ES2271242T3 - Tratamiento con cromo/biotina de la dislipemia. - Google Patents

Abstract

Utilización de un complejo de cromo y biotina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la dislipemia.

Description

Tratamiento con cromo/biotina de la dislipemia.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a la mejora de los niveles de colesterol y de triglicéridos en la sangre. Más específicamente, la invención se refiere a procedimientos para la reducción del colesterol LDL, para el aumento del colesterol HDL y para la reducción de los niveles de triglicéridos en la sangre mediante la administración de dosis de un complejo de sodio y biotina.

Descripción de la técnica relacionada Dislipemia

Las dislipemias son trastornos del metabolismo de las lipoproteínas, entre los que se incluyen la sobreproducción o la deficiencia de lipoproteínas. Estos trastornos pueden manifestarse como un incremento del colesterol total, de la concentración del colesterol de baja densidad (LDL) y de los triglicéridos, y como un decremento de la concentración del colesterol-lipoproteínas de alta densidad (HDL) del suero. Millones de seres humanos sufren las secuelas de la hipercolesterolemia cada año. Entre los ejemplos de las enfermedades se incluyen la hipertensión, la enfermedad de las arterias coronarias, la insuficiencia cardíaca congestiva, la enfermedad vascular periférica, los aneurismas, y la muerte debida, en parte, a estas condiciones. El colesterol elevado es uno de los principales factores de riesgo modificables de la enfermedad coronaria (CHD), la mayor causa de mortandad en Estados Unidos (Kannel, W.B. et al., Declining Cardiovascular Mortality, Circulation 70:331-336, 1984). Se responsabiliza a la CHD de aproximadamente 490.000 muertes cada año (National Center for Health Statistics, Annual summary of births, marriages, divorces and deaths, United States, 1993, Monthly vital statistics report; vol. 42 nº 13; Public Health Service, 1994). El infarto agudo de miocardio (MI) y la angina representan asimismo una fuente sustancial de morbilidad. Entre los efectos fisiológicos secundarios de la hipercolesterolemia se incluyen los episodios cerebrales, los compromisos de la función hepática, el bloqueo de la arteria renal, la senilidad, la impotencia masculina y el aneurisma arterioesclerótico. El riesgo de estas enfermedades puede reducirse incrementando el nivel de colesterol HDL y/o reduciendo el nivel del colesterol LDL de la sangre.

Se ha dado un énfasis renovado a la reducción del colesterol en la sangre, en particular del colesterol-lipoproteínas de baja densidad (LDL), el mayor depósito de colesterol del plasma sanguíneo. Se ha realizado un gran número de intentos para reducir los niveles de colesterol en individuos mediante el control de la dieta, la modificación de los hábitos, el ejercicio y la terapia farmacológica dirigidos a reducir o a controlar los niveles de colesterol en la
sangre.

La primera recomendación en el tratamiento de la hipercolesterolemia es generalmente la intervención dietética, mediante la que se restringe el consumo de lípidos. El Dr. Dean Omish et al. "Can Lifestyles Changes Reverse Coronary Heart Disease," The Lancet. vol. 336 (1990) y su programa, en curso en la actualidad, para la reversión de la enfermedad coronaria, ha demostrado que la total eliminación del colesterol en la dieta y la limitación del contenido graso a un nivel inferior al diez por ciento de la cantidad calórica total ingerida puede llevar a una reducción del cuatro por ciento de la placa arterioesclerótica tras cinco años de tratamiento, cuando se combina dicho tratamiento con un control del estrés y ejercicio aeróbico. Esta estricta dieta vegetariana (libre de carne, pescado, pollo, aceites vegetales y productos lácteos grasos) resulta poco realista para la mayoría de los individuos.

Los suplementos dietéticos han ofrecido algunas esperanzas en la lucha contra la hipercolesterolemia. Por ejemplo, se ha informado de que los salvados, la zaragatona, la goma guar, las lecitinas, el suero lácteo, los vinos tintos, los aceites de pescado y el extracto de raíz de ginseng reducen el colesterol alto o sus consecuencias. Los mecanismos son variados y entre los mismos se incluyen el aislamiento del colesterol, la quelación, la detención del progreso y la inhibición de su oxidación. Estos regímenes generalmente se relacionan sólo con un porcentaje de reducción del colesterol en sangre inferior al diez por ciento. Ninguna de estas intervenciones dietéticas han demostrado una detención o la curación de la aterosclerosis o de otras enfermedades asociadas al colesterol elevado.

La intervención dietética más severa de la que se ha informado se da a conocer en la patente US nº 5.032.608, en la que se describe la alimentación intravenosa de una mezcla de aminoácidos levógiros biológicamente activos en sustitución de cualquier otra alimentación excepto el agua. Una composición dietética libre de grasa funcionalmente equivalente se describe en la patente US nº 5.106.836, que da a conocer un procedimiento para la preparación de productos alimenticios entéricos, con una formulación parenteral modificada de aminoácidos nutricionales libre de grasa. Los alimentos preparados, cuando se digieren y se absorben, proporcionan en la sangre un perfil de aminoácidos con propiedades hipocolesterolémicas. Se ha informado de que resulta apreciable una reducción significativa del colesterol plasmático total y una regresión de la aterosclerosis si la dieta se mantiene.

Otros intentos de reducir los niveles de colesterol del suero se han centrado en el desarrollo de diversos preparados farmacéuticos. Por ejemplo, en la patente US nº 4.797.278 se da a conocer que un producto con células bacterianas reduce el colesterol en la sangre y/o los niveles de triglicéridos gracias a su habilidad para adherirse a las células epiteliales intestinales, optimizando de esta manera las condiciones para la colonización de bacterias beneficiosas en las áreas apropiadas del intestino.

La patente US nº 5.114.963 describe un procedimiento para la reducción de la enfermedad aterosclerótica mediante la reducción de los niveles de lipoproteínas del suero mediante la administración de N,S-diacril-L-cisteína. Los procedimientos para el tratamiento de la lesión miocárdica se han centrado asimismo en la inyección intravenosa de compuestos combinados con enzimas fibrinolíticos para la digestión o la disolución de la trombosis sanguínea, provocando la lisis del coágulo de fibrina y reestableciendo y manteniendo la perfusión del tejido isquémico. Este uso de los enzimas, cuyos efectos de mejora de las consecuencias de la aterosclerosis se describen en la patente US nº 5.028.599, no reduce la concentración de colesterol en la sangre.

En vista de los fracasos descritos anteriormente de las intervenciones dietéticas, las terapias enzimáticas y las intervenciones en el estilo de vida, se han buscado otros medios para reducir el colesterol en la sangre, para reducir los depósitos de placa arterial y, por otra parte, para mitigar los efectos del colesterol elevado en la sangre sobre otros tejidos. La reducción del colesterol con fármacos hipocolesterolémicos, fármacos antiabsorción del colesterol (por ejemplo, la melinamida, los tioésteres, la urea y las tioureas sustituidas), determinadas ciclodextrinas, que actúan como portadores sustitutos de apoproteínas del colesterol, y fármacos limitadores de la biosíntesis del colesterol para reducir el riesgo de enfermedad coronaria, se apoya en la convincente evidencia de que presentan una asociación causal con la reducción de los niveles de colesterol en la sangre. Estos fármacos y sus efectos secundarios adversos, tales como la discapacidad hepática, se encuentran bien descritos en Physicians' Desk Reference, Medical Economics Company, Oradell, N.J.

No se ha demostrado que ninguno de los fármacos anteriores, ni solo ni en combinación, reduzca significativamente el colesterol en la sangre ni que reduzca la placa de aterosclerosis sin necesidad de una severa restricción concurrente de la ingestión de lípidos. En la actualidad todavía existe una escasez de fármacos eficaces y seguros capaces de prevenir y tratar el colesterol elevado sin producir ningún efecto secundario adverso. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un tratamiento seguro y eficaz para las enfermedades asociadas con los niveles elevados de colesterol sin producir los efectos secundarios asociados ni severas restricciones del estilo de
vida.

El papel del cromo

Se ha informado de que la suplementación dietética con cromo en individuos normales conduce a mejoras de la tolerancia a la glucosa, de las concentraciones de lípidos en el suero, incluyendo el colesterol-lipoproteína de alta densidad, la insulina y la fijación de la insulina (Anderson, Clin. Psychol. Biochem, 4:31-41, 1986). El cromo suplementario en la forma trivalente, por ejemplo el cloruro de cromo, se asocia con mejoras de los factores de riesgo relacionados con la diabetes de inicio tardío (de tipo 2) y la enfermedad cardiovascular.

