ES2268868T3 - Toxinas y genes de bacillus thuringiensis para controlar plagas de coleopteros. - Google Patents
Toxinas y genes de bacillus thuringiensis para controlar plagas de coleopteros. Download PDFInfo
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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Abstract
Un polinucleótido aislado que codifica una proteína pesticida, manteniendo el polinucleótido o su complementario la hibridación con una secuencia de nucleótidos seleccionada entre SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6, tras un lavado acuoso a 0, 2 x o 1 x SSPE, 65ºC.
Description
Toxinas y genes de Bacillus thuringiensis
para controlar plagas de coleopteros.
Los insectos y otras plagas cuestan anualmente a
los agricultores billones de dólares en pérdidas de cosechas y en el
gasto que supone su control. Las pérdidas causadas por plagas en los
medios de producción agrícola incluyen la disminución del
rendimiento de las cosechas, la reducción de la calidad de las
cosechas y el aumento de los costes de recolección.
Los insectos del orden Coleoptera (los
coleópteros) son un grupo importante de plagas agrícolas que causa
cada año un daño de consideración en las cosechas. Hay un número de
escarabajos que causan un daño económico significativo; los ejemplos
incluyen los escarabajos crisomélidos (tales como los escarabajos
pulga y los gusanos de la raíz) y los curculiónidos (tales como los
gusanos verdes de la alfalfa).
Los escarabajo pulga incluyen un gran número de
géneros (p.ej., Altica, Apphthona, Argopistes,
Disonycha, Epitrix, Longitarsus,
Prodagricomela, Systena, Psylliodes y
Phyllotreta). El Phyllotreta striolata incluye el
escarabajo pulga rallado. El Phyllotreta cruciferae incluye
el escarabajo pulga de la canola, el escarabajo pulga de la colza y
el escarabajo pulgón. La canola, también conocida como la colza, es
una col con semilla oleaginosa (p.ej., Brassica campestris,
Brassica rapa, Brassica napus y Brassica
juncea).
Los escarabajos pulga incluyen un gran número de
escarabajos que se alimentan de las hojas de un número de gramíneas,
cereales y hierbas. El Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta
striolata y Phyllotreta undulata forman plagas anuales
particularmente destructivas que atacan al tejido de las hojas, los
tallos, las vainas y la raíz de las plantas susceptibles. El
Psylliodes chrysocephala, un escarabajo pulga, también es una
plaga bianual destructiva que ataca los tallos y las hojas de las
plantas susceptibles.
Los pesticidas químicos han proporcionado un
control eficaz de las plagas; sin embargo, la opinión pública ha
comenzado a concienciarse sobre la contaminación de alimentos con
productos químicos residuales, así como del medio ambiente,
incluyendo el suelo, las aguas superficiales y las aguas
subterráneas. El trabajo con pesticidas también puede representar un
peligro para las personas que los aplican. Las nuevas restricciones
estrictas sobre el uso de pesticidas y la eliminación de algunos
pesticidas eficaces del mercado podría limitar las opciones
económicas y eficaces del control de las costosas plagas.
Además, el uso regular de pesticidas para
controlar los organismos no deseados puede seleccionar cepas
resistentes. Esto ha ocurrido en muchas especies de insectos y otras
plagas económicamente importantes. El desarrollo de la resistencia a
los pesticidas requiere una búsqueda continua de nuevos agentes de
control que tengan unos modos distintos de acción.
De ese modo, existe una necesidad urgente de
identificar nuevos procedimientos y composiciones para controlar
plagas, tales como los muchos tipos diferentes de coleópteros que
causan un daño considerable en las plantas susceptibles.
Es posible caracterizar ciertas cepas del
microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B. t.), una
bacteria Gram-positiva formadora de esporas,
mediante inclusiones paraesporales de proteínas cristalinas. Estas
inclusiones aparecen habitualmente microscópicamente como cristales
de una forma particular. Las proteínas pueden ser muy tóxicas para
las plagas y son específicas en su actividad tóxica. Estas
\sigma-endotoxinas, que son producidas por ciertas
cepas de B. t. son sintetizadas por células esporulantes.
Ciertos tipos de toxinas de B. t., al ser ingeridas por un
insecto susceptible, son transformados en restos biológicamente
activos por las proteasas de los jugos del intestino de los
insectos. La diana principal son células del epitelio del intestino
del insecto, que son destruidas rápidamente por la toxina.
Se han aislado y secuenciado ciertos genes de
toxinas de Bacilllus. La clonación y la expresión de un gen
de proteína de cristal de B. t. en Escherichia
coli han sido descritas en el material publicado. Además, con
el uso de técnicas de ingeniería genética, están en desarrollo
nuevos enfoques para la administración de estas toxinas de
Bacillus en medios agrícolas, incluyendo el uso de plantas
modificadas genéticamente con genes de toxinas para la resistencia a
los insectos y el uso de células microbianas intactas estabilizadas
como vehículos de administración de endotoxinas de B. t. Se
han producido y aprobado para su uso productos de B. t.
basados en ADN recombinante. De ese modo, los genes de toxinas de
Bacillus aislados están adquiriendo un valor económico.
Hasta bastante recientemente, el uso comercial
de los pesticidas de B.t. ha estado ampliamente restringido a
un intervalo limitado de plagas de lepidópteros (orugas). Durante
muchos años se han usado las preparaciones de las esporas y los
cristales de B. thuringiensis subespecie kurstaki como
insecticidas comerciales para las plagas de lepidópteros. Por
ejemplo, el HD-1 de B. thuringiensis var.
Kurstaki produce una \sigma-endotoxina
cristalina que es tóxica para las larvas de un número de insectos
lepidópteros.
En los últimos años, sin embargo, se han
identificado nuevas especies de B. t., y los investigadores
han descubierto pesticidas de B.t. con especificidades por un
intervalo mucho más amplio de plagas. Por ejemplo, otras especies de
B. t., concretamente, israelensis y morrisoni
(a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t. M-7,
a.k.a. B.t. san diego) han sido usadas comercialmente para
controlar insectos de los órdenes Diptera y
Coleoptera, respectivamente.
Höfte y Whiteley (Höfte, H., H. R. Whiteley
(1989), Microbial Reviews 52(2):
242-255) clasificaron los genes de proteínas de
cristal de B. t. en cuatro clases principales. Las clases
fueron CryI (específica de los lepidópteros), CryII (específica de
los lepidópteros y los dípteros), CryIII (específica de los
coleópteros) y CryIV (específica de los dípteros). Se propusieron la
CryV y CryVI para designar una clase de genes de toxinas que son
específicos de los nematodos. Ahora se han identificado otras clases
de genes de B.t.
El esquema de nomenclatura y clasificación de
1989 de Höfte y Whiteley para las proteínas de cristal se basaba
tanto en la secuencia deducida de aminoácidos como en el espectro de
hospedadores de la toxina. Ese sistema fue adaptado para cubrir 14
tipos diferentes de genes de toxinas que fueron divididos en cinco
clases principales. A medida que se descubrían más genes de toxinas,
el sistema comenzó a ser inviable, pues se descubrió que genes con
secuencias similares tenían especificidades insecticidas
significativamente distintas. Se ha propuesto un esquema de
nomenclatura revisado que está basado únicamente en la identidad
aminoacídica (Crickmore et al., [1996] Society for
Invertebrate Pathology, XXIX Reunión Anual, III Coloquio
Internacional sobre Bacillus thuringiensis, Universidad de
Córdoba, Córdoba, España, 1-6 de septiembre,
Sumarios). El nemotécnico "cry" se ha conservado para
todos los genes de toxinas excepto para cytA y cytB, que permanecen
en una clase separada. Los números romanos han sido intercambiados
por números arábigos en la categoría principal, y se ha eliminado el
paréntesis en la tercera categoría. Se han conservado muchos de los
nombres originales, con las excepciones indicadas, aunque se haya
reclasificado un número de ellos. Véase también "Revisions of the
Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal
Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E.
Schenepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum y D. H. Dean,
Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62:
807-813; y Crickmore, Zeigler, Feitelson, Schnepf,
Van Rie, Lereclus, Baum. y Dean , "Bacillus thuringiensis
toxin nomenclature" (1999),
http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html. El
sistema usa las aplicaciones de software gratuitas CLUSTAL W y
PHYLIP. La aplicación NEIGHBOR del paquete PHYLIP usa un algoritmo
de medias aritméticas (UPGMA).
El aislado de B.t. PS86A1 es revelado en
las siguientes patentes estadounidenses: 4.849.217 (actividad contra
el gusano verde de la alfalfa); 5.208.017 (actividad contra el
gusano de la raíz del maíz); 5.286.485 (actividad contra los
lepidópteros); y 5.427.786 (actividad contra el género
Phyllotreta). Se clonó un gen procedente de PS86A1 en MR506
de B.t., lo que se revela en la patente estadounidense nº:
5.670.365 (actividad contra los nematodos) y la publicación de
solicitud de patente internacional vía PCT nº: WO93/04587 (actividad
contra los lepidópteros). Las secuencias de un gen y una toxina de
Cry6A (CryVIA) procedentes de PS86A1 son reveladas en
las siguientes patentes estadounidenses: 5.186.934 (actividad contra
el género Hypera); 5.273.746 (piojos); 5.262.158 y 5.424.410
(actividad contra los ácaros); así como la publicación de solicitud
de patente internacional vía PCT nº: WO94/23036 (actividad contra
los gusanos de alambre). Las patentes estadounidenses nº: 5.262.159
y 5.468.636 revelan PS86A1, la secuencia de un gen y una toxina del
mismo, y una fórmula genérica para toxinas que tienen actividad
contra los áfidos.
El aislado de B.t. PS52A1 es revelado por
las siguientes patentes estadounidenses como activo contra los
nematodos: 4.861.595; 4.948.734; 5.093.120; 5.262.399; 5.236.843;
5.322.932 y 5.670.365. PS52A1 también se revela en la patente
4.849.217 anterior y en la publicación de solicitud de patente
internacional vía PCT nº: WO95/02694 (actividad contra
Calliphoridae). Las secuencias de un gen y una toxina activa
contra los nematodos procedentes de PS52A1 son reveladas en la
patente estadounidense nº: 5.439.881 y la publicación de solicitud
de patente europea nº: EP 0462721. PS52A1, la secuencia de un gen y
una toxina activa contra los nematodos del mismo, así como una
fórmula genérica para las toxinas de CryVIA son reveladas en
la publicación de solicitud de patente internacional vía PCT nº: WO
92/19739.
