detallados anteriormente
muestran el interés de los mutantes g12, g112 y g14 frente a sus
características antigénicas y funcionales.
La capacidad inmunógena de los mutantes g12 y
g112 (buena afinidad por F105 y por 17b) debe de ser buena. Los
mutantes de la serie g4/g14 son interesantes porque tienen una buena
reactividad frente a los distintos anticuerpos ensayados.
Según los resultados de ELISA, se eligió el
panel de mutantes siguiente: g12, g112, g14. El mutante g13 también
se evaluó debido al posicionamiento en agrupamiento de los sitios
mutados sobre la superficie "silenciosa" del dominio externo de
gp120. Se utilizaron como referencias el mutante g123 (mutante no
agrupado), así como el gen de cubierta salvaje.
Cada gen de cubierta se subclonó en un vector
pCi-Rev que deriva del vector
pCi-Neo (Promega) mediante sustitución del gen de la
neomicina por el gen Rev que se encuentra entonces bajo el
control del promotor SV40. Cada constructo se preparó con un kit de
extracción de plásmido libre de endotoxina
(Macherey-Nagel PC2000 EF).
Las inmunizaciones se efectuaron de la siguiente
manera: para cada constructo, se inmunizaron 5 ratones Balb/C
hembras mediante balas biológicas (GeneGun, Biorad) con la ayuda de
partículas de oro recubiertas previamente con 4 \mug de plásmido a
inyectar. Se administraron cinco inyecciones sucesivas a D0, D14,
D28, D54 y D68. A D40 y D80, se tomaron muestras de sangre del ojo
de los animales. Estas muestras servían para ensayar el aumento de
los anticuerpos dirigidos contra la cubierta después de las
distintas inmunizaciones. Para ello, se efectuaron ensayos ELISA: se
adsorbió proteína de cubierta gp160 (ABL) diluida hasta 1 \mug/ml
sobre placas de 96 pocillos (Nunc). Tras saturación de los sitios no
específicos, los sueros de ratones inmunizados en los días D0, D40
y D80 se utilizaron a diluciones que oscilan de 1/100 hasta 1/800, y
después se revelaron con un anticuerpo acoplado a peroxidasa de
rábano picante dirigido contra los anticuerpos de ratón (Jackson).
Se considera significativa una lectura de DO mayor que 0,35. La
tabla 5 siguiente recapitula los ratones positivos obtenidos para
cada constructo.
| Constructos | Ratones "positivos" en ensayo ELISA | |
| pCI-Rev-g12 | S3, S4 | |
| pCI-Rev-g112 | S1, S2 | |
| pCI-Rev-g13 | S5 |
| Constructos | Ratones "positivos" en ensayo ELISA | |
| pCI-Rev-g14 | S3, S4 | |
| pCI-Rev-g123 | S2, S4, S5 | |
| pCI-Rev-env salvaje | S1, S2, S3, S4 |
Los sueros de estos ratones se usaron en dos
ensayos de neutralización descritos a continuación:
a- El virus FR (virus primario X4) se puso en
contacto con diluciones en serie (a 1/10, 1/20 y 1/40) de los
distintos sueros de ratones durante 1 hora a 37ºC en un medio DMEM
(Euromedex), y después se añadió en placas de 96 pocillos en las que
se cultivaron previamente células Hela P4PCCR5. Estas células poseen
el receptor CD4 y los correceptores CCR5 y CXCR4. Tienen el gen de
la \beta-galactosidasa, bajo el control de un LTR
retrovírico. Después de 1 hora de cocultivo, se añaden 200 \mul de
medio DMEM que contiene 5% de suero fetal de ternero. Entonces, las
células se incuban 48 horas a 37ºC. Al final de este periodo de 24
horas, la expresión de la \beta-galactosidasa se
revela gracias a una disolución de X-gal de 400
\mug/ml en ferricianuro de potasio de 0,2M/ferrocianuro de potasio
de 0,2M/MgCl_{2} 2M. El porcentaje de neutralización corresponde
al porcentaje de células no infectadas, para las cuales no se indujo
la síntesis de \beta-galactosidasa. Se efectuaron
ensayos en paralelo con un virus pero sin suero de ratones (control
de infección) o con suero de ratones no inmunizados (control del
ruido de fondo de la neutralización, Tneg). Los resultados obtenidos
se resumen en la tabla 6 siguiente y en la figura 8.
