ES2270434T3 - Sistema para el tratamiento ciclico de los cambios de temperatura de las muestras liquidas. - Google Patents
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Abstract
UN SISTEMA PARA TRATAMIENTO DE CAMBIO DE TEMPERATURA DE LIQUIDOS, EN PARTICULAR EN LA REALIZACION DE AISLAMIENTO Y AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS CON UN ELEMENTO DE ATEMPERADO RECUPERABLE Y UN ELEMENTO DE CALENTAMIENTO DISPONIBLE, TIENE LA VENTAJA DE REALIZACION ESPECIALMENTE SENCILLA DE TRATAMIENTO DE CAMBIO DE TEMPERATURA. ESTE SISTEMA PERMITE LA REALIZACION DE UNA PREPARACION DE MUESTRA Y UNA AMPLIFICACION EN UN RECIPIENTE UNICO.
Description
Sistema para el tratamiento cíclico de los
cambios de temperatura de las muestras líquidas.
El objetivo de la invención es un sistema para
el tratamiento del cambio de temperatura de los ácidos nucléicos,
un método para el tratamiento del cambio de temperatura de las
muestras líquidas y un método para la detección de un ácido
nucleico en una muestra.
El ajuste de una determinada temperatura en un
líquido es un criterio importante en las reacciones en las que
participan componentes activos desde un punto de vista biológico. Si
la temperatura no se ajusta de forma correcta, puede ocurrir que
una reacción determinada no transcurra o bien únicamente transcurra
en un entorno no deseado. Esto es especialmente válido en todas las
reacciones en las que intervienen los enzimas. Los enzimas
presentan, dependiendo de la temperatura, distintas cinéticas de
reacción. Además, la formación de complejos entre elementos de
enlace biológicos, por ejemplo, ácidos nucleicos complementarios
unos con otros, depende de la temperatura. Por encima de la
temperatura de fusión los ácidos nucleicos se presentan en forma de
una única hélice y por debajo de dicha temperatura en forma de
doble hélice. Para el caso en que pueden transcurrir varias
reacciones una tras otra, que exigen diferentes condiciones de
temperatura, es conveniente modificar la temperatura del medio de
reacción.
Hasta el momento esto se hacía de manera que el
recipiente en el que se encuentra la mezcla de reacción, se
desplazaba entre los baños de líquido a diferente temperatura. De
modo que el recipiente se sumergía un tiempo determinado en cada
baño, y de esta forma el líquido contenido en el recipiente adquiría
la temperatura del medio. Una vez transcurrido el tiempo suficiente
para la reacción deseada se transfería el recipiente con el líquido
a otro baño de líquido. Estos métodos eran naturalmente muy costosos
y difícilmente automatizables.
Recientemente se han desarrollado unos aparatos,
en los cuales el recipiente con el líquido que se va a atemperar se
dejan en un lugar, no obstante se ha modificado la temperatura del
medio. Este procedimiento tiene el inconveniente de que es
relativamente costoso en tiempo, porque debe modificarse la
temperatura del medio total de enfriamiento. En particular es éste
perjudicial en los procesos de enfriamiento.
En particular en el sector del diagnóstico de
ácidos nucleicos se emplean con frecuencia tratamientos de cambio
de temperatura. Por ejemplo, en la reacción en cadena de la
polimerasa (EP-A-201184) se modifica
cíclicamente la temperatura del medio regulador de la temperatura.
Para ello se han descrito los llamados termocicladores
(US-A-5.038.852 y
EP-A-0 488 769). En este método se
calienta y enfría un bloque de reacción de tipo metálico, en el que
se observan unas escotaduras para los recipientes de reacción, para
conseguir los tratamientos de cambio de tempera-
tura.
tura.
En la WO 92/07089 se describe un sistema, en el
cual el líquido de reacción es transportado en una circulación
cerrada entre zonas con elementos de frío o de calor. Sin embargo,
el sistema requerido para ello es complicado y poco adecuado para
un uso rutinario.
En la anterior
DE-A-4409436, no publicada con
anterioridad, se describe un método, en el cual se sumerge un
elemento de calor y frío combinados en el medio de reacción y la
temperatura del medio de reacción únicamente se modifica en la
proximidad inmediata del elemento de calefacción.
Al realizar un tratamiento para el cambio de
temperatura de las muestras líquidas, en particular durante la
reacción en cadena de la polimerasa se emplearán temperaturas, en
las cuales la presión de vapor del agua es relativamente elevada.
Por ello se condensa algo de líquido en la tapa del recipiente de
reacción. Sin embargo, puesto que esto conduce a una concentración
de los componentes de reacción en la mezcla de reacción, que no es
controlable, se ha propuesto integrar en la tapa un calentamiento,
de manera que las gotitas de líquido eventualmente depositadas en
la tapa puedan pasar de nuevo a la fase gas. Estos calentamientos de
la tapa se colocan de manera que únicamente se calientan unas zonas
que no se sumergen en la mezcla de reacción.
El objetivo de la presente invención consistía
en preparar o disponer de un sistema alternativo para el tratamiento
del cambio de temperatura de los líquidos.
El objetivo de la invención es un sistema para
el tratamiento del cambio de temperatura de los líquidos que
contienen ácidos nucleicos en un recipiente, donde el sistema
contiene un elemento de regulación de la temperatura
re-evaluable, un recipiente y un elemento de
calefacción desechable, de manera que el elemento de calefacción es
un componente integrado del recipiente o de una tapa del recipiente
y se sumerge para realizar el tratamiento en el líquido.
