ES2268399T3 - Procedimiento para la obtencion de vitamina b6. - Google Patents
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Abstract
Un mutante de un microorganismo recombinante del género Sinorhizobium, capaz de producir vitamina B6, el cual contiene un plásmido recombinante que contiene un gen piridoxol-5¿-fosfato sintasa, mediante el cual el microorganismo recombinante ha adquirido la característica de necesidad de histidina o de resistencia a la glicina, o una combinación de las propiedades fenotípicas de los mismos.
Description
Procedimiento para la obtención de vitamina
B_{6}.
La presente invención se refiere a nuevos
microorganismos y a un procedimiento para la preparación de vitamina
B_{6} mediante los mismos.
La "vitamina B_{6}" como se emplea en la
presente invención incluye el piridoxol, el piridoxal y la
piridoxamina. La vitamina B_{6} es una vitamina indispensable a
los seres humanos u otros animales y se emplea como materia prima
para medicamentos o como aditivo a los alimentos. Como procedimiento
para la preparación de la vitamina B_{6} mediante un método de
fermentación, es conocido un procedimiento para la preparación de la
vitamina B_{6} empleando un microorganismo derivado del género
Sinorhizobium (conocido también como Rhizobium) (EP
765.938). Sin embargo, es necesario construir un nuevo
microorganismo con un mayor rendimiento de vitamina B_{6} y
desarrollar un proceso de fermentación industrial perfeccionado que
pueda producir vitamina B_{6} con una producción suficientemente
alta y de manera eficaz, empleando dicho microorganismo.
Tazoe et al. [Bioscience Biotechnology
Biochemistry (1999) p. 1378-1382] describe un
microorganismo del género Sinorhizobium que produce vitamina
B_{6} así como también su empleo en un procedimiento para la
obtención de la vitamina B_{6}.
De acuerdo con la presente invención, es posible
producir la vitamina B_{6} más eficientemente que en el proceso
anterior. Los presentes inventores construyeron en primer lugar un
microorganismo recombinante del género Sinorhizobium capaz
de producir vitamina B_{6} con un plásmido recombinante
incorporado que comprendía un vector conteniendo el gen piridoxol
5'-fosfato sintasa (en adelante llamado pdx). Este
microorganismo recombinante mostró una mayor producción de vitamina
B_{6}. Este microorganismo recombinante fue mutado más tarde para
conseguir una propiedad fenotípica de necesidad de histidina o
resistencia a la glicina. Este microorganismo mutante muestra una
mayor productividad de vitamina B_{6}. Un mutante que reúne las
dos propiedades fenotípicas mencionadas más arriba, muestra
simultáneamente una productividad radicalmente mayor de vitamina
B_{6}, y que la vitamina B_{6} puede producirse ventajosamente
en el caldo de cultivo mediante el cultivo de los microorganismos,
y puede separarse del mismo con la pureza deseada.
La presente invención proporciona un mutante de
un microorganismo recombinante del género Sinorhizobium
capaz de producir vitamina B_{6}, el cual posee un plásmido
recombinante que contiene el gen pdxJ que consigue una propiedad
fenotípica de necesidad de histidina o de resistencia a la glicina,
o una combinación de las propiedades fenotípicas del mismo.
Otro objeto de le presente invención es el de
proporcionar un procedimiento para la preparación de vitamina
B_{6}, el cual comprende el cultivo de dicho microorganismo en un
medio de cultivo y recogida de la vitamina B_{6} produci-
da.
da.
Como cepa originaria para la preparación de un
microorganismo en la presente invención, puede emplearse cualquier
cepa que pertenezca al género Sinorhizobium capaz de producir
vitamina B_{6} y que dicho microorganismo perteneciente al género
Sinorhizobium, pueda aislarse de fuentes naturales o pueda
adquirirse en colecciones de cultivos. El S. meliloti IFO
14782 (DSM 10226) es el preferido para la presente invención. Un
microorganismo capaz de producir grandes cantidades de vitamina
B_{6} puede construirse como se describe más adelante.
El llamado "pdxJ" en la presente, significa
el gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis del
piridoxol 5'-fosfato a partir de
1-desoxi-D-xilulosa
5-fosfato y amino-acetona
3-fosfato. Es preferido un gen pdxJ derivado del
microorganismo perteneciente al género Sinorhizobium. Por
ejemplo, un ADN de pdxJ derivado del S. meliloti IFO 14782
puede clonarse de la siguiente manera. Los cebadores para la
reacción en cadena de la polimerasa (llamada PCR de aquí en
adelante) se sintetizan de acuerdo con la secuencia de ADN del pdxJ
en una base de datos de ADN de S. meliloti cepa 1021, y la
cual contiene el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
en el extremo 5' de cada cebador. El gen pdxJ puede amplificarse
mediante PCR empleando los cebadores y ADN cromosómico de S.
meliloti IFO 14782. El pdxJ amplificado se liga en un vector
replicable en Escherichia coli tal como una serie de pUC ó
serie pBR disponible. Un plásmido, en donde el pdxJ se inserta,
puede seleccionarse mediante análisis con gel de agarosa del
plásmido digerido con endonucleasa, y la secuencia de la región
amplificada puede determinarse con un secuenciador de ADN.