| TnegS1 | 30 | 30 | 30 |
| TnegS2 | 30 | 30 | 30 |
| g12-S3 | 75 | 65 | 40 |
| g12-S4 | 70 | 30 | 30 |
| g13-S5 | 30,5 | 30 | 30 |
| g14-S3 | 70 | 50 | 30 |
| g14-S4 | 75 | 50 | 30 |
| g112-S1 | 30,2 | 30 | 30 |
| g112-S2 | 29,7 | 30 | 30 |
| g123-S3 | 30,5 | 30 | 30 |
| g123-S4 | 31,5 | 30 | 30 |
| g123-S5 | 31 | 30 | 30 |
| wt-S1 | 30,7 | 30 | 30 |
| wt-S1 | 30,5 | 30 | 29,7 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se observa que, para la mayoría de los sueros,
no hay respuesta neutralizante que se diferencie del ruido de fondo
(aproximadamente 30% de neutralización). Sin embargo, para los
constructos pCI-rev-g12 y
pCI-rev-g14, los ratones positivos
en el ensayo de ELISA (respectivamente S3/S4) dan una respuesta
neutralizante significativa a la dilución 1/10 (70% de
neutralización). Este porcentaje es más bajo para una dilución a
1/20, y vuelve al valor del ruido de fondo para una dilución a 1/40,
excepto para el ratón S3 inmunizado mediante
pCI-rev-g12, cuyo valor es
ligeramente mayor (40%).Los sueros de los ratones inmunizados
mediante constructos no mutados
(pCI-rev-env salvaje = wt) y
positivos en el ensayo ELISA, no son neutralizantes en este formato
de ensayo.
b- Los sueros de ratones se evaluaron para
determinar su capacidad para neutralizar la infección de células
permisivas mediante pseudopartículas que llevan la cubierta 133
salvaje (= autóloga no mutada). Los sueros de ratones positivos así
como 2 sueros de ratones no inmunizados se incubaron durante 1 hora
a 37ºC en diluciones en serie (desde 1/8 hasta 1/128) con los
sobrenadantes de cultivo que contenían las pseudopartículas. Las
pseudopartículas que llevan la cubierta 133 salvaje se obtuvieron de
la siguiente manera: se cotransfectaron células 293T mediante el
constructo pCI-env133 y mediante el plásmido pNL4-3luc
(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program), con una relación
pNL4-3luc/pCI-env133 de 1/3. Esta transfección se
realiza gracias al kit Calcium Phosphate Transfection System
(Gibco). El plásmido pNL4-3luc permite expresar todos los
genes víricos salvo vpr y env (desplazamiento de marco), así como el
gen de luciferasa. Además, se forman pseudopartículas víricas que
llevan las cubiertas recombinantes 133 salvajes. Cuarenta y ocho
horas después de la transfección, se recuperan los sobrenadantes de
cultivo y se centrifugan a fin de eliminar los restos celulares.
Después, se completan hasta 20% con suero fetal de ternero, y se
toman alícuotas y se almacenan a -80ºC. Una evaluación de la p24,
realizada sobre el dispositivo automatizado VIDAS (bioMérieux),
permite evaluar la cantidad de partículas víricas presentes en estos
sobrenadantes.
La infección de células
GHOST-CCR5 o GHOST-CXCR4 (NIH AIDS
Research and Reference Reagent Program; estas células expresan CD4)
se efectúa durante la noche, en placas de cultivo de 96 pocillos,
mediante contacto con un volumen de sobrenadante que contiene las
pseudopartículas previamente puestas en contacto con los sueros (10
ng de equivalente de p24 por pocillo). Después, se añade un medio de
cultivo. Después de 3 días adicionales de incubación, se eliminan
los sobrenadantes, y las células se aclaran con PBS 1x. La lisis y
la reacción enzimática se efectúan con el kit LucLite Plus (Perkin
Elmer); la lectura de luminiscencia se realiza en un lector de
placas TopCount (Packard Biosciences).
Los resultados muestran que para los sueros
g12-S3, g14-S3 y
g14-S4, se observa una ligera neutralización para
una dilución al 1/8 puesto que, para estas muestras, la
luminiscencia es de aproximadamente 23% menor que aquella observada
para los sueros de ratones antes de la inmunización
(V_{g19-S3} = 85.000 frente a V_{T0} = 111.000).
