ES2271617T3 - Metodo de hibridacion-amplificacion para detectar y tipificar virus papiloma humano. - Google Patents
Metodo de hibridacion-amplificacion para detectar y tipificar virus papiloma humano. Download PDFInfo
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Abstract
Mezcla de iniciador de amplificación, donde dicha mezcla consiste de los iniciadores L1C1, L1C2, nuevoL1C2 que tienen SEQ. ID. NOS. 73-75, respectivamente, iniciadores que tienen SEQ. ID. NOS. 37-70, y SEQ ID NO. 35 y opcionalmente uno o más iniciadores seleccionados del grupo consistente de SEQ. ID. NOS: 70-72, SEQ. ID. NOS: 1-34 y 36.
Description
Método de
hibridación-amplificación para detectar y tipificar
virus papiloma humano.
El método de la presente invención se
proporciona para detección y tipificación genética mejoradas del
virus papiloma humano (HPV, por sus siglas en inglés).
Otro aspecto de la invención se relaciona con la
formulación optimizada de reactivos y el método, adecuado para
amplificar y detectar un conjunto expandido de genotipos HPB
("kits").
Se determinaron numerosas secuencias del virus
papiloma, ver las publicaciones HPV-6: de Villiers
et al., J. Virology, 40 (1981); HPV-11:
Dartmann et al., Virology 151, 124-130
(1986); HPV-16: Seedorf et al., Virology 145,
181-185 (1985); HPV-18: Cole y
Danos, Journal of Molecular Biology 93, 599-608
(1987); HPV-_31: Goldsborough et al.,
Virology 171, 306-311 (1989);
HPV-33: Cole y Streeck, J. Virology, 58,
991-995 (1986); HPV-54: Favre et
al., J. Cancer 45, 40-46 (1990);
HPV-56: Lörincz, J., Gen. Virol. 70, 3099
(1989).
La detección y tipificación de HPV se reporta en
un número de publicaciones, además de Southern blotting y otras
técnicas de hibridación, las técnicas más ampliamente usadas son los
métodos con base en PCR, puesto que estos métodos proporcionan
simultáneamente alta sensibilidad, especificidad y la flexibilidad
del ensayo da más control para cumplir los requisitos
analíticos.
El virus papiloma humano, un miembro de la
familia Papillomaviridae, es un virus de ADN, con un bp 8000 de
genoma circular. El virus muestra fuerte tropismo epitelial y
prolifera solo en células epiteliales diferenciadas. Se sospecha que
el papilomavirus tiene un rol etiológico en muchas enfermedades
humanas diferentes, por ejemplo enfermedades de la piel, es decir
verrugas, condiloma acuminato y tumores de la piel y en otras
condiciones, tales como carcinoma cervical, carcinomas anogenitales,
carcinoma de laringe. Está bien establecido que el papilomavirus
humano muestra correlación fuerte con la incidencia de estos tumores
y esto es cierto incluso para las lesiones
pre-cancerosas (CIN, VIN, VAIN, PIN, PAIN). El HPV
se puede detectar en el 99% de las pacientes con carcinoma cervical.
Esta cercana relación estadística es posiblemente causada por el rol
causal del HPV en la formación de carcinoma cervical. Con base en
los datos epidemiológicos, los pacientes a infectarse por diferentes
genotipos de HPV no tienen el mismo nivel de riesgo a desarrollar
carcinoma cervical. De acuerdo con estos hallazgos los genotipos se
clasifican en clases de riesgo bajo, riesgo medio y riesgo alto y
además también existen genotipos no clasificados. Puesto que los
riesgos son excesivamente diferentes y la incidencia de la infección
de HPV es muy alta, la determinación de genotipo es de gran
importancia.
El virus HPV no se puede cultivar. El
diagnóstico serológico de infecciones de HPV está limitado a
detectar la exposición al virus (infección pasada o actual), pero no
puede identificar exactamente el genotipo, el rol está limitado más
que todo a investigaciones epidemiológicas.
Para los virus papiloma no existe clasificación
serológica exacta (serotipificación) y el método de clasificación
ampliamente aceptado es la tipificación genética. Estos pueden
dividirse en dos grupos, de acuerdo si la detección está precedida
por amplificación o no. En una realización del método último, se
usan sondas de RNA genómicas de longitud total para detectar los
genomas de ADN de HPV desnaturizados y se detecta el heteroduplex
con anticuerpos específicos (Digenos de Captura Híbrida). De acuerdo
con otro método, la técnica de Southern blot se usa para detectar y
tipificar genéticamente los genotipos de HPV. La desventaja de estos
métodos es la insensibilidad relativa y la falta parcial de
especificidad. En el caso del método de Captura Híbrida muchas
publicaciones reportan diferentes reacciones cruzadas causando
falsas reacciones positivas en condiciones clínicas. Los autores
reportaron que las reacciones cruzadas eran aceptables sólo con un
control de corte de alta concentración de ADN (1 ng/ml), que subraya
el acoplamiento no deseable entre sensibilidad y especificidad.
Mediante los métodos de amplificación este
problema no aparece puesto que la reacción responsable por la
sensibilidad (amplificación) se lleva a cabo por separado.
Generalmente las técnicas de amplificación difieren en el segmento
de genoma amplificado seleccionado, numero de iniciadores y la
técnica de detección aplicada. Los iniciadores usados más
frecuentemente son los GP5+ - GP6+, MY9-MY11 y las
diferentes reacciones de PCR de tipo específico. Las técnicas de
detección más frecuentemente usadas son la hibridación de secuencia
específica, el polimorfismo de restricción de longitud de fragmento
(RFLP) y el ensayo de sonda de línea (LiPA). Además de estos, se usa
secuenciación de amplificaciones y patrón de timidina generados por
incorporación de dUTP, pero menos frecuentemente.
Las características analíticas de las técnicas
de amplificación varían en rangos amplios. Los métodos pueden
caracterizarse por los genotipos amplificables, la sensibilidad
analítica de la amplificación genotípica y la especificidad y
confiabilidad de la detección. En este campo el sistema iniciador
degenerado de MY9-MY11 se considera que es la
reacción de referencia. En caso del sistema MY9-MY11
MY9-MY11 existe el sistema de detección de
hibridación LiPA (Innogenetics). El mayor inconveniente del sistema
MY9-MY11 es la dificultad de controlar la síntesis
degenerativa de los iniciadores y por eso la proporción relativa de
las especies iniciador producidas en la síntesis varía de síntesis a
síntesis a síntesis, lo cual puede dar lugar a cambios impredecibles
de la conducta analítica de la reacción PCR; segundo, esta reacción
puede amplificar la menor cantidad de tipos, en comparación con
otras reacciones ampliamente usadas. Es bien conocido de la
literatura que el sistema puede amplificar el genotipo 51 solo en
caso de que se adicionen iniciadores de tipo específico del genotipo
51 de HPV a la reacción. Usando síntesis de iniciador degenerativa
no se puede cambiar la proporción relativa de las especies de
iniciador y es imposible diseñar las proporciones de iniciador para
alcanzar un mejor desempeño analítico y una amplificación balanceada
de genotipos.