Asimismo el objetivo de la invención es un
procedimiento para el tratamiento de ácidos nucleicos en un líquido
con el ajuste de 2 o más temperaturas por medio de un elemento de
calefacción y de regulación de la temperatura, donde el elemento de
regulación es parte de un aparato reevaluable y el elemento de
calefacción es parte de un dispositivo desechable.
El sistema conforme a la invención se ha pensado
para su uso en dicho método, en el cual un líquido o segmentos del
mismo deben ser llevados a distintos niveles de temperatura. Esto es
conveniente, por ejemplo, cuando los procesos que deben transcurrir
en el líquido, por ejemplo, las reacciones químicas o
preferiblemente enzimáticas, se producen únicamente o
preferiblemente a determinadas temperaturas. Se han descrito otros
procesos que son sensibles a la temperatura como la separación de
hélices de ácido nucleico complementarias unas a otras por
calentamiento o bien incubación del líquido a una temperatura por
encima del punto de fusión correspondiente (T_{m}) y la formación
de híbridos de ácidos nucleicos, que básicamente son complementarios
unos a otros a unas temperaturas que se encuentran por debajo del
punto de fusión, preferiblemente superiores a 15ºC por debajo del
punto de fusión, la llamada hibridación. Otro proceso que requiere
el tratamiento a una temperatura elevada es la disgregación de los
compartimentos celulares. Además se pueden aprovechar temperaturas
elevadas para la destrucción de las sustancias inactivables por la
temperatura, que se encuentran contenidas en el líquido, por
ejemplo, incluso para la inactivación de los enzimas empleados para
la disgregación, por ejemplo, las proteinasas. El sistema conforme
a la invención permite el ajuste de la temperatura correspondiente o
deseada, independientemente de la frecuencia a la que se requiera
un cambio de temperatura. Por eso también es posible realizar una o
varias de estas etapas una tras otra y varias veces, por ejemplo, de
forma cíclica.
Por un tratamiento de cambio de temperatura de
un líquido debe entenderse en el sentido de la invención un
tratamiento del líquido, en el cual el líquido se trata de manera
que los procesos que deben transcurrir en el líquido puedan
desarrollarse a distintas temperaturas. Aquí se engloban tanto
perfiles de temperatura temporales como perfiles de temperatura
locales.
Un ejemplo destacado de la realización múltiple
de tratamientos a diferentes temperaturas es la amplificación de
los ácidos nucleicos según la reacción en cadena de la polimerasa.
Esta reacción es frecuente entre los expertos y se ha descrito en
las más diversas modificaciones. Un ejemplo a destacar de una
publicación de este tipo es la
US-A-4.683.202. La característica
esencial de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) es la
realización múltiple de ciclos de temperatura, los cuales permiten
un tratamiento a elevadas temperaturas, por ejemplo, en una zona
entre 90 y 95ºC para lograr una sola hélice de ácidos nucleicos de
doble hélice, un tratamiento a temperaturas inferiores, por ejemplo
en el intervalo entre 50 y 65ºC, para la hibridación de cebadores o
iniciadores de las secuencias de ácidos nucleicos que se van a
amplificar y a una temperatura media, por ejemplo, en un intervalo
entre 70 y 75ºC, para la prolongación óptima del cebador utilizando
el ácido nucleico a amplificar como matriz. Las posibilidades para
la variación de los ciclos de temperatura se han descrito, por
ejemplo, en EP-A-0 511 712.
Los ácidos nucleicos, que pueden ser sometidos a
un tratamiento conforme a la invención, son todos de procedencia
natural o bien derivados de bases nucleicas que contienen
biopolímeros o análogos, que se obtienen por modificación o bien de
la base o del esqueleto de fosfato de azúcar. Los ácidos nucleicos
pueden presentarse en el líquido en forma disuelta, en forma
enlazada a las células y en una forma enlazada a una superficie
sólida (inmovilizada), por ejemplo, en partículas. Es posible pasar
los ácidos nucleicos de una forma inmovilizada a la forma disuelta
y viceversa, por ejemplo, mediante el calentamiento de los ácidos
nucleicos enlazados a una superficie por una sonda
inmovilizada.
Como líquidos son en principio especialmente
adecuados todos los líquidos que contienen ácido nucleico, por
ejemplo, muestras que se han extraído directamente de su entorno
primitivo. Como líquidos son especialmente adecuados los que han
experimentado un cierto tratamiento, por ejemplo, un paso para
eliminar determinados componentes de las muestras (por ejemplo, un
análisis posterior de los componentes perturbadores), para licuar
la muestra (por ejemplo, en muestras altamente viscosas), o para
diluir la muestra, e incluso para el aislamiento del ácido nucleico
de una muestra original (por ejemplo, para una limpieza previa).
Como muestras se tienen en cuenta en particular
los líquidos corporales como la sangre, orina, esputo o frotis.
El recipiente en el que se realiza el
tratamiento del cambio de temperatura se ha fabricado
preferiblemente de un material, que no sufre ningún cambio de forma
en el tratamiento ni permite que parte componentes del material
pasen al líquido. Son especialmente adecuados para ello los
plásticos, por ejemplo, polipropileno o poliestireno. Las
dimensiones del recipiente se eligen de manera que encajen la
muestra y los reactivos que eventualmente se añaden y el elemento
de calefacción. Son especialmente adecuados, por ejemplo, los
recipientes derivados de las capsulitas Eppendorf. Dichos
recipientes se obtienen en el comercio o se fabrican fácilmente
mediante un método de moldeo por inyección.