Como resultado de una amplia investigación, se
han concedido otras patentes por nuevos aislados de B. t. y
nuevos usos de los aislados de B. t. Sin embargo, el
descubrimiento de nuevos aislados, toxinas y genes de
Bacillus, así como de nuevos usos de los aislados de
B.t. conocidos sigue siendo una técnica imprevisible y
empírica.
Aunque se sabía que las cepas de B.t.
PS86A1 y PS52A1, y un gen y una toxina del mismo, tenían cierta
actividad pesticida, antes no se conocían en la técnica otros genes
que codificaran toxinas activas procedentes de estos aislados.
La presente invención proporciona novedosos
genes que codifican toxinas pesticidas. Los genes de toxinas
novedosos preferidos de la presente invención son denominados
86A1(b) y 52A1(b). Estos genes codifican toxinas que
son activas contra plagas de plantas, preferiblemente, insectos;
preferiblemente, coleópteros, siendo lo más preferible que sean
escarabajos pulga del género Phyllotreta.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a plantas y a células de plantas transformadas
con al menos una secuencia de polinucleótidos de la presente
invención, tal que las células de plantas transformadas expresan
toxinas pesticidas en tejidos consumidos por las plagas diana. Las
plantas son transformadas de este modo con el fin de conferir una
resistencia a las plagas en dichas plantas. En estas realizaciones
preferidas, las plagas entran en contacto con las toxinas expresadas
por la planta transformada mediante la ingestión o el consumo de los
tejidos de la planta que expresan la toxina. Tal transformación de
las plantas puede realizarse usando técnicas conocidas por aquellos
expertos en la técnica. Las proteínas expresadas de esta manera
están mejor protegidas de la degradación medioambiental y la
desactivación. Existen otros numerosos beneficios de usar las
plantas transformadas de la presente invención.
En una realización alternativa, se pueden usar
para controlar plagas los aislados de B.t. de la presente
invención, o microbios recombinantes que expresan las toxinas
descritas en la presente memoria. De este modo, la presente
invención incluye células de B.t. sustancialmente intactas y
células recombinantes que contienen las toxinas expresadas de la
invención, tratadas para prolongar la actividad pesticida cuando las
células sustancialmente intactas son aplicadas al medio de una plaga
diana. La célula tratada actúa como una cubierta protectora para la
toxina pesticida. La toxina se vuelve activa al ser ingerida por un
insecto diana.
Otro aspecto de la presente invención incluye
genes de B.t. sintéticos optimizados de plantas que son
particularmente adecuados para proporcionar un mantenimiento y una
expresión estables en la planta transformada.
La SEQ ID Nº 1 es una sonda de oligonucleótido
directo para 52A1(b) y 86A1(b).
La SEQ ID Nº 2 es una secuencia de nucleótidos
de un gen que codifica la toxina de 86A1(b).
La SEQ ID Nº 3 es una secuencia de aminoácidos
de la toxina de 86A1(b).
La SEQ ID Nº 4 es una secuencia de nucleótidos
de un gen que codifica la toxina de 52A1(b).
La SEQ ID Nº 5 es una secuencia de aminoácidos
de la toxina de 52A1(b).
La SEQ ID Nº 6 es una secuencia de nucleótidos
del gen MR510 optimizado de plantas.
La SEQ ID Nº 7 es una secuencia de aminoácidos
codificada por el gen MR510 optimizado de plantas.
La SEQ ID Nº 8 es una versión truncada preferida
de la toxina de 52A1(b) nativa de longitud completa.
En el gen que codifica esta toxina (y para los
genes que codifican la totalidad de las siguientes secuencias de
aminoácidos mostradas en SEQ ID Nº: 9-19), se ha
añadido el codón iniciador para la metionina, de manera que el
aminoácido N-terminal es la metionina y no la
leucina (la leucina es el primer aminoácido de la proteína nativa).
Este truncamiento y las proteínas mostradas en las SEQ ID Nº:
9-13 tienen deleciones N-terminales
con respecto a la proteína nativa. El extremo 52A1(b) natural
es, en cambio, usado en estos truncamientos. Después del primer
aminoácido, esta toxina truncada comienza con el aminoácido 10 de la
proteína nativa. Es decir, los 9 primeros aminoácidos de la proteína
nativa han sido reemplazados en favor del único aminoácido
metionina. La porción (C-terminal) restante de esta
toxina es igual que la de la proteína nativa. En realizaciones
preferidas, se usan dos codones de terminación en el gen que
codifica esta toxina, así como en los genes que codifican las
siguientes proteínas truncadas (SEQ ID Nº:
9-19).
La SEQ ID Nº 9 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. Esta proteína comprende metionina añadida a la proteína
nativa que comienza en el aminoácido 21 de la proteína nativa. De
este modo, los 20 primeros aminoácidos N-terminales
de la proteína nativa han sido reemplazados por metionina.
La SEQ ID Nº 10 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En este truncamiento, se reemplazan los 26 primeros
aminoácidos N-terminales de la proteína nativa por
metionina.
La SEQ ID Nº 11 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En este truncamiento, se reemplazan los 41 primeros
aminoácidos N-terminales de la proteína nativa por
metionina.
La SEQ ID Nº 12 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En este truncamiento, se reemplazan los 52 primeros
aminoácidos N-terminales de la proteína nativa por
metionina.
La SEQ ID Nº 13 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En este truncamiento, se reemplazan los 74 primeros
aminoácidos N-terminales de la proteína nativa por
metionina.
La SEQ ID Nº 14 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En este truncamiento (y en el resto de truncamientos
mostrados en las SEQ ID Nº: 15-19), se usa el
comienzo natural de la proteína de 52A1(b) (con la excepción
de que la leucina ha sido reemplazada por la metionina). De este
modo, estas toxinas (y los genes que las codifican) son el resultado
de hacer deleciones C-terminales a la proteína
nativa. En esta proteína truncada, se eliminan 93 aminoácidos del
terminal C de la proteína nativa. Por consiguiente, esta proteína
truncada termina con el aminoácido 269 de la proteína nativa.
La SEQ ID Nº 15 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En esta proteína truncada, se eliminan 82 aminoácidos del
terminal C de la proteína nativa. Por consiguiente, esta proteína
truncada termina con el aminoácido 280 de la proteína nativa.
La SEQ ID Nº 16 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En esta proteína truncada, se eliminan 74 aminoácidos del
terminal C de la proteína nativa. Por consiguiente, esta proteína
truncada termina con el aminoácido 288 de la proteína nativa.
La SEQ ID Nº 17 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En esta proteína truncada, se eliminan 30 aminoácidos del
terminal C de la proteína nativa. Por consiguiente, esta proteína
truncada termina con el aminoácido 322 de la proteína nativa.
La SEQ ID Nº 18 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En esta proteína truncada, se eliminan 20 aminoácidos del
terminal C de la proteína nativa. Por consiguiente, esta proteína
truncada termina con el aminoácido 342 de la proteína nativa.
La SEQ ID Nº 19 es otra versión truncada
preferida de la proteína de 52A1(b) nativa de longitud
completa. En esta proteína truncada, se eliminan tres aminoácidos
del terminal C de la proteína nativa. Por consiguiente, esta
proteína truncada termina con el aminoácido 359 de la proteína
nativa.
La presente invención proporciona novedosos
genes que codifican toxinas pesticidas. Los nuevos genes de toxinas
preferidos de la presente invención son denominados 86A1(b) y
52A1(b). Estos genes codifican toxinas que son activas contra
(que pueden ser usadas para controlar, o que son tóxicas para, o que
son letales para) plagas de plantas, preferiblemente, insectos;
preferiblemente, coleópteros; y lo más preferible, escarabajos pulga
del género Phyllotreta. También se contempla el uso de los
presentes genes y toxinas para controlar otras plagas, tales como
las plagas del género Psylliodes.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a plantas y a células de plantas transformadas
con al menos una secuencia de polinucleótidos de la presente
invención, tal que las células de plantas transformadas expresan
toxinas pesticidas en los tejidos consumidos por las plagas diana.
Las plantas son transformadas de esta manera con el fin de conferir
a dichas plantas una resistencia a las plagas. En estas
realizaciones preferidas, las plagas entran en contacto con las
toxinas expresadas por la planta transformada mediante la ingestión
o el consumo de los tejidos de la planta que expresan la toxina. Tal
transformación de las plantas puede ser realizada usando técnicas
conocidas por aquellos expertos en la técnica. Las proteínas
expresadas de esta manera están mejor protegidas frente a la
degradación medioambiental y de la desactivación. Existen otros
numerosos beneficios en el uso de las plantas transformadas de la
presente invención.
En una realización alternativa, es posible usar
para controlar plagas los aislados de B.t. de la presente
invención, o microbios recombinantes que expresen las toxinas
descritas en la presente memoria. De este modo, la presente
invención incluye células de B.t. sustancialmente intactas y
células recombinantes que contienen las toxinas expresadas de la
invención. Estas células pueden ser tratadas para prolongar la
actividad pesticida cuando las células sustancialmente intactas son
aplicadas en el medio de una plaga diana. Véase, p.ej., las
patentes estadounidenses nº: 4.695.462; 4.861.595 y 4.695.455. La
célula tratada actúa como una cubierta protectora para la toxina
pesticida. La toxina se vuelve activa al ser ingerida por un insecto
diana.
Las características de los aislados de
Bacillus thuringiensis PS86A1 y PS52A1, tales como la
morfología de las colonias, el tipo de inclusión y los tamaños de
las proteínas solubles en álcali (mediante
SDS-PAGE), han sido reveladas en, por ejemplo, la
patente estadounidense nº: 5.427.786 y la solicitud publicada vía
PCT WO 95/02694, respectivamente.