La reacción GP5+ - GP6+ resuelve el problema
solo mediante el uso de dos pares de iniciadores cuidadosamente
seleccionados optimizados par alas secuencias de HPV genital, los
dos sistemas de iniciador son fáciles de manejar, sin embargo la
flexibilidad es más baja. El sistema GP5+ - GP6+ puede amplificar
muchos genotipos de HPV conocidos, pero las características
analíticas del sistema no son óptimas (la sensibilidad no está
balanceada con diferentes genotipos) y el enfoque de dos iniciador
se restringe en optimización, por ejemplo balancear las
sensibilidades de detección para los genotipos individuales es
altamente problemático (excepto la optimización limitada de la
temperatura de fusión y concentración de MgCl_{2}). Es difícil
adaptar el sistema GP5+ - GP6+ a la amplificación de otros
genotipos, que en cualquier caso influye en su aplicación futura,
puesto que la necesidad de detectar nuevos genotipos ocurre
permanentemente. La identificación de los genotipos no se resuelve
adecuadamente.
Otro método de amplificación de genotipo
específico ampliamente conocido es el método L1C: el sistema de dos
iniciadores, con dos versiones, siendo una usar (con el iniciador
LC1) el iniciador L1C2 o el nuevo iniciador L1C2, para amplificar
otros genotipos. La descripción detallada de la amplificación L1C se
puede encontrar en la literatura [Jpn. J. Cancer Research 82,
524-531 (1991)].
Básicamente se deben cumplir dos criterios por
medio de los métodos de detección de
post-amplificación: aplicabilidad de diagnóstico
rutinaria (simplicidad, costes, tiempo) y la requisición de potencia
de nivel adecuado de discriminación de potencia de discriminación.
Un grupo significativo de métodos que no son adecuados en términos
de potencia de discriminación. Por lo tanto la aplicación de RFLP es
limitada y debido a las regiones amplificadas cortas no hay
suficientes sitios de restricción de diagnóstico, los genotipos
solamente pueden clasificarse en grupos. En otro ejemplo la técnica
SSCP es difícil para referir los patrones complejos de la SSCP a
genotipos, y la robusteza de estas reacciones no es satisfactoria
tampoco. El poder de discriminación es especialmente importante
desde el punto de vista de cumplir los requisitos de las autoridades
reguladoras. A partir de los aspectos de la simplicidad y del poder
de secuenciación de discriminación es el enfoque ideal, puesto que
su automatización se resuelve y es capaz de detectar cada uno de los
genotipos (o incluso subtipos de los mismos), si la muestra no es
una mezcla de genotipos. Pero en la práctica no es ampliamente
usado, debido a que es caro y consume tiempo, y su aplicación en
laboratorios de diagnóstico rutinario no es aceptable y en caso de
muestras mezcladas ninguno de los genotipos se puede
determinar.
determinar.
La ventaja de los métodos de hibridación es que
su potencia de discriminación o severidad puede cambiarse
fácilmente, puesto que se pueden variar varios parámetros en rangos
amplios y algunas formas se automatizan fácilmente, la reacción es
menos cara y en caso de implementación paralela (con algunas formas)
incluso el tiempo necesitado es insignificante.
Por lo tanto existe la necesidad de un nuevo
método de amplificación/detección de HPV que elimina las desventajas
de los métodos actuales y que sea barato, fácil de reproducir y
automatizar. La invención describe un ensayo de amplificación e
hibridación en el cual los iniciadores son moléculas sintetizadas
independientemente, por lo tanto su proporción relativa puede
controlarse y optimizarse fácilmente y la amplificación tiene una
sensibilidad balanceada. Las reacciones de hibridación llevadas a
cabo de manera altamente paralela cumplen con los criterios de una
reacción de bajo costo, rápida, flexible y susceptible de
automatizarse.
La presente especificación describe una región
genómica de papilomavirus humano que está dentro de una amplímero de
consenso (que es una región capaz de ampliarse con iniciadores
enlazados a secuencias conservadas que flanquean al amplímero o
amplicon). En donde estas regiones genómicas se caracterizan por
tener secuencia de ADN de genotípico específico, que es adecuada
para diseñar sondas de hibridación de genotipo específico.
Existe otra región genómica de HPV en este
amplímero (amplicon) de consenso donde estas regiones genómicas se
caracterizan por tener secuencia de ADN conservado, específica para
el gen de HPV, que es adecuada para diseñar sondas de hibridación
específicas para el gen.
Un elemento esencial de la invención es la
presencia de dos segmentos genómicos dentro de una amplímero
consensual que son adecuados para diseñar sondas de hibridación
específicos para el gene y el genotipo.
La invención describe el uso de iniciadores en
reacción de amplificación, las secuencias de ADN y sus
concentraciones, y las condiciones del ciclo de reacción a ser
optimizada para la amplificación de sensibilidad balanceada de los
genotipos del papiloma virus humano. Así, en un aspecto la invención
proporciona una mezcla de iniciador de amplificación, donde dicha
mezcla consiste de L1C1, L1C2, nuevos iniciadores L1C2 (SEQ. ID.
NOS. 73-75), SEQ. ID. NOS: 37-40, y
SEQ ID NO. 35, y opcionalmente uno o más iniciadores seleccionados
del grupo consistente de SEQ. ID. NOS: 70-72, SEQ.
ID. NOS: 1-34 y 36. Esta mezcla de iniciador se
puede usar para amplificar los genotipos 3, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 66,
67, 68, 72, 74 y 77 del virus papiloma humano.
La presente invención proporciona un método para
detectar uno o más genotipos de HPV en una muestra biológica, que
comprende los pasos de:
a) preparar uno o más amplímeros (amplicon)
usando la mezcla de iniciador de la reivindicación 1 a partir de
moléculas de ácido nucleico extraídas de la muestra biológica; y
b1) hibridizar el amplímero obtenido en (a) bajo
condiciones severas con una sonda de hibridación específica de
genotipo; y opcionalmente
b2) hibridizar el amplímero obtenido en (a) en
condiciones severas con una sonda de gen específico de HPV.
En otro aspecto la invención proporciona un kit
para detectar y tipificar HPV que incluye
i) la mezcla de iniciador de la reivindicación
1;
ii) opcionalmente iniciador de control
interno;
iii) sondas de hibridación que comprenden o
hibridizan a cualquiera de SEQ ID NOS. 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89,
91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 ó 111 y opcionalmente
cualquiera de SEQ. ID NOS. 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88,90, 92, 94,
96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, ó 110; y
En resumen el método proporcionado en la
presente invención se puede usar para la amplificación/detección de
un grupo dado de genotipos de HPV, dando lugar a la detección de ADN
genómico de HPV del mismo con sondas de gen específico, y la
tipificación genética colectiva (agrupada) o individual de los
genomas de HPV. El método se puede usar para acceder al riesgo o
para determinar aquellos individuos que están en riesgo de
condiciones o enfermedades posteriores, causadas o asociadas por los
virus HPV encontrados en los pacientes en un tiempo dado y
especialmente con la detección de tipo específico de los mismos. El
método suministrado por la invención también es adecuada para
tamizar o cribar la presencia de HPV en una población dada y también
para aumentar, apoyar o confirmar un diagnóstico citológico en un
individuo dado (screening o cribado).
