ES2269172T3

ES2269172T3 - Gen desaturasa de acidos grasos a partir de plantas.

Info

Publication number: ES2269172T3
Application number: ES00956479T
Authority: ES
Inventors: Ivo Feussner; Ellen Hornung; Kathrin Fritsche; Nicola Peitzsch; Andreas Renz
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2020-08-23
Also published as: WO2001016362A3; BR0013687A; JP2003508061A; NO20020949L; DK1208216T3; WO2001016362A2; ATE334214T1; EP1208216A2; CN1384882A; IL148011A0; HUP0202526A3; EP1208216B1; RU2002108174A; DE50013239D1; CA2382845A1; EE200200115A; HUP0202526A2; DE19941609A1; PL354408A1; AU778297B2

Abstract

Ácido nucleico aislado, que codifica un polipéptido con actividad de desaturasa, que transforma el ácido linoleico en ácido de caléndula, elegidos entre el grupo formado por: a) un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, b) ácidos nucleicos, que se derivan de los ácidos nucleicos representados en la SEQ ID NO: 1, como consecuencia del código genético degenerado, c) derivados del ácido nucleico, representados en la SEQ ID NO: 1, que pueden aislarse mediante hibridación a 42ºC en 5 x SSC y 50 % de formamida.

Description

Gen desaturasa de ácidos grasos a partir de plantas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de ácidos grasos insaturados o saturados así como a un procedimiento para la obtención de triglicéridos con un contenido elevado en ácidos grasos insaturados o saturados.

La invención se refiere, además, a una secuencia de ácidos nucleicos; a un constructo de ácido nucleico, a un vector y a un organismo que contiene al menos una secuencia de ácidos nucleicos o bien un constructo de ácidos nucleico. Además la invención se refiere a los ácidos grasos saturados o insaturados así como a los triglicéridos con un elevado contenido en ácidos grasos insaturados o saturados y a su empleo.

Los ácidos grasos y los triglicéridos tienen una pluralidad de aplicaciones en la industria de los artículos comestibles, del pienso para animales, de la cosmética y en el sector farmacéutico. En función de que se trate de ácidos grasos libres saturados o insaturados o de triglicéridos con un elevado contenido en ácidos grasos saturados o insaturados, son adecuados para aplicaciones diferentes. De este modo los ácidos grasos poliinsaturados se emplean para el alimento infantil para aumentar el valor nutriente. Fundamentalmente se obtienen los diversos ácidos grasos y los triglicéridos a partir de microorganismos tales como mortierela o a partir de plantas productoras de aceite tales como soja, colza, girasol y otras, presentándose por regla general en forma de sus glicéridos de triacilo. Sin embargo se obtienen también ventajosamente a partir de animales tales como pescados. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante saponificación.

De acuerdo con las finalidades de aplicación son preferentes aceites con ácidos grasos saturados o insaturados, de este modo son preferentes, por ejemplo, en la alimentación humana, los lípidos con ácidos grasos insaturados especialmente con ácidos grasos poliinsaturados, puesto que tienen un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en sangre y, por lo tanto, sobre la posibilidad de una enfermedad cardiaca. Éstos encuentran aplicación en diversos artículos comestibles dietéticos o en medicamentos.

Los ácidos grasos insaturados, especialmente valiosos y buscados, son los denominados ácidos grasos insaturados conjugados tales como el ácido linoleico conjugado. Se ha demostrado una serie de efectos positivos de los ácidos grasos conjugados, de este modo la administración de ácido linoleico conjugado reduce la grasa corporal en los seres humanos y en los animales o bien aumenta la conversión de pienso en peso corporal en el caso de los animales (WO 94/16690, WO 96/06605, WO 97/46230, WO 97/46118). Mediante la adición de ácido linoleico conjugado pueden influenciarse también, por ejemplo, de manera positiva las alergias (WO 97/32008) o el cáncer (Banni et al., Carcinogenesis, Vol. 20, 1999: 1019 - 1024, Thompson et al., Cancer, Res., Vol. 57, 1997: 5067 -
5072).

La obtención química de los ácidos grasos conjugados, por ejemplo del ácido de caléndula o del ácido linoleico conjugado, se describe en la publicación US 3,356,699 y en la publicación US 4,164,505. El ácido de caléndula se presenta de manera natural en la Calendula officinalis (U1'chenko et al., Chemistry of Natural Compounds, 34, 1998: 272 - 274). El ácido linoleico conjugado se encuentra, por ejemplo, en la carne de vacuno (Chin et al., Journal of Food Composition and Analysis, 5, 1992: 185 - 197). Pueden encontrarse ensayos bioquímicos para la síntesis del ácido de caléndula en las publicaciones Crombie et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 15, 1984: 953 - 955 y J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1985: 2425 - 2434.

Debido a sus propiedades positivas, no han faltado en el pasado intentos para poner a disposición genes, que participan en la síntesis de los ácidos grasos o bien de los triglicéridos, para la obtención de aceites en diversos organismos con un contenido modificado en ácidos grasos insaturados. De este modo se ha descrito en la publicación WO 91/13972 y en su equivalente norteamericana una \Delta-9-desaturasa. En la publicación WO 93/11245 se reivindica una \Delta-15-desaturasa; en la publicación WO 94/11516 se reivindica una \Delta-12-desaturasa. Se describen \Delta-6-desaturasas en las publicaciones WO 93/06712 y WO 96/21022. Otras desaturasas han sido descritas por ejemplo en las publicaciones EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144 - 20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999: 649 - 659. La caracterización bioquímica de las diversas desaturasas se ha llevado a cabo, sin embargo, hasta el presente sólo de manera insuficiente puesto que los enzimas, como proteínas enlazados con la membrana, sólo pueden aislarse y caracterizarse con dificultad (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141 - 12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777 - 792).

Se ha podido demostrar en levaduras tanto un desplazamiento del espectro de los ácidos grasos hacia los ácidos grasos insaturados así como también un aumento de la productividad (véanse las publicaciones Huang et al., Lipids 34, 1999: 649 - 659, Napier et al., Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611 - 614). Desde luego la expresión de las diversas desaturasas en plantas transgénicas no muestra el éxito deseado. Pudo observarse un desplazamiento del espectro de los ácidos grasos hacia los ácidos grasos insaturados pero al mismo tiempo se observó que el rendimiento de la síntesis de las plantas transgénicas disminuía de manera pronunciada, es decir que frente a las plantas de partida únicamente pudieron aislarse pequeñas cantidades de aceites.

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Así pues, sigue existiendo una gran necesidad de nuevos genes, que codifiquen enzimas que participen en la biosíntesis de los ácidos grasos insaturados y que posibiliten la síntesis de éstos y, especialmente, la síntesis de los ácidos grasos insaturados conjugados y la obtención a una escala industrial.

Por lo tanto, existía la tarea de poner a disposición otras desaturasas para la síntesis de ácidos grasos conjugados insaturados. Esta tarea se resolvió por medio de una secuencia de ácidos nucleicos aislada, que codifica un polipéptido con actividad de desaturasa, elegido entre el grupo formado por:

a): una secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1,

b): secuencias de ácidos nucleicos que se deriven como resultado del código genético degenerado de la secuencia de ácidos nucleicos representada en SEQ ID NO: 1,

c): derivados de la secuencia de ácidos nucleicos representada en SEQ ID NO: 1, que codifica polipéptidos con las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2 y que presentan al menos un 75% de homología en el plano de los aminoácidos, sin que se reduzca esencialmente el efecto enzimático de los polipéptidos.

