ES2270431T3 - Elemento regulador especifico de microesporas. - Google Patents
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Abstract
SE HA DESCUBIERTO, AISLADO Y CARACTERIZADO UN NUEVO ELEMENTO REGULADOR DE ADN QUE CONFIERE UNA EXPRESION DE GENES ESPECIFICOS DE MICROSPORAS. EL ELEMENTO REGULADOR ESPECIFICO DE MICROSPORAS SE PUEDE UTILIZAR PARA CONTROLAR LA EXPRESION DE UN GEN EXTRAÑO QUE ALTERE LA FUNCION DE LAS MICROSPORAS. POR CONSIGUIENTE, SE PUEDE CONSEGUIR CONTROLAR LA PRODUCCION DE POLEN UTILIZANDO EL ELEMENTO REGULADOR ESPECIFICO DE MICROSPORAS PARA PRODUCIR PLANTAS MACHO ESTERILES. PUEDEN UTILIZARSE DIFERENTES METODOS PARA RESTAURAR LA FERTILIDAD MASCULINA EN LA GENERACION F1 DE ESTAS PLANTAS MACHO ESTERILES. ADEMAS, EL ELEMENTO REGULADOR ESPECIFICO DE MICROSPORAS SE PUEDE UTILIZAR PARA CONFERIR RESISTENCIA FRENTE A PLAGAS VIRICAS Y DE INSECTOS.
Description
Elemento regulador específico de
microesporas.
La presente invención se refiere a un nuevo
elemento regulador que confiere especificidad de microesporas a la
expresión de genes. En particular, esta invención está dirigida a un
elemento regulador específico de microesporas del gen Brassica
napus Bnm1, y a usar dicho elemento regulador para producir
plantas transgénicas machos estériles. Esta invención también está
dirigida a un método para restablecer la fertilidad de machos en la
progenie de plantas machos estériles. Además, la presente invención
se refiere al uso del elemento regulador específico de microesporas
de la invención para proteger las plantas contra la infección por
virus y plagas de insectos.
El control de la fertilidad del polen es
esencial en la producción de cosechas híbridas. Los métodos
tradicionales para regular la fertilidad del polen incluyen
emasculación manual de plantas que han de usarse como precursor
hembra y la aplicación de composiciones químicas. De acuerdo con
este último método se producen semillas híbridas mediante la
fertilización cruzada de plantas hembras tratadas químicamente con
polen de plantas no tratadas. Ambos métodos, sin embargo, requieren
un gran trabajo. Además es preferible evitar la introducción de
compuestos químicos tóxicos en el medio ambiente.
Otro método para el control de la fertilidad se
basa en el uso un(os) gen(es) citoplásmico(s)
para la esterilidad de los machos. El problema de esté método es que
la expresión de ciertos genes citoplásmicos de esterilidad de machos
va acompañada por una mayor susceptibilidad a los hongos patógenos.
Por ejemplo, el uso extensivo del citotipo cmsT en el maíz
condujo a un episodio epifítico de tizón de las hojas en maíz del
Sur de EE.UU. en los primeros años de la década de 1970. Aunque han
llegado a estar disponibles citotipos adicionales de esterilidad de
machos, su uso no ha llegado a extenderse debido a la preocupación
sobre posible susceptibilidad a agentes patógenos.
La capacidad de producir líneas híbridas tiene
particular importancia económica para cosechas de semillas oleosas.
Por ejemplo, las líneas híbridas de Brassica napus F_{1}
producen típicamente rendimientos que son mayores que 20 a 70%,
comparados con las líneas establecidas. Thompson, Adv. Appl.
Biol. 7: 1 (1983); Johnston, Euphytica 20: 81 (1971). El
método más económico y flexible de controlar la fertilidad en
Brassica utiliza un sistema de
auto-incompatibilidad que está presente de modo
natural en las especies de Brassica. Gowers, Euphytica
24: 537 (1975). Sin embargo, el sistema de
auto-incompatibilidad no es fiablemente eficaz en
ciertas condiciones ambientales, tales como temperaturas
elevadas.
Existe, por tanto, la necesidad de un método
para controlar la producción de polen sin la dependencia de la
esterilidad de machos que se produce de modo natural o del gen de
auto-incompatibilidad o de los métodos tradicionales
manuales y químicos.
Por consiguiente, es un objeto de la presente
invención proporcionar un método para produce plantas machos
estériles usando un vector de expresión que interrumpe la función de
las microesporas.
Es otro objeto de esta invención proporcionar un
elemento regulador del DNA que confiere la expresión de genes
específicos de microesporas.
Este y otros objetos se consiguen, de acuerdo
con una realización de la presente invención por la creación de un
molécula de DNA, preferiblemente una molécula de DNA aislado; en
donde la molécula de DNA comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 8, (b) una
secuencia de nucleótidos que tiene al menos 65% de similitud de
secuencia con la SEQ ID NO: 8, en donde dicha secuencia de
nucleótidos tiene la función de un elemento regulador específico de
microesporas, y (c) un fragmento funcional de (a), en donde dicho
fragmento tiene la función de un elemento regulador específico de
microesporas.
La presente invención también contempla vectores
de expresión que comprenden un elemento regulador específico de
microesporas. Dichos vectores de expresión pueden comprender además
un promotor, en donde la función del promotor está bajo el control
de un elemento regulador específico de microesporas. Ejemplos de
promotores adecuados incluyen un promotor Bnm1, un promotor
específico de anteras y el promotor de núcleo CaMV 35S.
La presente invención también está dirigida a un
vector de expresión que comprende además un gen extraño que está
unido operativamente a un promotor, en donde el producto del gen
extraño interrumpe la función de las microesporas.
La presente invención contempla además un método
de usar dichos vectores de expresión para producir una planta
estéril macho, que comprende la etapa de introducir un vector de
expresión en células embriógenas de plantas, en donde en donde el
gen extraño se selecciona del grupo que consiste en un gen
estructural, un gen antisentido, un gen de ribozima y un gen de
secuencia de guía externa. Por ejemplo, se puede introducir un
vector de expresión en células embriogenias de plantas de
Brassica napus.
Los genes estructurales adecuados codifican una
proteína seleccionada del grupo que consiste en toxina de la
difteria, proteína antiviral de fitolaca (Phytolacca
americana) abreviadamente PAF, RNasa-T1 de
Aspergillus oryzae, barnasa y el producto del gen
rolB.
Un producto adecuado de un gen antisentido se
selecciona del grupo que consiste en RNA antisentido de actina, RNA
antisentido de tubulina, RNa antisentido de ubiquitina, RNA
antisentido de la enzima que se conjuga con ubiquitina, RNA
antisentido de la proteína portadora de ubiquitina, RNa antisentido
del factor de prolongación y RNA antisentido de
chalcona-sintasa.
Además, los genes de ribozima o los genes de la
secuencia de guía externa pueden comprender secuencias de
nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en secuencias de
nucleótidos de actina, secuencias de nucleótidos de tubulina,
secuencias de nucleótidos de ubiquitina, secuencias de nucleótidos
de la enzima que se conjuga con ubiquitina, secuencias de
nucleótidos de la proteína portadora de ubiquitina, secuencias de
nucleótidos del factor de prolongación y secuencias de nucleótidos
de chalcona-sintasa.
La presente invención también está dirigida a un
método de producir una planta macho estéril, que comprende:
- (a)
- construir un vector de expresión que comprende un elemento regulador específico de microesporas, un promotor, y un gen extraño, en donde el elemento regulador específico de microesporas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 8, (ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 65% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 8,
en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene la
función de un elemento específico de microesporas; y
- (iii)
- fragmentos de (i), en donde dicho fragmento tiene la función de un elemento específico de microesporas,
en donde el elemento regulador específico de
microesporas en conjunción con el promotor controla la expresión del
gen extraño, y en donde el producto del gen extraño interrumpe la
función de las microesporas, con lo cual se produce una planta macho
estéril.
Dicho método puede comprender además la etapa de
(b) introducir el vector de expresión en células embriógenas de
plantas.
La presente invención contempla además un método
de usar un elemento regulador específico de microesporas para
producir una planta híbrida macho fértil, que comprende:
- (a)
- producir una primera planta parental macho estéril que comprende un vector de expresión que comprende un elemento regulador específico de microesporas de la invención, un promotor, y un primer gen extraño, en donde el elemento regulador específico de microesporas en conjunción con el promotor controla la expresión del primer gen extraño, y en donde el producto del primer gen extraño interrumpe la función de las microesporas;
- (b)
- producir una segunda planta precursora que comprende un vector de expresión que comprende el elemento regulador específico de microesporas, un promotor y un segundo gen extraño, en donde el elemento regulador específico de microesporas en conjunción con el promotor controla la expresión del segundo gen extraño; y
- (c)
- someter a fertilización cruzada a la primera planta precursora con la segunda planta precursora para producir una planta híbrida,
en donde las microesporas de la planta híbrida
expresan el segundo gen extraño, y en donde el producto del segundo
gen extraño impide la interrupción de la función de las microesporas
función por el producto del primer gen extraño, produciendo de este
modo una planta híbrida macho fértil.
Por ejemplo, el primer gen extraño puede
codificar barnasa y el segundo gen extraño puede codificar un
inhibidor de barnasa. Alternativamente el producto del primer gen
extraño puede ser la toxina de la difteria y el producto del segundo
gen extraño puede ser la ribozima de la toxina de la difteria.
La presente invención también está dirigida a un
método para restablecer la fertilidad de una planta híbrida macho
estéril, que comprende tratar la planta híbrida macho estéril con
flavonol-aglicona, en donde la planta híbrida macho
estéril comprende un vector de expresión que comprende: (i) un
elemento regulador específico de microesporas, (ii) un promotor, y
(iii) un gen extraño,
en donde dicho elemento regulador específico de
microesporas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del
grupo que consiste en:
- (a)
- SEQ ID NO:8;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos con al menos 65% de similitud con la SEQ ID NO:8, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas; y
- (c)
- un fragmento de (a), en donde dicho fragmento tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas, en donde el elemento regulador específico de microesporas en conjunción con el promotor controla la expresión del gen extraño, y en donde el gen extraño expresa RNA antisentido de chalcona-sintasa, produciendo de este modo microesporas deficientes en flavonol. El kaempferol es un ejemplo de una flavonol-aglicona adecuada.
La presente invención se dirige además a un
método para producir plantas transgénicas resistentes a enfermedades
causadas por virus o insectos, que comprende construir un vector de
expresión que comprende un elemento regulador específico de
microesporas, un promotor, y un gen extraño, en donde el elemento
regulador específico de microesporas comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en (i) SEQ ID NO: 8,
(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 65% de
similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 8, en donde dicha secuencia
de nucleótidos tiene la función de un elemento regulador específico
de microesporas; y (iii) fragmentos de (i), en donde dicho fragmento
tiene la función de un elemento regulador específico de
microesporas, en donde elemento regulador específico de microesporas
en conjunción con el promotor controla la expresión del gen extraño,
y en donde el producto del gen extraño interrumpe la función del
virus o codifica una toxina insecticida, con lo cual confiere
resistencia a la enfermedad. El producto del gen extraño que
interrumpe el virus puede seleccionarse del grupo que consiste en la
proteína de cubierta viral,
2',5'-oligoadenilato-sintetasa, RNA
antisentido del genoma viral y proteína antiviral de fitolaca,
mientras que una toxina insecticida adecuada es una endotoxina de
Bacillus thuringiensis.
