ES2269171T3 - Dispositivo en capas con regiones de captura para analisis celular. - Google Patents

Abstract

Método de análisis de una muestra celular, que comprende: colocación de la muestra celular sobre un sustrato que comprende por lo menos dos regiones de captura diferentes superpuestas, donde cada región de captura es una capa y las diferentes regiones de captura del sustrato contienen moléculas de identificación diferentes que interactúan con moléculas biológicas diferentes de la muestra celular, y donde la muestra celular comprende células intactas o lisados celulares; y transferencia de componentes de las células intactas o lisados celulares a través de las regiones de captura en condiciones que permiten a los componentes interactuar con las diferentes moléculas de identificación en las regiones diferentes de captura del sustrato, de modo que los componentes transferidos tengan posiciones que corresponden a las posiciones de las células intactas o lisados celulares para producir un patrón que mantiene una correspondencia con una arquitectura bidimensional de la muestra celular, y se establece una correspondencia geométrica de los componentes transferidos con las células intactas o lisados celulares, analizándose de este modo la muestra celular.

Description

Dispositivo en capas con regiones de captura para análisis celular.

La presente invención se refiere a la separación e identificación de componentes de muestras celulares. En particular, la presente invención comprende la exploración de expresión, y en ejemplos particulares, un método para la identificación de componentes de la muestra manteniendo la relación espacial entre la ubicación del componente de la muestra de interés y el resto de la muestra.

El Proyecto Genoma Humano y otras iniciativas relativas al descubrimiento génico están multiplicando de forma espectacular la información disponible sobre el número, la ubicación genómica y las secuencias de los genes humanos. La base del conocimiento genético cada vez mayor viene acompañada de diversas tecnologías nuevas, orientadas hacia una elevada producción de mARN y el análisis proteómico de muestras biológicas, permitiendo una visión global de los genes y de los productos génicos que reflejan estados patológicos y fisiológicos normales. Utilizadas juntas, la creciente base de datos genéticos y las tecnologías de análisis de creciente desarrollo albergan un tremendo potencial para aumentar la comprensión de la fisiología celular normal y las alteraciones moleculares que subyacen a los estados patológicos.

No obstante, muchas muestras biológicas como las muestras histológicas de células completas siguen siendo singularmente difíciles de analizar, debido a su heterogeneidad celular compleja.

El primer informe sobre la aplicación de secciones histológicas directamente sobre tiras de papel y la posterior electrofóresis, lo hicieron Lindner et al (1956). Posteriormente, Saravis et al (1979) utilizaron geles agarosa y Bonte (1978) utilizó geles de poliacril amida para conseguir mejorar la separación de las proteínas analizadas. Como informa en una retrospectiva Neuhoff (1980), la aplicación rutinaria de estos procedimientos a tejidos celulares completos no estaba extendida debido a dificultades técnicas, de ahí la necesidad de métodos que utilicen la extracción de las proteínas de la muestra mediante lisis celular antes de que predomine la separación.

Más recientemente, Inczedy-Maresek et al (1988) descubrieron la utilización de la electrofóresis y del enfoque isoeléctrico de muestras de criostato colocadas directamente sobre geles de poliacril amida ultrafinos. La utilización de geles ultrafinos permitió la extracción de las proteínas de la muestra histológica, sin lisis de la célula de la muestra y superó alguna de las dificultades técnicas que tuvieron las primeras personas que trabajaron en este sector. Schumacher et al (1990) también descubrió la utilización del enfoque isoeléctrico para identificar enzimas, glucoproteínas y neuropéptidos presentes en secciones de criostato. Este proceso suponía la colocación directa de la muestra sobre geles ultrafinos seguido de enfoque isoeléctrico. Los procesos de Inczedy-Maresek et al y Schumacher et al., producen geles en los cuales las proteínas u otras moléculas de interés se mueven por el medio de gel según características físicas relacionadas con la carga y el peso molecular. No obstante, estos métodos proporcionan información únicamente sobre el contenido molecular total de la muestra que se está analizando, y representa la totalidad de proteínas y ácidos nucleicos presentes en todos los diversos tipos de celulares presentes en la muestra.

Se han descrito procesos de iso-enfoque y electrofóresis para muestras de tejido de criostato, seguido de análisis inmunoquímico. Específicamente, Schumacher y Trudrung (1991) y van der Sluis et al., (1998) describen la identificación de fosfatasas alcalinas y péptidos como vasopresina, respectivamente, por medio de enfoque isoeléctrico directo del tejido, seguido de transferencia Western. Está técnica de análisis inmunoquímico supone el movimiento de la proteína o las moléculas de interés, por acción capilar, desde el gen de enfoque hasta las membranas de nitrotelulosa. La proteína ligada a la membrana se detecta entonces utilizando procedimientos de inmuno coloración. Van der Sluis et al (1988) intentó localizar de forma general las proteínas dentro de la muestra de tejido aplicando este procedimiento a una serie de cortes histológicos. No obstante, el proceso de inmuno detección iba precedido de una etapa de iso-enfoque de modo que los resultados solo indican la presencia de la proteína dentro de una muestra de tejido
particular.

Se han realizado análisis moleculares de poblaciones celulares en cortes histológicos utilizando inmuno-histo-química (IHC) así como hibridación in situ (ISH). La técnica ISH es revisada por Jin and Lloyd (1997) y la técnica IHC es objeto del estudio de Grogan (1992). Si bien estas técnicas han constituido herramientas valiosas para investigar la localización celular de una proteína particular o mARN en un corte histológico complejo, ambas presentan tres inconvenientes principales. En primer lugar IHC e ISH se limitan al análisis de una sola especie molecular por muestra. En segundo lugar, la coloración del artefacto basada en la hibridación cruzada afecta gravemente la precisión de los resultados de la prueba. Finalmente, estos métodos tienen una aptitud limitada para visualizar proteínas y mARN expresados a niveles moderados o bajos en abundancia. Se han descrito técnicas para separar subconjuntos particulares de células de una muestra histológica completa. Por ejemplo, Emmert-Buck et al., (1996) describen la utilización de técnicas de microdisección basadas en láser para obtener rápidamente poblaciones celulares microscópicas, definidas histo-patológicamente. Alternativamente, los conjuntos de tejidos como los descritos por Kononen et al., (1998) permiten estudiar simultáneamente moléculas individuales en centenares de muestras histológicas separadas. Sin embargo, en el estado de la técnica sigue existiendo la necesidad de un método mejorado para el análisis de proteínas u otras moléculas de interés presentes en muestras celulares, método que sea capaz, en algunas realizaciones de proporcionar información relativa a la situación de las proteínas o moléculas de interés en la muestra histológica inicial, y/o ofrecer un método que evite algunos de los problemas encontrados con IHC e ISH.

El documento WO-A-9841863 describe un método para realizar por lo menos dos pruebas simultáneas utilizando un dispositivo de medio de prueba fijo. Los documentos WO 9967647 y US 5057438 describen dispositivos multicapas para análisis inmunológico pero no se refieren a la ubicación de las proteínas o de las moléculas en la muestra inicial. El documento WO9967647 pertenece al estado de la técnica según el artículo 54(3) EPC.

La presente descripción ofrece métodos, sistemas y dispositivos para analizar una muestra biológica, como una muestra celular. El método comprende un método de análisis de una muestra celular, que comprende:

colocación de la muestra celular sobre un sustrato que comprende por lo menos dos regiones de captura diferentes superpuestas, donde cada región de captura es una capa y las diferentes regiones de captura del sustrato contienen moléculas de identificación diferentes que interactúan con moléculas biológicas diferentes de la muestra celular, y donde la muestra celular comprende células intactas o lisados celulares; y

transferencia de componentes de las células intactas o lisados celulares a través de las regiones de captura en condiciones que permiten a los componentes interactuar con las diferentes moléculas de identificación en las regiones diferentes de captura del sustrato, de modo que los componentes transferidos tengan posiciones que corresponden a las posiciones de las células intactas o lisados celulares para producir un patrón que mantiene una correspondencia con una arquitectura bidimensional de la muestra celular, y se establece una correspondencia geométrica de los componentes transferidos con las células intactas o lisados celulares, analizándose de este modo la muestra celular.

En una realización, los componentes de la muestra celular son transferidos a través del sustrato (como diferentes matrices o capas de sustrato) por electrofóresis o por acción capilar de un tampón de transferencia que se mueve por la muestra celular. En ejemplos específicos, los componentes son transferidos secuencialmente por una pluralidad de capas prácticamente paralelas.

La transferencia de componentes de una muestra celular por el sustrato puede producirse manteniendo, si se desea, la arquitectura celular de la muestra. Como la arquitectura celular de la muestra se puede mantener en algunas realizaciones, se puede establecer una correlación entre la ubicación de las diferentes moléculas de identificación que interactúan con los componentes celulares y la ubicación original de los componentes celulares dentro de las muestras celulares. El análisis se puede realizar con una o más muestras celulares discretas diferentes sobre una superficie del sustrato. Como ejemplos de muestras celulares se pueden citar, sin que esto suponga limitación, los cortes histológicos (particularmente, cortes histológicos de tumor), una muestra citológica, células microdisecadas y células cultivadas. Los cortes histológicos de citostato cortados ligeramente más gruesos de lo habitual, es decir, aproximadamente 25 a 50 \mum, mejoran la detección de moléculas de abundancia de nivel moderado y bajo.

Las regiones (capas) del sustrato pueden oscilar entre aproximadamente 1 y más de 100, por ejemplo varios centenares, varios millares o varias decenas de millares, y cada región (una capa) tiene un grosor (por ejemplo) de por lo menos 25 nm aproximadamente. Las regiones, capas, se extienden por el sustrato y los componentes de la muestra son transferidos por lo general transversalmente a las capas, aunque pueden ser transferidos formando otros ángulos con las capas. Las moléculas de identificación presentes en las capas del sustrato pueden ser por ejemplo anticuerpos que interactúan con los componentes de la muestra celular, y se pueden utilizar para identificar moléculas particulares de interés presentes en la muestra. Otros ejemplos representativos, no limitativos de moléculas de identificación son los ácidos nucleicos, péptidos, receptores y ligandos. La molécula de identificación puede comprender por ejemplo una molécula de captura que retiene un componente de la muestra en la capa. Si ocurre esto, el análisis se puede completar exponiendo la molécula de identificación a una molécula de detección que asocia con una combinación de la molécula de captura y el componente de la muestra, o asocia con una región del componente distinto de la región que había sido econocida por la molécula de identificación. Por ejemplo, la molécula de interés puede ser una proteína, y la molécula de identificación puede reconocer un primer dominio de la proteína, y la molécula de detección reconoce un segundo dominio de la proteína.