Se entenderá por derivado o por derivados, por ejemplo, los homólogos funcionales del enzima codificado por SEQ ID NO: 1 o su actividad enzimática, es decir, los enzimas que catalicen las mismas reacciones enzimáticas que el enzima codificado por SEQ ID NO: 1. Estos genes posibilitan, igualmente, una obtención ventajosa de ácidos grasos conjugados insaturados. Se entenderán por ácidos grasos insaturados a continuación los ácidos grasos mono y poliinsaturados, cuyos dobles enlaces pueden ser conjugados o no conjugados. La secuencia citada en SEQ ID NO: 1 codifica una nueva desaturasa desconocida, que participa en la síntesis del ácido de caléndula en Calendula officinalis. El enzima convierte el (9Z,12Z)octadecadieno/ácido linoleico en (8E,10E,12Z)octadeca conjugado/ácido de caléndula. A continuación se denominará como desaturasa del ácido de caléndula.

La secuencia de los ácidos nucleicos según la invención o los fragmentos de la misma pueden emplearse ventajosamente para el aislamiento de otras secuencias genómicas mediante detección sistemática por homología.

Los derivados citados pueden aislarse por ejemplo a partir de otros organismos eucariotas tales como plantas como Calendula stellata, Osteospermum spinescens u Osteospermum hyoseroides, algas, protozoos tales como dinoflagelados u hongos.

Además, entre los derivados o bien los derivados funcionales de la secuencia citada en SEQ ID No. 1 deben entenderse, por ejemplo, los ácidos nucleicos que pueden aislarse mediante hibridación a 42ºC en 5 \times SSC y 50% de formamida.

La secuencia de aminoácidos, derivada de los ácidos nucleicos citados, puede verse en la secuencia SEQ ID No. 2. Las variantes alélicas abarcan, especialmente, variantes funcionales, que pueden obtenerse mediante eliminación, inserción o substitución de nucleótidos de la secuencia representada en SEQ ID No. 1, manteniéndose la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas.

Tales secuencias de ADN pueden aislarse, a partir de la secuencia de ADN, descrita en SEQ ID NO: 1 o a partir de partes de esta secuencia, por ejemplo con procedimientos usuales de hibridación o según la técnica PCR a partir de otros eucariotas, como los que se han citado más arriba. Estas secuencias de ADN se hibridan bajo condiciones normalizadas con las secuencias citadas. Para la hibridación se emplearán, ventajosamente, oligonucleótidos cortos, por ejemplo del intervalo conservado que pueden ser investigados de una manera conocida por el técnico en la materia mediante comparación con otros genes de desaturasa. Sin embargo pueden emplearse también fragmentos más largos de los ácidos nucleicos según la invención o las secuencias completas para la hibridación. De acuerdo con los ácidos nucleicos empleados: oligonucleótido, fragmento largo o secuencia completa o de acuerdo con el tipo de ácido nucleico ADN o ARN empleado en cada caso para la hibridación, varían estas condiciones normalizadas. De este modo las temperaturas de fusión para el híbrido ADN:ADN se encuentra aproximadamente 10ºC por debajo de la de los híbridos ADN:ARN con la misma longitud.

Por condiciones normalizadas se entenderán, por ejemplo, según el ácido nucleico, temperaturas comprendidas entre 42 y 58ºC en una solución acuosa tampón con una concentración comprendida entre 0,1 hasta 5 x SSC (1 X SSC = NaCl 0,15 M, 15 mM de citrato de sodio, pH 7,2) o, además, en presencia de 50% de formamida tal como por ejemplo 42ºC en 5 x SSC, 50% de formamida. Ventajosamente las condiciones de hibridación para el híbrido ADN:ADN son de 0,1 x SSC y temperaturas comprendidas entre aproximadamente 20ºC y 45ºC, preferentemente comprendidas entre 30ºC hasta 45ºC. Para el híbrido ADN:ARN las condiciones de hibridación ventajosas son de 0,1 x SSC y temperaturas comprendidas entre aproximadamente 30ºC y 55ºC, preferentemente entre aproximadamente 45ºC y 55ºC. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son, por ejemplo, valores calculados para la temperatura de fusión de un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido G + C del 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN han sido descritas en los manuales de genética del ramo, tal como por ejemplo en la publicación de Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse de acuerdo con las fórmulas conocidas por el técnico en la materia, por ejemplo en función de la longitud de los ácidos nucleicos, del tipo del híbrido o del contenido en G + C. Otras informaciones relativas a la hibridación pueden ser tomadas por el técnico en la materia de los siguientes manuales: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Para una expresión óptima de los genes heterólogos en organismos es ventajoso modificar la secuencia de los ácidos nucleicos de acuerdo con el uso del codón ("codon usage") específico empleado en el organismo. El "codon usage" puede determinarse fácilmente por medio de evaluaciones realizadas con ordenador de otros genes conocidos del organismo correspondiente.

Ventajosamente, puede combinarse el gen de la desaturasa del ácido de caléndula en el procedimiento según la invención con otros genes de la síntesis de los ácidos grasos.

Se entenderán por secuencias de aminoácidos según la invención aquellas proteínas que contengan una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 o una secuencia obtenible a partir de la misma mediante substitución, inversión, inserción o eliminación de uno o varios restos de aminoácidos, manteniéndose la actividad enzimática de la proteína representada en SED ID NO: 2 o bien sin que se reduzca de manera esencial. Se entenderán por enzimas que no están esencialmente reducidas todas aquellas que presenten al menos el 10%, preferentemente el 20%, de forma especialmente el 30% de la actividad enzimática del enzima de partida. En este caso pueden reemplazarse por ejemplo determinados aminoácidos por aquellos con propiedades fisicoquímicas similares (ocupación espacial, basicidad, hidrofobicidad, etc.). De manera ejemplificativa se intercambiarán restos de arginina por restos de lisina, restos de valina por restos de isoleucina o restos de ácido asparagínico por restos de ácido glutamínico. No obstante pueden intercambiarse también uno o varios aminoácidos en cuanto a su orden, pueden ser añadidos o retirados o pueden combinarse entre sí varias de estas medidas.

Se entenderá por constructo o fragmento de ácidos nucleicos, según la invención, la secuencia citada en SEQ ID NO: 1, secuencias que se derivan como resultado del código genético degenerado de la secuencia de ácidos nucleicos representada en Seq ID NO: 1, que se han enlazado funcionalmente con una o varias señales de regulación, ventajosamente para aumentar la expresión del gen. De manera ejemplificativa, estas secuencias reguladoras están constituidas por secuencias sobre las que se enlazan inductores o represores y, de este modo, regulan la expresión de los ácidos nucleicos. Además de estas nuevas secuencias de regulación en lugar de estas secuencias puede estar presente también la regulación natural de estas secuencias por delante de los genes estructurales propiamente dichos y pueden haber sido genéticamente modificadas en caso dado, de tal manera que se interrumpa la regulación natural y se aumente la expresión del gen. Sin embargo el constructo genética puede estar formado de una manera más sencilla, es decir que no se han insertado señales de regulación adicionales por delante de la secuencia o de sus derivados y no ha sido eliminado el promotor natural con su regulación. En lugar de ello se ha mutado la secuencia de regulación natural de tal manera que ya no tiene lugar una regulación y se aumenta la expresión del gen. Estos promotores modificados pueden aplicarse también solos por delante del gen natural para aumentar la actividad. El constructo genética puede contener ventajosamente también una o varias denominadas "secuencias reforzadoras" ("enhancer") funcionalmente enlazadas con el promotor, que posibiliten una mayor expresión de la secuencia de los ácidos nucleicos. Del mismo modo pueden insertarse en el extremo 3' de la secuencia de ADN secuencias adicionales ventajosas tales como otros elementos reguladores o finalizadores. El gen de desaturasa del ácido de la caléndula puede estar contenido en el constructo genética en una o varias copias.