Como un vector para la expresión de la proteína
PdxJ en E. coli, un vector puede ser remodelado en un nuevo
plásmido, el cual tiene un promotor que funciona en E. coli
tal como ptac, ptrp, plac ó ptrc, seguido por la secuencia de
reconocimiento de la enzima de restricción. Un plásmido que expresa
la proteína PdxJ en E. coli puede ser proporcionado mediante
la inserción del pdxJ así obtenido en un plásmido de expresión así
obtenido, el cual codifica el pdxJ bajo el control de un
promotor.
Como un vector para la expresión de la proteína
de PdxJ en S. meliloti, puede emplearse un vector de una
amplia gama de anfitriones tal como los pVK100, pRK290, pLAFR1 ó
RSF1010. Un plásmido que expresa la proteína PdxJ en S.
meliloti puede ser proporcionado mediante la inserción de un
fragmento de ADN que codifica un promotor que funciona en S.
meliloti tal como ptac, plac, ptrc, pS1 (promotor de una
subunidad ribosómica pequeña de S. meliloti) ó pNm (promotor
de un gen resistente a la neomicina) y pdxJ en un vector de una
amplia gama de anfitriones.
El procedimiento para la construcción de
vectores recombinantes puede realizarse de acuerdo con técnicas
estándar conocidas en los campos de la biología molecular,
bioingeniería e ingeniería genética.
Un plásmido que codifica el pdxJ de S.
meliloti puede transformarse a E. coli de acuerdo con
técnicas estándar conocidas en los campos de la biología molecular,
bioingeniería e ingeniería genética.
Un plásmido de una amplia gama de anfitriones
que codifica el pdxJ puede ser introducido en el S. meliloti
IFO 14782 mediante la unión a tres precursores, de la siguiente
manera. El S. meliloti como cepa receptora, el E.
Coli que alberga el plásmido auxiliar como cepa auxiliar, y el
E. coli que alberga el plásmido dador, como cepa dadora, se
cultivan separadamente y se mezclan todos juntos. Después del
cultivo mixto sobre una placa, el S. meliloti que recibe un
plásmido recombinante puede seleccionarse sobre una placa de agar
que contiene los antibióticos apropiados. Los plásmidos de colonias
crecidas sobre las placas se examinan mediante digestión con
endonucleasa.
El piridoxol en S. meliloti IFO 14782 es
sabido que se sintetiza mediante el cierre del anillo de dos
precursores, el
1-desoxi-D-xilulosa
y la
4-hidroxi-L-treonina
[Tazoe et al., J. Biol.. Chem.
275:11300-11305 (2000)]. En general, la acumulación
de aminoácidos sintetizados mediante una ruta ramificada se informa
que está muy potenciada por inducción de la necesidad de
aminoácidos. Así es concebible aislar los mutantes que requieren
aminoácidos para lograr un mayor productor de vitamina B_{6}. El
S. meliloti IFO 14782/pVKP601 preparado en (1) [B] está
sometido a mutagénesis con NTG para producir mutantes que producen
más piridoxol en el caldo de cultivo por inducción de los mutantes
que requieren aminoácidos. Las células de la cepa se tratan con
NTG. Después del tratamiento, se efectúa un cultivo reconstituyente
y el cultivo resultante se plaquea sobre medio de agar. Para aislar
los mutantes que requieren aminoácidos, se comprueba el crecimiento
de colonias sobre agar de un medio con una sal de nitrógeno
inorgánico que contiene vitaminas y ácidos nucleicos. A partir del
ensayo, pueden seleccionarse colonias que requieren aminoácidos y
puede seleccionarse un alto productor de vitamina B_{6},
comprobando la productividad de la vitamina B_{6} en la
fermentación. La cepa PV-C341-K1 es
uno de los mutantes objetivo en la presente invención.
La biosíntesis de la vitamina B_{6} en el
S. meliloti IFO 14782 es ya bien conocida como se ha descrito
en (2). El piridoxol se sintetiza a partir de un azúcar y de un
precursor de aminoácidos, y este último precursor, a partir de
glicolaldehido y glicina. La glicina no es solamente un precursor de
la vitamina B_{6} sino también un fuerte inhibidor del
crecimiento de la cepa. En consecuencia, la inducción del mutante
resistente a la glicina conduce a la potenciación de la producción
de vitamina B_{6}. Para aislar los mutantes resistentes a la
glicina, debe examinarse una mínima concentración inhibidora de
glicina frente a la cepa, sobre un medio apropiado debido a que la
fuerza de inhibición es diferente en el medio ensayado. Así, la cepa
PY-C341-K1 obtenida en (2) se
somete a la mutagénesis con NTG para producir mutantes resistentes a
la glicina. Las células de la cepa se tratan con NTG de manera
similar a la descrita en (2). Después del tratamiento, se efectúa un
cultivo reconstituyente y el cultivo resultante se plaquea en un
medio de agar. A los mutantes resistentes a la glicina aislados, se
esparce la suspensión de células sobre placas de medio de agar
conteniendo una concentración adecuada de glicina. Después de la
incubación, las colonias resistentes a la glicina pueden
seleccionarse sobre un medio de agar que contiene glicina.