Otra realización particular es un método de análisis de una muestra en el que se dispone de un sustrato que comprende diferentes regiones (capas) que tienen caras contiguas, comprendiendo cada una de las capas una molécula de captura correspondientes capaz de interactuar con y capturar un componente de la muestra, aplicar la muestra a una cara del sustrato y transferir componentes (como componentes intactos) de la muestra a través de las caras continuas de las distintas capas de la matriz. Los componentes de la muestra reaccionan con la molécula de captura y el patrón de captura en las distintas capas se puede correlacionar con información en torno a la muestra. Por ejemplo, la interacción con un anticuerpo específico en una capa particular indica la presencia del antígeno en la muestra. La ubicación de la interacción en una capa se puede correlacionar con una posición de la muestra. En el caso de muestras celulares, la arquitectura celular de una muestra histológica de la que se tomó la muestra puede mantenerse para permitir una correlación entre el patrón de captura y un componente celular o subcelular de la muestra.

La molécula de captura utilizada en algunas realizaciones de la presente invención tiene la aptitud de inhibir la transferencia de por lo menos alguna o varias de las moléculas de interés presentes en la muestra a una región corriente abajo (capa) del sustrato. En algunas realizaciones, el método da como resultado un patrón de captura que se puede ver como una pluralidad de patrones bidimensionales que, una vez apilados, forman una matriz tridimensional. Los patrones bidimensionales pueden ser, en algunas realizaciones específicas, cito-coherentes al reflejar los patrones el patrón de expresión o presencia de la molécula de interés dentro de la muestra. Si la muestra es una muestra celular y los dos patrones dimensionales son citocoherentes, la tercera matriz dimensional de captura puede correlacionarse con una arquitectura celular específica en una muestra celular. Como la presencia de proteínas o de mARN está asociada con la expresión de ciertos productos génicos, el scan (exploración) puede referirse en algunas realizaciones a un scan de expresión.

Se puede utilizar para el método antes mencionado un dispositivo para analizar una muestra, que incluye un sustrato que contiene diferentes regiones superpuestas (como matrices o capas) que tiene una superficie a la que se puede aplicar la muestra y mantenerse en coherencia espacial, como cito-coherencia. En estos ejemplos, las regiones sucesivas (capas de sustrato) contienen moléculas de identificación diferentes, cada uno de las cuales es capaz de interactuar con y mantener un componente correspondiente intacto de la muestra, incluso cuando la muestra celular no se ha sometido a ninguna degradación proteolítica, núcleolítica u otro tipo de degradación previa antes de transferir a través de las capas del sustrato. El dispositivo puede tener capas del substrato contiguas y conductoras, y que pueden transferir componentes intactos de la muestra celular a través de las capas, manteniendo una correspondencia entre una posición sobre una superficie del sustrato y una posición en el sustrato al que se transfiere el componente. Alternativamente, las capas pueden separarse (particularmente cuando los componentes son transferidos por electrofóresis).

En ejemplos particulares, el sustrato está estructurado para poder ejercer una presión capilar sobre la muestra para transferir el componente a través del sustrato, siendo un ejemplo de una estructura de este tipo una pila de membranas de nitrocelulosa. Si se desea movimiento por electrofóresis, el dispositivo incluye electrodos situados en relación con el sustrato para introducir una corriente eléctrica a través del sustrato, por ejemplo a través de las distintas capas de un sustrato. En una realización de este tipo, la corriente eléctrica mueve los componentes de interés desde la muestra a través de una o más capas del sustrato. Si se utiliza el movimiento utilizando un diferencial de presión de fluido, el dispositivo comprende un medio para establecer y mantener un diferencial de presión de fluido por las capas del sustrato.

En otro aspecto, se puede utilizar para el método antes citado un sistema para el análisis molecular de una muestra biológica, como una muestra celular. El sistema puede por ejemplo contener un soporte de muestra, múltiples regiones de separación contiguas superpuestas, capas, un medio de transporte y por lo menos dos alojamientos. El soporte de muestra puede soportar la muestra durante el movimiento del componente de la muestra desde la muestra a través de las regiones de separación. Las regiones de separación pueden, estar por ejemplo alineadas (por ejemplo apiladas) una frente a otra y cada región, es decir cada capa, comprende moléculas de captura que pueden hibridar para formar uno o más componentes de la muestra. El medio de transporte del presente sistema puede mover por lo menos un componente de la muestra desde el soporte de la muestra, a través de las caras, y por el interior de las matrices de separación. El medio de transporte puede incluir por ejemplo acción capilar, un diferencial de presión de fluido o un par de electrodos que crean una corriente eléctrica a través de las matrices.

Un ejemplo de alojamiento específico del presente sistema presenta múltiples matrices de separación alineadas la una frente a la otra durante el movimiento de los componentes de la muestra, pero permite la separación de las múltiples matrices de separación entre si con el fin de poder seguir realizando el análisis. El segundo alojamiento es el lugar del análisis ulterior de hibridación entre la molécula de captura y el componente de interés de la muestra
celular.

Lo anterior así como otros objetos, características y ventajas de la invención se podrán apreciar con más claridad en la siguiente descripción detallada de varias realizaciones, en las que se procede con referencia a las Figuras adjuntas.

La figura 1 es una ilustración de un corte de próstata que muestra como se puede centrar el análisis en áreas diferentes de la próstata y poblaciones celulares diferentes utilizando la presente invención. En este realización particular, el método se denomina Layered Expresión Scanning (LES) (Exploración de Expresión en Capas).

La figura 2A es una representación esquemática del método de la presente invención. Se muestran tres tipos diferentes de muestras de partida: una muestra de tejido en preparación microscópica completa; células disecadas, intactas; y células disecadas, lisadas. Esta figura 2A también comprende una vista en perspectiva ampliada de un ejemplo de sustrato de la presente invención que tiene múltiples capas porosas contiguas, y cada una de las capas tiene una molécula de identificación diferente ligada dentro de la misma.

La figura 2B muestra una realización del sustrato, similar a la mostrada en la figura 2A, pero donde las capas individuales están separadas.

La figura 3 presenta un conjunto de fotomicrografías que ilustran el mantenimiento de la arquitectura bidimensional de la muestra de tejido de preparación microscopia completa durante la transferencia por múltiples capas de captura. Las figuras muestran un corte intacto de tejido de próstata (figura 3B) y una imagen después de la transferencia capilar (figura 3A) a través de las capas de membrana de captura, donde cada capa tiene un tipo diferentes de anticuerpo ligado en su interior. El corte de preparación microscópica completa de próstata humana representa una sección transversal de todo el órgano, que se colocó sobre una capa superior de 10 capas de captura, y luego se transfirió a través de las capas y sobre una membrana de microcelulosa. La membrana se procesó ulteriormente de forma similar a una inmuno-transferencia standard, utilizando un anticuerpo contra citoqueratina, que colorea selectivamente el epitelio (figura 3A). Se demuestra el mantenimiento de la organización básica del corte histológico por todo el proceso de transferencia comparando la figura 3A con la figura 3B, que es un portaobjetos coloreado con hematoxilina y eosina, de un "recut" adyacente del mismo bloque histológico. El mantenimiento de la arquitectura del corte histológico después de la transferencia por 100 capas de captura también se demuestra comparando la figura 3C con la figura 3D, que muestra respectivamente, la capa de nitrocelulosa teñida de anticuerpo anti-citoqueratina, obtenida después de la transferencia de un corte histológico de preparación microscópica completa a través de 100 capas y un portaobjetos teñido de hematoxilina y eosina de un "recut" adyacente del mismo bloque histológico.

La figura 4A es un diagrama que ilustra el patrón de coloración obtenido en una capa de captura ligada a un anticuerpo anti-PSA después de que se hiciera pasar 5 muestras de lisato celular (solamente una de ellas contiene PSA) y un control positivo de PSA purificado como "spots" discretos de 4 mm a través de 10 membranas de captura, estando ligada cada membrana de captura a un anticuerpo diferente.

La figura 4B es un diagrama que ilustra el patrón de coloración obtenido cuando cada capa individual de una pila de 10 capas LES se analizó por separado por electrofóresis para conocer el PSA.

La figura 4C es un diagrama que ilustra el patrón de coloración obtenido cuando cada capa individual de una pila de 100 capas LES se analizó por separado por electrofóresis para conocer el PSA.

La figura 4D es un diagrama que ilustra los resultados de cimografía de gel obtenidos después de transferir mmp-2 a través de 100 capas LES.

La figura 5 muestra los autoradiogramas obtenidos para 10 capas LES y una membrana de nitrocelulosa después de transferir productos PCR radiomarcados de transcriptos pov1 y \beta-actin como spots discretos a través de 10 capas de captura. La capa 5 se ligó a un plásmido que contenía el cADN pov1 completo. Se utilizó una membrana de nitrotelulosa no bloqueada (tal como se muestra en la parte superior) para unir los transcriptos no capturados después de que atravesaran el conjunto de capas.

La figura 6 es una representación esquemática que muestra un gel inicial con 20 muestras diferentes que se hacen pasar a través de 10 capas (de A a J), y el patrón de coloración de PSA en la décima capa.

