ES2269084T3 - Procedimiento de purificacion de 1,3 propanodiol a partir de un medio de fermentacion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de purificación de 1, 3 propanodiol a partir de un medio de fermentación de un microorganismo productor de 1, 3 propanodiol, que comprende 1, 3 propanodiol y coproductos de la fermentación constituidos como mínimo por glicerol, caracterizado porque se procederá a: a) separar el microorganismo productor de 1, 3 propanodiol de los otros componentes del medio de fermentación de manera que se obtiene una solución acuosa clarificada, b) pasar dicha solución acuosa clarificada sobre una resina de intercambio de cationes, de manera que se obtenga como mínimo una fracción que comprende 1, 3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación, c) recuperar el 1, 3 propanodiol.
Description
Procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol
a partir de un medio de fermentación.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol a partir de un
medio de fermentación, que comprende 1,3 propanodiol y coproductos
de la fermentación.
La presente invención se refiere, de manera más
específica, a un procedimiento de purificación de 1,3 propanodiol
por cromatografía sobre resina catiónica de una solución acuosa
clarificada procedente de dicho medio de fermentación, para obtener
como mínimo una fracción que comprende 1,3 propanodiol purificado, y
como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la
fermentación.
En el sentido de la presente invención, se
comprende por "solución acuosa clarificada" la solución acuosa
obtenida después de la eliminación de los microorganismos
productores del 1,3 propanodiol del medio de fermentación.
Se comprende igualmente por "coproductos de la
fermentación" los productos que resultan de un metabolismo
secundario tales como, en especial, el glicerol, o el sustrato no
convertido tal como, por ejemplo, glucosa o glicerol, o incluso
residuos diversos procedentes de los elementos nutritivos del medio
de fermentación o que proceden del metabolismo bacteriano, tales
como ácido acético, etanol, o 2.3 butanodiol.
La presente invención se refiere, más
particularmente todavía a un procedimiento de purificación de 1,3
propanodiol por cromatografía, que utiliza una resina catiónica
cuyo catión se escoge ventajosamente entre el grupo constituido por
lantano, plomo, cinc, hierro y aluminio.
La presente invención se refiere finalmente a un
tratamiento, por microorganismos que convierten de manera
específica el glicerol en 1,3 propanodiol, de dicha solución acuosa
clarificada y/o fracciones que comprenden, respectivamente,
glicerol y/o una mezcla de glicerol y de 1,3 propanodiol, obtenidos
por la separación cromatográfica.
Los métodos de purificación del 1,3 propanodiol
a partir del medio de fermentación, conocidos en general en el
estado de la técnica, se basan principalmente en la sucesión de
etapas que consisten en extraer el 1,3 propanodiol de dicho medio
de fermentación mediante disolventes orgánicos y/o efectuar su
destilación.
Las técnicas de destilación convencionales
habitualmente utilizadas en estos procedimientos de purificación
requieren una aportación de energía importante que repercute en el
coste del producto final purificado de este modo. En efecto, la
temperatura de destilación del 1,3 propanodiol es de 214ºC.
MALINOWSKI (por ejemplo, en su artículo
Biotechnology Techniques, 1999, 13, páginas
127-130) ha propuesto un procedimiento de
extracción líquido-líquido por disolventes orgánicos
del 1,3 propanodiol, a partir de soluciones acuosas diluidas que lo
contienen.
No obstante, este procedimiento de purificación
requiere la manipulación de grandes cantidades de disolventes de
tipo pentanol (hasta nonanol), o hexanal (hasta decanal) y presenta
sobre todo una reducida eficacia de extracción y de separación del
1,3 propanodiol.
MALINOWSKI reconoce, por otra parte, la
necesidad de recurrir a un método alternativo de mayor rendimiento,
ya que el 1,3 propanodiol presenta un carácter demasiado
hidrofílico.
Se ha propuesto igualmente como alternativa por
BROEKHUIS y otros en Ind. Eng. Chim. Res., 1994, 33, páginas
3230-3237, recurrir a compuestos químicos de tipo
formaldehído o acetaldehído para formar un derivado dioxolano del
1,3 propanodiol, lo que permite entonces su extracción por un
disolvente.
