ES2268735T3 - Metodos y composiciones para la deteccion de cancer cervical. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA UN AMPLIO SURTIDO DE PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA DETECTAR Y TRATAR EL CANCER DE CUELLO DE UTERO EN UNA MUJER. LA INVENCION PROPORCIONA CONCRETAMENTE PROTEINAS ASOCIADAS AL CANCER CERVICAL-BLANCO, QUE PERMITE UNA RAPIDA DETECCION, PREFERENTEMENTE ANTES DE QUE OCURRAN METASTASIS, DEL CANCER CERVICAL. LA PROTEINA BLANCO ASOCIADA AL CANCER CERVICAL PUEDE DETECTARSE, POR EJEMPLO, HACIENDO REACCIONAR LA MUESTRA CON UNA MITAD DE FIJACION MARCADA, POR EJEMPLO, UN ANTICUERPO MARCADO CAPAZ DE FIJARSE ESPECIFICAMENTE A LA PROTEINA. LA INVENCION PROPORCIONA TAMBIEN KITS UTILES EN LA DETECCION DEL CANCER CERVICAL DE UNA PERSONA. ADEMAS, LA INVENCION PROPORCIONA PROCEDIMIENTOS QUE UTILIZAN LAS PROTEINAS ASOCIADAS AL CANCER CERVICAL COMO BLANCOS PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER CERVICAL O COMO INDICADORES PARA CONTROLAR LA EFICACIA DE DICHO TRATAMIENTO.

Description

Métodos y composiciones para la detección de cáncer cervical.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a métodos y composiciones para la detección de cáncer cervical. Más específicamente, la presente invención se refiere a proteínas asociadas con el cáncer cervical que actúan como indicadores celulares útiles (i) para detectar cáncer cervical, y (ii) como objetivos moleculares para la terapia de cáncer cervical.

Contexto de la invención

El cáncer de cuello de útero es uno de los males más comunes entre las mujeres y supone un significante problema de salud pública en todo el mundo. Sólo en los Estados Unidos, el cáncer cervical invasivo representa aproximadamente el 19% de todos los cánceres ginecológicos (Miller et al. (1993) en "Surveillance Epidemology, and End Results Program cancer Statistics Review: 1973-1990", NIH Pub. No. 93-27-89, Bethesda, MD: National Cancer Institute). En 1996, se estima que habrá 14.700 nuevos casos diagnosticados y ya se han atribuido 4.900 muertes a esta enfermedad (American Cancer Society, Cancer Facts & Figures 1996, Atlanta, GA: American Cancer Society, 1996). En muchos países desarrollados, donde los programas de revisión de masa no están a disposición de todo el mundo, el problema clínico es aún más serio. A nivel mundial, se estima que el número de nuevos casos será de 471.000 dentro de 4 años, con un porcentaje de supervivencia del 40% (Munoz et al. (1989) "Epidemiology of Cervical Cancer" en "Human Papillomavirus", New York, Oxford Press, pp 9-39; and National Institutes of Health, Consensus Development Conference Statement on Cervical Cancer, April 1-3, 1996).

El precursor del cáncer cervical es la displasia, también conocida en el campo como neoplasia intraepitelial cervical (NIC) o lesión intraepitelial escumosa (LIE) (Brinton et al. (1992) "Epidemology of Cercival Cancer: Overview" en "Epidemology of Cervical Cancer and Human Papillomavirus", Lyon, France: International Agengy for Research on Cancer; and Tabbara et al.(1992) "The Bethesda classification for squamous intraepithelial lesions: histologic, cytologic and viral correlates", Obstet. Gynecol. 79: 338-346). Aunque no se entiende cómo las células normales llegan a transformarse, el concepto de un espectro continuo de cambio histopatológico del epitelio normal y estratificado a través de NIC a cáncer invasivo ha sido comúnmente aceptada durante muchos años, (ver, por ejemplo, Mitchel et al. (1994) "The natural history of cervical intrapithelial neoplasia: an argument of intermediate endpoint biomarkers", Cancer Epidmiol. Biomark. Prev. 3: 619:626). Se han reunido un gran número de pruebas epidemiológicas y biológicas celulares para establecer que la infección de papillomavirus humano (HPV) es el factor causativo del cáncer cervical (Munoz et al. (1992) en "The Epidemology of Human Papillomavirus and Cervical Cancer", IRAC publication No. 119, Lyon, France: Int. Agency for Research on Cancer, pp 251-261). Se encontró HPV en el 85% o más de las lesiones invasivas de célula escuamosa, que representan el tipo histológico más común visto en carcinoma cervical (Cox et al. (1995) Baillierre's Clin. Obstet Gynaecol. 91-37). Entre los cofactores adicionales se incluyen, por ejemplo, oncogenes activados por mutaciones puntuales, y transcolocación cromosomal de supresiones (Spandidos et al. (1989) J. Pathol. 157: 1-10).

El examen citológico de citología de Papanicolao (también llamada citología Pap) es actualmente el mejor método para detectar cáncer cervical. A pesar del éxito histórico de este test, han surgido dudas con respecto a su habilidad para predecir de modo seguro el comportamiento de lesiones preinvasivas (Ostor et al. (1993) Int. J. Gynecol. Pathol. 12: 186-192; y Genest et al. (1993) Human Pathol. 24: 730-736). La identificación de un indicador de tumor asociado con el cáncer cervical para detectar de manera fiable la aparición de cáncer cervical y/o proporcionar información temprana de pronóstico ayudará en gran medida al tratamiento de cáncer cervical.

Todas las células eucarióticas tienen un núcleo que contiene ADN, o cromatina, que está organizada por un andamiaje de proteína interna conocido como matriz nuclear (MN). La matriz nuclear fue primeramente descrita en 1974 por Berezney et al. (Berezney et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Commun., 60: 1410-1417). Penman et al. describe un método para extraer de manera selectiva las proteínas de la matriz nuclear interior insoluble y sus ácidos nucleicos asociados de células y determinar el tipo de célula particular analizando las proteínas por medio de electroforesis de gel bidimensional (ver por ejemplo, U.S. Pat. Nos. 4,882,268, presentada el 21/11/89, Y 4,885,236, presentada el 5/12/89). WO 94/00573 describe secuencias genéticas y sus secuencias de aminoácido codificadas para dos proteínas de matriz nuclear interior útiles como indicadores de tipos de células
malignas.

Se cree que la matriz nuclear forma parte de una amplia variedad de funciones nucleares fundamentales para el control de expresión de genes. Para una visión general ver, por ejemplo, Fey et al. (1991) Crit. Rev. Euk. Gene Express. 1: 127-143. Las proteínas de matriz nuclear específica de tejido han sido identificadas en ratas, ratones y humanos. Fey et al. (1986) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85: 121-125; Stuurman et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 5460-5465; y Getzenberg et al. (1990) Mol. Endocrinol. 4: 1336-1342. Cambios en la presencia o ausencia de proteínas de matriz nuclear específica se han asociado con la transformación y diferenciación celular (Bidwell et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3162-3166; Brancolini et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6936-6940; y Greenfield et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11217-11221).

Varios estudios recientes que emplean una metodología similar han identificados proteínas de matriz nuclear específica de tumor en cánceres de próstata (Partin et al. (1993) Cancer Res. 53: 744-746), de pecho (Khanuja et al. (1993) Cancer Res. 53: 3394-3398), cáncer de colon (Keesee et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1913-1916), óseo (Bidwell et al. (1994) Cancer Res. 54: 28-32), de vejiga (Getzenberg et al. (1996) Cancer Res. 56: 690-694) y de laringe (Donat et al. (1996) Otolaringol. Head Neck Surg. 114: 387-393). Sin embargo, la caracterización molecular de las proteínas de matriz nuclear específica queda mal definida debido a la escasez de dichas proteínas en la célula y su carácter generalmente insoluble.

En cambio, existen una necesidad en la técnica de indicadores específicos y fiables que se expresen de manera diferencial en tejido cervical normal y cancerígeno que puede ser útil para detectar cáncer cervical o para predecir su aparición. De este modo, es un objeto de la presente invención proporcionar moléculas asociadas a cáncer cervical que son útiles como indicadores para la temprana y/o rápida detección de cánceres cervicales en un individuo. Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos para detectar cánceres cervicales en un individuo. Es otro objeto de la invención proporcionar métodos y composiciones para tratar cánceres cervicales en un individuo y para controlar la eficacia de tal tratamiento en el individuo.

Resumen de la invención

La invención proporciona una variedad de métodos y composiciones para detectar y/o pronosticar cáncer cervical en una muestra de tejido o fluido corporal tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de proteínas asociadas al cáncer cervical, como se determinó mediante electroforesis de gel bidimensional.

En un aspecto, la invención proporciona un método para detectar cáncer cervical en un humano. El método comprende el paso de detectar la presencia de una proteína asociada al cáncer cervical en una muestra de tejido o fluido corporal del humano indicando así la presencia de un cáncer cervical o un precursor de un cáncer cervical. La proteína asociada al cáncer cervical es una proteína asociada al cáncer cervical que consta de una secuencia continua de aminoácido seleccionada del grupo consistente en: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9. De manera alternativa, el método de la invención puede comprender el paso de detectar una proteína asociada al cáncer cervical que tiene una secuencia de aminoácido establecida como SEQ ID NO:10, comúnmente referida en la técnica como IEF SSP 9502. Ver, por ejemplo, Honore et al. (1994) Gene 151: 291-296.

Como aquí se emplea, el término "cáncer cervical" se entiende para expresar cualquier cáncer o lesión cancerígena asociada con tejido cervical o células cervicales y, además, incluye precursores del cáncer cervical, por ejemplo, displasia (también conocida en la técnica como una neoplasia intraepitelial cervical o como una lesión intraepitelial escamosa).

Como aquí se emplea, el término "moléculas asociadas a cáncer cervical" se refiere a moléculas que se originan a partir de y son aislables a partir de una célula o células de cáncer cervical y que sustancialmente no se originan ni son aislables a partir de una célula o células de un cáncer cervical normal: No es necesario que la molécula objetivo o proteína objetivo sean únicas a una célula de cáncer cervical; es más preferible que la molécula objetivo o proteína tenga una señal al radio sonoro suficientemente alta como para discriminar muestras originadas a partir de un tejido cervical o fluido corporal con cáncer y muestras originadas a partir de tejido cervical o fluido corporal
normal.

Los métodos de la invención pueden llevarse a cabo en cualquier muestra relevante de tejido o fluido corporal. Por ejemplo, métodos de la invención pueden llevarse a cabo en tejido cervical, más preferentemente tejido de biopsia cervical, y más preferentemente en citologías. De modo alternativo, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo en una muestra de fluido humano seleccionada del grupo consistente en: sangre; suero; plasma; materia fecal; orina; secreción vaginal; fluido espinal; saliva; fluido ascítico; fluido peritoneal; esputo; y exudado de pecho. Sin embargo, se contempla que los métodos de la invención también pueden ser útiles en ensayos para células de cáncer cervical metastatizadas en otras muestras de tejido o fluido corporal.

Proteínas indicadoras asociadas con un cáncer cervical en una muestra de tejido o fluido corporal pueden detectarse empleando cualquiera de los métodos disponibles en la técnica. En una realización, por ejemplo, la proteína asociada a cáncer cervical indicadora puede reaccionar con una parte de la molécula de enlace marcada capaz de enlazar específicamente con la proteína indicadora produciendo así un complejo marcado de la parte de la molécula de enlace y la proteína indicadora. Posteriormente, el complejo marcado puede detectarse empleando metodologías convencionales conocidas en la técnica. La detección de la presencia de complejo marcado puede proporcionar una indicación de presencia de células de cáncer cervical o células precancerígenas en el individuo a testar. Como aquí se emplea, el término "parte de molécula de enlace" se entiende como cualquier parte de enlace capaz de enlazar específicamente una proteína asociada a cáncer cervical con una afinidad de enlace superior a aproximadamente 10^{5} M^{-1}. Como aquí se emplean, los términos "enlace específicamente", "específicamente enlazado" y "enlaza específicamente" se refieren a una interacción de enlace con una afinidad de enlace superior a 10^{5} M^{-1}. Como aquí se emplea, la parte de la molécula de enlace está marcada con una parte de molécula detectable, por ejemplo, una etiqueta radioactiva, fluoroscópica, espectroscópica, o enzimática, empleando técnicas conocidas en la materia.

Se aprecia que, parte de molécula de enlace que interactúan y enlazan específicamente con la proteína objetivo, pueden ser diseñadas empleando métodos convencionales conocidos en la técnica. En la invención, la parte de la molécula de enlace puede se un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal. Se prefieren los anticuerpos monoclonales. Sin embargo, se contempla que otras parte de molécula de enlace útiles en la práctica de la invención instantánea incluyen, por ejemplo, puntos de enlace de anticuerpo biosintético, también referidos en la técnica como BABS o Fv's, y fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab', y (Fab')2. Los procedimientos para preparar, testar y etiquetar BAHS y fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica, y por lo tanto aquí no se añade más detalle al respecto.

En otra realización, uno o más indicadores de proteína en una muestra pueden detectarse aislando primero las proteínas de la muestra, y posteriormente separando las proteínas por medio de electroforesis de gel bidimensional para producir un patrón característico de electroforesis de gel bidimensional. Por lo tanto, en otra realización, la invención proporciona patrones de gel de electroforesis o electroferogramas de proteínas asociadas a cáncer cervical que son útiles para detectar un cáncer cervical en un individuo.

Las proteínas asociadas a cáncer cervical de la invención pueden purificarse o copurificarse de las células de cáncer cervical usando procedimientos de aislamiento de proteína de matriz nuclear, como aquellos descritos en U.S Patent No. 4,885,236 y U.S Patent No. 4,882,268.