Otro componente esencial del sistema es una
tapa, con la cual pueda cerrarse el recipiente. Debería ser adecuada
para ello de manera que pudiera mantener en unos límites la entrada
y salida de contaminaciones, por ejemplo, por aerosoles. Esta
consta también de un material básicamente resistente a la
temperatura como el indicado para el recipiente.
Un elemento regulador de la temperatura es un
dispositivo que de forma activa puede llevarse a una temperatura
deseada, preferiblemente un elemento refrigerante. El elemento
refrigerante en el sentido de la invención es un objeto, que se
enfría de forma activa y puede absorber calor directa o
indirectamente del líquido. No abarca el recipiente. En una primera
forma o configuración el elemento refrigerante es, por ejemplo, un
bloque de metal, que puede ser enfriado por elementos Peltier
(enfriamiento en seco) o bien a través de líquidos refrigerados
(enfriamiento del líquido). Siempre que se trate de un bloque
metálico, éste se adapta preferiblemente al contorno exterior del
recipiente. La adaptación puede ocurrir, por ejemplo, de manera que
el elemento refrigerante presente unas escotaduras cilíndricas
huecas, en las cuales puedan introducirse los recipientes. Cuanto
mejor es la adaptación del elemento refrigerante a la forma externa
del recipiente, tanto mejor es la acción refrigerante. En otra
configuración, el elemento refrigerante, preferiblemente un elemento
metálico, que sobresale por una abertura, preferiblemente un
orificio que se cierra mediante la tapa, está en el recipiente,
preferiblemente hasta el nivel de líquido. Aquí se prefiere un
enfriamiento por medio de un elemento Peltier. El elemento
refrigerante está protegido en este caso por una lámina, por
ejemplo, de teflón o de poliéster, de la contaminación directa a
través del líquido.
La lámina no se considera como parte del
elemento refrigerante, puesto que no es reciclable. El elemento
refrigerante, sin embargo, puede ser un baño de agua, en el cual
entra el recipiente. El paso del calor se produce del medio
refrigerante líquido directamente al medio de reacción a través del
recipiente. Un elemento regulador de la temperatura en el sentido
de la invención puede tener también una función calefactor, cuando
el tratamiento del cambio de temperatura en el líquido requiere una
temperatura límite mínima, que básicamente se encuentra más de 5 K
por encima de la temperatura ambiente. En este caso puede ocurrir
que el transporte del calor a través del elemento regulador al
entorno sea tan grande que para obtener la temperatura de percepción
mínima deba alimentarse calor. Con todo, la temperatura mínima del
elemento regulador alcanzada durante el proceso se encuentra
siempre por debajo de la máxima temperatura del elemento de
calefacción alcanzada durante el proceso.
Por capacidad de reutilizar o reciclar el
elemento refrigerante se entiende la posibilidad de utilizar el
mismo elemento refrigerante para el tratamiento de al menos otro
líquido. Este otro líquido tiene preferiblemente una composición
distinta del primer líquido, de manera debe tenerse en cuenta que se
minimiza una contaminación de otro líquido a través del primer
líquido. Por este motivo se prefiere la configuración en la que el
elemento refrigerante enfría el recipiente desde fuera.
Un elemento calefactor en el sentido de la
invención es un objeto, que se calienta de forma activa, y cuya
evolución del calor se aprovecha para el calentamiento del líquido
que se va a tratar. Puede tratarse de un elemento calefactor de
varios componentes. Preferiblemente el elemento calefactor contiene
un alambre metálico o una lámina metálica, por ejemplo de oro, o
bien un elemento de grafito. Dichos elementos calefactores son
conocidos por los expertos. La potencia de calentamiento del
elemento calefactor se determina de manera que la temperatura
deseada del líquido se alcanza en un tiempo deseado. Esto se puede
conseguir, por ejemplo, variando las dimensiones del elemento
calefactor, los materiales empleados y la transmisión de la
corriente.
Desechable en el sentido de la invención es un
elemento que se tira tras llevar a cabo un método para el
tratamiento del cambio de temperatura de un líquido determinado. No
se emplea para el tratamiento del cambio de temperatura de otros
líquidos, que deben someterse a un tratamiento de cambio de
temperatura independiente. En particular, en la analítica de dichos
líquidos se desecha el elemento calefactor entre cada análisis. Por
este motivo se prefieren elementos calefactores de fabricación
simple y barata.
Un componente integrado en la estructura en el
sentido de la invención es un componente, que no se puede separar
sin que no se altere el elemento calefactor o alguna pieza del
recipiente o de la tapa. Resulta preferible que el elemento
calefactor se integre en el recipiente o en la tapa, lo que aporta
ventajas para la fabricación técnica de la fundición por inyección.
En una primera configuración, el elemento calefactor puede estar
integrado en el recipiente. Para ello debería tenerse en cuenta que
el elemento calefactor está localizado en la zona de recepción del
líquido, es decir, por ejemplo en la base del recipiente o en la
pared lateral del recipiente, que entra en contacto con el líquido
que se va a calentar. En la configuración preferida en la que el
elemento calefactor es un componente que forma parte de la tapa, el
elemento calefactor se fija preferiblemente en el lado interno de
la tapa y penetra en el recipiente una vez puesta la tapa hasta por
debajo del nivel de líquido. El elemento calefactor o las
conexiones, por ejemplo, para la corriente salen hacia fuera por el
lado externo y pueden estar provistas de elementos de acoplamiento a
un aparato reutilizable par el abastecimiento del elemento
calefactor con corriente y si fuera preciso para la regulación de la
potencia calorífica.
El sumergir el elemento calefactor en el
recipiente se realiza de manera que la parte del líquido que se va
a calentar pueda recibir suficiente calor. El elemento calefactor
penetra preferiblemente con toda su altura en el líquido.