Los microorganismos obtenidos en la presente
invención se incuban en un medio que contiene una fuente de carbono
asimilable, una fuente de nitrógeno digestible, una sal inorgánica y
otros nutrientes necesarios para su crecimiento. Como fuente de
carbono puede emplearse por ejemplo, glucosa, fructosa, lactosa,
maltosa, galactosa, sucrosa, almidón, dextrina o glicerina. Como
fuente de nitrógeno, puede emplearse por ejemplo, peptona, extracto
de germen de maíz, harina de habas de soja, extracto de levadura,
extracto de carne, cloruro de amonio, sulfato de amonio, nitrato de
amonio, urea, o una mezcla de los mismos. Además, para elementos de
trazas, pueden emplearse sulfatos, hidrocloruros o fosfatos de
calcio, magnesio, zinc, manganeso, cobalto y hierro. Y si es
necesario, factores nutrientes convencionales, un agente captador
del ión fosfato, o un agente antiespumante, tal como el carbonato
de magnesio, óxido de aluminio, allophane, aceite animal, aceite
vegetal o aceite mineral pueden añadirse suplementariamente en un
medio de fermentación.
El pH del medio de cultivo puede ser
aproximadamente de 5,0 a 9,0, de preferencia, de 6,5 a 7,5. La
temperatura de cultivo puede ser aproximadamente 10ºC a 40ºC, de
preferencia 25ºC a 35ºC. El tiempo de cultivo puede ser
aproximadamente de 1 día a 15 días, de preferencia 2 días a 9
días.
En el cultivo, la aireación y la agitación dan
habitualmente resultados favorables.
Después del cultivo, la vitamina B_{6}
producida puede separarse también del caldo de cultivo y
purificarse. Para esta finalidad, un procedimiento generalmente
empleado para la extracción de un cierto producto del caldo de
cultivo puede aplicarse utilizando varias propiedades de la vitamina
B_{6}. Así por ejemplo, las células se eliminan del caldo de
cultivo, la substancia deseada del filtrado se absorbe en carbón
activo, a continuación se eluye y se purifica además con una resina
de intercambio iónico. Alternativamente, el filtrado del cultivo se
aplica directamente a una resina de intercambio iónico y, después de
la elución, el producto deseado se recristaliza en una mezcla de
alcohol y agua.
Los microorganismos empleados en la presente
invención incluyen todas las cepas mutantes del género
Sinorhi- zobium capaces de producir vitamina B_{6}
que tienen un plásmido recombinante con el gen pdxJ que ha adquirido
propiedad fenotípica de necesidad de histidina, o de resistencia a
la glicina, o una combinación de las propiedades fenotípicas del
mismo. Entre las cepas del género Sinorhizobium, una cepa
particularmente preferida es la S. meliloti
PY-EGC1, la cual fue depositada el 17 de Septiembre
de 2002, con el depósito número DSM15209 en el DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) ("Colección
Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares") en Göttingen
(Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.
La presente invención se explicará con más
detalle por referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe
comprenderse que la presente invención no está limitada a dichos
ejemplos particulares.
En los ejemplos, la cantidad de vitamina B_{6}
producida en el caldo de cultivo puede ensayarse mediante el método
de turbidez con Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080
[Osbone y Voogt, The Análisis of Nutrients in Foods ("Análisis de
nutrientes en alimentos"), Academic Press, London,
224-227 (1978)], y los derivados de la vitamina
B_{6} tales como el piridoxol, piridoxal, y piridoxamina en un
caldo de fermentación pueden ser cuantificados separadamente
mediante cromatografía líquida de alta presión (en adelante llamada
HPLC).
Para la amplificación del pdxJ de S.
meliloti IFO 14782 empleando el método PCR, se sintetizaron los
dos siguientes cebadores de acuerdo con la secuencia de ADN del
pdxJ (complemento 2249854-2250606,) en la base de
datos del genoma de la cepa S. meliloti 1021 (ingreso nº
NC_003047): cebador A (SEQ ID NO:1) con la secuencia de
reconocimiento de la enzima de restricción NdeI incluyendo el codon
de partida del pdxJ y el cebador B (SEQ ID NO:2) con el sitio PstI
justo después del codon de interrupción del pdxJ. El ADN cromosómico
se extrajo de las células crecidas en un medio (en adelante llamado
LBMC) compuesto de 1% de triptona Bacto (Becton Dickinson
Microbiology Systems, MD, USA), 0,5% de extracto de levadura Bacto
(Becton Dickinson Microbiology systems, MD, USA), 0,5% de NaCl,
0,061% de MgSO_{4}.7H_{2}O y 0,036% de CaCl_{2}.2H_{2}O con
tips genómicos QIAGEN (QIAGEN GmbH, Alemania).
