ES2269505T3 - Procedimiento para la obtencion de inhibidores tirc7 y sus ligandos y sus usos. - Google Patents

Abstract

Utilización de un inhibidor que interfiere con la interacción entre TIRC7 y su ligando enla preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, para el tratamiento de tumores, para la mejora de la curación de heridas o para la inducción de la ausencia de respuesta en un individuo, en donde dicho ligando es la cadena a HLA-clase II (antígeno asociado a leucocitos humanos).

Description

Procedimiento para la obtención de inhibidores TIRC7 y sus ligandos y sus usos.

La presente invención hace referencia a la utilización de un inhibidor que interfiere con la interacción entre TIRC7 y su ligando(s) en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, para el tratamiento de tumores, para la mejora de la curación de heridas o para la inducción o el mantenimiento de una ausencia de respuesta en un individuo. Además, la presente invención hace referencia a la utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica dicho inhibidor y de un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico para la preparación de una composición farmacéutica para la mejora, el tratamiento y la prevención de las enfermedades inmunológicas. Adicionalmente, la presente invención proporciona procedimientos para la identificación de un agente capaz de interferir con la interacción entre TIRC7 y su ligando y/o de identificar un poli(péptido) implicado en la regulación de la respuesta inmune en un individuo. En otra realización, la presente invención hace referencia a un procedimiento para perfeccionar un inhibidor, un agente o un (poli)péptido tal como se define o se identifica por el(los) procedimiento(s) de la invención. Además, la invención hace referencia a la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes, los (poli)péptidos identificados y/o perfeccionados por los procedimientos aquí descritos. En otra realización, la presente invención hace referencia a la utilización de un inhibidor, un agente o un (poli)péptido tal como se identifica y/o se perfecciona por los procedimientos de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica.

Diversos documentos se citan a los largo del texto de esta especificación.

Ninguno de los documentos citados son por ello anteriores en la materia de la presente invención. La activación de células T es un proceso en serie que implica múltiples vías de señalización y cambios secuenciales en la expresión génica y que da como resultado la diferenciación de células T en subpoblaciones distintas, es decir, Th1 y Th2, que se diferencian por su patrón de producción de citoquinas y se caracterizan por el modo de respuesta inmune celular. La respuesta de células T se inicia con la interacción del receptor de célula T antígeno-específico (TCR) con el péptido presentado por las moléculas del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) en la superficie de las células que presentan el antígeno (APCS). Señales adicionales se proporcionan por una red de interacciones receptor-ligando mediadas por diversas proteínas de membrana como CD28/CTLA4 y B7, CD40/CD40L, LFA-1 e ICAM-1 (Lenschow, Science 257 (1992), 789-792; Linsley, Annu Rev Immunol. 11 (1993), 191-212; Xu, Immunity 1 (1994), 423-431; Bachmann, Immunity 7 (1997), 549-557; Schwartz, Cell 71 81992), 1065-1068) denominadas colectivamente señales co-estimulantes (Perez, Immunity 6 (1997), 411). Estas proteínas de membrana pueden alterar la activación de células T de modos distintos (Bachmann, Immunity 7 (1997), 549-557) y regular la respuesta inmune mediante la integración de señales positivas y negativas por estas moléculas (Bluestone, Immunity 2 81995), 555-559; Perez, Immunity 6 (1997), 411). Muchos de los agentes que son efectivos en la modulación de la respuesta inmune celular interfieren con el receptor de célula T (Cosimi, Transplantation 32 (1981), 535-539), bloquean la señalización co-estimulante (Larsen, Nature 381 81996), 434-438, Blazar J. Immune, 157 (1996), 3250-3259; Kirk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 8789-8794; Linsley, Science 257 (1992), 792-95; Turka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 1102-11105, o inhiben las señales de activación intracelulares por debajo de estos detonadores primarios de membrana celular (Schreiber y Crabtree, Immunology Today (1992), 136-42). La prevención terapéutica de la activación de células T en el trasplante de órganos y las enfermedades autoinmunes se basa en la actualidad en fármacos inmunosupresores que interfieren con los eventos intracelulares cadena abajo de la vía de transducción de señales. La modulación específica de la respuesta inmune continúa siendo un objetivo a largo plazo en la investigación inmunológica.

En vista de la necesidad de medios terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad relacionada con las respuestas inmunes del cuerpo humano, el problema técnico de la presente invención es proporcionar medios y procedimientos para la modulación de la respuesta inmune como la ausencia de respuesta inmune en un individuo. La solución a dicho problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Según ello, en un aspecto de la presente invención se hace referencia a la utilización de un inhibidor que interfiere con la interacción entre TIRC7 y su ligando en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped, de la curación de heridas o para la inducción o mantenimiento de la ausencia de respuesta inmune en un individuo.

El término "TIRC7" tal como se utiliza según la presente invención, denota una proteína implicada en la transducción de señales de la activación y/o la proliferación de la célula T y que, preferentemente, en una forma soluble es capaz de inhibir o suprimir la proliferación de la célula T en respuesta a la aloactivación en un cultivo mixto de linfocitos, o en respuesta a mitógenos añadidos exógenamente al cultivo. La proteína TIRC7 traducida in vitro es capaz de suprimir eficientemente y de forma dependiente de la dosis la proliferación de células T en respuesta a la aloactivación en un cultivo mixto de linfocitos o en respuesta a un mitógeno. TIRC7 es una proteína conocida por los expertos en la materia y se describe en la patente internacional WO 99/117 y en Utku y col., Immnunity 9 (1998), 509, 518.

El término "inhibidor que interfiere en la interacción entre TIRC7 y su ligando" y según la presente invención se refiere a un agente capaz de inhibir y/o modular la interacción de TIRC7 con su ligando correspondiente. Ya que la interacción de TIRC7 con su ligando(s) modula eventos que son importantes durante el curso de la respuesta inmune, dichos inhibidores deberían ser capaces de modular la respuesta inmune. Según la presente invención, dicho inhibidor interacciona preferentemente con TIRC7-ligando, por ejemplo mediante la unión específica con el mencionado ligando. "Unión específica" significa "interacción específica con", cualquiera que sea dicha interacción, covalente, no-covalente y/o hidrofóbica. Dichos inhibidores se definen más abajo o pueden obtenerse por los procedimientos que aquí se describen. Los inhibidores potenciales incluyen moléculas pequeñas que se unen a, interfieren con y/o ocupan sitios relevantes en dicho ligando. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen los péptidos o moléculas de tipo peptídico pequeñas.

El término "con ausencia de respuesta inmune o inmuno-insensibles o sin respuesta inmune" se refiere a la ausencia de respuesta de subgrupos de células inmunes como células T, células B, células NK, monocitos y/o macrófagos. La ausencia de respuesta inmune puede mantenerse por el bloqueo de la estimulación de cada proteína del ligando que se une a TIRC7 en un individuo que presenta una enfermedad autoinmune con el fin de aliviar los síntomas de la enfermedad autoinmune. En estos casos, un TIRC7 o su agente inhibidor del ligando se administran al individuo en una cantidad y durante un período de tiempo suficientes como para mantener la ausencia de respuesta inmune. Alternativamente, la ausencia de respuesta inmune puede revertirse en un individuo que tenga un tumor con el fin de estimular una respuesta inmune específica o un individuo que reciba una vacuna para aumentar la eficacia de la vacuna. Por ejemplo, una célula (por ejemplo, una célula tumoral) puede modificarse para expresar el ligando TIRC7, o puede administrarse un agente estimulante de TIRC7 al individuo portador de un tumor o que tenga o haya tenido un tumor extraído quirúrgicamente para prevenir la recurrencia del mismo. Adicionalmente, la sensibilidad específica por el antígeno puede ser restaurada en las células inmunes inactivadas in vitro mediante la estimulación de células inmunes a través de TIRC7 o sus ligandos. A continuación, las células sensibles generadas in vitro pueden administrarse a un individuo.

Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se utilizan para obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de lo mismo y/o puede ser un efecto terapéutico en términos de curar parcial o completamente una enfermedad y/o un efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término "tratamiento" tal como se utiliza aquí abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular un humano, e incluye: (a) la prevención de la enfermedad en un individuo que puede estar predispuesto a padecerla pero a quien todavía no se le ha diagnosticado que la presente; (b) la inhibición de la enfermedad, es decir, el paro de su desarrollo; o (c) mitigar la enfermedad, es decir causar la regresión de la enfermedad.

Además, el término "individuo" tal como se utiliza aquí se refiere a animales que necesitan una mejora, un tratamiento y/o prevención de las enfermedades inmunológicas tal como se describe aquí. De preferencia, dicho individuo es un humano.

El ligando es la cadena alfa (\alpha) HLA-clase II (antígenos asociados a leucocitos humanos), también referido como la cadena-\alpha HLA-DR. Estos términos se utilizan aquí de forma intercambiable.

Dicho ligando de HLA-clase II es un heterodímero compuesto de dos glicoproteínas transmembrana, las cadenas alfa y beta. Orientadas con sus extremos amino-terminales hacia el exterior de la célula, ambas cadenas comprenden dos dominios extracelulares, cada uno de 90-100 aminoácidos, conectados a una cola corta citoplasmática por una secuencia aminoacídica hidrofóbica que facilita un paso único a través de la membrana celular. En la cadena alfa, el dominio distal de membrana es conocido como alfa 1 y el dominio proximal de membrana como alfa 2. De igual modo, en la cadena beta el dominio distal de membrana es conocido como beta 1 y el dominio proximal de membrana como beta 2. Ambos dominios proximales de membrana poseen características estructurales de dominios inmunes de globulina de tipo C1. Los dominios alfa 1 y beta 1 son polimórficos y están ocupados por péptidos (12-24 meros) que se exponen al receptor de célula T durante el curso de la activación de células T. Los estudios que utilizan mutantes de sitio específico han localizado en el mapa el sitio de unión de CD4 con la membrana proximal del dominio proximal beta 2 de la molécula HLA-clase II.

La expresión de ciertas moléculas HLA-clase II y sus polimorfismos se asocian fuertemente con varias enfermedades como la diabetes mellitus dependiente de insulina, el síndrome de Goodpasture, el pénfigo corriente, el lupus sistémico eritematoso, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Grave, la artritis reumatoide y la miastenia grave.

Muchas de las enfermedades asociadas con los polimorfismos HLA no implican infecciones activas y sus síntomas están causados por un estado crónico de inflamación y/o autoinmunidad. En el caso de la diabetes, un mecanismo general que se ha propuesto es que las células T activadas por la presencia de un antígeno microbiano reaccionen de forma cruzada con sus propios péptidos con quienes eran tolerantes antes de la activación. En consecuencia, las infecciones por el virus de Coxsackie se han relacionado con la diabetes y otras infecciones bacterianas del intestino con las enfermedades asociadas con HLA-clase II.

En las enfermedades infecciosas se conoce relativamente poco sobre los efectos de los polimorfismos HLA. De estudios en cohortes de pacientes con SIDA, se ha podido observar un efecto HLA, al igual que la rápida progresión de la enfermedad (Roger y col., Faseb, 12, 1998, pp. 625-32, Marsh, Parham y Barber, "The HLA-FACS Book", Academic Press (2000), 37-97).

Durante el desarrollo, la respuesta inmune humana se vuelve tolerante a componentes normales de las células y tejidos sanos a los que están expuestos los linfocitos. Es de especial importancia que un sistema inmune de una persona desarrolle tolerancia a los propios alotipos de clase I y II HLA expresados en la superficie de la célula de la propia persona. Por el contrario, un sistema inmune de una persona no es tolerante a muchos de los cientos de alotipos HLA no propios que son expresados por otro ser humano, como por ejemplo tras un trasplante de órganos. En consecuencia, cuando una persona recibe un trasplante, el rechazo agudo o hiperagudo del órgano trasplantado tiene lugar seguramente si el receptor y el donante no son compatibles con los tipos de antígenos HLA expresados en la superficie celular.

En el contexto de la presente invención, se halló de modo sorprendente que la cadena \alpha de HLA-clase II es capaz de interactuar con TIRC7, tal como se muestra en los ejemplos anexados. En consecuencia, y sin abrazar ninguna teoría, se cree que la interferencia con dicha unión/interacción entre TIRC7 y la cadena \alpha de HLA-clase II conduce a modificaciones de la respuesta celular debido a la interacción receptor/ligando correspondiente. Dichas modificaciones comprenden, pero no se limitan a, respuestas celulares inhibidoras y estimulantes. Sin embargo, independientemente de la teoría que se halle detrás del mecanismo molecular de acción, un inhibidor para utilizar según la presente invención puede caracterizarse por (1) interacción/unión a TIRC7 o su ligando, y (2) ser capaz de inhibir la proliferación de PBMCs estimulados por mitógenos en un ensayo tal como se describe en la patente internacional WO99/11782 y en Utku y col., Immunity 9 (1998), 509-518. Preferentemente, dicho inhibidor interacciona/se une al mencionado ligando de TIRC7 o a TIRC7 directamente de modo que dicho inhibidor evita que el ligando interaccione con TIRC7, por ejemplo al ocupar el sitio de TIRC7 con el que el ligando interacciona. Tal como se mencionó anteriormente, dicho ligando es la cadena \alpha de HLA-clase II. Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de la cadena \alpha HLA-clase II y HLA-DR son conocidas por los expertos en la materia y pueden obtenerse de bases de datos públicas, por ejemplo, correspondientes con los números de acceso de GenBank V00523 y M60334. Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de la cadena \alpha de HLA-clase II que se han identificado según la presente invención se muestran en la SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2, respectivamente.

Según ello, en una realización preferida de la presente invención, dicho inhibidor se selecciona a partir del grupo que consiste en:

(a) un agente de unión para y/o interferir con un (poli)péptido o un(os) fragmento(s) de lo mismo que comprenden una secuencia aminoacídica tal como se describe en la SEC ID NO:

(b) un agente de unión para un (poli)péptido o un(os) fragmento(s) de lo mismo codificados por un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica, tal como se describe en la SEC ID NO:1; y

(c) un análogo o derivado del (poli)péptido o fragmento(s) de lo mismo, tal como se define en (a) o (b);

Los antígenos de histocompatibilidad principal (MHC) de clase II están compuestos por dos cadenas polipeptídicas asociadas de forma no covalente, las cadenas beta 2 y alfa 2 que contienen puentes de disulfuro internos y se diferencian por su secuencia aminoacídica. Estas moléculas pertenecen a la superfamilia de Ig, y las cadenas alfa 1 y beta 1 corresponden con el dominio de unión peptídica de las moléculas de MHC clase II. La expresión diferencial de las moléculas MHC en diferentes tipos celulares determina si los linfocitos T pueden interactuar con los antígenos foráneos presentes en la superficie de estas células. Las moléculas MHC de clase II se expresan en la mayoría de células humanas inmunes y no inmunes. La expresión de productos génicos de MHC está regulada principalmente a nivel de la transcripción tanto por los factores específicos de tipo celular como por los estímulos inflamatorios e inmunes, incluyendo citoquinas como la IFN-gamma. Algunas células como los macrófagos pueden ser inducidas a expresar moléculas de clase II por las citoquinas, especialmente la IFN-gamma, mientras que otras células y los linfocitos B expresan de forma constitutiva moléculas de clase II. La activación de células auxiliares T CD4 por el antígeno requiere la participación de células distintas a los linfocitos T; estas células se denominan a menudo células auxiliares y expresan moléculas MHC de clase II en su superficie. La función obligatoria de las células auxiliares en la activación de linfocitos se continúa en dos vías:

En primer lugar, las células auxiliares son células presentadoras de antígeno (APC), que convierten los antígenos proteicos en péptidos y que presentan complejos péptidos-MHC en una forma tal que puedan ser reconocidos por las células T CD4+. La conversión de proteínas nativas a fragmentos de péptidos asociados a MHC por APC se denomina procesamiento antigénico. La segunda función de las células auxiliares es proporcionar estímulos a la célula T, más allá de los iniciados por los complejos péptido-MHC que se unen al receptor antigénico de célula T. Estos estímulos, referidos como actividades co-estimulantes, son necesarios para la activación fisiológica completa de células T, la cual es inducida por los productos de unión a membrana o los productos secretados por las células
auxiliares.