La presente descripción detallada describe un método de análisis de una muestra celular, que comprende:

colocación de la muestra celular sobre un sustrato que comprende por lo menos dos regiones de captura diferentes superpuestas, donde cada región de captura es una capa y las diferentes regiones de captura del sustrato contienen moléculas de identificación diferentes que interactúan con moléculas biológicas diferentes de la muestra celular, y donde la muestra celular comprende células intactas o lisados celulares; y

transferencia de componentes de las células intactas o lisados celulares a través de las regiones de captura en condiciones que permiten a los componentes interactuar con las diferentes moléculas de identificación en las regiones diferentes de captura del sustrato, de modo que los componentes transferidos tengan posiciones que corresponden a las posiciones de las células intactas o lisados celulares para producir un patrón que mantiene una correspondencia con una arquitectura bidimensional de la muestra celular, y se establece una correspondencia geométrica de los componentes transferidos con las células intactas o lisados celulares, analizándose de este modo la muestra celular. Las diversas regiones pueden adoptar una variedad de formas, como subunidades de sustrato identificables por separado e incluyen una matriz en la que se suspenden o fijan las moléculas de identificación. Una matriz no es necesariamente un conjunto regular y puede referirse también a una unidad que tiene una profundidad relativamente reducida y una cara con una anchura y una longitud. La cara de la matriz puede ser paralela, transversal o formar cualquier otro ángulo con un sentido de movimiento de la muestra a través del sustrato. La matriz puede extenderse total o parcialmente por el sustrato y las diferentes matrices pueden ser de dimensiones (anchura, longitud y profundidad) prácticamente uniformes o diferentes. La matriz es una capa y es uno de una serie de sustratos finos discretos que pueden o no ser separables entre sí. Si bien es evidente que el sustrato puede adoptar formas diferentes, a efectos de ilustración, el sustrato se describirá en asociación con un sustrato en capas donde las capas pueden estar físicamente separadas la una de la otra.

Las muestras biológicas (como cortes histológicos u otras poblaciones celulares que reciben aquí el nombre de muestras celulares) se separan en múltiples sustratos en capas, de forma que cada una de las capas se pueda someter a un análisis separado, que se puede correlacionar con la arquitectura citológica de la muestra original. El corte histológico de próstata de la figura 1 ilustra como unos cortes histológicos intactos pueden tener diferentes variaciones microscópicas, que se pueden correlacionar útilmente con los resultados de los diversos análisis. La figura 1 muestra un corte de tejido de próstata, que tiene una superficie 1 de linfocitos no asociados con el tumor; la superficie 2 de epitelio normal, adyacente al tumor; la superficie 3 de tumor de grado reducido; la superficie 4 de estroma; la superficie 5 de tumor de grado superior; la superficie 6 de hiperplasia; la superficie 7 de neoplasia intraepitelial prostática de grado inferior (PIN); la superficie 8 de epitelio normal; no adyacente a tumor; y la superficie 9 de linfocitos, asociados con tumor. Es interesante poder determinar diversas características moleculares de la muestra histológica intacta, y correlacionar estas características moleculares con regiones particulares del tejido. Las realizaciones particulares de los "scans" de expresión en capas (LES) de la presente invención lo harán posible.

En la figura 2, se muestra de forma esquemática un ejemplo de scan de expresión en capas. Una o varias muestras biológicas, como un corte histológico intacto (por ejemplo corte de próstata 30), lisatos celulares intactos disecados 32, o lisatos celulares disecados 34, se preparan y colocan dentro o sobre un gel ultra fino, denominado gel de muestra, que se aplica a un gel de varias capas, por ejemplo una superficie (como la superficie superior) de un sustrato de varias capas 36.

El gel de muestra puede utilizar cualquier matriz de gel conocida inclusive agarosa, poliacrilamida y matrices a base de gelatina. Si el gel de muestra es agarosa, su concentración es por ejemplo del orden de 0,1% a 5% aprox., y puede fundirse para ser "ultrafino" es decir del orden de 0,10 \mum de 1 mm de grosor aproximadamente. Alternativamente, las muestras biológicas se pueden colocar directamente en el sustrato o sobre una superficie como la superficie superior, del sustrato multicapas 36. Con el objeto de simplificar la ilustración de la figura 2, el corte de próstata intacto 30 se coloca directamente sobre una superficie superior del sustrato multi-capas 36.

La muestra 30 se coloca sobre la superficie superior de la capa A del sustrato, superficie que es prácticamente paralela a las separaciones entre las capas. Con fines ilustrativos, se muestran 11 capas (aunque se pueden utilizar muchas más, por lo menos centenares o millares de capas), y las capas están rotuladas de A a K. Cada una de las capas puede ser una membrana o lámina, cada una de las cuales puede contener una (o más) moléculas de identificación, como un anticuerpo que reconoce un antígeno particular, o una secuencia de ADN que funciona como sonda por hibridación a secuencias de ADN complementarias en la muestra. La molécula de identificación puede ser diferente en cada una de las capas A-K o igual.

Después de aplicar la muestra 30 a la superficie superior plana de la capa A, el contenido soluble de la muestra se transfiere (por ejemplo por acción capilar o por electrofóresis) a través de la serie de capas A-K, manteniéndose la arquitectura bidimensional global dentro de la muestra. Al pasar los componentes de la muestra, como proteínas y ácidos nucleidos, a través de las membranas, las moléculas de identificación de las capas del sustrato interactúan con las proteínas o con las moléculas de interés. Una vez que se ha producido está interacción, se separan las membranas (figura 2B) y se someten a análisis ulterior, como por ejemplo a la exposición a un segundo anticuerpo o a una secuencia de ADN, produciendo un perfil molecular específico y altamente sensible, o a "scan de expresión" de la muestra celular. Si el análisis se aplica a una muestra histológica completa, la etapa final del método puede comprender el examen de una muestra de referencia cortada en un lugar inmediatamente adyacente a la primera muestra histológica, de modo que se puedan correlacionar áreas de interés en la muestra intacta (como por ejemplo áreas de atipia celular) con resultados del scan de expresión. De este modo, la característica molecular de la muestra (como la expresión de las proteínas moleculares) se puede correlacionar con áreas de interés histológico (como invasión de la cápsula prostática). En el contexto del presente ejemplo, se puede localizar la expresión de proteínas particulares asociadas con invasión capsular (o metástasis en general).

El presente ejemplo de análisis de muestra celular comprende la colocación de la muestra celular sobre un sustrato en capas, donde las distintas capas del sustrato contienen moléculas de identificación diferentes, y la transferencia de componentes de la muestra celular a través de las capas en condiciones que permiten que los componentes interactúen con moléculas de identificación diferentes en las distintas capas contiguas del sustrato. La muestra celular comprende, sin que esto suponga limitación, cortes histológicos, células cultivadas o una muestra citológica. Los cortes histológicos tumorales producidos por el método de criostato resultan particularmente adecuados para utilizar en el presente método. Lefkovits et al. (1996) describen métodos standard de preparación de cortes histológicos. Si la molécula de interés está presente en nivel moderado o bajo de abundancia, con una presencia del orden de 1 a 10.000 copias por célula o incluso 1 a 100 copias por célula, el grosor del corte histológico a analizar se puede aumentar para intensificar el scan de expresión producido. El grosor de dichas muestras es de aproximadamente 25 \mum a 50 \mum. Como se puede utilizar una muestra de referencia adyacente para visualizar microscópicamente el tejido, y como los cortes son delgados, el detalle histológico del análisis no queda comprometido si se utiliza el corte histológico más grueso para el presente método.

La muestra celular a analizar con el método de la presente invención puede obtenerse también disecando una población celular de interés de una población celular mayor, por ejemplo, por microdisección de captura por láser, o la muestra celular puede ser unos lisados de una población celular disecada. En Emmert-Buck et al. (1996) y Bonner et al. (1997) se describen métodos de preparación de muestras histológicas para su microdisección. El procedimiento de microdisección de captura por láser, descrito por Emmert-Buck et al., (1996) y Bonner et al. (1997) permite la disección de poblaciones celulares particulares de interés de una muestra histológica, proporcionando muestras individuales para experimentos que comparan el contenido de diversos tipos histológicos dentro de una muestra. La figura 1 ilustra una muestra histológica que contiene 9 poblaciones de interés, donde se puede separar cada una de ellas utilizando el proceso de microdisección de captura por láser. Alternativamente, se pueden obtener comparaciones de los mismos tejidos con el tiempo, tales como los cambios en la expresión proteínica o el mARN durante el desarrollo del tumor. Si un investigador desea estudiar una proteína o mARN de abundancia muy baja, como por ejemplo una menina, se puede utilizar el gen responsable de la Neoplasia Endocrina Múltiple tipo 1, y luego preparar un lisado altamente concentrado derivado de células microdisecadas. El mARN se encontraría presente con una abundancia muy baja, en la célula, del orden de 1 a 10.000 copias. También es posible amplificar mARN de abundancia baja por reacción de cadena de polimerasa/transcripción inversa (RT/PCR) analizando luego sus cADN correspondientes.

Tal como se ha indicado anteriormente, la muestra celular preparada se coloca opcionalmente en un gel para permitir una fácil manipulación antes del análisis. En algunas realizaciones, la muestra de gel puede ser un gel ultrafino a base de agarosa o poliacrilamida. La muestra de gel se puede realizar utilizando agarosa standard al 2% disuelta en tampón tris-borato EDTA. Con la ayuda de una pipeta se depositan 200 \mul de está preparación sobre un portaobjeto histológico de cristal standard y se recubre el portaobjeto creando de este modo un gel ultrafino del orden de 0,5-1 mm de grosor. La muestra de gel se puede elegir para participar en la separación de los distintos componentes de la muestra celular. Está función de separación se realiza haciendo que la muestra de gel tenga una estructura particular que altera o ayuda la migración de ciertos componentes dentro de las capas del sustrato 36, y/o retrasa la migración de componentes que deben permanecer en la muestra de gel.

Entre los cambios estructurales que contribuyen a la función de separación se encuentra la variación de concentración del gel que alteran el tamaño de poro del gel o la variación de la composición del gel, como cuando se utiliza una formación ácida o básica para contribuir a la migración de ciertos componentes o retrasarla. Si no se desea que la muestra de gel presente una función de separación, se puede elegir un gel con característica neutra como por ejemplo agarosa al 2% en TBE con un pH de 7,4.

Si no se desea ninguna función de separación de gel y la forma física de la muestra es la adecuada (por ejemplo un corte histológico), la muestra 30 se coloca directamente sobre la cara superior plana de la primera capa A (figura 2A) del sustrato 36. Incluso si no se utiliza gel, se puede tratar la muestra celular analizada antes de la transferencia para permitir la transferencia selectiva de ciertas moléculas de referencia dentro de las capas del sustrato. Un ejemplo de este tipo de tratamientos es la utilización de un tampón de transferencia que contiene detergentes que tenderían a incrementar la transferencia de componentes de una muestra celular, presentes en la membrana celular (como la membrana plasmática).