De modo alternativo, las proteínas indicadores, una vez que se han identificado y caracterizado pueden aislarse de la muestra por cualquiera de los protocolos de purificación de proteína conocidos por aquellos expertos en la técnica, como cromatografía de afinidad, para producir proteínas aisladas. Como aquí se emplea, el término "aislado" se entiende que está sustancialmente libre de material no deseado, contaminante y con proteínas.

Además, el experto en la técnica, puede producir secuencias de ácido nucleico codificando toda la proteína indicadora aislada, o fragmentos de la misma, empleando métodos actualmente disponibles en la técnica (ver, por ejemplo, Maniatis et al., eds. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press). Por ejemplo, una proteína asociada a cáncer cervical aislada puede secuenciarse empleando protocolos de secuencias peptídicas convencionales, y después pruebas de hibridización oligonucleótido diseñadas para proteger una biblioteca de cADN. La biblioteca de cADN puede protegerse con el resultante oligonucliotide para aislar las secuencias de la longitud completa o parcial de cADN que codifican la proteína aislada.

Además, el experto en la técnica, empleando las metodologías descritas en U.S Patent Nos. 4,885,236 y 4,882,268 pueden aislar a partir de una muestra celular una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia capaz de reconocer y de ser específicamente enlazada por una proteína asociada al cáncer cervical. En tal procedimiento, las proteínas solubles se separan del núcleo y citoarmazón extrayendo células mamarias con una solución detergente no-fónica a pH fisiológico y fuerza iónica. La proteína insoluble y ácidos nucleicos son posteriormente digeridos con ADNasa y después se eluyó con una solución de sulfato de amonio de búfer para producir una molécula de ácido nucleico capaz de reconocer y estando específicamente unida por una proteína asociada al cáncer cervical. Todas las proteínas restantes se separaron posteriormente de la molécula de ácido nucleico objetivo.

La detección de las moléculas de ácido nucleico anteriormente mencionadas pueden servir como un indicador de la presencia de cáncer cervical y/o cáncer cervical metastatizado en un individuo. De este modo, en otro aspecto, la invención proporciona otro método para detectar cáncer cervical en un humano. El método comprende el paso de detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en una muestra de tejido o fluido corporal para indicar de este modo la presencia de un carcinoma cervical en el individuo. La molécula de ácido nucleico se selecciona de un grupo consistente en (i) molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia capaz de reconocer estar específicamente enlazada por una proteína asociada al cáncer cervical, y (ii) una molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia que codifica una proteína asociada al cáncer cervical. Como aquí se define la proteína asociada al cáncer cervical se caracteriza por constar de secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo consistente en SEQ ID Nos. 1 a 10.

Una molécula objetivo de ácido nucleico en una muestra puede detectarse, por ejemplo, por el análisis de la mancha Northern haciendo reaccionar la muestra con una prueba de hibridización marcada, por ejemplo, una prueba oligonucleótido marcada ^{32}P, capaz de hibridizar específicamente con al menos una porción de la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína indicadora. La detección de una molécula de ácido nucleico bien para codificar una proteína asociada al cáncer cervical o bien capaz de estar específicamente enlazada por una proteína asociada al cáncer cervical, puede servir por lo tanto como un indicador de la presencia de un cáncer cervical en el individuo a ser testado.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para detectar la presencia de cáncer cervical o para evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico de un cáncer cervical. Tales kits pueden constar de, en combinación, (i) un receptáculo para recibir la muestra de tejido humano o fluido corporal del individuo, (ii) una parte de enlace que se enlaza específicamente bien a un epítope en una proteína indicadora asociada al cáncer cervical o una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína indicadora asociada al cáncer cervical, como se ha definido anteriormente, (iii) medios para detectar el enlace de la parte de enlace con la proteína asociada al cáncer cervical o secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína asociada al cáncer cervical, y (iv) una muestra de referencia.

En una realización del kit, la parte de la molécula de enlace se enlaza específicamente a la proteína asociada al cáncer cervical como se ha definido anteriormente.

En otra realización del kit, la muestra de referencia puede constar de un control negativo y/o positivo. El control negativo es indicativo de un tipo de célula cervical normal y el control positivo es indicativo de cáncer cervical.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un compuesto para la fabricación de un medicamento para uso en un método para tratar cáncer cervical. El método comprende la administración a un paciente con cáncer cervical una cantidad terapéuticamente efectiva, preferentemente un anticuerpo, y más preferentemente un anticuerpo monoclonal, que se enlaza específicamente a una proteína objetivo asociada al cáncer cervical para desactivar de este modo la proteína. La proteína objetivo que está caracterizada por constar de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en SEQ ID Nos 1-10.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un compuesto para la fabricación de un medicamento para utilización en otro método para el tratamiento de cáncer cervical. El método comprende el paso de administrar al paciente diagnosticado con cáncer cervical una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que reduce in vivo la expresión de una proteína objetivo asociada al cáncer cervical reduciendo de este modo in vivo la expresión de la proteína objetivo. En una realización preferente, el compuesto es una secuencia que contiene núcleo base como una secuencia de ácido nucleico anti-sentido o molécula de ácido nucleico peptídico anti-sentido (PNA) complementaria a una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína objetivo. Después de la administración, la secuencia de ácido nucleico anti- sentido o molécula PNA anti-sentido se enlaza con las secuencias de ácido nucleico que codifican, al menos en parte, la proteína objetivo reduciendo así la expresión in vivo de la proteína objetivo asociada al cáncer cervical.

Por lo tanto, la invención proporciona una amplia gama de métodos y composiciones para detectar y tratar cáncer cervical en un individuo. Específicamente, la invención proporciona proteínas asociadas al cáncer cervical, que permiten de modo específico y temprano, preferiblemente antes de que ocurra metástasis, la detección de cáncer cervical en un individuo. Además, la invención proporciona kits útiles en la detección de cáncer cervical en un individuo. Además, la invención proporciona métodos que utilizan las proteínas asociadas al cáncer cervical como objetivos e indicadores para tratar cánceres cervicales y para controlar la eficacia de tal tratamiento. Estos y otros numerosos aspectos y ventajas de la invención resultarán más claras bajo la consideración de las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es un patrón de electroforesis de gel bidimensional a alta resolución de proteínas de matriz nuclear aisladas de una muestra de tejido de cáncer cervical. Las proteínas asociadas al tumor redondeadas y marcadas con los números de referencia 1-5 corresponden a las proteínas CvC-1 a CvC-5, listadas en la Tabla 2.

Figura 1b es un patrón de electroforesis de gel bidimensional a alta resolución de proteínas de matriz nuclear aisladas de una muestra de tejido de cáncer cervical. Como una referencia, las posiciones relativas correspondientes a las proteínas CvC-1 a CvC-5 de la Figura 1 están redondeadas y marcadas con números de referencia 1-5.

Figura 2a es un patrón de electroforesis de gel bidimensional a alta resolución de proteínas de matriz nuclear aisladas de la línea celular derivada del carcinoma celular C33A. Las proteínas asociadas al tumor CvC-2 y CvC-5 están redondeadas y marcadas con número de referencia 2 y 5.

Figura 2b es un patrón de electroforesis de gel bidimensional a alta resolución de proteínas de matriz nuclear aisladas de células CaSki. Las proteínas asociadas al tumor CvC-1 y CvC-3 están redondeadas y marcadas con números de referencia 1 y 3.

Para cada una de las figuras citadas, se indican estándares de pesos moleculares en los ejes de ordenadas (M_{r} x 10_{3}) y los puntos isoeléctricos se muestran en la abscisa.

Descripción detallada de los dibujos

La presente invención proporciona métodos y composiciones para la detección y tratamiento de cáncer cervical. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de proteínas asociadas al cáncer cervical que generalmente están presentes a niveles más altos detectables en células cervicales cancerígenas que en células normales, como se determinó por electroforesis de gel bidimensional.

Las proteínas asociadas al cáncer cervical pueden actuar como proteínas indicadoras útiles en la detección de cáncer cervical o como proteínas objetivo para terapia de cáncer cervical. Por ejemplo, se contempla que, las proteínas indicadoras y las partes de moléculas de enlace, por ejemplo, anticuerpos que se enlazan con las proteínas indicadoras o pruebas de ácido nucleico que hibridizan secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas indicadoras, puede usarse para detectar la presencia de cáncer cervical en un individuo. Además, se contempla que, el experto en la técnica puede producir nuevas terapias para tratar cáncer cervical que incluye, por ejemplo: anticuerpos que pueden administrarse a un individuo que se enlazan con y reducen o eliminan la actividad biológica de la proteína objetivo in vivo; secuencias de ácido nucleico o ácido nucleico peptídico que hibridizan con genes o transcripciones de genes que codifican las proteínas objetivo reduciendo así la expresión de las proteínas objetivo in vivo; o pequeñas moléculas, por ejemplo, moléculas orgánicas que interactúan con las proteínas objetivo u otras partes de moléculas celulares, por ejemplo, receptores de proteínas objetivo, reduciendo o eliminando de este modo la actividad biológica de las proteínas objetivo.

A continuación se exponen los métodos para aislar proteínas asociadas a cáncer cervical, métodos para detectar cáncer cervical utilizando proteínas asociadas a cáncer cervical como indicadores, y métodos para tratar individuos aquejados de cáncer cervical utilizando proteínas asociadas a cáncer cervical como objetivo en terapia de cáncer.

1. Identificación y Purificación de Proteínas asociadas al Cáncer Cervical

Proteínas indicadores de la invención, como aquí se describen se identifican por (i) aislar proteínas de tejido cervical normal y de tejido cervical cancerígeno utilizando un protocolo de purificación de matriz nuclear, como aquellos descritos generalmente en U.S Pat. No. 4,882,268 y 4,885,236, o Fey et al. (19869) supra (ii) fraccionando las preparaciones de proteína de matriz nuclear resultante por medio de electroforesis de gel 2-D, (iii) visualizando los patrones de proteína resultantes, por ejemplo, por coloración de plata, e (iv) identificando puntos polipeptídicos en los electroferogramas de gel 2-D resultantes que generalmente se detectan en muestras aisladas de células de cáncer cervical pero que no se detectan en muestras aisladas de células cervicales normales.

Proteínas indicadoras asociadas con tejido de cáncer cervical se aislaron como ya se ha descrito empleando una modificación del método Fey et al. (Fey et al. (1986) supra). En resumen, se pica tejido de cáncer cervical en pequeñas piezas (1 mm^{3}) y se homogenizan con mano de mortero Teflón® sobre hielo y se trata con una solución regulada que contiene 0.5% de Triton®-X-100, complejo de vanadilo ribosida con una cocktail de inhibidor de proteasa (fluoruro sulfonil fenilmetilo, aprotinina y leupeptina) para retirar los lípidos y las proteínas solubles. Células de tumor a partir de líneas celulares pueden cultivarse por tripsinización y se pueden tratar del mismo modo que a partir de tejido de tumor homogenizado. Se retiran agregados estromales filtrando el homogenado a través de una pantalla de nylon de 250 micrones seguido de un paso de centrifugación.

Las proteínas citoesquemáticas solubles se retiran incubando la bola en un buffer de extracción que contiene 250 Mm (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0.5% de Triton®-X-100, complejo de vanadilo ribosida con una cocktail de inhibidor de proteasa durante 10 minutos sobre hielo seguido de centrifugación. Se retira la cormatina incubando la bolaen ADNasa I en una solución regulada que contiene un cocktail de inhibidor de proteasa durante 45 minutos a 25ºC.

La fracción de bola restante, que contiene las proteínas objetivo y filamentos intermedios, se solubiliza en un buffer de desmontaje que contiene 8 M de urea, cocktail inhibidor de proteasa con 1% 2-mercaptoetanol. Los contaminantes insolubles, principalmente carbohidratos y matriz extracelular, se retiran mediante ultra centrifugación. Los filamentos intermedios pueden volverse a montar tras la retirada de la urea por diálisis en buffer de montaje que contiene cocktail de inhibidor de proteasa y se retiró mediante ultra centrifugación, dejando las proteínas objetivo en la fracción sobrenadante. La concentración de proteínas puede determinarse por el Kit Coomassie Plus Protein Assay (Pierce Chemical, Rockford, IL) empleando un estándar de globulina gamma bovina. Inmediatamente, las proteínas se precipitan en 80% de etanol y se almacenaron a -80ºC hasta su uso.

Se contempla que, después de la identificación, las proteínas asociadas al cáncer cervical resultantes pueden aislarse preparando una preparación de proteína de matriz nuclear, como la descrita anteriormente, sometiendo a electroforesis las proteínas resultantes en gel 2-D, y después algunos medios de visualización, aislando la proteína de interés del gel 2-D resultante. De modo alternativo, se contempla que la proteína indicadora, una vez identificada, puede aislarse, empleando metodologías de purificación de proteínas estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, tales como cromatografía de afinidad, para producir proteínas indicadoras sustancialmente puras. Como aquí se emplea, el término "sustancialmente puro" se entiende como al menos 80% puro como se determinó por electroforesis de gel de sodio dodecilsulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE).

2. Detección de Cáncer Cervical

Una vez que se han identificado las proteínas asociadas al cáncer cervical, pueden usarse como indicadores para determinar si un individuo tiene cáncer cervical y/o displasia cervical, y si es el caso, se pueden emplear métodos de detección adecuados para controlar el estado de la enfermedad.