La PCR se efectuó empleando el kit HF mejorado
PCR (CLONTECH Laboratories, Inc. CA, USA). 100 \mul de mezcla de
reacción contenía 10 ng de ADN cromosómico de S. meliloti IFO
14782, 50 pmoles de los dos cebadores, 10 \mul de 10 x HF mezcla
de dNTP, 10 \mul de tampón de reacción adicional 10 x HF PCR, y 2
\mul de mezcla 50 x HF mejorado polimerasa. Las condiciones de
reacción fueron como sigue; mantenimiento a 94ºC durante 3 minutos,
4 ciclos de 30 segundos a 98ºC, 1 minuto a 53ºC, 1 minuto a 72ºC, 20
ciclos de 30 segundos a 98ºC, 1 minuto a 68ºC y mantenimiento a
72ºC durante 10 minutos. 10 \mul de mezcla de reacción se
sometieron a un gel de agarosa sobre 1% (p/v) de gel, y se recuperó
una banda de 770 bp del gel con QIAEXII (QIAGEN GmbH, Alemania). El
fragmento se ligó a pUC18, el cual se digirió con SmaI y se
desfosforiló con fosfatasa alcalina mediante el kit de ligación
SureClone (Amersham Biosciences Corp., NJ, U.S.A.).
La mezcla de ligación así obtenida se transformó
en células competentes E. coli JM109 (Takara Bio Inc.,
Shiga, Japón) y se plaqueó sobre placas de un medio compuesto de 1%
de triptona Bacto, 0,5% de extracto de levadura Bacto y 0,5% de
NaCl (en adelante llamado LB) conteniendo 100 \mug/ml de
ampicilina (llamada Amp). Se prepararon plásmidos de colonias
crecidas sobre las placas, con Automatic DNA Isolation System
("Sistema Automático para Aislamiento del ADN")
PI-50 (Kurabo Industry Ltd., Japón). Mediante
análisis del plásmido con enzima de restricción se obtuvo un
plásmido recombinante pSHT56, en donde el pdxJ fue la misma
dirección que el gen lacZ sobre pUC18. El pSHT56 se
preparó a partir del E. coli JM109 albergando el pSHT56
con el kit QIAGEN plasmid Midi (QIAGEN GmbH, Alemania). La secuencia
de ADN del pdxJ en el plásmido fue confirmada con un secuenciador
ALF de ADN (Amersham Biosciences Corp., NJ, U.S.A.) y fue idéntico
al de la base de datos del genoma de la cepa 1021 de S.
meliloti.
Como vector para la expresión de pdxJ en E.
coli, el pUC 18 se remodeló en pUC-trc2, el cual
tiene la región trc del promotor de pTrc99A (Amersham Biosciences
Corp., NJ, USA) seguido por la secuencia de reconocimiento NdeI. El
pUC-trc2 se preparó a partir del E. coli
JM109 albergando el pUC-trc2 con el kit QIAGEN
plasmid Midi. Para dar un plásmido de expresión para pdxJ en E.
coli, pUC-trc2 se digirió con NdeI, y se
recuperó un fragmento de 2,5 kb a partir del gel de agarosa y se
desfosforiló con fosfatasa alcalina (Takara Bio Inc., Shiga,
Japón).
Por otro lado, el pSHT56 se escindió con NdeI,
se sometió al gel de agarosa y resultó un fragmento de 1 kb que se
recuperó del gel con QIAEXII. El fragmento de 1 kb recuperado fue
ligado al fragmento de 2,5 kb prescrito de pUC-trc2
con el kit de ligación (Takara Bio Inc., Shiga, Japón). El E.
coli JM109 se transformó con la mezcla de ligación así obtenida
y se plaqueó sobre placas LB que contenían 100 \mug/ml de Amp. El
plásmido de una colonia crecida sobre la placa se preparó con el
Automatic DNA Isolation System PI-50. Mediante
análisis del plásmido con enzima de restricción, se obtuvo un
plásmido recombinante pSHT57, en donde el pdxJ era la misma
dirección que el promotor trc (figura 1). El pSHT57 se preparó a
partir del E. coli JM109 acogiendo el pSHT57 con el kit
QIAGEN plasmid Midi.