El sistema conforme a la invención puede
contener además de los componentes esenciales que son el recipiente,
la tapa, el elemento calefactor y el elemento refrigerador otros
elementos adecuados para realizar los tratamientos de cambio de
temperatura de los líquidos y si fuera preciso las etapas de
tratamiento ulterior. Aquí se hace referencia especialmente a
elementos para la alimentación de los elementos calefactor y
refrigerante con medios refrigerantes o corriente, elementos para
regular la temperatura, elementos para medir la temperatura,
unidades para el transporte de recipientes, elementos para el
pipeteado de líquidos en el recipiente y fuera del recipiente y
elementos para el control de todo el sistema. El sistema contiene
preferiblemente una multitud de recipientes y tapas, de manera que
es adecuado para el tratamiento de una diversidad de líquidos (en
particular que contienen ácido nucleico) en serie o/y en
paralelo.
Respecto al calentamiento y enfriamiento del
líquido son posibles dos configuraciones especiales. En una primera
configuración o forma de trabajo el elemento calefactor es activo a
intervalos, por ejemplo, el líquido se calienta solamente
intervalos de segundos, mientras que el enfriamiento tiene lugar de
forma permanente. Debido a ello se forman en el líquido distintos
gradientes de temperatura, de manera que las temperaturas cerca del
elemento refrigerante se mantienen esencialmente constantes,
mientras que la temperatura del líquido cerca del elemento
calefactor varía mucho. Con ello se puede conseguir, por ejemplo,
que en regiones muy distintas transcurran diferentes reacciones en
el mismo recipiente. Por ejemplo, en el caso del calentamiento del
elemento calefactor a las temperaturas requeridas para la
desnaturalización de los ácidos nucleicos (por encima del valor
T_{m}), tenía lugar una desnaturalización únicamente en la
proximidad del elemento calefactor, por lo que los ácidos nucleicos
desnaturalizados podían ser transportados a zonas, en las que se
podía producir una hibridación con otros ácidos nucleicos. Este
transporte puede ocurrir, por ejemplo, por convección, sin embargo
es preferible que sea por difusión.
En una segunda configuración o forma de
ejecución especialmente preferida, se mantienen de forma permanente
tanto la calefacción como el enfriamiento y preferiblemente de forma
constante. Con ello se crea un gradiente de temperatura más estable
con una actividad suficientemente mayor, que es controlado por la
capacidad conductora del calor del líquido así como por la difusión
y si fuera preciso convección en el líquido. Aquí también pueden
transcurrir distintas reacciones en diferentes regiones del
recipiente. En esta configuración todos los componentes, que deben
participar en las reacciones respectivas, están preferiblemente
disueltos en el líquido.
En una configuración preferida el sistema consta
además de una multitud de tapas y recipientes básicamente de un
bloque regulador de la temperatura así como de elementos para
preparar y regular la energía eléctrica para el funcionamiento del
elemento calefactor.
El bloque regulador de la temperatura es un
cuerpo preferiblemente metálico con unas escotaduras para colocar
los recipientes de plástico. La potencia reguladora de la
temperatura necesaria viene suministrada por el empleo de líquidos
reguladores de la temperatura (líquido del soporte calorífico,
circulación-enfriamiento), empleo de elementos
Peltier o bien los conocidos métodos de regulación de la
temperatura.
Las dimensiones de las escotaduras para los
recipientes de plástico se basan firmemente en las dimensiones
externas de los recipientes de plástico, necesitándose el contacto
directo del bloque regulador de la temperatura y del recipiente de
plástico para el paso adecuado del calor. Las características del
diseño son bien conocidas por los expertos.
Preferiblemente la profundidad de la cavidad
debería estar en una relación de 5:1 respecto al diámetro, puesto
que con ello tiene lugar una circulación del líquido favorable para
el sistema con la formación de gradientes de temperatura.
El recipiente de plástico, en el cual tiene
lugar el tratamiento continuado del cambio de temperatura, es
preferiblemente de polipropileno con un grosor de pared inferior a
1,0 mm (sin embargo depende del volumen total de la solución de
reacción).
En los procesos de reacción en el campo de las
aplicaciones en Química Clínica y en el diagnóstico del ácido
nucleico se emplean volúmenes generalmente inferiores a 1 ml. Las
dimensiones aproximadas para el recipiente son de 8 mm de diámetro
interior y de 40 mm de altura.
Para evitar impurezas de la solución de reacción
y para impedir pérdidas de evaporación el recipiente se cierra con
una tapa, igualmente de polipropileno.
El elemento de calefacción desechable consta
preferiblemente de un material moldeado de plástico, de conexiones
eléctricas así como de una lámina conductora del calor. Las
dimensiones del elemento de calefacción desechable se adaptan a las
dimensiones del recipiente de reacción.
Una forma de ejecución preferida del elemento de
calefacción desechable consiste en que en una pieza de plástico
fabricada en un método de fundición por inyección, que consta de
tapa y soportes, se integra un dispositivo previamente fabricado a
base de una lámina conductora del calor y de unos contactos.
La lámina conductora del calor es
preferiblemente una lámina de oro de 20 \mum de grosor. El
plástico empleado para la pieza de fundición por inyección es el
polipropileno. La superficie del elemento calefactor activo es
preferiblemente de unos 60 mm^{2}, el final inferior del elemento
llega hasta el suelo del recipiente en el recipiente de
reacción.
El sistema anteriormente ilustrado para el
tratamiento del cambio de temperatura de los líquidos que contienen
ácidos nucleicos puede emplearse preferiblemente de múltiples
formas.