No obstante, si bien el procedimiento consume
menos energía, el coste de los componentes químicos utilizados hace
el procedimiento de extracción y de purificación impracticable,
puesto que es necesario además regenerar el 1,3 propanodiol a
partir de su derivado dioxolano.
De la misma manera, los procedimientos de
formación de complejo del 1,3 propanodiol con organoboratos
propuestos por BROEKHUIS y otros en Ind. Eng. Chim. Res.,
1996, 35, paginas 1206-1214, requieren importantes
medios de regeneración del 1,3 propanodiol, lo que hace sus
procedimientos de extracción no viables económicamente.
De todo lo anterior, resulta por lo tanto que
existe una necesidad no satisfecha de disponer de un procedimiento
simple de realizar, que permite purificar el 1,3 propanodiol a
partir del medio de fermentación de un microorganismo productor de
1,3. propanodiol.
Con la preocupación de desarrollar un
procedimiento que permita responder mejor que los existentes en las
limitaciones de la práctica, la sociedad solicitante ha comprobado
que una purificación eficaz de 1,3 propanodiol a partir de dicho
medio de fermentación se podía realizar utilizando un medio que
consiste en realizar una separación cromatográfica específica de
componentes del medio de fermentación.
Un procedimiento de separación de 1,3
propanodiol por cromatografía a partir de un medio de fermentación a
sido propuesto por GÜNZEL y otros (por ejemplo, en DECHEMA
BIOTECHNOLOGY Conferences, 1990, 4 pt. B., páginas
713-716), que consiste en utilizar técnicas de
adsorción, y en especial una adsorción sobre zeolitas hidrofóbicas
tales como silicato 1 o zeolitas NaY desaluminadas, o incluso carbón
activado.
No obstante, las capacidades de adsorción del
1,3 propanodiol sobre estos soportes son muy mediocres, y además se
lamenta la fijación de ciertos coproductos de la fermentación.
El procedimiento de purificación del 1,3
propanodiol a partir de un medio de fermentación de un
microorganismo productor de 1,3 propanodiol, que comprende 1,3
propanodiol y coproductos de fermentación constituidos por lo menos
de glicerol, de acuerdo con la invención, se caracteriza por lo
tanto por proceder a:
- a)
- separar el microorganismo productor de 1,3 propanodiol de los otros componentes del medio de fermentación de manera que se obtiene una solución acuosa clarificada,
- b)
- pasar dicha solución acuosa clarificada sobre una resina de intercambio catiónico, de manera que se obtiene como mínimo una fracción que comprende el 1,3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación,
- c)
- recuperar el 1,3 propanodiol.
El microorganismo productor del 1,3 propanodiol
se escoge dentro del grupo de los microorganismos recombinantes
capaces, por ejemplo, de producir 1,3 propanodiol a partir de
glucosa, es decir, microorganismos recombinantes del tipo E.
Coli o S. cerevisiae tales como se describen en las
solicitudes de Patente WO 96/35796 y WO 98/21341.
La solicitante ha observado que estos
microorganismos producen mayoritariamente, por una parte, 1,3
propanodiol y, por otra, especialmente glicerol como coproducto de
la fermentación. Se encuentra glucosa igualmente de forma eventual
en el medio de fermentación, que no se ha consumido por completo, y
un poco de ácido acético.
La primera etapa del procedimiento según la
presente invención consiste en separar los microorganismos
productores de 1,3 propanodiol de los otros componentes del medio
de fermentación, de forma que se obtiene una solución acuosa
clarificada.
Esta separación se realiza por cualquier técnica
conocida por el técnico en la materia y puede consistir en
microfiltrado, centrifugación o precipitación de dichos
microorganismos por agentes floculantes. Estas técnicas pueden ser
igualmente combinadas.
