ES2268809T3 - Un metodo de amplificacion basada en la transcripcion de dianas de adn de doble hebra. - Google Patents

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Abstract

Método para la amplificación de ADN de doble hebra con un método de amplificación basado en la transcripción, en donde el ADN de doble hebra es puesto en contacto con: - al menos, un oligonucleótido comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la primera de las dos hebras de ADN comprendidas en el ADN de doble hebra, comprendiendo adicionalmente dicho oligonucleótido la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa; - un oligonucleótido adicional comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la segunda hebra comprendida en el ADN de doble hebra; - una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ARN; - una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ADN; - una enzima poseyendo actividad RNasa H; - una enzima poseyendo actividad ARN polimerasa; y la mezcla de reacción así creada es mantenida bajo las condiciones isotérmicas adecuadas durante una cantidad de tiempo suficiente como para que tenga lugar una reacción de amplificación basada en la transcripción, sin someter la mezcla a ningún tratamiento de calentamiento después de que cualquiera de las enzimas haya sido añadida a la mezcla.

Description

Un método de amplificación basado en la transcripción de dianas de ADN de doble hebra.
La presente invención está relacionada con un método de amplificación basada en la transcripción para la amplificación de dianas de ADN.
Los métodos de amplificación de ácido nucleico son utilizados en el campo de la biología molecular y en la tecnología de ADN recombinante. Estos métodos son utilizados para incrementar el número de copias de una secuencia determinada de ácido nucleico presente en pequeñas cantidades y, a menudo, en un medio en el cual se encuentran presentes también una amplia variedad de otras secuencias de ácido nucleico, tanto de ARN como de ADN. En particular, los métodos de amplificación del ácido nucleico son utilizados para facilitar la detección o cuantificación de ácido nucleico, y son importantes a la hora de diagnosticar, por ejemplo, enfermedades infecciosas, enfermedades heredadas y varios tipos de cáncer. Los métodos de amplificación del ácido nucleico han encontrado aplicación también en otros campos, donde son investigadas muestras en las cuales el ácido nucleico puede estar presente en cantidades muy pequeñas, tales como las ciencias forenses, la arqueología o para establecer la paternidad.
Son conocidas algunas técnicas de amplificación del ácido nucleico basadas en diferentes mecanismos de acción. Un método para la amplificación del ácido nucleico, conocido como la "Reacción en cadena de la Polimerasa" (PCR), es descrito en las solicitudes de patente europeas EP 200362 y EP 201148. La PCR es un proceso cíclico, el cual tiene como diana al ADN de doble hebra. Cada ciclo en el proceso de PCR comienza con la separación de una diana de ADN de doble hebra en sus dos hebras complementarias. A cada hebra se empalma un iniciador y los ADN polimerasas presentes extenderán los iniciadores a lo largo de la hebra de ADN a la cual están empalmados, formando de esta manera dos nuevos dúplex de ADN. Cuando es calentada la mezcla de la reacción las hebras de los dúplex de ADN son separadas de nuevo y puede comenzar un nuevo ciclo de PCR. De esta forma, el proceso de PCR produce múltiples copias de ADN de una diana de ADN. Si la diana deseada para la PCR es el ARN de hebra sencilla, éste tiene que ser convertido primero en ADN de hebra doble por medio de transcriptasa reversa.
La presente invención está relacionada con una clase diferente de métodos de amplificación del ácido nucleico, es decir las "técnicas de amplificación basadas en la transcripción". Las técnicas implican la transcripción de copias múltiples de ARN procedentes de un templete comprendiendo un promotor reconocido por una ARN polimerasa. Con estos métodos son transcritas múltiples copias de ARN procedentes de un templete de ADN que comprende un promotor funcional reconocido por la ARN polimerasa. Dichas copias son utilizadas de nuevo como una diana, de las cuales es obtenida una nueva cantidad del templete de ADN, etc. Tales métodos han sido descritos por Gingeras et al. en WO88/10315 y Burg et al. en WO89/1050. Han sido descritas técnicas de amplificación basadas en transcripción isotérmica por Davey et al. en EP 323822 (en relación con el método NASBA), por Gingeras et al. en EP 373960 y por Kacian et al. en EP 408295. Las reacciones de amplificación basadas en la transcripción pueden ser realizadas también con enzimas termoestables. Las amplificaciones basadas en la transcripción son llevadas a cabo usualmente a una temperatura de alrededor de 41 grados Celsius. Estas enzimas termoestables permiten que la reacción sea llevada a cabo a temperaturas más elevadas. Un método termoestable de este tipo es descrito en la EP 682121, inscrita a nombre de Toyo Boseki KK.