Los aislados útiles según la presente invención
están disponibles en virtud de los depósitos descritos en diversas
patentes estadounidenses. En el apartado de antecedentes anterior,
se tratan con mayor detalle los ejemplos de tales patentes. Los
cultivos revelados en esta solicitud han sido depositados en la
Colección de Cultivos patentados del Servicio de Investigación
Agrícola (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria, Illinois 61604, EE.UU.
| Cultivo | Nº de acceso del depósito | Fecha del depósito |
| B.t. var. wuhanensis PS86A1 | NRRL B-18400 | 16 de agosto de 1988 |
| B.t. var. wuhanensis PS52A1 | NRRL B-18245 | 28 de julio de 1987 |
Los presentes cultivos han sido depositados en
condiciones que garantizan que el acceso a los mismos será posible
durante el período de espera de aprobación de esta solicitud de
patente determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas
Comerciales bajo el título de 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. Los
depósitos están disponibles según lo requerido por la leyes de
patente extranjeras de los países en los que se presenten los
homólogos de la presente solicitud, o su progenie. Sin embargo,
debería entenderse que la disponibilidad de un depósito no
constituye una licencia para practicar la presente invención en
menoscabo de los derechos de patente concedidos por la acción
gubernamental.
Además, los depósitos de los cultivos de la
invención serán almacenados y serán puestos a disposición del
público conforme a las disposiciones del Tratado de Budapest para el
Depósito de Microorganismos, es decir, serán almacenados con todo el
cuidado necesario para mantenerlos viables y no contaminados durante
un período de al menos cinco años tras la solicitud más reciente de
suministro de una muestra de un depósito, y en cualquier caso,
durante un período de al menos treinta (30) años tras la fecha del
depósito o durante la vida de obligación de cumplimiento de
cualquier patente que pueda publicarse revelando los cultivos. El
depositario acepta el deber de reemplazar los depósitos si el
depositaria fuera incapaz de proporcionar una muestra al ser
solicitada, debido al estado de los depósitos. Todas las
restricciones a la disponibilidad del público de los depósitos de
los cultivos de la presente invención serán irrevocablemente
eliminadas al concederse una patente que los revele.
Genes y toxinas. Ciertas secuencias de
ADN de la presente invención han sido ejemplificadas específicamente
en la presente memoria. Estas secuencias son ejemplos de la presente
invención. Debería resultar perfectamente evidente que la presente
invención no sólo incluye los genes y las secuencias ejemplificadas
específicamente en la presente memoria, sino que también incluye los
equivalentes, las variantes, las variaciones, los mutantes, las
fusiones, los quiméricos, los truncamientos, los fragmentos y los
genes de menor tamaño que muestren las mismas o características
similares en relación con la actividad pesticida y la expresión en
plantas, en comparación con aquéllos específicamente revelados en la
presente memoria.
Los fragmentos de los genes y las toxinas
específicamente ejemplificados en la presente memoria que conservan
la actividad pesticida de las toxinas ejemplificadas pertenecen al
alcance de la presente invención. Los genes y las toxinas útiles
según la presente invención no sólo incluyen las secuencias de
longitud completa, sino también los fragmentos de estas secuencias
que conservan la actividad pesticida característica de las toxinas
específicamente ejemplificadas en la presente memoria.
Las secuencias de ADN de variantes pertenecen al
alcance de la presente invención. Como se usa en la presente
memoria, "variantes" y "equivalentes" se refieren a
secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o
inserciones de nucleótidos (o aminoácidos) que no afectan
materialmente a la expresión de los presentes genes ni a la
actividad pesticida resultante de las toxinas codificadas,
particularmente, en plantas. Como se usa en la presente memoria, los
términos "variantes" y "variaciones" de genes se refieren
a secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o que
codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Como
se usa en la presente memoria, el término "toxinas
equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma o
esencialmente la misma actividad biológica contra las plagas diana
que las toxinas ejemplificadas.
Los genes pueden ser modificados, y las
variaciones de los genes pueden ser fácilmente construidas, como
sería sabido por cualquier experto en la técnica. Por ejemplo, la
patente estadounidense nº: 5.605.793 describe procedimientos para
generar una diversidad molecular adicional usando un reensamblaje de
ADN tras una fragmentación aleatoria. Hay técnicas estándar
disponibles para hacer mutaciones puntuales. El uso de la
mutagénesis dirigida es conocido en la técnica. Se pueden formar
fragmentos de los presentes genes usando exonucleasas o
endonucleasas comercialmente disponibles según procedimientos
estándar. Por ejemplo, se pueden usar enzimas tales como
Bal31 para cortar sistemáticamente nucleótidos de los
extremos de estos genes. Es posible obtener genes útiles usando una
variedad de enzimas de restricción. Se pueden usar proteasas para
obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas.
Debido a la redundancia del código genético, hay
una variedad de diferentes secuencias de ADN que puede codificar las
secuencias de aminoácidos reveladas en la presente memoria.
Pertenece al alcance de los expertos en la técnica crear estas
secuencias alternativas de ADN que codifican las mismas, o
esencialmente las mismas, toxinas. Estas secuencias de ADN de
variantes pertenecen al alcance de la presente invención. Como se
usa en la presente memoria, la referencia a "esencialmente la
misma" secuencia se refiere a secuencias que tienen
sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos
que no afectan sustancialmente a la actividad pesticida.
Debería resultar evidente para un experto en la
técnica que, dadas las secuencias de los genes y de las toxinas
expuestas en la presente memoria, es posible obtener los genes y las
toxinas de la presente invención a través de diversos
procedimientos. Por ejemplo, es posible construir los presentes
sintéticamente usando un sintetizador de genes. También es posible
derivar los presentes genes y las toxinas de genes y toxinas de tipo
salvaje procedentes de aislados depositados en un depósito de
cultivos según lo descrito anteriormente. Las toxinas equivalentes
y/o los genes que codifican estas toxinas equivalentes pueden ser
derivados de aislados de Bacillus y/o genotecas de ADN usando
las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria.
Como reconocería fácilmente un experto en la
técnica, el ADN puede existir en una forma bicatenaria. En esta
disposición, una cadena es complementaria de la otra cadena, y
viceversa. La "cadena codificante" es habitualmente usada en la
técnica para denominar a la cadena que tiene una serie de codones
(un codón es tres nucleótidos que pueden ser leídos de tres en tres
para producir un determinado aminoácido) que puede ser leída como un
marco de lectura abierto para formar una proteína o un péptido de
interés. Para expresar una proteína in vivo, lo común es
traducir una cadena de ADN en una cadena complementaria de ARN que
se usa como el molde para la proteína. Cuando se replica ADN en una
planta (por ejemplo) se producen cadenas complementarias adicionales
de ADN. Por consiguiente, la presente invención incluye el uso de
bien los polinucleótidos ejemplificados mostrados en el listado de
secuencias anexo o las cadenas complementarias. Se incluyen en la
presente invención el ARN y el ANP (Ácido Nucleico Peptídico) que
son funcionalmente equivalentes al ADN ejemplificado. De ese modo,
en realizaciones preferidas, la expresión directa o indirecta del
presente polinucleótido resulta, directa o indirectamente, en la
producción intracelular y el mantenimiento del polipéptido o la
proteína deseado.
Existe un número de procedimientos para obtener
las toxinas pesticidas de la presente invención. Por ejemplo, se
pueden usar los anticuerpos contra las toxinas pesticidas reveladas
y reivindicadas en la presente memoria para identificar y aislar
toxinas procedentes de una mezcla de proteínas. Específicamente, los
anticuerpos pueden ser aumentados a las porciones de las toxinas que
sean más constantes y más distintas de otras toxinas de
Bacillus. Estos anticuerpos pueden entonces ser usados para
identificar específicamente toxinas equivalentes con la actividad
característica mediante inmunoprecipitación, ELISA (Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay) y transferencia western. Los anticuerpos
contra las toxinas reveladas en la presente memoria, o contra las
toxinas equivalentes o fragmentos de estas toxinas, pueden ser
preparados fácilmente usando procedimientos estándar en esta
técnica.
Ciertas toxinas de la presente invención han
sido específicamente ejemplificadas en la presente memoria; estas
toxinas son simplemente ejemplos de las toxinas de la presente
invención. Es evidente que la presente invención comprende toxinas
equivalentes o variantes (y secuencias de nucleótidos que codifican
las toxinas equivalentes) que tienen la misma o una actividad
pesticida similar a la toxina ejemplificada. Los genes equivalentes
codificarán toxinas que tengan una identidad u homología de
aminoácidos elevada con las toxinas codificadas por los presentes
genes. Las toxinas equivalentes tendrán una homología de aminoácidos
con una toxina ejemplificada. Esta identidad de aminoácidos será
comúnmente mayor del 60%, preferiblemente, será mayor del 75%, más
preferiblemente, mayor del 80%, mucho más preferiblemente, mayor del
90%, pudiendo ser mayor del 95%. Estas identidades son como se
determinan mediante el uso de técnicas de alineamiento estándar. Los
procedimientos preferidos de determinación del porcentaje de
identidad son tratados en Crickmore et al., anterior. La
homología de los aminoácidos será la más alta en las regiones
fundamentales de la toxina que son responsables de la actividad
biológica y participan en la determinación de la configuración
tridimensional que, en última instancia, es responsable de la
actividad biológica. A este respecto, se aceptan y se pueden esperar
ciertas sustituciones de aminoácidos si están en regiones que no son
fundamentales para la actividad o son sustituciones conservativas de
aminoácidos que no afectan a la configuración tridimensional de la
molécula. Por ejemplo, los aminoácidos pueden ser distribuidos en
las siguientes clases: no polares, polares sin carga, básicos o
ácidos. Las sustituciones conservativas por medio de las cuales un
aminoácido de una clase es reemplazado por otro aminoácido del mismo
tipo pertenecen al alcance de la presente invención, siempre y
cuando la sustitución no altere sustancialmente la actividad
biológica del compuesto. La tabla 2 proporciona un listado de
ejemplos de aminoácidos pertenecientes a cada clase.