La respuesta inmune es altamente dependiente de una exposición satisfactoria de los antígenos a las células T, mediante la exposición de moléculas MHC de clase I o II sobre las células APC. En el caso de una exposición antigénica insuficiente a las células CD4, la generación de la respuesta inmune no tendrá lugar. En su lugar, se instaurará una insensibilidad o ausencia de respuesta. Ello conducirá a una disminución significativa de la capacidad del sistema inmune para destruir las partículas foráneas requeridas en por ejemplo las enfermedades infecciosas, la curación de heridas y sepsis. Tal como demostraron Utku y col., Immunity 9 (1998), 509-518, dirigir anticuerpos específicos contra TIRC7 como diana inhibe la respuesta inmune y disminuye la expresión de citoquinas de linfocitos de tipo TH-1, como la IFN-gamma.

En el contexto de la presente invención, se halló de forma sorprendente que el polipéptido, tal como se describe en la SEC ID NO:2, es una proteína capaz de interactuar con TIRC7, el cDNA del cuale se aisló mediante cribado de una librería de dobles híbridos de levaduras a partir de linfocitos humanos contra el polipéptido TIRC7. Tal como se mencionó anteriormente, la SEC ID NO:2 y su secuencia nucleotídica codificante, tal como se describe en la SEC ID NO:1, hacen referencia a la cadena-\alpha HLA-DR. HLA-DR se une a/interacciona con TIRC7, tal como se muestra en los ejemplos anexados. En consecuencia, y sin abrazar ninguna teoría, se cree que dicha unión/interacción conduce a modificaciones de las respuestas celulares frente a la interacción del receptor/ligando correspondiente. Dichas modificaciones comprenden, pero no se limitan a, respuestas celulares inhibidoras y estimulantes.

El término "agente" tal como se utiliza aquí hace referencia a moléculas de tipo (poli)péptido, sustancias orgánicas y/o inorgánicas, así como a moléculas sintetizadas sintéticamente. Por ejemplo, el mencionado "agente" puede comprender "moléculas pequeñas", como péptidos, sustancias orgánicas y/o inorgánicas o moléculas de tipo peptídico, como análogos peptídicos que comprenden aminoácidos D. El mencionado "agente" también puede comprender moléculas de ácido nucleico, como (oligo)nucleótidos específicos, PNAS y/o aptámeros. Según la presente invención el término "agente" tal como se utiliza aquí abarca sustancias que pueden ser una sola o múltiples sustancias, que a su vez pueden o no ser idénticas. Dicho agente/compuesto puede hallarse, por ejemplo, en todos los extractos de plantas, animales o microorganismos.

El polipéptido mencionado anteriormente tal como se indica en la SEC ID NO:2 se deriva de un clon de cDNA "cribado de cDNA-7", tal como se ilustra en los ejemplos anexados. Según la presente invención, el polipéptido mencionado anteriormente que corresponde a HLAII-DR comprende no sólo la secuencia aminoacídica exacta de la SEC ID NO:2, sino también los polipéptidos que comprenden secuencias aminoacídicas con una homología con la secuencia aminoacídica mencionada y son capaces de funcionar como la molécula HLA-DR (producto génico del "cribado de cDNA-7"), tal como se describe aquí. Estas secuencias aminoacídicas homólogas pueden comprender, entre otras cosas, "variantes" de HLA-DR. El término "variante" comprende, pero no se limita a variantes alélicas, variantes de ayuste del mRNA, variantes producidas sintéticamente o diseñadas por ingeniería genética. Estas variantes pueden variar a nivel polinucleotídico y/o polipeptídico. Alternativamente, las variantes no naturales también están comprendidas como las parejas de unión del agente identificado anteriormente. Estas variantes no naturales pueden estar producidas, entre otras cosas, por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa. En consecuencia, un(os) agente(s)
de unión a y/o interferencia con el polipéptido definido aquí anteriormente también hace referencia a los agentes capaces de interactuar con, unirse a y/o interferir con dichas variantes. Según ello, el término "fragmento(s)" tal como se ha utilizado más arriba en la presente invención hace referencia a péptidos y polipéptidos que se derivan de la mencionada molécula HLA II-DR y que son capaces de unirse y/o interactuar con el agente mencionado anteriormente.

El término "análogo o derivado" del polipéptido o fragmento de lo mismo, tal como se utiliza, aquí hace referencia a los análogos o derivados de la secuencia aminoacídica que se muestra en la SEC ID NO:2 y/o HLAII-DR al contrario que las variantes definidas más arriba de la mencionada molécula que es capaz de inhibir específicamente la interacción de HLAII-DR y TIRC7. Estos análogos/derivados, en consecuencia, comprenden, entre otras cosas, moléculas HLAII-DR modificadas química y/o genéticamente que no son capaces de provocar respuestas fisiológicas y/o celulares mediadas normalmente por interacciones HLAII-DR-TIRC7. Estos análogos y/o derivados también pueden, según la invención, ser proteínas de fusión y/o polipéptidos mosaico que comprendan HLAII-DR y/o fragmentos de lo mismo en combinación con otras moléculas o fragmentos polipeptídicos capaces de interferir con la interacción HLAII-DR - TIRC7 mencionada más arriba. El experto en la materia conocerá todas las técnicas/procedimientos para la preparación de dichos análogos/derivados, proteínas de fusión y/o polipéptidos mosaico; véase, entre otros, Sambrook y col. (Molecular cloning; A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor NY (1989)), o Oxender y Fox (1987) "Protein engineering", Liss New York. Estas técnicas comprenden, por ejemplo, técnicas de mutagénesis y síntesis directa bioquímica y/o química. De acuerdo con ello, dichos análogos/derivados pueden ser moléculas de origen natural, sintético, o semi-sintético.

En una realización preferida de la presente invención, dicho inhibidor es un aptámero o anticuerpo que se une específicamente a la cadena \alpha HLA-II. Se cree que el bloqueo de la unión de TIRC7 mediante la utilización de dichos anticuerpos anti-HLA-DR conduce al bloqueo de señales positivas y en consecuencia a la inhibición de la proliferación, por tanto es de gran importancia modular estas reacciones inmunes no deseadas.

El término "aptámero" significa molécula de ácido nucleico que puede unirse a una molécula diana, según la presente invención, es decir, la molécula diana HLAII-DR tal como se definió anteriormente. Los aptámeros comprenden generalmente RNA, ssDNA, RNA/DNA modificados. La preparación de aptámeros es conocida en la materia y puede implicar, por ejemplo, la utilización de librerías combinatoriales para identificar sitios de unión (Gold, Ann. Rev. Biochem. 64 (1995), 736-797).

Tal como se mencionó anteriormente, los inhibidores son capaces de interferir con la interacción de TIRC7 con
su(s) ligando(s) que también pueden comprender anticuerpos de unión específica con moléculas HLAII-DR tal como se define aquí. Dichos anticuerpos pueden comprender anticuerpos monoclonales, policlonales, sintéticos, quiméricos, humanizados, xenogénicos y/o semi-sintéticos. El término "anticuerpo" comprende los fragmentos como Fab, Fv o scFv. Los anticuerpos, fragmentos de éstos y derivados pueden producirse y/o obtenerse mediante procedimientos conocidos tal como se describe por ejemplo en Harlow y Lane "Antibodies, a Laboratory Manual" CSH Press, 1988. La preparación de anticuerpos quiméricos se describe en la patente internacional WO 89/09622.