Empleando las proteínas indicadoras, el experto en la técnica puede producir una variedad de métodos de detección para detectar cáncer cervical en un humano. Los métodos, típicamente comprenden los pasos para detectar, mediante algunos medios, la presencia de una o más proteínas asociadas a cáncer cervical en una muestra de tejido o fluido corporal de un humano. La precisión y/o fiabilidad del método para detectar cáncer cervical en un humano puede aumentar detectando la presencia de un conjunto de proteínas asociadas a cáncer cervical en una muestra de tejido o fluido corporal preseleccionado. El paso de detección puede constar de uno más de los protocolos descritos anteriormente.

2.A. Métodos de Detección de Proteínas

La proteína indicadora en una muestra puede reaccionar con una parte de molécula de enlace capaz de enlazar específicamente con la proteína indicadora. La parte de molécula que se enlaza puede contar, por ejemplo de un miembro de un par ligando-receptor, es decir, un par de moléculas capaces de tener una interacción de enlace específica. La parte de molécula de enlace puede constar, por ejemplo, de un miembro de un par específico de enlace, como anticuerpo-antígeno, enzima-sustrato, ácido nucleico-ácido nucleico, proteína-proteína u otro par específico de enlace conocido en la técnica. Las proteínas de enlace puede diseñarse para que tengan una mayor afinidad con la proteína objetivo. Opcionalmente, la parte de la molécula de enlace pude estar unida con una etiqueta detectable, como una etiqueta enzimática, fluorescente, radioactiva, fosforescente o coloreada. El complejo etiquetado o marcado puede detectarse, por ejemplo, visualmente o con la ayuda de un espectrofotómetro u otro detector.

Las proteínas indicadoras también pueden detectarse empleando técnicas de electroforesis de gel disponibles en la técnica. En electroforesis de gel bidimensional, las proteínas primero se separan en un gel de pH gradiente de acuerdo con su punto isoeléctrico. El gel resultante es posteriormente colocada en un segundo gel de poliacrilamida, y las proteínas se separan de acuerdo al peso molecular (ver, por ejemplo, O'Farrell (1975) J. Bil. Chem. 250: 4007-4021).

Una o más de las proteínas indicadoras pueden detectarse primero aislando proteínas de una muestra obtenida de un individuo sospechoso de tener cáncer cervical, y posteriormente preparando las proteínas por electroforesis de gel bidimensional para producir un patrón específico de electroforesis de gel bidimensional. Así, el patrón puede compararse con un patrón de gel estándar producido mediante la separación, bajo las mismas o similares condiciones, de proteínas aisladas de células cancerígenas o normales. El estándar puede aislarse u obtenerse en una base de datos electrónica de patrones de electroforesis. La presencia de una proteína asociada a cáncer cervical en un gel bidimensional significa una indicación de la presencia de un cáncer cervical en la muestra testada. La detección de una o más proteínas en el patrón de electroforesis de gel bidimensional aumenta además la precisión del ensayo. La presencia de un conjunto, por ejemplo, de dos a cinco, de proteínas asociadas a cáncer cervical en el gel bidimensional supone una clara indicación de la presencia de cáncer cervical en la muestra. El ensayo permite de este modo detectar y tratar de manera temprana el cáncer cervical.

2B. Ensayos de Inmunología

Una proteína indicadora asociada al cáncer cervical también puede detectarse utilizando cualquiera de las técnicas empleadas en los ensayos de inmunología disponibles en la técnica. Por ejemplo, el experto en la técnica puede emplear el formato de ensayo de sandwich para detectar cáncer cervical en una muestra de fluido corporal. De modo alternativo, el experto en la técnica puede usar procedimientos inmuno-histoquímicos convencionales para detectar la presencia de proteína asociada al cáncer cervical en una muestra de tejido, por ejemplo, en una citología, empleando una o más proteínas de enlace etiquetadas o marcadas (Ver Ejemplo 5, a continuación).

En un ensayo de inmunología sandwich, generalmente se emplean dos anticuerpos capaces de enlazar la proteína indicadora, por ejemplo, uno inmovilizado sobre un soporte sólido, y otro libre en una solución y marcado con compuesto químico detectable. Ejemplos de etiquetas o marcas químicas que pueden emplearse para el segundo anticuerpo incluyen radioisótopos, compuestos fluorescentes, y enzimas y otras moléculas que generan productos coloreados o activos electromecánicamente cuando se exponen a un sustrato reactivo o enzimático. Cuando una muestra que contiene la proteína indicadora se coloca en este sistema, la proteína indicadora se enlaza con el anticuerpo inmovilizado y con el anticuerpo marcado, para formar un complejo inmune "sandwich" sobre la superficie de soporte. La proteína compleja es detectada retirando los componentes de muestra no enlazados y el anticuerpo marcado en exceso, y midiendo la cantidad de anticuerpo marcado complejo a la proteína sobre la superficie de
soporte.

Tanto el ensayo de inmunología de sandwich como el proceso inmunohistoquímico de tejido son altamente específicos y muy concretos, teniendo en cuenta que se empleen etiquetas con buenos límites de detección. Un estudio detallado de diseño de ensayo inmunológico, teoría y protocolos puede encontrarse en numerosos textos en la técnica que incluye, "Practical Inmunology", Butt, WR., ed., (1984) Marcel Dekker, New York y "Antibodies, A Laboratory Approach" Harlow et al., eds. (1988) Cold Spring Harbor Laboratory.

En general, las consideraciones de diseño inmunológico incluyen preparaciones de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales y policlonales) que tienen especifidad de enlace suficientemente alta para la proteína objetivo para formar un complejo que pueda distinguirse de modo fiable de productos de interacciones no específicas. Como aquí se emplea, el término "anticuerpo" se entiende como proteínas de enlace, por ejemplo, anticuerpos u otras proteínas que constan de un dominio de enlace de región variable de inmunoglobulina, que tiene las afinidades y cualidades específicas apropiadas para la proteína objetivo. Cuanto más elevada es la especifidad de enlace del anticuerpo, menos es la concentración de proteína que puede ser detectada. Una especifidad de enlace preferente es aquella en la que la proteína de enlace tiene una afinidad de enlace para la proteína objetivo mayor que aproximadamente 10^{5}M^{-1}, preferentemente mayor que 10^{7}M^{-1}.

Los anticuerpos para una proteína asociada a cáncer cervical objetivo aislado que son útiles en ensayos para detectar un cáncer cervical en un individuo pueden generarse empleando procedimientos inmunológicos estándar conocidos y descritos en la técnica. Ver, por ejemplo, Practical Inmunology, Butt, N. R., ed., Marcel Dekker, NY, 1984. En resumen, se emplea una proteína objetivo aislada para aumentar los anticuerpos en un huésped xenogénico, como un ratón, una cabra o cualquier mamífero adecuado.

La proteína objetivo se combina con un adyuvante adecuado capaz de aumentar la producción de anticuerpos en el huésped, y se inyecta en el huésped, por ejemplo, a través de administración intraperitoneal. Se puede emplear cualquier adyuvante adecuado para estimular la respuesta inmune del huésped. Un adyuvante comúnmente usado es adyuvante completo de Freund (una emulsión que comprende las células microbiales muertas y secas y disponibles por ejemplo en Calbiochem Corp., San Diego, o Gibco, Grand Island, NY). Cuando se desean múltiples inyecciones de antígeno, las inyecciones posteriores constan del antígeno en combinación con un adyuvante incompleto (p.ej., emulsión libre de células).

Los anticuerpos policlonales puedes aislarse del huésped que produce anticuerpos extrayendo suero que contiene anticuerpos de la proteína de interés. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse aislando células huéspedes que producen el anticuerpo deseado, fusionando estas células con células mieloma empleando procedimientos estándar conocidos en la técnica inmunológica, y detectando las células híbridas (hibridomas) que reaccionan específicamente con la proteína objetivo y tienen la afinidad de enlace deseada.

Los dominios de enlace de anticuerpos también pueden producirse biosintéticamente y la secuencia de aminoácido puede manipularse para aumentar o mejorar la afinidad de enlace con un epítope en la proteína objetivo. En diferentes publicaciones se han descrito metodologías de anticuerpo específico. Una descripción más detallada de la preparación puede encontrarse, por ejemplo, en "Practical Inmunology" (1984) supra.

Además, los puntos de enlace del anticuerpo biosintético de ingeniería genética, también conocidos en el campo como BABS o sFv's, puede usarse en la práctica de la invención instantánea. Métodos para hacer y usar BABS comprenden (i) dímeros asociados de manera no covalente o V_{H} y V_{L} sintético enlace disulfuro, (ii) puntos de enlace de cadena sencilla VH-VL unidos covalentemente, (iii) dominios individuales V_{H} o V_{L}, o (iv) puntos de enlace de anticuerpo de cadena sencilla como los descritos en, por ejemplo, U.S Patent Nos.: 5,091,513; 5,132,405; 4,704,692; y 4,946,778.

Además, BABS que tienen la especifidad requerida para las proteínas asociadas al cáncer cervical pueden derivarse por clonación de anticuerpos phage a partir de bibliotecas de genes combinatorios (ver, por ejemplo, Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628). En resumen, una biblioteca de phage cada una de las cuales se expresa en su capa superficial, teniendo BABS regiones variables de inmunoglobulina codificadas por secuencias de genes de región variable derivadas de ratones pre-inmunizados con proteínas asociadas a cáncer cervical aislado, o fragmentos del mismo, se registran o comprueban para ver si poseen actividad de enlace contra la proteína asociada a cáncer cervical inmovilizada. Phage que puede enlazar con las proteínas asociadas a cáncer cervical inmovilizadas se cultivan y el gen que codifica BABS se convierte en una secuencia. Las secuencias de ácido nucleico resultantes que codifican los BABS de interés pueden expresarse en sistemas de expresión convencionales para producir la proteína BABS.

La proteína asociada al cáncer cervical aislada puede también usarse para el desarrollo de un diagnóstico y otros kits de ensayos evaluación de tejido con el fin de controlar el nivel de proteínas en una muestra de tejido o fluido. Por ejemplo, el kit puede incluir anticuerpos u otras proteínas de enlace específicas que se enlazan específicamente con las proteínas asociadas a cáncer cervical y que permiten la presencia y/o concentración de las proteínas asociadas a cáncer cervical para que se detecten y/o cuantifiquen en una muestra de tejido o fluido.

Se contempla que entre los kits adecuados para detectar proteínas asociadas al cáncer cervical se encuentra, por ejemplo, un recipiente u oros medios para capturar una muestra para ser evaluada, y medios para detectar la presencia y/o cantidad en la muestra de una o más proteínas asociadas al cáncer cervical aquí descritas. Como aquí se emplea, "medios para detectar" en una realización incluyen uno o más anticuerpos específicos para estas proteínas y medios para detectar el enlace de anticuerpos a estas proteínas por medio de, por ejemplo, un ensayo de inmunología sandwich estándar como el descrito anteriormente. Cuando se detecta la presencia de una proteína dentro de una célula, por ejemplo, a partir de una muestra de tejido, el kit también puede constar de medios para deteriorar la estructura celular y para exponer proteínas intracelulares.

2.C. Ensayos basados en Ácido Nucleico

La presencia de un cáncer cervical en un individuo también puede determinarse detectando, en una muestra de tejido o fluido corporal, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína asociada a cáncer cervical. Empleando métodos conocidos por los expertos, las proteínas asociadas a cáncer cervical de la invención pueden secuenciarse, y posteriormente, basándose en la secuencia determinada, se diseñan pruebas oligonucleótido para comprobar una biblioteca cADN (ver, por ejemplo, Maniatis et al. (1989) supra)

Una molécula objetivo de ácido nucleico que codifica una proteína indicadora asociada a cáncer cervical puede detectarse empleando una parte de molécula de enlace marcada, capaz de enlazar específicamente el ácido nucleico objetivo. La parte de molécula de enlace puede constar, por ejemplo, de una proteína, un ácido nucleico o un ácido nucleico peptídico. Además, un ácido nucleico objetivo, como un mARN que codifica una proteína asociada a cáncer cervical, puede detectarse llevando a cabo, por ejemplo, un análisis de la mancha Northern utilizando oligonucleótidos marcados, por ejemplo, fragmentos de ácido nucleico complementarios y capaces de hibridizar específicamente con al menos una porción de un ácido nucleico objetivo. Mientras cualquier longitud de oligonucleótido puede utilizarse para hibridizar una trascripción un mARN, se prevé que oligonucleótidos típicamente dentro del intervalo 8-100 nucleótidos, preferiblemente dentro del intervalo 15-50 nucleótidos son los más útiles en ensayos de hibridización estándar.

El oligonucleótido seleccionado para hibridizar el ácido nucleico objetivo, bien sintetizado químicamente o por metodologías de ADN recombinante, se aísla y purifica mediante técnicas estándar y después se marca o etiqueta (p. ej., con ^{35}S o ^{32}P) utilizando protocolos estándar de etiquetaje. Una muestra que contiene el ácido nucleico objetivo se extiende sobre un gel electroforesis, los ácido nucleicos dispersos se traspasaron a un filtro de nitrocelulosa y el oligonucleótido marcado se expuso al filtro bajo condiciones de hibridización adecuadas, por ejemplo, 50% de formamida, 5 X SSPE, 2 X Solución Denhardt, 0.1% SDS a 42ºC, como se ha descrito en Maniatis et al. (1989) supra. Otros procedimientos útiles conocidos en la técnica incluyen hibridización de solución, e hibridización ARN de punto y ranura. Opcionalmente, la cantidad de ácido nucleico objetivo presente en una muestra puede cuantificarse midiendo la radioactividad de fragmentos hibridizados, empleando procedimientos estándar conocidos en la técnica.