El cromo es un elemento traza nutricionalmente esencial. La esencialidad del cromo en la dieta fue establecida en 1959 por Schwartz, tal como se cita en Present Knowledge in Nutrition, página 571, quinta edición (1984, The Nutrition Foundation, Washington, DC). La escasez de cromo se caracteriza por la perturbación del metabolismo de la glucosa, de los lípidos y de las proteínas y por una esperanza de vida reducida. El cromo resulta esencial para una actividad insulínica óptima en todos los sistemas dependientes de insulina conocidos (Boyle et al., Southern Med. J. 70:1449-1453, 1977). La deficiencia de cromo en la dieta se ha relacionado tanto con la diabetes de inicio tardío como con la enfermedad cardiovascular.

Las principales fuentes de energía para el cuerpo son la glucosa y los ácidos grasos. La escasez de cromo conlleva una insulina biológicamente ineficaz y un metabolismo de la glucosa comprometido. Bajo estas condiciones, el cuerpo depende principalmente del metabolismo de los lípidos para cubrir los requerimientos de energía, resultando en la producción de cantidades excesivas de acetil-CoA y de cuerpos cetónicos. Parte de la acetil-CoA documentada se desvía hacia el incremento de la biosíntesis de colesterol, resultando en hipercolesterolemia. La diabetes mellitus se caracteriza en gran parte por glicosuria, hipercolesterolemia y frecuentemente por cetoacidosis. El proceso aterosclerótico acelerado observado en diabéticos se asocia a hipercolesterolemia (Boyle et al., supra.).

El cromo funciona como un cofactor para la insulina. Se fija al receptor de insulina y potencia muchas, y puede que todas, sus funciones (Boyle et al., supra). Entre estas funciones se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la regulación del metabolismo de los carbohidratos y de los lípidos, (Present Knowledge in Nutrition, supra, páginas 573-577). La introducción de compuestos de cromo inorgánicos per se en individuos no resulta particularmente beneficiosa. El cromo debe ser convertido endógenamente en un compuesto orgánico o consumirse en forma de molécula biológicamente activa. El cuerpo sólo asimila aproximadamente el 0,5% del cromo inorgánico ingerido (Recommended Daily Allowances, novena edición revisada, The National Academy of Sciences, página 160, 1980). Sólo entre 1% y 2% de la mayoría de los compuestos de cromo orgánico resultan asimilados por el cuerpo.

La patente US nº Re. 33.988 da a conocer que, al administrar determinados metales esenciales, entre los que se incluye el cromo, a mamíferos en forma de complejos coordinados de ácido picolínico sintetizados exógenamente, dichos metales se encuentran directamente disponibles para su absorción sin competir con otros metales. Dicha patente describe una composición y un procedimiento para la suplementación de manera selectiva de los metales esenciales en la dieta humana y para facilitar la absorción de estos metales por las células intestinales. Estos complejos resultan seguros, económicos, biocompatibles y fáciles de preparar. Estos complejos coordinados de ácido picolínico sintetizados exógenamente (ácido piridin-2-carboxílico) presentan la siguiente fórmula estructural:

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en la que M representa el catión metálico y n es igual a la valencia del catión. Por ejemplo, cuando M representa Cr y n=3, entonces el compuesto representa tripicolinato de cromo. Entre el resto de los demás picolinatos de cromo dados a conocer en la presente memoria se incluyen el monopicolinato de cromo y el dipicolinato de cromo.

El consumo diario de cromo recomendado en Estados Unidos (RDI) es de 120 \mug. La patente US nº 5.087.623 describe la administración de tripicolinato de cromo para el tratamiento de la diabetes de inicio tardío en dosis comprendidas en el intervalo de 50 \mug a 500 \mug. La solicitud de patente internacional nº WO96/35.421 da a conocer la utilización de dosis elevadas de tripicolinato de cromo (suministrando entre 1.000 \mug y 10.000 \mug de cromo diarios) para la reducción de la hiperglicemia y la estabilización del nivel de glucosa en suero en humanos con diabetes de tipo 2. Las patentes US nº 5.789.401 y nº 5.929.066 dan a conocer una composición de tripicolinato de cromo-biotina y su utilización en la reducción de los niveles de glucosa en sangre en seres humanos con diabetes de tipo 2.

Las patentes US nº 5.087.623, nº 5.087.624 y nº 5.175.156 dan a conocer la utilización de tripicolinato de cromo para la suplementación dietética de cromo, que reduce la hiperglicemia y estabiliza la glucosa del suero, incrementando la masa corporal magra y reduciendo la grasa corporal, y controlando los niveles de lípidos en el suero sanguíneo, incluyendo la reducción de de los niveles elevados no deseados de colesterol LDL en el suero sanguíneo y el incremento de los niveles de colesterol-lipoproteínas de alta densidad (HDL) en el suero sanguíneo, el denominado colesterol "bueno". Las patentes US nº 4.954.492 y nº 5.194.615 describen un complejo relacionado, el nicotinato de cromo, que también se utiliza para la suplementación dietética del cromo y para la reducción de los niveles de lípidos en el suero. El ácido picolínico y el ácido nicotínico son isómeros de posición que presentan las siguientes estructuras:

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El ácido nicotínico y el ácido picolínico forman complejos coordinados con iones metálicos monovalentes, divalentes y trivalentes y facilitan la absorción de estos metales transportándolos a través de las células intestinales y hacia el interior del riego sanguíneo. La absorción del cromo en ratas tras la administración de CrCl_{3}, se vio facilitada por los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID) aspirina e indometacina (Davis et al., J. Nutrition Res. 15:202-210, 1995; Kamath et al., J. Nutrition 127:478-482, 1997). Estos fármacos inhiben el enzima ciclooxigenasa, que convierte el ácido araquidónico en diversas prostaglandinas, comportando la inhibición de la formación de mucus intestinal y la reducción del pH intestinal, lo que facilita la absorción del cromo.

La patente US nº 4.315.927 da a conocer que, al administrar metales esenciales seleccionados a mamíferos en forma de complejos coordinados de ácido picolínico sintetizados exógenamente, éstos se encuentran disponibles para su absorción sin competir con otros metales. Estos complejos resultan seguros, económicos, biocompatibles y fáciles de preparar.

El biotina representa el grupo prostético para varias reacciones de carboxilación, siendo las más importantes la piruvato-carboxilasa que está relacionada con la gluconeogénesis y el cumplimiento del ciclo del ácido cítrico, y la acetil-CoA carboxilasa que está relacionada con la biosíntesis de los ácidos grasos. La cantidad de consumo diario de biotina segura y adecuada recomendada está comprendida entre 100 \mug y 300 \mug, aunque no se detectaron efectos secundarios o toxicidades en estudios clínicos anteriores con consumos orales de biotina de hasta 200 mg diarios (Mock et al., en Present Knowledge in Nutrition, séptima Edición, Ziegler, E. et al., editores, ILSI Press, Washington, DC, 1998, páginas 220-235). Se ha demostrado que las dosis supranutricionales de biotina presentan una utilidad terapéutica en el tratamiento de varios estados de enfermedad tales como la diabetes. Se ha demostrado que grandes dosis de biotina, orales o parenterales, por ejemplo, mejoran la tolerancia a la glucosa oral en ratas KK diabéticas (Reddi et al., Life Sci., 42:1323:1330, 1988), en ratas convertidas en diabéticas mediante una inyección de estreptozotocina (Zhang et al., 16th International Congress of Nutrition, Montreal, 1997, libro de resúmenes, página 264) y en ratas Otsuka Long-Evans Tokushima prediabéticas obesas (Zhang et al., J. Nutr. Sci. Vitaminol. 42:517-526, 1996).

Coggeshall et al., (Ann. N.Y. Acad. Sci., 447:387-392, 1985) demostraron en un estudio clínico que una dosis oral diaria de biotina de 16 mg reducía los niveles de glucosa plásmatica en ayunas en diabéticos de tipo I en los que se habían detenido temporalmente las inyecciones de insulina. Maebashi et al., (J. Clin. Biochem. Nutr. 14:211-218, 1993) demostró que la administración de 3 mg de biotina 3 veces al día a diabéticos de tipo 2 no controlados resultó en una mejora del funcionamiento de las células beta pancreáticas, tal como puso de manifiesto el hecho de que los niveles de insulina en ayunas no se redujeron en los sujetos tratados con biotina a pesar del brusco descenso de los niveles de glucosa.