Los métodos, como los descritos en la EP 323822, EP 373960 y EP 408295, son métodos continuos isotérmicos. Con estos métodos son necesarias cuatro actividades enzimáticas para conseguir la amplificación: una actividad ADN polimerasa dependiente de ARN, una actividad ADN polimerasa dependiente de ADN, una actividad RNasa (H) y una actividad ARN polimerasa. Algunas de estas actividades pueden ser combinadas en una enzima, por ello usualmente son necesarias únicamente 2 o 3 enzimas. Las enzimas poseyendo actividades ADN polimerasa dependiente de ARN son enzimas que sintetizan ADN de un templete de ARN. De esta forma, una polimerasa ADN dependiente de ADN sintetiza ADN procedente de un templete de ADN. En las reacciones de amplificación basadas en la transcripción puede ser utilizada una transcriptasa reversa, como una transcriptasa reversa de AMV (Virus de la Mieloblastosis Aviar) o de MMLV (Virus de la Leucemia Murina de Moloney). Tales enzimas poseen tanto actividad ADN polimerasa dependiente de ARN como dependiente de ADN, pero también una actividad RNasa inherente. Adicionalmente, puede ser añadida una RNasa a la mezcla de la reacción de una reacción de amplificación basada en la transcripción, como la RNasa H de E. coli.
Las ARN polimerasas dependientes de ADN sintetizan múltiples copias de ARN procedente de un templete de ADN incluyendo un promotor reconocido por la ARN polimerasa. Ejemplos de ARN polimerasas son las polimerasas procedentes de E. coli y de los bacteriófagos T7, T3 y SP6. Un ejemplo de una ARN polimerasa utilizada usualmente en los métodos de amplificación basados en la transcripción es la polimerasa T7. De esta manera, el promotor que es incorporado en el templete utilizado para transcribir copias múltiples del ARN sería entonces el promotor T7. Usualmente, el templete comprendiendo el promotor tiene que ser creado comenzando por el ácido nucleico comprendiendo la secuencia diana. Dicho ácido nucleico puede estar presente en el material inicial que es utilizado como material para la reacción de amplificación. El ácido nucleico presente en el material inicial contendrá usualmente la secuencia diana como una parte de una secuencia mucho mayor. Las secuencias de ácido nucleico adicionales pueden estar presentes tanto en el extremo 3' como en el 5' de la secuencia diana. La reacción de amplificación puede ser iniciada al juntar este ácido nucleido procedente del material inicial, las enzimas apropiadas que juntas proporcionan las actividades anteriormente mencionadas y, al menos, un oligonucleótido (pero usualmente dos). Al menos uno de estos oligonucleótidos debe comprender la secuencia del promotor.
Los métodos de amplificación basados en la transcripción son particularmente útiles si el material de inicio es ARN de hebra sencilla, aunque puede ser utilizado igualmente ADN de hebra sencilla o doble como material de inicio. Cuando es practicado un método de amplificación basado en la transcripción sobre una muestra con ARN de hebra sencilla (de sentido "plus") con secuencias adicionales tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de la secuencia diana, un par de oligonucleótidos utilizados convenientemente con los métodos, según es descrito en las técnicas previamente existentes, consistiría en:
- un primer oligonucleótido (usualmente referido como un "promotor-oligonucleótido") que es capaz de hibridizar con el extremo 3' de la secuencia diana, oligonucleótido que tiene la secuencia de un promotor (preferiblemente el promotor T7) acoplado a su extremo 5' (la parte hibridizante de este oligonucleótido posee polaridad opuesta a la del ARN positivo utilizado como material de inicio).
- un segundo oligonucleótido ("iniciador"), el cual comprende el extremo 3' de la secuencia diana (este oligonucleótido posee la misma polaridad que el ARN positivo).