Igualmente el objeto de la invención es por
tanto un método para el tratamiento de ácidos nucleicos en un
líquido ajustando dos o más temperaturas por medio de un elemento
refrigerante y uno de calefacción, donde el elemento refrigerante
es parte de un aparato reciclable y el elemento calefactor es parte
de un dispositivo desechable. Las características preferidas
anteriormente mencionadas sirven también para este método. Se ha
demostrado que es especialmente conveniente el uso del método
conforme a la invención en las reacciones de tipo termocíclicas. En
dichos métodos tienen lugar reacciones distintas a temperaturas
diferentes. Las reacciones pueden transcurrir cuando los reactivos
se someten a unas determinadas temperaturas. Esto puede ocurrir, por
un lado, tal como se ha descrito, mediante la variación temporal
del perfil de temperatura en la mezcla de reacción incrementando o
disminuyendo la potencia refrigerante o calorífica, pero también por
otro lado estableciendo un perfil de temperatura constante entre
las zonas calentadas y las zonas enfriadas. Pueden concebirse formas
de paso, producidas por las convecciones de la mezcla.
Es esencial que los reactantes de la reacción
deseada sean expuestos uno tras otro a las distintas temperaturas
según el método conforme a la invención, de manera que puedan
transcurrir las distintas reacciones deseadas. Durante todo el
periodo de tratamiento se puede conseguir, por ejemplo, para las
reacciones cíclicas, una potencia calorífica o refrigerante
mediante el control de la potencia calorífica o refrigerante, de
forma que los reactantes puedan ser sometidos a diferentes
condiciones de reacción y por tanto se realicen ciclos de reacción
uno tras otro. Fijando un gradiente de temperatura relativamente
constante en la mezcla de reacción, el tratamiento tiene lugar
preferiblemente por difusión del elemento de la reacción de un
primer segmento de la mezcla de reacción con una primera
temperatura a un segundo segmento espacial con una segunda
temperatura. Por difusión en un segmento espacial con una
temperatura, como la que necesita la reacción siguiente (por
ejemplo, que se repite a una primera o tercera temperatura) tiene
lugar la ejecución del ciclo. Puesto que los procesos de difusión
habitualmente tienen lugar de forma lenta, resulta preferible elegir
un gradiente de temperatura relativamente inclinado, es decir,
preocuparse de que las caídas de temperatura entre el elemento
calefactor y el elemento refrigerante se limiten a un recorrido
relativamente corto. Los recorridos típicos entre el elemento
refrigerante y el calorífico son de pocos milímetros.
Un ejemplo típico de un método para el
tratamiento del cambio de temperatura de los ácidos nucleicos es la
amplificación de ácidos nucleicos o partes de los mismos. Un ejemplo
de ello es la reacción en cadena de la polimerasa, como la que se
ha descrito en US-A-4.683.202. Otro
ejemplo es la reacción en cadena de la ligasa.
Otro objetivo de la invención es un método para
la detección de un ácido nucleico de una muestra mediante
- a)
- la liberación del ácido nucleico, en el que debe basarse la detección, de los compartimentos en los cuales se encuentra contenido, en un recipiente en un sistema conforme a la invención,
- b)
- aumento de las informaciones de secuencia, basada en la presencia de ácido nucleico en el recipiente y
- c)
- detección de informaciones de secuencia,
El sistema conforme a la invención se puede
emplear por tanto para simplificar fácilmente el método de detección
de ácidos nucleicos. Se prefiere especialmente que el líquido
exceptuando los procesos de mezcla no sea transportado por dentro
del recipiente de un lugar a otro.
La liberación de ácidos nucleicos puede
producirse en un principio de forma conocida. Los tratamientos
habituales contienen la lisis de las paredes celulares, por
ejemplo, mediante reacciones adecuadas, como la proteinasa K,
detergentes o álcalis o/y por calentamiento. Esto hace que los
ácidos nucleicos se presenten en solución y accesibles para los
reactivos. Esta etapa tiene lugar en un recipiente, que es inerte
frente a las condiciones de reacción de la liberación y de la etapa
siguiente b), por ejemplo, el polipropileno. En el mismo recipiente,
aumenta ahora la información de secuencia, que se basa en la
existencia de ácido nucleico en el recipiente, por ejemplo, por
amplificación de una zona parcial del ácido nucleico liberado. Esto
puede ocurrir, por ejemplo, por la reacción en cadena de la
polimerasa.
Por información de secuencia se entiende la
secuencia de bases, por ejemplo, la (secuencia del nucleótido) de
una parte o de la totalidad del ácido nucleico que se va a
detectar.
En principio la información de secuencia puede
consistir en una secuencia de nucleótidos, que se acopla a través
de una reacción de enlace al ácido nucleico que se va a detectar y
seguidamente es amplificada. Por ejemplo, puede tratarse de la
llamada amplificación de señal. Básicamente el objetivo de la
invención es que tengan lugar las reacciones de las etapas a) y b)
en el mismo recipiente. La etapa b) puede iniciarse, por ejemplo,
de manera que el líquido que contiene ácidos nucleicos en el
recipiente se someta a un tratamiento de cambio de temperatura con
ayuda del elemento regulador de la temperatura reciclable
anteriormente mencionado en particular el elemento refrigerante, y
el elemento calorífico desechable. La mejor manera de que esto
ocurra será que el recipiente se guarde en el elemento refrigerante
reutilizable durante las etapas a) y b) y para la realización de la
etapa b) el elemento calorífico desechable se introduzca en el
recipiente. Cuando el elemento calorífico desechable se encuentra
integrado en una tapa, ésta puede encontrarse incluso durante la
etapa a) sobre el recipiente y ser empleada para el tratamiento
calorífico durante y después de la liberación del ácido
nucleico.