Además, también pueden emplearse los oligonucleótidos para identificar otras secuencias que codifican miembros de las familias de proteínas objetivo. La metodología también puede usarse para identificar secuencias genéticas asociadas con las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas aquí descritas, por ejemplo, para identificar secuencias no codificadoras que se encuentran en dirección ascendente o descendente de la secuencia codificadora de proteína, y que puede jugar un papel funcional en la expresión de estos genes. Además, los ensayos de enlace pueden llevarse a cabo para identificar y detectar proteínas capaces de una interacción específica de enlace con un ácido nucleico que codifica una proteína asociada a cáncer cervical, que puede verse implicada, por ejemplo, en la regulación de genes o en la expresión de genes de la proteína.

En otra realización, los ensayos aquí descritos pueden emplearse para identificar y detectar moléculas de ácido nucleico que comprendan una secuencia capaz de reconocer y que esté específicamente enlazada por una proteína asociada a cáncer cervical.

Además, se anticipa que mediante el empleo de una combinación de cebos oligonucleótidos apropiados, es decir, más de un cebo, el experto debe determinar el nivel de expresión de un gen objetivo in vivo por medio de procedimientos de reacción en cadena de polimerasa estándar (PCR), por ejemplo, en Innes et al. (1990) "PCR Protocols; A guide to methods and Applications", Academic Press e Innes et al. (1995) "PCR Strategies" Academic Press, San Diego, CA.

3. Identificación de Proteínas que interactúan in vivo con Proteínas asociadas a cáncer cervical

Además, se contempla que el experto, utilizando procedimientos como aquellos descritos a continuación, puede identificar otras moléculas que interactúan in vivo con las proteínas asociadas a cáncer cervical aquí descritas. Tales moléculas pueden proporcionar objetivos para quimioterapia.

Como modo de ejemplo, cADN que codifica proteínas o peptídicos capaz de interactuar con proteínas asociadas a cáncer cervical pueden determinarse mediante un ensayo dos-híbrido, como se expone en Durfee et al. (1993) Genes & Develop. 7: 555-559.

El principio del sistema de dos híbrido es que la interacción no covalente de dos proteínas desencadena un proceso (trascripción) en el cual estas proteínas normalmente no juegan un papel directo, debido a su unión covalente a los dominios que funcionan en este proceso. Por ejemplo, en el ensayo dos-híbrido, la expresión detectable de un gen informador ocurre cuando dos proteínas de fusión, una conteniendo un dominio de enlace ADN y otra conteniendo un dominio de iniciación de interacción, interactúan.

El experto en la técnica puede emplear una célula huésped que contiene una o más proteínas informadoras, como tipo levadura Y153, expuesto en Durfee et al. (1993) supra. Este tipo transporta dos genes informadores localizados en los cromosomas cuya expresión se regula por Gal4. Un primer gene informador, es el gene E. coli IacZ bajo el control del impulsor Gal4. Un segundo gene informador es el gene seleccionable HIS. Otros genes informadores útiles incluyen, por ejemplo, el gene luciferasa, el gen LEU2, y el gene GFP (Green Fluorescent Protein).

Se utilizan dos conjuntos de plasmids en el sistema dos híbrido. Un conjunto de plasmids contiene ADN que codifica un dominio de enlace ADN Gal 4 fusionado en el armazón a ADN que codifica la proteína asociada a cáncer cervical. El otro conjunto de plasmids contiene ADN que codifica un dominio de activación Gal4 fusionado con porciones de una biblioteca de cADN humano construido a partir de linfocitos humanos. La expresión del primer conjuntos de plasmids resulta en una proteína de fusión que comprende un dominio de enlace Gal4 ADN y una proteína asociada a cáncer cervical. La expresión del segundo conjunto de plasmids produce una proteína de activación trascripción fusionada con una producto de expresión de la biblioteca cADN linfocito. Cuando los dos plasmids se transforman en una célula huésped de galón deficiente, como la célula Y153 levadura descrita anteriormente, la interacción del dominio de enlace Gal ADN y el dominio de activación trascripción tienen lugar solamente si la proteína asociada al cáncer cervical fusionada con el dominio de enlace ADN se enlaza con una proteína expresada a partir biblioteca cADN linfocitos fusionada con el dominio de activación trascripción. Como resultado de la interacción proteína-proteína entre la proteína asociada a cáncer cervical y su pareja de enlace in vivo, se dan niveles detectables de expresión de genes informadores.

Además de identificar moléculas que interactúan in vivo con las proteínas asociadas a cáncer cervical, el experto en la técnica debe también examinar moléculas, por ejemplo, pequeñas moléculas que alteran o inhiben interacción específica entre la proteína asociada a cáncer cervical y su pareja de enlace in vivo.

Por ejemplo, la célula huésped puede ser traspasada con ADN que codifica un adecuado dominio de enlace ADN/híbrido de proteína asociada a cáncer cervical, y una dominio activación translación/pareja de enlace de proteína asociada al supuesto cáncer cervical, como se ha descrito anteriormente. La células huésped también contiene un gen informador adecuado en asociación operativa con un elemento de activación trascripción cis activo que se reconoce mediante el dominio de enlace ADN del factor de trascripción. Se prueba el nivel de gen informador expresado en el sistema. Posteriormente, la célula huésped es expuesta a una molécula candidata y se detecta el nivel de la expresión del gen informador. Una reducción den la expresión del gen informador es indicativa de la habilidad del candidato para interferir con formación o estabilidad compleja con respecto a la proteína asociada a cáncer cervical y su pareja de enlace in vivo. Como un control, también se prueba la habilidad de la molécula candidata para interferir con otra, complejos proteína-proteína no relacionados. Moléculas capaces de interferir específicamente con una proteína asociada a cáncer cervical/interacción de pareja de enlace, pero no otras interacciones proteína-proteína, se identifican como candidatas para la producción y para análisis adicionales. Una vez que se ha identificado un candidato potencial, se prueba su eficacia en modular células de modo cíclico y en la réplica celular en un sistema de modelo cíclico estándar.

Las moléculas candidatas se pueden producir como se describe a continuación,. Por ejemplo, ADN que codifica las moléculas candidatas pueden insertarse, utilizando técnicas convencionales descritas en la técnica (ver, por ejemplo, Maniatis (1989) supra) en cualquiera de las variedades de vectores de expresión y se transfiere a una célula huésped apropiada para producir proteínas recombinantes, incluyendo formas de completa longitud o truncadas. Células huésped útiles incluyen, E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, el sistema celular de insecto/baculaviurs, células mieloma, y varias otras células de mamíferos. Las formas de longitud completa de tales proteínas se expresan preferentemente en células de mamíferos, como aquí se describe. Las secuencias de nucleótidos incluyen preferentemente una secuencia para dirigir la secuencia trasladada al núcleo, utilizando, por ejemplo, una secuencia que codifica los ocho núcleos de aminoácido que dirigen la secuencia del gran antígeno T, que está bien caracterizado en la técnica. El vector puede además incluir varias secuencias para mejorar la correcta expresión de la proteína recombinante, incluyendo el impulsor de trascripción y las secuencias de terminación, secuencias de mejora, secuencias de puntos de enlace de ribosoma preferente, secuencias líder de mARN preferente, secuencias de proceso de proteínas preferentes, secuencias de señal preferente para secreción de proteínas y similares. La secuencia ADN que codifica el gen de interés puede también manipularse para retirar potencialmente secuencias inhibidoras o para minimizar la formación de estructuras secundarias no deseadas. Como el propio experto podrá apreciar, la proteína recombinante puede también expresarse como una proteína de fusión.

Después de la traslación, la proteína puede purificarse a partir de las propias células o recuperarse a partir del medio de cultivo. El ADN también puede incluir secuencias que ayudan en expresión y/o purificación de la proteína recombinante. El ADN puede expresarse directamente o puede expresarse como parte de una proteína de fusión que tiene una unión de fusión fácilmente divisible.

El ADN también puede expresarse en un huésped mamífero adecuado. Huéspedes adecuados incluyen células fibroblasta 3T3 (p. ej., NIH 3T3, de CRL 1658) COS (riñón de simio ATCC, CRL-1650) o células CHO (Ovario de hámster chino) (p. ej., CHO-DXB11, de Chasin (1980) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 77: 4216-4222), células epiteliales de pulmón de visón (MV1 Lu), células fibroblasta de prepucio humano, células gliobastoma humanas, y células teratocarcinoma. Otros sistemas celulares de eucariocitos útiles incluyen células de levadura, sistemas de insecto/baculovirus o células mieloma.

Con el fin de expresar una molécula candidata, el ADN es subclonado en un punto de inserción de un vector adecuado y comercialmente disponible junto con secuencias adecuadas de impulso/mejora y secuencias de terminación 3'. Combinaciones útiles de secuencia de impulso/mejora incluyen el impulsor CMV (impulsor de citomeglovirus humano (MIE)) presente, por ejemplo, en pCDM8, así como el implusor de virus de tumo mamario (MMTV) estimulado por el virus sarcoma Rous LTR secuencia de mejora (p. ej., de Clontech, Inc., Palo Alto). Un impulsor que se pueda inducir útil, incluye, por ejemplo, un impulsor que se pueda inducir A Zn^{2+}, como el impulsor metalotionein Zn^{2+} (Wrana et al. (1992) Cell 71: 1003-1014). Otros impulsores son bien conocidos en la técnica y puedes emplearse con similares óptimos resultados. Expresión también puede además mejorarse utilizando secuencias de mejora de tras-activación. El plasmad también contiene preferentemente un indicador que puede amplificarse, como DHFR bajo control de impulsión adecuado, por ejemplo, SV40 primer impulsor (ATCC #37148). Las condiciones de transfección, el cultivo de células, la amplificación de genes y la expresión de proteínas son condiciones estándar, bien conocidas en la técnica, como ya se ha descrito, por ejemplo en Ausubel et al., ed., (1989) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY. En resumen, las células transfectadas se cultivan en un medio que contiene 5-10% de suero de ternero fetal dializado (dFCS), y líneas de células de alta expresión establemente transfectadas obtenidas por amplificación y subclonación y se evalúan por medio de análisis de mancha Western y Northern. Las manchas Southern también pueden emplearse para calcular el estado de secuencias integradas y la extensión de su amplificación de número de copia.

La proteína candidata expresada es posteriormente purificada empleando procedimientos estándar. Una metodología preferente actualmente usa una columna de afinidad, como una columna de afinidad de ligando o una columna de afinidad de anticuerpo. La columna es después lavada, y las moléculas candidatas se eluyen de manera selectiva en un gradiente de fuerza iónica ascendente, cambios en pH, o adición de detergente suave. Se aprecia que además de las moléculas candidatas que enlazan con proteínas asociadas a cáncer cervical, las propias proteínas asociadas a cáncer cervical pueden asimismo producirse empleando tales tecnologías de ADN recombinante.

4. Terapia de Cáncer Cervical y Métodos para Controlar la Terapia

El experto en la técnica, después de identificar las proteínas asociadas a cáncer cervical y proteínas que interactúan con las proteínas asociadas a cáncer cervical, puede desarrollar una variedad de terapias para tratar cáncer cervical. Debido a que las proteínas indicadoras aquí descritas están presentes a niveles altamente detectables en células de cáncer cervical en relación con células no pertenecientes a cáncer cervical, el experto puede emplear, por ejemplo, las proteínas indicadoras y/o ácidos nucleicos que codifican las proteínas indicadoras como moléculas objetivo para una quimioterapia de cáncer.

4.A. Terapias basadas en anti-sentido

Una terapia de cáncer particularmente útil es una secuencia de nucleótidos o ácido nucleico peptídico complementaria y capaz de hibridizar bajo condiciones fisiológicas para parte o todo el gen que codifica la proteína indicadora o parte o todo de la trascripción que codifica la proteína indicadora reduciendo o inhibiendo de este modo la trascripción/traslación del gen de proteína indicadora. De modo alternativo, se pueden aplicar las mismas tecnologías para reducir o inhibir la trascripción/traslación de las proteínas que interactúan con las proteínas asociadas a cáncer cervical.

Se han empleado de manera extensiva oligonucleótidos anti-sentido para inhibir la expresión genética en células normales y anormales. Ver, por ejemplo, Stein et al. (1988) Cancer Res. 48: 2659-2668, para una consulta pertinente de teoría anti-sentido y protocolos establecidos. Además, la síntesis y uso de ácidos nucleicos peptídicos como terapias basadas en anti-sentido se describen en publicaciones PCT PCT/EP92/01219 publicado el 26 de noviembre, 1992, PCT/US92/10921 publicado el 24 de junio, 1993, y PCT/US94/013523 publicado el 1 de junio, 1995.

De este modo, las terapias basadas en anti-sentido pueden emplearse como parte de quimioterapia, solas o en combinación con otras terapias.

Secuencias de oligonucleótidos anti-sentido y de ácido nucleico peptídicos son capaces de hibridizar a un gen y/o trascripción mARN y, por lo tanto, pueden usarse para inhibir trascripción y/o traslación de la proteína aquí descrita. Se aprecia, sin embargo, que las secuencias de oligonucleótidos son generalmente más susceptibles de ataque enzimático por ribonucleasas que las secuencias de deoxiribonucleótidos. De ahí que se prefieren los oligodeoxiribonucleótidos a los oligoribonucleótidos para uso en terapias in vivo. Se aprecia que las secuencias de ácido nucleico peptídico, a diferencia de las secuencias de ácido nucleico normales, no son susceptibles de degradación de nucleasa y, por lo tanto, tienden a tener una mayor longevidad in vivo. Además, se aprecia que las secuencias de ácido nucleico peptídico enlazan a ADN sencillo complementario varado y ARN vara de manera más fuerte que las secuencias correspondientes de ADN (ver, por ejemplo, PCT/EP92/20702 publicado el 26 de noviembre, 1992). De este modo, se prefieren las secuencias de ácido nucleico peptídico para uso terapéutico in vivo.