La Figura 1 presenta la secuencia de nucleótidos
[SEQ ID NO: 1] de cDNA de Bnm1 con su correspondiente
secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 2]. El codón de iniciación ATG,
el codón de parada TGA y una supuesta señal de poliadenilación están
doblemente subrayados.
La Figura 2 presenta la secuencia de nucleótidos
[SEQ ID NO: 5] del clon genómico de Bnm1 incluyendo el
promotor, la región codificadora y un solo intrón (en letra
cursiva). La región subrayada es idéntica a la secuencia de cDNA de
Bnm1. El codón de iniciación ATG, el codón de parada TGA y
una supuesta señal de poliadenilación están indicados por
asteriscos.
La Figura 3 presenta la secuencia de nucleótidos
[SEQ ID NO: 8] del fragmento promotor amplificado por PCR usado para
clonar el promotor de Bnm1. El codón de iniciación ATG está
presente dentro del sitio de restricción NcoI.
La Figura 4 presenta un mapa del vector DP5476
que contiene el promotor demicroesporas de Brassica napus
(Msp Prom) que activa la casete gen GUS- terminador PINII insertada
en los sitios SalI-EcoRI de pBlueScript® II SK+. El
vector también contiene el gen de resistencia a la ampicilina (AmpR)
como marcador seleccionable para transformaciones de E.
coli.
La Figura 5 presenta un mapa de DP5477 que
contiene el promotor demicroesporas de Brassica napus (MSP
Prom) que activa la casete gen GUS-terminador PINII
insertada en el sitio SalI-EcoRI del vector binario
DP1741. DP5477 también contiene el promotor CaMV 35S que activa el
gen de la neomicina-fosfotransferasa (NPTII) que se
usa como marcador de selección. Los bordes izquierdo y derecho de
T-DNA están marcados con LB (left border) y
RB (right border), respectivamente.
En la descripción que sigue, se usan ampliamente
cierto número de términos y frases definidores. Las siguientes
definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la
invención.
Un gen estructural es una secuencia de
DNA que se transcribe en RNA mensajero (mRNA) que luego se traduce
en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido
específico.
Un promotor es una secuencia de DNA que
dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente un
promotor está localizado en la región 5' de un gen, próximo al sitio
del comienzo de la transcripción de un gen estructural. Si un
promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de
transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. En
contraste, la velocidad de transcripción no está regulada por un
agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo.
Un promotor de núcleo contiene secuencias
de nucleótidos esenciales para la función del promotor, incluyendo
la caja TATA y el comienzo de la transcripción. Por esta definición,
un promotor de núcleo puede contener o no actividad detectable en
ausencia de secuencias específicas que pueden potencial la actividad
o conferir actividad específica de tejidos. Por ejemplo, el promotor
de núcleo del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S consiste
en aproximadamente 33 nucleótidos antes del extremo 5' del sitio de
iniciación de la transcripción del genoma de 35S.
Un elemento regulador específico de
microesporas es una secuencia de DNA que dirige un nivel
superior de transcripción de un gen asociado en microesporas al de
algunos o todos los otros tejidos de una planta. Por ejemplo, el gen
Bnm1, descrito en la presente memoria, se expresa en
microesporas durante las fases binucleadas y trinucleadas del
desarrollo. El elemento regulador específico de microesporas del gen
Bnm1 puede dirigir la expresión de un gen extraño en
microesporas, pero no en otros tejidos de pared, pistilo o
sépalo.
Una molécula de DNA aislada es un
fragmento de DNA que no está integrado en el DNA genómico de un
organismo. Por ejemplo, el elemento regulador específico de
microesporas del gen Bnm1 es un fragmento de DNA que ha sido
separado del DNA genómico de Brassica napus. Otro ejemplo de
una molécula de DNA aislada es una molécula de DNA químicamente
sintetizada que no está integrada en el DNA genómico de un
organismo.
Un potenciador es elemento regulador de
DNA que puede aumentar la eficacia de la transcripción,
independientemente de la distancia u orientación del potenciador con
respecto al sitio del comienzo de la transcripción.
DNA complementario (cDNA) es una de
molécula DNA monocatenario que se forma a partir de un molde de mRNA
por la enzima transcriptasa inversa. Típicamente, se emplea un
cebador complementario a porciones de mRNA para la iniciación de la
transcripción inversa. Los expertos en la técnica también usan el
término "cDNA" para referirse a una molécula de DNA bicatenario
que consiste en dicha molécula de DNA monocatenario y su cadena de
DNA complementaria.
El término expresión se refiere a la
biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen
estructural, la expresión implica la transcripción del gen
estructural en mRNA y la traducción del mRNA en uno o más
polipéptidos.
Un vector de clonación es una molécula de
DNA, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la
capacidad de replicarse autónomamente en una célula hospedante. Los
vectores de clonación contienen típicamente uno o un pequeño número
de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los
cuales pueden insertarse las secuencias de DNA extraño de un modo
determinable sin pérdida de una función biológica esencial del
vector, así como un gen marcador que es adecuado para uso en la
identificación y selección de células transformadas con el vector
de clonación. Los genes marcadores incluyen típicamente genes que
proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a
ampicilina.
Un vector de expresión es una molécula de
DNA que comprende un gen que se expresa en una célula hospedante.
Típicamente, la expresión del gen está colocada bajo el control de
ciertos elementos reguladores, incluyendo promotores constitutivos o
inducibles, elementos reguladores específicos de tejidos, y
potenciadores. De dicho gen se dice que ha de estar "unido
operativamente" a los elementos reguladores.
Un gen extraño se refiere en la presente
descripción a una secuencia de DNA que está unida operativamente a
al menos un elemento regulador heterólogo. Por ejemplo, se considera
que cualquier gen distinto del gen estructural Bnm1 es un gen
extraño si la expresión de ese gen está controlada por un elemento
regulador específico de microesporas del gen Bnm1.
Un hospedante recombinante puede ser
cualquier célula procariótica o eucariótica que contiene un vector
de clonación o de expresión. Esta frase también incluye las células
procarióticas o eucarióticas que han sido alteradas por ingeniería
genética para contener el(los) gen(es)
clonado(s) en el cromosoma o genoma de la célula
hospedante.
Una planta transgénica es una planta que
tiene una o más células de plantaque contienen un vector de
expresión.
En eucariotas, la RNA-polimerasa
II cataliza transcripción de un gen estructural para producir mRNA.
Una molécula de DNA se puede diseñar de modo que contenga molde de
RNA-polimerasa II en el cual el RNA transcrito tiene
una secuencia que es complementaria a la del mRNA específico. El RNA
transcrito se denomina un RNA antisentido y una secuencia de DNA que
codifica el RNA antisentido se denomina un gen
antisentido. Las moléculas de RNA antisentido son capaces de
unirse moléculas de mRNA, dando como resultado una inhibición de la
traducción del mRNA.
Una ribozima es una molécula de RNA que
contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de RNA,
RNA auto-empalmantes, y RNA
auto-escindibles. Una secuencia de DNA que codifica
una ribozima se denomina un gen de ribozima.
Una secuencia de guía externa es una
molécula de RNA que dirige la ribozima endógena, RNasa P, hasta
especies particulares de mRNA intracelular, dando como resultado la
escisión del mRNA por la RNasa P. Una secuencia de DNA que codifica
una secuencia de guía externa se denomina un gen de secuencia de
guía externa.
Se considera que dos moléculas de ácido nucleico
tienen una sustancial similitud de secuencia si sus
secuencias de nucleótidos comparten una similitud de al menos 65%.
Las determinaciones de similitud de secuencias puede realizarse, por
ejemplo, usando el programa de ordenador FASTA (Genetics Computer
Group; Madison, WI). Alternativamente, las determinaciones de
similitud de secuencias pueden realizarse usando el programa BLASTP
(Basic Local Alignment Search Tool) del Experimental
GENIFO(R) BLAST Network Service. Véase Altschul et al., J.
Mol. Biol. 215: 403 (1990). Véanse también Pasternak et
al., "Sequence Similarity Searches, Multiple Sequence
Alignments, and Molecular Tree Building," en METHODS IN PLANT
MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (eds.), pp.
251-267 (CRC Press 1993).
Se conocen en la técnica genes específicos de
microesporas. Véanse, por ejemplo, Wing et al., Plant Molec.
Biol. 14: 17 (1989), Albani et al., Plant Molec. Biol.
15: 605 (1990). Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 224:
161 (1990). Twell et al., Development 109: 705 (1990), van
Tunen et al., The Plant Cell 2: 393 (1990). Albani et al.,
Plant. Molec. Biol: 16: 501 (1991). Twell et al., Genes &
Development 5: 496 (1991) y Albani et al., The Plant Journal
2: 331(1992). De acuerdo con el esquema de Mascarenhas,
Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 317 (1990) los
genes expresados durante la microesporogénesis pueden caracterizarse
como genes "tempranos" o "tardíos". Los transcritos de los
genes tempranos son primeramente detectables poco después de la
meiosis y se reducen o son indetectables en el polen maduro. En
contraste, la expresión de los genes tardíos comienza
aproximadamente en el momento de la mitosis de microesporas y
continúa a medida que madura el polen. Además, es posible que los
genes particulares expresados durante la microesporogénesis no
puedan ser clasificados ni como genes tempranos ni como genes
tardíos.
De acuerdo con el esquema de clasificación de
Mascarenhas, el gen Bnm1 descrito en la presente memoria es
un gen temprano. Por tanto, el elemento regulador del gen
Bnm1 es funcionalmente distinto de los elementos reguladores
de los genes tardíos, tales como el gen del maíz Zm13
(Guerrero et al., supra), el gen NTP303 del tabaco
(Weterings et al., Plant. Mol. Biol. 18: 1101 (1992)), el gen
LAT51 del tomate (McCormick, Trends Genet. 7: 298
(1991)), el gen de la flavona-isomerasa de la
chalcona de petunia (promotor chiA P_{A2}; van Tunen et al.,
The Plant Cell: 2:393 (1990)) y el gen Bcp1 de
Brassica campestris (Theerakulpisut et al., The Plant Cell
3: 1073 (1991)).
También pueden encontrarse diferencias en el
grupo de genes tempranos comparando modelos de síntesis de mRNA. Por
ejemplo, el gen LAT52 se expresa en el endospermo, el gen
LAT59 se expresa en el endospermo y las raíces, mientras que
el gen LAT56 se expresa en las raíces. Twell et al., Mol.
Gen. Genet. 217: 240 (1989); Wing et al., supra;
McCormick, The Plant Cell 5: 1265 (1993). En contraste, el
gen Bnm1 no se expresa ni en las raíces ni en las semillas en
desarrollo. Véase el Ejemplo 2. Además, el análisis de Northern
indica que el nivel de expresión del gen Bnm1 es mayor que el
nivel de expresión de los genes Bp4, Bp19 y Bp10 de
Brassica napus (1990,1991,1992) supra. Véase el
Ejemplo 2. Esta observación sugiere que el promotor del gen
Bnm1 es más potente que los promotores de los genes Bp4,
Bp19 y Bp10.