La detección de la información de secuencia
puede producirse según un método en principio conocido, por ejemplo,
en el paso de la mezcla de reacción de la etapa b) a un recipiente,
en el que los ácidos nucleicos formados se detectan preferiblemente
por medio de una reacción de hibridación. Un método de análisis
posible aprovecha el llamado principio de Sándwich, tal como se
describe en EP-B-0 079 139. Este
método utiliza una sonda de freno o retenida complementaria a la
información de secuencia amplificada, que está o puede estar unida a
una fase sólida, y una sonda de detección que está marcada y es
complementaria a otra parte de la información de secuencia
amplificada. La formación del complejo de sondas y la información de
secuencia amplificada que contiene ácidos nucleicos se emplea para
señalar la presencia de ácidos nucleicos en la muestra. Evitando el
paso de ácidos nucleicos de un recipiente a otro se reduce
considerablemente el peligro de una contaminación de la mezcla de
reacción y del entorno. Además el método es naturalmente mucho más
simple y practicable si se utilizan menos aparatos.
En la figura 1 se muestra una tapa (1) conforme
a la invención con un elemento calefactor integrado. Puede verse
que la tapa presenta una pieza de cierre (3), que se adapta a la
forma del orificio del recipiente que se va a cerrar. La pieza de
cierre sigue en un soporte de plástico (6) para el elemento
calefactor (5). En la superficie de este soporte de plástico se
fija el elemento calefactor de manera que las conducciones (4) para
el elemento calefactor quedan en el interior del soporte de plástico
o bien de la pieza de cierre y terminan en un extremo en el
contacto eléctrico (2) para la conexión a un abastecimiento de
corriente.
En la figura 2 se visualiza la tapa en una forma
que cubre un recipiente. En la figura 2 se muestran también las
dimensiones externas de un recipiente y de la tapa visualizada en la
figura 1. Estas dimensiones son adecuadas para la realización de un
método conforme a la invención, para la realización de un método de
amplificación, pero el experto las adapta de forma simple a unas
cantidades de líquido variables. El recipiente viene caracterizado
por la referencia (7).
En la figura 3 se visualiza un sistema conforme
a la invención con un módulo de tratamiento de muestras 17, con el
cual puede realizarse una preparación de los líquidos que contienen
ácido nucleico para la amplificación y la propia amplificación. En
esta figura, el manipulador superior (manipulador de la tapa 11)
puede agarrar la tapa de la figura 1 (Top 1) y colocarla sobre los
recipientes de reacción preparados
(disposable-devices 12). En el manipulador superior
se han integrado además los contactos para la fuente de corriente de
calefacción de la tapa. Con ayuda de la unidad de pipeteado y de
las puntas de pipetas (disposable tips 13) se pueden transportar
los reactivos 14 o /y líquidos de prueba 15 a los recipientes de
reacción 7 (aquí disposable devices 12). Tan pronto como se coloca
la tapa conforme a la invención, éste se puede transportar a un
recipiente de descarga 16 (solid phase disposable with top). Es
preferible que todos los procesos se realicen en un aparato, en el
que puedan tener lugar los procesos de transporte y pipeteado en
todas las 3 direcciones espaciales (x, y, z) (por ejemplo, robots
de laboratorio 18).
En la figura 4 se visualiza un sistema con
conexión de corriente (8), contactos eléctricos (2), mezcla de
reacción (9), que se agita por convección mediante el desarrollo de
calor del elemento calorífico, recipiente (7) y bloque de
enfriamiento (10).
En la figura 5 se muestra un esquema de la
realización de un ensayo con tratamiento del cambio de
temperatura.
- 1
- Tapa con elemento calefactor desechable
- 2
- Contactos eléctricos
- 3
- Pieza de cierre de la tapa
- 4
- Conducción eléctrica para el elemento calorífico (que penetra en el interior del plástico)
- 5
- Elemento de calefacción (lámina de oro)
- 6
- Soporte de plástico para el elemento de calefacción
- 7
- Recipiente
- 8
- Conexión de corriente
- 9
- Mezcla de reacción
- 10
- Elemento refrigerante
- 11
- Manipulador de la tapa (agarrado, retirada, colocación de la tapa, alimentación de corriente por los contactos)
- 12
- Dispositivos desechables (contienen una multitud, por ejemplo, 16 recipientes, enlazados unos con otros)
- 13
- Puntas de pipetas en un brazo de pipeteado del aparato
- 14
- Reactivos en el recipiente
- 15
- Líquido de prueba en el recipiente
- 16
- Recipiente de residuos para la tapa
- 17
- Módulo de preparación de muestras (soporte para recipientes, bloque regulador de la temperatura)
- 18
- Robots de laboratorio (con regulación de las etapas de transporte y de regulación de la temperatura, control del proceso)
- 19
- Unidad de control para el elemento de calefacción
- 20
- Ordenador de registro y evaluación de todo el proceso
El sistema está compuesto de un baño de agua,
que se regula a una temperatura de 57ºC. Sobre la superficie del
agua se fija una plancha matriz de agujeros a una distancia, de
manera que el recipiente de reacción según la figura 2 se sumerja
aproximadamente la mitad dentro del agua. Un reborde en el
recipiente impide que éste se deslice en el agua. Las escotaduras
de alojamiento de la plancha de agujeros son escasamente mayores de
8 mm. El recipiente de plástico es de polipropileno con un grosor de
pared de 0,4 mm (figura 2).