Si las muestras son lisados celulares solubilizados, es posible preparar una muestra de gel de la siguiente forma. Se "taladra" un gel de agarosa al 2% de 2 mm de grosor para generar una serie de orificios (4 mm de diámetro, por ejemplo) que sirven como "pocillos" de muestra. Las muestras se pueden añadir entonces a agarosa liquida al 1%, colocarse dentro de los pocillos y luego dejar que se solidifiquen para formar una muestra de gel 34. La muestra de gel creada por este proceso se puede colocar entonces sobre la parte superior del sustrato en capas 36.

El sustrato en capas 36 de la realización descrita en la figura 2A comprende capas separables de un material (como capas A-K de nitrocelulosa, que se pueden obtener en Schleicher and Schuell, Keene, NH, producto nº BA-85), que se puede colocar en capas contiguas múltiples, tal como se muestra en la figura 2A, y la separación ulterior en múltiples capas separadas (no contiguas), tal como se muestra en la figura 2B. Las capas de microcelulosa se pueden tratar con un agente de bloqueo, para inhibir la fijación de proteínas a la nitrocelulosa de las capas, que permite que las proteínas pasen de la capa a no ser que interactúe con la molécula de identificación y sea capturada por la misma. Una vez que los componentes de la muestra han migrado a través de las capas contiguas, se separan las capas para permitir el análisis individualizado de los componentes de la muestra celular retenida en cada capa separada.

Otros ejemplos de capas del sustrato comprenden, aunque sin limitarse a geles de agarosa de concentración eleva a, geles de agarosa de concentración baja, geles de poliarilamida de concentración elevada, un gel de poliacrilamida de concentración baja y unas membranas, como membranas porosas, similares a papel de nitrocelulosa. La concentración baja de la agarosa oscila entre 0,1 y 3% aproximadamente, mientras que concentración elevada es inferior a 3% aproximadamente. La concentración baja de poliacrilamida es de aproximadamente 2% a 20%, mientras que la concentración elevada es superior a 20 ó aproximadamente. Estos geles o membranas pueden reforzarse opcionalmente con una membrana de poliéster o similar para proporcionar resistencia mecánica así como una "sustancia de contacto" que permite la transferencia eficaz de los componentes de la muestra celular entre las capas del sustrato y reduzca la pérdida de la arquitectura bidimensional de la muestra (como la muestra 30) al migrar el componente a través del sustrato 36.

Las capas de nitrocelulosa constituyen ejemplos de capas porosas que ejercen presión capilar sobre las muestras (como la muestra 34) en la superficie superior de la capa A (figura 2A), y conducen componentes de la muestra a través de las capas. Estas capas porosas o membranas permiten el movimiento de líquido de una cara a otra cara opuesta de la membrana y ejercen una acción capilar sobre la muestra para mover componentes solubles de la muestra a través de las capas múltiples. El tamaño de poro de las capas porosas puede ser cualquiera de los disponibles, particularmente una membrana de celulosa de 0,45 \mum de tamaño de poro. El número de capas del sustrato puede oscilar considerablemente, por ejemplo entre 1 y por lo menos 2, 5, 10 o incluso 1000 capas, aunque con vistas a la ilustración en las figuras 2A y 2B se muestran 11 capas de A a K. El número de capas puede modificarse dependiendo, en parte, del número de moléculas de fijación diferentes u otras moléculas de identificación utilizadas y queda limitado en última instancia únicamente por la aptitud para promover la migración de los componentes celulares a través de los niveles del sustrato. Las capas de sustrato pueden tener una estructura idéntica o bien dichas capas pueden ser mezclas de tipos de sustrato diferentes.

En una de las realizaciones descritas, cada capa del sustrato se impregna con múltiples copias de al menos una molécula de identificación que puede interactuar con una o más moléculas de interés. De forma similar, diversas capas del sustrato pueden contener múltiples moléculas de identificación diferente, por ejemplo cada capa puede tener una o más moléculas de identificación presentes. En una realización alternativa del sustrato, todas las capas contendrán la misma molécula de identificación y la migración diferencial a través de las diversas capas de sustrato permitirá la separación. La migración diferencial se puede promover diferenciando las características físicas de las capas del sustrato, como p. ej. diámetros de poro o pH diferente, o gradientes de porosidad o pH en el sentido de las capas A-K. De forma similar, en otras realizaciones, algunas de las capas del sustrato no contienen moléculas de identificación y pueden servir para promover la migración diferencial de componentes de la muestra a través de las capas.

Como ejemplos representativos de moléculas de identificación se pueden citar, sin que esto suponga limitación, los anticuerpos, ácidos nucleicos, péptidos, receptores, ligandos, tintes, colorantes o enzimas colorimétricas. Como ejemplos específicos de moléculas de identificación se pueden citar los anticuerpos antígeno específico anti-próstata (Scripp, San Diego, CA;) anticuerpos anti-citoqueratina, anticuerpos anti-alfa-actina (Sigma, St. Louis, MO); anti-cuerpos anti-PB39 y anticuerpos anti-menina (Nacional Cancer Institute Core Antibody Lab. Fredrick, MD). Las moléculas de identificación pueden interactuar específicamente con la molécula de interés, como por ejemplo la fijación de un anticuerpo o interacción complementaria con una sequencia de ADN de una sola cadena o más generalmente como la interacción entre un tinte y una molécula coloreada por dicho tinte. Si la molécula de identificación evita la migración de la molécula de interés al interior de capas subsiguientes del sustrato, la molécula de identificación recibe el nombre de molécula de captura. Cuando la transferencia de los componentes de la muestra celular se produce por movimiento capilar de líquido presente en la muestra a través del sustrato, es deseable que las capas múltiples (u otras regiones) del sustrato estén en contacto físico entre sí. La utilización de capas de sustrato contiguas A-K (como la figura 2A) reduce los efectos de la difusión sobre la migración precisa de las proteínas o moléculas de interés a través del sustrato y potencia el movimiento capilar de los componentes. Alternativamente, los componentes pueden moverse a través de las capas del sustrato utilizando electrofóresis, una variación de enfoque isoeléctrico, u otros métodos similares para mover moléculas cargadas. Si se utiliza la electrofóresis u otro método que emplea electricidad, las distintas capas del sustrato son idealmente conductoras, como por ejemplo un gel de agarosa o de poliacrilamida. Los métodos basados en la electrofóresis se limitaran por lo general a la separación de especies cargadas de la muestra celular. Sin embargo, la utilización de la electrofóresis puede evitar el uso de capas de sustrato contiguas. Por ejemplo, las capas pueden estar separadas entre sí, siempre que haya un medio conductor eléctrico (como un líquido, particularmente un líquido que comprende iones como el que se puede formar disolviendo una sal en un líquido) entre las capas a través de las cuales se procede a la electrofóresis de la muestra.

Otro de los medios para transferir componentes de muestra a través de las capas del sustrato es utilizando el movimiento de líquido en respuesta a un diferencial de presión del fluido. Por ejemplo, la presión, como la facilitada por un gas comprimido, se puede aplicar a la muestra para forzar el líquido presente en la muestra a que se introduzca en el sustrato 36 y pase a través de él. Alternativamente, se puede utilizar otro líquido bajo presión para llevar los constituyentes de la muestra al interior y a través de las capas del sustrato hasta una zona de presión inferior. El líquido presente en una muestra o proporcionado para llevar con los constituyentes de una muestra al interior de las capas del sustrato puede hacerse pasar también a través del sustrato 36 por medio de vacío aplicado al sustrato 36 situado frente a la superficie en la que se aplica la muestra (como la muestra 30). Como de este modo se puede establecer un medio fluido continuo, las capas pueden ser contiguas o no.

Una vez que las moléculas de interés han sido transferidas a través de las capas del sustrato en el ejemplo descrito, las diversas capas se pueden separar entre sí para permitir su análisis utilizando una segunda molécula de identificación, separada de la utilizada para la captura inicial, como un segundo anticuerpo o secuencia de ADN. Por ejemplo, el segundo anticuerpo puede ser un agente de fijación específico como un anticuerpo que reconoce el anticuerpo original ligado a su antígeno en la capa de sustrato. La utilización del segundo agente de identificación garantiza una elevada especificidad de la señal de coloración presente en el scan de expresión.

En las figuras 2A-B se ilustra el análisis separado de capas de sustrato diferentes. En este ejemplo, se colocó un corte de preparación microscópica completa de tejido de próstata humana que representa una sección transversal para todo el órgano, sobre la parte superior del sustrato y se transfirió a través de 10 capas de captura y sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se procesó ulteriormente de forma similar a una inmuno-transferencia standard utilizando un anticuerpo contra citoqueratina que colorea selectivamente el epitelio.

El mantenimiento de la organización básica del corte histológico durante todo el proceso de transferencia se demuestra comparando la figura 3A (capa de transferencia de anticuerpo citoqueratina) con la figura 3B (portaobjeto de un "recut" adyacente del mismo bloque histológico teñido con hematoxilina y eosina).

La especificidad de la captura molecular utilizando esta técnica también se ilustró transfiriendo un corte de preparación microscópica completa de tejido de próstata a través de 10 membranas de captura, cada una de las cuales tiene un anticuerpo diferente ligado por toda la membrana. Después de la transferencia del corte histológico, se colocó cada membrana en un tampón de desnaturalización para eliminar las moléculas de captura y se analizó ulteriormente por inmuno-transferencia utilizando anti-PSA (antígeno específico de próstata). La captura específica de PSA se demostró aislando una sola banda de PSA de 30 kDa después de la electrofóresis.

Para demostrar el potencial del método para un análisis de producción muy elevada se procedió a una repetición del experimento de captura de PSA, con la diferencia de que el tejido se transfirió a través de 100 capas de captura, con anti-PSA colocado sobre la capa nº 100. Se realizó con éxito la captura de PSA en la capa nº 100. No parece existir límite para el número de membranas de captura que se pueden utilizar, y por lo tanto el método puede comprender la exploración de expresión utilizando centenares o incluso millares de capas para permitir la medida simultanea de millares de especies moleculares.