Estos resultados parecen ir en el mismo sentido que aquellos
descritos en el experimento anterior. La excepción viene del suero
g12-S4 para el cual no se observa ninguna actividad
neutralizante.
La obtención de pseudopartículas que expresan
los distintos mutantes de desglicosilación es importante porque
permite estudiar la proteína de cubierta en su entorno natural, es
decir integrada en una partícula vírica.
Se cotransfectaron células 293T con cada uno de
los constructos pCI-env mutados (mutantes de
desglicosilación, véase lista en la tabla 2), y con el plásmido
pNL4-3luc (NIH AIDS Research and Reference Reagent
Program) según el protocolo descrito en el ejemplo 1 anterior.
Cuarenta y ocho horas después de la
transfección, los sobrenadantes de cultivo se recuperan y se
centrifugan a fin de eliminar los restos celulares. Después, se
completan hasta 20% con suero fetal de ternero, se toman alícuotas y
se almacenan a -80ºC. Una evaluación de la p24, realizada en un
dispositivo automatizado VIDAS (bioMérieux), permite evaluar la
cantidad de partículas víricas presentes en estos sobrenadantes.
La infección de células
GHOST-CCR5 o GHOST-CXCR4 (NIH AIDS
Research and Reference Reagent Program) se efectúa durante la noche,
en placas de cultivo de 24 pocillos, mediante contacto con un
volumen de sobrenadante que corresponde a 50 ng de p24 por pocillo.
Entonces, se renueva el medio de cultivo. Después de 3 días
adicionales de incubación, se eliminan los sobrenadantes, se aclaran
las células con PBS 1x, y se lisan mediante 300 \mul de CCLR (Cell
Culture Lysis Reagent de Promega) durante 15 minutos. Se pone en
contacto un volumen de 20 \mul de estos lisados con 80 \mul de
sustrato (Luciferase Assay System de Promega), y se mide la
luminiscencia en un luminómetro (Turner Desings TD 20/20). Los
resultados se agrupan en la figura 9.
Este experimento indica que, cuanto mayor sea el
número de mutaciones, menor es la capacidad de las cubiertas
recombinantes para inducir la infección de las células
GHOST-CCR5. Es nula para los constructos en los que
hay poca ruptura o nada. Ningún mutante induce la infección de las
células GHOST-CXCR4. Estos resultados están de
acuerdo con los ensayos de formación de sincitios descritos
anteriormente (véase tabla 4). Sin embargo, no se detecta ninguna
infección para los mutantes g112, g122, g13 y g123, mientras que se
observaba una ligera actividad de fusión célula hacia célula. Para
el mutante g14, usado en los experimentos de neutralización, se
observa un bajo porcentaje de infección. Con el fin de completar
este estudio, se controló la presencia de la proteína de cubierta en
los viriones. Para ello, se concentraron y se purificaron las
pseudopartículas mediante ultracentrifugación en un cojín de
sacarosa al 20% durante 3 horas a 70.000 g. Los peletes se lisaron
en PBS-Triton al 0,5%, y una evaluación de la p24
permitió normalizar las muestras. Entonces, se realizó una
transferencia Western usando un anticuerpo policlonal
anti-gp120 (Biogenesis). Env se detecta únicamente
en las pseudopartículas que infectan las células GHOST: cuando se
aumenta el número de sitios desglicosilados, parece que se afecta la
exportación de la proteína de cubierta hacia la membrana plásmica,
así como también la incorporación de la cubierta en las
pseudopartículas.
\newpage
Finalmente, se evaluó la sensibilidad de estas
pseudopartículas frente a sueros neutralizantes: antes de la
infección de células indicadoras GHOST-CCR5, los
sobrenadantes de cultivo que contienen las pseudopartículas se
incuban durante 1 hora a 37ºC en presencia de diluciones en serie de
suero humano. Se trata del suero GRI/LY (donación del Dr C. Moog,
INSERM U544, Estrasburgo), cuyo título neutralizante se determinó
para 5 aislados primarios de distintos subtipos. Paralelamente, los
sueros VIH-1 neutralizantes de referencia #1 y #2
(NIBSC) se usaron como un control en las pseudopartículas que llevan
la cubierta 133 nativa. El protocolo de infección es similar a aquel
descrito más arriba. La infección se realiza en placas de 96
pocillos por contacto con un volumen equivalente a 10 ng de p24. La
lisis y la reacción enzimática se efectúan con el kit LucLite Plus
(Perkin Elmer). La lectura de luminiscencia se realiza en un lector
de placas TopCount (Packard Biosciences).