Además, la presente invención hace referencia a la utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica el mencionado inhibidor para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno inmunológico, como la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, para el tratamiento de tumores, para la mejora de la curación de heridas o para la inducción o mantenimiento de la ausencia de respuesta en un individuo. Las moléculas de ácido nucleico tal como se utilizan en la presente invención comprenden RNA, mRNA, DNA y cDNA. El término también comprende PNAs. Además, la presente invención hace referencia a la utilización de un vector que comprende la molécula de ácido nucleico tal como se describe sobre la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de los trastornos inmunológicos definidos anteriormente, o para la mejora de la curación de heridas, o para la inducción o mantenimiento de la ausencia de respuesta inmune en un individuo. El vector de la presente invención puede ser un plásmido, cósmido, virus u otro vector utilizado, por ejemplo, en aproximaciones de terapia génica. Para más detalles, véase por ejemplo Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis (véase más arriba), secuenciación, introducción de DNA en las células y expresión génica, y análisis de proteínas, tal como se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausuble y col., John Wiley & Sons, 1994 y ediciones actualizadas.

Además, la presente invención hace referencia a un procedimiento para la identificación de un agente capaz de interferir con la interacción entre TIRC7 y su ligando que comprende las etapas de:

(a) analizar una colección de (poli)péptidos o sustancias por su capacidad para inhibir la interacción entre TIRC7 y HLAII-DR utilizando un sistema de lectura adecuado; y

(b) identificar (poli)péptidos o sustancias que sean positivas para la inhibición de la interacción de TIRC7 con su ligando en la etapa (a).

La prueba mencionada anteriormente de la etapa (a) puede comprender, entre otras cosas, el analizar si dichos (poli)péptidos o sustancias (por ejemplo, los agentes definidos aquí) en ensayos que permitan la detección de la unión de moléculas HLAII-DR. Estos (poli)péptidos o sustancias pueden, mediante la unión específica a moléculas HLAII-DR, ser capaces de interferir con la vía de señalización TIRC7-HLAII-DR. Dicha "prueba para la capacidad de interferir/inhibir" entre TIRC7 y su ligando puede, en consecuencia, llevarse a cabo mediante ensayos inmunológicos y/o bioquímicos conocidos en la materia. Dichos ensayos comprenden la cuantificación de la formación de complejos, ensayos en donde las parejas de unión se detectan, por ejemplo mediante ELISA, RIAs y otros. Dichos ensayos de interacción pueden también comprender sistemas de lectura conocidos en la materia como los sistemas del doble híbrido, en donde, entre otras cosas, pueden detectarse las parejas de unión de HLAII-DR (las cuales pueden utilizarse para interferir con la interacción HLAII-DR-TIRC7) o en ensayos de unión in vitro. Dichos ensayos y los sistemas de lectura correspondientes también pueden comprender la detección de la formación de complejos y/o la inhibición de la formación de dichos complejos. Por ejemplo, se puede analizar si in vitro se forma un complejo de TIRC7/HLAII-DR (o fragmentos de lo mismo) en presencia del (poli)péptido, sustancia, o agente a ser detectado. Los sistemas de lectura en este complejo pueden ser, entre otras cosas, equipos fluorescentes e inmunoensayos, como los ensayos de inmunoprecipitación. También se puede contemplar utilizar un cribado de alto rendimiento en los procedimientos de la presente invención.

En una realización, la invención hace referencia a un procedimiento para la identificación y aislamiento de un agente para el tratamiento de enfermedades inmunes que comprende las etapas siguientes de:

(a) cribado de una célula huésped que comprende un gen reportero cuya transcripción está directa o indirectamente activada por dímeros que comprenden TIRC7 y la cadena \alpha HLA-clase II o sus dominios de unión correspondientes que interaccionan con el compuesto a analizar; y

(b) selección de un compuesto que reprima la activación del gen reportero.

Los compuestos que evitan la formación de complejos diméricos o multiméricos que comprenden TIRC7 y la cadena \alpha HLA-clase II puede utilizarse como una intervención terapéutica en enfermedades asociadas con TIRC7. De acuerdo con ello, esta realización de la invención proporciona un procedimiento para el descubrimiento de compuestos que inhiben la transducción de señal asociada con la cadena \alpha HLA-clase II y mediada por TIRC7 en las respuestas del sistema inmune. El ajuste básico para los ensayos según el procedimiento de la presente invención es bien conocido por el experto en la materia. Esto puede lograrse mediante ensayos bien conocidos en la materia, por ejemplo, tal como se describe por Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065) mediante la utilización del sistema de levaduras denominado "doble híbrido". En este sistema la proteína codificada por TIRC7 que codifica las moléculas de ácido nucleico o una parte menor pueden estar unidas al dominio de unión al DNA del factor de transcripción GAL4. Una cepa de levadura que expresa la proteína de fusión y que comprende un gen reportero lacZ conducido por un promotor adecuado, que es reconocido por el factor de transcripción GAL4, se transforma con un vector que expresa el ligando proteico de TIRC7 o los péptidos de lo mismo fusionado a un dominio de activación. En consecuencia, en ausencia de sustancias que interfieran con la formación de complejos diméricos o multiméricos que comprenden TIRC7 y el mencionado ligando, por ejemplo, cadena \alpha HLA-clase II, el complejo es capaz de dirigir la expresión del gen reportero. Por ejemplo, en función de lo anterior puede adaptarse el sistema de ensayo del doble híbrido descrito en los Ejemplos. Por tanto, ya no se utiliza el cribado de una pareja de interacción de TIRC7 para la identificación de sustancias que interfieran con la interacción entre TIRC7 y su pareja de unión ya identificada, es decir, la cadena \alpha HLA-clase II. En una realización preferida del procedimiento descrito anteriormente, la célula huésped utilizada en el ensayo de cribado comprende por lo menos un vector que contiene una molécula de DNA que codifica al menos una cadena \alpha HLA-clase II o un fragmento de lo mismo unido operativamente con un dominio de transactivación o de unión al DNA. Una estrategia similar puede lograrse con el sistema del triple híbrido.

Otros procedimientos para la identificación de compuestos que interfieren con la formación de dímeros o complejos multiméricos que comprenden TIRC7 y el mencionado ligando, por ejemplo la cadena \alpha HLA-clase II son, por ejemplo, el cribado in vitro con el sistema de expresión en fagos así como los ensayos de unión en filtros, o la cuantificación a "tiempo real" de la interacción utilizando, por ejemplo, el aparato BIAcore (Pharmacia); véanse las referencias citadas supra.

En una realización preferida, la presente invención hace referencia a un procedimiento para la identificación de un agente capaz de interferir con la interacción entre TIRC7 y su ligando, que comprende además la etapa

(c) repetición de las etapas (a) y (b) con los (poli)péptidos o sustancias identificadas una o más veces, en donde el (poli)péptido o sustancia recién identificada reemplaza el (poli)péptido o sustancia identificada con anterioridad como un cebo para la identificación de un (poli)péptido o sustancia de interacción.

Adicionalmente, la presente invención hace referencia a un procedimiento de identificación y obtención de un (poli)péptido implicado en la regulación de la respuesta inmune en un individuo que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una colección de (poli)péptidos con un(os) (poli)péptido(s) o fragmento(s) de lo mismo que tengan una secuencia aminoacídica tal como se describe en la SEC ID NO:2, o estén codificados por la SEC ID NO:1, o sean obtenibles por los procedimientos que se describen aquí, en condiciones adecuadas que permitan la unión de dichos (poli)péptidos;

(b) eliminar de la mencionada colección de (poli)péptidos aquellos (poli)péptidos que no se unan al mencionado (poli)péptido(s) o fragmentos de lo mismo tal como se define en (a); y

(c) identificar los (poli)péptidos que se unan al mencionado (poli)péptido(s) o fragmentos de lo mismo tal como se definió anteriormente en (a).