Cuando un par de tales oligonucleótidos, junto con todas las enzimas que poseen las actividades apropiadas y una fuente suficiente de los ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos necesarios son juntados en una mezcla de reacción, y son mantenidos bajo las condiciones apropiadas (es decir, bajo las condiciones de tamponado apropiadas y a la temperatura adecuada) durante un periodo de tiempo suficiente, dará comienzo una reacción de amplificación continua isotérmica. La figura 1 proporciona un mecanismo propuesto para parte de una reacción de amplificación basada en la transcripción conocida en este campo. El proceso continuo isotérmico de amplificación es representado en la Figura 1 como un proceso cíclico. Sin embargo, de hecho todas las fases de este proceso tendrán lugar al mismo tiempo ya que todos los ingredientes se encuentran presentes en el recipiente de la reacción. De esta forma, el representar el proceso como una secuencia determinada de sucesos podría ser beneficioso para una mejor comprensión de un posible mecanismo subyacente en el proceso de amplificación, aunque podría no ser un reflejo auténtico de lo que realmente sucede en la mezcla de la reacción durante la amplificación. El ciclo representado en la Figura 1 puede considerarse que comienza con una primera cantidad de ARN de hebra sencilla. El ARN representado en el ciclo es ARN de sentido negativo. De esta manera, será capaz de hibridizar con el segundo oligonucleótido del par de oligonucleótidos mencionados más arriba. Este ARN negativo usualmente no se encontrará presente como tal en el material de inicio para la reacción de amplificación, pero será derivado, por ejemplo, del ARN positivo presente en el material de inicio, a través de la reacción con los oligonucleótidos y enzimas cuando son juntados todos los ingredientes de la mezcla de reacción.
Han sido descritas muchas variantes del tema anterior en la literatura relativa a los procedimientos ya existentes. Partiendo del esquema de reacción representado en la Figura 1 puede ser visto que el segundo oligonucleótido (conforme es descrito más arriba) sirve como un iniciador para iniciar la síntesis de una hebra de ADN complementaria del ARN negativo. El oligonucleótido comprendiendo la secuencia promotora es capaz de empalmarse al extremo 3' del producto de extensión del segundo oligonucleótido. La parte promotora de este oligonucleótido sirve como un templete para el alargamiento del producto de extensión del segundo oligonucleótido, con el fin de proporcionar un promotor de doble hebra. El extremo 3' del oligonucleótido promotor puede ser extendido por medio de la enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ADN (transcriptasa reversa), pero esto no es necesario. Para reflejar la función que tiene como un templete de un oligonucleótido conteniendo una secuencia promotora, es referido como un "templete de empalme" en alguna literatura previa existente en relación con la amplificación basada en la transcripción (por ejemplo, EP 408295 de Genprobe Inc.). El extremo 3' de un "templete de empalme" de este tipo puede incluso ser bloqueado. En ese caso, la capacidad del "templete de empalme" de servir como un iniciador se ve eliminada por completo.
La Figura 1 proporciona un esquema propuesto para una amplificación basada en la transcripción. Este esquema comprende la síntesis de transcriptos de ARN de hebra sencilla. Conforme es mencionado más arriba, el material de inicio conteniendo el ácido nucleico a ser amplificado puede que no contenga el ácido nucleico en esta forma determinada. No contendrá ARN negativo de una longitud definida. Ello es por lo que este ciclo propuesto de sucesos, conforme es representado en la Figura 1, es precedido probablemente por una secuencia de eventos que llevan desde el ácido nucleico en el material de inicio hasta la primera fase de transcripción del ARN. Conforme es explicado anteriormente, los métodos de amplificación basados en la transcripción son particularmente útiles para la amplificación que comienza con ARN de hebra sencilla. Uno de los oligonucleótidos, el que tiene la secuencia promotora, será empalmado presumiblemente entonces a este ARN de hebra sencilla, y será alargado por medio de la enzima con ADN polimerasa dependiente de ARN (como la transcriptasa reversa). Es obtenido de esta forma un dúplex de ADN-ARN, pudiendo ser digerida la hebra de ARN del mismo por medio de RNasa H. El otro oligonucleótido