Las secuencias de regulación ventajosas para el procedimiento según la invención están contenidas, por ejemplo, en promotores tales como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^{q-}, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, \lambda-P_{R}- o en el promotor \lambda-P_{L}, que encuentran aplicación ventajosamente en bacterias gram-negativas. Otras secuencias de regulación ventajosas están contenidas por ejemplo en los promotores gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de levaduras y de hongos ADC1, MF\alpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores de plantas tales como CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant.Mol. Biol.22(1993)], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos o en el promotor de ubicuitina. Otros promotores vegetales ventajosos son, por ejemplo, un promotor que puede ser inducido por la bencenosulfonamida (EP 388186), un promotor que puede ser inducido por la tetraciclina (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), un promotor que puede ser inducido por el acido abscínico (EP335528) o bien un promotor que puede ser inducido por etanol o por ciclohexanona (WO9321334). Otros promotores vegetales son, por ejemplo, el promotor de la FBPasa citosólica de patata, el promotor ST-LSI de patata (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), el promotor del fosforibosilpirofosfato aminotransferasa de Glycine max (véase también Genbank Accession Nummer U87999) o un promotor específico de los nodos como se ha descrito en la publicación EP 249676. Son especialmente ventajosos aquellos promotores vegetales que aseguran la expresión en tejidos o en partes vegetales en las que tenga lugar la biosíntesis de las grasas o bien de sus precursores. Especialmente deben citarse aquellos promotores que garanticen una expresión específica de las semillas tales como por ejemplo el promotor usp, el promotor LEB4, el promotor de la faseolina o el promotor de la
napina.

En principio pueden emplearse todos los promotores naturales con sus secuencias de regulación como los que se han citado más arriba para el procedimiento según la invención. Además pueden emplearse también ventajosamente promotores sintéticos.

En el fragmento de los ácidos nucleicos (= constructo genético, constructo de ácido nucleico) pueden estar contenidos, como se ha descrito más arriba, además otros genes, que deban ser incorporados en los organismos. Estos genes pueden encontrarse bajo regulación independiente o bajo la misma región de regulación que el gen de desaturasa según la invención. Estos genes están constituidos, por ejemplo, por otros genes de la biosíntesis ventajosamente de la biosíntesis de los ácidos grasos y de los lípidos, que posibiliten una síntesis acrecentada. De manera ejemplificativa pueden citarse los genes para la \Delta15-, \Delta12-, \Delta9-, \Delta6-, \Delta5-desaturasa, las diversas hidroxilasas, las acetilenasas, las acil-ACP-tioesterasas, las \beta-cetoacil-ACP-sintasas, las acetiltransferasas tales como la diacilglicerolaciltransferasa, la glicerol-3-fosfataciltransferasa o la aciltransferasa del ácido lisofosfatídico o las \beta-cetoacil-ACP-reductasas. Ventajosamente se
emplearán los genes de desaturasa en el constructo de ácido nucleico, preferentemente el gen de la \Delta12-desaturasa.

El fragmento de los ácidos nucleicos se inserta en un organismo huésped para la expresión, por ejemplo en un microorganismo tal como un hongo o una planta, ventajosamente en un vector tal como por ejemplo un plásmido, un fago o un ADN de otro tipo, que posibilite una expresión óptima del gen en el huésped. Los plásmidos adecuados son, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III^{113}-B1, \lambdagt11 o pBdCI, en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en Bacillus pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, pIL2 o pBB116, en levaduras 2 \muM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHlac^{+}, pBIN19, pAK2004, pVKH o pDH51 o derivados de los plásmidos anteriormente citados. Los plásmidos citados representan una pequeña selección de los posibles plásmidos. Otros plásmidos son perfectamente conocidos por el técnico en la materia y pueden verse por ejemplo en el libro titulado Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ámsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Los vectores vegetales adecuados han sido descritos, entre otras, en la publicación "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), capítulos 6/7, páginas 71-119.

Se entenderán por vectores, además de los plásmidos, también todos aquellos vectores, conocidos por el técnico en la materia, tales como por ejemplo fagos, virus tales como SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o pueden replicarse de manera cromosómica. Es preferente una replicación cromosómica.

El vector contiene, ventajosamente, al menos una copia de la secuencia de los ácidos nucleicos según la invención y/o del fragmento de los ácidos nucleicos según la invención.

Para aumentar el número de genocopias pueden incorporarse las secuencias de los ácidos nucleicos o los genes homólogos, por ejemplo, en un fragmento de los ácidos nucleicos o bien en un vector, que contenga preferentemente secuencias genéticas reguladoras, asociadas con los genes correspondientes o una actividad promotora de acción análoga. Especialmente se emplearán aquellas secuencias reguladoras que refuercen la expresión genética.

Ventajosamente, el fragmento de ácidos nucleicos contiene además secuencias reguladoras 3' y/o 5' terminales para la expresión de los otros genes contenidos, para aumentar la expresión que se eligen de acuerdo con el organismo huésped elegido y el gen o los genes para una expresión óptima.

Estas secuencias reguladoras deben posibilitar la expresión específica de los genes y la expresión de proteínas. Esto puede significar por ejemplo según el organismo huésped que el gen sea expresado y/o sobreexpresado solamente tras la incubación o que sea expresado y/o sobreexpresado inmediatamente.

Las secuencias o bien los factores reguladores pueden influenciar positivamente en este caso preferentemente la expresión genética de los genes incorporados y aumentarla de este modo. De este modo puede verificarse un refuerzo de los elementos reguladores ventajosamente en el plano de la transcripción, empleándose señales de transcripción fuertes como promotores y/o reforzadores ("enhancer"). Además es posible también un reforzamiento de la traducción si se mejora, por ejemplo, la estabilidad del mARN.

En otra forma de realización del vector puede insertarse el constructo genética según la invención también ventajosamente en forma de un ADN lineal en los organismos no humanos e integrarse en el genoma del organismo huésped a través de recombinación heteróloga u homóloga. Este ADN lineal puede estar constituido por un plásmido linealizado o únicamente por un fragmento de ácidos nucleicos como vector o de la secuencia de ácidos nucleicos según la invención.

Ventajosamente, se clonará la secuencia de ácidos nucleicos según la invención junto con, al menos, un gen indicador en un constructo de ácido nucleico, que se incorpora en el genoma. Este gen indicador debería posibilitar una fácil aptitud a ser detectado a través de un ensayo de crecimiento, de fluorescencia, químico, bioluminiscente o de resistencia o por medio de una medida fotométrica. De manera ejemplificativa pueden citarse como genes indicadores los genes resistentes a los antibióticos o a los herbicidas, los genes de hidrolasa, los genes de proteína fluorescente, los genes bioluminiscentes, los genes del metabolismo de los azúcares o de los nucleótidos o los genes de biosíntesis como el gen Ura3, el gen Ilv2, el gen de la luciferasa, el gen de la \beta-galactosidasa, el gen gfp, el gen de la 2-desoxiglucosa-6-fosfato-fosfatasa, el gen de la \beta-glucoronidasa, el gen de la \beta-lactamasa, el gen de la neomicinafosfotransferasa, el gen de la higromicinafosfotransferasa o el gen de la resistencia al BASTA (= glufosinato). Estos genes posibilitan una fácil posibilidad de medida y de cuantificación de la actividad traductora y, por lo tanto, de la expresión de los genes. De este modo pueden identificarse puntos del genoma que muestran una productividad diferente.

En otra forma ventajosa de realización, puede introducirse la secuencia de los ácidos nucleicos, según la invención, también sola en un organismo no humano. Cuando deban introducirse otros genes en el organismo, además de la secuencia de ácidos nucleicos según la invención, podrán introducirse todos ellos con un gen indicador en un solo vector o cada gen individual podrá incorporarse con un gen indicador respectivamente en un vector en el organismo no humano, pudiéndose introducir simultánea o sucesivamente los diversos vectores.

Ventajosamente, el organismo huésped contiene, al menos, una copia de los ácidos nucleicos según la invención y/o del constructo de los ácidos nucleicos según la invención.