Para construir un vector de expresión en el
S. meliloti IFO 14782, se empleó el pVK100, el cual se
informa que es un vector de un amplia gama de anfitriones, del tipo
IncP-1 y replicable en S. meliloti. El pVK100
se preparó a partir del E. coli HB101/pVK100 con el kit
QIAGEN plasmid midi, y se digirió con HindIII, los extremos se
hicieron romos con el kit de volver romos (Takara Bio Inc., Shiga,
Japón) y se desfosforilaron con fosfatasa alcalina. El pSHT57 se
digirió con BamHI y KpnI. El fragmento resultante de 875 bp que
contenía el promotor trc y el pdxJ, se recuperó a partir del
gel de agarosa, se volvieron romos los extremos con el kit de
volver romos, y se ligó al pVK100 prescrito con el kit de ligación.
Las células competentes de E. coli HB101 (Takara Bio Inc., Shiga,
Japón) se transformaron con la mezcla de ligación obtenida y se
plaquearon sobre placas LB que contenían 10 \mug/ml de
tetraciclina (en adelante llamada Tc). Los plásmidos de colonias
crecidas sobre las placas se prepararon con el Automatic DNA
Isolation System PI-50. Mediante el análisis del
plásmido con enzimas de restricción, se obtuvo un plásmido
recombinante pVK601 en donde el promotor trc y el pdxJ estaban en
la dirección opuesta contra el gen resistente a la canamicina
(figura 1).
El pSHT57 se transformó en el mutante
pdxJ^{-}, el E. coli AT3208 (adquirido en E. coli
Genetic Stock Center, Yale Univ., U.S.A.). Todos los transformantes
resistentes al Amp crecieron sobre la placa EMM exenta de vitamina
B_{6}, compuesta de 10 g de glucosa, 8 g de ácido casamino exento
de vitamina (Becton Dickinson Microbiology systems, MD, U.S.A.),
2,5 mg de MnSO_{4}.5H_{2}O, 125 mg de MgSO_{4}.7H_{2}O, 125
mg de CaCl.2H_{2}O, 425 mg de KCl, 250 \mug de
FeCl_{3}.6H_{2}O, 250 \mug de hidrocloruro de tiamina, 8
\mug de biotina, 15 g de agar Bacto (Becton Dickinson Microbiology
systems, MD, U.S.A.) por litro (pH 6,8) mientras que el mutante de
pdxJ^{-}, E. coli AT3208, no creció sobre la placa. Esto
indicaba que el pdxJ clonado trabajaba como PdxJ.
El pVK601 se introdujo en el S. meliloti
IFO 14782 mediante la unión a tres antecesores, como se describe
más adelante. El S. meliloti IFO14782 como cepa receptora se
inoculó en 5 ml de medio LBMC líquido y se incubó con agitación a
30ºC a 140 rpm durante 16 horas. 400 \mul del cultivo fueron
transferidos en el mismo medio recién preparado y se incubó además
durante 6 horas. El E. coli HB101 albergando el
pRK2013 (KM^{r}; IncP tra^{+}, ColEI ori) (ATCC 37159) como
cepa auxiliar, se inoculó en 5 ml de medio LB líquido que contenía
50 \mug/ml de canamicina y se incubó con agitación a 37ºC a 140
rpm durante 16 horas. 100 \mul del cultivo fueron transferidos al
mismo medio recién preparado y se incubaron durante otras 6 horas
más. El E. coli HB101 que albergaba el pVK601 se inoculó en
5 ml de medio LB líquido que contenía 10 \mug/ml de Tc y se
incubó con agitación a 37ºC y 140 rpm durante 16 horas. 100 \mul
del cultivo fueron transferidos en el mismo medio recién preparado
y se incubaron durante otras 6 horas más. Se cosechó cada cepa y las
células se mezclaron según el ratio 1:1:4 (v/v/v). La mezcla se
colocó sobre un filtro de nitrocelulosa colocado sobre una placa de
agar LBMC. Después de incubar esta placa durante 20 horas a 30ºC,
las células del filtro se rascaron y se suspendieron en solución
estéril 0,85% de NaCl. La suspensión se diluyó apropiadamente y se
esparció sobre las placas de LBMC que contenían 20 \mug/ml de
ácido nalidíxico (a seleccionar para S. meliloti IFO 14782)
y 10 \mug/ml de TC (a seleccionar para pVK601). Después de incubar
estas placas a 30ºC durante 5 días, las colonias crecidas sobre
estas placas se picaron y se cultivaron para la extracción del
plásmido mediante el QIAGEN plasmid mini kit (QIAGEN GmbH,
Alemania). El ADN del plásmido así obtenido mostró, con tratamiento
de endonucleasa, un modelo idéntico al pVK601 sobre gel de agarosa.
A partir de este resultado, se seleccionó una colonia entre las
colonias ensayadas como S. meliloti IFO 14782/pVK601.