se empalmará a la hebra restante de ADN y será alargado, utilizando esta hebra como un templete. De esta manera puede ser creado un templete de ADN de hebra doble incluyendo un promotor de hebra doble funcional para la ARN polimerasa, a partir del cual puede tener lugar la primera fase de la transcripción. Los transcriptos obtenidos de esta forma pueden entrar en el esquema de reacción propuesto, conforme es representado en la Figura 1. En la práctica, esta secuencia completa de sucesos -comenzando desde el ARN de hebra sencilla en la muestra- tendrá lugar tan pronto como todos los ingredientes sean juntados, y la mezcla sea llevada hasta la temperatura adecuada para que todas las enzimas se encuentren activas. El practicante de este método no necesita intervenir para realizar ninguna de estas fases. Sin embargo, cuando un método de amplificación basado en la transcripción ha de ser realizado sobre material de inicio comprendiendo la secuencia diana únicamente como ADN de hebra doble -tanto circular como lineal-, el experto no pretenderá ser capaz de amplificar nada sin que primeramente tenga que llevar a cabo un método, por ejemplo un método de desnaturalización química, conforme es descrito en la DE 4238699, para conseguir primero ácido nucleico de hebra sencilla del ADN de hebra doble presente en el material de inicio. No pretenderá que ninguno de sus oligonucleótidos sea capaz de empalmarse al ADN, ya que éste se encuentra en una configuración de doble hebra. Basándonos en los conocimientos del experto, lo más lógico aquí sería separar las hebras del ADN de hebra doble por medio de la aplicación de una temperatura elevada (hasta unos 100 grados Celsius), con el fin de separar el ADN y permitir que uno de los oligonucleótidos se empalme a una de las hebras sencillas. Las enzimas utilizadas con los métodos usuales de amplificación basados en la transcripción no serían capaces de soportar una temperatura tan alta y, en tales casos, pueden ser añadidas únicamente después de que hayan sido separadas las hebras de ADN. Cuando uno de los nucleótidos se empalma a un ADN de hebra sencilla y es alargado, es creado de nuevo ADN de doble hebra, y la mezcla de la reacción tendrá que ser sometida a una temperatura elevada lo suficientemente alta como para separar de nuevo el ADN de doble hebra en sus dos hebras. De nuevo este aumento de temperatura destruirá las enzimas presentes, y tendrán que ser añadidas nuevas enzimas después de que la fase de calentamiento haya sido aplicada de nuevo. A continuación, el segundo oligonucleótido puede ser añadido y empalmado a la hebra que fue creada procedente del oligonucleótido (promotor) alargado en la primera fase, creando de esta manera el templete de ADN de doble hebra incluyendo un promotor funcional de doble hebra a partir del cual puede tener lugar una primera fase de transcripción de ARN. Los transcriptos de ARN resultantes pueden entrar en un ciclo igual al representado en la Figura 1 y el proceso puede ser también isotérmico.
De lo anterior se deduce que el comenzar un método de amplificación basado en la transcripción partiendo de ADN de doble hebra puede ser un proceso tedioso. Éste requiere que el practicante lleve a cabo varias acciones específicas; la muestra tiene que ser calentada y enfriada repetidamente y las enzimas tienen que ser repuestas después de cada fase de calentamiento.
Alternativamente, el ADN de doble hebra en el material de inicio puede ser transcrito en ARN antes del comienzo de la amplificación. Tal fase extra puede estar basada en una enzima, por ejemplo la ARN polimerasa de E. coli, que transcribe el ADN de doble hebra en ARN sin la presencia de una secuencia promotora, también referida como un sitio de unión a la polimerasa. Ha sido descrito en la solicitud de patente PCT nº WO9602668 un proceso de este tipo de fases extras, para facilitar la amplificación de ADN de doble hebra por medio de métodos de amplificación basados en la transcripción. Las fases extras descritas en este procedimiento no incluye únicamente fases de manejo adicionales, sino también la utilización de ingredientes adicionales, i.e. la ARN polimerasa de E. coli.
Se ha descubierto ahora que, en los casos donde la muestra comprende ADN de doble hebra, puede ser aplicado un proceso de amplificación basado en la transcripción, el cual es esencialmente isotérmico, y da como resultado grandes cantidades de transcriptos de ARN comprendiendo la secuencia del ADN.