La introducción de los ácidos nucleicos según la invención, del constructo de los ácidos nucleicos o del vector en organismos no humanos, por ejemplo en plantas, puede llevarse a cabo, en principio, según todos los métodos conocidos por el técnico en la materia.

En el caso de los microorganismos, el técnico en la materia puede tomar los métodos correspondientes de los manuales de Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, de F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, de D.M. Glover et al., ADN Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), de Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press o de Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press.

La transmisión de genes foráneos hasta el genoma de una planta se denomina como transformación. En este caso se aprovecharán los métodos descritos para la transformación y la regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales para la transformación pasajera o estable. Los métodos adecuados son la transformación de protoplastos mediante el alojamiento de ADN inducido por polietilenglicol, el empleo de un cañón génico, la electroporación, la incubación de embriones secos en solución que contenga ADN, la microinyección y la transferencia génica verificada a través de Agrobacterium. Los procedimientos conocidos han sido descritos, por ejemplo, en la publicación de B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editada por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 así como en la publicación Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Preferentemente se clonará en un vector el constructo a ser expresado, que sea adecuado para transformar el Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). La transformación de plantas con Agrobacterium tumefaciens se ha descrito, por ejemplo, por Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877.

Los agrobacterios transformados con un vector de expresión, según la invención, pueden ser empleados igualmente, de manera conocida, para la transformación de plantas tales como plantas de ensayo como Arabidopsis o plantas de cultivo, especialmente plantas de cultivo oleaginosas, tales como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza, semillas de coco, palma oleaginosa, cártamo tintóreo (Carthamus tinctorius) o semillas de cacao, por ejemplo bañándose hojas heridas o trozos de hojas en una solución de agrobacterias y cultivándose a continuación en medios adecuados.

Las células vegetales, genéticamente modificadas, pueden regenerarse por medio de todos los métodos conocidos por el técnico en la materia. Los métodos correspondientes pueden verse en las publicaciones anteriormente citadas de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o de Höfgen y Willmitzer.

Como organismos o bien como organismos huésped para los ácidos nucleicos, para el constructo de los ácidos nucleicos o para el vector, según la invención, son adecuados, en principio, todos los organismos no humanos, que sean capaces de sintetizar ácidos grasos, especialmente ácidos grasos insaturados o bien que sean adecuados para la expresión de genes recombinantes. De manera ejemplificativa pueden citarse plantas tales como Arabidopsis, Asteraceae tal como caléndula o plantas de cultivo tales como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza, semillas de coco, palma oleaginosa, cártamo tintóreo (Carthamus tinctorius) o semillas de cacao, microorganismos tales como hongos, especialmente del género Mortierella, Saprolegnia o Pythium, bacterias tales como las del género Escherichia, levaduras tales como las del género Saccharomyces, algas o protozoos tales como dinoflagelados como Crypthecodinium. Serán preferentes aquellos organismos que puedan sintetizar los aceites naturales en grandes cantidades tales como hongos como Mortierella alpina, Pythium insidiosum o plantas tales como soja, colza, lino, semillas de coco, palma oleaginosa, cártamo tintóreo, ricino, caléndula, cacahuete, semillas de cacao o girasol o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, siendo especialmente preferentes soja, colza, lino, girasol, caléndula o Saccharomyces cerevisiae. En principio son adecuados como organismos huésped también animales transgénicos no humanos, por ejemplo Caenorhabditis elegans.

Otra realización según la invención está constituida, como ya se ha descrito anteriormente, por las plantas transgénicas, que contengan un ácido nucleico funcional o no funcional o un constructo de ácido nucleico funcional o no funcional. Se entenderá por no funcional cuando ya no se sintetiza ninguna proteína enzimáticamente activa, puesto que se ha inactivado el gen natural. Además, se entenderá por ácido nucleico o por constructo de ácido nucleico, no funcional, también un ADN denominado antisentido, que conduce a plantas transgénicas, que presenta una reducción de la actividad enzimática o que no presenta actividad enzimática. Con ayuda de la tecnología antisentido, especialmente cuando la secuencia de ácidos nucleicos, según la invención, se combine con otros genes para la síntesis de los ácidos grasos en el ADN antisentido, es posible la síntesis de triglicéridos con un elevado contenido en ácidos grasos saturados o bien la síntesis de ácidos grasos. Se entenderán por plantas transgénicas las células vegetales individuales y sus cultivos sobre medios sólidos o en cultivo líquido, partes de las plantas y plantas
completas.

El empleo de la secuencia de ácidos nucleicos según la invención o del constructo de ácido nucleico según la invención para la obtención de plantas transgénicas pertenece, por lo tanto, también al objeto de la invención.

Otro objeto de la invención está constituido por un enzima, que convierte un ácido graso de la estructura general I

1

que presenta dos dobles enlaces separados entre sí por un grupo metileno, en un ácido graso triinsaturado de la estructura general II

2

estando en conjugación los tres dobles enlaces de los ácidos grasos y teniendo los substituyentes y las variables en los compuestos de las estructuras generales I y II el significado siguiente:

R^{1} =: hidrógeno, alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituido o insubstituido, insaturado o saturado, ramificado o no ramificado,

3

R^{2} =: alquilo con 1 a 9 átomos de carbono substituido o insubstituido, insaturado o saturado

R^{3} y R^{4} significan independientemente entre sí hidrógeno, alquilcarbonilo con 1 a 22 átomos de carbono substituido o insubstituido, saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, o fosfo-,

n =: 1 hasta 14, preferentemente 1 hasta 8, de forma especialmente preferente 4 hasta 6, de forma muy especialmente preferente 6.

En los compuestos de las fórmulas I y II, R^{1} significa hidrógeno, alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituido o insubstituido, saturado o insaturado, ramificado o no ramificado, o

4

Como restos alquilo pueden citarse cadenas alquilo con 1 a 10 átomos de carbono substituidas o insubstituidas, ramificadas o no ramificadas, tales como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n-butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1-etil-1-metilpropilo, 1-etil-2-metilpropilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo o n-decilo.

Los restos preferentes para R^{1} son hidrógeno y

5

En los compuestos de las fórmulas I y II, R^{2} significa alquilo con 1 a 9 átomos de carbono insubstituido o substituido, insaturado o saturado.

Como restos alquilo pueden citarse cadenas alquilo con 1 a 9 átomos de carbono substituidas o insubstituidas, ramificadas o no ramificadas, tales como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n-butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1-etil-1-metilpropilo, 1-etil-2-metilpropilo, n-heptilo, n-octilo o n-nonilo. Es preferente alquilo con 1 a 5 átomos de carbono, siendo especialmente preferente alquilo con 5 átomos de carbono.

Independientemente entre sí, R^{3} y R^{4} significan hidrógeno, alquilcarbonilo con 1 a 22 átomos de carbono substituido o insubstituido, saturado o insaturado, ramificado o no ramificador o fosfo.

Alquilcarbonilo con 1 a 22 átomos de carbono tal como metilcarbonilo, etilcarbonilo, n-propilcarbonilo, 1-metiletilcarbonilo, n-butilcarbonilo, 1-metilpropilcarbonilo, 2-metilpropilcarbonilo, 1,1-dimetiletilcarbonilo, n-pentilcarbonilo, 1-metilbutilcarbonilo, 2-metilbutilcarbonilo, 3-metilbutilcarbonilo, 1,1-dimetilpropilcarbonilo, 1,2-dimetilpropilcarbonilo, 2,2-dimetilpropilcarbonilo, 1-etilpropilcarbonilo, n-hexilcarbonilo, 1-metilpentilcarbonilo, 2-metilpentilcarbonilo, 3-metilpentilcarbonilo, 4-metilpentilcarbonilo, 1,1-dimetilbutilcarbonilo, 1,2-dimetilbutilcarbonilo, 1,3-dimetilbutilcarbonilo, 2,2-dimetilbutilcarbonilo, 2,3-dimetilbutilcarbonilo, 3,3-dimetilbutilcarbonilo, 1-etilbutilcarbonilo, 2-etilbutilcarbonilo, 1,1,2-trimetilpropilcarbonilo, 1,2,2-trimetilpropilcarbonilo, 1-etil-1-metilpropilcarbonilo y 1-etilo-2-metilpropilcarbonilo, heptilcarbonilo, nonilcarbonilo, decilcarbonilo, undecilcarbonilo, n-dodecilcarbonilo, n-tridecilcarbonilo, n-tetradecilcarbonilo, n-pentadecilcarbonilo, n-hexadecilcarbonilo, n-heptadecilcarbonilo, n-octadecilcarbonilo, n-nonadecilcarbonilo o n-eicosilcarbonilo.