\vskip1.000000\baselineskip
| Clase de aminoácido | Ejemplos de aminoácidos |
| No polar | Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp |
| Polar sin carga | Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln |
| Ácido | Asp, Glu |
| Básico | Lys, Arg, His |
En algunos casos, también se pueden hacer
sustituciones no conservativas. El factor fundamental es que estas
sustituciones no deben restar un valor significativo a la actividad
biológica de la toxina.
Como se usa en la presente memoria, la
referencia a polinucleótidos "aislados" y/o toxinas
"purificadas" se refiere a estas moléculas cuando no están
asociadas con las otras moléculas con las que serían encontradas en
la naturaleza, e incluiría su uso en plantas. De este modo, la
referencia a "aislado y purificado" supone la participación de
la "mano del hombre" según lo descrito en la presente memoria.
Las toxinas y los genes quiméricos también implican la "mano del
hombre".
Es posible expresar toxinas de B.t. de
longitud completa y luego convertirlas en formas truncadas activas a
través de la adición de reactivos apropiados y/o mediante el
desarrollo de cultivos en condiciones que den como resultado el
truncamiento de las proteínas a través de la acción fortuita de
proteasas endógenas. En una realización alternativa, la toxina de
longitud completa puede sufrir otras modificaciones para producir la
forma activa de la toxina. El ajuste de la solubilización de la
toxina, así como otras condiciones de la reacción, tales como el pH,
la fuerza iónica o el potencial redox, puede ser usado para efectuar
la modificación deseada de la toxina. Las toxinas truncadas de la
presente invención pueden ser obtenidas mediante el tratamiento de
la \sigma-endotoxina cristalina de Bacillus
thuringiensis con una serina proteasa tal como tripsina bovina a
un pH alcalino y, preferiblemente, en ausencia de
\beta-mercaptoetanol.
Los genes y las toxinas quiméricos y/o de fusión
(comúnmente producidos mediante bien la combinación de porciones
procedentes de más de una toxina o un gen de Bacillus, o la
combinación de genes y toxinas de longitud completa, y combinaciones
de los mismos) también pueden ser utilizados según las enseñanzas de
la presente invención. La presente invención incluye el uso de todas
o parte de las toxinas y los genes en la producción de proteínas de
fusión y genes de fusión. Las toxinas quiméricas también pueden ser
producidas mediante la combinación de porciones de múltiples
toxinas.
Se han desarrollado procedimientos para elaborar
toxinas quiméricas útiles mediante la combinación de porciones de
proteínas de cristal de B.t. Las porciones que son combinadas
no necesitan ser pesticidas, siempre y cuando la combinación de las
porciones cree una proteína quimérica que sea pesticida. Esto se
puede hacer usando enzimas de restricción, según lo descrito en, por
ejemplo, la patente europea 0 228 838; Ge, A.Z., N.L. Shivarova,
D.H. Dean (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:
4037-4041; Ge, A.Z.; D. Rivers, R. Milne, D.H. Dean
(1991) J. Biol. Chem. 266: 17954-17958;
Schnepf, H.E., K. Tomezak, J.P. Ortega, H.R. Whiteley (1990) J.
Biol. Chem. 265: 20923-20930; Honee, G., D.
Convents, J. Van Rie, S. Jansens, M. Peferoen, B. Visser (1991)
Mol. Microbiol. 5:2799-2806.
Alternativamente, se puede usar la recombinación usando mecanismos
de recombinación celular para conseguir resultados similares. Véase,
por ejemplo, Caramori, T., A.M. Albertini, A. Galizzi (1991)
Gene 98: 37-44; Widner, W.R., H.R. Whiteley
(1990) J. Bacteriol. 172: 2826-2832; Bosch,
D., B. Schipper, H. van der Kliej, R.A. de Maagd, W. J. Stickema
(1994) Biotechnology 12: 915-918. Hay un
número de otros procedimientos conocidos en la técnica por medio de
los cuales es posible formar tales ADN quiméricos. La presente
invención pretende incluir proteínas quiméricas que utilicen las
nuevas secuencias identificadas en la presente solicitud.
Además, es posible usar las toxinas de la
presente invención en combinación entre sí o con otras toxinas para
conseguir un mayor control de plagas. Por supuesto, esto incluye el
uso de las presentes toxinas con diferentes toxinas en esquemas de
control de plagas diseñados para controlar plagas que podrían haber
desarrollado resistencia frente a una o más toxinas.
Con las enseñanzas proporcionadas en la presente
memoria, un experto en la técnica podría producir fácilmente y usar
las diversas toxinas y las secuencias de polinucleótidos descritas
en la presente memoria.
Hospedadores recombinantes y otros
procedimientos de aplicación. Los genes que codifican las
toxinas de la presente invención pueden ser introducidos en una
amplia variedad de hospedadores microbianos o vegetales. Como se usa
en la presente memoria, el término gen "heterólogo" se refiere
a un gen que no ocurre de forma natural en el hospedador que es
transformado con el gen. En realizaciones preferidas, la expresión
del gen de toxina resulta, directa o indirectamente, en la
producción intracelular y el mantenimiento del pesticida.
Cuando las plantas transformadas de la presente
invención son ingeridas por la plaga, las plagas ingerirán la
toxina. El resultado es un control de la plaga. Los beneficios de la
expresión en plantas de las proteínas de toxinas incluyen una mayor
protección del pesticida frente a la degradación medioambiental y la
desactivación. El uso en plantas también evita el tiempo y el gasto
de pulverizar o aplicar de otro modo organismos y/o la toxina en la
planta o en el sitio de la plaga con el fin de entrar en contacto
con y controlar la plaga diana.
Los presentes genes de toxinas de B.t.
pueden ser introducidos mediante un vector adecuado en un
hospedador, preferiblemente, un hospedador vegetal. Existen muchos
cultivos compatibles de interés, tales como el maíz, el algodón y el
girasol.
Los genes optimizados de plantas sintéticos,
como los ejemplificados en la presente memoria, son particularmente
adecuados para proporcionar un mantenimiento y una expresión
estables del gen en la planta transformada.
En algunas realizaciones de la presente
invención, los hospedadores microbianos transformados pueden ser
usados en etapas preliminares para preparar precursores que, en
última instancia, serán usados para transformar células de plantas
y/o plantas. Los microbios transformados y usados de esta manera
pertenecen al alcance de la presente invención. Los microbios
recombinantes pueden ser, por ejemplo, B.t., E. coli o
Pseudomonas (tales como Pseudomons fluorescens). Las
transformaciones pueden ser realizadas por aquellos expertos en la
técnica usando técnicas estándar. Los materiales necesarios para
estas transformaciones son revelados en la presente memoria o, de no
ser así, están fácilmente disponibles para el experto.
Como una alternativa al uso de plantas
transformadas con un gen de la presente invención, se pueden usar
los aislados de B.t. o los microbios recombinantes que
expresan las toxinas descritas en la presente memoria para controlar
las plagas.
Los aislados de B.t. de la invención
pueden ser cultivados usando medios técnicos estándar y técnicas de
fermentación. Una vez completado el ciclo de fermentación, las
bacterias pueden ser cosechadas separando primero las esporas y los
cristales de B.t. del caldo de fermentación mediante
procedimientos conocidos en la técnica. Las esporas, los cristales
y/o las toxinas de B.t. recuperados pueden ser formulados en
polvos humectantes, concentrados líquidos, gránulos u otras
formulaciones mediante la adición de tensioactivos, dispersantes,
vehículos inertes y otros componentes que faciliten la manipulación
y la aplicación en plagas diana concretas. Estos procedimientos de
formulación y aplicación son conocidos en la técnica.
La presente invención también incluye mutantes
de los aislados de B.t. anteriores que tienen sustancialmente
las mismas propiedades pesticidas que los aislados de B.t.
parentales. Los mutantes pueden ser elaborados mediante
procedimientos conocidos en la técnica. La luz ultravioleta y la
nitrosoguanidina son ampliamente usadas con este fin. Se puede
obtener un mutante esporógeno a través de la mutagénesis de un
aislado con sulfonato de etilmetano
(EMS).
(EMS).
Los hospedadores microbianos adecuados, p.ej.,
Pseudomonas, transformados para expresar uno o más genes de
la presente invención pueden ser aplicados donde se encuentra
situada la plaga, el lugar en el que el hospedador transformado
puede proliferar y/o ser ingerido. El resultado es un control de la
plaga.
Alternativamente, el microbio que hospeda al gen
de toxina puede ser matado y tratado en condiciones que prolonguen
la actividad de la toxina y estabilicen la célula; la célula
tratada, que conserva la actividad tóxica, puede entonces ser
aplicada al medio de la plaga diana. Véase, p.ej., las patentes
estadounidenses nº: 4.695.462; 4.861.595 y 4.695.455. De este modo,
la invención incluye el tratamiento de células de B.t.
sustancialmente intactas y/o células recombinantes que contienen las
toxinas expresadas de la invención, tratadas para prolongar la
actividad pesticida cuando las células sustancialmente intactas son
aplicadas al medio de una plaga diana. Tal tratamiento puede ser por
medios químicos o físicos, o una combinación de medios químicos o
físicos, siempre y cuando la técnica no afecte negativamente a las
propiedades del pesticida, no disminuya la capacidad celular de
protección del pesticida. La célula tratada actúa como una cubierta
protectora para la toxina pesticida. La toxina se vuelve capaz de
actuar como tal al ser ingerida por un insecto diana.
Genes sintéticos optimizados de plantas.
Los genes de B.t. sintéticos preferidos según la presente
invención incluyen secuencias de nucleótidos que tienen: (1) más
codones preferidos de la planta que el gen de B.t. nativo,
(2) una frecuencia de uso de codón que es más cercana a la
frecuencia de codón del hospedador vegetal destino que del gen de
B.t. nativo, o (3) sustancialmente todos los codones
comprendidos del codon que tiene la frecuencia más elevada en el
hospedador vegetal destino. Aunque que la presente invención
proporciona realizaciones específicas de genes sintéticos que son
particularmente útiles en plantas transformadas, también se pueden
usar otros genes que son funcionalmente equivalentes a los genes
ejemplificados en la presente memoria para transformar hospedadores,
preferiblemente, hospedadores vegetales. Se puede encontrar una guía
adicional para la producción de genes sintéticos destinados a su uso
en plantas en, por ejemplo, la patente estadounidense nº:
5.380.831.