Existe una necesidad constante de tratamientos eficaces para la reducción de los niveles de LDL y de triglicéridos que incrementen simultáneamente los niveles de HDL en el sujeto. La presente invención se refiere a esta necesidad dando a conocer un agente terapéutico seguro, económico y libre de fármacos. Un procedimiento para la reducción y la reversión de la dislipemia que no provoque efectos secundarios en el paciente representaría un avance sustancial en la prevención y el tratamiento de una variedad de estados de enfermedad.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de complejos de cromo y biotina en la preparación de medicamentos para el tratamiento de la dislipemia.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de complejos de cromo en la preparación de medicamentos para su utilización en combinación con biotina para el tratamiento de la dislipemia.

En todavía otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de biotina en la preparación de un medicamento para su utilización en combinación con un complejo de cromo para el tratamiento de la dislipemia.

En una forma de realización determinada, la cantidad de complejo de cromo administrada por día se encuentra comprendida entre 25 \mug y 2.000 \mug, preferentemente entre 300 \mug y 1.000 \mug por día.

En una forma de realización determinada, la cantidad de biotina administrada por día se encuentra comprendida entre 25 \mug y 20 mg, preferentemente entre 150 \mug y 5 mg por día.

El complejo de cromo de la presente invención puede incluir picolinato de cromo, tripicolinato de cromo, nicotinato de cromo, polinicotinato de cromo, cloruro de cromo, histidinato de cromo o levadura de cromo.

Preferentemente, el complejo de cromo se encuentra en un portador farmacéuticamente aceptable. De manera similar, se considera preferente que el biotina se encuentre en un portador farmacéuticamente aceptable.

Opcionalmente, el complejo de cromo y la biotina se administran de forma oral. De todas formas, en algunos aspectos de la presente invención, el cromo y la biotina se administran parenteralmente.

En todavía otro aspecto de la presente invención, resulta posible añadir determinados agentes quelantes para facilitar la absorción del complejo de cromo. En un aspecto de la presente invención, se administra ácido picolínico al individuo. En otro aspecto, se administra ácido nicotínico al individuo. Y en todavía otro aspecto, se administra tanto ácido pilolínico como ácido nicotínico al individuo para el tratamiento de la dislipemia.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la cascada de señalización insulínica.

La figura 2 es un gráfico que muestra la captación de la 2-desoxiglucosa con picolinato de cromo y biotina.

La figura 3 es una representación gráfica de la síntesis del glucógeno en un cultivo de músculo esquelético humano cuando se incuba con picolinato de cromo y biotina.

La figura 4A es un gráfico de columnas que muestra la síntesis del glucógeno.

La figura 4B es un gráfico de columnas que ilustra la expresión génica (ARNm).

La figura 5 es un gráfico que muestra el diseño del estudio de evaluación del efecto del cromo y de la biotina sobre la sensibilidad a la insulina en ratas.

La figura 6 es un gráfico de columnas que representa los resultados de la administración conjunta de cromo y biotina sobre el consumo de glucosa en un modelo de rata.

La figura 7 es un gráfico de columnas que muestra los efectos del picolinato de cromo sobre los niveles de insulina plasmática en ayunas de ratas obesas al comienzo y al final del estudio.

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La figura 8A es un gráfico que muestra los resultados de los ensayos de tolerancia a la glucosa intraperitoneal en ratas obesas y los efectos del picolinato de cromo sobre la tolerancia a la glucosa.

La figura 8B demuestra la respuesta a la insulina observada después del tratamiento con picolinato de cromo.

La figura 9 es un gráfico de columnas que demuestra los efectos sobre la sensibilidad a la insulina de ratas obesas comparado con la de ratas magras al administrar picolinato de cromo frente al control.

La figura 10 es un gráfico lineal que representa los efectos observados en función del tiempo sobre los niveles de colesterol en modelos de rata tratados con una diversidad de protocolos de cromo y biotina.

La figura 11 es un gráfico de columnas que muestra los cambios del colesterol en función del tiempo en diversos protocolos de tratamiento, incluyendo la administración de dosis altas y bajas de cromo y de biotina, solos o combinados.

La figura 12A es un gráfico de columnas que muestra el perfil de colesterol HDL en ratas JCR tratadas con picolinato de cromo.

La figura 12B es un gráfico de columnas que muestra la perfil de colesterol-HDL en ratas JCR tratadas con picolinato de cromo.

La figura 13 es un gráfico de columnas que ilustra la proporción de colesterol-HDL en ratas JCR tratadas y no tratadas.

La figura 14 es un gráfico de columnas que representa el cambio de los niveles de HDL en función del tiempo en ratas JCR a las que se había administrado varias combinaciones de cromo y biotina.

La figura 15 es un gráfico lineal que muestra el perfil de HDL en una muestra de animales a los que se había administrado varias dosis de cromo y biotina, tanto de forma separada como conjuntamente.

La figura 16 es un gráfico lineal que muestra el cambio de los niveles de triglicéridos en función del tiempo en ratas tratadas con cromo y biotina, tanto de forma separada como conjuntamente.

La figura 17 es un gráfico de columnas que ilustra el cambio del perfil de los triglicéridos en ratas a las que se había administrado varias dosis de cromo, de biotina o de ambos.

La figura 18 es un gráfico de columnas que ilustra el efecto de bebida a la que se había añadido picolinato de cromo y biotina sobre los niveles de hemoglobina glucosilada.

La figura 19 es un gráfico de columnas que demuestra el efecto de bebida a la que se había añadido picolinato de cromo y biotina sobre la glucosa en sangre.

La figura 20 es una representación gráfica del efecto del picolinato de cromo y biotina sobre la fatiga.

Descripción detallada de la forma de realización preferida

La presente invención se refiere a los procedimientos para el tratamiento de la dislipemia.

No se pretende que la terminología utilizada en la descripción presentada en la presente memoria se interprete de manera limitada y restrictiva, simplemente debido a que se utiliza conjuntamente con una descripción detallada de determinadas formas de realización preferidas de la invención. Además, las formas de realización de la invención pueden incluir diversas características nuevas, no siendo ninguna de ellas ni la única responsable de sus características deseables ni esencial para la práctica de la invención descrita en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "complejos de cromo" o "complejo de cromo" incluye, sin limitación, el picolinato de cromo, el tripicolinato de cromo, el nicotinato de cromo, el polinicotinato de cromo, el cloruro de cromo, el histidinato de cromo, o la levadura de cromo.

Una base principal de la presente invención es el nuevo e inesperado descubrimiento de que la coadministración de dosis eficaces de complejos de cromo en combinación con biotina produce una mejora sinérgica de la sensibilidad a la insulina. La coadministración de cromo y biotina puede facilitar el tratamiento y la recuperación de los individuos que sufren de una diversidad de condiciones médicas, tales como la dislipemia. Además, la administración de complejos de cromo en combinación con una dosis eficaz de biotina proporciona una reducción efectiva de la hipercolesterolemia y un incremento del colesterol HDL en la sangre. Esta reducción resulta marcadamente superior a la que resultaría previsible en el caso de que los componentes fueran administrados de forma separada, demostrando de esta manera la existencia del efecto sinérgico.

La resistencia a la insulina es un parámetro patogénico crucial de la diabetes de tipo 2, y las intervenciones clínicas que mejoran la sensibilidad a la insulina son consideradas piedras angulares en el control de la enfermedad. Además, la relación entre la resistencia a la insulina y la enfermedad cardiovascular y sus factores de riesgo asociados ha sido bien establecida en los últimos años. Por lo tanto, con la reciente salida al mercado de numerosos medicamentos, los tratamientos actuales de la diabetes de tipo 2 se centran en la consecución de una "sensibilización clínica a la insulina". Este concepto se basa en el objetivo clínico establecido de la reducción de la glucosa en la sangre en un esfuerzo por reducir las complicaciones microvasculares (por ejemplo, las enfermedades oculares, renales y nerviosas) con una estimulación mínima de la insulina endógena o con la aplicación de dosis exógenas de insulina lo más reducidas posibles. Debido a este concepto clínico, la terapia de combinación para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 actualmente se considera el estándar del cuidado en el control clínico. Las combinaciones de agentes farmacológicos (tales como la sulfonilureas/metformina, sulfonilureas/glitazonas y metformina/glitazonas) representan intervenciones farmacológicas altamente eficaces que parecen reducir tanto los niveles de glucosa como los de insulina. Además, existe evidencia que indica que la terapia triple de fármacos (por ejemplo sulfonilureas/metformina/glitazonas) puede reducir la glicemia clínica además de reducir los niveles de insulina. Debido al éxito de estas formulaciones clínicas, los agentes farmacológicos con el efecto clínico de reducción de la glucosa y de mejora de la acción de la insulina se considera muy favorables en el futuro del control de la diabetes de tipo 2.