Secuencias de ácido nucleico peptídico o oligonucleótidos anti-sentido terapéuticamente útiles pueden sintetizarse mediante cualquiera de las metodologías químicas conocidas de síntesis de ácidos nucleicos peptídicos y oligonucleótidos y que se describen con detalle en la técnica. De modo alternativo, una secuencia complementaria para parte o toda la secuencia del natural mARN puede generarse empleando tecnologías estándar de ADN recombinante.

Ya que la secuencia completa de nucleótido que codifica toda la proteína indicadora al igual que las secuencias adicionales 5' y 3' no trasladadas son conocidas por cada una de las proteínas indicadoras y/o pueden determinarse fácilmente empleando técnicas bien conocidas en la técnica, oligonucleótidos anti-sentido o ácidos nucleicos peptídicos que hibridizan con cualquier porción de la trascripción mARN o secuencias no codificadoras pueden prepararse utilizando metodologías convencionales de síntesis de ácidos nucleicos peptídicos y oligonucleótidos.

Oligonucleótidos complementarios, y que puedan hibridizarse con una porción de las trascripciones mARN que codifican las proteínas indicadoras son, en principio, efectivas para inhibir la traslación de las proteínas objetivo como aquí se describen. Por ejemplo, como se describe en U.S. Pat. No. 5,098,890, presentada el 24 de marzo, 1992, oligonucleótidos complementarios a mARN en o cerca del punto del codón de iniciación de traslación puede emplearse para inhibir la traslación. Además, se ha sugerido que las secuencias que están demasiado distantes en la 3' dirección del punto de iniciación de traslación pueden ser menos efectivas para hibridizar las trascripciones mARN debido al potencial de ribosoma "read-through", un fenómeno a través del cual el ribosoma es postulado para desenmarañar el dúplex anti-sentido/sentido para permitir la traslación del mensaje.

Una variedad de longitudes de secuencia de oligonucleótido o ácido nucleico peptídico puede emplearse para hibridizar las trascripciones mARN. Sin embargo, secuencias muy cortas (por ejemplo, secuencias que contienen menos de 8- 15 nucleobasas) pueden enlazar con menos especifidad. Además, para uso in vivo, secuencias cortas de oligonucleótido pueden ser particularmente susceptibles a degradación enzimática. Ácidos nucleicos peptídicos, como se ha mencionado anteriormente, tienden a resistir la degradación de nucleasa. Donde secuencias de oligonucleótido o ácido nucleico peptídico se proporcionan directamente a las células, secuencias muy largas pueden ser menos efectivas en la inhibición debido a la respuesta disminuida por la célula objetivo. De este modo, donde el oligonucleótido o ácido nucleico peptídico es para proporcionar directamente a células objetivo, secuencias de oligonucleótido o ácido nucleico peptídico que contienen aproximadamente 8-50 nucleobases, y más preferentemente 15-30 nucleobases, se supone que son más ventajosas.

Un modo alternativo para proporcionar secuencias de oligonucleótido anti-sentido para una célula objetivo es terapia genética donde, por ejemplo, una secuencia ADN, preferentemente como parte de un vector a asociada con un impulsor, se expresa de manera constitutiva dentro de la célula objetivo. Recientemente, Oeller et al. (Oelller et al. (1992) Science 254: 437-539, donde se describía que la inhibición in vivo de la enzima sintasa ACC empleando una secuencia de ADN que se exprese de manera constitutiva que codifica una secuencia anti-sentido a toda la longitud de la trascripción de sintasa ACC. Por consiguiente, donde se proporcionan las secuencias de oligonucleótidos anti-sentido a una célula objetivo indirectamente, por ejemplo, como parte de una secuencia de gen expresable para que se exprese dentro de la célula, se pueden emplear de manera ventajosa secuencias más largas de oligonucleótidos, incluyendo secuencias complementarias a sustancialmente todas las secuencias que codifican proteínas.

Finalmente, secuencias de oligonucleótidos terapéuticamente útiles incluyen no sólo oligómeros nativos compuestos de nucleótidos que ocurren naturalmente, sino que también comprenden nucleótidos modificados para, por ejemplo, mejorar la estabilidad y solubilidad de lípidos y por lo tanto mejorar la respuesta o absorción celular. Por ejemplo, se conoce que la solubilidad de lípidos mejorada y/o resistencia a digestión de nucleasa resulta tras sustituir un grupo de metilo o átomo de sulfuro por un oxígeno de fosfato en la unión fosfodiéster internucleótidoa ("S-oligonucleótidos" donde un fosfato de oxígeno es sustituido por un átomo de sulfuro), en particular, son estables a hendiduras o grietas de nucleasa, son solubles en lípidos, y son preferibles, en particular para administración directa de oligonucleótidos. S- oligonucleótidos puede sintetizarse químicamente empleando metodologías de síntesis convencional bien conocidas y descritas en la técnica.

Uniones de internucleósido sintético preferente incluyen fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioato, ésteres-fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, fosfato-triésteres, acetamidato y ésteres-carboximetilo. Además, uno o más del grupo 5'-3' fosfato puede estar covalentemente unido a un grupo orgánico de bajo peso molecular (p. ej., 15-500 Da), por ejemplo, cadenas de alkil bajas o grupos alifáticos (p. ej., metilo, etilo, propilo, butilo) alkil sustituido y grupos alifáticos (p. ej., aminoetilo, aminopropilo, amino hidroxietilo, amino hidroxipropilo), pequeños sacáridos o grupos glicosil. Otras modificaciones de bajo peso molecular orgánico incluyen adiciones a las uniones de fosfato internucleósido tales como colesterilo o compuestos de diamina con números variables de residuos de carbono entre grupos amino y ribosa terminal. Oligonucleótidos con estas uniones o con otras modificaciones pueden prepararse empleando métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, U.S. Pat. No. 5,149,798).

Secuencias adecuadas de oligonucleótidos o ácido nucleico peptídico que inhiben trascripción y/o traslación de las proteínas indicadoras pueden identificarse mediante pruebas estándar in vivo bien caracterizadas en la técnica. Preferentemente, se emplea un rango de dosis para determinar concentraciones efectivas para la inhibición así como especifidad de hibridización. Por ejemplo, en los casos de un oligonucleótido, un rango de dosis de 0-100 \mug secuencias de oligonucleótidos/ml puede ensayarse. Además, los oligonucleótidos pueden ser trasfectados a las células en una sola transfección, o como parte de una serie de transfecciones. Eficacia anti-sentido puede determinarse ensayando un cambio en la proliferación celular durante el tiempo seguido a la transfección, empleando metodologías contadoras de células estándar y/o ensayando para reducir la expresión de la proteína indicadora, por ejemplo, por inmunofluorescencia. De manera alternativa, la habilidad de las células para aceptar y usar timidina es otro medio estándar de ensayo para la división celular y aquí se puede usar, p. ej., usando ^{3}H timidina. Inhibición efectiva anti-sentido debería inhibir la división celular de manera suficiente como para reducir la absorción de timidina, inhibir la proliferación celular, y/o reducir los niveles detectables de proteínas indicadoras.

Se anticipa que las concentraciones terapéuticamente efectivas de oligonucleótido o ácido nucleico peptídico pueden variar de acuerdo con la naturaleza y extensión del neoplasma, la secuencia particular de nucleobase empleada, la relativa sensibilidad del neoplasma a la secuencia de oligonucleótido o ácido nucleico peptídico, y otros factores. Rangos útiles para una tipo de célula dado y oligonucleótido o ácido nucleico peptídico pueden determinarse llevando a cabo experimentos de rango de dosis estándar. Los experimentos de rango de dosis también pueden llevarse a cabo para calcular los niveles de toxicidad para células normales y malignas. Se contempla que concentraciones útiles pueden estar en el intervalo entre 1 a 100 \mug/ml por 10^{5} células.

Para uso in vivo, las secuencias de oligonucleótido anti-sentido o ácido nucleico peptídico pueden estar combinadas con un portador farmacéutico, tal como un vehículo líquido adecuado o un excipiente, y de manera opcional un aditivo auxiliar o aditivos. Los vehículos líquidos o excipientes son convencionales y están comercialmente disponibles. Ejemplos de ellos son agua destilada, salina fisiológica, soluciones acuosas de dextrosa, y similares. Para terapias de cáncer in vivo, las secuencias anti-sentido pueden proporcionarse preferentemente directamente hacia las células malignas, por ejemplo, por inyección directamente sobre el tumor. De modo alternativo, el oligonucleótido o ácido nucleico peptídico puede administrarse sistemáticamente, siempre y cuando la secuencia anti-sentido está asociada con medios para dirigir las secuencias a las células malignas objetivo.

Además de la administración con portadores convencionales, las secuencias de oligonucleótido anti-sentido o ácido nucleico peptídico pueden administrarse por medio de una variedad de técnicas especializadas de envío de oligonucleótidos. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden encapsularse en liposomas, como se describe en Mannino et al. (1988) BioTechnology 6: 682, y Feigner et al. (1989) Bethesda Res. Lab. Focus 11:21. Lípidos útiles para producir formulaciones de liposomas incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos bile, y similares. La preparación de tales formulaciones de liposoma forma parte del nivel preparatorio del experto en la técnica (ver, por ejemplo, en U.S. Pat. No. 4,235,871; U. S. Pat. No. 4,501,728; U.S. Pat. No. 4,837,028; y U.S. Pat. No. 4,737,323). La composición farmacéutica de la invención puede además incluir compuestos tales como ciclodextrina y similares que mejorar el envío de oligonucleótidos a las células. Cuando la composición no se administra sistemáticamente, sino que se inyecta en el punto de las células objetivo, se pueden añadir detergentes catiónicos (p. ej. Lipofectina) para mejorar la absorción. Además, envolventes de virus reconstituidos han sido empleados de manera exitosa para enviar ADN y ARN a las células (ver, por ejemplo, Arad et al. (1986) Biochem. Biophy. Acta. 859: 88-94).

Para uso terapéutico in vivo, las secuencias de oligonucleótido anti-sentido y/o ácido nucleico peptídico se administran al individuo en una cantidad terapéuticamente efectiva, por ejemplo, una cantidad suficiente para reducir o inhibir la expresión de proteína objetivo en células malignas. La dosis real administrada puede tenerse en cuenta si la naturaleza del tratamiento es profiláctico o terapéutico en naturaleza, la edad, peso, salud del paciente, la ruta de administración, el tamaño y naturaleza del mal, así como otros factores determinantes. La dosis diaria suele variar en el intervalo de 0.01 a 1,000 mg por día. Cantidades mayores o menores de secuencias de oligonucleótido anti-sentido o ácido nucleico peptídico pueden administrarse si es necesario. Como el propio experto en medicina podrá apreciar, y en particular el experto en quimioterapia, dosis apropiadas para administración in vivo supondrá experimentación rutinaria para el clínico/a. Como una guía preliminar, las concentraciones efectivas para inhibición in vitro de la molécula objetivo pueden determinarse en primer lugar.

4.B. Terapias basadas en el Enlace de Proteínas

Como se ha mencionado anteriormente, una proteína indicadora de cáncer o una proteína que interactúa con la proteína indicadora de cáncer puede usarse como un objetivo para quimioterapia. Por ejemplo, una proteína de enlace diseñada para enlazar la proteína indicadora esencialmente y de manera irreversible puede ser proporcionada a las células malignas, por ejemplo, por asociación con un ligando específico para la célula y que se pueda absorber por la célula. Medios para dirigir moléculas a células particulares y tipos de células son descritos en la técnica de quimioterapia.

Las proteínas de enlace puede obtenerse y probarse usando tecnologías bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las porciones de enlace de anticuerpos pueden usarse como ventaja. Sin embargo, se contempla que los anticuerpos intactos o BABS, que preferiblemente han sido humanizados, pueden emplearse en la práctica de la invención. Como aquí se emplea, el término "humanizado" se entiende como el proceso a través del cual las secuencias de región de marco de una región variable de inmunoglobulina no humana se sustituyen por secuencias de región variable humanas. Por consiguiente, se contempla que tales proteínas de enlace humanizadas provocarán una respuesta inmune más débil que sus homólogas no humanizadas. Son particularmente útiles las proteínas de enlace identificadas con alta afinidad para la proteína objetivo, p. ej, mayor que aproximadamente 10^{9}M^{-1}. De modo alternativo, ADN que codifica la proteína de enlace pude proporcionarse a la célula objetivo como parte de un gen expresable que se expresa dentro de la célula tras los procesos empleados para protocolos de terapia de gen descritos en la técnica. Ver, por ejemplo, U. S. Patent No. 4,497,796, y "Gene Transfer", Vijay R. Baichwal, ed., (1986). Se anticipa que, una vez enlazada por proteína de enlace, la proteína objetivo será desactivada o su actividad biológica se verá reducida inhibiendo o retardando de este modo la división celular.

Como se ha descrito anteriormente, proteínas de enlace adecuadas para uso in vivo, pueden combinarse con un portador farmacéutico adecuado, como salina fisiológica u otros portadores útiles bien caracterizados en el campo médico. Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse directamente a las células malignas, por ejemplo, por medio de inyección directa, o pueden proporcionarse sistemáticamente, siempre y cuando la proteína de enlace esté asociada con medios para dirigir la proteína a las células objetivo. Finalmente, se deben calcular rangos de dosis adecuados y niveles de toxicidad celular adecuados mediante el empleo de experimentos de rango de dosis estándar. Concentraciones terapéuticamente efectivas oscilan en el rango de aproximadamente entre 0.01 y 1,000 mg por día. Como se ha descrito anteriormente, las dosis reales administradas pueden variar dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del mal, la edad, peso y salud del individuo, así como de otros factores.