Para ayudar a entender la invención se definen
diversos términos abajo.
Los términos "ácido nucleico" y
"oligonucleotido" se refieren a sondas, iniciadores y otros
ADN, RNA, PNA (ácido nucleico péptido) y otros oligómeros químicos
capaces de enlazarse en una secuencia específica sobre una plantilla
de ADN, RNA o PNA (molécula objetivo o diana).
El término "hibridación" se refiere al
enlazamiento en secuencia específica de dos secuencias de ácido
nucleico. Las condiciones usadas determinan de manera significativa
la severidad de hibridación, por lo tanto puede ocurrir hibridación
en condiciones menos severas, incluso si los ácidos nucleicos no son
exactamente complementarios. En algunos casos podría ser necesarios
que la sonda de ácido nucleico se enlace con un grupo de secuencias
que son familiares más cercanos o más lejanos unas de otras.
Aquellos versados en el arte de la tecnología de ácido nucleico
pueden determinar las condiciones que si se cumplen entonces el
enlazamiento es adecuadamente específico o no específico.
El término "sonda" se refiere a un conjunto
de oligonucleótidos que muestran hibridación de secuencia específica
en presencia de ácidos complementariamente o parcialmente
complementariamente nucleicos. La estructura de los oligonucleotidos
se puede modificar para hacer ejecución de los pasos que siguen una
posible hibridación, o para cambiar sus propiedades de
hibridación.
El término "sonda de tipo específico" se
refiere a un conjunto de oligonucleótidos que en condiciones severas
se enlazan solo a la región objetivo que es exactamente
complementaria con ellos. Las condiciones de hibridación adecuadas
para este requisito son bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo
Sambrook et al., 1985, Molecular Cloning Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. USA).
Genenarlmente, las condiciones severas se seleccionan para que estén
cerca de 5ºC más bajo que el punto de fusión térmico (Tm) para la
secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la
temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de
la sonda se asocia en presencia de la molécula objetivo
complementariamente. Relajar la severidad de las condiciones de
hibridación (por ejemplo aumentar la concentración de sal o bajar la
temperatura) permitirá enlaces de secuencias no exactamente
complementarias. En caso de planilla no exactamente complementaria,
los nucleótidos que no se enlazan al ácido nucleico plantilla son
los "nucleótidos mal encajados".
El término "iniciador" se refiere a
nucleótidos capaces de actuar como punto de inicio de la síntesis de
ADN (imprimación) en condiciones en las que se induce síntesis de un
producto de extensión de iniciador hacia una cadena de ácido
nucleico sobre una plantilla de ácido nucleico, es decir, en
presencia de cuatro trifosfatos nucleosidos diferentes y un agente
para polimerización (es decir polimerasa o transcriptasa invertida
de ADN) en un búfer apropiado y a una temperatura adecuada. Un
iniciador es preferiblemente una molécula de ADN monocatenaria. La
longitud apropiada de un iniciador abarca típicamente desde 15
hasta 40 nucleótidos.
Un iniciador no necesita reflejar la secuencia
exacta de la plantilla, por lo tanto cambiar la temperatura del
grupo de enlace (reacción) de moléculas similares objetivos puede
servir como plantilla para la síntesis (amplímero consensual). Los
grupos químicos con ciertas características ventajosas pueden usarse
para etiquetar el oligonucleótido iniciador para hacerlo capaz de
enlazarse a la fase sólida y para otros propósitos.
El término "iniciador" - en la presente
invención - también se refiere a un grupo de oligonucleótidos
secuencialmente relacionados, donde el grupo de oligonucleótidos es
capaz de imprimación (tal como se describe arriba) sobre cierto
grupo de secuencias plantilla o de molde. Adicionalmente, los
miembros del grupo pueden consistir de oligonucleótidos que pueden
formar malos emparejamientos con algunos o todos los miembros de un
conjunto dado de ácidos nucleicos de plantilla o molde. Pero en
condiciones apropiadas estos iniciadores también pueden participar
en la imprimación. El término "iniciadores consensuales" se
refiere a un iniciador o grupo de iniciadores que se pueden usar
para la imprimación de ciertas regiones de ácidos nucleicos de molde
relacionados. Las características de estas regiones es que su
variabilidad es significativamente más baja que la variabilidad de
todo el ácido nucleico, es decir, ellas se conservan, por lo tanto
en estas secuencias los iniciadores consensuales seleccionados
pueden hacer imprimación incluyendo el grupo entero de secuencias de
ácido nucleico de molde. El iniciador consensual no es
necesariamente un iniciador individual, puede ser un grupo de
iniciadores.
El término "enzima de polimerasa
termoestable" se refiere a una enzima que es relativamente
estable a 95ºC y cataliza la polimerización de trifosfatos
nucleosidos para formar productos de extensión de iniciador que son
complementarios para una de las cadenas de ácido nucleico de la
secuencia objetivo. Una enzima polimerasa purificada termoestable se
describe en U.S. Pat. No. 4,889,818, y se encuentra comercialmente
disponible por ejemplo en
Applera.
Applera.
En la presente invención la amplificación de ADN
se lleva a cabo por reacción de cadena depolimerasa (PCR, por sus
siglas en inglés), divulgada en U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202,
and 4,965,158.
En la presente invención se han desarrollado
condiciones optimizadas de PCR para los propósitos de la
amplificación de un número grande de diferentes genotipos HPV con
optimización de concentraciones de iniciador, secuencias de
iniciador condiciones de ciclización. La primera parte de la
amplificación amplifica con severidad constantemente creciente, con
el objetivos de que la amplificación de los genotipos, para los
cuales los iniciadores contienen más nucleótidos mal emparejados,
pueda empezar a amplificar con la misma eficacia que los otros
genotipos, pero más tarde la temperatura de enlace creciente aumenta
desplaza la reacción hacia el uso de iniciadores, que se encuentran
en cantidades más grandes. Con una mezcla optimizada de iniciadores
este proceso, en teoría, desplazará las secuencias de enlace de
iniciador hacia una secuencia consensual, creando así la posibilidad
de amplificación de sensibilidad balanceada de los genotipos.
Aunque la reacción en cadena de polimerasa es el
método de amplificación preferido, las regiones genómicas
mencionadas y nucleótidos pueden usarse en cualquier método
conocido. Por ejemplo la reacción en cadena de ligasa (Wu y Wallace
1989, Genomics 4:_560-569), El sistema de
amplificación TAS (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:_1173-1177) y la replicación de secuencia
auto-sostenida (Guatelli et. al., 1990, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:_1874-1878) pueden ser
también adecuados para la amplificación correcta de la secuencia
objetivo. De manera similar, en el sistema
Q-beta-replicasa (Kramer y Lizardi,
1989, Nature 339:401-402) se pueden amplificar
sondas de secuencia específica.