Los substituyentes preferentes para R^{3} y R^{4} son alquilcarbonilo con 16 a 22 átomos de carbono saturado o insaturado.

Como substituyentes de los restos citados pueden citarse, por ejemplo, halógeno, tal como flúor o cloro, alquilo o hidroxilo.

En el caso de la reacción con el enzima, según la invención, se introduce un doble enlace en el ácido graso y se desplaza un doble enlace de tal manera que los tres dobles enlaces, que participan en la reacción, se presentan conjugados. Además, se isomeriza un doble enlace (de cis pasa a trans).

El enzima (= desaturasa del ácido de caléndula) cataliza ventajosamente la reacción del ácido linoleico (18:2, 9Z,12Z) para dar el ácido de caléndula (18:3,8E, 10E,12Z). El enzima introduce un doble enlace trans en la posición C8 y provoca el desplazamiento específico de un doble enlace cis hasta la posición C9 para dar un doble enlace trans en la posición C10, verificándose la isomerización regioespecífica. Un posible mecanismo hipotético de la reacción ha sido representado en la figura 1. Tras una desprotonización en C8 del ácido linoleico y una transposición del radical hasta C10 se produce, en el transcurso de una disociación de agua, la desprotonización en C11 y, de este modo, la formación del ácido de caléndula. Al mismo tiempo se reduce Fe IV enlazado para dar Fe III. La figura 1 indica el mecanismo hipotético para la (8,11)-linoleoil desaturasa (desaturasa del ácido de caléndula) modificado según Svatos, A et al. (Insect Biochemistry and Molecular Biology 29, 1999:225-232), basado en el mecanismo de catálisis propuesto para la \Delta9-desaturasa del ricino (Lindqvist, Y et al., EMBO Journal 15, 1996:4081-4092). Como substratos entran en consideración además también los ácidos grasos 6Z,9Z,12Z, 18:3 y los ácidos grasos 9Z,12Z,15Z, 18:3, que se transforman a continuación para dar los ácidos grasos 6Z,8E,10E,12Z o bien 8E,10E,12Z,15Z.

Otro objeto de la invención está constituido por un procedimiento para la obtención de ácidos grasos insaturados caracterizado porque se introduce en un mecanismo no humano, preferentemente productor de aceite, una secuencia de ácidos nucleicos según la invención, anteriormente descrita, o al menos un constructo de ácido nucleico según la invención, se cultiva este organismo y se aísla el aceite contenido en el organismo y se liberan los ácidos grasos contenidos en el aceite.

Como organismos para el procedimiento citado pueden citarse por ejemplo plantas tales como Arabidopsis, soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza, semillas de coco, palma oleaginosa, cártamo tintóreo (Carthamus tinctorius) o semillas de cacao, microorganismos tales como hongos, Mortierella, Saprolegnia o Pythium, bacterias tales como el género Escherichia, levaduras tales como el género Saccharomyces, algas o protozoos tales como dinoflagelados como Crypthecodinium. Serán preferentes los organismos que puedan sintetizar aceites naturales en grandes cantidades tales como hongos, como Mortierella alpina, Pythium insidiosum o plantas tales como soja, colza, lino, semillas de coco, palma oleaginosa, cártamo tintóreo, ricino, caléndula, cacahuete, semillas de cacao o girasol o levaduras como Saccharomyces cerevisiae, serán especialmente preferentes soja, colza, lino, girasol, caléndula o Saccharomyces cerevisiae.

Los organismos, empleados en el procedimiento, se cultivarán o bien se criarán de acuerdo con el organismo huésped correspondiente, en la forma conocida por el técnico en la materia. Los microorganismos se cultivarán por regla general en un medio líquido, que contenga una fuente de carbono, en la mayoría de los casos en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, en la mayoría de los casos en forma de fuentes de nitrógeno orgánico tales como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, una fuente de fosfato, tal como hidrógenofosfato de potasio, elementos en trazas tales como sales de hierro, de manganeso, de magnesio y, en caso dado, vitaminas, a temperaturas comprendidas entre 0ºC y 100ºC, preferentemente comprendidas entre 10ºC y 60ºC con gaseado con oxígeno. En este caso el pH del líquido nutriente puede mantenerse en un valor fijo, es decir que se regula en pH durante el cultivo. Del mismo modo es posible también un cultivo sin regulación del pH. El cultivo puede llevarse a cabo en tandas, en semitandas o de manera continua. Los nutrientes pueden disponerse al inicio de la fermentación o pueden alimentarse ulteriormente de manera semicontinua o de manera continua.

Las plantas se regenerarán, después de la transformación, en primer lugar como se ha descrito anteriormente y a continuación se criarán o bien se cultivarán de manera usual.

Tras el cultivo se obtendrán a partir de los organismos no humanos los lípidos, de manera usual. Para ello pueden someterse en primer lugar a una digestión los organismos no humanos tras la recolección o pueden emplearse directamente. Los lípidos se extraen ventajosamente con disolventes adecuados tales como disolventes apolares como el hexano o polares tales como el etanol, el isopropanol o mezclas tales como hexanol/isopropanol, fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, a temperaturas comprendidas entre 0ºC y 80ºC, preferentemente entre 20ºC y 50ºC. La biomasa se extrae, por regla general, con un exceso de disolvente, por ejemplo con un exceso de disolvente con respecto a la biomasa de 1:4. El disolvente se elimina a continuación, por ejemplo mediante una destilación la extracción puede llevarse a cabo también con CO_{2} supercrítico. Tras extracción puede eliminarse la biomasa restante por ejemplo mediante filtración. Los métodos usuales para la extracción de los ácidos grasos a partir de plantas y de microorganismos se han descrito en las publicaciones Bligh et al. (Can. J. Biochem. Physiol. 37, 1959: 911-917) o Vick et al. (Plant Physiol. 69, 1982: 1103-1108).

El aceite, denominado aceite en bruto, puede purificarse a continuación todavía más, por ejemplo eliminándose la turbidez mediante la combinación con disolventes polares tal como la acetona o con disolventes apolares tal como el cloroformo y subsiguiente filtración o centrifugación. También es posible una purificación adicional a través de columnas o por otras técnicas.

Para la obtención de los ácidos grasos libres a partir de los triglicéridos, éstos se saponifican de manera usual por ejemplo con NaOH o con KOH.

Otro objeto de la invención está constituido por los ácidos grasos insaturados o saturados así como por los triglicéridos con un contenido elevado en ácidos grasos saturados o insaturados, que hayan sido obtenidos a partir del procedimiento anteriormente citado así como su empleo para la obtención de artículos comestibles, pienso para animales, productos cosméticos o farmacéuticos. Para ello se añadirán a los artículos comestibles, al pienso para los animales, a los productos cosméticos o a los productos farmacéuticos en cantidades usuales.

La invención se explica con mayor detalle en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Se clonó por medio de técnicas de RT-PCR o de RACE un cADN a partir del mARN de caléndula. Mediante la expresión de este cADN en levaduras se transforma el ácido linoleico en el ácido de caléndula octadecaconjugado (8E,10E,12Z). En este caso se trata, según nuestros conocimientos, de la descripción por primera vez de una desaturasa de ácido de caléndula. El enzima provoca un desplazamiento regio específico de un doble enlace cis en la posición C9 para dar un doble enlace trans en la posición C10 e introduce un nuevo doble enlaces trans en la posición C8.