Los resultados se ilustran en la figura 10.
La curva "de suero negativo" corresponde a
un experimento llevado a cabo en pseudoviriones que expresan la
cubierta salvaje puesta en presencia de un suero
VIH-1 negativo (CTS Lyon-Gerland).
Es la curva que determina el ruido de fondo. La neutralización es
efectiva para una dilución de suero mayor que 1/640.
Estos resultados muestran que las
pseudopartículas se neutralizan de manera distinta según la cubierta
expresada en su superficie. Sin embargo, sólo los mutantes g30 y g22
ven su porcentaje de infección significativamente reducido con
relación a la cubierta salvaje (no mutada). Incluso si no hay
correlación directa entre este experimento y la capacidad de tal
mutante para inducir anticuerpos neutralizantes in vivo, el
mutante g22 podría ser un candidato interesante a ensayar para
determinar su capacidad para inducir anticuerpos neutralizantes
después de la inmunización de ADN de pequeños animales.
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> VIH1-m
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<151> 06/09/2001
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIH-1 133
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIH-1 mutante
g12
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2007
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2007
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g14 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g14 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2007
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g14 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> 133 de VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g12 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> g12 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> g112 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g112 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> g14 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
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<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g14 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g14 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g22 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2007
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g22 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1494
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g22 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 844
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g22 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g22 mutante de
VIH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g22 mutante de
VIH-1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
Claims (27)
1. Gen env mutado que codifica para una
glicoproteína de cubierta mutada del virus VIH-1 de
un aislado primario, caracterizado porque dicho gen
presenta con relación al gen env de un aislado primario de
primo-infección, denominado de referencia, al menos
dos mutaciones a nivel de los sitios de glicosilación conservados de
un aislado primario a otro, consistiendo cada mutación en la
sustitución de un codón AAC o AAT que codifica para una asparagina
por un codón CAG o CAA que codifica para una glutamina, siendo las
dos mutaciones seleccionadas al menos de entre las siguientes:
- (a)
- al menos dos mutaciones en la parte del gen env que codifica para la región C3 de la proteína Env,
- (b)
- al menos una mutación en la parte que codifica para la región C3, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3,
- (c)
- al menos una mutación en la parte que codifica para la región C2, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de los codones 862-864 y 970-972,
- (d)
- al menos una mutación en la parte que codifica para la región C2 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de los codones 667-669, 679-681, 700-702, 763-765, 844-846, y al menos una mutación en la parte que codifica para la región V3,
pudiendo la posición de al menos uno cualquiera
de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos, o
el gen env mutado consiste en una cualquiera de las secuencia SEC.
ID nº: 8, SEC. ID nº: 9 o SEC. ID nº: 10, o sus secuencias
complementarias.
2. Gen según la reivindicación 1,
caracterizado porque, según las mutaciones (a), se efectúa al
menos una mutación a nivel de los codones 976-978,
991-993 de la parte que codifica para la región C3,
y se efectúa al menos una mutación a nivel de los codones
1039-1041 ó 1060-1062 de la parte
que codifica para la región C3, pudiendo la posición de al menos uno
cualquiera de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro
nucleótidos.
3. Gen según la reivindicación 2,
caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia
seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº:
21, SEC. ID nº: 22 y SEC. ID nº: 23, o sus secuencias
complementarias.
4. Gen según la reivindicación 1,
caracterizado porque, según las mutaciones (b), se efectúa al
menos una mutación a nivel de los codones 976-978,
991-993, 1039-1041 o
1060-1062 de la parte que codifica para la región
C3, y se efectúa al menos una mutación a nivel del codón
880-882 de la parte que codifica para la región V3,
pudiendo la posición de al menos uno cualquiera de dichos codones
variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos.
5. Gen según la reivindicación 4,
caracterizado porque las mutaciones se efectúan a nivel de
los codones 976-978, 991-993 y
880-882, pudiendo la posición de al menos uno
cualquiera de dichos codones variar de tres hasta veinticuatro
nucleótidos.