Un asa de S. meliloti IFO 14782/pVK601,
y el precursor S. meliloti IFO 14782 crecido sobre una placa
de agar LBMC a 30ºC durante 48 horas, se inoculó a tubos que
contenían 8 ml de un medio de siembra (en adelante, llamado SM)
compuesto de 1% de glucosa, 1% de extracto de germen de maíz (Oji
Cornstarch Co., Ltd., Tokio, Japón), 0,2% de extracto de levadura
Bacto, 0,05% de MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,001% de
MnSO_{4}.5H_{2}O y 0,001% de FeSO_{4}.7H_{2}O (pH 7,0) y a
continuación los tubos se agitaron en un agitador recíproco (275
rpm) a 30ºC. Después de agitar durante 19 horas, cada 4 ml de los
cultivos se transfirió a una botella de 500 ml con dos deflectores
conteniendo 200 ml de un medio de producción (en adelante llamado
PM), compuesto de 6% de glucosa, 3% de extracto de germen de maíz,
0,8% de extracto de levadura Bacto, 0,35% de NH_{4}Cl, 0,05% de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,025% de MnSO_{4}.5H_{2}O, 1% de
Allophosite (Shinagawa Chemicals Co., Ltd., Tokio, Japón) y 0,025%
de Actocol (pH 6,8) y se agitó en un agitador rotativo (180 rpm) a
30ºC. Después del cultivo durante 7 días, se cuantificaron los
contenidos de vitamina B_{6} en el sobrenadante de cada caldo de
cultivo mediante cromatografía líquida de alta presión (en adelante
llamada HPLC) y la vitamina B_{6} producida se calculó por el
método del estándar interno con 4'-desoxipiridoxol
como se describe más adelante. Para preparar las muestras para la
HPLC, 100 \mul de solución conteniendo 100 mg/l de
4'-desoxipiridoxol como substancia interna, se
añadieron a 400 \mul de las soluciones estándar de piridoxol y el
sobrenadante a partir del caldo de cultivo, y a continuación la
mezcla se colocó en la columna siguiente. Las condiciones analíticas
fueron como sigue: columna Capcell pack C18 SG120 (4,6 x 250
mm)(Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japón); fase móvil 0,1 M de
perclorato de sodio, 0,1 M de fosfato de potasio, y 2% de
acetonitrilo (pH 3,5); temperatura de la columna
25-26ºC; velocidad del flujo 1,0 ml/minuto; y
detector, ultravioleta (UV) (a 292 nm). Como resultado, el S.
meliloti IFO 14782/pVK601 produjo 119 mg de piridoxol por litro
y fue aproximadamente 1,34 veces mayor que el precursor, la cepa IFO
14782.
El S. meliloti IFO 14782 obtenido en el
ejemplo 1, se cultivó en una botella que contenía LBMCG conteniendo
5 \mug/ml de Tc durante 17 horas a 30ºC y se preparó la
suspensión de células de la cepa. Un tubo que contenía 5 ml de la
mezcla de reacción compuesta de 150 \mug/ml de NTG y 1,6 x
10^{9} células por ml en 50 mM de tampón de
Tris-HCl (pH 8,0) se incubó con un agitador
recíproco (275 rpm) durante 30 minutos a 30ºC. Las células se
lavaron dos veces con solución salina estéril y se suspendieron en
solución salina. 100 \mul de la suspensión de células se
esparcieron sobre placas de agar que contenían LBMCG conteniendo 5
\mug/ml de Tc, y a continuación las placas se incubaron durante 2
días a 30ºC. Las células crecidas sobre las placas se recogieron en
7 ml de solución salina estéril, y las suspensiones de células se
diluyeron en una serie 10^{-1} - 10^{-7} en solución salina
estéril y se esparcieron sobre las mismas placas de agar. Para
aislar los mutantes que requieren aminoácidos, el crecimiento de
1.136 colonias crecidas sobre LBMCG conteniendo 5 \mug/ml de Tc,
se ensayó sobre agar de un medio mínimo (en adelante llamado MM)
compuesto de 1% de glucosa, 0,22% de NH_{4}Cl, 0,06% de
K_{2}HPO_{4}, 0,06% de KH_{2}PO_{4}, 0,04% de
MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,02% de Cacl_{2}.2H_{2}O, 0,04% de NaCl y
las siguientes sales metálicas, vitaminas y ácidos nucleicos (por
litro): 12 mg de FeCl_{3}.6H_{2}O, 4 mg de
MnSO_{4}.5H_{2}O, 0,5 mg de H_{3}BO_{3}, 0,4 mg de
Na_{2}MoO_{4}, 0,32 mg de ZnSO_{4}.7H_{2}O, 0,04 mg de
CuSO_{4}.5H_{2}O, 0,002 mg de CoCl_{2}.6H_{2}O, 4 mg de
pantotenato de calcio, 3 mg de tiamina.HCl, 1,25 mg de riboflavina,
0,04 mg de biotina, 10 mg de hipoxantina, 10 mg de sulfato de
guanina, 10 mg de timina, y 10 mg de uracilo conteniendo 5
\mug/ml de Tc. Después de una incubación durante 4 días a 30ºC,
37 colonias que indicaban un pobre crecimiento o ningún crecimiento,
se sembraron por picadura en un agar de LBMCG que contenía 5
\mug/ml de Tc, y la productividad de la vitamina B_{6} se
examinó mediante fermentación en botella. Un asa de células de 37
colonias y S. meliloti IFO 14782/pVK601 (precursor) se
inocularon a tubos que contenían 8 ml de medio SM, y a continuación
los tubos se agitaron en un agitador recíproco (275 rpm) a 30ºC.