Para demostrar la utilización de la técnica de exploración con muestras microdisecadas, se obtuvieron nueve poblaciones celulares separadas de tres pacientes diferentes, de cortes histológicos por microdisección de captura por láser, se solubilizarán y transfirieron como nueve spots separados de 5 mm a través de 10 capas de captura estando presente en la capa nº 3 el anti-PSA policlonal. Se colocó una población de células disecadas de células epiteliales de próstata en la esquina superior izquierda de la capa superior del sustrato. Después de la transferencia de tejido, se procedió al sondeo de la capa nº 10 con anticuerpo monoclonal con PSA y se visualizó por medio de quicio luminiscencia potenciada (ECL). La coloración específica de PSA se visualizó únicamente para la muestra del tejido que contenía epitelio de próstata, lo cual se corresponde con la conocida localización epítelial de PSA. Las muestras 2-9 fueron adecuadamente negativas a la coloración de PSA.

El manteniendo de la arquitectura celular ayuda a . determinar asociaciones entre resultados celulares y características moleculares determinadas por el scan de expresión. Por ejemplo, la presencia de los linfocitos se puede correlacionar con resultados asociados con otras capas. Asimismo, la expresión de un receptor particular se puede correlacionar o cartografiar con epitelio. Alternativamente, otro marcador molecular se puede asociar con áreas de metaplasma o invasión capsular.

El análisis separado de las capas del sustrato permiten investigar regiones múltiples de la molécula de interés, es decir dominios de una proteína o exones de un transcripto de ARN, tal como se describe de forma más completa en los ejemplos. El presente método puede proporcionar una indicación cuantitativa de la abundancia relativa de los componentes en la muestra celular si las moléculas de identificación interactúan en abundancia relativa con la cantidad del componente de interés en la muestra celular. También se puede realizar la secuenciación de la espectroscopia de masas después de la separación para caracterizar una secuencia de aminoácidos capturada.

La explicación anterior se ilustrará mejor con los siguientes ejemplos específicos adicionales.

Ejemplo 1 Identificación de PSA, tubulina, actina y citoqueratina en tumor de próstata

Se realizó el procedimiento LES en cortes tumorales de próstata. El experimento preliminar utilizó citoqueratina como proteína de interés. Se preparó un corte de criostato de preparación microscópica completa de tejido de próstata humana haciendo un corte congelado fino de próstata, corte que tiene un grosor de aproximadamente 10 \mum. Como se muestra en la figura 1, el corte comprende múltiples poblaciones celulares de interés biológico inclusive epitelio normal, lesiones premalignas, focos tumorales de grado alto y bajo y notables interacciones huésped-tumor como la interacción de linfocitos con células cancerosas. Este corte se colocó sobre gel agarosa ultrafino al 2% que había sido fundido sobre un portaobjetos histológico de cristal. El corte se cubrió con una solución de agarosa al 2%. Se aplicó un cubre objetos sobre la parte superior del corte y se dejó polimerizar la agarosa creando de este modo una muestra de gel de dos capas con el corte histológico entre ambas. La muestra de gel de agarosa que contenía la muestra de tejido se aplicó a la superficie de un sustrato de una sola capa hecho a base de una membrana de nitrocelulosa de tamaño de poro 0,45 de 1,75'' x 1,75'' (Schlieicher and Schuell, Keen, NH). La membrana se sondó entonces con un anticuerpo con citoqueratina (Sigma, dilución 1:1000) durante la noche a 4ºC. Se sondó entonces la membrana una segunda vez con un anticuerpo secundario biotinilado (Sigma, valor 1:5000) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se visualizaron por autoradiografía utilizando quimioluminiscencia potenciada (ECL) siguiendo la recomendación del fabricante (Pierce, Rockford, IL).

Se realizó entonces un segundo experimento para probar la especificidad de "moléculas de captura" en las capas de la membrana. Se preparó un corte de criostato de 20 \mum de tejido de próstata dentro de un gel agarosa al 2% ultrafino según lo descrito anteriormente. Se transfirieron durante la noche a temperatura ambiente componentes de este corte histológico a través de 10 membranas de nitrocelulosa contiguas (0,5'' x 0,5'', tamaño de poro 0,45, Schliecher and Schuell) por acción capilar. Antes de su utilización, se ligó cada una de las membranas a una molécula de identificación diferentes, en este caso anticuerpos, durante una hora a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces durante 10 minutos en 1X PBS y se trataron con un agente de bloqueo comercial (Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de un nuevo lavado. Las membranas de anticuerpo/nitrocelulosa (ilustradas como A-J en la figura 2) se prepararon del siguiente modo:

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Capa	Molécula de identificación	Procedencia
A	Anti-PB39, 644	NCI
B	Anti-actina	Sigma
C	Anti-tubulina	Sigma
D	Anti-PB39,655	NCI
E	Anti-PSA policlonal	Scripps, S. Diego, CA
F	Anti-CAIR 1	NCI
G	Anti-PB-39,656	NCI
H	Anti-citoqueratina	Sigma
I	Anti-CD-3	NCI
J	Anti-PB-39,645	NCI

Se ligaron anticuerpos con las membranas de nitrocelulosa utilizando métodos bien conocidos como los descritos por ejemplo en la patente US 4.774.177, concedida a Marks el 27/9/88 o la patente US 4.727.037 concedida a Ring el 23 de febrero de 1988.

Las capas de nitrocelulosa son ejemplos de capas porosas que ejercen presión capilar sobre las muestras en la superficie superior del sustrato, y conducen componentes de las muestras a través de las capas. Estas capas porosas o membranas permiten el movimiento de líquido de una cara la cara opuesta de la membrana y ejercen acción capilar sobre la muestra para mover componentes solubles de la muestra a través de las capas múltiples. Aunque la nitrocelulosa liga con mucha facilidad biomoléculas como proteínas, puede ser alterada con agentes de bloqueo conocidos para inhibir por ejemplo la fijación de proteína y promover el movimiento de la proteína o de otra biomolécula a través de las capas de nitrocelulosa.

Los agentes de bloqueo sirven para evitar interacciones no específicas entre el sustrato y los componentes de la muestra cuando se transfieren a través del sustrato. "Agente de bloqueo" es un término colectivo para varios aditivos que evitan la fijación no específica pero que no tienen parte activa en la reacción específica, como una reacción inmuno-química, entre una molécula de identificación particular y su target (blanco/referencia). Los agentes de bloqueo suelen ser soluciones proteínicas concentradas. Como ejemplos de este tipo de soluciones se pueden citar las siguientes: suero de ternera fetal 10-20% y leche en polvo no grasa 5% disuelta en un tampón como PBS, TBS o TBST. Los agentes de bloqueo comercialmente disponibles son los siguientes SuperBlock^{TM}, Blocker^{TM} BLOTTO, Blocker^{TM} BSA y SeaBlock^{TM} (Pierce Chemical, Rockford III) así como NAP-Su-reBlocker^{TM}, un agente de bloqueo proteínico no animal (Geno Technology, Maplewood, MO).

Después de la transferencia, cada membrana se colocó por separado dentro de 30 \mul de muestra tampón SDS (Novex, San Diego, CA) para eliminar cualquier molécula capturada. Las moléculas solubilizadas, eliminadas se separaron por electrofóresis en un gel de tris-glicina archilamida al 4-20% (Novex) durante 1,5 horas a 110 V. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,2 \mum de tamaño de poro durante dos horas a 40 V y se analizaron mediante un procedimiento de inmunotransferencia standard utilizando un valor 1:1000 de moléculas anti-PSA monoclonales (Scripps). En cada caso, la señal obtenida se restringió a la banda de peso molecular de tamaño adecuado para la molécula capturada por el anticuerpo.

Se mostró la viabilidad de transferir a través de 100 capas de membrana, repitiendo el experimento anterior con 99 capas tratadas únicamente con agente de bloqueo y una capa final 100 que tenía un anticuerpo anti-PSA policlonal ligado a su superficie. La transferencia Western mostró captura de PSA únicamente en la capa 100. La captura no específica de PSA en las capas 1-99 es evitada por el agente de bloqueo previamente al tratamiento. Este experimento se repitió utilizando un anticuerpo contra matriz metaloproteinasa-2 en capa 100. En lugar de inmunotransferencia Western, se analizó la proteína aislada por cimografía de gel, tal como lo describen Zucker et al (1994). Es por tanto posible permitir la medida simultánea de millares de especies moleculares presentes en las muestras histológicas o poblaciones celulares aisladas, utilizando millares de capas de sustrato.

Se realizó otro experimento para detectar la presencia de PSA en una población celular disecada. Se recogen por separado poblaciones celulares diferentes, distinguidas por tipo de tejido, utilizando técnicas de microdisección por láser tal como las describen Emmert-Buck et al., (1997). Se colocaron 10 muestras de epitelio 1-10 en una fila sobre una muestra de gel, tal como muestra en la figura 6 y 10 muestras no de epitelio 11-20 se colocaron en una segunda fila inmediatamente por debajo de las muestras epiteliales. Las 20 se transfirieron a través de un sustrato que contenía 10 membranas de nitrocelulosa (A a J), donde únicamente la membrana J tenía anticuerpos anti-PSA ligados a su superficie. Después de la transferencia, se sondó cada una de las 10 membranas con un anticuerpo monoclonal contra PSA y se visualizó por quimioluminiscencia potenciada (ECL) según se describe anteriormente. Las primeras 9 membranas A e I no produjeron una señal ECL, lo cual indicaba que no se había producido ninguna captura de PSA. No obstante, se visualizó la coloración positiva para PSA en la membrana J en todas las muestras que contenían epitelio (muestras nº 1-10). Este resultado se corresponde con la localización epitelial conocida de PSA. Las muestras 11-20 no contenían células epiteliales y eran adecuadamente negativas para coloración de PSA.