Las levaduras y las plantas transgénicas con expresión acrecentada de los cADN de desaturasa del ácido de caléndula presentan ácido de caléndula en sus lípidos.

Ejemplo 1 Aislamiento del ARN a partir de semillas de Calendula officinalis

Para poder aislar clones de cADN de la desaturasa del ácido de caléndula mediante PCR se preparó ARN a partir de semillas de Calendula officinalis. Debido al elevado contenido en grasas de las semillas no se pudieron emplear para ello protocolos normalizados, sino que se aplicó el método siguiente:

Se machacaron por medio de un mortero 20 g de material vegetal en nitrógeno líquido hasta formar un polvo. Se añadieron 100 ml de tampón de extracción 1 [100 mM Tris/HCl, pH 7,5, 25 mM EDTA, 2% (p/v) laurilsarcosilo, 4 M guanidiniotiocianato, 5% (p/v) PVP (= polivinilpirrolidona), 1% (v/v) \beta-mercaptoetanol], se mezclaron y se homogeneizaron inmediatamente. La solución se transfirió a recipientes de 50 ml y se sacudió durante aproximadamente 15 min. Tras una centrifugación a 4.000 g durante 10-15 min, se retiró la capa de grasa o bien las gotas de grasa flotantes en la parte superior y el sobrenadante se transfirió a recipientes frescos. Se verificó una extracción con un volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (= PCI, 25:24:1) y una extracción con cloroformo, sacudiéndose respectivamente durante 15 minutos y a continuación se llevó a cabo una separación por centrifugación. La fase acuosa, superior, se retiró, se superpuso sobre 8 ml de almohadilla de CsCl (CsCl 5 M) y se centrifugó durante 18 horas a 18ºC y a 100.000 g. El sobrenadante se decantó y el precipitado de ARN se secó momentáneamente. Tras una etapa de lavado con etanol al 70% se disolvió el ARN en una mezcla constituida por 7,5 ml de tampón de extracción II (100 ml Tris/HCl, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2% SDS) y 10 ml de PCI, se sacudió durante 15 minutos y se separó por centrifugación. La fase acuosa, superior se combinó, después de una extracción con cloroformo, con el mismo volumen de LiCl 5 M. La precipitación del ARN se llevó a cabo durante la noche a 4ºC. A continuación se centrifugó durante 60 minutos a 12.000 g y a 4ºC. El precipitado se lavó dos veces con etanol al 70% y se secó y a continuación se recogió en 500 \mul de H_{2}O.

A partir del ARN total de caléndula, obtenido de este modo, se aisló el mARN con el estuche Poly-Attract (Promega, Mannheim) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Se tradujo 1 \mug de este mARN en cADN con la transcriptasa reversa de SuperscriptII de Gibco BRL (Eggenstein) con 200 pmol de iniciador oligo-dT de acuerdo con la rutina del fabricante y se empleó como matriz en una reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Ejemplo 2 Aislamiento y clonación de la desaturasa del ácido de caléndula a partir de Calendula officinalis

Para aislar las secuencias de ADN de la caléndula, que codifiquen una desaturasa del ácido de caléndula, se derivan diversos iniciadores degenerados de oligonucleótidos de las secuencias de los aminoácidos de las cajas conservadas de histidina de diversas \Delta12-desaturasas.

Iniciador A:: 5'-CCD TAY TTC TCI TGG AAR WWH AGY CAY CG-3'

\quad: Iniciador directo, derivado de la secuencia de aminoácidos P Y F S W K Y/I S H R

Iniciador B:: 5'-CCA RTY CCA YTC IGW BGA RTC RTA RTG-3'

\quad: Iniciador inverso, derivado de la secuencia de aminoácidos H Y D S S/T E W D/N W

\vskip1.000000\baselineskip

Las letras en los iniciadores A y B tienen el significado siguiente:

\quad: R = A/G

\quad: Y = C/T

\quad: W = A/T

\quad: H = A/C/T

\quad: B = C/G/T

\quad: D = A/G/T

\quad: I = Inositol

Se amplificó un fragmento de ADN con una longitud de 470 bp, en una PCR, con el cADN de hebra sencilla de caléndula (preparado según el ejemplo 1) como matriz con los iniciadores A y B. Se empleó el programa siguiente para la PCR:

1.	2 min	94ºC
2.	30 seg	94ºC
3.	45 seg	50ºC (temperatura de enlace)
4.	1 min	72ºC
	10 x 2. hasta 4.
5.	0 seg	94ºC
6.	45 seg	50ºC
7.	1 min	72ºC, incremento temporal 5 seg por ciclo
	20 x 5. hasta	7.
8.	2 min	72ºC

Para la amplificación se empleó la polimerasa TfI-ADN de Biozym (Hess. Oldendorf). El fragmento de ADN, con una longitud de 470 bp, se clonó y se secuenció con ayuda del estuche TOPO TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, USA) en el vector pCR 2.1-TOPO. La secuencia del fragmento con 470 bp correspondía a la secuencia de los nucléotidos 466 hasta 893 de la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 3 Obtención y secuenciado de clones completos de cADN

Con el fin de obtener un clon de longitud completa se prolongó el fragmento por medio de 5'- y de 3'-RACE (rapid amplification of cADN ends). A partir de 1 \mug de mARN (aislado según el ejemplo 1) se preparó cADN de doble hebra con el estuche de "Marathon cADN Amplification" de CLONTECH (Heidelberg). Una vez verificada la ligadura del adaptador se llevó a cabo con los siguientes iniciadores 5'- o bien 3'-RACE:

Iniciador específico para 5'-RACE

Iniciador C: 5'-GTG AGG GAG TGA GAG ATG GGT GTG GTG C-3'

Iniciador D: 5'-AAC ACA CTT ACA CCT AGT ACT GGA ATT G-3'

\vskip1.000000\baselineskip

Iniciador específico para 3'-RACE

Iniciador E: 5'-TAT TCC AAA CTT CTT AAC AAT CCA CCC G-3'

Iniciador F: 5'-CAA TTC CAG TAC TAG GTG TAA GTG TGT T-3'

\vskip1.000000\baselineskip

En primer lugar, se llevó a cabo una PCR con el cADN de doble hebra, ligado con el adaptador y con el iniciador C o bien E, a continuación se llevó a cabo una segunda PCR con el iniciador D o bien F y una dilución de 1:50 del producto de la PCR procedente de la reacción del iniciador C o bien E como matriz.

La RACE-PCR se verificó de acuerdo con el programa siguiente:

1.	1 min	94ºC
2.	30 seg	94ºC
3.	3 min	68ºC
	10 x 2. - 3.
4.	30 seg	94ºC
5.	30 seg	65ºC
6.	3 min	68ºC
	25 x 4. - 6.
7.	5 min	68ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Los fragmentos de ADN, obtenidos, se clonaron y se secuenciaron con ayuda del estuche TOPO TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, USA) en pCR 2.1-TOPO. El producto 5'-RACE se extendió a través del codón iniciador hasta la zona 5'-no-traducida (5'-UTR), el 3'-RACE se extendió a través del codón de detención hasta el 3'-UTR.

La secuencia combinada, constituida por el producto de la PCR y por los productos de la RACE se han representado en la SEQ ID NO: 1. El segmento codificante se extiende desde el nucleótido 42 (codón iniciador) hasta el 1.175 (condón de detención). Los UTR 5' y 3' se secuencian ahora con una sola hebra de tal manera que en este caso son posibles errores individuales secuenciación.