Después de agitar durante 19 horas, cada 4 ml de caldo de cultivo
se transfirió a botellas de 500 ml con dos deflectores conteniendo
200 ml de medio PM y se agitaron en un agitador rotativo (180 rpm) a
30ºC. Después de un cultivo durante 7 días, se cuantificaron los
contenidos de vitamina B_{6} en el sobrenadante de cada caldo de
cultivo mediante HPLC. Como resultado, el S. meliloti
PY-C341K1 produjo 171 mg de piridoxol por litro y
fue 1,44 veces mayor que la del precursor, la cepa IFO
14782/pVK601.
La necesidad de aminoácido de la cepa
PY-C341K1 juntamente con el precursor, la cepa
S. meliloti IFO 14782/
pVK601, se examinó mediante el cultivo durante 2 días a 30ºC en tubos conteniendo 8 ml de MM suplementado con varias clases de aminoácidos. Según el resultado, la cepa PY-C341K1 creció al igual que el precursor S. meliloti IFO 14782/pVK601, en medio MM suplementado con 42 \mug/ml de histidina.
pVK601, se examinó mediante el cultivo durante 2 días a 30ºC en tubos conteniendo 8 ml de MM suplementado con varias clases de aminoácidos. Según el resultado, la cepa PY-C341K1 creció al igual que el precursor S. meliloti IFO 14782/pVK601, en medio MM suplementado con 42 \mug/ml de histidina.
De una manera similar a la descrita en el
ejemplo 3, el S. meliloti PY-C341K1 se
cultivó en una botella conteniendo LBMCG que contenía 10 \mug/ml
de Tc durante 16 horas a 30ºC y se preparó la suspensión de células
de la cepa. Un tubo que contenía 5 ml de la mezcla de reacción
compuesta de 0,30 y 50 \mug/ml de NTG y 1,6 x 10^{9} células
por ml en 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 8,0) se
incubó con un agitador recíproco (275 rpm) durante 30 minutos a
30ºC. Las células de cada mezcla de reacción se lavaron dos veces
con solución salina estéril y se suspendieron en solución salina.
100 \mul de la suspensión de células se esparcieron sobre placas
de agar conteniendo LBMCG que contenían 10 \mug/ml de Tc y a
continuación se incubaron las placas durante 2-3
días a 30ºC. Las células crecidas en las placas se recogieron
suspendiéndolas en solución salina estéril. Después de centrifugar
la suspensión, la suspensión de células se diluyó hasta dar una
turbidez OD_{600} = 1,6, y finalmente a 10^{-5}. Cada 100
\mul de diluyentes se esparcieron sobre cinco placas de agar
conteniendo LBMCG que contenía 10 \mug/ml de Tc y 0, 0,125, 0,15,
ó 0,175% de glicina debido a que el 0,15% de glicina inhibió
completamente el crecimiento de S. meliloti
PY-C341K1 sobre la placa LBMCG, y a continuación las
placas se incubaron durante 4 días a 30ºC. Diez colonias tratadas
con 50 \mug/ml de NTG crecidas sobre placas LBMCG conteniendo 10
\mug/ml de Tc y 0,175% de glicina se sembraron por picadura sobre
agar LBMCG conteniendo 10 \mug/ml de Tc. Después de la incubación
durante 2 días a 30ºC la productividad de la vitamina B_{6} en
diez colonias juntamente con la cepa precursora (S. meliloti
PY-C341K1) se examinó mediante fermentación en
botella. Un asa de células se inoculó en tubos que contenían 8 ml de
medio SM y a continuación los tubos se agitaron en un agitador
recíproco (275 rpm) a 30ºC. Después de agitar durante 19 horas, cada
4 ml de caldo de cultivo se transfirió a una botella de 500 ml con
dos deflectores conteniendo 200 ml de medio PM modificado a 0,175%
de NH_{4}Cl y se agitó en un agitador rotativo (180 rpm) a 30ºC.