En la presente invención se eligen los
iniciadores de un grupo de secuencias más o menos complementarias
adecuadas para amplificar amplímeros consensuales de HPV. Se logra
imprimación efectiva en presencia de nucleótido mal emparejado
usando temperatura de hibridación y concentraciones relativas de los
iniciadores diseñadas cuidadosamente.
En la presente invención los iniciadores de la
invención (SEQ. ID. NO: 1-40, 70-72)
se usan con los iniciadores conocidos (SEQ. ID. NO:
73-75) en la forma de reactivos adecuados. Esto
permite la detección un conjunto extendido de genotipos HPV, por lo
menos 47 genotipos conocidos. Se puede ver en el ejemplo 4 que la
amplificación del genotipo 35 HPV de acuerdo con la invención se
puede llevar a cabo incluyendo el iniciador SEQ. ID. NO. 37 en la
reacción. Sin este iniciador que incluye solo los iniciadores
conocidos en la reacción el genotipo HPV-35 no se
amplifica. Otro aspecto de la invención se refiere a los iniciadores
de tipo específico para el gen HPV L1, los cuales incluyen una de
las secuencias nucleótidas descritas en las secuencias SEQ. ID. NO:
1-36.
La invención se refiere a la mezcla de
iniciadores que incluyen los iniciadores L1C1, L1C2 o nuevos
iniciadores LlC2 (SEQ. ID. NOS. 73-75), SEQ. ID.
NOS: 37-40, y SEQ ID NO. 35, y opcionalmente uno o
más iniciadores seleccionados del grupo que consiste de SEQ. ID.
NOS: 70-72, SEQ. ID. NOS: 1-34 y 36.
Además, la invención se refiere a la aplicación de una mezcla de
iniciadores así para la amplificación de genotipos de HPV 3, 4, 6,
7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28, 29., 30, 31, 32,
33, 34, 35, 36, 39, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56,
58, 49, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 ó 77.
Un elemento esencial de la presente invención es
la presencia de segmentos genómicos genéricos y de tipo específico
en los amplímeros. Estos segmentos genómicos posibilitan la
realización de hibridación y detección altamente específica. Por lo
tanto la presente invención también describe un segmento genómico de
los amplímeros caracterizado por un segmento genómico diverso, de
genotipo específico, que se estira desde el 3' extreme del amplímero
(en dirección 3'-5') desde el -80 bp hasta -30 bp.
Estos segmentos genómicos son secuencias de ADN bicatenario de
alrededor de 40 bp de largo, dadas en las secuencias SEQ. ID. NO:
77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107,
109, 111.
La presente invención describe otro segmento de
los amplímeros, que se estiran 3'-5' desde el
extremo 3' del amplímero desde los -150 bp hasta -105 bp, y se
caracteriza por secuencias de baja complejidad altamente conservadas
entre genotipos, lo cual muestra especificidad de gen HPV genérico.
Estos segmentos genómicos son ADN bi-catenarios,
usualmente contienen 23 bp, y su cadena superior tiene una de las
siguientes secuencias: SEQ. ID. NO: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90,
92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.
Durante la detección de hibridación de los
amplímeros, se usan sondas de hibridación de tipo específico,
diseñadas para los segmentos genómicos mencionados arriba. Las
sondas oligonucleótidas genéricas son generalmente aplicables para
detección de los amplímeros de HPV, que son el ADN de HPV
amplificado, mientras las sondas de tipo específico se pueden usar
para más tipificación de las mismas, es decir para detectar los
genotipos individuales. Ambas sondas de hibridación pueden ser ADN,
RNA o PNA al natural.
Las sondas genéricas usadas en el método de la
invención tienen propiedades similares a los iniciadores
consensuales con la diferencia de que el extremo 5' no se prefiere
para la posición de pares nucleótidos mal emparejados. En la
presente invención ellos se usan como sondas, estas sondas genéricas
pueden usarse tanto como sondas de hibridación como iniciadores.
Las sondas de hibridación genéricas
(consensuales) o iniciadores de la invención incluyen una de las
secuencias listadas en las secuencias SEQ. ID. NO:
41-49.
En un método preferido de la invención se usan
las siguientes sondas como sondas genéricas: SEQ. ID. NO:
41-49.
En caso de sondas de tipo específico las sondas
son 100% complementarias a la secuencia del genotipo
correspondiente. Durante su diseño es importante excluir la
posibilidad si otros genotipos muestran complementación de alto
nivel con la sonda o parte de ella. Puesto que el segmento de tipo
específico es alrededor de 40 bp de largo en los amplímeros de la
invención, es posible seleccionar incluso secuencias de sonda que se
solapan, las cuales son las más adecuadas tanto teórica- como
experimentalmente. Se demuestra en el ejemplo 5 que se pueden
diseñar y usar sondas adecuadas que tienen alta especificidad (en
comparación con los 70 genotipos investigados) y mantienen su
especificidad incluso a temperatura ambiente con las condiciones de
hibridación usadas. Puesto que la hibridación de las sondas es
adecuadamente específica en condiciones de hibridación idénticas,
también se puede usar la mezcla de las sondas. Por lo tanto desde el
punto de vista práctica se pueden usar condiciones de reacción más
uniformes. Por lo tanto la invención divulga las secuencias de las
sondas de tipo específico que se pueden en amplificación y detección
de de HPV y ensayos de genotipificación, e incluyen una de las
secuencias listadas en SEQ. ID. NO: 50-67.
La invención se refiere a cualquier realización
de la hibridación pero comercialmente se prefiere la hibridación de
fase sólida.
La tal llamada hibridación de fase sólida
(adelante) enlaza las sondas a ácido nucleico objetivo inmovilizado
(amplímero), mientras que la hibridación invertida enlaza el ácido
nucleico objetivo (amplímero) a sondas inmovilizadas. Se retiran
productos de reacción no enlazados con diferentes soluciones de
lavado en el proceso. En el primer caso la sonda debe etiquetarse
adecuadamente para un desarrollo posterior, Mientras en la invertida
forman el amplímero etiquetado. Ambos sistemas se pueden realizar en
placas de microtitulación. Puesto que la capacidad de inmovilización
es limitada, en la presente invención el sistema de hibridación
adelante se prefiere debido al gran número de las sondas
individuales que constituyen la mezcla de sondas usadas.
El método descrito en US 6,214,979 puede ser
aplicable de manera similar, cuando las sondas se adicionan a la
reacción durante la amplificación. Durante el proceso la actividad
exonucleasa 5'-3' de la polimerasa Taq descompone
las sondas, y la detección de la descomposición producida puede
usarse para detectar la presencia del ácido nucleico objetivo. Pero
también se conocen otros sistemas de detección, llamados de tiempo
real, en su mayoría con base en hibridación, pero estos difieren
sólo en su método de implementación y detección y no en una
realización teóricamente diferente del enlazamiento de amplímero de
sonda de secuencia específica.