Para obtener un clon de longitud completa continuo se llevó a cabo una PCR con el sistema Expand High Fidelity (Boehringer, Mannheim) y con los iniciadores G y H así como con el cADN de caléndula (véase el ejemplo 1) como matriz

Iniciador G: 5'-ATTA\underline{\mathbf{GAGCTC}}ATGGGTGCTGGTGGTCGGATGTCG-3'

\quad: Iniciador directo (con puntos de corte \underline{\mathbf{SacI}})

Iniciador H: 5'-ATTACT\underline{\mathbf{CGAGTG}}ACATACACCTTTTTGATTACATCTTG-3'

\quad: Iniciador inverso (con puntos de corte \underline{\mathbf{XhoI}})

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se llevó a cabo según el programa siguiente:

1.	2 min	94ºC
2.	30 seg	94ºC
3.	35 seg	63ºC
4.	2 min	72ºC
	10x2.-4.
5.	30 seg	94ºC
6.	35 seg	63ºC
7.	2 min	72ºC, incremento temporal 5 seg por ciclo
	15 x 5. - 7
8.	2 min	72ºC

El producto de la PCR con una longitud de 1,2 kb se clonó en el vector pGEM-T (Promega, Mannheim) y se transformó en E. coli DH10B. El ADN insertado se secuenció con un secuenciador 373 ADN (Applied Biosystems) de doble hebra. Para ello se utilizaron además del iniciador inverso y del iniciador-21 los siguientes iniciadores específicos de la secuencia:

Iniciador I:: 5'-CGG TCT TCT CGC TGT ATT-3'

Iniciador J:: 5'-ATT ACC CAA GCT GCC C-3'

La secuencia de ADN completa de la desaturasa del ácido de caléndula (CalDes) es idéntica al segmento del nucleótido 42 hasta 1.193 de la SEQ ID NO: 1. La secuencia abarca la parte codificante y un segmento corto del 3'-UTR.

En comparación con la secuencia de aminoácidos derivada de Co-CalDes (SEQ ID NO: 2) con secuencias de proteína anotadas de los bancos de datos SWISS-PROT y SP-TREMBL se produce la homología máxima con respecto a una \Delta12-acetilenasa de Crepis alpina (SP_PL: 081931, 74% de aminoácidos idénticos), a una \Delta12-epoxigenasa de Crepis palaestina (SP_PL: 065771, 73% de aminoácidos idénticos) y a una \Delta12-desaturasa de Borago officinalis (SP_PL: 082729, 62% de aminoácidos idénticos) a través de todo el segmento codificante. La comparación de las secuencias se ha representado en la figura 2. La figura 2 muestra una comparación de las secuencias de los aminoácidos de Co-CalDes con \Delta12-acetilenasa de Crepis alpina (Ca-acetilo), \Delta12-epoxigenasa de Crepis palaestina (Cp-epoxi) y \Delta12-desaturasa de Borago officinalis (Bo-Des).

Ejemplo 4 Expresión de la desaturasa del ácido de caléndula en levaduras

Para demostrar la funcionalidad de la CalDes se clonó, en un primer intento, el segmento codificante de los cADN en un vector de expresión de levadura y se expresó en S. cerevisiae. La desaturasa del ácido de caléndula producida en la levadura debería transformar el ácido linoleico, añadido, en ácido de caléndula. Éste debería detectarse a su vez en los extractos lípidos hidrolizados mediante HPLC.

En un segundo intento se expresó en levaduras además de la CalDes la \Delta12-desaturasa FAD2 procedente de A. thaliana (Kajiwara et al., Appl. Environ. Microbiol., 62, 1996: 4309 - 4313), de tal manera que las células de la levadura produjesen ácido linoleico endógeno, que podría transformarse entonces, a su vez, en ácido de caléndula mediante la actividad de la CalDes. Esta última debería detectarse, a su vez, mediante HPLC.

Todos los medios sólidos y líquidos para las levaduras se prepararon según los protocolos de Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995).

El CalDes-cADN se cortó del vector pGEM-T mediante digestión de restricción con SacI/XhoI, se clonó en el vector lanzadera cortado SacI/XhoI pYES2 (Invitrogen, Carlsbad, USA) y el vector pYES2-CalDes, formado de este modo, se transformó en E. coli XL1 blue. Tras una nueva preparación del plásmido con ayuda del estuche Plasmid Maxi (QIAGEN) se transformó el pYES2-CalDes con ayuda del método del polietilenglicol (Von Pein M., Dissertation, Heinrich Heine-Universität Düsseldorf, 1992) en S. cerevisiae INCSv1 (Invitrogen, Carlsbad, USA), en el que tuvo lugar la expresión del CalDes-cADN bajo el control del promotor GAL1.

Para poder expresar en el segundo intento, además de la CalDes también la FAD2 en levadura, se amplificó adicionalmente el segmento codificante del gen FAD2 mediante PCR (con relación al protocolo véanse los iniciadores G y H) a partir de A. thaliana-cADN con ayuda de la Tfl-polimerasa (Biozym). Para ello se emplearon los iniciadores siguientes:

Iniciador K:: 5'-AAA\underline{\mathbf{CTCGAG}}ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCCGG-3'

\quad: Iniciador directo (puntos de corte \underline{\mathbf{XhoI}})

Iniciador L:: 5'-AAA\underline{\mathbf{AAGCTT}}TCATAACTTATTGTTGTACCAGTACACACC-3'.

\quad: Iniciador inverso (puntos de corte \underline{\mathbf{HindIII}})

El producto de la PCR formado se clonó, tras digestión por restricción con XhoI/HindIII en el vector de expresión de levadura cortado XhoI/HindIII pESC-Leu (Stratagene), formándose el FAD2-ADN bajo el control del promotor GAL1.

La expresión de la CalDes en S. cerevisiae INCSv1 se llevó a cabo según los métodos modificados de Avery et al. (Appl. Environ. Microbiol., 62, 1996: 3960 - 3966) y Girke et al. (The Plant Journal, 5, 1998: 39 - 48). Para la preparación de un cultivo de partida se inocularon 10 ml de medio YPAD con una colonia de monocélulas y se incubó durante 48 horas a 30ºC a 200 revoluciones por minuto. El cultivo de células se lavó a continuación en medio 1 x YPA sin azúcar y se separó por centrifugación. Las células pelletizadas se suspendieron de nuevo en 2 ml de medio de cultivo mínimo sin suplemento y sin azúcar. Se inocularon, con 1 ml de esta suspensión de células, 100 ml de medio de cultivo mínimo (dropout powder, 2% de Raffinose, 1% de Tergitol NP40) en matraces Erlenmeyer de 500 ml y los cultivos se cultivaron a 30ºC y a 200 rpm. Con una OD_{600} de 0,5 se añadió un 2% (p/v) de galactosa y (para la primera carga) un 0,003% de ácido linoleico (solución madre al 3% en 5% de Tergitol NP40). Se prosiguió el cultivo de las células hasta que se alcanzó la fase estacionaria. A continuación se lavaron con medio de cultivo mínimo sin suplementos y se conservaron a -20ºC.

Ejemplo 5 Extracción de los lípidos y análisis por HPLC de los ácidos grasos procedentes de levaduras transgénicas

Las células de levadura se suspendieron en 30 ml de solución HIP (0,1 mM de 2,6-di-terc.-butil-4-metil-fenol en hexano : isopropanol (3:2 v/v)), se sacudieron con 150 \mul de HCl concentrado y se homogenizaron en el Ultra-Turrax (1 min, 24.000 rpm). A continuación se sacudieron las muestras durante 10 min a 4ºC y se separaron por centrifugación a 5.000 g y a 4ºC durante 10 min. El sobrenadante se transfirió a un nuevo recipiente y se completó hasta 47,5 ml con K_{2}SO_{4} 0,38 M. Las muestras se sacudieron de nuevo durante 10 min a 4ºC y se separaron por centrifugación (véase más arriba). La fase de hexano se retiró y se concentró por evaporación bajo corriente de N_{2}. El residuo se disolvió en 20 \mul de cloroformo. Se añadieron 400 \mul de metanol así como 80 \mul de solución de KOH al 40% (p/v) para la hidrólisis alcalina de los ésteres de los ácidos grasos y la muestra se incubó durante 20 min a 60ºC bajo argón. A continuación se enfrió la muestra hasta la temperatura ambiente, se acidificó con 35 \mul de HCl concentrado hasta pH 3,0 y se separó mediante HPLC.