4.C. Terapias basadas en Pequeña Molécula

Después de haber aislado las proteínas de matriz nuclear asociadas a cáncer cervical, el experto en la técnica puede, mediante metodologías conocidas en la técnica, puede examinar bibliotecas de pequeña molécula (bibliotecas basadas en péptido o no-péptido) para identificar moléculas candidatas que reducen o inhiben la función biológica de las proteínas asociadas a cáncer cervical. Las pequeñas moléculas preferiblemente llevan a cabo esta función reduciendo la expresión in vivo de la molécula objetivo, o interactuando con las molécula objetivo para inhibir de este modo la actividad biológica de molécula objetivo o una interacción entre la molécula objetivo y su pareja de enlace in vivo. Se contempla que, una vez que las moléculas pequeñas han sido esclarecidas, el experto en la técnica puede aumentar la eficacia de la pequeña molécula usando métodos racionales de diseño de drogas. De modo alternativo, el experto en la técnica puede usar una variedad de programas de ordenador que ayudan al experto en la técnica a desarrollar relaciones de actividad estructural cuantitativa (QSAR) que además ayudan al diseño de moléculas candidatas adicionales de novo. Una vez identificadas, las pequeñas moléculas pueden producirse en cantidades comerciales y quedan sujetas a los estudios de seguridad y eficacia apropiados.

Se contempla que las pruebas de revisión puedes estar automatizadas facilitando de este modo la revisión de un gran número de pequeñas moléculas al mismo tiempo. Tales procesos de automatización están en el nivel formativo del experto en la técnica de investigación de drogas y, por lo tanto, aquí no se describen. Las pequeñas moléculas basadas en péptido candidato pueden producirse por expresión de una secuencia apropiada de ácido nucleico en una célula huésped o empleando químicas sintéticas u orgánicas. De modo similar, las pequeñas moléculas basadas en no-péptido pueden producirse mediante químicas orgánicas sintéticas bien conocidas en la técnica.

Como se ha descrito anteriormente, para uso in vivo, las moléculas pequeñas identificadas pueden combinarse con un portador farmacéutico adecuado, tales como salina fisiológico u otros portadores útiles bien caracterizados en el campo médico. Las composiciones farmacéuticas pueden proporcionarse directamente a las células malignas, por ejemplo, por medio de inyección directa, o pueden proporcionarse sistemáticamente, siempre y cuando la proteína de enlace esté asociada con medios para dirigir la proteína a las células objetivo. Finalmente, se deben calcular rangos de dosis adecuados y niveles de toxicidad celular adecuados mediante el empleo de experimentos de rango de dosis estándar. Como se ha descrito anteriormente, las dosis reales administradas pueden variar dependiendo, por ejemplo, de la naturaleza del mal, la edad, peso, salud del paciente, así como otros factores determinantes.

4.D. Métodos para Controlar el Estado de Cáncer Cervical en un Individuo

La progresión del cáncer cervical o la eficacia terapéutica de la quimioterapia puede medirse utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la eficacia de un agente quimioterapéutico particular puede determinarse midiendo la cantidad de una proteína asociada a cáncer cervical que se suelta de células de cáncer cervical que están sometidas a muerte celular. Como se describe en la publicación PCT/US92/09220, publicado el 13 de mayo, 1993, las proteínas solubles del matriz nuclear y los fragmentos de las mismas son soltados por las células tras las muerte celular. Tales proteínas solubles de matriz nuclear pueden cuantificarse en un fluido corporal y se pueden emplear para controlar el grado o tasa de muerte celular en un tejido.

Por ejemplo, la concentración de proteínas de matriz nuclear solubles en fluido líquido o un fragmento de las mismas soltadas de células es comparado con tejido sano, no-tratado. Se recogen muestras de fluido a intervalos discretos durante el tratamiento y se comparan con muestras estándar. Se considera que los cambios en el nivel de una proteína asociada a cáncer cervical soluble de fluido corporal, serán indicativos de la eficacia del tratamiento (es decir, la tasa de muerte de células cancerígenas). Se considera que el escape o liberación de proteínas de matriz nuclear interior soluble de fluido corporal puede medirse en sangre, plasma, orina, esputo, secreción vaginal y exudado de pecho.

Cuando el ensayo o prueba se emplea para controlar la viabilidad del tejido o progresión de cáncer cervical, el paso para detectar la presencia y abundancia de la proteína indicadora o su trascripción en muestras de interés se repite a intervalos y estos valores son posteriormente comparados, y los cambios en las concentraciones detectadas reflejan cambios en el estado del tejido. Por ejemplo, un aumento en el nivel de proteínas asociadas a cáncer cervical puede estar correlacionado con progresión del cáncer cervical. Donde el ensayo se emplea para evaluar la eficacia de una terapia, los pasos de control tienen lugar tras la administración del agente o proceso terapéutico (es decir, después de la administración de un agente quimioterapéutico o después de un tratamiento de radiación). De modo similar, un descenso en el nivel de proteínas asociadas a cáncer cervical puede estar en correlación con una regresión de cáncer cervical.

Por lo tanto, el cáncer cervical puede identificarse por la presencia de proteínas asociadas a cáncer cervical tal y como aquí se ha mostrado. Una vez identificada, el cáncer cervical puede tratarse usando compuestos que reducen in vivo la expresión y/o actividad biológica de las proteínas asociadas a cáncer cervical. Además, los métodos aquí proporcionados pueden emplearse para controlar la progresión de la enfermedad y/o tratamiento de la enfermedad. Los siguientes ejemplos no limitativos facilitan detalles del aislamiento y caracterización de proteínas asociadas a cáncer cervical y métodos para su uso en la detección de cáncer cervical.

Ejemplo 1 Aislamiento de Proteínas de Matriz Nuclear Asociadas a Cáncer Cervical a Partir de Muestras de Tejido Cervical y Líneas Celulares

Se identificaron proteínas asociadas a cáncer cervical comparando patrones de proteínas de gel 2-D teñidas de plata aisladas de células normales y células cancerígenas.

Se obtuvo tejido fresco de carcinoma cervical de pacientes que sufren histerectomía para carcinomas clínicamente localizadas (paso IB, II o III, Internacional Federation of Gynecology and Obstetrics or FIGO Classification) del cuello del útero del Instituto Nacional de Cancerología en México City, México, de acuerdo con la aprobación directiva del Comité Científico y Ético. Se obtuvieron un pequeño número de tejidos de tumor con la aprobación de la Directiva Institucional del Centro de Cancerología de Pittsburg (Pittsburg, PA). Se obtuvo tejido cervical normal con la aprobación de la Directiva Institucional de pacientes que sufren histerectomía por causas no relacionadas con histopatología cervical anormal, por medio de Cooperative Human Tissue Network (Columbus, OH). En la tabla 1 se muestran el andamiaje clínico e histopatología de tumor para veinte pacientes que proporcionaron muestras de tejido para uso en estos experimentos. Con excepción de un caso de carcinoma adenosquamous, todos los tumores fueron carcinomas de células escumosas. La mayoría de éstas fueron del amplio tipo de células no-queratinizadas. Todos los pacientes tenían enfermedad localizada con pasos clínicos oscilando de IB a IIB (Tabla 1).

TABLA 1 Edad del Paciente, Paso Clínico e Histopatología

1

2

Se obtuvo tejido fresco durante la operación, se colocó en un medio de transporte (RPMI 1640 suplementado con gentamicida y 10% de suero de ternero fetal (GIBCO)), empaquetado en hielo y enviado a Matritech, Inc. por la empresa de transporte nocturna. En un pequeño número de casos donde el envío inmediato no pudo ser posible, los especimenes de tejidos fueron congelados en trozos en nitrógeno líquido y se enviaron sobre hielo seco a Matritech, Inc. por una empresa de transporte nocturna. El mínimo tamaño de especimenes de tejidos fue 0.2 gramos. Se obtuvo el diagnóstico a partir de informes patológicos que acompañaban a cada espécimen.

Las proteínas de matriz nuclear se aislaron del cáncer cervical empleando una modificación del método de Fey et al. (1986) supra. Especimenes frescos de tejido cervical cancerígeno, oscilando en tamaños de aproximadamente 0.2 g a aproximadamente 1.0 g, se obtuvieron de 20 pacientes diferentes. Los especimenes de tejidos fueron troceados en pequeñas piezas (1 mm^{3}) y se y se homogenizaron con mano de mortero Teflón® sobre hielo y se trataron con una solución regulada que contenía 0.5% de Triton®-X-100, complejo de vanadilo ribosita (inhibidor de ARNasa, Five Prime-Three Prime, Inc.) con un cocktail de inhibidor de proteasa que contenía fluoruro sulfonil fenilmetilo (Sigma Chemical Co.), aprotinina y leupeptina (Boehringer Mannheim), para retirar los lípidos y las proteinas solubles.

Se retiraron agregados estromales filtrando el homogenado a través de una pantalla de nylon de 250 micrones Nitex (Tetko, Inc.) seguido de un paso de centrifugación (600 x g, 4ºC, 5 min). Las proteínas citoesquemáticas solubles se retiraron incubando la bola en un buffer de extracción que contiene 250 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0.5% de Triton®-X-100, complejo de vanadilo ribosida con una cocktail de inhibidor de proteasa durante 10 minutos sobre hielo seguido de centrifugación (600 x g, 4ºC, 5 min).

La cromatina se retiró incubando la bola en ADNasa (100 mg/mL, Boehringer-Mannheim) en una solución concentrada que contenía cocktail de inhibidor de proteasa durante 45 minutos a 25ºC. La fracción de bola restante, que contenía las proteínas de matriz nuclear y filamentos intermedios, se solubilizó en buffer de desmontaje que contenía 8 M de urea, cocktail inhibidor de proteasa y 1% (vol/vol) 2-mercaptoetanol. Contaminantes insolubles, principalmente carbohidratos y matriz extracelular, se retiraron por medio de ultracentrifugación (163,000 x g, 20ºC, 1 hr). Los filamentos intermedios pudieron remontarse tras la retirada de urea por diálisis en un buffer de montaje que contenía 150 mM KCI, 24 mM imidazol HCl, 5 mM MgCl2, 0.125 mM EGTA y 2 mM ditiotreitol (DTT) con inhibidores de proteasa y se retiraron por ultracentrifugación (109,000 x g, 15ºC, 1.5 hr), dejando las proteínas de matriz nuclear en la fracción sobrenadante.

Además, las proteínas asociadas a cáncer cervical se aislaron de líneas celulares de tumor cervical CaSki, Me-180, C33A, HeLa (S3 subline), SiHa, C4-1, C4-11, y HT-3. Cada línea celular se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvo a 37ºC en 5% CO_{2} en Dulbecco's Modified Eagles Médium suplementado con 10% de suero de ternero fetal, gentamicina, fungizon y 0.12% SeraExtend (Irving Scientific). Para estudios de extracción de matriz nuclear, las células crecieron a aproximadamente el 80% de confluencia en 10 fábricas de cultivo celular de fases (Nunc), se cosecharon por tripsinización, se contaron y extrajeron del mismo modo que el tejido de tumor homogenizado. La concentración de proteínas de las proteínas de matriz nuclear fue determinada por el kit de ensayo Coomasie Plus Protein (Pierce Chemical) empleando un estándar de globulina gama bovina. Las proteínas fueron inmediatamente precipitadas en 80% de etanol y se almacenaron a -80ºC hasta su uso.

Las proteínas de matriz nuclear resultantes fueron posteriormente caracterizadas por electroforesis de gel bidimensional de alta resolución de acuerdo con el procedimiento de O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-4021 (1975), en un sistema investigador 2-D (Oxford Glycosystems, Bedford, MA). Las proteínas de matriz nuclear fueron solubilizadas por análisis de enfoque isoeléctrico (IEF) en un buffer de muestra que contenía 9 M urea, 65 mM 3-[(colamidopropilo)dimetilamno]-1-propanosulfato (CHAPS), 2.2% anfolitos, y 140 mM ditiotreitol (DTT). Se cargaron doscientos microgramos de proteínas de matriz nuclear por gel.

Se llevó a cabo un enfoque isoeléctrico unidimensional furante 18,000 voltio-horas empleando 1 mm x 18 mm tubos de gel. Después de la electroforesis de primera dimensión, se extrajeron los geles de los tubos de gel, se equilibraron durante 2 minutos en un buffer que contenía 0.3 M Tris base, 0.075 M Tris-HCl, 3.0% SDS, 50 Mm DTT, Y 0.01% de azul de bromofenol y se colocó en la parte superior de 1 mm 10% Tris-glicina-SDS Duracryl (Oxford Glycosystems) de electroforesis de geles de placa de poliacrilamida de alta resistencia a la tensión. Los geles de placa de segunda dimensión fueron sometidos a electroforesis a 16 Watts por gel y 12ºC de temperatura constante durante aproximadamente 5 horas. Los niveles de peso molecular consistieron en albúmina bovina (M_{r} 66,000), ovalbúmina (M_{r} 45,000), gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa (M_{r} 36,000), anhidrasa carbónica (M_{r} 29,000), tripsinógeno pancreático bovino (M_{r} 24,000), e inhibidor de tripsina de soja (M_{r} 20,100) (Sigma Chemical Co.). Los puntos isoeléctricos fueron determinados empleando proteínas de control interno con puntos isoeléctricos bien caracterizados. Después de la electroforesis, los geles fueron fijados en una solución que contenía 40% de etanol/10% de ácido acético seguido de un tratamiento con una solución que contenía 0.5% de glutaraldehído. Los geles se lavaron exhaustivamente y se tiñeron de plata de acuerdo con el método de Rabillioud et al. (Rabillioud et al. (1992) Electrophoresis 13: 429-439) y se secaron entre hojas de papel de celofán.