Además, las variaciones en la función de los
elementos reguladores de los genes tempranos pueden revelarse por
estudios de transformación. Por ejemplo, el elemento regulador
específico del polen del gen SLG_{13} de Brassica
oleracea induce la expresión del gen en el polen de plantas
transgénicas principalmente en la fase binucleada del desarrollo.
Thorsness et al., Develop. Biol. 143:173 (1991); Dzelzkalns
et al., The Plant Cell 5:855 (1993). Además, el elemento
regulador SLG_{13} no induce la expresión del gen en el
tapetum de plantas transgénicas. Thorsness et al., supra. En
contraste, el elemento regulador del gen Bnm1 induce la
expresión del gen en las microesporas de plantas transgénicas
comenzando en la fase mononucleada del desarrollo, así como en las
células tapetales. Véase el
Ejemplo 5.
Ejemplo 5.
Por tanto, el gen Bnm1 puede distinguirse
sobre una base funcional de otros genes tempranos conocidos.
Además de esta distinción funcional, una
comparación de secuencias de nucleótidos en varias bases de datos
fracasó en revelar una secuencia de nucleótidos que fuera
equivalente o similar a la secuencia de nucleótidos del
elemento regulador específicos de microesporas Bnm1 mostrado
en la Figura 3 [SEQ ID NO: 8]. La ausencia de un apareamiento es
consistente con el hecho de que no ha sido posible desarrollar
principios generalmente aceptados o criterios estructurales para
reconocer secuencias de DNA que confiere especificidad de
microesporas. Esto es particularmente cierto para los elementos
reguladores de los genes específicos de microesporas de
Brassica. Consecuentemente, un elemento regulador específico
de microesporas de Brassica no puede aislarse de una genoteca
genómica por escrutinio para una secuencia de consenso que confiere
la expresión de genes específicos de microesporas.
Por tanto, el nuevo elemento regulador
específico de microesporas de la presente invención se obtuvo
aislando moléculas de cDNA que codifican genes específicos de
microesporas y luego, usando los cDNA como sondas para identificar
genes correspondientes en una genoteca genómica adecuada.
La primera etapa en la construcción de una
genoteca de cDNA que contiene genes específicos de microesporas es
aislar RNA total de las microesporas. Preferiblemente, el RNA se
aísla de microesporas mononucleadas tardías/bininucleadas tempranas
que han sido cultivadas durante cuatro días para inducir la
embriogénesis. Más preferiblemente, dichas microesporas se obtienen
a partir de Brassica napus.
El RNA total puede prepararse a partir de las
microesporas usando métodos bien conocidos por los expertos en la
técnica. En general, las técnicas de aislamiento de RNA deben
proporcionar un método para romper células vegetales, medios de
inhibir la degradación dirigida por RNasa, y un método de separar
RNA de DNA, proteínas y contaminantes polisacáridos. Por ejemplo, el
RNA total puede aislarse de las microesporas congelando el tejido en
nitrógeno líquido, moliendo el tejido congelado con un mortero y su
mano para lisar las microesporas, extrayendo el tejido molido con
una solución de fenol/cloroformo para separar las proteínas, y
separando el RNA de las impurezas restantes por precipitación
selectiva con cloruro de litio. Véase, por ejemplo, Ausubel et
al., (eds.),CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pp.
4.3.1-4.3.4 (Wiley Interscience 1990) [en lo
sucesivo "Ausubel"]. Véase también Sharrock et al., Genes
and Development 3: 1745 (1989).
Alternativamente, el RNA total puede aislarse de
las microesporas extrayendo el tejido molido con isotiocianato de
guanidinio, extrayendo con disolventes orgánicos, y separando el RNA
de los contaminantes usando centrifugación diferencial. Véase, por
ejemplo, Strommer et al., "Isolation and
characterization of Plant mRNA" en METHODS IN PLANT MOLECULAR
BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (eds.),pp.
49-65 (CRC Press 1993).
Con el fin de construir una genoteca de cDNA,
debe aislarse RNA de poli(A)^{+} de una preparación
de RNA total. El RNA de poli(A)^{+} puede aislarse
del RNA total usando la técnica estándar de cromatografía sobre
oligo(dT)-celulosa. Véase, por ejemplo,
Strommer et al., supra.
Las moléculas de cDNA bicatenario se sintetizan
a partir de RNA de poli (A)^{+} usando métodos bien
conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo,
Ausubel en las páginas 5.5.2-5.6.8. Además pueden
usarse kits comercialmente disponibles para sintetizar moléculas de
cDNA bicatenario. Por ejemplo, dichos kits están disponibles en
GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), Clontech Laboratories, Inc. (Palo
Alto, CA), Promega Corporación (Madison, WI) y Stratagene® Cloning
Systems (La Jolla, CA).
Para la construcción de una genoteca de cDNA de
microesporas son adecuados diversos vectores de clonación. Por
ejemplo, una genoteca de cDNA puede prepararse en un vector derivado
de bacteriófagos, tal como un vector \lambdagt10. Huynh et
al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in
\lambdagt10 y \lambdagt11" en DNA Cloning: A Practical
Approach, Vol. I, Glover (ed.), pp. 49-78 (IRL
Press, 1985).
Alternativamente, las moléculas de cDNA
bicatenario pueden insertarse en un vector plasmídico, tal como un
vector pBluescript® (Stratagene® Cloning Systems; La Jolla, CA), un
vector LambdaGEM®-4 (Promega Corp.) u otros vectores comercialmente
disponibles. Los vectores de clonación adecuados pueden obtenerse de
American Type Culture Collección (Rockville, MD). Con el fin de
amplificar las moléculas de cDNA clonadas, la genoteca de cDNA se
inserta en un hospedante procariota, usando técnicas estándares. Por
ejemplo, la genoteca de cDNA de microesporas puede introducirse en
células de E. coli DH5 competentes, que pueden obtenerse en
GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD).
Puede usarse escrutinio diferencial para aislar
clones de cDNA que codifican genes específicos de microesporas a
partir de la genoteca cDNA. Por ejemplo, pueden sintetizarse sondas
de cDNA monocatenario en presencia de nucleótidos radioactivos
usando aislados de RNA de poli(A)^{+} de
microesporas que han sido tratadas para inducir embriogénesis
("Mi-RNA") o de microesporas que han sido
tratadas para eliminar la respuesta embriógena
("Mx-RNA"). Los clones de cDNA que se hibridan
con sondas de cDNA sintetizadas a partir de Mi-RNA,
pero no con sondas Mx-cDNA se aíslan para análisis
posterior. El método de escrutinio diferencial es bien conocido por
los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sargent,
"Isolation of Differentially Expressed Genes" en GUIDE
TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Berger et al., (eds.), pp.
423-432 (Academic Press, 1987); Tedder et al.,
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 208 (1900). El Ejemplo 1 ilustra
el uso de esta técnica.
El método básico para obtener clones de cDNA
específicos de microesporas puede modificarse construyendo una
genoteca sustraída de cDNA que está enriquecida en clones de cDNA
específicos de microesporas. Hedrick et al., Nature 308: 149
(1984). Por ejemplo, puede prepararse un cDNA bicatenario con
extremos de EcoRI a partir de Mi-RNA y mezclarse con
un exceso de 50 veces de pequeños fragmentos de cDNA de extremos
romos, preparados a partir de Mx-RNA. La mezcla de
los cDNA se calienta para fundir el cDNA bicatenario, los cDNA
monocatenarios se dejan hibridar y las moléculas de cDNA bicatenario
se insertan en el sitio EcoRI de un vector de clonación. En
estas condiciones, las únicas moléculas de Mi-cDNA
que probablemente regeneren los fragmentos bicatenarios de un sitio
EcoRI en cada extremo son los cDNA que carecen de los
fragmentos complementarios en el Mx-cDNA. Ausubel en
las páginas 5.8.9.-5.8.15.
Los clones de cDNA pueden analizarse usando una
variedad de técnicas, tales como análisis Northern, análisis
Southern, cartografía de restricción y análisis de secuencias, como
se ilustra en los Ejemplos 1-3.
La metodología descrita anteriormente puede
usarse para aislar clones de cDNA que codifican proteínas que se
expresan en tejido de microesporas. Un clon de cDNA específico de
microesporas, tal como el clon cDNA de Bnm1, puede usarse
para interrumpir la función de las microesporas en construcciones
antisentido, siguiendo los métodos generales descritos más adelante.
Además, tales clones de cDNA pueden usarse como sondas para aislar
los genes correspondientes de una genoteca genómica.
Una genoteca genómica de DNA de plantas puede
prepararse por medios bien conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Slightom et al., "Construction of X Clone
Banks" en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND
BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (eds.), pp.
121-146 (CRC Press, 1993). Una fuente preferida de
de DNA genómico de plantas es DNA de Brassica napus. El DNA
genómico puede aislarse de tejido de Brassica napus, por
ejemplo, lisando tejido de la planta con el detergente Sarkosyl,
digiriendo el lisado con proteinasa K, aclarando los residuos
insolubles del lisado por centrifugación, precipitando el ácido
nucleico del lisado usando isopropanol, y purificando el DNA
resuspendido en un gradiente de densidad de cloruro de cesio.
Ausubel en las páginas 2.3.1-2.3.3.
Los fragmentos de DNA que son adecuados para la
producción de una genoteca genómica pueden obtenerse por
cizallamiento al azar de DNA genómico o por la digestión parcial del
DNA genómico con endonucleasas de restricción. Véase, por ejemplo,
Ausubel en las páginas 5.3.2-5.4.4, y Slightom et
al., supra.
Los fragmentos de DNA genómico pueden insertarse
en un vector, tal como un vector cósmido o bacteriófago, de acuerdo
con técnicas convencionales, tales como el uso de digestión por
enzimas de restricción para proporcionar los extremos adecuados, el
uso de un tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión
indeseable de las moléculas de DNA, y ligación con ligasas
apropiadas. Las técnicas para dicha manipulación están descritas por
Slightom et al., supra, y son bien conocidas en la técnica.
Véase también Ausubel en las páginas
3.0.5-3.17.5.
Alternativamente, puede obtenerse una genoteca
genómica de plantas a partir de una fuente comercial, tal como
Clontech Laboratories, Inc, (Palo Alto, CA) o Stratagene® Cloning
Systems (La Jolla, CA).
Una genoteca que contiene clones genómicos se
escruta con uno o más clones de cDNA específico de microesporas
usando técnicas estándares. Por ejemplo, Ausubel en las páginas
6.0.3-6.6.1; Slightom et al., supra; Raleigh
et al., Genetics 122: 279 (1989). El Ejemplo 4 presenta el
método que se usó para escrutar una genoteca genómica de Brassica
napus.
Los clones genómicos pueden analizarse usando
una variedad de técnicas, tales como análisis de restricción,
análisis Southern, análisis por extensión de cebador, y análisis de
secuencias de DNA. El análisis por extensión de cebador o análisis
con protección de la nucleasa SI, por ejemplo, puede usarse para
localizar el supuesto sitio de transcripción del gen clonado.
Ausubel en las páginas 4.8.1-4.8.5; Walmsley et
al., "Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous
Gene Expression by the S1 Nuclease Protection Assay" en
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION
PROTOCOLS, Murray (ed.), pp. 271-281 (Humana Press
Inc. 1991). El Ejemplo 4 ilustra el uso de análisis Southern,
cartografía por restricción y análisis de secuencias para
caracterizar el gen Bnm1.