Para la inmovilización se pueden etiquetar los
amplímeros. De las diversas posibilidades en la presente invención
se prefiere el etiquetado biotina de los iniciadores y el uso de
iniciador etiquetado en reacciones de amplificación. En presencia de
avidina o estreptavidina absorbida a la biotina de fase sólida da
lugar a la inmovilización del amplímero, como una consecuencia del
enlazamiento de avidina-biotina altamente específico
y muy estable. En una reacción dada solo iniciadores que hibridicen
una u otra cadena se biotinilan para que la otra cadena se pueda
retirar antes de hibridación.
Para propósitos de detección las sondas se
pueden etiquetar y sus etiquetas se pueden detectar mediante
diversos métodos, por ejemplo mediante métodos de detección que se
basen en fluorescencia, radioactividad, colorimetría, difracción de
rayos X, absorción, magnetismo, actividad de la enzima, etc. Por lo
tanto el etiquetado adecuado puede incluir pero no limitarse a lo
siguiente: fluoroforos, cromóforos, isótopos, substancias
electrodensas, enzimas o ligandos capaces de formar enlazamiento
específico. También se puede usar una combinación de los sistemas
mencionados arriba. En la presente invención se prefiere el
enlazamiento específico de fluoresceína con anticuerpo HRPO
anti-fluoresceína que se detecta mediante la
reacción de oxidación de peroxidasa de rábano en la presencia de
substrato de HPPA y H_{2}O_{2} (ver ejemplo 2). En la presente
invención se usan iniciadores delanteros o invertidos. Tanto el
etiquetado de las sondas como la HRPO
anti-fluoresceína se encuentran disponibles
comercialmente. Los químicos necesarios para los lavados y las
diversas soluciones también se encuentran disponibles por lo
general. Se puede armar o usar un sistema que usa fosfatasa alcalina
o cualquier otra enzima cuya actividad se pueda detectar. Además de
la detección fluorescente, la luminometría y colorimetría también
son métodos de detección aceptables para aplicación de diagnóstico
médico del sistema.
Incluir un control interno durante la aplicación
de diagnóstico del método de la invención brinda la posibilidad de
reconocer reacciones falsas negativas y se prefiere desde un punto
de vista de diagnóstico. Se pueden usar diversas fuentes de ADN
natural o artificial para control interno. Se prefieren aquellos
sistemas que no aumenten el número de los iniciadores usados en la
reacción y se estandarizan adecuadamente la cantidad y las
propiedades analíticas del ácido nucleico objetivo. En la presente
invención a la muestra se adiciona una secuencia artificial de ácido
nucleico (SEQ. ID. NO: 68) en forma de plasmida recombinante
(ejemplo 6). En la presente invención la detección del control
interno se lleva a cabo paralelamente con la detección de
hibridación de ADNA de HPV, y solo se separa el desarrollo de los
substratos. La sonda se etiqueta con digitoxigenina (SEQ. ID. NO:
69) y detectable con fosfatasa alcalina conjugada con anticuerpo
anti-digitoxigenina. Sin embargo también son
adecuadas otras técnicas de detección para detección de sonda
interna.
Pero la detección del control interno también se
puede llevar a cabo con base en las diferencias de movilidad, usando
electroforesis de gel agarosa u otra técnica adecuada.
Para la amplificación y la detección de ADN de
HPV el método de la presente invención es adecuado para producir una
unidad armonizada de los reactivos (kit). En esta forma el kit
contiene todos los siguientes reactivos o cualquier combinación de
ellos, y otros reactivos: iniciadores, mezcla de iniciadores,
búferes, polimerasa termostable, ADN de HPV de control positivo, ADN
de no HPV, ADN de control interno, sondas o mezcla de sondas,
conjugado anticuerpo-enzima.
La descripción de secuencias de los iniciadores
y sondas de la invención es solo ilustrativa. Se pueden diseñar
muchas variantes de sondas tanto genéricas como de tipo específico
usando la región genómica de HPV de tipo específico, para aquellos
versados en el arte, por lo tanto las variaciones en cuanto sean
elegidas de la región genómica de la invención están cubiertas por
el alcance de la presente invención.
La invención se presenta en más detalle con los
siguientes ejemplos. Aunque el método, que es la base de la
invención es aplicable a la amplificación de cualquier genoma de
HPV, en los siguientes ejemplos solo se usan genomas de HPV genital,
que son de mayor importancia médica. Se debe notar que los ejemplos
son solo ilustrativos y no deben considerarse como limitantes del
alcance de la invención.
Los iniciadores oligonucleosidos usados en el
método de la invención fueron de fuentes comerciales (IDT, USA). Los
iniciadores se sintetizaron con un grupo amino 5'. Se usó éster NHS
para etiquetado de biotina, fluoresceína y digitoxigenina. Los
nucleótidos etiquetados se purificaron con HPLC.
Se tomaron muestras por parte de ginecólogos
usando citoescobilla, se transportaron muestras en solución PBS
(Salmuera de fosfato tamponada de 10 mM pH=7,4, Sigma, NaCl 138 mM,
KCl 2,7 mM). Se hizo pretratamiento de las muestras en los tubos de
muestreo: antes de lisado las muestras se centrifugaron (2000 g, 10
minutos), se descartaron los sobrenadantes y se adicionó 1 ml de
solución de PBS, se pasó por vórtex, se centrifugó, descartando el
sobrenadante. Al final del proceso se adicionaron 250 \mul de
solución para lisado a las muestras (proteinase-K
0,5 mg/ml, 0,01 M TRIS-HCl pH=8, 0,001 M EDTA pH=8,
en agua destilada), cuya solución contiene el control interno de la
prueba de HPV (SEQ. ID. NO: 68), se pasó por el vórtex y se incubó
por 30 minutos a 56ºC. A partir de este punto todas las tareas de
manipulación se llevaron a cabo en el robot TECAN RSP150, se
añadieron 200 \mul de solución de enlazamiento (5,5 M GUSCN, 20
mM EDTA, 10 mM TRIS-HCl pH=6,5, 65 mM ditiotreitol,
40 g/l sílice, SIGMA Cat. No.: 28,851-3, agua
destilada), y el sílice se preparó mediante filtración al vacío a
partir de los componentes solubles. Se usó de nuevo filtración para
lavar el sílice dos veces con 200 \mul de solución de enlazamiento
sin sílice (5,5 M GUSCN, 20 mM EDTA, 10 mM TRIS-HCl
pH=6,5, 65 mM ditiotreitol, agua destilada), y se usan dos veces
200 \mul de solución de lavado (25% de isopropilalcohol, 25% de
etanol al 96%, 50% de agua destilada, 0,1 M NaCl), finalmente se
aplica con 200 \mul etanol al 96%. Después de secar al aire, se
eluyó ADN en 200 \mul de solución TRIS a un pH=8,0. El ADN se
almacena congelado a -20ºC hasta su uso posterior.