En contraste con la terapia farmacológica, la intervención nutricional resulta una aproximación muy atractiva para el tratamiento de la resistencia a la insulina y, por lo tanto, del control de la glucosa en diabéticos de tipo 2. En este sentido, existen pruebas categóricas que sugieren que los complejos de cromo suplementarios, tales como el picolinato de cromo (CrPic), pueden mejorar favorablemente la sensibilidad a la insulina y el control glucémico en ensayos realizados con seres humanos. Específicamente, esta afirmación ha sido demostrada en un estudio en la población diabética china, en el que CrPic redujo significativamente los niveles de glucosa y de insulina (Anderson et al., Elevated intakes of supplemental chromium improve glucosa and insulin variables in individuals with type 2 diabetes, Diabetes, 48:1786-1791, 1997). Recientemente, se ha demostrado que la administración de 1000 \mug diarios de CrPic puede mejorar la sensibilidad a la insulina en una cohorte de sujetos que representan a la población humana obesa y prediabética (Cefalu, W.T. et al., Effects of chromium picolinate on insulin sensitivity in vivo. J. Trace Elem. Exp. Med. 12:71-83, 1999). De manera similar, el CrPic presenta un robusto efecto de mejora de la sensibilidad a la insulina y de los perfiles de los lípidos en un modelo de roedor obeso, hiperinsulinémico y con resistencia a la insulina (Wang et al., Chromium picolinate enhances insulin sensitivity in an animal model for the metabolic syndrome: the obese, insulin resistant JCR:LA-corpulent rat, Diabetes, en prensa (resumen que se presentará en el Annual Meeting of the ADA, Junio 2000). Esto sugiere fuertemente que los sujetos que presentan los componentes del "síndrome X" (por ejemplo obesidad central, dislipemia y resistencia a la insulina) pueden responder favorablemente a la suplementación con cromo.

Además de los tratamientos en monoterapia con un complejo de cromo, tal como picolinato de cromo, las recientes investigaciones sugieren fuertemente que otros nutrientes, tales como la biotina, pueden mejorar el efecto del cromo observado en la ingestión de la glucosa. Específicamente, la combinación de complejos de cromo con biotina mejora de forma considerable la captación de glucosa en cultivos de músculo esquelético humano. Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se cree que el mecanismo celular mediante que un complejo de cromo puede mejorar la sensibilidad a la insulina se refiere a la mejora de la síntesis del glucógeno. La importancia de esta observación para la comprensión del mecanismo por el que el cromo mejora la sensibilidad a la insulina resulta subrayada por el hecho de que el aspecto de la resistencia a la insulina que más ha sido descrito es la ineficiencia en la captación y en la utilización de la glucosa en respuesta a la sensibilidad a la insulina en tejidos sensibles a la insulina. Esto queda representado por una reducción de la reserva de glucosa en forma de glucógeno estimulada por insulina, tanto en los músculos como en los
riñones.

Los defectos celulares específicos que caracterizan la resistencia a la insulina no han sido caracterizados por completo. Sin embargo, la figura 1 destaca las rutas de la cascada de señalización insulínica aceptadas en la actualidad y destaca específicamente las rutas relacionadas con la translocación del transportador de glucosa (Glut-4) y la síntesis del glucógeno. Estos dos parámetros celulares se ven alterados en estados de resistencia a la insulina y la superación de estos defectos conduce a un incremento de la sensibilidad a la insulina. En este sentido, la presente invención se refiere a la exploración del papel que desempeñan la biotina y los complejos de cromo en la mejora de la señalización celular, llevando a un incremento de la insulina objetivo, tanto in vitro como in vivo.

La presente invención contempla la utilización de complejos de cromo en combinación con biotina para la reducción beneficiosa del nivel de colesterol-LDL y/o un incremento beneficioso del nivel de colesterol-HDL en la sangre. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse a un individuo de forma separada o como composición única. De forma ventajosa, se administra a un individuo una dosis farmacéuticamente eficaz de un complejo de cromo, tal como el picolinato de cromo. En una forma de realización de la presente invención, la biotina se administra simultáneamente. En una forma de realización alternativa, el complejo de cromo se administra primero y la biotina se añade posteriormente. En todavía otra forma de realización, se administra primero la biotina. Si se administran de forma separada, los compuestos deben proporcionarse separados por poco tiempo, por ejemplo en un periodo de veinticuatro horas, de forma que se potencie la reducción de la hipercolesterolemia. Más particularmente, los compuestos pueden proporcionarse separados por menos de una hora. La administración puede ser mediante cualquiera de los procedimientos de administración indicados a continuación o mediante procedimientos de administración de fármacos conocidos por el experto en la materia.

La síntesis de los picolinatos crómicos se describe en la patente US nº 5.087.623. La biotina y los complejos de cromo, tales como el picolinato de cromo, se encuentran comercialmente disponibles de establecimientos de alimentos naturales, farmacias y otras fuentes comerciales. Para conseguir la reducción de los niveles de colesterol LDL y/o el incremento de los niveles de HDL, se prevé que el intervalo de dosis que se debe administrar a un individuo será de por lo menos aproximadamente 25 \mug diarios. Preferentemente, la cantidad de cromo se encuentra comprendida en el intervalo entre 25 \mug y 2.000 \mug diarios. Más preferentemente, la cantidad de cromo se encuentra comprendida en el intervalo entre 300 \mug y 1000 \mug diarios. Todavía más preferentemente, la cantidad de cromo se encuentra comprendida en el intervalo entre 400 \mug y 1.000 \mug diarios. En una forma de realización particularmente preferida, la cantidad de cromo se encuentra comprendida en el intervalo entre aproximadamente 600 \mug y 1.000 \mug diarios. Respecto al componente de biotina de la terapia de combinación, la dosis diaria es de por lo menos 25 \mug. Preferentemente, la dosis de biotina se encuentra comprendida entre aproximadamente 25 \mug y 20 mg diarios. Más preferentemente, la dosis diaria de biotina se encuentra comprendida en el intervalo entre aproximadamente 150 \mug y 10 mg. Todavía más preferentemente, la dosis diaria de biotina se encuentra comprendida en el intervalo entre aproximadamente 300 \mug y 5 mg. Obsérvese que estas cantidades se basan en un adulto humano de 70 kg, y que la dosis pueden aplicarse en función del peso a humanos o a animales de diferentes pesos.

Mientras que los complejos de cromo ayudan en la absorción de cromo por parte de las células intestinales, en algunas formas de realización se incluyen de forma ventajosa agentes quelantes no complejos en las composiciones para facilitar la absorción de cromo así como de otros metales, entre los que se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cobre, hierro, magnesio, manganeso y cinc. Entre los agentes quelantes adecuados se encuentran el ácido picolínico, el ácido nicotínico o ambos. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención son formas de cromo fácilmente absorbibles que facilitan además la absorción de otros metales esenciales en la dieta huma-
na.

Los complejos de cromo de la presente invención presentan los mismos usos que se describen para el tripicolinato de cromo en las patentes US nº 5.087.623, US nº 5.087.624, US nº 5.174.156, es decir, aportando cromo a la dieta, reduciendo los niveles de glucosa en la sangre en diabéticos, reduciendo los niveles de lípidos en el suero e incrementando la masa corporal magra. Además, el picolinato de cromo de la presente invención actúa tratando los síntomas asociados a la diabetes.

De forma ventajosa, los complejos de cromo son sintéticos. La síntesis y la utilización del picolinato de cromo se describen, por ejemplo, en las patentes US nº Re 33.988 y US nº 5.087.623. El picolinato de cromo se encuentra disponible en establecimientos de alimentos naturales, farmacias y otras fuentes comerciales. La síntesis y la utilización del picolinato de cromo se describen en la patente US nº 5.194.615.