En el procedimiento según la invención, es
preferible una técnica de microfiltrado, utilizando una membrana de
microfiltrado cuya porosidad está adaptada a las dimensiones de los
microorganismos considerados, por ejemplo, membranas TECHSEP de 0,1
\mum de porosidad para microorganismos productores de 1,3
propanodiol del tipo E. coli recombinante.
Se escoge preferentemente hacer pasar la
solución acuosa clarificada obtenida de este modo por una columna
de carbón activado y desmineralizarla sobre una resina catiónica
fuerte y una resina aniónica débilmente básica, o sobre una resina
catiónica fuerte y una resina aniónica fuertemente básica, por
ejemplo, de tipo acrílico, utilizando las técnicas conocidas de
manera general por el técnico en la materia.
Estas etapas permiten eliminar los desperdicios
celulares y las proteínas resultantes de la posible lisis de los
microorganismos productores de 1,3 propanodiol, y el desalado
conduce a la eliminación de la carga mineral del medio de
fermentación.
Se puede escoger, a continuación, tratar dicha
solución acuosa clarificada por un microorganismo que convierte el
glicerol residual en 1,3 propanodiol.
Este microorganismo es escogido entonces entre
el grupo constituido por microorganismos de los tipos Klebsiella,
Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Ilyobacter, Pelobacter
o Enterobacter y es preferentemente un Citrobacter o
un Clostridium.
En una forma de realización más preferente del
procedimiento según la invención, se escoge la utilización de este
microorganismo capaz de convertir el glicerol en 1,3 propanodiol en
forma libre o inmovilizada, y preferentemente en forma
inmovilizada.
Se puede realizar esta inmovilización con ayuda
de alginato cálcico, tal como se describe, por ejemplo, en la
Patente USA 5.164.309 para microorganismos del tipo
Citrobacter, o utilizar la tecnología desarrollada por la
sociedad GENIALAB® BIO TECHNOLOGIE para microorganismos del género
Clostridium (comunicación al Congreso ECB9 de Bruselas,
Julio 1999, en la sesión Bioencapsulation processes).
Esta etapa de conversión del glicerol residual
en 1,3 propanodiol permite, con este hecho, aumentar la
concentración de 1,3 propanodiol en la solución clarificada, y por
lo tanto disminuir el componente de glicerol de los constituyentes
de dicha solución acuosa clarificada, lo que facilita la separación
cromatográfica propiamente dicha.
La segunda etapa del procedimiento según la
invención consiste en hacer pasar la solución acuosa clarificada
sobre una resina de intercambio catiónico.
De manera ventajosa, el catión se escoge dentro
del grupo constituido por lantano, plomo, hierro, zinc y
aluminio.
Esta etapa es efectuada de forma que se obtenga
como mínimo una fracción que comprende 1,3 propanodiol purificado,
y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la
fermentación.
La forma de realización de esta separación
cromatográfica es indiferente. Es posible escoger una separación
cromatográfica discontinua, o un procedimiento continuo de
separación cromatográfica.
Esta etapa puede ser conducida ventajosamente
sobre una resina de intercambio catiónico, fuertemente ácida, del
tipo de poliestireno ácido sulfónico, reticulada como mínimo al 4%,
preferentemente como mínimo 7%, de divinilbenceno.
La elución será realizada en agua, lo que
constituye una característica importante del procedimiento de
purificación de 1,3 propanodiol según la invención, puesto que
ningún disolvente orgánico puede ser utilizado para ello. El
procedimiento es por lo tanto apropiado y satisface las normas de
protección ambientales.
En una primera forma de realización del
procedimiento según la invención, se prefiere cargar la resina con
un catión escogido entre el grupo constituido por lantano, plomo y
hierro.
La sociedad solicitante ha comprobado que la
elección de esos cationes permite asegurar una separación eficaz de
los componentes de dicha solución clarificada, tal como se indicará
a continuación a modo de ejemplo, con una elución de la fracción
que comprende exclusivamente el 1,3 propanodiol en las primeras
fracciones de la cromatografía.
En un segundo modo de realización del
procedimiento según la invención, se escoge un catión en el grupo
constituido por el zinc y el aluminio.