Los compuestos y la colección de (poli)péptidos que pueden analizarse e identificarse según un procedimiento de la presente invención pueden ser librerías de expresión, por ejemplo, librerías de expresión de cDNA, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, péptidomiméticos, PNAS o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (19959, 237-245:Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 y las referencias citadas supra). En una realización preferida de cualquiera de los procedimientos descritos más arriba de la invención, se utilizaron lisados celulares derivados de, por ejemplo, tejido tumoral o células del sistema inmune, más preferentemente se utiliza un lisado de linfocitos humanos; véanse los Ejemplos y la Figura 3.

Además, la presente invención hace referencia a un procedimiento de perfeccionamiento de un inhibidor tal como se define aquí o un agente o (poli)péptido identificados por los procedimientos, tal como se describe aquí, que comprenden:

(a) modelado del mencionado agente o (poli)péptido mediante péptidomiméticos; y

(b) síntesis química del compuesto modelado.

Por tanto, los procedimientos descritos más arriba pueden, desde luego, combinarse con una o más etapas de cualquiera de los procedimientos de cribado descritos anteriormente y que son bien conocidos en la materia. Los procedimientos para el descubrimiento de compuestos de aplicación clínica comprenden por ejemplo el cribado de alto rendimiento (Sundberg, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 47-53) para dirigir la identificación, y el diseño de fármacos basado en la estructura (Veninde y Hol, Structure 2 (1994), 577-587) y la química combinatorial (Salemme y col., Structure 15 (1997), 319-324) para su optimización. Una vez se ha seleccionado el fármaco, el procedimiento puede tener una etapa adicional de repetición del procedimiento utilizado para realizar el diseño racional de fármacos mediante la utilización del fármaco modificado y para valorar si dicho fármaco modificado presenta una mejor afinidad de acuerdo con, por ejemplo, el análisis de interacción/energía.

De acuerdo con lo anterior, los compuestos aislados por los procedimientos indicados más arriba también pueden servir como compuestos líder para el desarrollo de compuestos análogos. Los análogos deberían tener una configuración electrónica y una conformación molecular estable que permita exponer los grupos funcionales clave al TIRC7 o su ligando en esencialmente la misma forma que el compuesto líder. En particular, los compuestos análogos tienen propiedades electrónicas espaciales que son comparables con la región de unión, pero pueden ser moléculas más pequeñas que el compuesto líder, frecuentemente tienen un peso molecular por debajo de los 2 KD y preferentemente por debajo de 1 KD. La identificación de compuestos análogos puede realizarse a través de la utilización de técnicas como el análisis del campo autoconsistente (SCF), el análisis de interacción de la configuración (CI), y el análisis dinámico del modo normal. Los programas informáticos para la implementación de estas técnicas están disponibles, por ejemplo, en Rein, Computer-Assisted Modeling or Receptor-ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Los procedimientos para la preparación de derivados y análogos químicos es bien conocida por los expertos en la materia y se describe, por ejemplo, en Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edición New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. y Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Además, los mencionados derivados y análogos pueden analizarse por sus efectos de acuerdo con los procedimientos conocidos en la materia; véase también supra. También es posible utilizar los péptidomiméticos y/o el diseño con ayuda informática de los derivados o análogos adecuados, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos descritos más arriba. Los procedimientos para la generación del compuesto líder en el descubrimiento de fármacos también incluye la utilización de proteínas y procedimientos de detección como la espectrometría de masas (Cheng y col., J. Am. Soc. 117 (1995), 8859-8860) y algunos procedimientos de resonancia magnética nuclear (RMN) (Fejxo y col., Chem. Biol. 6 (1999), 755-769; Lin y col.,J. Org. Chem. 62 (1997), 8930-8931).

El inhibidor, los agentes y los (poli)péptidos utilizados en las composiciones de la presente invención tienen preferentemente una especificidad de unión esencialmente idéntica a la especificidad del TIRC7 con su ligando, siendo dicho ligando la cadena \alpha HLA-clase II, en particular si se desea la estimulación de TIRC7. Un inhibidor puede tener una afinidad de unión con la cadena \alpha HLA de clase II de al menos 10^{-5} M^{-1}, preferentemente superior a 10^{7} M^{-1} y ventajosamente de hasta 10^{10} M^{-1} en el caso de que deba suprimirse la proliferación mediada por TIRC7 de las células inmunes. En una realización preferida, un agente supresor o inhibidor tiene una afinidad de al menos 10^{-7} M, preferentemente de al menos 10^{-8} M y más preferentemente de al menos 10^{-11} M. En el caso de moléculas de ácido nucleico antisentido es preferible que tengan una afinidad de unión con las codificantes de la cadena \alpha HLA-clase II de al menos 2, 5, o 10 veces menos que un complemento exacto de 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia codificante.

Preferentemente, el inhibidor, agente o (poli)péptido no es más grande que "la pared de biodisponibilidad" de 500-600 Da para que pueda ser capaz de atravesar la membrana celular lipofílica y dirigirse al interior de la célula. Por otra parte, en la terapia de proteínas, se ha demostrado recientemente que las enzimas fusionadas con parte de una proteína del virus VIH pueden atravesar las membranas celulares al tiempo que retienen su actividad enzimática in vivo en los ratones (Schwarze, Science 285 (1999), 1569-1572). Se conoce desde hace aproximadamente 10 años que la proteína reguladora transactivadora (proteína TAT) del virus HI tiene una capacidad inusual para atravesar las membranas celulares sin la necesidad de utilizar receptores o transportadores, ni requerir ATP (Green y Loewenstein, Cell 55 (1988), 1179-1188). Aunque su mecanismo exacto se desconoce, se ha demostrado que el dominio de transducción proteico (PTD) de TAT abre un "agujero" en la bicapa lipídica de la membrana celular, empujando a través éste a cualquier cosa unida covalentemente a esta proteína, antes de cerrarse de nuevo dicho agujero. Este es un proceso específico que no lesiona la célula. Por tanto, un agente inhibidor funcional o (poli)péptido identificado por un procedimiento de la presente invención puede estar conjugado a un PTD mediante un engarce con el fin de permitir que atraviese la membrana celular; véase también para una revisión DDT 4 (1999), 537.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una composición que comprende la formulación del inhibidor tal como se describe aquí, un agente identificado por los procedimientos tal como se describe aquí, el (poli)péptido identificado por el procedimiento tal como se describe aquí o un agente o (poli)péptido perfeccionado por el procedimiento tal como se describe aquí y, opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Una vez el fármaco se ha seleccionado según cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente de la presente invención, es posible sintetizar el fármaco o un pro-fármaco de lo mismo en una cantidad efectiva terapéuticamente. Tal como se utiliza aquí, el término "cantidad efectiva terapéuticamente" significa la cantidad total del fármaco o pro-fármaco que es suficiente para mostrar un beneficio importante en el paciente, es decir, tratamiento, curación, prevención o mejoramiento de, por ejemplo, una enfermedad inmune, o un aumento en la tasa de tratamiento, curación, prevención o mejoramiento de dichas condiciones. Adicional o alternativamente, en relación con la prueba pre-clínica del fármaco, el término "cantidad efectiva terapéuticamente" incluye la cantidad total del fármaco o profármaco que es suficiente para provocar una respuesta fisiológica, preferentemente tras su unión con su diana TIRC7 o su ligando, en una prueba con un animal no humano.

Después de la administración in vivo, se metabolizan los fármacos o pro-fármacos con el fin de eliminarlos por excreción o convertirlos por el metabolismo en uno o más metabolitos activos o inactivos (Meyer, J. Pharmacokinet Biopharm. 24 (1996), 449-459). Por tanto, en lugar de utilizar el compuesto actual o el fármaco identificado y obtenido según los procedimientos de la presente invención, es posible utilizar una formulación correspondiente como un profármaco, el cual se convierte en su forma activa en el paciente. Las medidas de precaución que deben tenerse en cuenta en la aplicación de profármacos y fármacos se describen en la literatura; véase, para un resumen, Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329.