La separación de los ácidos grasos libres se llevó a cabo con una columna ET 250/4 Nucleosil 120-5 C18 (Macherey & Nagel). Como eluyente sirvió metanol : H_{2}O: ácido acético glacial (85:15:0,1 v/v/v). La separación se llevó a cabo con un caudal de 1 ml/min y a 25ºC, para la detección de los trienos conjugados se midió la absorción a 268 nm.

La figura 3 muestra el perfil de elución de los extractos lípidos tras hidrólisis alcalina procedentes de células de levadura transformadas (figura 3B, perfil de elución de S. cerevisiae INCSv1 transformado con FAD2-ADN de A. thaliana y C, perfil de elución de S. cerevisiae INCSv1 transformado con pYES2-CalDes de Calendula officinalis) o bien el perfil de elución de un patrón de ácido de caléndula (figura 3A). El ácido de caléndula tiene un tiempo de retención de 12 min con una absorción a 268 nm potente, típica de los trienos conjugados. Los extractos lípidos hidrolizados de células de levadura, que se habían transformado con el vector vacío pYES2 y que se habían cultivado con un 0,003% de ácido linoleico, no presentan ácidos grasos con un tiempo de retención del ácido de caléndula (no mostrado). Del mismo modo los extractos de lípidos hidrolizados de las células de levadura, que expresan en gen FAD2, tampoco contienen ácido de caléndula (figura 3B).

El análisis promedio de HPLC de los extractos de células de levadura transformadas con la YES2-CalDes, que se han cultivado con un 0,003% de ácido linoleico, presentan, por el contrario, una señal con el tiempo de retención del ácido de caléndula (figura 3C), que presenta también el mismo espectro de absorción con un máximo a 268 nm y máximos secundarios a 258 y a 282 nm como el patrón (figura 4A, patrón y C, perfil de elución de S. cerevisiae INCSv1 transformado con pYES2-CalDes de Calendula officinalis). De este modo se ha demostrado que la expresión de la desaturasa del ácido de caléndula conduce en levaduras a la biosíntesis del ácido de caléndula. La detección del ácido de caléndula a partir de las células de levadura transformadas se consiguió únicamente tras hidrólisis de los lípidos. En los ácidos grasos libres de estas células no pudo demostrarse ácido de caléndula, es decir que el ácido de caléndula se incorpora en los lípidos en la levadura. Puesto que las levaduras no contienen triacilglicéridos, debe suponerse que el ácido de caléndula detectado estaba enlazado con los fosfolípidos de la levadura.

Además, el extracto de los lípidos de las células de levadura transgénicas, que expresan simultáneamente FAD2 y CalDes, contienen igualmente ácido de caléndula (no mostrado)

Ejemplo 6 Expresión de la desaturasa del ácido de caléndula en Arabidopsis thaliana y Linum usitatissimum

La expresión de la desaturasa del ácido de caléndula a partir de Calendula officinalis en las plantas transgénicas es ventajosa para aumentar el contenido de ácido de caléndula en estas plantas. Para ello se clonó en vectores binarios el CalDes cADN y se transfirieron por medio de ADN de transferencia a través de Agrobacterium en A. thaliana y L. usitatissium. La expresión del CalDes cADN se encontraba en este caso bajo el control del promotor constituyente CaMV 35 S o bien del promotor específico de la semillas USP.

Como vectores de expresión se emplearon el vector pBinAR (Höfgen y Willmitzer, Plant Science, 66, 1990: 221 - 230) o bien el derivado pBinAR, pBinAR-USP, en el cual se había intercambiado el promotor CaMV 35 S por el promotor USP procedente de V. faba. Para la reclonación tuvo que trocearse el CalDes-cADN del vector pGEM-T. Para ello se troceó en primer lugar con NcoI y se completó con Klenow para formar extremos lisos. A continuación se extrajo el inserto con SalI y se clonaron los vectores pBinAR o bien pBinAR-USP, cortados en SmaI/SalI.

Los plásmidos formados pBinAR-CalDes o bien pBinAR-USP-CalDes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens (Höfgen y Willmitzer, Nucl. Acids Res., 16, 1988: 9877). La transformación de A. thaliana se llevó a cabo por medio de "floral dip" (Clough y Bent, Plant Journal, 16, 1998: 735 - 743), la transformación de L. usitatissimum se llevó a cabo por medio de cocultivo de trozos de hipocótilo de lino con células transformadoras de A. tumefaciens.

La expresión del gen CalDes-Gens en plantas transgénicas de Arabidopsis y de Linum se ensayó por medio del análisis de Northern-Blot. Las plantas seleccionadas se ensayaron en cuanto a su contenido en ácido de caléndula en el aceite de las semillas.

De manera análoga a la del promotor USP puede emplearse también el promotor Napin, para alcanzar la expresión específica de las semillas de la CalDes.

<110> Institut für Pflanzenbiochemie

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<120> Gen de la desaturasa de ácidos grasos a partir de plantas

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<130> Secuencia_desaturasa

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<140> 50669

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<141> 1999-08-31

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<160> 2

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<170> PatentIn Vers. 2.0

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<210> 1

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<211> 1285

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<212> ADN

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<213> Calendula officinalis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (42)..(1175)

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<400> 1

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6

7

8

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<210> 2

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<211> 377

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<212> PRT

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<213> Calendula officinalis

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<400> 2

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9

10

Claims

1. Ácido nucleico aislado, que codifica un polipéptido con actividad de desaturasa, que transforma el ácido linoleico en ácido de caléndula, elegidos entre el grupo formado por:

a): un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1,

b): ácidos nucleicos, que se derivan de los ácidos nucleicos representados en la SEQ ID NO: 1, como consecuencia del código genético degenerado,

c): derivados del ácido nucleico, representados en la SEQ ID NO: 1, que pueden aislarse mediante hibridación a 42ºC en 5 x SSC y 50% de formamida.

2. Secuencia de aminoácidos codificada por medio de un ácido nucleico según la reivindicación 1.

3. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 2, codificada por medio del ácido nucleico representado en la SEQ ID NO: 1.

4. Constructo de ácido nucleico, que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico está enlazado con una o varias señales de regulación.

5. Vector que contiene un ácido nucleico, según la reivindicación 1, o un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 4.

6. Organismo no humano, que contiene, al menos, un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 4.

7. Organismo no humano, según la reivindicación 6, estando constituido el organismo por una planta, un microorganismo o un animal.

8. Planta transgénica, que contiene un constructo de ácido nucleico funcional o no funcional, según la reivindicación 4.

9. Procedimiento para la obtención de ácidos grasos insaturados, caracterizado porque se inserta al menos un ácido nucleico, según la reivindicación 1 o, al menos, un constructo de ácido nucleico, según la reivindicación 4, en un organismo no humano productor de aceite, este organismo se cultiva y se aísla el aceite contenido en el organismo y se liberan los ácidos grasos contenidos en el aceite.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el organismo está constituido por una planta o por un microorganismo.

11. Empleo de un ácido nucleico, según la reivindicación 1, o de un constructo de ácido nucleico, según la reivindicación 4, para la obtención de plantas transgénicas.

12. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque se añaden los ácidos grasos insaturados o saturados, obtenidos en el procedimiento, a artículos comestibles, a piensos para animales, a productos cosméticos o a productos farmacéuticos.