Ejemplo 2 Captura selectiva de antígeno específico de la próstata (PSA)

Para demostrar la captura molecular selectiva dentro de las capas del sustrato se obtuvieron muestras células de cinco pacientes separados a partir de muestras histológicas y se solubilizarán en tampón de extracción proteínico standard. Las muestras comprendían lisados de tejido de pulmón normal, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, próstata normal y cáncer de mama. Cada uno de los lisados celulares se colocó dentro de una mancha (spot) discreta de 4 mm de diámetro sobre la capa superior de un conjunto de membrana de captura. Esto se realizó taladrando agujeros de 4 mm de diámetro ("pocillos") en un gel agarosa de 2 mm de grosor, añadiendo los lisados a agarosa líquida al 1%, rellenado los pocillos de 4 mm con la solución de lisado/agarosa y dejando que se solidifiquen. La muestra de gel así creada se colocó sobre la capa superior de un conjunto de membranas de captura. Además, se utilizó PSA purificado como muestra de control positivo. En este experimento, las membranas de captura consistían en 10 capas de nitrocelulosa, acopladas cada una de ellas un anticuerpo diferente. Se ligó anti-PSA policlonal a la capa nº 10 (la décima membrana de captura sucesiva). Las seis muestras de tejido se colocaron sobre la superficie del sustrato y se transfirieron a través de las membranas de captura por acción capilar y cada membrana se analizó ulteriormente. La figura 4A muestra la capa de captura nº 10 después de sondar con un anti-cuerpo monoclonal contra PSA y visualizar mediante quimio-luminiscencia potenciada (ECL). Las muestras 1 (PSA purificado) y 5 (tejido de próstata normal) muestran una señal positiva, que indican que ha habido éxito en la captura del PSA. Las muestras 2 (pulmón normal), 3 (tumor pulmonar), 4 (tumor del esófago) y 6 (cáncer de mama) no contienen PSA y son adecuadamente negativas.

Se preservó prácticamente una posición de cada una de las muestras que se colocó sobre la capa superior y se reprodujo sobre las membranas a través de las cuales se transfirieron las muestras. El hecho de que mantengan prácticamente su relación espacial permite correlacionar los patrones resultantes con las muestras originales.

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Ejemplo 3 Especificidad de la captura de PSA

Para mostrar la especificidad del proceso de captura, se solubilizó una sola muestra de tejido de próstata y se transfirió a través de un conjunto de capas de captura tal como se describe en el ejemplo 2 anterior, con la diferencia de que el anti-PSA policlonal se colocó sobre la membrana 5. Después de la transferencia del tejido de próstata a través de las capas, cada una de las membranas se colocó en tampón de desnaturalización para eliminar las moléculas capturadas. Las proteínas recuperadas de cada membrana se separaron ulteriormente por electrofóresis de gel (las proteínas recuperadas de la capa 1 se vertieron en la Vía 1, las proteínas recuperadas de la capa 2 se vertieron en la Vía 2 y así sucesivamente) y se analizaron por inmuno-transferencia utilizando un anticuerpo anti-PSA monoclonal. La figura 4B muestra los resultados de cada una de las capas de captura, de uno a nueve. La Vía 5 (que representa la capa 5, ligada a anti-PSA) muestra una sola banda de PSA clara en M_{\gamma} = 30.000 (30 kDa). Las membranas de captura restantes son negativas para PSA. Este resultado demuestra que el PSA solo fue capturado en la membrana que contenía su anticuerpo. Además, la única banda en la inmuno-transferencia indique que la señal ECL derivada de la membrana de captura en el ejemplo 2 era específica de PSA. Para ilustrar el potencial del método para análisis de elevada producción, se repitió el experimento con la diferencia de que el tejido se transfirió a través de 101 capas de captura estando el anti-PSA colocado en la capa nº 100. En la figura 4C se muestra la captura específica y realizada con éxito de PSA. Únicamente la Vía 100 (que representa la capa 100, ligada a anti-PSA) muestra una sola banda de PSA clara en M_{\gamma} = 30.000 (30 kDa). Las membranas de captura restantes son negativas para PSA. La captura específica y selectiva observada después de la transferencia a través de este gran número de capas indica que es posible utilizar la exploración de expresión en capas para la medida simultanea de centenares, millares o incluso decenas de millares de especies moleculares, proporcionando agentes de captura diferentes en la diversas capas.

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Ejemplo 4 Captura de enzimas activas

Para demostrar la aptitud de la exploración de expresión en capas para capturar y analizar enzimas activas se repitió el experimento de 10 capas descrito anteriormente en el ejemplo 3 con la diferencia de que el anticuerpo anti-PSA que estaba ligado a la capa de captura 5 fue sustituido por un anticuerpo contra la matriz metaloproteinasa-2 (MMP-2). La proteína purificada MMP-2 se transfirió a través de las capas de captura y cada membrana se analizó ulteriormente por cimografía de gelatina. La figura 4D muestra el éxito en la captura de MMP-2 representado por una sola banda en M_{\gamma} = 72.000 (72 kDa) en la Vía 5 que corresponde a la capa de captura 5. Todas las demás vías, que corresponden a capas que no contienen anticuerpos anti-MMP-2, fueron negativas para MMP-2.

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Ejemplo comparativo 5

Captura selectiva y específica de ácidos nucleicos

El ejemplo demuestra la aptitud de la exploración de expresión en capas para analizar ácidos nucleicos. Se amplificaron productos PCR ^{32}P-rotulados (200 bp) a partir de plásmidos que contenían cADN de los genes de POV1 (PB30, NCI) y \beta-actina (Clonetech, Palo Alto, CA), respectivamente. Los productos PCR radio rotulados se extrajeron de un gel agarosa y se colocó 5% de cada producto en manchas discretas de 4 mm tal como se describe para las muestras histológicas del ejemplo 2. Los productos PCR se transfirieron a través de 10 capas de captura durante la noche por transferencia capilar utilizando 6X SSC. En este experimento, las capas de captura consistieron en geles agarosa al 2% ultrafinos (< 50 \mum). La capa de captura 5 contenía un plásmido que contenía todo el cADN del gen POV1. Durante la preparación de la capa a5, el plásmido que contenía cADN de POV1 se añadió a la agarosa antes de la polimerización del gel en una concentración final de 30 ng/\muL). Se utilizó una membrana de nitrocelulosa no bloqueada para ligar los productos PCR \beta-actina y POV1 después de que atravesaran el conjunto de membranas. Después de la transferencia, las capas se separaron y se visualizaron por radiografía X-OMAT. La figura 5 muestra el existo en la captura selectiva de cADN de POV1 en la capa 5 mientras que el producto PCR actina se movió a través de todo el conjunto de capas y no fue capturado hasta que reaccionó con la capa de nitrotelulosa no bloqueada.

Ejemplo 6 Transferencia de cortes histológicos intactos

Los ejemplos anteriores muestran la viabilidad de la exploración de expresión en capas para analizar muestras histológicas una vez que han sido obtenidas y solubilizadas adecuadamente. La exploración de expresión en capas también se puede utilizar para analizar cortes histológicos intactos. Si se utiliza como muestra un corte histológico intacto, es posible correlacionar la arquitectura bidimensional del corte histológico con el patrón bidimensional de componentes celulares localizados en capas de captura particulares tras la transferencia.

Para demostrar que se mantiene la arquitectura bidimensional de un corte histológico, se colocaron cortes de criostato de preparación microscópica completa de 10 \mum de grosor de próstata humana de muestras de prostatectomia radical en la parte superior de un conjunto de gel agarosa de 10 capas o de 100 capas. El corte histológico intacto se transfirió a través de las capas por movimiento de fluido capilar durante la noche a temperatura ambiente a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum de tamaño de poro, 1,75 pulgadas cuadradas (Schleicher and Schuell). Después de la transferencia de los cortes histológicos, las membranas de nitrocelulosa se sondaron con un anticuerpo contra citoqueratina (Sigma dilución 1:1000) para identificar selectivamente elementos epiteliales y se visualizaron por ECL siguiendo las recomendaciones del fabricante (Pierce).

En las figura 3A-D se demuestra el mantenimiento de la organización básica del corte histológico a través del proceso de transferencia, comparando los cortes transferidos (figura 3A y figura 3C) con un portaobjetos coloreado de hematoxilina y eosina (H y E) de un corte "recut" adyacente. La arquitectura total de los cortes transferidos es altamente similar a los portaobjetos coloreados H y E, y se puede determinar la posición de los elementos epiteliales glandulares individuales dentro de los cortes histológicos. Por consiguiente, la exploración de expresión en capa se puede utilizar para analizar cortes histológicos intactos, manteniendo una correspondencia entre la arquitectura bidimensional del corte histológico y la posición bidimensional de componentes transferidos a las capas de captura. El nivel unicelular de resolución permitirá analizar las células individuales para detectar la presencia de moléculas particulares. Por ejemplo, en el cáncer de próstata, todos los focos pre-malignos de ganglios normales individuales y los ganglios tumorales de grado elevado y bajo se pueden analizar simultáneamente al igual que sus poblaciones importantes, tales como ganglios tumorales que invaden la cápsula prostática. Alternativamente, la resolución de nivel de estructura microscopia podría permitir la localización de proteínas particulares de organelas subcelulares individuales.

Ejemplo 7 Membranas de exploración de expresión en capa

Las membranas y los geles útiles para crear capas de identificación y de captura, tal como se utilizan en los ejemplos pueden tener una o varias de las propiedades siguientes. En primer lugar, las membranas o geles pueden inmovilizar moléculas individuales de identificación o de captura (por ejemplo anticuerpos, ácidos nucleicos y tintes). En segundo lugar, las membranas o geles permiten a los componentes celulares transferidos de una muestra atravesar de forma eficaz el conjunto de capas y acumularse o reaccionar en la capa adecuada. En tercer lugar, las membranas o geles facilitan la transferencia con una pérdida mínima de la relación bidimensional de la/las muestra(s) biológica(s).

Como ejemplos particulares de materiales adecuados para construcción de un conjunto de capas para la exploración de expresión en capas se pueden citar las membranas de nitrocelulosa, membranas de nitrocelulosa derivadas, geles agarosa de alta concentración, geles agarosa de baja concentración, geles de poliacrilamida de alta concentración, gel de poliamida de baja concentración y membranas como membranas porosas, como papel de nitrocelulosa. La agarosa de baja concentración tiene de 0,1 a 3% aproximadamente mientras que la de alta concentración tiene más de 3%. La acrilamida de baja concentración tiene en torno a 2%-20% mientras que la de alta concentración tiene más de 20%.