6. Gen según la reivindicación 5,
caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia
seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº: 2,
SEC. ID nº: 3 y SEC. ID nº: 4, o sus secuencias complementarias.
7. Gen según la reivindicación 4,
caracterizado porque se efectúa al menos una mutación a nivel
del codón 976-978 ó 991-993, se
efectúa al menos una mutación a nivel del codón
880-882, y se efectúa al menos una mutación a nivel
del codón 1039-1041 ó 1060-1062,
pudiendo la posición de al menos uno cualquiera de dichos codones
variar de tres hasta veinticuatro nucleótidos.
8. Gen según la reivindicación 7,
caracterizado porque las mutaciones se efectúan a nivel de
los codones 976-978, 991-993,
880-882, 1039-1041 y
1060-1062.
9. Gen según la reivindicación 8,
caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia
seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº: 5,
SEC. ID nº: 6 y SEC. ID nº: 7, o sus secuencias
complementa-
rias.
rias.
10. Gen según la reivindicación 1,
caracterizado porque, según las mutaciones (c), se efectúa al
menos una mutación a nivel del codón 805-807 de la
parte que codifica para la región C2, pudiendo la posición de al
menos uno cualquiera de dichos codones variar de tres hasta
veinticuatro nucleótidos.
11. Gen según la reivindicación 1,
caracterizado porque, según las mutaciones (d), se efectúa al
menos una mutación a nivel del codón 880-882 de la
parte que codifica para la región V3, pudiendo la posición de al
menos uno cualquiera de dichos codones variar de tres hasta
veinticuatro nucleótidos.
12. Glicoproteína Env mutada del virus
VIH-1 de un aislado primario,
caracterizada porque presenta con relación a una proteína Env
nativa de un aislado primario de primo-infección,
denominado de referencia, al menos dos mutaciones a nivel de los
sitios de glicosilación de dicha proteína de referencia que se
conservan de un aislado a otro, consistiendo cada mutación en la
sustitución de una asparagina por una glutamina, siendo las dos
mutaciones seleccionadas al menos entre las siguientes:
- (a')
- al menos dos mutaciones en la región C3 de la proteína Env,
- (b')
- al menos una mutación en la región C3, y al menos una mutación en la región V3,
- (c')
- al menos una mutación en la región C2, y al menos una mutación en la región V3 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel del aminoácido 288 ó 324,
- (d')
- al menos una mutación en la región C2 seleccionada de entre los sitios de glicosilación a nivel de uno cualquiera de los aminoácidos 223, 227, 234, 255, 282, y al menos una mutación en la región V3,
pudiendo la posición de dichos sitios de
glicosilación conservados de un aislado primario de
primo-infección a otro variar de uno hasta ocho
aminoácidos,
o la glicoproteína Env mutada consiste en una
cualquiera de las secuencia SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 19 o SEC. ID
nº: 20.
13. Glicoproteína según la reivindicación 12,
caracterizada porque, según las mutaciones (a'), se efectúa
al menos una mutación en el sitio de glicosilación a nivel del
aminoácido 326 ó 331, y se efectúa al menos una mutación en el sitio
de glicosilación a nivel del aminoácido 347 ó 354, pudiendo la
posición de dichos sitios de glicosilación conservados de un aislado
primario de primo-infección a otro variar de uno
hasta ocho aminoácidos.
14. Glicoproteína según la reivindicación 13,
caracterizada porque su secuencia consiste en una secuencia
seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº:
21, SEC. ID nº: 22 y SEC. ID nº: 23.
15. Glicoproteína según la reivindicación 12,
caracterizada porque, según las mutaciones (b'), se efectúa
al menos una mutación a nivel del aminoácido 326 ó 331, y se efectúa
al menos una mutación a nivel del aminoácido 294, pudiendo la
posición de al menos uno cualquiera de dichos sitios de
glicosilación conservados de un aislado primario de
primo-infección a otro variar de uno hasta ocho
aminoácidos.
16. Glicoproteína según la reivindicación 15,
caracterizada porque las mutaciones se efectúan a nivel de
los aminoácidos 326, 331 y 294, pudiendo la posición de uno
cualquiera de dichos sitios de glicosilación conservados de un
aislado primario de primo-infección a otro variar de
uno hasta ocho aminoácidos.