Los agentes quelantes, tales como el ácido picolínico y el ácido nicotínico, se encuentran disponibles de muchas fuentes comerciales, incluyendo Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) (ácido picolínico; catálogo nº P5.503; ácido nicotínico; catálogo nº PN4.126). Preferentemente, la proporción entre el complejo de cromo y el agente quelante se encuentra comprendida en el intervalo entre 10:1 y 1:10 (p/p), más preferentemente se encuentra comprendida en el intervalo entre 5:1 y 1:5 (p/p). Alternativamente, la proporción molar entre el complejo de cromo y los agentes quelantes no complejos preferentemente es de 1:1 y puede encontrarse comprendida en el intervalo entre 5:1 y
1:10.

Para la administración oral, los complejos de cromo y biotina pueden presentarse en forma de comprimido, de suspensión acuosa u oleosa, de polvos o de granulado, de emulsión, de cápsula blanda o dura, de jarabe, de elixir o de bebida. Las composiciones destinadas a la administración oral pueden prepararse según cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica de preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables y estas composiciones pueden presentar uno o más de los agentes siguientes: edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y conservantes. Los edulcorantes y los agentes saborizantes incrementan la comestibilidad del preparado. Los comprimidos que contienen complejos de cromo mezclados con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables, adecuados para la preparación de comprimidos, se consideran aceptables. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que el agente debe resultar aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación (además de no ser perjudicial para el paciente). Entre estos excipientes se incluyen diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y agentes desintegrantes, tales como almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden carecer de recubrimiento o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas con el objetivo de retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y de esta manera mantener una acción sostenida durante un mayor periodo de tiempo. Por ejemplo, puede utilizarse un material retardador, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o acompañado de una cera.

Las formulaciones para la utilización oral además pueden presentarse en forma de cápsulas duras de gelatina en las que el ingrediente activo se encuentra mezclado con un diluyente inerte sólido, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o en forma de cápsulas blandas de gelatina, en las que el ingrediente activo se encuentra mezclado con agua o con un medio oleoso, tal como aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva. Las suspensiones acuosas pueden contener el complejo de cromo de la invención mezclado con excipientes adecuados para la preparación de suspensiones acuosas. Entre tales excipientes se incluyen agentes de suspensión, agentes dispersantes o agentes humectantes, uno o más conservantes, uno o más colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas pueden formularse mediante la suspensión del ingrediente activo en un aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral, tal como parafina líquida. La suspensión oleosa puede contener un agente espesante, tal como la cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes, tales como los indicados anteriormente, y agentes saborizantes para proporcionar una preparación oral comestible. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante, tal como el ácido ascórbico. Los polvos dispersables y los granulados de la invención adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión, y uno o más conservantes. Asimismo, pueden encontrarse presentes excipientes adicionales, por ejemplo edulcorantes, agentes saborizantes o colorantes.

Los jarabes y los elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, tales como glicerol, sorbitol o sacarosa. Asimismo, dichas formulaciones pueden contener un demulcente, un conservante, un agente saborizante o un agente colorante.

Los preparados de complejos de cromo para administración parenteral pueden presentarse en forma de un preparado inyectable estéril, tal como una suspensión inyectable estéril acuosa o aceitosa. Esta suspensión puede formularse según procedimientos bien conocidos de la técnica, utilizando agentes de dispersión, agentes de suspensión o humectantes adecuados. Además, el preparado inyectable estéril puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como una solución de 1,3-butanodiol. Entre los diluyentes adecuados se incluyen, por ejemplo, agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, pueden utilizarse aceites fijos estériles utilizados convencionalmente como solventes o medios de suspensión. Para este fin, puede utilizarse cualquier aceite suave que incluya monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos, tales como el ácido oleico, también pueden utilizarse en la preparación de preparados
inyectables.

Las composiciones farmacéuticas también pueden presentarse en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, tal como el aceite de oliva o el aceite de cacahuete, un aceite mineral tal como la parafina líquida, o una mezcla de los mismos. Entre los agentes emulsionantes adecuados se incluyen gomas naturales, tales como la goma acacia y la goma tragacanto, fosfátidos naturales, tales como lecitina de soja, ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos, y anhídridos de exitol, tales como monooleato de sorbitán, y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tales como monooleato de poliexietilensorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y saborizantes.

La dosis de complejos de cromo/biotina que puede combinarse con el material portador para producir una unidad de dosificación dependerá del paciente, así como del modo particular de administración utilizado.

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Ejemplos

Los ejemplos siguientes muestran los procedimientos y las composiciones dados a conocer en la presente memoria para la mejora de la sensibilidad a la insulina, la reducción de los niveles de colesterol, el tratamiento de la hiperglicemia postprandial, y la reducción del índice glucémico de los alimentos mediante la administración de por lo menos un complejo de cromo conjuntamente con biotina.

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Ejemplo 1

Efectos del cromo y de la biotina sobre la sensibilidad a la insulina

Para la evaluación del mecanismo celular potencial para el efecto in vivo del CrPic, se evaluó el papel del cromo, como monoterapia y como terapia de combinación con biotina, en la captación de la glucosa en un cultivo de músculo esquelético humano ("HSMC"). El HSMC se considera representativo de un tejido sensible a la insulina y el músculo esquelético representa el principal tejido para el consumo de glucosa en el ser humano (ver Henry, R. R. et al., Acquired defects of glycogen synthase activity in cultured human skeletal muscle cells: influence of high glucose and insulin levels, Diabetes 45:400-407, 1996).

En el aspecto específico de la captación de la glucosa, los presentes inventores han demostrado que el cromo administrado de manera aislada mejora la captación de la glucosa, en contraste con la biotina administrada de manera aislada. Sin embargo, al incubar HSMC con ambos, se observó un efecto sinérgico en la captación de la glucosa, tal como se ilustra en la figura 2. Esta observación se hizo extensiva al análisis de la síntesis del glucógeno. La línea celular del músculo esquelético humano se cultivó en presencia de CrPic, de biotina y de la combinación de CrPic/biotina. Tras la incubación, las células se sometieron a ayuno y se analizó la síntesis de glucógeno al inicio y después de la estimulación de insulina. El cromo y la biotina incrementaron la síntesis del glucógeno al principio y bajo condiciones de estimulación a la insulina, tal como se ilustra en la figura 3. El contenido de proteína del IRS-2 se incrementó también con la combinación CrPic + biotina.

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Ejemplo 2

Evaluación del mecanismo celular por el que el CrPic y la biotina mejoran la síntesis del glucógeno

Con el fin de evaluar el mecanismo celular por el que el CrPic y la biotina mejoran la síntesis del glucógeno, se analizaron la ARNm glucógeno sintetasa ("GS") y la síntesis del glucógeno. Se incubaron HSMC con el CrPic a 10 ng/ml, biotina a 10 pm, y ambos, CrPic y biotina. Tal como se demuestra, nuevamente se observó que CrPic y la biotina mejoraban la síntesis del glucógeno estimulada por insulina, tal como se muestra en la figura 4A. Al analizar la expresión génica, se observó que la combinación de CrPic y biotina mejoraba el ARNm de GS (ver la figura 4B). Al analizar los niveles de ARNm de GS, el cromo incrementó la expresión génica del GS en 26%, la biotina la incrementó en 15% y la combinación de ambos la incrementó en 33%. Estos datos sugieren un efecto sinérgico del cromo y de la biotina en la expresión génica de la GS.

El mecanismo propuesto es la modificación, debida al CrPic y a la biotina, de la velocidad de transcripción génica de los enzimas (en particular, de GS) implicados en la mediación de los efectos biológicos de la insulina en el músculo esquelético humano.

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Ejemplo 3

Efecto del cromo y de la biotina sobre la sensibilidad a la insulina en un modelo animal

Con el fin de analizar los efectos del cromo y de la biotina, tanto de manera aislada como en combinación, sobre la sensibilidad a la insulina, se utilizó un modelo de roedor con "síndrome X". Específicamente, se utilizó la rata JCR debido a que es un modelo de obesidad y de resistencia a la insulina bien establecido. Además, este modelo muestra componentes clínicos del síndrome de resistencia a la insulina (por ejemplo dislipemia, obesidad
central).

Después de una fase inicial en la que se analizaron de manera precisa los pesos, la composición corporal y la ingestión de alimento, los animales se asignaron de forma aleatoria a control, CrPic sólo, biotina sola o CrPic/biotina (ver la figura 5). Los animales se pesaron semanalmente y los nutrientes se administraron diariamente en el agua suministrada a una dosis/kilogramo de peso corporal específica. El tratamiento de los animales se llevó a cabo a lo largo de un periodo de 12 semanas.