El volumen total de reacción fue de 25 \mul,
incluyendo los siguientes componentes: 10 \mul de ADN, 2,5 \mul
10X búfer de polimerasa (concentración final: 10 mM de
TRIS-HCl (pH=9,0), 50 mM KCl, 0,1% Triton
X-100 (Promega)), 2 mM MgCl_{2}, cada dNTP (ATP,
CTP, GTP, TTP) de 250 \muM, 4 \muM de una mezcla de iniciadores:
SEQ. ID. NO: 35, 37-40, 73-75, y 1U
de Taq polimerasa de ADN (Promega). La reacción se llevó a cabo en
un ciclador térmico GeneAmp 9700 PCR, con los siguientes
parámetros:
Ciclo 1: 4 minutos a 95ºC;
Ciclos 2-40: 30 segundos a 94ºC,
1 minuto a 48ºC y 45 segundos a 72ºC;
Ciclo 41: 3 minutos a 72ºC.
La hibridación se llevó a cabo en fase sólida.
24 horas antes las placas de poliestireno de 96 ozos (Costar) se
cubrieron con estreptavidina (0,02 mg/ml de estreptavidina en
solución de PBS). Se incubaron las placas a temperatura ambiente y
24 horas más tarde las placas se lavaron dos veces con 250 \mul de
solución de lavado [25 mM TRIS pH=7,5, 125 mM NaCl, 20 mM
MgCl_{2}, 3% Tween-20]. Se diluyeron 20 \mul del
producto de la reacción de PCR con 140 \mul de agua destilada, y
se mezclaron 5 \mul de esta solución con 45 \mul de búfer de
enlazamiento [25 mM TRIS pH=7,5, 125 mM NaCl, 5 mM
EDTA-Na2, 5X de solución de Denhardt, 0,1%
Tween-20] y se dispensó a los pozos de la plaqueta
revestida de estreptavidina. La reacción se incubó a temperatura
ambiente por 30 minutos, con agitación constante. Luego se
adicionaron 50 \mul de búfer de elución [100 mM NaOH, 300 mM NaCl]
a la mezcla, incubada por 3 minutos a temperatura ambiente, y las
placas se lavaron 3 veces con 250 \mul de solución de lavado [25
mM TRIS pH=7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl_{2}, 3%
Tween-20]. Después de lavar el búfer de hibridación
(5xSSC (0,3 M citrato de Na pH=7, 3 M NaCl), solución de 1xDenhardt,
0,1% SDS], que contiene sondas etiquetadas de fluoresceína (5 nM por
sonda) se adicionó a los pozos. La mezcla se incubó por 30 minutos a
50ºC con agitación constante, y se lavó 6 veces con 250 \mul de
solución de lavado con alta astringencia [0,05 x SSC, 0,3%
Tween-20]. Después de esto a la reacción se
añadieron 50 \mul de búfer de conjugación [25 mM TRIS pH=7,5, 125
mM NaCl, 2 mM MgCl_{2}, 0,3% Tween-20, 1% BSA],
que contiene anticuerpo POD antifluorescente (Roche) (0,0015
E/reacción). Las placas se incubaron por 30 minutos a temperatura
ambiente con agitación y se lavaron 6 veces con 250 \mul de
solución de lavado de alta astringencia [25 mM TRIS pH=7,5, 125 mM
NaCl, 20 mM MgCl_{2}, 3% Tween-20]. Para
desarrollo se añadieron 135 ml de solución substrato (5 volúmenes
[45 mM ácido hidroxifenil-propiónico (HPPA),
disueltos en búfer 0,1 M TRIS-HCl pH=9,0], + 1
volumen [0,6 g/l H_{2}O_{2} en búfer citratao fosfato de 20
mM]). Para detener la reacción se agregaron 65 \mul de solución de
detención [0,75 M glicina pH=10,3] a la mezcla de reacción después
de 20 minutos. La señal fluorescente se midió con fluorómetro de
placas SpectraMax a 324/410 nm. Las muestras se consideraron
positivas si su valor era más alto que tres veces el promedio de 3
valores de muestra de control paralela negativa.
Las muestras se picaron a razón de 10
ng/reacción por plasmidas que contienen una región clonada HPV L1 de
diferentes genotipos y usada para amplificar y detectar ADN HPV
mediante el método de la invención. La reacción e hibridación PCR se
llevó a cabo de acuerdo con la descripción del ejemplo 3, con la
diferencia de que la composición de los iniciadores fue cambiada. La
reacción sin el L1F2 (SEQ. ID. NO: 37) no dio lugar a amplificación
con el genotipo HPV 35, mientras que usar iniciador L1F2 dio lugar a
la detección efectiva del genotipo HPV 35.
Se picaron muestras a razón de 10 ng/reacción
por plasmidas que contienen la región HPV L1 clonada de diferentes
genotipos y se usó para amplificar y detectar ADN HPV por el método
de la invención. La reacción e hibridación PCR se realizó de acuerdo
con el ejemplo 3. Se emprendió la amplificación y tipificación de
los siguientes genotipos de HPV: 1-24,
26-42, 45, 47-68,
72-74, 76-77, 86. La amplificación
de los siguientes genotipos se demostró con electroforesis de gel
agarosa: 3, 6-7, 10-11,
13-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29,
30-36, 39-40, 42, 45, 51,
52-55, 58-62, 66-68,
72. Usando la mezcla de las sondas de gen específico SEQ. ID. NO:
41-49 (usando las condiciones descritas en el
ejemplo 3) los siguientes genotipos fueron detectables:
3-4, 6-7, 9-14, 16,
18, 20, 24, 26, 29, 30-37, 39-42,
45, 51, 52-55, 58-62,
66-68, 72, 74, 77. Los datos muestran que una
porción de los genotipos puede detectarse solo mediante hibridación,
lo cual no es sorprendente, puesto que la hibridación es cerca de
10-100- veces más sensible que la electroforesis de
gel agarosa. También se puede ver a partir de los datos que la
hibridación de gen específico sí detectó todos los genotipos
positivos de electroforesis de gel agarosa indicando su verdadera
naturaleza de gen específico.
Las muestras se picaron a razón de 10
ng/reacción por plasmidas que contienen la región HPV L1 clonada
desde diferentes genotipos y usada para amplificar y detectar ADN de
HPV mediante el método de la invención. La reacción e hibridación
PCR se llevaron a cabo de acuerdo con la descripción del ejemplo 3.
la sonda de hibridación fue el oligonucleótido diseñado para el
genotipo HPV 35 (SEQ. ID. NO: 58). Se emprendió la detección de
amplímeros de los siguientes genotipos: 3-4,
6-7, 9-14, 16, 18, 20, 24, 26, 29,
30-37, 39-42, 45, 51,
52-55, 58-62, 66-68,
72, 74, 77. La sonda detectó solo el amplímero de genotipo HPV 35
correspondiente.