17. Glicoproteína según la reivindicación 16,
caracterizada porque su secuencia consiste en una secuencia
seleccionada entra las secuencias identificadas en SEC. ID nº: 12,
SEC. ID nº: 13 y SEC. ID nº: 14.
18. Glicoproteína según la reivindicación 12,
caracterizada porque, según las mutaciones (b'), se efectúa
al menos una mutación a nivel del aminoácido 326 ó 331, y se efectúa
al menos una mutación a nivel del aminoácido 347 ó 354, y se efectúa
al menos una mutación a nivel del aminoácido 294, pudiendo la
posición de al menos uno cualquiera de dichos sitios de
glicosilación conservados de un aislado primario de
primo-infección a otro variar de uno hasta ocho
aminoácidos.
19. Glicoproteína según la reivindicación 18,
caracterizada porque las mutaciones se efectúan a nivel de
los aminoácidos 326, 331, 294, 347 y 354, pudiendo la posición de al
menos uno cualquiera de dichos sitios de glicosilación conservados
de un aislado primario de primo-infección a otro
variar de uno hasta ocho aminoácidos.
20. Glicoproteína según la reivindicación 19,
caracterizada porque su secuencia consiste en una secuencia
seleccionada de entre las secuencias identificadas en SEC. ID nº:
15, SEC. ID nº: 16 y SEC. ID nº: 17.
21. Glicoproteína según la reivindicación 12,
caracterizada porque, según las mutaciones (c'), se efectúa
al menos una mutación a nivel del aminoácido 269 de la región C2,
pudiendo la posición de al menos uno cualquiera de dichos sitios de
glicosilación conservados de un aislado primario de
primo-infección a otro variar de uno hasta ocho
aminoácidos.
22. Glicoproteína según la reivindicación 12,
caracterizada porque, según las mutaciones (d'), se efectúa
al menos una mutación a nivel del aminoácido 294 de la región V3,
pudiendo la posición de al menos uno cualquiera de dichos sitios de
glicosilación conservados de un aislado primario de
primo-infección a otro variar de uno hasta ocho
aminoácidos.
\newpage
23. Composición farmacéutica que comprende:
- (i)
- al menos un gen mutado que codifica una glicoproteína de cubierta mutada del virus VIH-1, siendo dicho gen mutado seleccionado de entre uno cualquiera de los genes descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y poniéndose bajo el control de secuencias de regulación que permiten su expresión en una célula hospedante,
- un vehículo farmacéuticamente aceptable, y
- de manera facultativa, un agente adicional que facilita la penetración de dicho gen mutado en dicha célula y/o que permite seleccionar como diana a dicha célula, o
- (ii)
- al menos el gen mutado identificado en (i) clonado en un vector vírico recombinante.
24. Composición farmacéutica que comprende:
- -
- al menos una glicoproteína de cubierta mutada del virus VIH-1, siendo dicha glicoproteína mutada seleccionada de entre cualquiera de las glicoproteínas descritas en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22,
- -
- un vehículo y/o excipiente y/o adyuvante y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.
25. Procedimiento para obtener anticuerpos según
el cual se inmuniza un animal mamífero no humano, tal como ratón o
rata o mono, con al menos un gen mutado que codifica una
glicoproteína de cubierta mutada del virus VIH-1,
siendo dicho gen mutado seleccionado de entre cualquiera de los
genes descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y
poniéndose bajo el control de secuencias de regulación que permiten
su expresión in vivo.
26. Procedimiento para obtener anticuerpos
según el cual se inmuniza un animal mamífero no humano, tal como
ratón o rata o mono, con al menos una glicoproteína de cubierta
mutada del virus VIH-1, siendo dicha glicoproteína
mutada seleccionada de entre cualquiera de las glicoproteínas
descritas en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22.
27. Procedimiento de evaluación de un agente
terapéutico, según el cual se administra a un animal no humano al
menos un gen mutado que codifica una glicoproteína de cubierta
mutada del virus VIH-1, tal como se describe en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y se realiza:
- -
- una medida de anticuerpos específicos de la glicoproteína mutada, y/o
- -
- una medida de los anticuerpos neutralizantes específicos de la glicoproteína mutada o nativa, y/o
- -
- una medida de la respuesta inmune celular inducida contra la glicoproteína mutada, por ejemplo mediante un ensayo de activación in vitro de células linfocitos T "auxiliares" específica(s) de la glicoproteína mutada.
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