El análisis estructural per se no puede
conducir a la identificación de un elemento regulador específico de
microesporas asociado con el gen Bnm1 clonado debido a que no
se ha desarrollado un modelo para secuencias reguladoras específicas
de microesporas de Brassica napus. Por tanto, el elemento
regulador debe identificarse usando análisis funcional.
El método general de dicho análisis funcional
implica subclonar fragmentos del clon genómico en un vector de
expresión que contiene un gen informador, introducir el vector de
expresión en diversos tejidos de plantas, y analizar el tejido para
detectar la expresión transitoria del gen informador. La presencia
de un elemento regulador específico de microesporas en el subclon
genómico se verifica por la observación de la expresión del gen
informador en el tejido de microesporas y la ausencia de expresión
del gen informador en tejido que no es microesporas, tal como
tejidos de pistilos o de sépalos.
Los métodos para generar fragmentos de un clon
genómico son bien conocidos. Preferiblemente, se usa digestión
enzimática para formar deleciones anidadas de fragmentos de DNA
genómico. Véase, por ejemplo, Ausubel en las páginas
7.2.1-7.2.20; An et al., "Techniques for
Isolating and Characterizing Transcription Promotors, Enhancers, and
Terminators" en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND
BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (eds.), pp.
155-166 (CRC Press 1993).
Como Ejemplo, puede ensayarse la posibilidad de
que el elemento regulador resida "aguas arriba" o hacia el
extremo 5', del sitio de comienzo de la transcripción subclonando un
fragmento de DNA que contiene la región "aguas arriba",
digiriendo el fragmento de DNA bien en la dirección 5' a 3' o bien
en la dirección 3' a 5' para producir deleciones anidadas, y
subclonar los pequeños fragmentos en vectores de expresión para la
expresión transitoria.
La selección de un vector de expresión apropiado
dependerá del método de introducir el vector de expresión en células
hospedantes. Típicamente, un vector de expresión contiene: (1)
elementos de DNA procariótico que codifican un origen de replicación
bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para
proporcionar el crecimiento y selección del vector de expresión en
la célula hospedante; (2)elementos de DNA eucariótico que
controlan la iniciación de la transcripción, tal como un promotor;
(3) elementos de DNA que controlan el procesamiento de los
transcritos, tales como una secuencia de terminación de la
transcripción/poliadenilación; y (4) un gen informador que está
unido operativamente a los elementos de DNA que controlan la
iniciación de la transcripción. Genes informadores útiles incluyen
\beta-glucurodinasa,
\beta-galactosidasa,
cloranfenicol-acetil-transferasa,
luciferasa y similares. Preferiblemente, el gen informador es
cualquier gen de \beta-glucuronidase (GUS) o el
gen de luciferasa. Pueden encontrarse descripciones generales de
vectores de expresión en plantas y genes informadores en Gruber
et al., "Vectors for Plant Transformation" en
METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et
al. (eds.), pp. 89-119 (CRC Press 1993). Además,
los vectores de expresión de GUS y las casetes de gen GUS están
disponibles en Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), mientras
que los vectores de expresión de luciferasa y casetes de genes de
luciferasa están disponibles en Promega Corporation (Madison,
WI).
Los vectores de expresión que contienen
fragmentos genómicos de ensayo pueden introducirse en protoplastos,
o en tejidos intactos o células aisladas. Preferiblemente, los
vectores de expresión se introducen en tejidos intactos. Se
proporcionan métodos generales de cultivar tejidos de plantas, por
ejemplo, en Miki et al., "Procedures for Introducing
Foreign DNA into Plants," en METHODS IN PLANT MOLECULAR
BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et (eds.), pp.
67-88 (CRC Press, 1993).
Los métodos de introducir vectores de expresión
en tejido de planta incluyen la infección directa o el
co-cultivo de tejido de planta con Agrobacterium
tumefaciens. Horsch et al., Science 227:1229 (1985). Se
proporcionan descripciones de sistemas vectores de
Agrobacterium y métodos para transferencia de genes mediada
por Agrobacterium en Gruber et al., supra, Miki et
al., supra, y Moloney et al., Plant Cell Reports 8: 238
(1808).
Alternativamente, los vectores de expresión se
introducen en tejidos de plantas usando un método directo de
transferencia de genes, tales como suministro mediado por
microproyectiles, inyección de DNA, electroporación, y similares.
Véase, por ejemplo, Gruber et al., supra; Miki et
al., supra; Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992).
Por ejemplo, los vectores de expresión pueden introducirse en
tejidos de plantas usando suministro mediado por microcroproyectiles
con un dispositivo biolístico.
Se han usado de estudios de transformación para
identificar secuencias de DNA que regulan la expresión de genes de
un modo específico de microesporas. Se encontró, en particular, un
elemento regulador específico de microesporas que residía dentro de
un fragmento de DNA de 820 pares de bases que está localizado
inmediatamente aguas arriba del sitio de comienzo de la traducción
de Bnm1. La secuencia de nucleótidos de un elemento regulador
específico de microesporas se proporciona en la Figura 3 [SEQ ID NO:
8]. Por tanto, la presente invención comprende una molécula de DNA
que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y que tiene
la función de un promotor específico de microesporas.
Pueden producirse variantes del elemento
regulador específico de microesporas delecionando, añadiendo y/o
sustituyendo nucleótidos para los nucleótidos descritos en la SEQ ID
NO: 8. Dichas variantes pueden obtenerse, por ejemplo, por
mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de
exploración con enlazador, mutagénesis que usa la reacción en cadena
de polimerasa, y similares. Ausubel en las páginas
8.0.3-8.5.9. Véase también generalmente, McPherson
(ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991).
Por tanto, la presente invención también abarca moléculas de DNA
que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen al menos 65% de
similitud de secuencia con la SEQ ID NO:8. y funcionan como promotor
específico de microesporas.
Además, el análisis por deleción puede
realizarse nuevamente para localizar uno o más elementos reguladores
específicos de microesporas dentro del elemento regulador específico
de microesporas de 820 pares de bases. Por tanto, la presente
invención también abarca "fragmentos funcionales" de SEQ ID NO:
8 que tienen la función de un elemento regulador específico de
microesporas.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar medios para controlar la producción de polen usando
elemento regulador específico de microesporas. En particular, la
presente invención abarca la producción de plantas machos estériles
usando secuencias reguladoras de Bnm1 para estimular la
expresión de un gen extraño en microesporas. El elemento regulador
específico de microesporas de Bnm1 induce la expresión de
genes desde inmediatamente antes de la fase binucleada hasta la fase
trinucleada del desarrollo de microesporas. Puesto que la expresión
está confinada a un tejido y fases limitadas, el uso del elemento
regulador de Bnm1 para inducir esterilidad de machos obvia
los problemas de regulación referentes a la acumulación de un
producto de un gen extraño en otros diversos tejidos, incluyendo las
porciones comestibles de las plantas.
Un método general para inducir esterilidad de
machos es construir un vector de expresión en el cual el elemento
regulador específico de microesporas está unido operativamente a una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína capaz de
interrumpir la función de las microesporas. Las proteínas capaces de
interrumpir la función de las microesporas incluyen proteínas que
inhiben la síntesis de macromoléculas que son esenciales para la
función celular, enzimas que degradan macromoléculas que son
esenciales para la función celular, proteínas que alteran la
biosíntesis o el metabolismo de hormonas de plantas, y proteínas que
inhiben una función específica de microesporas.
Por ejemplo, puede construirse un vector de
expresión en el cual el elemento regulador específico de
microesporas está unido operativamente a una secuencia de
nucleótidos que codifica un sistema inhibidor de la síntesis de
proteínas. La toxina de la difteria, por ejemplo, es un inhibidor
bien conocido de la síntesis de proteínas en eucariotas. Las
moléculas de DNA que codifican el gen de la toxina de la difteria
pueden obtenerse en American Type Culture Collección (Rockville,
MD), ATCC Nº 39359 o ATCC Nº 67011. Como se ha analiza más adelante,
la proteína antiviral de fitolaca es otro inhibidor adecuado de la
síntesis de proteínas.
Alternativamente, la interrupción de la función
de las microesporas puede conseguirse usando secuencias de DNA que
codifican enzimas capaces de degradar un macromolécula
biológicamente importante. Por ejemplo, Mariani et al., Nature
347:737 (1990), han demostrado que la expresión en el tapetum de
RNasa-T1 de Aspergillus oryzae o de una RNasa
de Bacillus amyloliquefaciens, denominada "barnasa"
indujo la destrucción de las células tapetales, dando como resultado
infertilidad de machos. Por tanto, la función de las microesporas
puede interrumpirse usando un vector de expresión que contiene un
elemento regulador específico de microesporas que está
operativamente unido a un gen de barnasa. Otras enzimas adecuadas
incluyen DNasas, proteasas y lipasas.
Los genes que codifican las enzimas
interruptoras de la función de las microesporas pueden obtenerse por
síntesis química usando secuencias de nucleótidos publicadas. Los
genes de RNasa-T1 y barnasa pueden obtenerse por
ejemplo, sintetizando los genes con oligonucleótidos largos
mutuamente cebantes. Véase, por ejemplo, Ausubel en las páginas
8.2.8 a 8.2.13. Véase también Wosnick et al., Gene 60:115
(1987). Además, técnicas habituales que usan la reacción en cadena
de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar genes tan
grandes como de una longitud de 1,8 kilobases. Adang et al.,
Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods
and Applications 2:266 (1993). Ouaas et al., Eur. J. Biochem.
273:617 (1988), describen la síntesis química de la
RNasa-T1, mientras que la secuencia de nucleótidos
del gen de la barnasa está descrita en Hartley, J. Molec. Biol.
202:913 (1988).
En un método alternativo, la función del polen
se interrumpe alterando el metabolismo de hormonas de plantas, tales
como auxinas y gibberelinas. Por ejemplo, el gen roIB de
Agrobacterium rhizogenes codifica una enzima que interfiere
con el metabolismo de la auxina catalizando la liberación de indoles
libres de
indoxil-\beta-glucósidos. Estruch
et al., EMBO J. 11:3125 (1991). Spena et al.,Theor. App.
Genet. 84:520 (1992) han demostrado que la expresión específica
de anteras del gen rolB en tabaco da como resultado plantas
que tienen mayores niveles de ácido
indol-3-acético, menor actividad de
gibberelina, y anteras arrugadas en las cuales está fuertemente
disminuida la producción de polen. Puesto que se espera que la
expresión del gen rolB en microesporas aumente los niveles de
ácido indol-3-acético en tejidos de
anteras, el gen rolB es otro ejemplo de un gen que es útil
para controlar la producción de polen. Slightom et al., J. Biol.
Chem. 261:108 (1985), describe la secuencia de nucleótidos del
gen rolB.
Con el fin de expresar una proteína que
interrumpe la función de las microesporas se construye un vector de
expresión en el cual una secuencia de DNA que codifica la proteína
está unida operativamente a una secuencia de DNA que regula la
transcripción del gen de una manera específica de microesporas. Los
requisitos generales de un vector de expresión se describen
anteriormente en el contexto de un sistema de expresión transitoria.
Aquí, sin embargo, el objetivo es introducir el vector de expresión
en el tejido embriógeno de plantas de tal modo que se expresará una
proteína extraña en una fase tardía del desarrollo de las
microesporas de la planta adulta. La estabilidad mitótica puede
conseguirse usando vectores virales de plantas que proporcionan
replicación epicromosómica.