Con el método de la presente invención es proporcionado un método de amplificación isotérmico basado en la transcripción para la amplificación de ADN de doble hebra. El método de la presente invención para la amplificación de ADN de doble hebra comprende las fases de puesta en contacto de dicho ADN de doble hebra con:
- al menos, un oligonucleótido comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la primera de las dos hebras de ADN comprendidas en el ADN de doble hebra, comprendiendo adicionalmente dicho oligonucleótido la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa,
- un oligonucleótido adicional comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la segunda hebra comprendida en el ADN de doble hebra,
- una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ARN,
- una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ADN,
- una enzima poseyendo actividad RNasa H,
- una enzima poseyendo actividad ARN polimerasa,
y manteniendo la mezcla de reacción así creada bajo las condiciones adecuadas durante una cantidad de tiempo suficiente como para que tenga lugar la amplificación, sin someter la mezcla a ningún tratamiento de calentamiento después de que cualquiera de las enzimas haya sido añadida a la mezcla.
El método conforme a la invención es particularmente útil para la amplificación de moléculas pequeñas de ADN, e.g. ADN plásmido.
El método es particularmente útil para la detección de pequeñas moléculas de ADN de microorganismos patogénicos, haciendo posible el diagnóstico. En particular, pueden ser detectadas por medio de este método las moléculas circulares de ADN del VIH-1, que son formadas durante el replicado del virus VIH-1. La detección de tales moléculas circulares de ADN del VIH-1 indica el replicado activo del virus, lo cual puede ser relacionado con la progresión de la enfermedad, i.e. el desarrollo del SIDA. En otra aplicación el método puede ser utilizado para la detección de moléculas de ADN plásmido, presentes de manera natural en especies de Clamidia. Los plásmidos de Clamidia pueden codificar ciertos factores de virulencia, lo cual significa que la detección del plásmido no solo muestra la presencia de la infección por Clamidia, sino que también muestra que las células de Clamidia que causan la infección portan ciertos factores de virulencia.
Incluso en otras aplicaciones, el método puede ser utilizado para la amplificación de secuencias genómicas después de la degradación parcial y del aislamiento del ADN. Esto posee una amplia gama de aplicaciones, de las cuales muchas pueden estar asociadas con la detección e identificación de mutaciones en el ADN genómico. Estas mutaciones pueden estar asociadas al diagnóstico del cáncer, enfermedad hereditaria o predisposición a la enfermedad.
Sorprendentemente, la amplificación basada en la transcripción puede partir de ADN de doble hebra, sin la necesidad de tratar el ADN con enzimas de restricción o, lo que es más importante, de separar las hebras con anterioridad por medio de la aplicación de calor. Todos los reactivos utilizados convencionalmente en reacciones de amplificación isotérmicas basadas en la transcripción pueden ser utilizados simplemente sobre el material de inicio conteniendo ADN de doble hebra, como si éste fuera ARN de hebra sencilla.
Las enzimas utilizadas con el método conforme a la invención puede ser cualquier tipo de enzimas de las conocidas en este campo como enzimas adecuadas para los métodos de amplificación basados en la transcripción, y las condiciones de la reacción son esencialmente las mismas que las de los métodos antiguos ya existentes de amplificación basados en la transcripción, usualmente utilizados para amplificar ARN de hebra sencilla. Con la presente invención ha sido descubierto ahora que pueden ser utilizados esencialmente los mismos protocolos para la amplificación isotérmica basada en la transcripción del ADN de doble hebra, incluso cuando, basándose en el conocimiento de los mecanismos conforme a los cuales las reacciones de amplificación basadas en la transcripción se suponía que funcionaban, el experto en este campo no hubiera esperado que este método fuera factible.
En una realización preferida el ADN es calentado hasta los 65 grados Celsius en presencia de los oligonucleótidos de amplificación, pero no en presencia de las enzimas de amplificación. Las enzimas son añadidas a la reacción únicamente después de que la mezcla de la reacción es enfriada hasta la temperatura de incubación para la reacción de amplificación, i.e., 41 grados Celsius. En otra realización del método de la presente invención el ADN puede ser calentado hasta los 100 grados Celsius en presencia de los dos oligonucleótidos de amplificación. Una persona experta en este campo seguiría sin esperar que este método fuera factible, debido a que después del empalme y extensión del oligonucleótido, la hebra recién confeccionada de ADN tiene que ser separada de la hebra del templete de ADN original antes de que el segundo oligonucleótido pueda empalmarse y ser extendido. En esta segunda realización preferida, únicamente con una fase de calentamiento, las enzimas son añadidas únicamente después de que la mezcla de la reacción es enfriada hasta la temperatura de incubación de la amplificación, i.e., 41 grados Celsius.