La sociedad solicitante ha comprobado que esta
separación cromatográfica conduce a la eliminación de todos los
coproductos de fermentación del 1,3 propanodiol en las primeras
fracciones de elución, lo que autoriza la salida de dicho 1,3
propanodiol en las últimas fracciones cromatográficas.
La sociedad solicitante recomienda, en esta
etapa de realización del procedimiento según la invención, reunir
las fracciones eventuales que contienen glicerol como coproducto de
la fermentación, y someterlas a un tratamiento por los
microorganismos capaces de convertir el glicerol en 1,3 propanodiol,
de manera que se obtiene una fracción enriquecida en 1,3
propanodiol.
A continuación, es posible reunir esta fracción
enriquecida de este modo en 1,3 propanodiol con las fracciones de
1,3 propanodiol purificado obtenidas a nivel de la etapa de
separación cromatográfica que se han mencionado anteriormente.
No obstante, es preferible reinyectar dicha
fracción enriquecida en 1,3 propanodiol más arriba de la separación
cromatográfica para completar la purificación, en caso
necesario.
La última etapa del procedimiento según la
invención consiste en reunir todas las fracciones cromatográficas
que contienen 1,3 propanodiol.
Otras características y ventajas de la invención
aparecerán en la lectura de los ejemplos siguientes, que, no
obstante, solamente tienen carácter ilustrativo y no limitativo.
Ejemplo
1
Un medio de fermentación que comprende 90,5 g/l
de 1,3 propanodiol, 28,7 g/l de glicerol, obtenido por fermentación
de E. coli recombinante que produce 1,3 propanodiol a partir
de glucosa en condiciones tales como las que se describen en la
solicitud de Patente WO 96/35796, es sometido a microfiltrado sobre
membrana TECHSEP de porosidad 0,1 \mum a efectos de eliminar las
células.
La fermentación será interrumpida, en este caso
cuando la totalidad de la glucosa introducida ha sido consumida por
el microorganismo.
La solución acuosa clarificada, obtenida de este
modo encierra algunos desperdicios celulares y una carga iónica de
70 meq/l.
Se ha procedido al paso sobre columna de carbón
activado para eliminar las proteínas, seguido de una etapa de
desmineralización para eliminar los iones residuales del medio de
fermentación que todavía se encuentran presentes, y ello, por paso
sobre resina catiónica fuerte y después sobre resina débilmente
básica de tipo acrílico.
La solución clarificada desproteinizada de este
modo y desalada presenta un contenido de materia seca de 12% en
peso.
Esta solución es sometida a continuación a una
separación cromatográfica sobre resina de intercambio de cationes
PCR 732 PUROLITE constituida por polestileno ácido sulfónico
reticulado por 7% de divinilbenceno, en el que el catión es
lantano.
Siendo esta resina inicialmente una resina en
forma H, se procede a la substitución del catión por percolación de
la resina con una solución de cloruro de lantano a 200 g/l, hasta
que más del 98% de la capacidad de la columna se encuentre en forma
de lantano, lo que se determina por el seguimiento del pH de la
solución en la salida de la columna.
350 ml de esta resina se colocan entonces en una
columna de 2 m de altura, por una sección de 15 mm.
Se introducen 2,3 ml de la solución clarificada
desproteinizada y desalada en dicha columna. La elución se realiza
con agua introducida con un caudal de 3 ml/min.
La temperatura del sistema se fija a 65ºC.
La detección de los componentes de las
fracciones recogidas en la salida de la columna se realiza por
utilización de un detector refractométrico R401 comercializado por
la sociedad WATERS, relacionado con una tabla de trazado y su
análisis se realiza por HPLC en columna BCX6 en forma de calcio a 6%
de DVB comercializado por la sociedad BIORAD, acoplado a un
detector refractométrico.
Se obtiene una primera fracción de 39 ml que
contiene el 1,3 propanodiol a una concentración de 2,0 g/l (es
decir, un rendimiento de 31,9%, porcentaje expresado con relación a
la cantidad en peso de los compuestos eluídos por dicha
columna).