Después de agitar durante 4 días, se añadió una solución estéril de
urea al 0,125% a cada botella y la agitación se continuó durante 3
días más. Los contenidos de vitamina B_{6} en el sobrenadante del
caldo de cultivo de 7 días fueron cuantificados mediante el método
HPLC como se describe en el Ejemplo 3. Como resultado, la S.
meliloti PY-EGC1 produjo 362 mg de piridoxol
por litro y fue aproximadamente 2,11 veces mayor que la cepa
PY-C341K1 (precursora).
\newpage
La vitamina B_{6} se recuperó del caldo de
cultivo de S. meliloti PY-EGC1 preparado en
las mismas condiciones de cultivo que las descritas en el ejemplo
5. El piridoxol en cada paso de purificación, y la concentración,
fueron seguidos mediante HPLC. Un litro del caldo de cultivo de 168
horas que contenía 344 mg/l de PN se centrifugó a 7.500 rpm durante
10 minutos. El pH del sobrenadante resultante se ajustó a 3,1 con
ácido clorhídrico 1N y a continuación el sobrenadante se aplicó a
una columna (5,5 x 15 cm) rellena con 350 ml de Amberlite CG 120
(forma H^{+}, 100-200 mallas, Rohm and Haas
Company, Philadelphia, Pennsylvania, USA). La columna se lavó con
500 ml de agua desionizada y a continuación se eluyó con 5% de
hidróxido de amonio. Las fracciones de vitamina B_{6} se
concentraron a presión reducida. El residuo así obtenido se disolvió
en 10 ml de agua desionizada, y la solución se aplicó sobre una
columna (5,5 x 16 cm) rellena con 380 ml de Dowex 1 x 4 (forma
OH^{-}, 200-400 mallas, Dow Chemical Co., Ltd.,
Midland, Michigan, U.S.A.) y a continuación se lavaron con 500 ml
de agua desionizada. La columna se eluyó a continuación con HCl
0,1N. Las fracciones que contenían piridoxol se concentraron a un
volumen pequeño a presión reducida. Después de disolver el residuo
sólido en una pequeña cantidad de etanol caliente, la solución se
guardó en reposo a 4ºC durante la noche. Los precipitados
resultantes se recogieron por filtración y se secaron al vacío hasta
obtener 282 mg de cristales brutos. Se recristalizaron en etanol
obteniéndose 217 mg de cristales blancos con un punto de fusión de
160ºC. La absorción infrarroja, la absorción UV y el espectro RMN
del producto coincidieron con los del piridoxol auténtico.
La tabla 1 resume las productividades de
vitamina B_{6} del S. meliloti IFO 14782 (DSM nº 10226),
S. meliloti IFO 14782/pVK601, y sus mutantes obtenidos hasta
la fecha.
| Ejemplo | Microorganismo | Propiedades del fenotipo | Piridoxol | Magnitud del |
| (mg/litro) | aumento | |||
| S. meliloti IFO 14782 (DSM nº 10226) | 89 | 1,0 | ||
| 2 | S. meliloti IFO 14782/ pVK601 | amplificación del pdxJ | 119 | 1,34 |
| 3 | S. meliloti PY-C341K1 | requisito de histidina | 171 | 1,92 |
| 4 | S. meliloti PY-EGC1 | resistencia a la glicina | 362 | 4,07 |
<110> Roche Vitamins AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la obtención de
la vitamina B_{6}
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NDR5222
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccatatgc ctgcaaagct ctcc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccctgcagt taagccgtct cgcc
\hfill
Claims (6)
1. Un mutante de un microorganismo
recombinante del género Sinorhizobium, capaz de producir
vitamina B_{6}, el cual contiene un plásmido recombinante que
contiene un gen piridoxol-5'-fosfato
sintasa, mediante el cual el microorganismo recombinante ha
adquirido la característica de necesidad de histidina o de
resistencia a la glicina, o una combinación de las propiedades
fenotípicas de los mismos.
2. El mutante de un microorganismo
recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho
plásmido recombinante contiene el plásmido de vector pVK100.
3. El mutante de un microorganismo
recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen
piridoxol-5'-fosfato sintasa deriva
de un microorganismo del género Sinorhizobium el cual es
capaz de producir vitamina B_{6}.
4. El mutante de un microorganismo
recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, el cual es el
Sinorhizobium meliloti PY-EGC1 que tiene
resistencia a la glicina, el cual ha sido depositado en la DSMZ con
el nº DSM 15209.
5. Un procedimiento para la producción de
vitamina B_{6}, el cual comprende el cultivo de un mutante de
acuerdo con la reivindicación 1, en un medio de cultivo a un valor
del pH de aproximadamente 5,0 a 9,0 a una temperatura de 10ºC a
40ºC y durante 1 día a 15 días en condiciones aeróbicas, y el
aislamiento de la vitamina B_{6} a partir del medio de
cultivo.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en donde el mutante es el Sinorhizobium
meliloti PY-EGC1 que tiene resistencia a la
glicina, el cual ha sido depositado en la DSMZ con el nº DSM
15209.
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