La detección de las muestras preparadas de
acuerdo con el ejemplo 2 se llevó a cabo de acuerdo con el ejemplo
3, con la diferencia de que la sonda del control internó etiquetada
con digitoxigenina (su cantidad fue la misma que las sondas de tipo
específico) fue empleada con las sondas de tipo específico y los
anticuerpos de POD anti-fluoresceína y ALP
anti-alp [1:2000, Jackson Immuno Research] estaban
simultáneamente presentes en el paso de conjugación. Después del
desarrollo de la reacción de POD (ver ejemplo 2), se realizó
desarrollo de ALP de acuerdo con lo siguiente: la solución substrato
era 6,25 mg/100 ml de
4-metil-umbeliferil-fosfato
en 100 mM de TRIS pH=9,0; 0,5 mM de búfer MgCl_{2}. Después del
desarrollo de la HPPA se lavó una vez la placa de microtitulación
con [25 mM TRIS pH=7,5, 125 mM NaCl, 20 mM MgCl_{2}, 3%
Tween-20], y se adicionaron 150 \mul de solución
substrato a cada uno de los pozos de reacción. Después de 30 minutos
de incubación se midió la señal fluorescente con un fluorómetro de
placa SpectraMax a 355/460 nm. Las muestras fueron consideradas
positivas si su valor era mayor de tres veces el promedio de 3
valores de muestra de control positiva paralela.
Las sondas de tipo específico detectaron los
tipos adecuados solamente. La detección del control interno fue
positivo en cada reacción excepto en aquellas reacciones donde
ocurrió una fuerte competencia entre la amplificación de HPV y el
control interno. No hubo reacciones inhibidas. (ADN de HPV o ADN de
control interno amplificado en todas las muestras). El control
interno excluyó adecuadamente la posibilidad de resultados falsos
negativos.
<110> Jeney, Csaba
\hskip1cmTakács, Tibor
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de amplificación e
hibridación para detectar y tipificar virus papiloma humano
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/HU03/00020
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-03-10
\vskip0.400000\baselineskip
<150> HU P0200981
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-14
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF6)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgta ttcccttatt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21'
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR6)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacaggg tatttaaggt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF11)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgta ttcccttatt tttta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR11)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatatagag tgtttagggt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF42)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacctg taccatattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR42)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtacagag tatttagagt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF44)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtg tttccttgtt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> B
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR44)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatataggg tttttaagat g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF16)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtt taccatattt tttt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR16)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacaggg tatttagaat a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF18)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtg ttccctattt ttttg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR18)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatatagag tatttagggt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF31)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtg tatcatattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR31)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatataggg tatttagggt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF33)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtt ttccatattt tttta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR33)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatataggg tttttagggt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF35)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaagcta tcccatattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR35)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacagag tatttagagt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF39)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgta ttccctattt ttttc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR39)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatataggg tatttcgcgt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF45)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgta ttccctattt ttttg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR45)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtataggg tgtttagagt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF51)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgta taccctattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR51)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacaggg tatttagggt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF52)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtaaacgt tttccatatt ttttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR52)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacaggg tatttagaat t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF56)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgta ttccctattt ttttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR56)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaatatagg gtatttaggg ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF58)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgtaaacgt tttccatatt ttttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR58)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtataggg tctttagggt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF59)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtg ttccctattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR59)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacagag tatttagggt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF66)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgtaaacgt attccctatt ttttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR66)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtatagag tgtttagggt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CF68)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacacc ttccttattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1CR68)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacagag tgtttagggt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1F2)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaagcta taccatattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1F3)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacacg ttccatattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1F4)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtg tttcctattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1R2)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtacagag tttttagaat t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK1)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccaaca tattttatta tgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK2)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaagca tctattatta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK3)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaagca tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK4)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccagta tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK5)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaagca tttactatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK6)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccaact acttttacca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK7)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaccagta ttttctacca cgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK8)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaggca tatattacta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación de gen
específico (PK9)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccaaca tatattatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-6 sonda de
hibridación de tipo específico (P6)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttgttagc ccgttttatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-11 sonda de
hibridación de tipo específico (P11)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaactgttt ttgttaactt ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-42 sonda de
hibridación de tipo específico (P42)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcttattt ggcctttttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-44 sonda de
hibridación de tipo específico (P44)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcttgtttg ctggtcgtat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-16 sonda de
hibridación de tipo específico (P16)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaatatttt gttattgtta ggttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-18 sonda de
hibridación de tipo específico (P18)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatcctgctt attgccacc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-31 sonda de
hibridación de tipo específico (P31)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggattgtcag atttaggtat gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-33 sonda de
hibridación de tipo específico (P33)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttagcgt tagtaggatt ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-35 sonda de
hibridación de tipo específico (P35)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctatttta ttagaatctt gtttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-39 sonda de
hibridación de tipo específico (P39)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaccattc atacccact
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-45 sonda de
hibridación de tipo específico (P45)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctgcacca ttaggtacaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-51 sonda de
hibridación de tipo específico (P51)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgttgaggt tttaggtatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-52 sonda de
hibridación de tipo específico (P52)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaattaccac tactggtgtt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-56 sonda de
hibridación de tipo específico (P56)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtttgtttt ggtattgtcc t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-58 sonda de
hibridación de tipo específico (P58)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttattggga cttttgatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-59 sonda de
hibridación de tipo específico (P59)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtctac cattaccacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-66 sonda de
hibridación de tipo específico (P66)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggtaccag atttggaaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-68 sonda de
hibridación de tipo específico (P68)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagacata ggaaccttaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molécula de oligonucleótido de
control interno
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de hibridación de amplímero
específico de control interno (IC-P1)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacatagat ccccatagac a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1F5)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgta ttccctattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1F6)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtt ttccatattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1R3)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtacagag tttttagagt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1C1)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaaacgtt ttccctattt tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (L1C2)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatacagag tatttagggt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PCR iniciador (new L1C2)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatataggg tatttagggt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tipo 6 de virus papiloma humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de enlazamiento de sonda de