Preferiblemente son utilizados en el método conforme a la invención dos oligonucleótidos;
- un primer oligonucleótido (usualmente referido como un "promotor-iniciador", que es capaz de hibridizar con una secuencia específica en la primera hebra del ADN de doble hebra, cuyo nucleótido posee la secuencia de un promotor (por ejemplo, el promotor T7) unida a su extremo 5' y
- un segundo oligonucleótido ("iniciador"), el cual comprende una secuencia suficientemente complementaria de una secuencia específica en la segunda hebra del ADN de doble hebra. Las secuencias de los oligonucleótidos deben ser escogidas de tal manera que no puedan hibridizar entre sí.
Es sorprendente que al poner en contacto el ADN de doble hebra con los dos oligonucleótidos y las enzimas apropiadas, pueda ser llevado a cabo un proceso de amplificación basado en la transcripción en donde no haya necesidad de distintas fases de separación de hebras para separar las dos hebras que componen el ADN de doble hebra. El método dará como resultado copias múltiples de ARN lineal comprendiendo la secuencia diana que es parte de la secuencia del ADN de doble hebra.
Descripción de las figuras
Figura 1: esquema de reacción para amplificaciones basadas en la transcripción.
Ejemplos Prólogo
Los siguientes ejemplos demuestran el mecanismo y utilidad de la presente invención. No son limitadores y no deben ser considerados como tales. Las enzimas utilizadas en los siguientes ejemplos son la transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), la ARN polimerasa T7 y la RNasa H del E. coli. Pueden ser utilizadas otras enzimas con actividades similares y enzimas procedentes de otras fuentes. Pueden ser también útiles para su utilización otras ARN polimerasas con diferente especificidad de promotor.
Las condiciones de reacción NASBA utilizadas en los siguientes ejemplos fueron 40 mM de Tris, pH 8.5, 42 mM de KCl (o en experimentos posteriores 70 mM de KCl), 12 mM de MgCl_{2}, 5 mM de DTT, 1 mM de cada dNTP, 2 mM de rATP, 2mM de rCTP, 2 mM de rUTP, 1,5 mM de rGTP, 0,5 mM de ITP, 0,2 \muM de cada oligonucleótido, 375 mM de sorbitol, 0,105 g/l de BSA, 6,4 unidades de AMV-RT, 32 unidades de ARN polimerasa T7, 0,08 unidades de RNasa H de E. coli, y una cantidad especificada de templete en 20 \mul de volumen. Las secuencias de oligonucleótido utilizadas son un ejemplo, y no son limitadoras, ya que han sido utilizadas otras secuencias para éstas y otras secuencias diana.
Ejemplo 1
Para demostrar la viabilidad de la amplificación de una diana de ADN con NASBA, sin fases de desnaturalización a temperatura elevada, fueron utilizados los dos siguientes oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción NASBA anteriormente descritos:
gag1P1 del VIH-1:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTG
CTA TGT CAC TTC CCC TTG-GTTCTC TCA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
gag1P2 del VIH-1:
5' AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CAT GCA
AA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la amplificación parte de la región gag del genoma del VIH-1. Como material de inicio para la amplificación del ADN plásmido fue utilizado pUCp24 comprendiendo la región gag del genoma del VIH-1 en diferentes cantidades iniciales. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado en un filtro de nylon e hibridizado con la sonda 5' GAA TGG GAT AGA GTG CAT CCA GTG CAT G 3' de la región gag del VIH-1 marcada con P^{32}. Pudo ser obtenido en la amplificación un resultado positivo con una sensibilidad de 10^{5} moléculas de material de inicio de ADN plásmido. Los mismos resultados pudieron ser obtenidos siguiendo el mismo protocolo sin la incubación a 65ºC.
Ejemplo 2
Para demostrar la viabilidad de la amplificación sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción NASBA anteriormente descritos:
P1 del HPV16:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGA
AAA ATA AAC TGT AAA TCA-TATTC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del HPV16:
5' TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la amplificación parte del genoma del HPV16. Como material de inicio para la amplificación del ADN plásmido fue utilizado pHPV16 conteniendo un genoma completo del HPV16 en diferentes cantidades iniciales. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con la sonda 5' AGT ACA AAT ATG TCA TTA TGT GC 3' del HPV16 marcada con P^{32}. Pudo ser obtenido en la amplificación un resultado positivo con una sensibilidad de 1 pg de material de inicio de ADN plásmido.