Un método alternativo y preferido de obtener
estabilidad mitótica es proporcionado por la integración de
secuencias del vector de expresión en el cromosoma hospedante. Dicho
estabilidad mitótica puede ser proporcionada por la técnica de
transformación mediada por Agrobacterium ilustrada en el
Ejemplo 5, más adelante.
La transcripción del gen extraño puede
controlarse por un promotor de un gen específico de microesporas o
por un promotor viral, tal como el promotor del virus del mosaico de
la coliflor (CaMV), un promotor del virus del mosaico del virus del
mosaico de escrofularia y similares. Gruber et al., supra.
Preferiblemente, el promotor es un promotor de un gen específico de
microesporas o el promotor de núcleo CaMV 35S. Más preferiblemente,
el promotor es un promotor de un gen específico de microesporas y en
particular, el promotor del gen Bnm1.
Alternativamente, la transcripción del gen
extraño puede ser controlada por un promotor de un gen específico de
anteras. De este modo, los genes extraños capaces de interrumpir la
función celular pueden expresarse en microesporas y otras células de
anteras. Los promotores y genes específicos de anteras son conocidos
en la técnica. Véase, por ejemplo, McCormick et al.,
"Anther-Specific Genes: Molecular
Characterization and Promotor Analysis in Transgenic Plants"
en PLANT REPRODUCTION: FROM FLORAL INDUCTION TO POLLINATION, Lord
et al., (eds.), pp. 128-135 (1989); Scott
et al., Publicación de solicitud de patente internaciona Nº
WO 92/11379 (1982); van der Meer et al., The Plant Cell 4:
253 (1992). Los métodos antes descritos pueden usarse para
sintetizar químicamente un promotor específico de anteras que tiene
una secuencia publicada de nucleótidos.
Para seleccionar células transformadas, el
vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable, tal como
un gen de resistencia a herbicidas o un gen de resistencia a
antibióticos. Por ejemplo, dichos genes pueden conferir resistencia
a fosfinotricina, glifosato, sulfonilureas, atrazina, imidazolinona
o antibióticos de aminoglicósidos, tales como neomicina, kanamicina
y G428 (genticina). Preferiblemente, el gen marcador seleccionable
es el gen de neomicina-fosfotransferasa (gen
nptII).
El vector de expresión puede contener secuencias
de cDNA que codifican una proteína extraña bajo el control de un
elemento regulador específico de microesporas, así como un gen
marcador seleccionable bajo el control de un promotor constitutivo.
Alternativamente, el marcador seleccionable puede suministrarse a
células hospedantes en un vector de expresión de selección separado
por co-transformación con ambos vectores.
En un método alternativo, la esterilidad de
machos puede inducirse mediante el uso de un vector de expresión en
el cual el elemento regulador específico de microesporas está unido
operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un RNA
antisentido. La unión de moléculas de RNA antisentido a moléculas de
mRNA diana da como resultado en hibridación con detención de la
traducción. Paterson, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA,
74: 4370 (1987). Por tanto, una molécula de RNA antisentido
adecuada podría tener una secuencia que es complementaria a la de
una especie de mRNA que codifica una proteína que es necesaria para
la función celular.
Por ejemplo, las moléculas de RNA antisentido
pueden usarse para inhibir la traducción de los mRNA que codifican
actina, tubulina, ubiquitina, enzima que se conjuga con ubiquitina,
proteína transportadora de ubiquitina o factores de prolongación.
Las moléculas de DNA que codifican dichos genes pueden usarse usando
técnicas estándares. Por ejemplo, los genes de actina de plantas se
describen en Shah et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1022
(1992) y en Baird et al., EMBO J. 6:3223 (1987). Los genes de
tubulina de plantas se describen en Raha et al., Plant Mol. Biol.
9: 505(1987). Ludwig et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci.
USA 84: 5833 (1987), y Yamada et al., Plant Physiol. 103:
1467 (1993). Los genes de ubiquitina de plantas han sido aislados
por Gausing et al., Eur. Biochem. 158: 57 (1986) por Xia
et al., Plant Physiol. 104: 805 (1994). Pramanik et al.,
Plant Physiol. 102: 1049 (1993), informan de la clonación de de
la proteína portadora de ubiquitina de alfalfa, mientras que Picton
et al., Plant Physiol 103: 1471 (1993), aislaron una enzima
que se conjuga con ubiquitina de tomate. La clonación del factor de
prolongación de cebada ha sido descrita por Sutton et al., Plant
Physiol. 104: 807 (1994). Además, las moléculas de DNA que
codifican genes útiles pueden utilizarse usando secuencias
publicadas de nucleótidos, como se ha indicado
anteriormente.
anteriormente.
Además, las moléculas de RNA antisentido pueden
ser dirigidas a los mRNA que codifican proteínas esenciales para el
desarrollo de polen. Por ejemplo, la
chalcona-sintasa (CHS) cataliza la etapa inicial en
la biosíntesis de flavonoides, y una falta de actividad de CHS ha
sido correlacionada con una función anormal del polen y/o del
desarrollo. Coe et al., J. Hered. 72: 318 (1981); Taylor
et al., J. Hered. 83:11 (1992); van der Meer et al., The
Plant Cell 4: 253 (1992). Significativamente, el polen
deficiente en flavonoides no funciona en los
auto-cruzamientos. Taylor et al., supra. Por
tanto, la esterilidad de machos puede ser inducida por la inhibición
de la biosíntesis de flavonoides usando un vector de expresión que
produzca RNA antisentido para la región 3' no traducida del gen A de
la chalcona-sintasa. Van der Meer et al.,
supra. La clonación y caracterización del gen A de la
chalcona-sintasa está descrita por Koes et al.,
Gene 81: 245 (1989) y por Koes et al., Plant Molec. Biol.
12: 213 (1989).
Alternativamente puede construirse un vector de
expresión en el cual el elemento regulador específico de
microesporas está unido operativamente a una secuencia de
nucleótidos que codifica una ribozima. Las ribozimas pueden
diseñarse para expresar actividad de endonucleasa que está dirigida
a una cierta secuencia diana en una molécula de mRNA. Por ejemplo,
Steinecke et al., EMBO J. 11:1525 (1992), consiguieron hasta
100% de inhibición de la expresión del gen de la
neomicina-fosfotransferasa gene por ribozimas en
protoplastos de tabaco. Más recientemente, Perriman et al.,
Antisense Research and Development 3: 253 (1993), inhibieron la
actividad de la
cloramfenicol-acetil-transferasa en
protoplastos de tabaco usando un vector que expresaba una ribozima
del tipo cabeza de martillo modificada. En el contexto de la
presente invención, las moléculas de DNA diana apropiadas para
ribozimas incluyen especies de mRNA que codifican proteínas
esenciales para la función de las microesporas, como se ha descrito
antes.
En un método alternativo pueden construirse
vectores de expresión en los cuales un elemento regulador específico
de microesporas dirige la producción de moléculas de transcritos de
RNA capaces de promover la escisión mediada por RNasa P de moléculas
de mRNA diana. De acuerdo con este método, puede construirse una
secuencia de guía externa para dirigir la ribozima endógena, RNasa
P, a una especie particular de mRNA intracelular, que
subsiguientemente es escindido por la ribozima celular. Altman et
al., patente de EE.UU. nº 5.168.053. Yuan et al., Science
263, 1269 (1994). Preferiblemente, la secuencia de guía externa
comprende una secuencia de diez a quince nucleótidos complementaria
de una especie de mRNA que codifica una proteína esencial para la
función de las microesporas, y una secuencia de nucleótidos
3'-NCCA, en donde N es preferiblemente una purina.
Id. Los transcritos de la secuencia de guía externa se unen a
las especies de mRNA diana por la formación de pares de bases entre
el mRNA y las secuencias de guía externa complementarias,
promoviendo así la escisión de mRNA por la RNasa P en el nucleótido
localizado en el extremo 5' de la región de bases apareadas.
Id.
Alternativamente, los genes antisentido, los
genes de ribozima, y los genes de secuencias de guía externa pueden
ser regulados por una combinación de un elemento regulador
específico de microesporas y un promotor de un gen específico de
anteras. Todas las microesporas de la planta transgénica no pueden
expresar el gen extraño que interrumpe la función celular. Sin
embargo, el Ejemplo 5 presenta evidencia de que el elemento
regulador específico de microesporas del gen Bnm1 también
induce la expresión de un gen extraño en células tapetales, que son
esenciales para el desarrollo de las microesporas. Por tanto, las
secuencias reguladoras del gen Bnm1 son particularmente
adecuadas para asegurar esterilidad completa de machos.
No obstante, pueden idearse mecanismos
adicionales para interrumpir la función de las microesporas que no
expresan en el gen extraño. Por ejemplo, el gen extraño puede
codificar una proteína que estimula la producción de una molécula
difusible capaz de interrumpir la función de las microesporas
viables. Un aumento en los niveles de ácido
indol-3-acético por expresión del
gen roIB o la producción de toxina de la difteria podría
conseguir este objetivo. Además, el elemento regulador específico de
microesporas del gen Bnm1 puede estar unido operativamente a
secuencias de DNA que codifican otras macromoléculas funcionalmente
estables que pueden degradar microesporas, polen o sus componentes
estructurales (por ejemplo, las paredes celulares). De este modo,
las macromoléculas producidas en una microespora se introducen en el
lóculo (pequeña cavidad) circundante después de la degradación las
microesporas, y actúan en otras microesporas o polen.
Este método es particularmente atractivo en el
caso de heterozigotos en los que solamente el 50% de de los granos
de polen en desarrollo expresan el gen interruptor. De nuevo, la
función de las microesporas o granos de polen que no contienen el
gen extraño podría ser interrumpida por la acción de macromoléculas
liberadas desde microesporas o granos de polen que expresan el gen
extraño. Puesto que el elemento regulador del gen Bnm1
estimula la expresión del gen de un modo dependiente de tejidos, se
pueden desarrollar normalmente los tejidos restantes de la planta
estéril.
Finalmente, puede construirse un vector de
expresión en el cual la expresión del gen extraño está controlada
por un elemento regulador del gen Bnm1 y un promotor
específico de anteras, como se ha indicado anteriormente.
Los métodos antes descritos pueden usarse para
producir plantas transgénicas machos estériles para la producción de
híbridos F1 en cruzamientos dirigidos a gran escala entre líneas
endógamas. Si todas las células gametos machos de las plantas
transgénicas machos estériles no contienen el gen extraño que
interrumpe la función de las microesporas, entonces una proporción
de los híbridos F1 tendrá un fenotipo macho-fértil.
Por otro lado, los híbridos F1 tendrán fenotipo de machos estériles
si el gen extraño está presente en todas las células gametos machos
de las plantas transgénicas machos estériles debido a que sería
dominante la esterilidad inducida por el gen extraño. Además, los
híbridos F1 tendrán fenotipos de machos estériles si la expresión
del gen extraño da como resultado la interrupción de las células
vecinas. Por tanto, es deseable usar un sistema de restablecimiento
de la fertilidad de machos para proporcionar la producción de
híbridos F1 machos fértiles. Dicho sistema de restablecimiento de la
fertilidad tiene un valor particular cuando se siembra el producto
cosechado.