En una realización preferida, la presente invención hace referencia al procedimiento tal como se describe aquí, en donde la composición es una composición farmacéutica. Para esta realización, cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente pueden comprender las etapas de (a) modificación de un agente identificado por el procedimiento de la invención como un compuesto líder para lograr (i) un sitio de acción modificado, espectro de actividad, especificidad de órgano, y/o (ii) potencia mejorada, y/o (iii) toxicidad disminuida (índice terapéutico mejorado), y/o (iv) efectos secundarios reducidos, y/o (v) modificación de la aparición de la acción terapéutica, duración del efecto modificado, y/o (vi) parámetros farmacocinéticos modificados (resorción, distribución, metabolismo y excreción), y/o (vii) parámetros físico-químicos modificados (solubilidad, higroscopicidad, color, sabor, olor, estabilidad, estado), y/o (viii) especificidad general, especificidad de órgano/tisular mejoradas, y/o (ix) forma y vía de aplicación optimizadas mediante (i) esterificación de grupos carboxilo, o (ii) esterificación de grupos hidroxilo con ácidos de carbono, o (iii) esterificación de grupos hidroxilo a, por ejemplo, fosfatos, pirofosfatos o sulfatos o hemisuccinatos, o (iv) formación de sales aceptables farmacéuticamente, o (v) formación de complejos aceptables farmacéuticamente, o (vi) síntesis de polímeros activos farmacológicamente, o (vii) introducción de porciones hidrofílicas, o (viii) introducción/intercambio de sustituyentes en cadenas aromáticas o laterales, cambio del patrón del sustituyente, o (ix) modificación mediante la introducción de porciones isostéricas o bioisostéricas, o (x) síntesis de compuestos homólogos, o (xi) introducción de cadenas laterales ramificadas, o (xii) conversión de sustituyentes alquil a análogos cíclicos, o (xiii) derivación del grupo hidroxilo a quetalos, acetalos, o (xiv) N-acetilación a amidas, fenilcarbamatos, o (xv) síntesis de bases
Mannich, iminas, o (xvi) transformación de cetonas o aldehídos a bases de Schiffs, oximas, acetalos, quetalos, enolesteres, oxazolidinas, tiozolidinas o combinaciones de lo mismo; y (b) formulación del producto de dicha modificación con un vehículo aceptable farmacéuticamente.

Las diversas etapas citadas más arriba son bien conocidas en la materia. Éstas incluyen o se basan en la relación cuantitativa de estructura-acción. Análisis (QSAR) (Kubinyi, I. Med. Chem. 41 (1998), 22553-2564; Pharm., Unserer Zeit 23 (1994), 281-290), bioquímica combinatorial, química clásica y otros.

El término "composición farmacéutica", en el contexto de esta invención, opcionalmente, comprende además otras moléculas, solas o en combinación, como por ejemplo moléculas que son capaces de modular y/o interferir con el sistema inmune. La composición farmacéutica puede estar en la forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otras cosas, en un forma de un(os) polvo(s), una(s) tableta(s), una(s) solución(es) o un(os) aerosol(es).

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un vehículo aceptable farmacéuticamente. Ejemplos de vehículos aceptables farmacéuticamente son bien conocidos en la materia e incluyen las soluciones salinas tamponadas con fosfato, el agua, las emulsiones, como las emulsiones aceite-agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la materia. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al individuo a una dosis adecuada. La administración de composiciones adecuadas puede efectuarse por diferentes vías, por ejemplo, por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. El régimen de dosificación estará determinado por el médico y los factores clínicos. Tal como es bien conocido en el campo de la medicina, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto determinado a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que puedan administrarse
concurrentemente.

Además, la presente invención hace referencia a la utilización de un inhibidor tal como se describe aquí, de un agente o de un (poli)péptido tal como se identifica por los procedimientos descritos aquí, o de un inhibidor tal como se perfecciona por el procedimiento descrito aquí para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, para el tratamiento de tumores, para la mejora de la curación de la herida o para la inducción o el mantenimiento de la ausencia de respuesta en un individuo.

Adicionalmente, la presente invención hace referencia a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor, una molécula de ácido nucleico y/o un agente tal como se define aquí y/o un (poli)péptido identificado por el procedimiento aquí descrito.

La presente invención, hace referencia además a un animal transgénico que sobreexpresa un producto génico codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica tal como se definió más arriba. Además, la presente invención también proporciona un animal transgénico no humano, en donde la molécula de ácido nucleico tal como se define aquí, o un homólogo, parálogo, u ortólogo de lo mismo se silencia y/o se muta. Dichos animales transgénicos no humanos son de especial interés para la investigación médica o científica y pueden comprender animales como los ratones, las ratas, los perros, las ovejas y similares, así como animales no vertebrados como C. elegans o Drosophila. El animal no humano puede utilizarse según un procedimiento de cribado de la invención aquí descrito. La producción de embriones transgénicos y el cribado de aquellos que puedan realizarse, por ejemplo, tal como se describe en A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. El DNA de las membranas embrionales puede utilizarse utilizando, por ejemplo, transferencias de Southern con una sonda adecuada.

Además, la presente invención hace referencia a la utilización de la cadena \alpha HLA-clase II o un fragmento o derivado de la mima para la identificación de fármacos para el tratamiento de una enfermedad inmune o un tumor o un ligando en cualquiera de los procedimientos definidos anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención hace referencia a un procedimiento de diagnóstico de una condición patológica, o una susceptibilidad a una condición patológica en un individuo que está relacionada con una enfermedad mediada por o que responde a la actividad de TIRC7, dicho procedimiento comprende:

(a) la determinación de la presencia o ausencia de una mutación en un polinucleótido que codifica la cadena \alpha de HLA clase II; y

(b) el diagnóstico de una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica basada en la presencia o ausencia de la mencionada mutación.

Además, la presente invención hace referencia a un procedimiento de diagnóstico de una condición patológica, o una susceptibilidad a una condición patológica en un individuo que está relacionada con una enfermedad mediada por o que responde a la actividad de TIRC7; dicho procedimiento comprende:

(a) la determinación de la presencia o la cantidad de expresión de un polipéptido de la cadena \alpha HLA-clase II en una muestra biológica; y

(b) el diagnóstico de una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica basada en la presencia o en la cantidad de expresión del polipéptido.

En estas realizaciones, los polinucleótidos de la cadena \alpha HLA de clase II, las moléculas de ácido nucleico, (poli)péptido, anticuerpos o compuestos identificados anteriormente se marcan preferentemente de forma detectable. Están disponibles diversas técnicas para el marcaje de biomoléculas, las cuales son bien conocidas en la materia y se consideran que se hallan dentro del ámbito de la presente invención. Dichas técnicas están, por ejemplo, descritas en Tijsen "Practice and theory of enzyme immuno assays", Burden, RH arid von. Knippenburg (Ed), volumen 15 (1985), "Basic methods in molecular biology", Davis, LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer y col., (Eds) "Immunochemical methods in cell and molecular biology", Academic Press, London (1987), o en las series "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. Existen muchos y distintos marcajes y procedimientos de marcaje conocidos por los expertos en la materia. Los marcajes más comúnmente utilizados comprenden, entre otras cosas, los fluorocromos (como la fluoresceína, la rodamina, el Texas Red, etc.), las enzimas (como la peroxidasa de rábano, la \beta-galactosidas, la fosfatasa alcalina), los isótopos radiactivos (como el P^{32} o I^{125}), la biotina, la digoxigenina, los metales coloidales, los compuestos quimio o bioluminiscentes (como los dioxetanos, el luminol, o las acridinas). Los procedimientos de marcaje, como el acoplamiento covalente de enzimas o de grupos biotinilados, la yodinación, las fosforilaciones, las biotinilaciones, el cebado aleatorio, el desplazamiento de rotura, el marcaje terminal (mediante la utilización de la terminal transferasa) son bien conocidos en la materia. Los procedimientos de detección comprenden, pero no se limitan a, la autorradiografía, la microscopía fluorescente, las reacciones enzimáticas directas o indirectas, etc.