Ejemplo 3
Para demostrar la viabilidad de la amplificación sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción NASBA anteriormente descritos:
\newpage
P1 del plásmido natural de la Clamidia trachomatis:
5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GCA
AGA GTA CAT CGG TCA ACG-A 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del plásmido natural de la Clamidia trachomatis:
5' TCA CAG CGG TTG CTC GAA GCA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la amplificación parte del plásmido natural de la Clamidia trachomatis. Como material de inicio para la amplificación fueron utilizados preparados plásmidos procedentes de la Clamidia trachomatis en diferentes cantidades iniciales en relación con la cantidad de Unidades Formadoras de Inclusión de Clamidia trachomatis (IFUs). El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con la sonda plásmida natural de la Clamidia trachomatis 5' CGT GCG GGG TTA TCT TAA AAG GGA T 3' marcada con P^{32}. Pudo ser obtenido en la amplificación un resultado positivo con una cantidad de ADN plásmido correspondiente a 0,01 IFU.
Ejemplo 4
Para demostrar la viabilidad de la amplificación sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción NASBA anteriormente descritos:
P1 del Factor Tisular:
5' AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GAG
GGA ATC ACT GCT TGA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del Factor Tisular:
5' GAC CGT AGA AGA TGA ACG GA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la amplificación parte del gen del Factor Tisular humano. Como material de inicio para la amplificación del ADN plásmido fue utilizado pUC13-TF conteniendo parte del gen del Factor Tisular en diferentes cantidades iniciales. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con la sonda del Factor Tisular 5' GTT CAG GAA AGA AAA CAG CCA 3' marcada con P^{32}. Pudo ser obtenido un resultado positivo en la amplificación con una sensibilidad de 10^{3} moléculas de material de inicio de ADN plásmido.
Ejemplo 5
Para demostrar la viabilidad de la amplificación sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción NASBA anteriormente descritos:
P1 del CD14:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG
ATC TCC ACC TCT ACT GCA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del CD14:
5' GAA GCT AAA GCA CTT CCA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la amplificación parte del gen CD14 humano. Como material de inicio para la amplificación del ADN plásmido fue utilizado p\piH3M conteniendo parte del gen CD14 en diferentes cantidades iniciales. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN plásmido diana con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con la sonda del CD 14 5' CCA TGG AGC GCG CGT CCT 3' marcada con P^{32}. Pudo ser obtenido en la amplificación un resultado positivo con una sensibilidad de 10^{3} moléculas de material inicial de ADN plásmido.
Ejemplo 6
Para demostrar la viabilidad de la amplificación sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción NASBA anteriormente descritos:
P1 de la Actina:
5' AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GGG A
(AG)G GGC C(CG)G (AC)CT-CGTC(AG)T ACT 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 de la Actina:
5' ATC AT(TC) GC(ATC) CC(GTC) CC(GAT) GAG
CGC A 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada en cursiva. Los nucleótidos entre paréntesis indican posición "degenerada", donde cualquiera de los nucleótidos entre paréntesis puede tener lugar. Estos iniciadores tienen como diana para la amplificación parte del gen humano de la Actina. Como material de inicio para la amplificación fue utilizado ADN genómico humano completo (ADN placentario humano obtenido comercialmente) tratado con RNasa A, en una cantidad inicial de material de 400 ng. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN genómico placentario humano diana con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con la sonda de Actina 5' CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG TGG A 3' marcada con P^{32}. Pudo ser mostrado un resultado positivo en la amplificación utilizando el ADN genómico humano como material inicial.