Un método para el restablecimiento de la
fertilidad sería cruzar plantas transgénicas machos estériles con
plantas transgénicas machos fértiles que contienen un gen de
restablecimiento de la fertilidad bajo el control de un elemento
regulador específico de microesporas de la invención. Por ejemplo,
el gen de restablecimiento de la fertilidad puede codificar una
proteína especificamente dianizada para el producto del gen
interruptor celular. Como una ilustración, Mariani et al., Nature
357: 384 (1992), cruzaron plantas
machos-fértiles que expresaban un inhibidor de
barnasa en células de anteras, denominado "barstar", con
plantas machos estériles que expresaban barnasa en las células de
anteras. Hartley, J. Mol.. Biol. 202: 913 (1988), describe la
secuencia de nucleótidos de barstar.
Alternativamente, el gen de restablecimiento de
la fertilidad puede usarse para producir moléculas de RNA que están
dianizadas para los mRNA que codifican la proteína interruptora
celular. Por ejemplo, el restablecimiento de la fertilidad de machos
puede conseguirse expresando ribozimas de la toxina de la difteria o
RNA antisentido en plantas machos-fértiles para
neutralizar los efectos de la toxina de la difteria en plantas
machos-estériles. Por tanto, la fertilidad de machos
puede restablecerse en los híbridos F1 produciendo una planta
transgénica macho-fértil que sintetiza una especie
particular de molécula de RNA o polipéptido para contrarrestar los
efectos del gen extraño particular expresado en las plantas
transgénicas machos estériles.
En un método alternativo, la fertilidad de
machos puede restablecerse por aplicación de un compuesto químico.
Como se ha analizado antes, la esterilidad de machos puede inducirse
bloqueando la expresión de chalcona-sintasa para
inhibir la biosíntesis de flavonoides. La aplicación de
flavonol-agliconas puede usarse para complementar el
defecto bioquímico y restablecer la función del polen. Mont et
al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 1713 (1992); Vogt et al.,
The Plant Cell 6: 11(1994). Las
flavonol-agliconas preferidas, tal como kaempferol,
tiene un enlace insaturado entre los carbonos de las posiciones dos
y tres en el anillo de C del esqueleto de flavonoides, así como un
grupo hidroxilo no sustituido en la posición tres del anillo C. Vogt
et al., supra.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar medios para controlar enfermedades causadas por plagas.
En particular, la presente invención abarca la producción de plantas
transgénicas que comprende, vectores de expresión en los cuales las
secuencias reguladoras del gen Bnm1 estimulan la expresión de
macromoléculas útiles para defensa contra virus e insectos.
Aproximadamente 20% de los virus de plantas se
transmiten de generación en generación en las semillas. Matthews,
PLANT VIROLOGY, 3rd Edition, (Academic Press, Inc. 1991); Mink,
Ann. Rev. Phytopathol. 31: 375 (1993). La transmisión por las
semillas se consigue ya sea por invasión directa del embrión o ya
sea por una invasión indirecta del embrión mediante los gametos
infectados. De acuerdo con Mink, supra, hay al menos nueve
virus que parecen extenderse planta a planta a través del polen, y
al menos cuatro viroides que se transmiten a través del polen a las
semillas y plantas hembras. Por tanto, el elemento regulador
especifico de microesporas del gen Bnm1 se puede usarpara
inhibir la transmisión de estos virus y viroides.
En un método para conferir protección contra
infecciones virales se usa un elemento regulador del gen Bnm1
para estimular la expresión de una proteína viral de cubierta. La
acumulación de proteínas virales de cubierta en células de plantas
transformadas proporciona resistencia a la infección viral y/o al
desarrollo de enfermedades por el virus del cual se derivó el gen de
la proteína de cubierta, así como por virus relacionados. Véase
Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 (1990); Beachy,
"Virus Resistance Through Expression of Coat Protein
Genes," en BIOTECHNOLOGY IN PLANT DISEASE CONTROL, 3rd
Edition, Chet (Ed.), pp. 89-104
(Wiley-Liss, Inc. 1993). Por ejemplo, la resistencia
mediada por proteínas de cubierta ha sido conferida por plantas
transformadas contra el virus del mosaico de la alfalfa, virus del
mosaico del tabaco, virus de bandas del tabaco, virus X de la
patata, virus Y de la patata, virus etch del tabaco, virus
rattle del tabaco, y virus del mosaico del tabaco.
Id.
Alternativamente, la protección contra
enfermedades virales puede conseguirse usando un vector que
comprende
2',5'-oligoadenilato-sintetasa de
mamíferos unido operativamente a un elemento regulador específico de
microesporas. Truve et al., Biol, Technology 11: 1048 (1993),
describe la clonación y secuencia de nucleótidos de un cDNA que
codifica
2',5'-oligoadenilato-sintetasa de
ratas, un componente de la respuesta antiviral inducida por
interferón en mamíferos. Truve et al., también describen que
las plantas transgénicas que expresan
2',5'-oligoadenilato-sintetasa están
protegidas contra la infección viral en las condiciones de
campo.
En un tercer método para proporcionar protección
contra la infección viral se usa un elemento regulador específico de
microesporas de la presente invención para dirigir la expresión del
RNA antisentido del genoma viral. Por ejemplo, el RNA antisentido
puede usarse para conferir resistencia al virus del mosaico del
pepino, como se describe por Rezaian et al., Plant Molec. Biol.
11: 463 (1988). Alternativamente, el RNA antisentido puede
usarse para conferir resistencia contra el virus del mosaico de
tomate, como se describe por Day et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci.
88: 6721 (1991).
En un cuarto método para proporcionar protección
contra infecciones virales, se usa un elemento regulador específico
de microesporas para dirigir expresión de proteína antiviral de
fitolaca (PAF), una proteína inhibidora del ribosoma encontrada en
las paredes celulares de Phytolacca americana. Lodge et
al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:7089 (1993), mostraron que
las plantas transgénicas que expresan PAF son resistentes a un
amplio espectro de virus de plantas. Lodge et al. también
describen un método para aislar cDNA de PAF.
La presente invención también contempla el uso
de un elemento reguladordel gen Bnm1 para proporcionar
protección contra plagas de insectos, tales como thrips (pequeño
insecto chupador) y los artrópodos que se alimentan de polen del
orden Thysanoptera. De acuerdo con este método se usa un
elemento regulador del gen Bnm1 para estimular la expresión
de genes de toxinas insecticidas. Por ejemplo, la bacteria
gram-positiva Bacillus thuringiensis produce
polipéptidos que son tóxicos para una variedad de plagas de
insectos, pero no tienen actividad contra vertebrados e insectos
beneficiosos. Thompson, "Biological Control of Plant Pests and
Pathogens: Alternative Approaches" en BIOTECHNOLOGY IN PLANT
DISEASE CONTROL, Chet (ed.), pp. 275-290
(Wiley-Liss, Inc. 1993). Las toxinas adecuadas de
Bacillus thuringiensis incluyen cry/A
\delta-endotoxinas que son altamente tóxicas para
insectos lepidópteros y cryIIIA
\delta-endotoxinas que son altamente tóxicas para
insectos coleópteros.
Geiser et al., Gene 48: 109 (1986),
describe la clonación y secuencia de nucleótidos de un gen de la
cry/A (b) \delta-endotoxina. La
transformación de plantas con vectores que comprende un gen de la
cry/A(b) \delta-endotoxin ha sido
descrita por Williams et al., Biol. Technology 10: 540
(1992), Koziel et al., Biol. Technology 11: 194 (1993), y
Fujimoto et al., Biol. Technology 11: 1151 (1993). Lereclus
et al., Bio/Technology 10: 418 (1992), describen la
construcción de un plásmido que comprende genes estructurales que
codifican cry/11A y cry/Ac. Además, Adang et al., Plant
Molec. Biol. 21: 1131 (1993), describen la secuencia de
nucleótidos de un gen cryIIIA sintético que se diseñó para la
expresión óptima en células de plantas. Además, las moléculas de DNA
que codifican genes de \delta-endotoxinas pueden
adquirirse a Ameri-
can Type Culture Collección (Rockville, MD), con los números de acceso ATCC. 40098, 67136, 31995 y 31998.
can Type Culture Collección (Rockville, MD), con los números de acceso ATCC. 40098, 67136, 31995 y 31998.
Como una ilustración, el perforador del maíz
europeo, Ostrinia nubilalis, es una plaga principal del maíz
en América del Norte y Europa. Después de incubar, las larvas del
perforador del maíz de la mayor parte de la segunda prole de
neonatos alimentadas sobre el polen se acumula en las axilas de las
hojas y en la vaina y los tejidos del cuello. Una vez que las larvas
empiezan a alimentarse dentro del cuello, están protegidas de los
efectos de los plaguicidas químicos. Koziel et al., supra,
demostraron que las plantas de maíz transgénicas que expresan el gen
cry/A (b) fueron resistentes a infestaciones repetidas e
intensas del perforador del maíz.
La lista siguiente proporciona otras toxinas
insecticidas conocidas que son adecuadas para la expresión
específica de microesporas.
- (1)
- Una proteína fijadora de vitamina, tal como avidina. Véase la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 07/911864, que enseña el uso de avidina y homólogos de avidina como larvicidas contra plagas de insectos.
- (2)
- Un inhibidor enzimático, por ejemplo, un inhibidor de proteasa o un inhibidor de amilasa. Véase, por ejemplo, Abe et al., J. Biol. Chem. 262: 16793 (1987) (secuencia de nucleótidos del inhibidor de cisteína-proteinasa del arroz), Huub et al., Plant Molec. Biol. 21: 985 (1993) (secuencia de nucleótidos de cDNA que codifica el inhibidor I de la proteinasa del tabaco), y Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993) (secuencia de nucleótidos del inhibidor de \alpha-amilasa de Streptomyces nitrosporeus).
- (3)
- Una hormona o feromona específica de insectos, tal como un ecdyesteroide y hormona juvenil, una de sus variantes, una base mimética basada sobre ella o uno de sus antagonistas o agonistas. Véase, por ejemplo, la descripción de Hammock et al., Nature 344: 458 (1990) de la expresión de baculovirus de la hormona esterasa juvenil clonada, un inactivador de la hormona juvenil.
- (4)
- Un péptido o neuropéptido específico de insectos que, por expresión, interrumpe la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véanse las descripciones de Regan, J. Biol. Chem. 269: 9 (1994) (la clonación de la expresión proporciona DNA que codifica el receptor de la hormona diurética de insectos), y Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989) (se identifica una alostatina en Diploptera puntata). Véase también la patente de EE.UU. Nº 5.266.317 de Tomalski et al., que describe genes que codifican neurotoxinas paralizantes específicas de insectos.
- (5)
- Un veneno específico de insectos producido en la naturaleza por una serpiente, una avispa, etc. Por ejemplo, véase Pang et al., Gene 116: 165 (1992), para la descripción de expresión heteróloga en plantas de un gen que codifica un péptido de escorpión tóxico para los insectos.
- (6)
- Una enzima responsable de una hiperacumulación de un monoterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no proteína con actividad insecticida.