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Métodos

Se realizaron análisis de glucosa y de insulina en momentos específicos del estudio. Se determinaron análisis específicos del metabolismo de los carbohidratos utilizando un ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal y un ensayo de tolerancia a la insulina. Los animales se analizaron aleatoriamente en las semanas 6 y 12. A continuación se describe el ensayo específico del metabolismo.

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Ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT)

Después de las mediciones iniciales de glucosa y de insulina, de administraron por vía intraperitoneal 1,5 mg de D_{50}W por cada gramo de peso corporal. Las extracciones se iniciaron a los 30, 60, 90 y 120 minutos de la administración de la glucosa. Se analizaron las áreas bajo las curvas correspondientes a la insulina y a la glucosa. Se analizaron ocho animales de cada grupo durante las 12 semanas. Los resultados del IPGTT se muestran en la Tabla 1. La Tabla 1 detalla la cantidad de consumo de glucosa para los animales tratados con CrPic y/o con biotina en diversas dosificaciones. Obsérvese que "L" representa las ratas magras de control; "O-contr" representa las ratas obesas de control; "LB" representa un tratamiento con una dosis reducida de biotina; "HB" representa un tratamiento con una dosis elevada de biotina; "LC" y "HC" representan dosis reducidas y elevadas de cromo, respectivamente. La figura 6 es una representación gráfica de los resultados de los estudios de IPGTT.

TABLA 1 Datos de consumo de glucosa para el estudio animal de picolinato de cromo + biotina

3

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O-Control	1,8585
LB	2,0615
LB-LC	2,273333
LB-HC	3,1005
HC	2,928
HB-LC	2,258667
HB-HC	3,275333

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Ensayo de tolerancia a la insulina (ITT)

Después del análisis inicial de la glucosa, se administró la insulina (5 unidades por cada kg de peso corporal) por vía intravenosa. Se repitieron los análisis de glucosa a intervalos de 5, 15 y 30 minutos tras la administración de la insulina. Se midió la velocidad de desaparición de la glucosa. De nuevo, se analizaron ocho animales de cada grupo a lo largo de las 12 semanas.

Se determinó la grasa corporal total al inicio y al final del estudio. Para ello, se anestesiaron los animales con metafano, un gas inhalado que induce la anestesia en menos de 30 segundos y que se ha demostrado que resulta muy bien tolerado por los roedores. El sistema utilizado para medir la composición corporal es el TOBEC (instrumento de medición de la conductividad eléctrica del cuerpo). El principio esencial de este procedimiento es que el campo electromagnético se distorsiona en función directa de la cantidad de tejidos que contienen minerales (es decir, el tejido magro). La máquina no utiliza radiaciones y no supone peligros biológicos. Una vez anestesiada, la rata se coloca en el interior de la máquina TOBEC sin restricción, se toman las lecturas y se realizan las medi-
ciones.

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Biopsia de músculo esquelético

Al final del estudio, se realizaron biopsias de músculo vasto lateral tras la estimulación con insulina. La determinación del contenido de glucógeno y los estudios de expresión génica se llevaron a cabo como sigue:

1. contenido de glucógeno en el músculo esquelético: la determinación de la hidrólisis del glucógeno y de la glucosa en biopsia del músculo esquelético se realizaron de acuerdo con Gomez-Lechon, con algunas modificaciones (Gomez-Lechon, M. J. et al. A microassay for measuring glycogen in 96-well-cultured cells. Anal. Biochem. 102:344-352, 1980). Después de la biopsia, las células del músculo esquelético se lavaron tres veces con PBS (pH 7,4). Se añadieron insulina 100 nM y glucosa 30 nM al medio (sólo SkBM), o se añadió el mismo volumen de NaCl al 0.9% como incubación basal de 2 horas. Después de lavados extensivos en PBS helado, se eliminó todo el líquido y después se añadieron a cada tubo 200 \muL de de tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 4,8, y se sonicaron con un procesador ultrasónico de alta intensidad (VIR Sonic 60) en la posición 7 durante 20 segundos. Se extrajeron alícuotas de 50 \mul de cada pocillo del homogenado para el análisis de ADN, tal como se describe en Labarca, C and Paigen, K., A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure, Anal. Biochem. 102:344-352, 1980). Se añadió amiloglucosidasa a cada pocillo a una concentración final de 500 mU/pocillo. Las placas se incubaron a 40ºC durante 2 horas, bajo agitación para evitar la sedimentación de los agregados de glucógeno-proteínas. Los productos de la digestión del enzima se recogieron en tubos de microcentrifugación de 1,5 ml y se centrifugaron a 3.000 r.p.m. durante 10 minutos. Para el análisis de la glucosa, se transfirieron alícuotas de 50 \mul por pocillo de los sobrenadantes anteriormente indicados a una placa de 96 pocillos y se añadieron 150 \mul de solución del ensayo (se añadieron 20 u/litro de peroxidasa, 10 u/litro de glucosa oxidasa, y 1 g/litro de ABST). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 a 40 minutos. La intensidad del color de la reacción se midió a 405 nm utilizando un lector de microplacas. Se consiguió un blanco de la reacción mediante la incubación de homogenados celulares carentes de glucoamilasa; este valor representa el contenido de glucosa libre y se restó del total de glucosa obtenido después de la hidrólisis enzimática. Se construyó una curva estándar con cantidades conocidas de glucógeno de hígado de conejo y se procesó como una muestra de ejemplo. Los contenidos de glucógeno se expresaron en nM de glucosa equivalente/pocillo después de corregirse para la concentración de ADN.

2. Detección de las proteínas hexoquinasa y glucógeno sintasa quinasa-3("GSK-3"): se llevó a cabo una transferencia Western mediante el procedimiento de Burnett, Burnett, W. N. (Western Blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112:195-203, 1981). Después de lavar las células del músculo esquelético tres veces con PBS, las células se centrifugaron a 600 x g durante 5 min. Se añadieron 50 \mul de tampón B (100 mM Tris/HCl, pH 7,4 que contenía pirofosfato de sodio 100 mM, fluoruro de sodio 100 mM, EDTA 5 mM, ortovanadato de sodio 2 mM, PMSF 1 mM, 20 \mug/ml de aprotinina y triton x-100 al 1%) a los tubos de microcentrifugación y se sonicaron durante 20 segundos, tal como se ha indicado anteriormente. Los sonicados se mantuvieron en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 15.000 x g durante 10 minutos. Se realizaron mediciones de la concentración proteínica del sobrenadante. Las alícuotas de sobrenadante que normalizan a cantidad de proteína se diluyeron 1:1 en tampón de Lamelli 2x y se calentaron a 95ºC durante 5 minutos. Las proteínas se separaron con geles SDS-PAGE al 8% y se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa. Se realizaron mediciones de la proteína HK mediante la incubación de las hojas de nitrocelulosa con un anticuerpo policlonal anti-HK (cultivado a partir de ovejas a una concentración de 1:250 en un tampón TBS que comprendía BSA al 3%) durante la noche a 4ºC, seguido de 4 lavados con TBS de 15 minutos, seguido de una incubación con el anticuerpo antioveja conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, dilución de 1:75.000). Las proteínas GSK-3 se identificaron utilizando un IgC monoclonal (0,5 \mug/ml) contra un péptido sintético (CKQLLHGEPNVSYICSRY), que identifica la GSK-3 en una banda de 46 a 51 kDa (Upstate, Lake Placid, NY). El segundo anticuerpo era un IgG anti-ratón conjugado con una dilución de HRP de 1:5.000 (Sigma, St. Louis, MO). Tras lavados extensivos con TBS, los complejos inmunológicos se detectaron utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorado. Las bandas en las películas se cuantificaron con un Alpha Imager 2.000 (San Leandro, CA).

Preparación del ARN: se aisló la totalidad del ARN de la biopsia de músculo esquelético utilizando tiocianato de guanidio, extracción con fenol-cloroformo y precipitación en alcohol. La muestra de ARN se cuantificó con un espectrofotómetro. La proporción de absorbancias (260:280 nm) se encontraba comprendida en el intervalo de 1,8 a 2,0 para todos los preparados y la integridad del ARN se verificó en un gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio. Para la PCR-RT se utilizó la totalidad del ARN aislado.