El elemento de calefacción empleado se
representa esquemáticamente en la figura 1. Se trata de una pieza de
plástico fabricada en un proceso de fundición por inyección, en el
cual se han integrado una lámina de oro de 20 \mum de grosor y
unas conducciones de calor, de manera que la lámina de oro se moja
con el líquido por un lado.
El ADN de los leucocitos del ser humano se
aislaba según el método siguiente partiendo de sangre entera
mediante el uso del estuche QIAamp Blood (nr. 29104) de la empresa
Quiagen (BRD, Postfach, 40719 Hilden).
En un recipiente Eppendorf de 2 ml se pipeteaban
200 \mul de EDTA-sangre entera anticoagulada, 25
\mul de protei-
nasa - solución K (19 mg/ml) y 200 \mul de solución tampón. La muestra se agitaba inmediatamente por medio de Vortex®, para volver a suspender el sedimento celular formado. La muestra se calienta durante 10 minutos a 70ºC, luego se enfría a temperatura ambiente y se guarda con 210 \mul de isopropanol. La muestra se transfiere a una "spin-column" QIAamp. La "spin-column" es un dispositivo de centrifugación /tubito abierto hacia abajo, en cuya base se encuentra un vellón de fibra de vidrio.
nasa - solución K (19 mg/ml) y 200 \mul de solución tampón. La muestra se agitaba inmediatamente por medio de Vortex®, para volver a suspender el sedimento celular formado. La muestra se calienta durante 10 minutos a 70ºC, luego se enfría a temperatura ambiente y se guarda con 210 \mul de isopropanol. La muestra se transfiere a una "spin-column" QIAamp. La "spin-column" es un dispositivo de centrifugación /tubito abierto hacia abajo, en cuya base se encuentra un vellón de fibra de vidrio.
La "spin-column" se fija a
un recipiente de Eppendorf de 2 ml de entrada de muestra y se
centrifuga en una centrífuga de mesa a 6.000xg (=8.000 rpm) durante
1 minuto. El filtrado se tira y se pipetean 500 \mul de solución
tampón de lavado en la "spin-column". Se
centrifuga de nuevo 1 minuto a 6.000 x g. El filtrado se desecha y
el proceso de lavado se repite de nuevo.
Después se pipetean 200 \mul de la solución de
elución (Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) en la
"spin-column" y el ADN enlazado es eluido del
vellón de fibra de vidrio por medio de una nueva centrifugación (1
minuto a 6.000xg).
El ADN purificado es caracterizado por medio de
la medición de la extinción en un fotómetro a 260 nm y 280 nm y por
medio de la electroforesis del gel. De 200 \mul de sangre entera
(aproximadamente 5 x 10^{6} leucocitos por ml), se obtienen unos
6 \mug de ADN en 200 \mul de la solución de elusión (lo que
corresponde a aprox. 30 ng de ADN/\mul) con un coeficiente de
extinción A_{260}/A_{280} de 1,7-1,9 (una
extinción de 1000 mE a 260 nm corresponde a un contenido en ADN de
la muestra de 50 ng/\mul).
El tamaño de los fragmentos de ADN eluido se
sitúa entre 1 y 50 Kbp, principalmente entre 20 y 40 Kbp,
determinado por medio de la electroforesis del gel en un gel de
azarosa al 1% (coloración de bromuro de etidio).
Por medio de dos cebadores específicos se
amplifica una secuencia del
gen-tPA-humano (tPA= activador del
plasminógeno tipo tisular). Las secuencias del cebador empleado
son:
Forward (es decir, "upstream")
- SEQ.ID.NO.1: 5’-AGA CAG TAC AGC CAG CCT CA-3’
Reverse (es decir, "downstream")
- SEQ.ID.NO.2: 5’-GAC TTC AAA TTT CTG CTC CTC-3’
Utilizando este par de cebadores se forma un
amplificado con una longitud de 375 bp.
Se pipetea la mezcla master siguiente en un
recipiente de reacción de polipropileno anteriormente descrito
(PCR):
- 10 \mul 10 veces tampón PCR con MgCl_{2} (100 mM Tris HCl pH 8,9; KCl 500 mM, MgCl_{2} 15 mM)
- 2 \mul de mezcla dNTP 10 mM (es decir, dATP, dGTP, dCTP y dTTP 10 mM, respectivamente)
- 0,5 \mul de Taq-polimerasa (5 U/\mul)
- 1 \mul de cebador Forward (30 \muM, secuencia ver antes)
- 1 \mul de cebador reverse (30 \muM, secuencia ver antes)
- 82,5 \mul agua bidestilada, en autoclave
Los reactivos empleados en total para la
amplificación (a excepción del cebador) proceden del estuche PCR
Core (nr. 1578 553) de Fa. Boehringer Mannheim.
La mezcla master (\Sigma= 97 \mul) se
centrifuga ligeramente en una centrífuga de mesa y luego se añaden
con pipeta 3 \mul de muestra que contiene ADN (del punto 1,
contenido en ADN aproximadamente 30 ng/\mul). El recipiente de
PCR se coloca en un bloque calefactor /refrigerante conforme a la
invención y se cierra con una tapa que contiene un elemento
calorífico desechable.
El elemento calorífico de la tapa se coloca de
manera que el cable de calefacción está metido en la mezcla PCR
hasta dos terceras partes. El elemento de calefacción se conecta a
la alimentación de voltaje y la mezcla PCR se incuba así
aproximadamente ½ hora, de manera que se ajusta en el cable de
calefacción en el tubo una temperatura de 95ºC y en la pared
interior del tubo una temperatura de 58ºC.