Sondas de polinucleótido. Un
procedimiento para identificar toxinas y genes útiles es a través
del uso de sondas de oligonucleótido. Estas sondas son secuencias de
nucleótidos detectables. Las sondas proporcionan un procedimiento
rápido para identificar los genes que codifican toxinas. Los
segmentos de nucleótido que son usados como sondas pueden ser
sintetizados usando un sintetizador de ADN y procedimientos
estándar.
Se sabe que el ADN posee una propiedad
fundamental denominada complementariedad de bases. En la naturaleza,
el ADN existe comúnmente en forma de pares de cadenas antiparalelas,
proyectándose las bases de cada cadena desde esa cadena hacia la
cadena opuesta. La base adenina (A) de una cadena siempre será
opuesta a la base timina (T) de la otra cadena, y la base guanina
(G) será opuesta a la base citosina (C). Las bases son mantenidas en
aposición por su capacidad de enlazarse con hidrógenos de este modo
específico. Aunque cada uno de los enlaces individuales es
relativamente débil, el efecto neto de muchas bases adyacentes
enlazadas a hidrógeno, junto con los efectos de apilamiento de
bases, constituyen una unión estable de las dos cadenas
complementarias. Estos enlaces pueden ser rotos mediante
tratamientos tales como un pH elevado o una temperatura elevada, y
estas condiciones resultan en la disociación o la
"desnaturalización" de las dos cadenas. Si entonces se coloca
el ADN en condiciones que conviertan al enlace de las bases con
hidrógeno en termodinámicamente favorable, las cadenas de ADN se
aparearán o se "hibridarán", volviendo a formar el ADN
bicatenario original. Si se lleva a cabo en condiciones apropiadas,
esta hibridación puede ser muy específica. Es decir, sólo las
cadenas con un alto grado de complementariedad de bases serán
capaces de formar estructuras bicatenarias estables. La relación
entre la especificidad de la hibridación y la condiciones de
reacción es conocida. Por consiguiente, se puede usar la hibridación
para analizar si dos piezas de ADN son complementarias en sus
secuencias de bases. Es este mecanismo de hibridación lo que
facilita el uso de sondas para detectar fácilmente y caracterizar
las secuencias de ADN de interés.
Las sondas pueden ser ARN, ADN o ANP (ácido
nucleico peptídico). La sonda normalmente tendrá al menos
aproximadamente 10 bases, más habitualmente, al menos
aproximadamente 17 bases, y puede tener hasta aproximadamente 100
bases o más. Se pueden utilizar fácilmente sondas más largas, y
tales sondas pueden ser, por ejemplo, de una longitud de varias
kilobases. La secuencia de la sonda es diseñada para que sea al
menos sustancialmente complementaria a una porción de un gen que
codifique una toxina de interés. La sonda no necesita tener una
complementariedad perfecta con la secuencia a la que se hibrida. Las
sondas pueden ser marcadas utilizando técnicas que son conocidas
por aquellos expertos en la técnica.
Un enfoque para el uso de sondas supone
identificar primero mediante un análisis de transferencia southern
un banco de genes de los segmentos de ADN de todos los aislados de
Bacillus que sean homólogos a las secuencias de nucleótidos
reveladas. Por tanto, es posible, sin la ayuda de una análisis
biológico, conocer de antemano la actividad probable de muchos
aislados nuevos de Bacillus, y de los productos génicos
individuales expresados por un aislado dado de Bacillus. Tal
análisis de la sonda proporciona un procedimiento rápido para
identificar los genes de toxinas insecticidas con un posible valor
comercial dentro de las subespecies tan diversas de B.t. La
técnica de hibridación concreta no es esencial. A medida que se van
realizando mejoras en las técnicas de hibridación, éstas pueden ser
fácilmente aplicadas.
Un procedimiento de hibridación útil comúnmente
incluye las etapas iniciales de aislar la muestra de ADN de interés
y purificarla químicamente. Se pueden usar bien bacterias lisadas o
ácido nucleico totalmente fraccionado aislado de bacterias. Las
células pueden ser tratadas usando técnicas conocidas para liberar
su ADN (y/o ARN). La muestra de ADN puede ser cortada en piezas con
una enzima de restricción apropiada. Las piezas pueden ser separadas
por tamaños a través de electroforesis en un gel, habitualmente, de
agarosa o acrilamida. Las piezas de interés pueden ser transferidas
a una membrana de inmovilización.
La sonda y la muestra pueden ser entonces
combinadas en una solución tampón de hibridación y mantenidas a una
temperatura apropiada hasta que se produzca el apareamiento. A
partir de entonces, se lava la membrana para eliminar los materiales
extraños, dejando que la muestra y las moléculas enlazadas de la
sonda sean normalmente detectadas y cuantificadas mediante
autorradiografía y/o recuento por centelleo líquido. Como es sabido
en la técnica, si la molécula de sonda y la muestra de ácido
nucleico se hibridan formándose un fuerte enlace no covalente entre
las dos moléculas, sería razonable asumir que la sonda y la muestra
son esencialmente idénticas. La etiqueta detectable de la sonda
proporciona un medio para determinar de una manera conocida si la
hibridación tiene
lugar.
lugar.
En el uso de segmentos de nucleótidos como
sondas, la sonda en concreto es marcada con cualquier etiqueta
adecuada conocida en la técnica, incluyendo etiquetas radiactivas y
no radiactivas. Las etiquetas radiactivas típicas incluyen ^{32}P,
^{35}S o similares. Las etiquetas no radiactivas incluyen, por
ejemplo, ligandos tales como biotina o tirosina, así como enzimas
tales como hidrolasas o perixodasas, o diversos quimioluminiscentes
tales como luciferina; o compuestos fluorescentes como la
fluoresceína y sus derivados. Las sondas pueden hacerse
inherentemente fluorescentes según lo descrito en la solicitud
internacional nº: WO 93/16094.
Se pueden emplear diversos grados de condiciones
restrictivas de hibridación, como se describe más abajo. Cuanto más
restrictivas sean las condiciones, mayor será la complementariedad
que es requerida para la formación del dúplex. Las condiciones
restrictivas pueden ser controladas por la temperatura, la
concentración de sonda, la longitud de la sonda, la fuerza iónica,
el tiempo y similares. Preferiblemente, la hibridación es realizada
en condiciones restrictivas moderadas a altas mediante técnicas
conocidas en la técnica, según lo descrito, por ejemplo, en Keller,
G.H., M.M. Manak (1987) "DNA Probes", Stockton
Press, Nueva York., pp. 169-170.
Es posible realizar la hibridación de ADN
inmovilizado sobre transferencias southern con sondas con
especificidad génica marcadas con ^{32}P mediante procedimientos
estándar (Maniatis et al. [1982] "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY). En general, la hibridación y los lavados posteriores
pueden ser llevados a cabo en condiciones restrictivas bajas,
moderadas y/o altas que permitan la detección de las secuencias
diana con homología a los genes de toxinas ejemplificados. Para las
sondas de genes de ADN bicatenario, la hibridación puede ser llevada
a cabo durante toda una noche a 20-25ºC por debajo
de la temperatura de fusión (Tf) del híbrido de ADN en 6 x SSPE, 5 x
solución de Denhardt, SDS al 0,1%, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizado.
La temperatura de fusión se describe mediante la siguiente fórmula
(Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas y F.C.
Kafatos [1983] "Methods of Enzymology", R. Wu. L. Grossman y K.
Moldave [eds.] Academic Press, Nueva York 100:
266-285).
Tf = 81,5ºC + 16,6 Log[Na^{+}] + 0,41
(%G + C) - 0,61 (% formamida) - 600/longitud del dúplex en pares de
bases.
\vskip1.000000\baselineskip
Los lavados son comúnmente llevados a cabo como
sigue:
- (1)
- Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1 x SSPE, SDS al 0,1% (lavado en condiciones restrictivas bajas).
- (2)
- Una vez a la Tf - 20ºC durante 15 minutos en 0,2 x SSPE, SDS al 0,1% (lavado en condiciones restrictivas moderadas).
\vskip1.000000\baselineskip
Otros lavados en condiciones restrictivas bajas
incluyen 6 x SSPE, SDS al 0,1% a 37ºC o 2 x SSPE, SDS al 0,1% a la
Tf - 20ºC.
Para las sondas de oligonucleótido, la
hibridación puede ser llevada a cabo durante toda una noche a
10-20ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tf)
del híbrido en 6 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, SDS al 0,1%, 0,1
mg/ml de ADN desnaturalizado. La Tf para las sondas de
oligonucleótido puede ser determinada mediante la siguiente
fórmula:
fórmula:
Tf (ºC) = 2 (número de pares de bases de T/A) +
4(número de pares de bases de G/C) (Suggs, S.V., T. Miyake,
E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura y R.B. Wallace [1981]
ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using
Purified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, Nueva
York, 23: 683-693).
\newpage
Los lavados son comúnmente llevados a cabo como
sigue:
- (1)
- Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1 x SSPE, SDS al 0,1% (lavado en condiciones restrictivas bajas).
- (2)
- Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1 x SSPE, SDS al 0,1% (lavado en condiciones restrictivas moderadas).
En general, es posible modificar la sal y/o la
temperatura para cambiar las condiciones restrictivas. Además, se
puede usar lavados de formamida o acuosos. Los lavados de formamida
requieren una temperatura más baja que los lavados acuosos. Con un
fragmento de ADN marcado de una longitud de >70 bases o así, se
pueden usar las siguientes condiciones (lavados acuosos):
| Bajas: | 1 ó 2 x SSPE, temperatura ambiente |
| Bajas: | 1 ó 2 X SSPE, 42ºC |
| Moderadas: | 0,2 ó 1 x SSPE, 65ºC |
| Altas: | 0,1 x SSPE, 65ºC. |
La formación y la estabilidad del dúplex depende
de la complementariedad sustancial entre las dos cadenas de un
híbrido y, como se indica anteriormente, se puede tolerar un cierto
grado de apareamiento erróneo. Por tanto, las secuencias de sonda
útiles pueden incluir mutaciones (tanto simples como múltiples),
deleciones, inserciones de las secuencias descritas y combinaciones
de las mismas, en las que dichas mutaciones, inserciones y
deleciones permiten la formación de híbridos estables con el
polinucleótido diana de interés. Las mutaciones, las inserciones y
las deleciones pueden ser producidas de muchos modos en una
secuencia de polinucleótido dada, y estos procedimientos son
conocidos por cualquier experto en la técnica; en el futuro, se
conocerán otros procedimientos. Estas variantes pueden ser usadas de
la misma manera que las secuencias originales de cebador, con la
condición de que las variantes tengan una homología secuencial
sustancial con la secuencia original. Como se usa en la presente
memoria, la homología secuencial sustancial se refiere a una
homología que sea suficiente para permitir que la sonda variante
funcione con la misma capacidad que la sonda original.