Análisis del nivel del ARNm de GS: se analizaron los niveles del ARNm de GS utilizando kits de PCR-RT de una etapa (Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA). La síntesis del ADNc de la primera cadena de GS se realizó con 1 \muh del ARN total con 1 x RT-AdvanTaq más una mezcla de enzimas en tricina 40 mM, KCl 20 mM, MgCl_{2} 3 mM, 3,75 ug/ml de BSA, desoxinucleósido trifosfato 0,2 mM, 400 pmoles de cebadores oligo-dT, y 200 ppm de cebador de GS (cadena sentido: 5'-GTGCTGACGTCTTTCTGGAG-3', cadena antisentido: 5'-CCAGCATCTTGTTCATGTCG-3') en un volumen final de 50 \mul. Las mezclas de reacción se sometieron a incubación a 50ºC durante 60 minutos en el termociclador Eppendorf Master Cycler (Westbury, NY). La reacción se detuvo mediante calentamiento a 95ºC durante 5 minutos. Después, las mezclas PCR se sometieron a 15 ciclos de amplificación de PCR con un perfil de ciclos que incluía una desnaturalización durante 30 segundos a 95ºC, hibridación durante 30 segundos a 65ºC y alargamiento durante 2 minutos a 72ºC, seguido de 20 ciclos de amplificación de PCR en la que cada ciclo incluía 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC y 2 minutos a 72ºC, respectivamente. El alargamiento final fue de 5 minutos a 72ºC. Se añadieron cebadores G3PDH a los tubos de reacción de PCR al mismo tiempo que el control
interno.

Análisis de los productos de PCR-RT: los productos de la amplificación de 10 \mul de cada PCR se separaron en un gel de agarosa al 2%, se tiñeron con 0,5 \mug/ml de cloruro de etidio y se fotografiaron. Se evaluaron las densidades de las bandas (Alpha Imagen 2.000, San Leandro, CA). Se verificó la ausencia de contaminación de ADN genómico mediante experimentos de control omitiendo el ARN o sin la transcriptasa inversa en la etapa RT mediante el precalentamiento de una mezcla maestra a 95ºC durante 5 minutos para inactivar el enzima.

Análisis estadístico: la significancia estadística se evaluó mediante ANOVA. Se comparó la sensibilidad a la insulina y la expresión génica con CrPic y con biotina solos y en combinación en comparación con el control. La significancia se aceptó al nivel de p<0,05.

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Resultados

Los datos de los presentes inventores sugieren fuertemente que el cromo puede mejorar la señalización de la insulina, lo que queda demostrado por los presentes inventores en un modelo animal representativo in vivo del síndrome de la resistencia a la insulina. Específicamente, se administró CrPic frente a soluciones de control a ratas JCR obesas, hiperinsulinémicas y que presentaban resistencia a la insulina. El estudio se inició con animales de aproximadamente 4 meses de edad, y los animales se trataron específicamente durante 3 meses. Tal como se muestra en la figura 7, CrPic redujo significativamente la insulina plasmática en ayunas en el análisis de final de estudio. Además, al comparar la respuesta de la glucosa con una ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal, CrPic mejoró significativamente la respuesta de la glucosa (ver la figura 8A), y redujo significativamente la respuesta a la insulina en las ratas obesas (figura 8B). La sensibilidad a la insulina, analizada mediante una ensayo de tolerancia a la insulina, mejoró significativamente con CrPic (figura 9). Esto se consiguió sin variaciones en el peso corporal de los animales. La mejora de la sensibilidad a la insulina se asoció a una reducción de los niveles de colesterol total en comparación con la de los animales magros (ver, por ejemplo, la Tabla 2, y las figuras 10 y 11). El efecto de la combinación de cromo y biotina sobre los niveles de lípidos en el estudio animal se detalla en la Tabla 2. Específicamente, el efecto del cromo y de la biotina sobre los niveles del colesterol, sobre los niveles del colesterol de los lípidos de alta densidad (colesterol-HDL) y de los niveles de triglicéridos, se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2 Estudio animal del picolinato de cromo + biotina (efecto de la combinación de los niveles de lípidos)

Colesterol

4

Colesterol-HDL

5

Triglicéridos mg/dl

6

Además, la mejora de la sensibilidad a la insulina se asoció a niveles mejorados de colesterol-HDL (figura 12A) y a una proporción de colesterol-HDL reducida (figura 12B). Finalmente, la coadministración de cromo y biotina resultó en la reducción global del conjunto de los triglicéridos en los animales tratados (figuras 16 y 17).

En resumen, estos estudios en animales sugieren fuertemente que el cromo y la biotina presentan un efecto in vivo de mejora de la resistencia a la insulina y de los componentes del síndrome de la resistencia a la insulina.

Ejemplo 4

Mejora de los niveles de colesterol en sangre mediante la coadministración de cromo y biotina

Se identificó un individuo que presentaba colesterol elevado. Se le administró oralmente picolinato de cromo y biotina en dosis de 500 \mug y 5 mg diarios, respectivamente. Se observó un incremento del colesterol-HDL y una reducción del colesterol-LDL en sangre con el tiempo.

Ejemplo 5

Atenuación del incremento de los niveles de glucosa en sangre en personas con diabetes de tipo 2 mediante la coadministración de cromo y biotina

Se realizó una investigación del efecto del cromo y de la biotina sobre los niveles de hemoglobina glucosilada en diabéticos de tipo 2. Específicamente, se inició una determinación de los efectos de picolinato de cromo más biotina, incorporados a una bebida que contenía carbohidratos, sobre el control de la glucosa en sangre en sujetos con diabetes de tipo 2. Además, se evaluó el efecto del picolinato de cromo y la biotina sobre los niveles de glucosa en ayunas en diabéticos de tipo 2 que ingirieron una bebida que contenía carbohidratos.

Diseño del estudio

Se llevó a cabo el experimento clínico controlado y aleatorizado de doble ciego de 12 semanas con el fin de determinar los efectos del picolinato de cromo con biotina sobre el control de los niveles de glucosa en personas con diabetes de tipo 2.

Se incluyeron 34 sujetos en la evaluación (24 hombres y 10 mujeres). La selección de los sujetos se basó en diversos criterios. Cada sujeto se presentó con diabetes de tipo 2, con un nivel de glucosa en ayunas superior a 90 mg/dl e inferior a 170 mg/dl, y un nivel de hemoglobina glucosilada superior a 7 mg/dl. El nivel de hemoglobina de los sujetos debía superar 12,5 g/dl y el IMC debía ser superior a 26,0 kg/m^{2} e inferior a 39,0 kg/m^{2}. Las medicaciones hipoglucémicas de línea base se mantuvieron estables a lo largo de periodo de tratamiento.

El estudio incluía dos grupos paralelos, un grupo de control y un grupo de ensayo. Cada grupo recibió bebidas que contenían 29 g de carbohidratos, dos veces diarias, como suplemento dietético. Las bebidas de ensayo y de control presentaban un contenido similar al de las bebidas populares diseñadas para personas con diabetes e incluían los ingredientes siguientes: agua, maltodextrina, aislado de proteínas de soja, aceite de canola, inulina, cacao en polvo desgrasado, maltodextrina, fructosa cristalina, mezcla de vitaminas y minerales, sabor de chocolate natural, lecitina, sabor de vainilla natural, Nutrasweet® (NutraSweet Co., Deerfield, IL), acesulfamo K y SeaKem (FMC Corp., Philadelphia, PA). El grupo de ensayo recibió bebidas que contenían 300 \mug de cromo (en forma de picolinato de cromo) y 150 \mug de biotina. La Tabla 3 detalla la información nutricional de la bebida.

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TABLA 3 Composición nutricional de la bebida

Nutrientes	Con CrPic + biotina	Control
Calorías totales, Kcal	200	200
Grasas, g	6,8	6,8
Proteínas	10,0	10,0
Carbohidratos, g	29,0	29,0
Fibra dietética, g	5,4	5,4
Cromo (como CrPic), \mug	300,0	-
Biotina, \mug	150,0	-

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P.D. El resto de las vitaminas y de los minerales eran similares en ambos grupos (basados en el porcentaje de cantidad diaria y la CDR); los ácidos grasos saturados (SFA), ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), y ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) eran los mismos en todos los grupos de ensayo (fuente: el aceite de canola proporciona cantidades elevadas de MUFA y PUFA, y niveles reducidos de SFA).