Además, los compuestos descritos anteriormente pueden unirse a una fase sólida. Las fases sólidas son bien conocidas por los expertos en la materia y pueden comprender bolas de poliestireno, bolas de látex, partículas de metal coloidal, vidrio y/o chips y superficies de silicio, bandas de nitrocelulosa, membranas, hojas, glóbulos rojos de animales, o fantasmas de glóbulos rojos, duracitos y las paredes de los pocillos de una placa de reacción, tubos de plástico u otros tubos de ensayo. Los procedimientos adecuados de inmovilización de los ácidos nucleicos de la cadena \alpha HLA-clase II, (poli)péptidos, proteínas, anticuerpos, etc. en fases sólidas incluyen pero no se limitan a las interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y similares. La fase sólida puede retener uno o más receptores adicionales que tengan la capacidad de atraer e inmovilizar la región tal como se definió anteriormente. Este receptor puede comprender una sustancia cargada que esté cargada opuestamente respecto al propio reactivo, o a una sustancia cargada conjugada con el reactivo de captura. O el receptor puede ser cualquier pareja de unión específica que esté inmovilizada sobre (enganchada a) la fase sólida y que sea capaz de inmovilizar el reactivo tal como se definió más arriba.

Los ensayos de detección utilizados pueden comprender procedimientos radioisotópicos o no radioisotópicos. Estos comprenden, entre otras cosas, RIA (Radioisotopic Assay) e IRMA (Ensayo Radioinmunométrico inmune), EIA (Ensayo Inmuno Enzimático), ELISA (Ensayo Inmune Ligado a Enzimas), FIA (Ensayo Inmune Fluorescente), y CLIA (Ensayo Inmune Quimioluminiscente). Otros procedimientos de detección que se utilizan en la materia son aquellos que no utilizan moléculas marcadoras. Un prototipo de estos procedimientos es el ensayo de aglutinación, basado en la propiedad de una molécula dada para unir al menos dos partículas.

Para el diagnóstico y la cuantificación de (poli)péptidos, polinucleótidos, etc. en muestras clínicas y/o científicas, se han desarrollado una gran diversidad de procedimientos inmunológicos, tal como se describió anteriormente al igual que para los procedimientos de biología molecular, como los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, los ensayos de PCR o los inmunoensayos enzimáticos de DNA (Mantero y col., Clinical Chemistry 37 (1991), 422-429), ensayos que son bien conocidos en la materia. En este contexto, debería hacerse notar que las moléculas de ácido nucleico de la cadena \alpha HLA de clase II también pueden comprender PNAs, análogos de DNA modificado que contienen uniones de esqueleto amida. Dichos PNAS son útiles, entre otras cosas, como sondas para la hibridación DNA/RNA.

Las composiciones descritas anteriormente pueden utilizarse para procedimientos de detección de la expresión del polinucleótido de cadena \alpha HLA-clase II mediante la detección de la presencia del mRNA codificante de un (poli)péptido de cadena \alpha HLA-clase II. Dichos procedimientos comprende, por ejemplo, la obtención de mRNA de células de un individuo y el contacto del mRNA así obtenido con una sonda/cebador, la cual comprende una molécula de ácido nucleico de hibridación específica con un polinucleótido de cadena \alpha HLA-clase II en las condiciones de hibridación adecuadas, y la detección de la presencia del mRNA hibridado con la sonda/cebador. Otros procedimientos diagnósticos que conducen a la detección de moléculas de ácido nucleico en una muestra comprenden, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transferencia de Southern en combinación con la hibridación de ácidos nucleicos, la hibridación comparativa de genomas (CGH) o los análisis de diferencias representativas (RDA). Estos procedimientos para el análisis de la presencia de moléculas de ácido nucleico son conocidos en la materia y pueden llevarse a cabo sin demasiada experimentación.

Además, la invención comprende procedimientos para la detección de la presencia de una proteína de cadena \alpha de HLA de clase II en una muestra, por ejemplo, una muestra celular. Dichos procedimientos comprenden la obtención de una muestra de células de un individuo, el contacto de dicha muestra con uno de los mencionados anticuerpos en las condiciones que permitan la unión del anticuerpo con la proteína de cadena \alpha HLA-clase II y la detección de la presencia del anticuerpo de esta manera unido, por ejemplo, mediante la utilización de técnicas de inmunoensayo como el radioinmunoensayo o el inmunoensayo enzimático. Además, el experto en la materia puede detectar específicamente y diferenciar los polipéptidos que sean proteínas de cadena \alpha HLA-clase II funcionales de las formas mutadas que han perdido o tienen una actividad de cadena \alpha HLA-clase II alterada, gracias a la utilización de un anticuerpo que reconozca específicamente un (poli)péptido con actividad de cadena \alpha HLA-clase II, pero que no reconozca una forma inactiva de lo mismo o que reconozca específicamente una forma inactiva pero no el polipéptido correspondiente con actividad de cadena \alpha HLA-clase II.

La presente invención se refiere además a un procedimiento tal como se describió anteriormente, en donde dicha muestra es o se deriva del pelo, sangre, suero, esputo, heces u otro fluido corporal. La muestra a analizar puede ser tratada para extraer, entre otras cosas, las moléculas de ácido nucleico, los (poli)péptidos o los anticuerpos.

La presente invención también se refiere a las utilizaciones de composiciones de equipos que contienen reactivos específicos de cadena \alpha HLA-clase II, como los descritos más arriba. Los equipos contienen DNA o RNA de la cadena \alpha HLA-clase II, anticuerpos contra la cadena \alpha HLA-clase II, se facilita la posibilidad de preparar proteína de cadena \alpha HLA-clase II. Dichos equipos se utilizan para detectar el DNA que hibrida con el DNA o RNA de cadena \alpha HLA-clase II o para detectar la presencia de fragmentos de proteína o péptidos de cadena \alpha HLA-clase II en una muestra. Dicha caracterización es útil para diversos propósitos incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los análisis forenses, las aplicaciones diagnósticas, y los estudios epidemiológicos según los procedimientos descritos anteriormente de la presente invención. Las proteínas de cadena \alpha HLA-clase II recombinantes, las moléculas de DNA, las moléculas de RNA y los anticuerpos facilitan la formulación de equipos adecuados para la detección y tipado de la cadena \alpha HLA-clase II. Un tal equipo comprende de forma característica un recipiente con compartimientos adecuados para mantener en un compartimiento estanco al menos un reactivo. El recipiente comprenderá además reactivos como la proteína de cadena \alpha HLA-clase II o los anticuerpos de anti-cadena \alpha HLA-clase II adecuados para la detección de la cadena \alpha HLA-clase II. El recipiente también puede contener un medio para la detección de dicho antígeno marcado o los sustratos enzimáticos o similares.

Estas y otras realizaciones se describen y están incluidas por la descripción y ejemplos de la presente invención. Literatura adicional referente a cualquiera de los procedimientos, utilizaciones y compuestos a utilizar según la presente invención puede obtenerse de las bases de datos de librerías públicas, mediante dispositivos electrónicos. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos "Medline" que está disponible en internet, por ejemplo en la dirección http://www.ncbi.nlm.nih. Gov/PubMed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones com http://www.infobiogen. fr; http://www.fmi.ch/biology/research_{-}tools.html; http://www.tigr.org son conocidas en la materia y pueden también obtenerse utilizando por ejemplo http://www.lycos.com. Una visión global sobre la información de patentes en biotecnología y una valoración de las fuentes relevantes de información de patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y un conocimiento actual se proporcionan por Berks, TIBTECh 12 (1994), 352-364.

Esta descripción puede ser mejor comprendida junto con las figuras acompañantes, incorporadas aquí como referencias. Además, un mejor conocimiento de la presente invención y de sus muchas ventajas se proporciona a partir de los ejemplos siguientes, añadidos a modo de ilustración y no con intención limitante.