Las capas individuales también pueden estar compuestas por dos o más membranas o geles. Por ejemplo, se pueden combinar con membranas de nitrocelulosa o geles de agarosa o poliacrilamida membranas polímeras finas, como membranas polímeras polares, p. ej. de poliéster, para formar capas compuestas para la exploración de expresión en capas. En una realización particular, la membrana compuesta está formada del siguiente modo, se utiliza como capa principal una membrana de poliéster fina (10 \mum). La membrana de poliéster se recubre entonces con un material polímero soluble, como agarosa 2% para formar una capa ultrafina (<1 \mum) que cubre el soporte de poliéster. Se añade una molécula de captura (por ejemplo un anticuerpo o ácido nucleico) al material polímero antes de añadirlo al soporte de poliéster. Una vez recubierto el soporte de polímero, forma un gel y atrapa de forma irreversible la molécula de captura dentro de la estructura del gel. El compuesto gel de polímero/soporte de poliéster que contiene la molécula de captura puede utilizarse entonces como membrana de captura de exploración de expresión en capas. Los experimentos han demostrado que estas membranas compuestas son altamente eficaces y cumplen los criterios antes mencionados. Una ventaja particular de las membranas compuestas es que el gel polímero que recubre el soporte de poliéster sirve de "sustancia de contacto" entre cada una de las capas, permitiendo de este modo la transferencia eficaz de biomoléculas con una pérdida mínima de correspondencia con la arquitectura bidimensional en la muestra.

Ejemplo 8 Determinación del estado de fijación o del "partner" de fijación de una molécula de interés durante la progresión del tumor

Se recogen por separado poblaciones celulares diferentes de tumor, que se distinguen por la etapa de progresión del tumor, utilizando técnicas de microdisección por láser como las que describe Emmert-Buck et al., (1997). Cada una de las poblaciones celulares diferentes se coloca en su propia posición dentro de una muestra de gel, tal como se describe más arriba en el ejemplo 1. La muestra de gel se coloca sobre un sustrato multicapas que contiene por lo menos una capa reticulada con anticuerpos contra uno o más "partners" de fijación de la molécula de interés. Las moléculas se podrían tratar con un agente reticulante y por consiguiente los "partners" de fijación permanecerán en el estado en que están en el momento de la preparación del criostato durante la transferencia. Después de la transferencia de los componentes de las poblaciones celulares a través de las capas de sustrato, según lo descrito anteriormente, las capas se separan y las moléculas de interés se vierten sobre un gel y se sondan mediante el anticuerpo de captura. Este experimento por consiguiente muestra si una molécula de interés está ligada o no o es libre a distintas etapas de desarrollo tumoral, determinando el peso molecular de la especie cuando se prepara la muestra histológica.

Con el objeto de buscar nuevos "partners" de fijación, el experimento se realiza en la forma descrita anteriormente para fijar el estado sin la reticulación anterior a la transferencia. Después de la transferencia de la muestra celular, se puede utilizar espectrometría de masas para determinar la identidad de proteínas capturadas con la proteína de interés. Tras la separación de la molécula de captura y el aislamiento en un gel, la secuenciación MS-MS (espectrometría de masas-espectrometría de masas) puede identificar las proteínas recuperadas de números relativamente reducidos de células microdisecadas, tal como se describe en Huang et al., (1999).

Ejemplo 9 Expresión comparativa entre poblaciones celulares normales y con patologías

Se puede utilizar LES como "sistema abierto" para buscar patologías asociadas con alteraciones moleculares en muestras histológicas. En este ejemplo, se colocan muestras celulares normales y con patología dentro de la muestra de gel según se describe en el ejemplo 1. Las moléculas de información reticuladas sobre las capas de membrana pueden ser anticuerpos, péptidos o secuencias de ADN para cualquier proteína conocida, o bibliotecas de ssADN o mARN. Se utilizan simultáneamente grandes números de moléculas de captura para analizar la expresión comparativa entre poblaciones celulares normales y con patologías de los blancos (targets) de las moléculas de captura. Las muestras probadas se pueden derivar de uno o de varios pacientes. Una vez que se muestra que una proteína o ácido nucleico se expresa de forma diferente en células normales o con patología, se puede determinar su identidad mediante la molécula de captura a la que se fija. Está identidad se puede confirmar utilizando técnicas de secuenciación standard o también se pueden utilizar técnicas de secuenciación inicialmente para determinar si el blanco de la molécula de captura es desconocido.

Ejemplo 10 Determinación de la estructura de una proteína de interés durante la progresión de un tumor

Se recogen por separado poblaciones celulares diferentes, que se distinguen por la etapa de progresión tumoral utilizando técnicas de microdisección por láser como las que describe Emmert-Buck et al. (1996). Cada población celular se coloca en su propia posición dentro de una muestra de gel, tal como se describe más arriba en el ejemplo 1. El gel de muestra se coloca sobre un sustrato que contiene por lo menos una membrana reticulada con anticuerpo policlonal contra proteína supresora de tumor. Después de la transferencia de los componentes de las poblaciones celulares a través de las capas del sustrato, se separan las membranas y las membranas proteínicas de supresor anti tumor, con sus moléculas capturadas se sonda con dos anticuerpos monoclonales rotulados diferencialmente que reconocen diferentes regiones de la proteína supresora del tumor. Un anticuerpo es específico del termino N de la proteína y el otro es específico del termino C de la proteína. Comparando la presencia o ausencia del termino N o C de la proteína en diversas etapas de la progresión tumoral, está investigación puede detectar si la proteína supresora el tumor ha sido truncada en algún punto durante el desarrollo del tumor. La mutación es un ejemplo de un evento que puede conducir a la truncación de proteína. Estas alteraciones en las proteínas durante la transición entre células normales y tumorales se producen, como es bien sabido, por ejemplo en el producto génico supresor de tumor coli poliposis adenomatoso (APC), según el informe de Smith et al., (1993).

Ejemplo 11 Utilización de transferencia diferencial a partir de la muestra de gel

La colocación inicial de la muestra histológica dentro de un gel de concentración elevada limita la migración a proteínas relativamente pequeñas. Alternativamente, los geles de concentración reducida permiten transferir y analizar moléculas más grandes. En la próstata normal, el PSA está localizado exclusivamente dentro de las células epiteliales por lo que en los tumores el PSA puede entrar en el estroma y es ligado por alfa-1-anti-quimotripsina (ACT) según describen Chen et al., (1995). PSA y ACT forman un complejo inhibidor de enzima con un peso molecular total notablemente superior al del PSA solo. Alterando la característica del gel dentro del cual se coloca la muestra histológica, es posible analizar por separado el complejo PSA y PSA-ACT en tumores. Hay una captura selectiva de membrana de PSA después de colocar un corte de tumor de próstata dentro de un gel agarosa al 2%. Sin embargo, si la concentración del gel se reduce a 0,5%, el PSA y el PSA-ACT migran a través de las membranas y son capturados. La alteración de las condiciones experimentales para realizar la migración molecular puede permitir a los investigadores adaptar los experimentos en la forma necesaria para sus objetivos particulares. Por ejemplo, se puede realizar un estudio de perfiles moleculares subcelulares utilizando tampones de transferencia con y sin detergentes para movilizar de forma selectiva proteínas solubles o ligadas a membranas.

Ejemplo 12 Exploración de expresión automatizada

La exploración de expresión en capas de la presente invención se puede utilizar también en asociación con un instrumento de laboratorio automático capaz de múltiples aplicaciones. Por ejemplo las capas de captura en el presente sistema de prototipo se sustituyen por membranas transparentes finas de tal modo que varios millares de capas apiladas solo tendrán un grosor de unos pocos milímetros. Por consiguiente, la distancia de migración total de la muestra histológica durante la transferencia y la detección o la inmovilización es mínima, optimizándose de este modo la resolución celular del sistema. En está aplicación, la muestra histológica, tampones de lavado y moléculas de detección secundarias rotuladas por fluorescencia se transfieren a través del conjunto de membranas intactas, sin que sea necesario separar y procesar individualmente cada capa de captura. La muestra, los tampones de lavado y las moléculas de detección secundarias rotuladas por fluorescencia pueden transferirse al interior de las capas apiladas en el mismo sentido que los componentes de la muestra a través de las capas apiladas o en otro sentido como en el sentido inverso o a lo largo de las capas mismas. El conjunto de membranas intactas se analiza entonces por microscopia de fluorescencia confocal y los datos de expresión de cada capa individual se determinan y se superponen con la imagen histológica de alta calidad del corte histológico. El método se demostró en un experimento similar al mostrado en la figura 4, en el que cada uno de los reactivos de detección se transfirió a través de las membranas de captura mientras las membranas permanecían como conjunto intacto. La captura y el análisis se realizaron con éxito.

En otra realización más, el conjunto de capas de captura se puede utilizar repetidas veces para producir scans de expresión lavando las capas apiladas con un tampón desnaturalizante entre scans para eliminar las moléculas capturadas. Como tampones adecuados para este fin se pueden citar los tampones que contienen desnaturalizantes como detergentes o urea, y sales como cloruro sódico a concentraciones suficientes para eliminar las moléculas capturadas de las capas apiladas. Un ejemplo particular de tampón desnaturalizante adecuado es un tampón que contiene 1% de sodio dodecil sulfato (SDS) y 500 mM de cloruro sódico. En el estado de la técnica se conocen otros sistemas tampón desnaturalizantes y su idoneidad para utilizarlos con exploración de expresión automática se puede determinar analizando las capas para comprobar la presencia continuada de moléculas ligadas después de haberse lavado con un sistema tampón desnaturalizante particular.

En otro método, las membranas de captura serán separables y se procesarán individualmente después de la transferencia de tejido. Las membranas separadas podrán estudiarse entonces más allá de la medida de los niveles de expresión de moléculas individuales. Por ejemplo, se puede utilizar espectrometría de masas para identificar los partners de fijación que son "co-capturados" junto con las moléculas de interés.

Ejemplo 13 Análisis de biomoléculas clonadas individuales

Los métodos de exploración de expresión en capas (LES) se pueden utilizar para analizar biomoléculas clonadas individuales tales como ARN mensajeros recuperados de una población celular y clonados en bacterias utilizando métodos standard.

En una realización particular, las bacterias se cultivan en placas de Petri sobre un medio y se cultivan colonias individuales en presencia de nucleótido rotulado. Las colonias individuales se colocan entonces en la parte superior de un dispositivo LES y los ácidos nucleicos de cada colonia se transfieren a través de un conjunto de capas LES como las descritas en el ejemplo 5 anterior donde cada capa LES contiene un clon individual de cADN. La identidad del cADN en todas las colonias bacterianas se determina simultáneamente analizando la presencia o ausencia de hibridación en cada membrana de captura después de que el ADN clonado ha atravesado el conjunto de capas LES. Una aplicación de este método particular es realizar un análisis de expresión génica de alta producción de una determinada población celular determinando la identidad de un gran número de clones bacterianos derivados de una población particular de ARN mensajero de células.