La duración del ensayo clínico fue de 12 semanas. Al principio del tratamiento de 12 semanas, se recogieron datos de referencia relativos a los niveles de hemoglobina glucosilada, a las concentraciones de glucosa en sangre en ayunas y a la fatiga. Los indicadores de glucosa en sangre en el control se analizaron al principio, durante y al final del estudio. Específicamente, los sujetos se analizaron en las semanas 0, 1, 2, 4, 6, 8 y 12.

Se analizaron los efectos de la coadministración de cromo y biotina sobre la atenuación del incremento de los niveles de glucosa en sangre en las personas con diabetes de tipo 2 que habían ingerido dos veces al día una bebida que contenía carbohidratos. Los resultados del estudio se muestran en las figuras 18, 19 y 20. En la figura 18, se muestra el cambio de la media de los niveles de hemoglobina glucosilada desde el inicio hasta el final de la semana 12. Se observó un incremento significativo de los niveles de hemoglobina glucosilada en el grupo de control, al que se proporcionó la bebida que contenía carbohidratos, en comparación con el grupo de tratamiento, al que se administró picolinato de cromo.

En la figura 19, se ilustra el cambio de la media de los niveles de azúcar en sangre en ayunas (mg/dl) a lo largo del periodo de tratamiento entre sujetos a los que se había administrado picolinato de cromo y biotina, frente a los sujetos de control. Con el tiempo, el grupo de control mostró un incremento de la media de los niveles de azúcar en sangre en ayunas mientras continuaban ingiriendo la bebida que contenía carbohidratos. Por el contrario, los sujetos que ingirieron las bebidas que contenían carbohidratos suplementados con picolinato de cromo y biotina no mostraron un incremento de la media de los niveles de azúcar en sangre en ayunas.

Se evaluaron los cambios de los niveles de energía de los sujetos al principio y al final del ensayo de 12 semanas. La figura 20 es un gráfico de columnas que muestra las diferencias de los niveles de fatiga en sujetos que habían consumido la bebida que contenía los carbohidratos con el suplemento de picolinato de cromo y biotina frente a los sujetos de control, que consumieron la bebida con carbohidratos sin picolinato de cromo ni biotina. La fatiga se midió utilizando una escala Likert de 10 puntos, en la que una puntuación de 0 equivale a "ausencia de fatiga" y una puntuación de 10 indica fatiga severa. Notablemente, no se observó incremento de fatiga en los sujetos tratados con picolinato de cromo y biotina.

Conclusiones

Los sujetos diabéticos del tipo 2 a los que se había administrado una bebida con carbohidratos con suplemento de picolinato de cromo 2 veces al día durante 12 semanas presentaron una reducción de los niveles de hemoglobina glucosilada y un menor nivel de glucosa en sangre que los sujetos diabéticos de tipo 2 que habían ingerido la bebida que contenía carbohidratos sin picolinato de cromo y sin biotina. Sin pretensión de limitarse a ninguna teoría en particular, estos fenómenos podrían estar basados, en parte, en observaciones que indican que el picolinato de cromo mejora la sensibilidad a la insulina incrementando el número de receptores de insulina y/o facilitando la fijación de la insulina a estos receptores. Además, el cromo potencia la captación de la glucosa en las células musculares e incrementa la producción de glucógeno. La biotina estimula la actividad de la glucoquinasa en el riñón, mejora la función de las células de los islotes del páncreas y mejora la regulación por parte de la insulina del cromo III.

Los datos de los presentes inventores sugieren fuertemente que el cromo y la biotina pueden mejorar la hiperglicemia postprandial. Tal como se muestra en las figuras 18 y 19, CrPic y la biotina aparentemente redujeron significativamente los niveles de glucosa en sangre y los niveles de hemoglobina analizados al final del estudio. Esto se consiguió sin cambios del nivel de fatiga de los individuos con una bebida que contenía picolinato de cromo y biotina. En resumen, estos estudios en seres humanos indican que CrPic y la biotina podrían presentar efectos sobre la hiperglicemia postprandial. Además, los estudios sugieren fuertemente que la coadministración de complejos de cromo conjuntamente con biotina puede reducir el índice glucémico de los alimentos.

Ejemplo 6

Coadministración de un complejo de cromo para la reducción del índice glucémico de un zumo de fruta

Un complejo de cromo y biotina actuó reduciendo el índice glucémico de un zumo de naranja. Se formularon 600 \mug de histidinato de cromo y 300 \mug de biotina en forma de líquido y se añadieron a ocho onzas de zumo de naranja. El histidinato de cromo y la biotina se mezclaron con el zumo de naranja y la mezcla fue ingerida por un individuo. Se observó una reducción de 10 a 25 mg/dl de azúcar en sangre en comparación con los niveles de azúcar en un individuo que había consumido zumo de naranja no suplementado con histidinato de cromo ni con biotina. Por lo tanto, se redujo el índice glucémico del zumo de naranja.

Ejemplo 7

Coadministración de un complejo de cromo para la reducción del índice glucémico de una bebida carbonatada con sabor a cola y edulcorada con fructosa

Un complejo de cromo más biotina actuó reduciendo el índice glucémico de una bebida carbonatada con sabor a cola y edulcorada con fructosa. Se formularon 600 \mug de picolinato de cromo y 300 \mug de biotina en forma de líquido y se añadieron a ocho onzas de la bebida. El picolinato de cromo y la biotina se mezclaron con la bebida y el conjunto fue ingerido por un individuo. Se observó una reducción de 10 a 25 mg/dl de azúcar en la sangre en comparación con los niveles de azúcar en un individuo que había ingerido bebida carbonatada con sabor a cola y edulcorada con fructosa no suplementada con picolinato de cromo ni con biotina. Se redujo el índice glucémico de la bebida carbonatada con sabor a cola y edulcorada con fructosa.

Ejemplo 8

Polinicotinato de cromo y biotina para la reducción del índice glucémico de un alimento rico en carbohidratos

Se formuló un compuesto que comprendía 300 \mug de picolinato de cromo y 200 \mug de biotina en forma de polvos y se espolvoreó sobre pasta preparada. La pasta fue ingerida por un individuo. Al poco tiempo de la ingestión de la pasta, se analizaron los niveles de hemoglobina glucosilada y de azúcar de una muestra de sangre del individuo. Se observó una reducción de la hemoglobina glucosilada y de los niveles de azúcar en sangre. La coadministración de picolinato de cromo y de biotina actuó reduciendo el índice glucémico de la pasta, minimizando por lo tanto el previsible y rápido incremento de la respuesta de la glucosa al ingerir el individuo la pasta sin suplemento de picolinato de cromo ni de biotina.

Claims (22)

1. Utilización de un complejo de cromo y biotina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la dislipemia.

2. Utilización de un complejo de cromo en la preparación de un medicamento para la utilización en combinación con biotina para el tratamiento de la dislipemia.

3. Utilización de biotina en la preparación de un medicamento para la utilización en combinación con un complejo de cromo para el tratamiento de la dislipemia.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la dosis eficaz del complejo de cromo se encuentra comprendida en el intervalo entre 25 y 2.000 microgramos por día.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que la dosis eficaz del complejo de cromo se encuentra comprendida entre 300 y 1.000 microgramos por día.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la dosis eficaz de biotina se encuentra comprendida entre 25 \mug y 20 mg diarios.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que la dosis eficaz de biotina se encuentra comprendida entre 150 \mug y 5 mg.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha dislipemia es causada por niveles elevados en sangre de colesterol LDL.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha dislipemia es causada por niveles reducidos en sangre de colesterol HLD.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha dislipemia es causada por niveles elevados en sangre de triglicéridos.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho complejo de cromo se selecciona de entre picolinato de cromo, tripicolinato de cromo, nicotinato de cromo, polinicotinato de cromo, cloruro de cromo, histidinato de cromo o levadura de cromo.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho complejo de cromo se encuentra en un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha biotina se encuentra en un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho complejo de cromo se administra oralmente.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha biotina se administra oralmente.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho complejo de cromo está destinado a la administración parenteral.

17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y la reivindicación 16, en la que dicha biotina se administra parenteralmente.

18. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento comprende además el ácido picolínico.

19. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento comprende además el ácido nicotínico.

20. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho complejo de cromo y dicha biotina deben administrarse simultáneamente.

21. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicha biotina debe administrarse en las 24 horas posteriores a la administración de dicho complejo de cromo.

22. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la que dicho complejo de cromo debe administrarse en las 24 horas posteriores a la administración de dicha biotina.