Preferiblemente, ésta es mayor del 50%; más preferiblemente, esta
homología es mayor del 75%; y lo más preferible es que esta
homología sea mayor del 90%. El grado de homología necesario para
que la variante funcione con la capacidad pretendida dependerá del
uso que se pretenda dar a la secuencia. Pertenece al alcance de
cualquier experto en la técnica realizar mutaciones mutacionales,
insercionales y delecionales que estén diseñadas a mejorar la
función de la secuencia, o a proporcionar de otro modo una ventaja
metodológica.
Tecnología PCR. La reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) es una síntesis enzimática repetitiva con cebado
de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento es conocido y
comúnmente usado por los expertos en esta técnica (véase, Mullis,
patentes estadounidenses nº: 4.683.195; 4.683.202 y 4.800.159;
Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis,
Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Amheim [1985] "Enzymatic
Amplification of \beta-Globin Genomic Sequences
and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell
Anemia", Science 230: 1350-1354). La PCR
se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de
interés que está flanqueado por dos cebadores de oligonucleótido que
se hibridan a cadenas opuestas de la secuencia diana. Los cebadores
están orientados con los extremos 3' señalando uno al otro. Los
ciclos repetidos de la desnaturalización por calor del molde, el
apareamiento de los cebadores a sus secuencias complementarias y la
extensión de los cebadores apareados con una polimerasa de ADN
resultan en la amplificación del segmento definido por los extremos
5' de los cebadores PCR. Como el producto de la extensión de cada
cebador puede servir como un molde para el otro cebador, cada ciclo
duplica esencialmente la cantidad de fragmento de ADN producida en
el ciclo anterior. Esto da como resultado la acumulación exponencial
del fragmento diana específico, hasta varios millones de veces en
unas cuantas horas. Al usar una polimerasa de ADN termoestable tal
como la polimerasa Taq, que es aislada de la bacteria
termófila Thermus aquaticus, el procedimiento de
amplificación puede ser completamente automático. Otras enzimas que
pueden ser usadas son conocidas por los expertos en la técnica.
Las secuencias de ADN pueden ser diseñadas y
usadas como cebadores para la amplificación por PCR. Al realizarse
la amplificación por PCR, se puede tolerar un cierto grado de
apareamientos erróneos entre el cebador y el molde. Por lo tanto,
las mutaciones, las deleciones y las inserciones (especialmente, las
adiciones de nucleótidos al extremo 5') pueden ser producidas en un
cebador dado mediante procedimientos conocidos por cualquier experto
habitual en la técnica.
A continuación se presentan ejemplos que
ilustran los procedimientos para la práctica de la invención. Estos
ejemplos no deberían considerarse como restrictivos. Todos los
porcentajes están en peso y todas las proporciones de mezcla de
disolventes están en volumen, a no ser que se indique lo
contrario.
\newpage
Ejemplo
1
Se puede usar un subcultivo de un aislado de
B.t. para inocular el siguiente medio (medio con una peptona,
glucosa y sales, pH 7,2):
| Bacto Peptona | 7,5 g/l | |
| Glucosa | 1,0 g/l | |
| KH_{2}PO_{4} | 3,4 g/l | |
| K_{2}HPO_{4} | 4,35 g/l | |
| Solución salina | 5,0 ml/l | |
| Solución de CaCl_{2} | 5,0 ml/l | |
| Solución de sales (100 ml) | ||
| MgSO_{4} . 7H_{2}O | 2,46 g | |
| MnSO_{4} . H_{2}O | 0,04 g | |
| ZnSO_{4} . 7H_{2}O | 0,28 g | |
| FeSO_{4} . 7H_{2}O | 0,40 g | |
| Solución de CaCl_{2} (100 ml) | ||
| CaCl_{2}. 2H_{2}O | 3,66 g |
La solución salina y la solución de CaCl_{2}
son esterilizadas por filtración y añadidas al caldo curado en
autoclave y cocido en el momento de la inoculación. Los matraces son
incubados a 30ºC en un agitador giratorio a 200 rpm durante 64
h.
El procedimiento anterior puede ser ampliado
fácilmente a fermentadores de gran tamaño mediante procedimientos
conocidos en la técnica.
Las esporas y los cristales de B.t.,
obtenidos en la anterior fermentación, pueden ser aislados mediante
procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento usado
frecuentemente consiste en someter el caldo de fermentación
cosechado a técnicas de separación, p.ej., a una centrifugación.
Ejemplo
2
El ADN celular total fue preparado a partir de
las células de Bacillus thuringiensis (B.t.) PS52A1 y
PS86A1 cultivadas a 30ºC hasta una densidad óptica de 1,0 a 600 nm.
Las células fueron peletizadas por centrifugación y resuspendidas en
tampón de protoplastos (20 mg/ml de lisozima en sacarosa 0,3M,
Tris-Cl 25 mM [pH 8,0], EDTA 25 mM). Tras una
incubación a 37ºC durante 1 hora, los protoplastos fueron lisados
mediante dos ciclos de congelación y descongelación. Se añadieron
nueve volúmenes de una solución de NaCl 0,1M; SDS al 0,1%;
Tris-Cl 0,1M [pH 8,0] para completar la lisis. El
lisado aclarado fue extraído dos veces con fenol:cloroformo (1:1).
Los ácidos nucleicos fueron precipitados con dos volúmenes de etanol
y peletizados por centrifugación. La pella fue resuspendida en
tampón de TE (Tris-Cl 10 mM [pH 8,0], EDTA 1mM) y se
añadió Rnasa hasta una concentración final de 50 \mug/ml. Tras una
incubación a 37ºC durante 1 hora, la solución fue extraída una vez
cada una con fenol:cloroformo (1:1) y cloroformo saturado con TE. Se
hizo precipitar el ADN de la fase acuosa mediante la adición de 1/10
de volumen de NaOAc 3M y dos volúmenes de etanol. El ADN fue
peletizado por centrifugación, lavado con etanol al 70%, secado y
resuspendido en tampón de TE.
También se preparó ADN de plásmido a partir de
la cepa de B.t. PS86A1. Las células de B.t. fueron
cultivadas a 30ºC hasta una densidad óptica de 1,0 a 600 nm. Las
células fueron peletizadas por centrifugación y resuspendidas en
tampón de protoplastos (20 mg/ml lisozima en sacarosa 0,3 M,
Tris-Cl 25 mM [pH 8,0], EDTA 25 mM). Tras una
incubación sobre hielo durante 30 minutos, se añadieron diez
volúmenes de tampón de lisis (NaOH 0,085 M; SDS al 0,1% en tampón de
TE). El lisado fue mecido suavemente a temperatura ambiente durante
30 minutos. Se añadió medio volumen de KOAc 3M a la suspensión para
una incubación a 4ºC durante toda una noche. Se precipitaron los
ácidos nucleicos con un volumen de isopropanol y se peletizaron por
centrifugación, se lavaron con etanol al 70%, se secaron y se
resuspendieron en tampón de TE. La suspensión de ADN fue purificada
adicionalmente mediante la extracción una vez con fenol:cloroformo
(1:1). El ADN de la fase acuosa fue precipitado mediante la adición
de 1/10 de volumen de NaOAc 3M y un volumen de isopropanol. El ADN
fue peletizado mediante centrifugación, lavado con etanol al 70%,
secado y resuspendido en tampón de TE. Se añadió CsCl en un peso
igual al volumen de la solución de ADN, y se añadió bromuro de
etidio hasta una concentración final de 0,5 mg/ml. Se separó el ADN
de plásmido de los ácidos nucleicos extraños mediante una ultra
centrifugación de una noche de duración. La banda de plásmido
recuperada fue extraída cinco veces con un exceso de
agua-butanol saturado y sometida a diálisis frente a
tampón de TE. El ADN fue precipitado, peletizado, lavado, secado y
resuspendido en tampón de TE como se describe anteriormente. En base
a los datos de secuenciación de aminoácidos
N-terminales del polipéptido PS86A1 de 45 kDa, se
sintetizó el siguiente oligonucleótido "directo" de secuencia
(SEQ ID Nº: 1) para su uso en hibridaciones southern:
- 5'-TGGATAAAAAATCWATWACACATGAAGAATTTATWMGACA-3'
en la que W = A o T, y M = A o C,
según las convenciones estándar de la
IUPAC.
El ADN de plásmido y el ADN celular total de
PS86A1 fueron digeridos con endonucleasas de restricción
seleccionadas, sometidos a electroforesis sobre un gel de agarosa,
posteriormente, transferidos encima de una membrana de nailon e
inmovilizados mediante un "horneado" de la membrana a 80ºC. Se
realizó un análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción (RFLP) usando la sonda de oligonucleótido escrita
anteriormente. Las transferencias southern fueron hibridadas durante
toda una noche en 6 x SSPE, 5 x solución de Denhardt, 0,1 mg/ml de
ADN transportador monocatenario y SDS al 1% a 37ºC. Las
transferencias fueron entonces lavadas en 1 x SSPE, SDS al 0,1% a
37ºC, secadas al aire y luego expuestas a una película de rayos X.
La autorradiografía identificó una banda de Xba I de
aproximadamente 6,6 kbp tanto en las transferencias de ADN de
plásmido como en las de ADN celular total que fue teorizada para
contener todo o parte del gen de toxina PS86B1(b).