Ejemplo 14 Análisis del contenido genómico de células

El método de exploración de expresión en capas se puede utilizar para analizar el contenido genómico de ADN de células individuales o células dentro de un corte histológico. A continuación se da un ejemplo de está aplicación.

Se purifica ADN de una serie de líneas celulares, se rotula con un nucleótido "etiquetado" (radio marcado o rotulado por fluorescencia) y se coloca en una retícula sobre una membrana en la parte superior del dispositivo LES, tal como se describe anteriormente, en el Ejemplo 2. En está realización particular, cada una de las capas LES contiene un clon de ADN genómico específico. Las muestras de ADN se transfieren a través de las capas LES de modo que los fragmentos de ADN de las muestras celulares hibridan específicamente en la capa LES que contiene el clon genómico correspondiente. Las capas LES se analizan entonces por (radiografía o fluorescencia) para obtener una medida cuantitativa de la cantidad de ADN en cada muestra celular en cada locus genómico incluido en el conjunto de capas LES. Esta aplicación resultaría útil para determinar las regiones específicas de ADN (y genes asociados) amplificadas o borradas en una serie de líneas celulares.

Aunque muchos de los ejemplos anteriores ha sido descritos en asociación con un sustrato en capas, en el que unas capas discretas o separables se extienden sucesivamente transversalmente al sentido de movimiento del material que se analiza, estos mismos principios se pueden aplicar a otras configuraciones del sustrato. Por ejemplo, se pueden disponer las capas prácticamente paralelas o formando cualquier otro ángulo con el sentido del movimiento. En otras realizaciones, cada capa se puede subdividir en múltiples regiones, cada una con una molécula de captura diferente, que pueden producir más patrones complejos de los que puede reconocer el usuario o el software de procesamiento de imagen. Cada una de las regiones puede extenderse en cualquier forma deseada por la capa, que puede extenderse en cualquier dirección respecto del sentido de movimiento de la muestra por el sustrato. Sin embargo, en realizaciones particularmente útiles, las diferentes regiones son transversales al sentido de movimiento para mantener una correspondencia espacial entre una superficie del sustrato al que se aplica la muestra y la región que captura una molécula de interés.

Aunque las realizaciones descritas examinan un patrón de interacción en capas sucesivas que corresponden a posiciones sobre una superficie del sustrato, se puede utilizar cualquier patrón que transporte información acerca del contenido molecular de la muestra. Con patrones particularmente complejos (del tipo que se puede generar mediante múltiples tipos diferentes de moléculas de captura en cada capa, en patrones regulares e irregulares, que se pueden extender hasta profundidades diferentes del sustrato), el software de reconocimiento de patrón resulta particularmente eficaz para almacenar y comparar patrones.

Habida cuenta de las múltiples posibilidades de realización a las que se pueden aplicar los principios de la presente invención, es preciso decir que las realizaciones ilustradas son únicamente ejemplos particulares de la invención y no se tienen que tomar como limitación del ámbito de la invención. Por el contrario, el ámbito de la invención queda definido por las reivindicaciones siguientes.

Referencias

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Claims (34)

1. Método de análisis de una muestra celular, que comprende:

colocación de la muestra celular sobre un sustrato que comprende por lo menos dos regiones de captura diferentes superpuestas, donde cada región de captura es una capa y las diferentes regiones de captura del sustrato contienen moléculas de identificación diferentes que interactúan con moléculas biológicas diferentes de la muestra celular, y donde la muestra celular comprende células intactas o lisados celulares; y

transferencia de componentes de las células intactas o lisados celulares a través de las regiones de captura en condiciones que permiten a los componentes interactuar con las diferentes moléculas de identificación en las regiones diferentes de captura del sustrato, de modo que los componentes transferidos tengan posiciones que corresponden a las posiciones de las células intactas o lisados celulares para producir un patrón que mantiene una correspondencia con una arquitectura bidimensional de la muestra celular, y se establece una correspondencia geométrica de los componentes transferidos con las células intactas o lisados celulares, analizándose de este modo la muestra
celular.

2. El método de la reivindicación 1, donde las capas son contiguas y se transfieren componentes de la muestra celular a través de las diferentes capas del sustrato por la acción capilar del sustrato o por electroforesis.

3. El método de la reivindicación 1, donde los componentes mantienen una arquitectura celular de las células intactas, al transferirse los componentes a través de las capas del sustrato.

4. El método de la reivindicación 3, que comprende además la correlación de la interacción entre diferentes moléculas de identificación y los componentes de las células intactas con una arquitectura celular de las células intactas.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende además la colocación de múltiples muestras celulares discretas diferentes sobre una superficie del sustrato.

6. El método de la reivindicación 5, donde se colocan por lo menos 20 muestras celulares diferentes sobre la superficie del sustrato.

7. El método de la reivindicación 1, donde las células intactas comprenden el corte de una muestra histológica, células cultivadas o una muestra de citología.

8. El método de la reivindicación 7, donde el corte histológico es el correspondiente a un tumor.

9. El método de la reivindicación 1, donde el sustrato comprende por lo menos 10 capas o por lo menos 100 capas. 10. El método de la reivindicación 2, donde las capas del sustrato tienen un grosor de por lo menos 25 mm aproximadamente.

11. El método de la reivindicación 1, donde la muestra celular se coloca sobre una superficie del sustrato en capas antes de transferir componentes de la muestra celular a través del sustrato.

12. El método de la reivindicación 1, donde las células intactas se tratan, antes de transferir componentes de la muestra celular a través de las capas, para transferir selectivamente componentes a través de las capas.

13. El método de la reivindicación 1, donde la muestra celular se coloca sobre una superficie del sustrato en capas en un gel y se modifica la concentración del gel para transferir selectivamente componentes de tamaño molecular diferente.

14. El método de la reivindicación 13, donde se utiliza un gel de alta concentración para transferir selectivamente proteínas de un tamaño molecular relativamente menor.

15. El método de la reivindicación 1, que comprende además la reacción de un componente identificado con una segunda molécula de identificación para determinar si el componente identificado está asociado con otro componente.

16. El método de la reivindicación 15, donde la muestra celular es una muestra de tumor y el componente identificado es una proteína intacta, y la identificación del otro componente se utiliza para determinar si una segunda proteína está asociada con la proteína en el tumor.

17. El método de la reivindicación 16, donde se colocan varias muestras tumorales sobre el sustrato y se transfieren por separado a través del sustrato y de forma simultánea componentes de las múltiples muestras tumorales.

18. El método de la reivindicación 17, donde las muestras tumorales múltiples son muestras de un tipo particular de tumor en distintas etapas de la progresión tumoral.

19. El método de la reivindicación 18, donde las muestras tumorales múltiples son muestras de un tumor de un paciente particular en distintas etapas de la progresión tumoral en dicho paciente.

20. El método de la reivindicación 1, donde la muestra celular se obtiene por disección de una población celular de interés a partir de una población celular mayor.

21. El método de la reivindicación 20, donde la disección de una población celular de interés comprende la microdisección de captura por láser de la población celular.

22. El método de la reivindicación 1, donde una o varias capas son capas conductoras de la electricidad.

23. El método de la reivindicación 22, donde las capas son separables y se separan después de transferir los componentes de la muestra celular, para la identificación individualizada de los componentes de la muestra celular retenidos en cada capa separada.

24. El método de la reivindicación 22, donde cada capa se elige dentro del grupo formado por un gel agarosa de elevada concentración, un gel agarosa de concentración baja, un gel de poliacrilamida de concentración elevada, un gel de poliacrilamida de concentración baja y una membrana.

25. El método de la reivindicación 1, donde las moléculas de identificación comprenden moléculas elegidas dentro del grupo formado por anticuerpos, ácidos nucleicos, péptidos, receptores y ligandos.

26. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de identificación comprende una molécula de captura que retiene en la capa un componente de la muestra celular, y el método comprende además la exposición de la molécula de identificación a una molécula de detección que se asocia con una combinación de la molécula de captura y el componente de la muestra celular, o con una región del componente que no sea una región reconocida por la molécula de identificación.

27. El método de la reivindicación 26, donde el componente es una proteína, la molécula de identificación reconoce un primer dominio de la proteína, y la molécula de detección reconoce un segundo dominio de la proteína.

28. El método de la reivindicación 27, donde la molécula de detección se elige dentro del grupo formado por anti- cuerpos, ácidos nucleicos, péptidos, receptores, ligandos y colorantes.

29. El método de las reivindicaciones 1 o 2, donde las moléculas de identificación capturan componentes de los componentes transferidos en abundancia relativa a una cantidad de los componentes en la muestra celular, y proporciona una indicación cuantitativa de la abundancia relativa de los componentes de la muestra celular.

30. El método de las reivindicaciones 1 o 2, donde los componentes transferidos que interactúan con las moléculas de identificación diferentes comprenden proteínas intactas o moléculas de ácido nucleico intactas que no han sido sometidas a reacciones nucleolíticas o proteolíticas antes de transferir a través de las distintas capas o del sustrato.

31. El método de la reivindicación 1, que comprende además la captura de un componente de las muestras celulares y la realización de secuenciación por espectroscopia de masa para identificar el componente capturado.

32. El método de la reivindicación 1, donde la transferencia de componentes de la muestra celular a través del sustrato en capas produce una matriz tridimensional, donde una superficie del sustrato sobre el cual se coloca la muestra celular proporciona una matriz bidimensional, y se proporciona una tercera dimensión mediante la transferencia de componentes de las muestras celulares a través de las distintas capas, donde se da una correspondencia identificable entre una posición del componente de la muestra celular en la matriz bidimensional y una posición de los componentes transferidos en la matriz tridimensional.

33. El método de la reivindicación 2, donde la electrofóresis comprende la introducción de una corriente eléctrica a través de las capas contiguas del sustrato, de modo que la corriente circule transversalmente a la pluralidad de capas diferentes.

34. El método de la reivindicación 22, donde una o más capas conductoras eléctricas comprenden geles conductores eléctricos a través de los que pasa la corriente eléctrica.

35. El método de la reivindicación 32, donde la matriz bidimensional es una matriz cito-coherente bidimensional o un conjunto de muestras celulares.