- (7)
- Una enzima implicada en la modificación, incluyendo la modificación post-traduccional de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, una enzima glicolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, unafosfatasa, una quinasa, una fosforilasa, una elastasa, una quitinasa y una gluglucanasa, tanto natural como sintética. Véase la solicitud de patente PCT WO 93/02197 a nombre de Scott et al., que describe la secuencia de nucleótidos de un gen de calasa. Las moléculas de DNA que contienen secuencias que codifican quitinasa se pueden obtener, por ejemplo, en ATCC Números de acceso 39637 y 67152. Véase también Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23: 691 (1993), que enseña la secuencia de nucleótidos de un cDNA que codifica quitinasa de la lombriz del tabaco, y Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21: 673 (1993), que proporcionan la secuencia de nucleótidos del gen de la ubi4-2 poliubiquitina del perejil.
- (8)
- Una molécula que estimule la transducción de señales, por ejemplo, véase la descripción de Botella et al., Plant Molec. Biol. 24: 757 (1894) de la secuencia de nucleótidos para clones de cDNA de calmodulina de habichuela, y Griess et al., Plant Physiol. 104: 1467 (1994), que proporciona la secuencia de nucleótidos de un clon de cDNA de calmodulina de maíz.
- (9)
- Un anticuerpo específico de insectos o una inmunotoxina derivada del mismo. Por tanto, un anticuerpo dianizado para una función metabólica crítica en el intestino de insectos inactivaría una enzima afectada, matando al insecto. Compárese con Taylor et al., Abstract Nº 497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (1994) (inactivación enzimática en tabaco transgénico mediante la producción de fragmentos de anticuerpos monocatenarios).
La presente invención, descrita así de un modo
general, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes
ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende
que sean limitativos de la presente invención.
Se cultivaron microesporas de Brassica
napus cv Topas, mononucleadas tardías/binucleadas tempranas,
durante cuatro días a 32,5ºC para inducir embriogénesis. Se aisló
RNA de Poli(A)^{+} de las microesporas usando un
método con isotiocianato de guanidinio como se describe en Ouellet
et al., Plant Journal 2: 321 (1992). Se sintetizó cDNA
bicatenario a partir de RNA de poli(A) usando el sistema de
síntesis de cDNA Riboclone® (Promega Corp.; Madison, WI) y se clonó
en el vector de clonación LambdaGEM®-4 (Promega Corp.).
La genoteca de cDNA se escrutó diferencialmente
para clones específicos de microesporas sondando tomas por duplicado
con RNA de microesporas marcado con ^{32}P usado para la
construcción de la genoteca (Mi-RNA) o con RNA
marcado ^{32}P de microesporas sometidas a 25ºC durante 24 horas y
luego a 32ºC durante tres días para eliminar la respuesta embriógena
(Mx-RNA). Se purificaron y luego se caracterizaron
tres clones de cDNA (Mi-cDNA 3, 4 y 5) que se
hibridaron con Mi-RNA, pero no con
Mx-RNA.
Una transferencia Southern de cada clon de cDNA
aislado se hibridó con sondas de cDNA marcadas con ^{32}P que
representan la genoteca de DNA total de microesporas. Los brazos de
DNA del promotor napin y del vector lambda se incluyeron en la
transferencia como controles negativos. Tanto
Mi-cDNA 3 como Mi-cDNA 4 se
hibridaron con la sonda de cDNA total y se encontró que contenían
insertos de aproximadamente 800 pares de bases. El análisis de la
secuencia de nucleótidos reveló que Mi-cDNA 3 y
Mi-cDNA 4 eran idénticos, y probablemente contenían
insertos de cDNA de longitud completa debido a que ambos cDNA
terminaban en el mismo nucleótido. El clon de cDNA específico de
microesporas se designó Bnm1. En la Figura 1 se muestra la
secuencia de nucleótidos del cDNA de Bnm1 [SEQ ID NO: 1] con
su correspondiente secuencia de aminoácidos [SEQ ID NO: 2].
Se realizaron análisis Northern para
caracterizar el modelo de expresión del gen Bnm1. Estos
estudios revelaron que el cDNA de Bnm1 se hibridaba con RNA
de brotes enteros, flores y anteras, pero no se hibridaba con RNA
aislado de raíces, tallos, hojas, pistilos y semillas en desarrollo.
La expresión de RNA de Bnm1 fue muy fuerte en microesporas
trinucleadas y binucleadas pero estaba esencialmente ausente en las
fases mononucleadas y de tetradas del desarrollo de microesporas.
Los resultados de los análisis Northern también indican que el RNA
de Bnm1 se expresa en una mayor extensión en todo el
desarrollo de las microesporas, en comparación con los clones
específicos de microesporas Bp4, Bp10 y Bp19 de
Brassica. Albani et al., Plant Molecular Biology 15:
605 (1990); Albani et al., Plant Molecular Biology 16: 501
(1991); Albani et al., The Plant Journal 2: 331 (1992).
Para caracterizas más el clon Bnm1, se
cultivaron microesporas mononucleadas a 32,5ºC durante cuatro días
para inducir la embriogénesis o bien se cultivaron a 24ºC durante
cuatro días para permitir el desarrollo del polen. Los embriones de
microesporas se aislaron en las fases o estados de desarrollo
globular, torpedo, corazón y cotiledonal. Los análisis Northern de
las muestras de RNA revelaron bajos niveles de expresión del gen
Bnm1 en microesporas inducidas a embriogénesis con niveles
marcadamente mayores de expresión en microesporas inducidas por
polen. Las muestras de RNA de las fases o estados de desarrollo
globular, torpedo, corazón y cotiledonal no se hibridaban con la
sonda de Bnm1.
Las hibridaciones para el análisis Southern y el
escrutinio genómico, analizadas más adelante, se realizaron a 42ºC
usando la siguiente mezcla de hibridación: formamida al 50%,
solución de Denhardt 10x: (100x: 10 gramos de polivinilpirrolidona,
10 gramos de seroalbúmina y 10 gramos de Ficoll 400 en 500
mililitros de agua estéril), tampón 5x SSC (20x: cloruro de sodio 3M
y citrato de Na_{3}..2H_{2}O 0,3M, pH 7,0), fosfato sódico 50 mM
(pH 7,0), dodecil-sulfato sódico al 1%, y 5 mg/ml de
DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Las transferencias se
lavaron usando requisitos muy estrictos (0,1x SSC, 65ºC) y luego se
incubaron con una película de rayos X para diverso periodos de
tiempo con el fin de obtener la exposición óptima.
En una serie de experimentos se sondó
Bnm1 contra una transferenciaSouthern de muestras de DNA
obtenidas de B. campestris cv Candle, B. napus cv Topas, B.
oleracea alboglabra, picea negro, Arabidopsis thaliana,
girasol, tabaco, cebada y maíz. Los resultados que indican que el
gen Bnm1 está presente en picea negro, cebada, y las
crucíferas, pero no en girasol, tabaco o maíz.
Se construyó una genoteca genómica de
Brassica napus digeriendo parcialmente DNA genómico de B.
napus cv Westar con Sau3Ae insertándolos fragmentos de
DNA (tamaño medio del inserto aproximadamente 8 kilobases) en el
sitio SAII parcialmente hueco-lleno del plásmido
TZ18R. Mead et al., Protein Eng. 1: 67 (1986); Nantel et
al., Plant Molecular Biology 16: 955 (1991). Siguiendo el método
de Nantel et al., supra, la genoteca se recogió en 42
fracciones, una parte alícuota de cada fracción se digerió con
EcoRI, y los productos de digestión con EcoRI se
examinaron por análisis Southern para identificar que
fracción(es) contenía(n) clones genómicos
correspondiente a cDNa de Bnm1.
Se escrutaron aproximadamente 10.000 colonias de
cada fracción que se hibrida positivamente con filtros
Hybond-N (Amersham Corp.; Arlington Heights, IL)
usando una sonda de cDNA marcado con cebador al azar de
^{32}P-dCTP. Las colonias hibridantes se
cultivaron por duplicado sobre placas de ensayo de rejilla de
colonias para escrutinio secundario. Los positivos potenciales se
tomaron a través de un escrutinio terciario final para aislar
colonias positivas individuales. Después de la tercera ronda de
escrutinio se identificaron cinco clones que mostraban señales
positivas fuertes.
Se generaron mapas de restricción para cinco
clones genómicos positivos usando como sonda el cDNA del gen
Bnm1 completo. Los resultados de estos estudios sugieren que
tres de los cinco clones representaban el mismo fragmento genómico.
Uno de estos tres clones más los dos clones restantes
(Bnm1-5, 8 y 31) se caracterizaron adicionalmente. La
cartografía por restricción y el análisis Southern eliminó
Bnm1-5 como clon genómico útil.
Se determinaron las longitudes de la región
aguas arriba (hacia el extremo 5') en Bnm1-8 y Bnm1-31
sintetizando los siguientes oligonucleótidos para amplificar el
extremo 5' del gen Bnm1 cuando se usa en combinación con
cualquiera de los cebadores de secuenciación universales o
inversos:
MSP-1 y MSP-2 se
diseñaron para generar fragmentos que difieren en tamaño en
aproximadamente 230 pares de bases. Los cebadores se asociaron a
65ºC en tampón 1x de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(Perkin Elmer Corp.; Norwalk, CT) que contenía MgCl_{2} 2,5
mM.
Se amplificaron dos bandas, 2,7 kilobases y 3,2
kilobases, a partir de Bnm1-8 usando los cebadores
MSP-1 y MSP-2, respectivamente en
combinación, con el cebador de secuenciación inversa. La diferencia
inesperada de 500 pares de bases en el tamaño se pensó que era
debida a la presencia de un intrón. Se secuenció la región
codificadora del clon genómico clone y se confirmó la presencia de
un solo intrón de 361 pares de bases. La Figura 2 muestra la
secuencia de nucleótidos [SEQ ID NO: 5] del clon genómico
Bnm1 con regiones aguas arriba y codificadora.
Para determinar la secuencia de nucleótidos de
los fragmentos de la PCR, cada fragmento se digerió con EcoRI
y un fragmento de 1,3 kilobases se subclonó enel sitio
EcoRI-HincII de pTZ18R. Las moléculas de DNA ligadas
se introdujeron en la cepa de E. coli DH5\alphaMCR-. Los
fragmentos de PCR subclonados se secuenciaron usando un kit
Sequenase (United States Biochemical Corp.; Cleveland, OH) que usa
el protocolo de terminación de cadena mediado por didesoxi de Sanger
et al. J. Mol. Biol. 94: 441 (1975).
Se encontró que los fragmentos de PCR contenían
solo 535 pares de bases de la secuencia 5' aguas arriba no
traducida. Luego se subclonó un fragmento PvuII-BamHI
de 2,95 kilobases del clon genómico Bnm1 original para
obtener secuencias adicionales aguas arriba. Se usó recorrido del
cebador para secuenciar un total de 820 bases de la supuesta región
promotora.
Para examinar la función del promotor del gen
Bnm1, se diseñó el siguiente conjunto de cebadores de PCR
para añadir un sitio SalI en el extremo 5' del promotor
introducir un sitio NcoI en el codón ATG:
El cebador MSP-6 consiste en 23
nucleótidos de la región 5' aguas arriba partiendo del nucleótido
-820 y también incluye un sitio SalI aguas arriba para
facilitar la clonación. El cebador MSP-7 consiste en
23 nucleótidos que flanquean el codón de iniciación ATG y se diseñó
para crear por ingeniería genética un sitio NcoI en el codón
de iniciación del gen Bnm1. MSP-7 también
incluye un sitio Xba/I para facilitar la clonación.