Las otras dos fracciones contienen
respectivamente:
- -
- 51 ml de una mezcla de glicerol a 0,8 g/l y de 1,3 propanodiol a 2,7 g/l (es decir un rendimiento de 57,9%).
- -
- 50 ml de glicerol a 0,5 g/l (es decir un rendimiento de 8,5%).
Estas dos fracciones han sido recogidas, y a
continuación sometidas a un tratamiento mediante Clostridium
butyricum NRRL B-1024 inmovilizados en forma
LENTIKATS®, facilitado por la sociedad GENIALAB TECHNOLOGIE.
La conversión total del glicerol ha sido
conducida, permitiendo reunir todas las fracciones que contienen
1,3 propanodiol en una solución de alta pureza.
Ejemplo
2
La separación cromatográfica ha sido realizada
en las mismas condiciones operativas que en el ejemplo 1, pero con
una resina catiónica cuyo catión es el plomo.
Se obtiene una primera fracción de 48 ml que
contiene el 1,3 propanodiol con una concentración de 3,0 g/l (es
decir, un rendimiento del 47%, porcentaje expresado con relación a
la cantidad en peso de los compuestos eluídos de dicha
columna).
Las otras dos fracciones contienen,
respectivamente:
- -
- 54 ml de una mezcla de glicerol a 0,7 g/l y de 1,3 propanodiol a 1,4 g/l (es decir un rendimiento de 37,5%),
- -
- 70 ml de glicerol a 0,5 g/l (es decir un rendimiento del 11%).
La conversión total de glicerol ha sido
conducida por los Clostridium butyricum NRRL
B-1024 inmovilizados en forma LENTIKATS®,
permitiendo reunir todas las fracciones que contienen 1,3
propanodiol en una solución de alta pureza.
Claims (8)
1. Procedimiento de purificación de 1,3
propanodiol a partir de un medio de fermentación de un
microorganismo productor de 1,3 propanodiol, que comprende 1,3
propanodiol y coproductos de la fermentación constituidos como
mínimo por glicerol, caracterizado porque se procederá a:
- a)
- separar el microorganismo productor de 1,3 propanodiol de los otros componentes del medio de fermentación de manera que se obtiene una solución acuosa clarificada,
- b)
- pasar dicha solución acuosa clarificada sobre una resina de intercambio de cationes, de manera que se obtenga como mínimo una fracción que comprende 1,3 propanodiol purificado, y como mínimo una fracción que comprende los coproductos de la fermentación,
- c)
- recuperar el 1,3 propanodiol.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque el catión de la resina de intercambio de
cationes es escogido entre el grupo constituido por lantano, plomo,
hierro, zinc y aluminio.
3. Procedimiento según una u otra de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la solución
acuosa clarificada es pasada sobre una columna de carbón activado y
es desmineralizada por una resina catiónica fuerte y una resina
aniónica débilmente básica, o sobre una resina catiónica fuerte y
una resina aniónica fuertemente básica.
4. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución
acuosa clarificada es tratada con un microorganismo que convierte
el glicerol en 1,3 propanodiol.
5. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las fracciones
de cromatografía de la etapa b), que comprenden especialmente
glicerol como coproducto de la fermentación, son tratadas con un
microorganismo que convierte el glicerol en 1,3 propanodiol.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5,
caracterizado porque las fracciones tratadas de este modo son
reintroducidas más arriba de la etapa de separación
cromatográfica.
7.Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el
microorganismo que convierte el glicerol en 1,3 propanodiol es
escogido en el grupo constituido por los microorganismos de los
géneros Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus,
Ilyobacter, Pelobacter o Enterobacter, y es
preferentemente un Citrobacter o un Clostridium.
8. Procedimiento, según la reivindicación 7,
caracterizado porque el microorganismo que convierte el
glicerol en 1,3 propanodiol es utilizado en forma libre o
inmovilizada, y preferentemente en forma
inmovilizada.
inmovilizada.
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