Los geles teñidos de plata fueron representados empleando un Sistema de Representación Biológico MasterScan (CSP, Inc., Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se emplearon algoritmos de filtro digital para retirar tanto el fondo uniforme como el no uniforme sin retirar la imagen crítica. Análisis de gel bidimensional de Dos-D scan (TM) se usaron para calcular los patrones de lugar en modelos óptimamente formados de la información como fue descrito por Olson et al. (1980) Anal. Biochem. 169: 49-70. Se usó la triangulación de los niveles internos para determinar con precisión el peso molecular y el punto isoeléctrico de cada proteína objetivo de interés. Se llevó a cabo densitometría interpretativo empleando módulos de aplicación software específicos para integrar la información en informes numéricos y gráficos para cada gel analizado.

Ejemplos 2, 3 y 4 están incluidos solamente con fines ejemplares y no tienen la intención de formar parte del campo de la invención reivindicada.

Ejemplo 2 Identificación de Proteínas de Matriz Nuclear asociadas a Cáncer Cervical y que tiene Apariencia Diferencial sobre Geles 2-D

Como se ha descrito en el Ejemplo previo, los patrones de electroforesis de gel 2-D se obtuvieron fraccionando las proteínas aisladas de células cervicales normales y cancerígenas. La Figura 1 muestra un patrón de proteína típica de matriz nuclear asociada a cáncer cervical obtenida de tejido de cáncer cervical. La Figura 1 b muestra un patrón de gel típico producido por las proteínas de matriz nuclear que se obtiene de una muestra de tejido cervical normal. Se determinaron aproximadamente 600 proteínas por gel. La mayoría de las proteínas observadas estaban siempre presentes, independientemente del tipo de tejido que se estuviera investigando.

La comparación entre las Figuras 1 y 2 revela que, mientras la mayoría de las proteínas en las muestras cancerígenas y no cancerígenas son idénticas, hay cinco proteínas que son únicas a la muestra cancerígena (marcadas en la Figura 1). Las proteínas, designadas CvC-1 a CvC-5, se detectaron en 20 muestras de tejido obtenidas de pacientes diagnosticados con carcinoma cervical pero no se detectaron en tejido cervical aislado de un grupo de 10 individuos normales. La Tabla 2 identifica proteínas, designadas CvC-1 a CvC-5, por su peso molecular aproximado y punto isoeléctrico. Tanto el valor del peso molecular como el valor del punto isoeléctrico listado en la Tabla 1 son aproximados y precisos dentro de 2,000 Daltons para peso molecular y dentro de 0.2 pl unidades para punto isoleléctrico. Un análisis detallado para identificar proteínas comunes a tejido cervical normal pero ausentes en tejido cervical cancerígeno no reveló ninguna proteína que estuviera específicamente asociada con tejido cervical normal.

TABLA 2 Proteínas asociadas a Cáncer Cervical

3

Además, se investigó la expresión de proteínas de matriz nuclear aisladas de las líneas celulares de cáncer cervical cuyos resultados se resumen en la Tabla 3, mostrada a continuación. Se sabe que los tumores de origen celular epitelial se caracterizan por la presencia de estroma y otros elementos, como aquellos que resultan de infiltrar células inflamatorias. La detección de matriz nuclear o proteínas asociadas a matriz en líneas celulares de tumor derivadas de tumores de células epiteliales reduce la posibilidad de que las proteínas son el resultado de contaminación de estroma u otros tipos de contaminación de la preparación de matriz nuclear.

Se obtuvieron patrones de electroforesis de gel 2-D a partir de muestras que contenían células de cáncer cervical derivadas de líneas celulares de cáncer cervical. La Figura 2a muestra un patrón de proteína de matriz nuclear asociada a cáncer cervical obtenido a partir de la línea celular de cáncer cervical C33A. En la Figura 2a, las proteínas asociadas a tumor CvC-2 y CvC-5 están redondeadas y identificadas con los número 2 y 5. La Figura 2b muestra un patrón de gel producido proteínas de matriz nuclear que se obtiene a partir de la línea celular CaSki de cáncer cervical en muestra de tejido cervical normal. En la Figura 2b, las proteínas asociadas a tumor CvC-1 y CvC-3 están redondeadas e identificadas con los números 1 y 3.

Cuatro de las cinco proteínas asociadas a tumor (CvC-1 a CvC-3 y CvC-5) se detectaron de manera reproductiva en una o más líneas celulares de tumor cervical (Figura 2, Tabla 3), confirmando el origen epitelial de las proteínas. La expresión de la quinta proteína, CvC-4, fue variable pero se pudo detectar en la línea celular de tumor C33A
(Tabla 3).

TABLA 3 Expresión de Proteína asociada a Carcinoma Cervical en Líneas Celulares de Tumor Cervical

4

Dos de las proteínas asociadas a cáncer cervical específicas de células de cáncer cervical fueron aisladas y procesadas para análisis de microsecuencia.

Ejemplo 3 Caracterización de Indicadores de Proteínas de Matriz Nuclear asociadas a Cáncer Cervical

Se aislaron dos puntos de tinte de proteínas detectables sobre un gel 2-D correspondientes con CvC-3 y CvC-5, y la proteína se cosechó y se sometió a análisis de microsecuencia, como se describe a continuación.

Para secuenciar los polipéptidos asociados a cáncer cervical CvC-3 y CvC-5, la fracción de matriz nuclear de las células HeLa fue sometido a electroforesis sobre geles bidimensionales como se ha descrito anteriormente. Cada gel fue cargado con 300 microgramos de proteína aislada por el proceso de aislamiento de proteínas de matriz nuclear, como se ha descrito anteriormente. Después de electroforesis de segunda dimensión, las proteínas fueron visualizadas por tinte inverso. En resumen, los geles se pusieron a remojo en 200 mM imidazol durante 10 minutos, se enjuagaron en agua durante 1 minutos, seguido de 1-2 minutos en 300 mM de cloruro de zinc (Fernández-Patrón et al. (1992) BioTechniques 12: 564-573). Después de que comenzaran a aparecer los puntos que contenían proteínas, los geles se colocaron en agua, y los puntos relevantes de gel se eliminaron. Los puntos de gel aislados que representaban polipéptidos individuales asociados a cáncer cervical fueron acumulados y se les quitó el tinte por medio de un baño de 5 minutos en 2% de ácido cítrico, seguido de varios baños en 100 mM Tris hidrocloruro a pH 7.0 para elevar el pH dentro de las piezas de gel.

Cada conjunto de fragmentos de gel acumulados fue posteriormente diluido con un volumen igual de 2X electroforesis de gel poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) buffer de muestra (250 mM Tris-Cl, 2% SDS, 20% glicerol, 0.01% azul de bromofenol y 10% \beta-mercaptoetanol, pH 6.8) y se incubó a 75ºC durante 3 minutos. Las muestras que contenían fragmentos de gel se enfriaron en hielo y se cargaron en un 4% de poliacrilamida amontonada/11% poliacrilamida separada gel SDS-PAGE, y se sometió a electroforesis en Buffer Tank 1X (24 mM Tris-HCl, 192 mM glicina, 1% SDS, pH 8.3) para concentrar los puntos de gel en bandas o franjas. Se emplearon los indicadores de peso molecular (BioRad #161-0304) en cada gel para relacionar los pesos moleculares observados sobre los geles unidimensional y bidimensional. Tras la electroforesis, estos geles fueron electrosecados en membranas Immobilon PVDF (Oxford Glycosystems, Inc.) (Towbin et al. (1979) Proc. Nat'l. Acod. Sci. USA 76: 4350-4354) como se modificó por Matsudaira (Matsudaira et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 10035) para el formato mini-gel. Posteriormente, las membranas se tiñeron durante un minuto con Buffalo Black (0.1% en 1% de ácido acético, 40% metanol) y se enjuagaron con agua. Las regiones de membrana que contenían bandas de polipéptido fueron eliminadas con un escalpelo limpio.

Los polipétptidos unidos a PVDF fueron sujetos a un trazado peptídico tríptico y a una microsecuencia (Fernández et al. (1984) Analytical Biochem. 218: 112-117) en la Facilidad de Microquímica en la Fundación Worcester para Investigación Biomédica empleando un Modelo Hewlett Packard 109M HPLC. Las determinaciones de secuencias se realizaron sobre un Secuenciador Aplicado a Biosistemas ProCise, y la mayoría se confirmaron por espectometría de masa MALDI-TOF de péptidos individuales. Otros péptidos fueron identificados sólo por análisis de masa, o análisis de masa de material digerido de carboxipeptidasa.

Análisis de Microsecuencia de Péptidos CvC-3

Empleando la mitología descrita anteriormente, CvC-3 fue aislado de aproximadamente 120 geles bidimensionales de matriz nuclear HeLa y se reconcentraron en membrana Immobilon-PVDF para análisis de microsecuencia. A pesar de que sólo una proteína fue observada por el tinte de plata, la localización del gel 2-D identificada como CvC-3, reconcentrándose de la proteína sobre un minigel unidimensional 11% resultó en la resolución de dos bandas de proteínas claramente separables. Estas proteínas fueron etiquetadas como CvC-3H y CvC-3L y se sometieron por separado a análisis de microsecuencia. El análisis de los mapas trípticos indica que dos proteínas diferentes estaban contenidas en las dos bandas vistas en el minigel reconcentrante, ya que se observó un pequeño solapamiento en los tiempos de retención de pico de los dos péptidos.

Se detectaron diez masas por espectometría de masa de sietes de los picos CvC-3H. Se obtuvo secuencia de aminoácido de tres péptidos, dos por degradación Edman y uno por análisis carboxipeptidasa-MALDI-TOF. Las secuencias obtenidas para estos péptidos, mostradas en la Tabla 4 coinciden con una proteína conocida como IEF SSP 9502 o "Fosfoproteína nuclear humana novedosa". (Honore et. al. (1994) supra; GenBandk Accesión #LO7758). La secuencia completa de aminoácido para esta proteína, como se derivó de una secuencia de gen, se muestra en SEQ. ID No.: 10. Otras siete masas de las fracciones de pico separadas sobre el mapa tríptico de CvC-3H también coincidieron con aquellos fragmentos trípticos pronosticados de esta proteína. La información de correlación de masa de péptidos trípticos de CvC-3H está resumida en la Tabla 4. El peso molecular pronosticado de la fosfoproteína nuclear, basada en su secuencia de nucleótido es 55 kDa, donde se observa que el peso molecular por análisis de gel 2-D es 79 kDa (Honore et al. (1994) supra).

TABLA 4 Correlación de Masa de Péptidos Trípticos derivados de CvC-3H

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Además, se detectaron siete masas por espectometría de masa de cuatro picos derivadas de digestión tríptica de CvC-3L. Una de éstas fue directamente secuenciada y resultó ser idéntica a citoqueratina 17 (Troyanovsky et al. (1992), supra; GenBank Accesión #Q04695). Otras seis masas de fracciones separadas en el mapa tríptico CvC-3L también coincidieron con aquellos fragmentos trípticos pronosticados de citoqueratina humana 17. La secuencia de aminoácido para esta proteína, de Troyanovsky et al. (1992), supra, se muestra en SEQ.ID No.: 18. Los datos de correlación de masa de péptidos trípticos de CvC-3L se resumen en la Tabla 5. El peso molecular aparente de CvC-3L (47.9 kDa) es consistente con la detección de una molécula de completa longitud de citoqueratina 17 (peso molecular pronosticado, 48 kDa) en tumores cervicales.

TABLA 5 Correlación de Masa de Péptidos Trípticos derivados de CvC-3L

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Análisis de Microsecuencia de Péptidos CvC-5

El punto de gel identificado como CvC-5 se recogió de la matriz nuclear a partir de los mismos geles bidimensionales preparativos que se emplearon para la recopilación de CvC-3. Se recopilaron aproximadamente 100 puntos de gel como se ha descrito y se reconcentraron en membrana Immobilon-PVDA para análisis de microsecuencia. Durante la identificación inicial de proteínas asociadas a tumor se observó que en algunos tumores cervicales dos proteínas parecían migrar muy cerca una junto a otra en la localización identificada como CvC-5. Sólo una proteína era claramente evidente. Sin embargo, cuando la expresión de esta proteína fue examinada en líneas celulares de tumor cervical, líneas celulares 3 y 8 demostraron la presencia de al menos dos proteínas en el área definida por CvC-5 (Tabla 3). Sin basarse únicamente en la teoría, una explicación para la aparente detección de sólo una proteína en el punto gel CvC-5 en muchos tumores es que una de las proteínas podría ser más abundante, tapando de este modo la presencia de otras proteínas migratorias cercanas. Cuando los puntos de gel CvC-5 se agruparon y reconcentraron en un minigel bidimensional, sólo se detectó una banda de proteína difusamente teñida.

El mapa tríptico de la banda difusa que contenía componente polipéptidos del punto de gel CvC-5 contenía aproximadamente 30 picos resuelto. Se llevó a cabo análisis de masa en 12 de estos picos y se obtuvieron 30 masas. Se obtuvieron seis secuencias de aminoácido por degradación Edman automatizada, revelando la presencia de tres polipéptidos distintos. El primero de estos es una proteína conocida como TDP-43 o TAR ADN proteína de enlace (Out et. Al. (1995) supra; GenBank Accesión #U23731). La secuencia completa de aminoácido, como se derivó de la secuencia de gen para esta proteína, se muestra en SEQ. ID. No. 26. El peso molecular aparente de 43 kDa sugiere la identificación de la proteína intacta en tumores cervicales. Otras seis masas de fracciones separadas en el mapa tríptico CvC-5 también coincidieron con aquellos fragmentos trípticos pronosticados de esta proteína. Los datos de correlación de masa y los datos de secuencia peptídico de péptidos trípticos que corresponden a TDP-43 se muestran en la Tabla 6.