Usando estos cebadores se amplificó, clonó y
secuenció un fragmento de 844 pares de bases. El fragmento de DNA
incluía 820 pares de bases de la región promotora situada
directamente aguas arriba del sitio de iniciación ATG del gen
Bnm1. La secuencia de nucleótidos [SEQ ID NO: 8] del
fragmento de 844 pares de bases se muestra en la
Figura 3.
Figura 3.
El fragmento promotor se digerió con
NcoI-SalI, se ligó a un fragmento
Nco/I-EcoRI que contenía un gen informador GUS y la
región 3' no traducida (terminador) de un gen inhibidor de
proteinaza de patata (PINII), y se clonó en sitios
SalI-EcoRI de ambos pBluescript® II SK+ (Stratagene
Cloning Systems; La Jolla, CA)yDP1741 para producir los
vectoresDP5476 (Figura 4) y DP5477 (Figura 5), respectivamente.
DP1741 difiere de pBl101.1 (Jefferson, Plant Molecular Biology
Reporter 5: 387 (1987) por contener las secuencias reguladoras
de CaMV 35S, en lugar de las secuencias reguladoras 5' y 3' de la
nopalina-sintasa, para regular la expresión del
marcador seleccionable NPTII.
La construcción binaria DP5477 se transformó en
B. napus cv Westar mediante co-cultivo
mediado por Agrobacterium de peciolos cotiledóneos usando la
metodología general de Moloney et al., Plant Cell Reports 8:
238 (1889). Se encontró que las microesporas aisladas de tres de
cada cuatro transgénicos de canola analizadas para actividad de GUS
estaban intensamente teñidas, mientras que la cuarta exhibía una
ligera tinción azul. La expresión de GUS parece estar localizada
principalmente en las microesporas puesto que no se tiñeron otros
tejidos incluyendo paredes de las anteras, pistilos y sépalos. Sin
embargo, la matriz dentro de los lóculos estaba teñida de azul
indicando que en ellos puede haber algo de expresión tapetal. La
mayoría de la expresión de GUS parece estar asociada con
microesporas mononucleadas y binucleadas, y es probable que la
expresión sea post-meiótica, debido a que no estaban
manchadas el 25 al 50% de las microesporas.
Aunque la descripción anterior se refiere a
realizaciones preferidas particulares, ha de entenderse que la
presente invención no está limitada a las mismas. A los expertos con
conocimiento ordinario de la técnica se les ocurrirá que pueden
hacerse diversas modificaciones de las realizaciones descritas.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente
mencionadas en esta memoria son indicactivas del nivel de
conocimiento de los expertos en la técnica a la que pertenece esta
invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 700 Capital Square, 400 Locust Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Des Moines
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO O PROVINCIA: Iowa
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 50390
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ELEMENTO REGULADOR ESPECÍFICO DE MICROESPORAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Foley & Lardner
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3000 K Street, N.W., Suite 500
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: D.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 20007-5109
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRMA: Patent In Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS USUALES DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: PENDIENTE DE ASIGNAR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD : US 08/345,756
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-NOV-1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BENT, STEPHEN A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 29,768
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 33229/372/PIHI
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (202)672-5300
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (202)672-5399
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 904136
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 786 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 24..569
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 182 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGAATTC GCCGCCGCGG CGAAGGTAGA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGAATTC CTGCCTTACC CGTCTCAGCC ACG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2039 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGTCGAC GCATCAAAGT GATGCGGAAG GAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGGTCTA GAACGTTGCC ATGGTCTTTG CGTCG
\hfill3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 859 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8
Claims (25)
1. Una molécula de DNA que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- SEQ ID NO:8;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos con al menos 65% de similitud con la SEQ ID NO:8, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas; y
- (c)
- un fragmento de la secuencia de nucleótidos de (a), en donde dicho fragmento tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas.
2. La molécula de DNA de la reivindicación 1, en
donde dicha molécula de DNA consiste en la secuencia de nucleótidos
de la SEQ ID NO:8.
3. Un vector de expresión que comprende un
elemento regulador específico de microesporas de la reivindicación 1
ó 2.
4. El vector de expresión de la reivindicación
3, que comprende además un promotor, en donde la función de dicho
promotor está bajo el control de dicho elemento regulador específico
de microesporas.
5. El vector de expresión de la reivindicación
4, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en
el promotor del gen Bnm1, un promotor específico de anteras y
el promotor de núcleo CaMV 35S.
6. El vector de expresión de la reivindicación 4
ó 5, que comprende además un gen extraño, en donde dicho gen extraño
está unido operativamente a dicho promotor.
7. El vector de expresión de la reivindicación
6, en donde el producto de dicho gen extraño interrumpe la función
de las microesporas.
8. Un método de producir una planta macho
estéril, que comprende la etapa de introducir el vector de expresión
de la reivindicación 7 en células embriónicas de planta, en donde
dicho gen extraño se selecciona del grupo que consiste en un gen
estructural, un gen antisentido, un gen de ribozima y un gen de una
secuencia de guía externa.
9. El método de la reivindicación 8, en donde
dicho gen estructural codifica una proteína seleccionada del grupo
que consiste en toxina de la difteria, proteína antiviral de
fitolaca, RNasa-T1 de Aspergillus oryzae,
barnasa y el producto del gen rolB.
10. El método de la reivindicación 8, en donde
el producto de dicho gen antisentido se selecciona del grupo que
consiste en: RNA antisentido de actina, RNA antisentido de tubulina,
RNA antisentido de ubiquitina, RNA antisentido de la enzima que se
conjuga con ubiquitina, RNA antisentido de la proteína portadora de
ubiquitina, RNA antisentido de factor de prolongación y RAN
antisentido de chalcona-sintasa.
11. El método de la reivindicación 8, en donde
dicho gen de ribozima comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en: secuencias de nucleótidos de
actina, secuencias de nucleótidos de tubulina, secuencias de
nucleótidos de ubiquitina, secuencias de nucleótidos de una enzima
que se conjuga con ubiquitina, secuencias de nucleótidos de la
proteína portadora de ubiquitina; secuencias de nucleótidos del
factor de prolongación y secuencias de nucleótidos de
chalcona-sintasa.
12. El método de la reivindicación 8, en donde
dicho gen con secuencia de guía externa comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de
nucleótidos de actina, secuencias de nucleótidos de tubulina,
secuencias de nucleótidos de ubiquitina, secuencia de nucleótidos de
una enzima que se conjuga con ubiquitina, secuencia de nucleótidos
de la proteína portadora de ubiquitina, secuencia de nucleótidos de
factor de prolongación y secuencia de nucleótidos de
chalcona-sintasa.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en donde dichas células embriógenas de
planta son células de Brassica napus.
14. Una planta transgénica que comprende el
vector de expresión de la reivindicación 7.
15. Un método de producir un planta estéril
macho, que comprende:
- (a)
- construir un vector de expresión que comprende un elemento regulador específico de microesporas, un promotor, y un gen extraño, en donde dicho elemento regulador específico de microesporas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (i)
- SEQ ID NO: 8,
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 65% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 8, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas; y
- (iii)
- un fragmento de (i), en donde dicho fragmento tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas,
en donde dicho elemento regulador específico de
microesporas en conjunción con dicho promotor controla la expresión
de dicho gen extraño, y en donde el producto de dicho gen extraño
interrumpe la función de las microesporas, con lo cual se produce
una planta macho estéril.
16. El método de la reivindicación 15, que
comprende además la etapa de:
- (b)
- introducir dicho vector de expresión en células embriógenas de plantas.
17. Un método de usar un elemento regulador
específico de microesporas para producir una planta fértil macho
híbrida, que comprende:
- (a)
- producir una primera planta parental macho estéril que comprende un vector de expresión que comprende un elemento regulador específico de microesporas de la reivindicación 1 ó 2, un promotor, y un primer gen extraño, en donde dicho elemento regulador específico de microesporas en conjunción con dicho promotor controla la expresión de dicho primer gen extraño, y en donde el producto de dicho primer gen extraño interrumpe la función de las microesporas;
- (b)
- producir una segunda planta precursora que comprende un vector de expresión que comprende dicho elemento regulador específico de microesporas, un promotor y un segundo gen extraño, en donde dicho elemento regulador específico de microesporas en conjunción con dicho promotor controla la expresión de dicho segundo gen extraño; y
- (c)
- someter a fertilización cruzada a dicha primera planta precursora con dicha segunda planta precursora para producir una planta híbrida,
en donde las microesporas de dicha planta
híbrida expresan dicho segundo gen extraño, y en donde el producto
de dicho segundo gen extraño impide la interrupción de la función de
las microesporas por el producto de dicho primer gen extraño,
produciendo de este modo una planta híbrida macho fértil.
18. El método de la reivindicación 17, en donde
dicho primer gen extraño codifica barnasa y dicho segundo gen
extraño codifica un inhibidor de barnasa.
19. El método de la reivindicación 17, en donde
dicho producto de dicho primer gen extraño es toxina de la difteria
y dicho producto de dicho segundo gen extraño es una ribozima de la
toxina de la difteria.
20. Un método para restablecer la fertilidad de
una planta macho estéril híbrida, que comprende tratar la planta
macho estéril híbrida con flavonol-aglicona, en
donde dicha planta macho estéril híbrida comprende un vector de
expresión que comprende: un elemento regulador específico de
microesporas, un promotor, y un gen extraño, en donde dicho elemento
regulador específico de microesporas comprende una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- SEQ ID NO:8;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos con al menos 65% de similitud con la SEQ ID NO:8, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas; y
- (c)
- un fragmento de (a), en donde dicho fragmento tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas,
en donde dicho elemento regulador específico de
microesporas en conjunción con dicho promotor controla la expresión
de dicho gen extraño, y en donde dicho gen extraño expresa RNA
antisentido de chalcona-sintasa, produciendo de este
modo microesporas deficientes en flavonol.
21. El método de la reivindicación 20, en donde
dicha flavonol-aglicona es kaempferol.
22. Un método para producir plantas transgénicas
resistentes a enfermedades causadas por virus o insectos, que
comprende:
- (a)
- construir un vector de expresión que comprende un elemento regulador específico de microesporas, un promotor, y un gen extraño, en donde dicho elemento regulador específico de microesporas comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (i)
- SEQ ID NO: 8,
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 65% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 8, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas; y
- (iii)
- un fragmento de (i), en donde dicho fragmento tiene la función de un elemento regulador específico de microesporas,
en donde dicho elemento regulador específico de
microesporas en conjunción con dicho promotor controla la expresión
de dicho gen extraño, y en donde el producto de dicho gen extraño
interrumpe la función de dicho virus o codifica una toxina
insecticida, con lo cual confiere resistencia a enfermedades.
23. El método de la reivindicación 22, que
comprende además la etapa de:
- (b)
- introducir dicho vector de expresión en células embriógenas de plantas .
24. El método de la reivindicación 22 ó 23, en
donde dicho producto de gen extraño interruptor de virus se
selecciona del grupo que consiste en proteína de cubierta viral,
2',5'-oligoadenilato-sintetasa, RNA
antisentido de genoma viral y proteína antiviral de fitolaca.
25. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, en donde dicha toxina insecticida es una
endotoxina de Bacillus thuringiensis.
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|---|---|---|---|
| US345756 | 1989-05-01 | ||
| US08/345,756 US5633438A (en) | 1994-11-22 | 1994-11-22 | Microspore-specific regulatory element |
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|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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