Salvo que se especifique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas recombinantes de DNA se realizaron de acuerdo con los protocolos descritos en Sambrook y col. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press NY o en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols.

Las figuras muestran:

Figura 1 a: La secuencia de cDNA de la cadena \alpha HLA DR humana que contiene 819 nucleótidos y muestra el cDNA que se ha aislado mediante cribado de una librería de doble híbrido de levaduras a partir de linfocitos
humanos.

Figura 1 b: La secuencia aminoacídica de la molécula HLA DR que incluye 254 aminoácidos iniciándose con una metionina.

Figura 1 c: La co-inmunoprecipitación de la proteína TIRC7 con la proteína HLA-DR del lisado de linfocitos humanos mediante la utilización de anticuerpos anti-TIRC7 y anti-cadena \alpha HLA-DR.

Ejemplos que ilustran la invención.

Ejemplo 1

Identificación de un ligando de TIRC7 mediante la utilización del cribado de una librería de doble híbrido

El cDNA de TIRC7 publicado por Utku y col., Immunity 9 (1998), 509-518, se utilizó para realizar un cribado de doble híbrido mediante la utilización del sistema HYBRZAP 2.1 de Stratagene, La Jolla, USA. Los clones positivos se analizaron según las instrucciones del fabricante. El "cribado de cDNA-7" puso en evidencia un inserto de cDNA de 819 pb de longitud que presentaba una identidad de secuencia del 100% con el antígeno de clase II-DR de leucocitos (figura 1a-1b).

Ejemplo 2

Inmunoprecipitación de la cadena alfa HLA-DR

La coinmunoprecipitación se realizó tal como se describe por Jöns y col., Histochem. Cell. Biol., 1999, 111(4), 313-8. En resumen, el lisado de linfocitos de sangre periférica (Figura 1c, carril 1) se utilizó para la inmunoprecipitación de la cadena alfa de HLA-DR mediante la utilización del anticuerpo monoclonal CBL120 (Cybus-Biotechnology) (Figura 1c, carril 2). Por el contrario, el anticuerpo control, isotipo IgG1 (Pharmigen) no mostró ninguna precipitación (Figura 1c, carril 3).

<110> Genopat 77 Pharmacogenetics AG

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<120> Utilización de inhibidores de la unión del ligando de TIRC7

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<130> E2385 PCT

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<140>

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<141>

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<150> EP 0012 3666.0

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<151> 2001-10-30

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<160> 2

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<170> Patentin Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 819

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 254

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 2

2

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Claims (16)

1. Utilización de un inhibidor que interfiere con la interacción entre TIRC7 y su ligando en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, para el tratamiento de tumores, para la mejora de la curación de heridas o para la inducción de la ausencia de respuesta en un individuo, en donde dicho ligando es la cadena \alpha HLA-clase II (antígeno asociado a leucocitos humanos).

2. Utilización según la reivindicación 1, en donde el mencionado inhibidor se selecciona a partir del grupo que consiste en:

(a)

un agente de unión a, y/o que interfiere con un (poli)péptido o un(os) fragmento(s) de lo mismo que comprende una secuencia aminoacídica tal como se muestra en la SEC ID NO:2;

(b)

un agente de unión a un (poli)péptido o un(os) fragmento(s) codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica tal como se muestra en la SEC ID NO:1; y

(c)

un análogo o derivado del (poli)péptido o del fragmento(s) de lo mismo tal como se define en (a) o (b).

3. Utilización según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho inhibidor es un aptámero o anticuerpo que se une específicamente con el(los) (poli)péptido(s) tal como se define en la reivindicación 1 o 2.

4. Utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica el inhibidor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una composición farmacéutica en el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, para el tratamiento de tumores, para la mejora de la curación de heridas o para la inducción o el mantenimiento de la ausencia de respuesta inmune en un individuo.

5. Utilización según la reivindicación 4, en donde dicha molécula de ácido nucleico está comprendida en un vector.

6. Procedimiento de identificación y obtención de un agente capaz de interferir con la interacción entre TIRC7 y su ligando que comprende las etapas de:

(a)

Analizar una colección de (poli)péptidos o sustancias por su capacidad de inhibir la interacción entre TIRC7 y (poli)péptidos de cadena \alpha HLA-clase II o un(os) fragmento(s) de lo mismo mediante la utilización de un sistema de lectura; y

(b)

Identificar los (poli)péptidos o las sustancias que sean positivas en el ensayo de inhibición de la interacción de TIRC7 con su ligando en la etapa (a).

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en donde los mencionados (poli)péptidos de la cadena \alpha HLA-clase II o fragmentos de lo mismo comprenden una secuencia aminoacídica derivada de la SEC ID NO:2, o están codificados por la SEC ID NO:1.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 o7, que además comprende la etapa de;

(c)

Repetición de las etapas (a) y (b) con los (poli)péptidos o sustancias identificadas una o más veces, en donde el (poli)péptido o sustancia identificada reemplaza los (poli)péptidos de cadena \alpha HLA-clase II como un cebo para la identificación de un (poli)péptido o sustancia interaccionante, y en las rondas subsiguientes es reemplazado por el (poli)péptido o sustancia identificada en la anterior ronda.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 para la identificación y obtención de un (poli)péptido implicado en la regulación de la respuesta inmune en un individuo.

10. Procedimiento para la identificación y aislamiento de un agente para el tratamiento de las enfermedades inmunes que comprende las etapas de:

(a)

cribado de una célula huésped que comprende un gen reportero cuya transcripción está activada directa o indirectamente por dímeros que comprenden TIRC7 y la cadena \alpha HLA-clase II o sus dominios de unión interaccionantes correspondientes junto con un compuesto a ser cribado; y

(b)

selección de un compuesto que reprime la activación del gen reportero.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde la mencionada célula huésped comprende al menos un vector de expresión que contiene una molécula de DNA que codifica al menos una cadena \alpha HLA-clase II o un fragmento de lo mismo unido operativamente a un dominio de transactivación o de unión al DNA.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 que además comprende:

(a)

modelado del mencionado agente o (poli)péptido por péptidomiméticos; y

(b)

síntesis química del compuesto modelado.

13. Utilización de la cadena \alpha HLA-clase II o un fragmento o derivado de lo mismo en un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.

14. Procedimiento in vitro de diagnóstico de una condición patológica, o una susceptibilidad a una condición patológica en un individuo relacionada con una enfermedad que esté mediada por o responda a la actividad de TIRC7; dicho procedimiento comprende:

(a)

la determinación de la presencia o ausencia de una mutación en un polinucleótido que codifica la cadena \alpha HLA-clase II; y

(b)

el diagnóstico de una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica basado en la presencia o ausencia de la mencionada mutación,

en donde, dicha enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, los tumores, la deficiencia en la curación de heridas y la deficiencia de un individuo en provocar las respuestas inmunes adecuadas.

15. Procedimiento in vitro de diagnóstico de una condición patológica, o una susceptibilidad a una condición patológica en un individuo relacionada con una enfermedad que esté mediada por, o responda a la actividad de TIRC7; dicho procedimiento comprende:

(a)

determinar la presencia o la cantidad de expresión del polipéptido de cadena \alpha HLA-clase II en una muestra biológica; y

(b)

diagnosticar una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica basada en la presencia o la cantidad de expresión del polipéptido,

en donde, dicho trastorno se selecciona entre el grupo que consiste en la enfermedad del injerto contra el huésped, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades alérgicas, las enfermedades infecciosas, la sepsis, los tumores, la deficiencia en la curación de heridas y la deficiencia de un individuo en provocar las respuestas inmunes adecuadas.

16. Utilización de un equipo en un procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en donde dicho equipo comprende un polipéptido de cadena \alpha HLA-clase II o un fragmento activo biológicamente de lo mismo, una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena \alpha HLA-clase II o una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que hibrida con un gen de cadena \alpha HLA-clase II, o un anticuerpo anti-cadena \alpha HLA-clase II, y opcionalmente los medios adecuados para su detección.