Ejemplo 7
Para demostrar la viabilidad de la amplificación sobre diana de ADN con NASBA sin fases de desnaturalización a temperatura elevada, fueron utilizados los siguientes dos oligonucleótidos en combinación con los ingredientes de reacción NASBA anteriormente descritos:
P1 del exón 4 del CMV:
5' AAT TCT AAT ACT CAC TAT AGG GAG ATC
CTC AAT GCG GCG CTT CA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
P2 del exón 4 del CMV:
5' GCT TGT ATG ATG ACC ATG TA 3'
La parte del promotor T7 del P1 es proporcionada en cursiva. Estos iniciadores tienen como diana para la amplificación parte del genoma del CMV. Como material de inicio para la amplificación fue utilizado ADN completo de células HEL infectadas con CMV, tratado con RNasa A, con una cantidad de material inicial equivalente a 0,1 células. El protocolo que fue utilizado consistió en mezclar el ADN con los ingredientes descritos más arriba en el prólogo, con excepción de las enzimas, calentando hasta los 65ºC, enfriando hasta los 41ºC, añadiendo las enzimas e incubando a 41ºC durante 90 minutos. El material amplificado fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, secado sobre un filtro de nylon e hibridizado con la sonda de CMV 5' CTG CTA TGT CTT AGA GGA GA 3' marcada con P^{32}. Pudo ser mostrado un resultado positivo en la amplificación utilizando el ADN de un equivalente de 0,1 células como material inicial.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Akzo Nobel N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Velperweg 76
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Arnhem
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 0412 666379
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 0412 650592
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Amplificación basada en la transcripción de dianas de ADN de doble hebra.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEÍBLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: Disco floppy.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0,
\vskip0.500000\baselineskip
Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGTGCTA TGTCACTTCC CCTTGGTTCT CTCA 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAA 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAATGGGATA GAGTGCATCC AGTGCATG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGGAAAA ATAAACTGTA AATCATATTC 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGTTACTG TGGTAGATAC TAC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTACAAATA TGTCATTATG TGC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGCAAGA GTACATCGGT CAACGA 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCACAGCGGT TGCTCGAAGC A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTGCGGGGT TATCTTAAAA GGGAT 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGGA ATCACTGCTT GA 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACCGTAGAA GATGAACGGA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTCAGGAAA GAAAACAGCC A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGGGATC TCCACCTCTA CTGCA 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGCTAAAG CACTTCCA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATGGAGCG CGCGTCCT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGGGAAG GGGCCCGGAC CTCGTCAGTA CT 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCATTCGCA TCCCGTCCCG ATGAGCGCA 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGTCCACCT TCCAGCAGAT GTGGA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAATA CTCACTATAG GGAGATCCTC AATGCGGCGC TTCA 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTTGTATGA TGACCATGTA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC.ID. Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCTATGTC TTAGAGGAGA 
\hfill
20

Claims (10)

1. Método para la amplificación de ADN de doble hebra con un método de amplificación basado en la transcripción, en donde el ADN de doble hebra es puesto en contacto con:
-
al menos, un oligonucleótido comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la primera de las dos hebras de ADN comprendidas en el ADN de doble hebra, comprendiendo adicionalmente dicho oligonucleótido la secuencia de un promotor reconocido por una ARN polimerasa;
-
un oligonucleótido adicional comprendiendo una secuencia complementaria de una parte de la segunda hebra comprendida en el ADN de doble hebra;
-
una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ARN;
-
una enzima poseyendo actividad ADN polimerasa dependiente de ADN;
-
una enzima poseyendo actividad RNasa H;
-
una enzima poseyendo actividad ARN polimerasa;
y la mezcla de reacción así creada es mantenida bajo las condiciones isotérmicas adecuadas durante una cantidad de tiempo suficiente como para que tenga lugar una reacción de amplificación basada en la transcripción, sin someter la mezcla a ningún tratamiento de calentamiento después de que cualquiera de las enzimas haya sido añadida a la mezcla.
2. El método conforme a la reivindicación 1, en donde el ADN es calentado una vez en presencia de los oligonucleótidos, pero antes de que sean añadidas las enzimas.
3. El método conforme a la reivindicación 2, en donde el ADN es calentado hasta 65 grados Celsius.
4. El método conforme a la reivindicación 2, en donde la mezcla es calentada hasta los 100 grados Celsius.
5. El método conforme a la reivindicación 1, en donde el ADN de doble hebra es un ADN plásmido o un ADN genómico.
6. El método conforme a la reivindicación 5, en donde el ADN es ADN genómico, el cual ha sido degradado parcialmente.
7. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde es utilizada una transcriptasa reversa.
8. El método conforme a la reivindicación 7, en donde la transcriptasa reversa es la transcriptasa reversa AMV.
9. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia promotora es la secuencia promotora T7, y la ARN polimerasa utilizada es la ARN polimerasa T7.
10. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde es utilizada una enzima RNasa H por separado.
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