TABLA 6 Correlación de Masa de Péptidos Trípticos derivados de CvC-5

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8

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La información de secuencia obtenida para tres péptidos corresponden a una proteína de poro nuclear conocida como nucleoporina o Nup358 (Wu et. al (1995) supra, Gen Bank Accesión #L41840). La secuencia completa de aminoácido, como se derivó de la secuencia genética, se muestra en SEQ. ID. No.:34. Los datos de correlación de masa para cinco masas adicionales identificadas a partir del mapa tríptico CvC-5 que corresponde a los fragmentos trípticos pronosticados de Nup358 se muestran en la Tabla 7. La localización de las secuencias que corresponden a Nup358 sugiere nuestro aislamiento de un fragmento C-terminal de la proteína intacta (M_{r} 358 kDa) de tumores cervicales.

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TABLA 7 Correlación de Masa de Péptidos Trípticos derivados de CvC-5

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El tercer polipéptido identificado en el punto gel CvC-5 es un fragmento de lamin A (Fisher et.al. (1986), supra; GenBank Accesión #M13452). Se obtuvieron dos secuencias que corresponden con lámina A por degradación Edman (Tabla 8). Nueves masas adicionales de fragmentos del mapa tríptico CvC-5 corresponden a las masas pronosticadas de fragmentos trípticos de lámina A. Los datos de correlación de masa para estas masas adicionales se mostraron en la Tabla 8. La secuencia de aminoácido para esta proteína, (Fisher et al. (1986) supra), se muestra en SEQ. ID No.:46.

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TABLA 8 Correlación de Masa de Péptidos Trípticos derivados de CvC-5

11

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Proteínas asociadas a cáncer cervical pueden identificarse mediante el uso de técnicas conocidas basadas en las secuencias parciales de aminoácidos proporcionadas anteriormente. Por lo tanto, las proteínas asociadas a cáncer cervical detectadas de acuerdo con los métodos de la invención pueden referirse como el conjunto que consta de una secuencia continua mostrada en los fragmentos de secuencia anteriormente indicados. Se aprecia que el experto en la técnica, en vista de la siguiente descripción, sería capaz de producir un anticuerpo dirigido contra cualquier proteína asociada a cáncer cervical identificada por los métodos aquí descritos. Sin embargo, el experto en la técnica, en vista de la siguiente descripción, sería capaz de producir secuencias de ácido nucleico que codifiquen los fragmentos anteriormente descritos, así como secuencias de ácido nucleico complementarias con ellas. Además, el experto en la técnica mediante el empleo de mitologías convencionales de ADN recombinante, por ejemplo, examinando una librería cADN con tal secuencia de ácido nucleico, sería capaz de aislar secuencias de ácido nucleico de completa longitud que codifican las proteínas objetivo asociadas a cáncer cervical. Secuencias de ácido nucleico de completa longitud, o fragmentos de las mismas, pueden emplearse para generar sistemas o terapias de detección basadas en ácido nucleico.

Ejemplo 4 Producción de Anticuerpos Que Enlazan Específicamente con las Proteínas Asociadas a Cáncer Cervical

Una vez identificada, la proteína asociada a cáncer cervical, tal como de CvC-1 a CvC-5, puede detectarse en una muestra de tejido o fluido corporal mediante el empleo de ensayos o pruebas de enlace que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, como se ha anotado anteriormente, una proteína asociada a cáncer cervical puede detectarse tanto en una muestra de tejido como de fluido corporal empleando un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, que se enlaza específicamente con un epítope dispuesto sobre la proteína asociada a cáncer cervical. En tales sistemas de detección, el anticuerpo es preferentemente etiquetado con una parte de molécula detectable.

A continuación se proporciona un protocolo ejemplar para la producción de un anticuerpo monoclonal asociado a cáncer anti-cervical. Por consiguiente, el método particular para producir anticuerpos para proteínas objetivo no se considera un aspecto de la invención.

Balb/c por J ratones (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) son inyectados intraperitonealmente con una proteína objetivo, por ejemplo, la proteína CvC-3 aislada de HeLa matriz nuclear celular, cada 2 semanas hasta que los ratones inmunizados obtienen el título de suero apropiado. Después de esto, los ratones son inyectados con 3 impulsos intravenosos consecutivos. El adyuvante completo de Freund (Gibco, Grand Island) es empleado en la primera inyección, incompleto de Freund en la segunda inyección y salina para las posteriores inyecciones intravenosas. Posteriormente el animal es sacrificado y se le retira el bazo. Las células del bazo (o células de nódulo linfático) son fusionadas con una línea de mieloma de ratón, por ejemplo, mediante el método de Kohler et al. (1975) Nature 256: 495.

Los hibridomas que producen anticuerpos que reaccionan con las proteínas objetivo son posteriormente clonados y crecen como ascites. Los hibridomas son protegidos por reactividad nuclear contra la línea celular que es la fuente del inmunogen y por inmunoquímica de tejido empleando procedimientos estándar conocidos en el campo inmunológico. Descripciones detalladas de protocolos de revisión, producción de ascites e inmunoensayos son también descritos en PCT/US92/09220 publicado el 13 de mayo, 1993.

Ejemplo 5 Ensayo basado en Anticuerpos para Detectar Cáncer Cervical en un Individuo

El siguiente ensayo ha sido desarrollado para muestras de tejido. Sin embargo, se considera que se pueden llevar a cabo ensayos similares para testar muestras de fluido sin demasiada experimentación. Un ensayo típico puede emplear un kit comercial de inmunodetección, por ejemplo, el Kit ABC Elite de Vector Laboratories, Inc.

Una muestra de biopsia, por ejemplo, se retira una citología del paciente que está siendo investigado de acuerdo con las pautas médicas apropiadas. Posteriormente, la muestra es aplicada a un portaobjetos de cristal de microscopio y la muestra se fija en acetona fría durante 10 minutos. Después, el portaobjetos se enjuaga en agua destilada y es pretratado con un peróxido de hidrógeno que contiene solución (2 mL 30% H_{2}O_{2} y 30 mL metanol frío). Posteriormente, el portaobjetos se enjuaga en un Buffer A que contiene Solución Salina Tamponada de Tris (TBS) con 0.1% Tween® y 0.1% Brij®. Se añade una anticuerpo monoclonal de proteína asociada a cáncer anti-cervical de ratón en Buffer A a la muestra y la muestra se incuba durante unan hora a temperatura ambiente. A continuación, la muestra se lava con Buffer A, y se añade un anticuerpo secundario (Kit ABC Elite, Vector Labs, Inc) en Buffer A a la muestra que después se incuba durante 15 minutos a 37ºC en una cámara de humedad. Las muestras se vuelven a lavar con Buffer A, y el reagente ABC (Kit ABC Elite, Vector Labs, Inc) es añadido a la muestra para amplificar la señal. La muestra es incubada durante otros 15 minutos a 37ºC en la cámara de humedad.

La muestra se lava posteriormente en agua destilada, y se añade un sustrato de diaminobencidina (DAB) durante 4-5 minutos. Después, la muestra se enjuaga con agua destilada, se contratiñe con hematoxilina, se enjuga, con 95% etanol, se enjuaga con 100% etanol, y se enjuaga con xileno. Finalmente, se aplica una cubierta a la muestra y el resultado se observa por microscopía óptica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: KEESEE, SUSAN

\vskip0.800000\baselineskip

OBAR, ROBERT

\vskip0.800000\baselineskip

WU, YING-JYE

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA DETECCIÓN DE CÁNCER CERVICAL.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 46

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Testa, Hurwitz & Thibeault

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 125 High St.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Boston

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 02110

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEÍBLE DE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco blando

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30.

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: GREENHALGH, DUNCAN A

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 38,678

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA: MTP-023 (8395/27)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TELÉFONO: (617) 248-7000

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

TELEFAX: (617) 248-7100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ala Ala Ser Leu Ala Val His Thr Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Gly Gln Ile Glu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Ile Ala Glu Ala Lys Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ser Leu Val His Ser Arg Asp Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Trp Asp Ile Ser Thr Val Ser Ser Val Asn Glu Ala Phe Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Leu Gly Ser Ala Arg Asn Ser Ser Ile Ser Gly}

\sac{Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xii)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Lys Pro Ile Phe Thr Leu Asn Ala His Asn Asp Glu Ile Ser}

\sac{Gly Leu Asp Leu Ser Ser Gln Ile Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gln Thr Leu Gln Phe His Pro Phe Glu Ala Gln Thr Leu Ile}

\sac{Gly Ser Tyr Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Val Leu Phe Cys Ser Ser Cys Cys Pro Asp Leu Pro Phe Ile}

\sac{Tyr Ala Phe Gly Gly Gln Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 501 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

12

13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Ser Gln Tyr Tyr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn His Glu Glu Glu Met Asn Ala Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Glu Gly Glu Asp Ala His Leu Thr Gln Tyr Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Asn Glu Met Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Glu Ile Ser Glu Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Glu Asp Trp Phe Phe Ser Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Ar}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 432 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly Gly Phe Gly Asn}

\sac{Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Cys Asp Cys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Phe Gly Phe Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Pro Asn Ser Lys Gln Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro Trp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 414 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Tyr Tyr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Tyr Tyr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gln Glu Ala Gln Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Ala Asp Cys Phe Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD:22 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Gly Thr Gly Gly Gln Ser Ile Tyr Gly Asp Lys Phe Glu Asp}

\sac{Glu Asn Phe Asp Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Thr Met Glu Leu Phe Xaa Asn Ile Val Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Thr Gly Pro Gly Leu Leu Ser Met Ala Asn Gln Gly Gln Asn Thr}

\sac{Asn Asn Xaa Xaa Phe Val Ile Xaa Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3224 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

18

19

20

21

22

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Phe Glu Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Tyr Ser Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asp Asn Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Tyr Ser Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Tyr Ser Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Leu Asp Met Glu Ile His Ala Tyr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Met Ala Glu Met Arg Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Leu Asp Phe Gln Lys Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gln Gln Gln Leu Asp Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Asp Ile Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Leu Asp Phe Gln Lys Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 115 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

26

27

Claims (31)

1. Un método para detectar cáncer cervical en un humano, el método consta de:

- detectar en una muestra aislada de dicho individuo la presencia de una proteína que consta de una secuencia de aminoácido seleccionada de un grupo consistente en SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10, siendo la presencia de esta proteína indicativa de cáncer cervical en dicho humano.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:1.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:2.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:3.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:4.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:5.

7. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:6.

8. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:7.

9. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:8.

10. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:9.

11. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:10.

12. El método de la reivindicación 1, donde dicha muestra es una muestra de tejido o fluido corporal.

13. El método de la reivindicación 1, donde dicha muestra es una muestra de biopsia.

14. El método de la reivindicación 1, donde dicha muestra es una muestra de célula cervical.

15. El método de la reivindicación 1, donde dicha muestra es un frotis.

16. Un método para detectar cáncer cervical en un humano, donde el método consta de los siguientes pasos:

a)

contactar una muestra derivada de dicho humano con una parte de molécula de enlace que enlaza específicamente con una proteína asociada a cáncer cervical para producir un complejo de proteína asociado a cáncer cervical de parte de molécula de enlace, donde dicha parte de molécula de enlace está caracterizada por ser capaz de enlazar específicamente una proteína que consta de la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:10; y

b)

detectar la presencia de dicho complejo, siendo la presencia de dicho complejo factor indicativo de la presencia de cáncer cervical en dicho humano.

17. El método de la reivindicación 16, donde dicha muestra es una muestra de tejido o fluido corporal.

18. El método de la reivindicación 16, donde dicha muestra es una muestra de biopsia.

19. El método de la reivindicación 16, donde dicha muestra es un frotis.

20. El método de la reivindicación 16, donde dicha muestra es una muestra de célula cervical.

\newpage

21. El método de la reivindicación 16, donde dicha parte de molécula de enlace es seleccionada de un grupo consistente en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y un punto de enlace de anticuerpo biosintético.

22. El método de la reivindicación 16, donde dicha parte de molécula es un anticuerpo.

23. El método de la reivindicación 22, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

24. El método de la reivindicación 22, donde dicho anticuerpo está etiquetado con una parte de molécula detectable.

25. El método de la reivindicación 23, donde dicho anticuerpo monoclonal está etiquetado con una parte de molécula detectable.

26. Un método para detectar cáncer cervical en un humano, que consta de:

detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en una muestra de tejido o fluido corporal del humano para indicar de este modo la presencia de un cáncer cervical en el humano, donde la molécula de ácido nucleico es seleccionada del grupo consistente en:

(a)

una molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia capaz de enlazar específicamente con una proteína asociada a cáncer cervical que consta de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10; y

(b)

una molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia de nucleótido que codifica una proteína asociada a cáncer cervical que consta de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10.

27. El método de la reivindicación 26, que consta del paso adicional de hacer reaccionar la muestra con una prueba de hibridización etiquetada capaz de hibridizar específicamente al menos una porción de la molécula de ácido nucleico.

28. El método de la reivindicación 25, donde la molécula ácido nucleico es capaz de enlazar específicamente con una proteína asociada con cáncer cervical metastatizado, y donde la presencia de la molécula de ácido nucleico es indicativa de la presencia de cáncer cervical metastatizado.

29. Un kit para detectar la presencia de cáncer cervical o para evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico de un cáncer cervical, constando el kit de la siguiente combinación:

(a)

un recipiente para recibir una muestra de tejido humano o fluido corporal; y

(b)

una parte de molécula de enlace capaz de enlazar específicamente con una proteína asociada a cáncer cervical que consta de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10.

30. El kit de la reivindicación 29, que además consta de una muestra de referencia indicativa de una célula cervical normal.

31. El kit de la reivindicación 29, donde dicha parte de molécula de enlace es seleccionada del grupo consistente en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, y un punto de enlace de anticuerpo biosintético.