Una vez finalizada la amplificación la mezcla
PCR se analiza según el punto 3.
En la bolsa de muestras de un gel de agarosa del
1% se cargan 10 \mul de amplificado de PCR del punto 2. En una
bolsa de muestras colindante se colocan 800 ng del estándar
longitudinal de ADN VI de Boehringer (nr. 1062 590, tamaño del
fragmento 2176 bp hasta 154 bp).
El gel se desarrolla durante 2 horas en un campo
de tensión y luego se analiza en una mesa de UV.
En presencia de leucocitos-ADN
humanos en la mezcla master resulta visible en el gel una banda de
ADN intensiva (375 bp.), cuya posición se encuentra entre la banda
394 bp y la banda 298 p del estándar longitudinal VI.
El objetivo de este experimento es averiguar y
optimizar un gradiente de temperatura que varía de forma periódica
con un sistema conforme a la invención. Para ello se colocaba un
tubo de reacción de polipropileno, que se llenaba con 300 \mul de
agua bidestilada y tratada en autoclave, en un bloque metálico
regulador de la temperatura, que se enfriaba sobre elementos
Peltier. En la tapa se integraba un Chip-Pt24
disponible en el comercio, que al mismo tiempo servía de elemento
calefactor y de sensor de la temperatura. El elemento calefactor se
introduce en el agua. En un tubo de reacción colindante se
controlaba el ajuste y el mantenimiento de la temperatura estándar
(temperatura del bloque de atemperado) con un dispositivo medidor de
la temperatura M 4011 BBC. En la figura 5 se representa
esquemáticamente el ensayo. Este montaje funcionaba empleando
intervalos distintos de temperatura. Como unidad se caracteriza el
periodo de tiempo en que la calefacción es activa y como tiempo se
define el intervalo de tiempo entre los ciclos de calentamiento. En
las figuras 6 hasta 12 se indican los resultados de los ensayos.
Puede verse que la realización conforme a la figura 12 no hacía
posible ningún tratamiento de cambio de temperatura ya que los
tiempos son suficientemente razonables para una rehibridación de
los ácidos nucleicos. Con ayuda de estos ensayos un experto puede
averiguar las mejores condiciones para un sistema especial
(geometrías especiales, potencias de calentamiento, etc.) para su
determinación.
| Temp estand. ºC | Temp.total ºC | Unidad/ms | Tiempo/ms | Anexo nr. |
| 4 | 4,9 | 800 | 2000 | FIG 6 |
| 10 | 11,0 | 400 | 2000 | FIG 7 |
| 10 | 10,6 | 800 | 2000 | FIG 8 |
| 10 | 11,0 | 800 | 3000 | FIG 9 |
| 10 | 10,9 | 800 | 4000 | FIG 10 |
| 20 | 20,2 | 800 | 3000 | FIG 11 |
| 20 | 20,5 | 2000 | 1000 | FIG 12 |
(1) DATOS GENERALES
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Boehringer Mannheim GMBH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhoferstr. 116
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LUGAR: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAIS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CODIGO POSTAL: 68305
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TELEFONO: 0621 759 4348
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFAX: 0621 759 4457
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DEFINICIÓN DEL HALLAZGO: Sistema para el tratamiento del cambio de temperatura de muestras líquidas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEGIBLE INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE FUNCIONAMIENTO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0 versión # 1,30(EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RESPECTO A LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HÉLICE: Una sola hélice
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Ácidos nucleicos variados
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: = oligodesoxiribonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICAMENTE: BO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGACAGTACA GCCAGCCTCA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(3) DATOS RESPECTO A LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FORMA DE HÉLICE: Una sola hélice
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Ácidos nucleicos variados
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: = oligodesoxiribonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICAMENTE: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTTCAAAT TTCTGCTCCT C
\hfill21
Claims (7)
1. Sistema para el tratamiento del cambio de
temperatura de los líquidos que contienen ácidos nucleicos en un
recipiente (7), donde el sistema contiene un elemento regulador de
la temperatura reciclable (10), un recipiente o depósito (7) y un
elemento calefactor desechable (5), de manera que el elemento
calefactor (5) es un componente integrado del recipiente (7) o de
una tapa (1) y se sumerge para realizar el tratamiento en el
líquido.
2. Utilización de un sistema conforme a la
reivindicación 1 para el tratamiento de ácidos nucleicos en un
líquido mediante el ajuste de dos o más temperaturas por medio del
elemento calefactor y refrigerante.
3. Uso conforme a la reivindicación 2, que
se caracteriza porque el dispositivo desechable es la tapa
de un recipiente.
4. Uso conforme a la reivindicación 2 ó 3,
que se caracteriza porque el elemento calefactor durante el
proceso de calefacción se sumerge en el líquido.
5. Método para detectar un ácido nucleico en
una muestra mediante
- a)
- liberación del ácido nucleico que va a ser la base para la detección de los compartimentos en los que se encuentra, en un depósito en un sistema conforme a la reivindicación 1,
- b)
- información de la secuencia de replicación que se basa en la presencia del ácido nucleico en el recipiente y
- c)
- determinación de la información de la secuencia
6. Método conforme a la reivindicación 5,
que se caracteriza porque la información de la secuencia se
repite en ciclos de temperatura.
7. Método conforme a la reivindicación 5, que se
caracteriza porque los ciclos de temperatura se forman con
ayuda de un elemento de calefacción y refrigeración donde el
elemento de calefacción es parte de un dispositivo desechable.
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|---|---|
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