El fragmento de Xba I de aproximadamente
6,6 kbp fue clonado en pHTBlueII (un vector lanzadera de E.
coli/B. thuringiensis compuesto de pBluescript II SK
(Stratagene, La Jolla, CA) y el origen de replicación procedente de
un plásmido de B.t. residente, Lereclus et al., [1989]
FEMS Microbiology Letters 60: 211-218]). El mapeado
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar si
el fragmento contenía el gen de longitud completa fue realizado
usando el cebador de oligonucleótido directo descrito anteriormente
y los cebadores de vector. El cebador directo combinado con el
cebador de vector T7 resultó en la amplificación de un fragmento de
un tamaño aproximado de sólo 400 bp, en lugar del gen de
aproximadamente 1,0 kbp esperado para codificar una proteína de una
longitud de 45 kDa. Esto estableció que sólo aproximadamente un
tercio del gen de toxina PS86A1(b) fue clonado. Se realizó
otra verificación mediante una secuenciación de didesoxinucleótidos
(Sanger et al [1977] Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 74:
5463-5467) usando Sequenase (US Biochemical,
Cleveland, OH) sobre el constructo subgénico. El fragmento de PCR
fue radiomarcado posteriormente con ^{32}P y usado como una sonda
en hibridaciones estándar de transferencias southern y genetocas de
ADN celular total de PS86A1 y PS52A1.
Se construyó una genoteca a partir del ADN
celular total de PS86A1 parcialmente digerido con Sau3A I.
Los digestos de restricción parcial fueron fraccionados mediante
electroforesis sobre gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de 9,3 a
23 kbp de tamaño fueron extirpados del gel, electroeluidos de la
porción de gel, purificados sobre una columna de intercambio iónico
Elutip-D (Schleicher y Schuell, Keene, NH) y
recuperados mediante precipitación con etanol. Los insertos de
Sau3A I fueron ligados en LambdaGem-11
digerido por BamHI (Promega, Madison, WI). El fago
recombinante fue empaquetado y colocado sobre una placa de células
KW251 de E. coli (Promega, Madison, WI). Las placas fueron
rastreadas mediante la transferencia del ADN de fago recombinante a
filtros y la hibridación con la sonda PCR anteriormente descrita. La
hibridación fue llevada a cabo durante toda una noche a 37ºC en una
solución constituida por 6 x SSPE, 5 X solución de Denhardt, 0,1
mg/ml de ADN transportador monocatenario y SDS al 0,1%. Los filtros
fueron posteriormente lavados en 1 x SSPE y SDS al 1% a 37ºC,
secados al aire y luego expuestos a una película de rayos X. El fago
hibridante fue purificado en placa y usado para infectar cultivos
líquidos de células KW251 de E. coli para aislar el ADN
mediante procedimientos estándar (Maniatis et al. [1982]
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). La transferencia southern del
ADN de fago hibridante purificado en placa digerido con
endonucleasas de restricción seleccionadas usando la sonda
amplificada por PCR y las condiciones de lavado descritas
anteriormente revelaron un fragmento de EcoR V + Sal I
de aproximadamente 2,3 kbp que se creía que contenía el gen
PS86A1(b).
Para subclonar el gen PS86A1(b) que
codifica la toxina de aproximadamente 45 kDa, se digirieron
cantidades preparativas de ADN de fago con EcoRV y
SalI. La banda de aproximadamente 2,3 kbp fue ligada en
pHTBlueII digerido por SmaI + SalI. La mezcla de
ligación fue usada para transformar células NM522 de E. Coli
competentes congeladas (ATCC 47000). Los transformantes de
\beta-galactosidasa-negativa
fueron rastreados mediante la digestión de restricción de ADN
miniprep de plásmido de lisado alcalino. El constructo de plásmido
deseado, pMYC2344, contiene el gen de toxina PS86A1(b). El
pMYC2344 fue introducido en el hospedador de B.t.
acristalífero (Cry-), CryB (A. Aronson, Purdue University, West
Lafayette, IN) por electroporación. Se demostró la expresión de la
toxina mediante la visualización de la formación de cristales bajo
un examen microscópico, y un análisis de SDS-PAGE.
El constructo génico pMYC2344 en B.t. es denominado
MR509.
En la SEQ ID Nº:2 se muestra una secuencia del
gen 86A1(b). En la SEQ ID Nº: 3, se muestra una secuencia de
aminoácidos deducida para la toxina 86A1(b).
Las sondas de PS86A1(b), la hibridación y
las condiciones de lavado también fueron usadas para clonar un gen
relacionado, PS52A1(b), de la cepa de Bacillus
thuringiensis PS52A1. Se construyó una genoteca digiriendo
parcialmente el ADN celular total de PS52A1 con Sau3A 1. Los
digestos de restricción parcial fueron fraccionados mediante
electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN de un tamaño
de 9,3 a 23 kbp fueron extirpados del gel, electroeluidos de la
porción de gel, purificados sobre una columna de intercambio iónico
Elutip-D y recuperados mediante una precipitación
con etanol. Los insertos de Sau3A I fueron ligados en
LambdaGem-11 digerido con BamHI. El fago
recombinante fue empaquetado y colocado en una placa sobre células
KW251 de E. Coli. Las placas fueron rastreadas por
hibridación con la sonda PCR anteriormente descrita. El fabo
hibridante fue purificado en placa y usado para infectar cultivos
líquidos de células KW251 de E. coli para el aislamiento del
ADN mediante procedimientos estándar. La transferencia southern del
ADN de fago hibridante purificado en placa digerido con
endonucleasas de restricción seleccionadas usando la sonda PCR
reveló un fragmento de EcoRV + SalI de aproximadamente
2,3 kbp que se creía que contenía el gen PS51A1(b).
Para subclonar el gen PS52A1(b) que
codifica la toxina de aproximadamente 45 kDa, se digirieron
cantidades preparativas de ADN de fago con EcoRV y
SalI. La banda de aproximadamente 2,3 kbp fue ligada en
pHTBlueII digerido por SmaI + SalI. La mezcla de
ligación fue usada para transformar células NM522 de E. Coli
competentes congeladas. Los transformantes de
\beta-galactosidasa-negativa
fueron rastreados mediante digestión de restricción de ADN miniprep
de plásmido de lisado alcalino. El constructo de plásmido deseado,
pMYC2349, contiene el gen de toxina 52A1(b) que es nuevo en
comparación con otros genes de toxina que contienen proteínas
insecticidas. El pMYC2349 fue introducido en el hospedador de
B.t. acristalífero (Cry-), CryB, por electroporación. Se
demostró la expresión de la toxina mediante la visualización de la
formación de cristales bajo un examen microscópico y un análisis de
SDS-PAGE. El constructo génico pMYC2349 en
B.t. es denominado MR510.
En la SEQ ID Nº:4 se muestra una secuencia del
gen 52A1(b). En la SEQ ID Nº: 5, se muestra una secuencia de
aminoácidos deducida para la toxina 52A1(b).
Ejemplo
3
Se recogieron Phyllotreta cruciferae
salvajes y se mantuvieron en cámaras criadero a 25ºC, con un
foto-período de 16 h de luz:6 horas de oscuridad. Se
plantaron cinco semillas de canola (Hyola 401) en tierra de maceta
estándar. Se extirparon los cotiledones de los plantones y se
sumergieron en suspensiones de MR509 de B.t. (100 \mug de
toxina/ml) hechas con Bond al 0,1% (el Bond sirvió como agente
adhesivo). Se dejó secar un único cotiledón tratado y se colocó en
un pozo de plástico (bandejas NuTrend) que contenía aproximadamente
1 ml de gel agar al 2%. El gel agar sirvió como una fuente de
humedad para aumentar la longevidad de los cotiledones extirpados.
Se colocó un escarabajo adulto en cada pozo de ensayo. Los ensayos
fueron almacenados a temperatura ambiente. Se midió la mortalidad y
el daño de la planta a los 4 y 7 días posteriores al tratamiento. El
daño del cotiledón fue evaluado sobre una escala de 1 a 10 puntos
con la puntuación de 10 correspondiente a una destrucción completa
del tejido de la planta.
Varios tratamientos mostraron un daño reducido
de la planta en relación con los controles de CryB (una cepa de
B.t. sin cristales) y los controles sin tratar. Se determinó
que una proteína de aproximadamente 45 kda de MR509 era muy activa
frente a las plagas de Phyllotreta cruciferae analizadas:
esta toxina es denominada como el gen 86A1(b).
Ejemplo
4
MR509 y MR510 fueron evaluados en los siguientes
ensayos. Se usó CryB como un control negativo. Otros controles
negativos fueron hojas sin tratar y la solución de Bond que fue
añadida como un adhesivo-extendedor.
Se extirparon cotiledones recién brotados y
fueron sumergidos en las suspensiones de ensayo. Tras secarlos, los
cotiledones fueron infectados con 2 escarabajos pulga adultos. Se
evaluó el daño de las hojas 4 días después de la infección. El daño
de las hojas fue evaluado sobre una escala del 1 al 10, siendo el 0
correspondiente a ningún daño.
Los clones MR509 y MR510 proporcionaron
indicaciones claras de la dependencia en la dosis de la protección
de las hojas. Esta actividad resultó particularmente evidente para
MR510.
Ejemplo
5
Mediante el uso de las técnicas conocidas por
los expertos en la técnica, algunas de las cuales son tratadas
anteriormente, es posible truncar las proteínas nativas. Estas
toxinas truncadas pueden ser examinadas en cuanto a su actividad por
cualquier experto en la técnica, usando la guía proporcionada en la
presente memoria junto con lo que se conoce en la técnica. Las
proteínas truncadas preferidas se muestran en las SEQ ID Nº
8-19. La presente invención también incluye
polinucleótidos que codifican las proteínas truncadas
ejemplificadas, así como otros truncamientos, fragmentos y variantes
de las toxinas ejemplificadas, siempre y cuando los truncamientos,
los fragmentos o las variantes conserven la actividad pesticida,
preferiblemente, frente a coleópteros, y lo más preferible, frente a
escarabajos pulga.
Las toxinas truncadas según la presente
invención no sólo incluyen toxinas que tienen deleciones en las
porciones N-terminales o
C-terminales como se ejemplifica en la presente
memoria, sino también las toxinas que tienen tanto porciones
N-terminales como C-terminales de la
proteína nativa. Los ejemplos de tales truncamientos incluirían
proteínas resultantes de usar cualquier deleción
N-terminal ejemplificada en la presente memoria
junto con cualquiera de las deleciones C-terminales
ejemplificadas en la presente memoria.
Ejemplo
6
Un anticuerpo policlonal denominado R#56 fue
desarrollado y purificado para a la toxina nativa 52A1(b).
Este anticuerpo reconoce la toxina 86A1(b) nativa. Este
anticuerpo puede ser usado en rastreos de transferencia
(transferencias de puntos, ranuras y/o western) para determinar si
hay presentes homólogos de 52A1(b) y 86A1(b) en otras
cepas de Bacillus.
Por tanto, en otra realización de la presente
invención, se pueden caracterizar y/o identificar toxinas pesticidas
adicionales según su nivel de reactividad con anticuerpos de las
toxinas pesticidas ejemplificadas en la presente memoria. Los
anticuerpos pueden ser desarrollados contra las toxinas
específicamente ejemplificadas de la presente invención. Otras
toxinas pertenecientes al alcance de esta invención pueden se
entonces identificadas y/o caracterizadas según su reactividad con
los anticuerpos. En una realización preferida, los anticuerpos son
anticuerpos policlonales. En esta realización, las toxinas con la
mayor similitud a las toxinas de 86A1(b) y 52A1(b)
tendrían la mayor reactividad con los anticuerpos policlonales. Las
toxinas con la mayor diversidad reaccionan con los anticuerpos
policlonales, pero en un menor grado.
Ejemplo
7
Un aspecto de la presente invención es la
transformación de plantas con genes que codifican la toxina
insecticida de la presente invención. Las plantas transformadas son
resistentes al ataque de la plaga diana. Los genes preferidos serán
mantenidos de forma estable y expresados a niveles altos en la
planta transformada y/o las células de la planta. En la SEQ ID Nº:
6, se proporciona un ejemplo de un gen optimizado de planta
sintético preferido que es un gen optimizado de dicotiledónea
derivado de MR510. La proteína codificada por este gen se
proporciona en la SEQ ID Nº: 7 (las abreviaturas de los aminoácidos
son conforme a las convenciones estándar de la IUPAC).
Los genes que codifican las toxinas pesticidas,
como se revelan en la presente memoria, pueden ser insertados en
células vegetales usando una variedad de técnicas que son conocidas
en la técnica. Por ejemplo, hay disponible un gran número de
vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en
E. Coli y un marcador que permite la selección de las células
transformadas para la preparación de la inserción de genes foráneos
en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo,
pBR3212, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, etc. Por
consiguiente, la secuencia que codifica la toxina de Bacillus
puede ser insertada en el vector en un sitio de restricción
adecuado. El plásmido resultante es usado para la transformación en
E. Coli. Las células de E. Coli son cultivadas en un
medio de nutrientes adecuado, luego cosechadas y lisadas. El
plásmido es recuperado. El análisis de secuencias, el análisis de
restricción, la electroforesis y otros procedimientos de
bioquímica-biología molecular son generalmente
llevados a cabo como los procedimientos de análisis. Tras cada
manipulación, la secuencia de ADN usada puede ser escincida y unida
a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede
ser clonada en el mismo u otros plásmidos. En función del
procedimiento de inserción de los genes deseados en la planta,
pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se
usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal,
entonces se tiene que unir al menos el borde derecho, pero
habitualmente, el borde derecho e izquierdo del
ADN-T de plásmido Ti o Ri, a medida que se va
injertando la región flanqueante de los genes.
El uso de ADN-T para la
transformación de las células vegetales ha sido intensamente
investigado y suficientemente descrito en EP 120 516: Hoekema
(1985): en: "The Binary Plant Vector System",
Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam,
Capítulo 5: Fraley et al., Crit. Rev. Plant
Sci. 4:1-46; y An et al. (1985) EMBO
J. 4:277-287.
Una vez que el ADN insertado ha sido integrado
en el genoma, es relativamente estable. Normalmente, contiene un
marcador de selección que confiere a las células de la planta
transformada una resistencia frente a un biocida, un herbicida tal
como glifosato o BASTA, o un antibiótico, tal como kanamicina, G418,
bleomicina, higromicina o cloranfenicol, entre otros. El marcador
empleado individualmente permitiría, por consiguiente, la selección
de las células transformadas en lugar de las células que no
contienen el ADN insertado.
Hay un gran número de técnicas disponibles para
insertar ADN en una célula hospedadora vegetal. Esas técnicas
incluyen la transformación con ADN-T usando
Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes como agente de transformación, la fusión, la
microinyección, la biolística (bombardeo de micropartículas), la
reabsorción de ADN mediada por PEG o la electroporación, así como
otros posibles procedimientos. Si se usan agrobacterias para la
transformación, el ADN que se va a insertar tiene que ser clonado en
plásmidos especiales, concretamente, bien en un vector intermedio o
en un vector binario. Los vectores intermedios pueden ser integrados
en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga perteneciente
a las secuencias que son homólogas a las secuencias del
ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la
región vir necesaria para la transferencia del
ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse
en agrobacterias. El vector intermedio puede ser transferido a
Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar
(conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar tanto en
E. Coli como en agrobacterias. Comprenden un gen marcador de
selección y un ligador o un poliligador que está enmarcado por las
regiones fronterizas derecha e izquierda del ADN-T.
Pueden ser transformados directamente en agrobacterias (Holsters
et al., [1978] Mol. Gen. Genet. 163:
181-187). La agrobacteria usada como la célula
hospedadora contiene un plásmido que transporta la región
vir. La región vir es necesaria para la transferencia
del ADN-T a la célula de la planta. Puede contener
más ADN-T. La bacteria así transformada se usa para
la transformación de células vegetales. Los explantos vegetales
pueden ser ventajosamente cultivados con Agrobacterium
tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la
transferencia del ADN a la célula vegetal. Es posible entonces
regenerar plantas enteras a partir del material vegetal infectado
(por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero
además, protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio
adecuado, que puede contener antibióticos, herbicidas o biocidas
para la selección. Las plantas así obtenidas pueden ser entonces
analizadas en cuanto a la presencia del ADN insertado. No se
plantean exigencias especiales en cuanto a los plásmidos en el caso
de la inyección y la electroporación. Es posible usar plásmidos
habituales, tales como, por ejemplo, derivados de pUC. En la
transformación biolística, se puede emplear ADN de plásmido o ADN
lineal.
Las células transformadas son regeneradas en
plantas morfológicamente normales de una manera habitual. Si en la
transformación participa una célula de la línea germinal, entonces
el ADN insertado y los correspondientes caracteres fenotípicos serán
transmitidos a las plantas de la progenie. Tales plantas pueden ser
cultivadas de una manera normal o cruzadas con plantas que tengan
los mismos factores hereditarios transformados u otros factores
hereditarios. Las plantas de la progenie resultantes tienen las
correspondientes propiedades fenotípicas según las reglas de la
segregación genética.
En una realización preferida de la presente
invención, las plantas serán transformadas con genes en los que el
uso de codón ha sido optimizado para plantas. Véase, por ejemplo, la
patente estadounidense nº: 5.380.831. También se usará
ventajosamente ADN que codifique una toxina truncada. La toxina
truncada comúnmente codificará del aproximadamente 55% al
aproximadamente 80% de la toxina de longitud completa. Los
procedimientos para crear genes de Bacillus sintéticos para
su uso en plantas son conocidos en la técnica.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INFORMACIÓN DEL SOLICITANTE:
| Nombre(s) del solicitante: | MYCOGEN CORPORATION | |
| Calle: | 5501 Oberlin Drive | |
| Ciudad: | San Diego | |
| Estado/Provincia: | California | |
| País: | EE.UU. | |
| Código postal: | 92121 | |
| Número de teléfono: (619) 453-8030 Número de fax: (619) 453-6991 | ||
| Número de télex: |
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Toxinas y genes de Bacillus thuringiensis para controlar las plagas de coleópteros
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Saliwanchik, Lloyd & Saliwanchik
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2421 NW 41^{st} Street, Suite A-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Gainesville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: FL
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 32606
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn versión 1.0., versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 09/076.193
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 de mayo de 1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sanders, Jay M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 39.355
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: MA-716C1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (352) 375-8100
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (352) 372-5800
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGATAAAAA ATCWATWACA CATGAAGAAT TTATWMGACA
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1089 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 362 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1089 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 362 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1086 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 362 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 354 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 343 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 337 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 322 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 311 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 289 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 280 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 288 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 332 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 342 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID Nº: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 359 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Un polinucleótido aislado que codifica una
proteína pesticida, manteniendo el polinucleótido o su
complementario la hibridación con una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº 6, tras un
lavado acuoso a 0,2 x o 1 x SSPE, 65ºC.
2. Un polinucleótido según la reivindicación 1,
que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID
Nº 3, SEQ ID Nº 5 y SEQ ID Nº 7.
3. Un polinucleótido según la reivindicación 2,
que comprende la SEQ ID Nº 2, la SEQ ID Nº 4 o la SEQ ID Nº 6.
4. Una proteína pesticida aislada que es
codificada por una secuencia de nucleótidos, y esa secuencia o su
complementaria mantiene la hibridación con una secuencia de
nucleótidos seleccionada entre SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 4 y SEQ ID Nº
6, tras un lavado a 0,2 x o 1 x SSPE, 65ºC.
5. Una proteína según la reivindicación 4, que
comprende la SEQ ID Nº 3, la SEQ ID Nº 5 o la SEQ ID Nº 7.
6. Un hospedador no humano recombinante que
comprende un polinucleótido según lo definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
7. Un hospedador según la reivindicación 6, que
es una planta o una célula de planta.
8. Un procedimiento para controlar plagas en
plantas, que comprende poner en contacto las plagas con una proteína
según lo definido en la reivindicación 4 o la reivindicación 5.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que las plagas son de insectos coleópteros.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que las plagas pertenecen al género Phyllotreta.
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