gen específico de amplímero HPV-6
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccaaca tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tipo 6 de virus papiloma humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de enlazamiento de sonda de
tipo específico de amplímero HPV-6
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttattttt ccataaaacg ggctaacaaa actgttgtg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Papiloma virus humano tipo 11
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de enlace de sonda de gen
específico de amplímero HPV-11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccaaca tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Papiloma virus humano tipo 11
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de enlace de sonda de tipo
específico de amplímero HPV-11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatattact ctatcaaaaa agttaacaaa acagttgta
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 42
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-42
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccaact acttttacca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 42
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-42
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttattact ctattacaaa aagccaaata agacatctat cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 44
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-44
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccaaca tatattacca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 44
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-44
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttattttg ccatacgacc agcaaacaag acacttgtg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 16
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaaaca tatattatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 16
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttcctatt aaaaaaccta acaataacaa aatattagtt
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-18
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccacaagca tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-18
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattttagggt tcctgcaggt ggtggcaata agcaggatat t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 31
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-31
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaaccaaca tatattatca cgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 31
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV -31
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 33
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-33
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaagca tttattatta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 33
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-33
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctattaaa aatcctacta acgctaaaaa attattggta
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 35
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-35
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaaaca tctactatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 35
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-35
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgctatt aaaaaacaag attctaataa aatagcagta
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 39
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-39
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaggca tatattatta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 39
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-39
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattttaaagt gggtatgaat ggtggtcgca agcaggacat t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 45
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-45
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaagca tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 45
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-45
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagggttgta cctaatggtg caggtaataa acaggctgtt
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 51
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-51
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaccggca tatattacta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 51
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-51
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattttcca atacctaaaa cctcaacgcg tgctgctatt
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 52
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV-_52 sitio de
enlace de gen específico de amplímero
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaagca tctattatta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 52
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-52
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaaaacacc agtagtggta atggtaaaaa agttttagtt c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 56
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-56
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcactagta tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 56
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-56
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctattactct gtgactaagg acaataccaa aacaaacatt c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 58
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-58
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcacaagca tttattatta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 58
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-58
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccatcaaa agtcccaata acaataaaaa agtattagtt c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 59
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-59
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaccagta ttttctacca cgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 59
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-59
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttaaagta cctaaaggtg gtaatggtag acaggatgtt c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus papiloma humano Tipo 66
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-66
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtaccagta tattttatca tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus papiloma humano Tipo 66
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-66
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttattactct gtttccaaat ctggtaccaa aacaaacatc c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus papiloma humano Tipo 68
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de gen específico de
amplímero HPV-68
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcactggca tgtattacta tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus papiloma humano Tipo 68
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de enlace de tipo específico
de amplímero HPV-68
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttaaggtt cctatgtctg ggggccgcaa gcagggcatt
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 44
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-44
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-35
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 39
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-39
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 45
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-45
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 51
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-51
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 56
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-56
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus papiloma humano tipo 59
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-59
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tipo 6 de virus papiloma humano
6
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-66
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tipo 6 de virus papiloma humano
8
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> amplímero HPV-68
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Mezcla de iniciador de amplificación, donde
dicha mezcla consiste de los iniciadores L1C1, L1C2, nuevoL1C2 que
tienen SEQ. ID. NOS. 73-75, respectivamente,
iniciadores que tienen SEQ. ID. NOS. 37-70, y SEQ ID
NO. 35 y opcionalmente uno o más iniciadores seleccionados del grupo
consistente de SEQ. ID. NOS: 70-72, SEQ. ID. NOS:
1-34 y 36.
2. Uso de la mezcla de iniciadores de la
reivindicación 1 para la amplificación de los genotipos 3, 4; 6, 7,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 16,18, 20, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58,
59, 60, 61, 66, 67, 68, 72, 74 y 77 del virus papiloma humano.
3. Método para detector uno o más genotipos de
HPV en una muestra biológica, que comprende los pasos de:
a) Preparar uno o más amplímeros (amplicons)
usando la mezcla de iniciadores de la reivindicación 1 a partir de
moléculas de ácido nucleico extraídas de la muestra biológica; y
b1) Hibridizar el amplímero obtenido en (a) en
condiciones severas con una sonda de hibridación de genotipo
específico; y opcionalmente
b2) Hibridizar el amplímero obtenido en (a) en
condiciones severas con una sonda de gen específico de HPV.
4. El método tal como se reivindica en la
reivindicación 3 donde dicha sonda de gen específico de HPV es:
i) una sonda consensual o iniciador de HPV que
hibridiza a cualquiera de la SEQ. ID NOS. 76, 78, 80, 82, 84, 86,
88, 90, 92. 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, ó 110;
ii) una sonda complementaria a la sonda en (i);
ó
iii) cualquiera de SEQ. ID NOS.
41-49.
5. El método tal como se reivindica en la
reivindicación 3 donde dicha sonda de hibridación de genotipo
específica es:
i) una sonda de genotipo específico de HPV que
hibridiza a cualquiera de SEQ. ID NOS. 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89,
91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 ó 111;
ii) una sonda complementaria a (i); o
iii) cualquiera de SEQ. ID NOS.
50-67.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, donde se detectan los grupos de genotipo de
HPV de bajo y alto riesgo.
7. El método tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, comprendiendo además un
oligonucleótido sintético en calidad de control interno.
8. El método de la reivindicación 7, en el cual
la secuencia SEQ. ID. NO: 68 se usa en calidad de control interno y
para detector esto se usa SEQ. ID. NO: 69 en calidad de sonda de
hibridación.
9. Un kit para detectar y tipificar HPV, que
incluye
i) la mezcla de iniciadores de la reivindicación
1;
ii) opcionalmente un iniciador de control
interno;
iii) sondas de hibridación que comprenden o
hibridizan hasta cualquiera de SEQ ID NOS. 77, 79, 81, 83, 85, 87,
89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109 or 111 y
opcionalmente cualquiera de SEQ. ID NOS. 76, 78, 80, 82, 84, 86,
88,90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, ó 110; y
iv) opcionalmente sondas de hibridación para
detectar el control interno.
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| CN101487042B (zh) * | 2008-01-18 | 2012-05-30 | 中山大学达安基因股份有限公司 | Hpv高危和低危亚型分型dna微阵列芯片 |
| WO2009104926A1 (ko) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | (주)차바이오메드 | Hpv 지노타이핑용 칩 |
| KR100894682B1 (ko) * | 2008-06-19 | 2009-04-24 | 주식회사 코젠바이오텍 | 인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트 |
| US9090948B2 (en) | 2008-09-30 | 2015-07-28 | Abbott Molecular Inc. | Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples |
| JP2013517803A (ja) * | 2010-01-29 | 2013-05-20 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | サンプル中のｈｐｖの存在を決定および確認する方法 |
| CA2799205A1 (en) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
| CN101942440B (zh) * | 2010-09-28 | 2012-06-20 | 深圳华大基因科技有限公司 | 检测和定型食管hpv病毒的引物和方法 |
| CN101956024B (zh) * | 2010-10-18 | 2012-10-10 | 中国科学院微生物研究所 | 用于检测人乳头瘤病毒的试剂 |
| CN103072832B (zh) | 2011-10-26 | 2016-02-17 | 夏普株式会社 | 供纸装置以及具备该供纸装置的图像形成装置 |
| WO2013131083A1 (en) * | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Winthrop-University Hospital | METHOD FOR USING PROBE BASED PCR DETECTION TO MEASURE THE LEVELS OF CIRCULATING DEMETHYLATED β CELL DERIVED DNA AS A MEASURE OF β CELL LOSS IN DIABETES |
| CN103540683A (zh) * | 2012-07-13 | 2014-01-29 | 钟建 | 用于人乳头瘤病毒18基因检测的生物试剂 |
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| CN104651531B (zh) * | 2015-01-24 | 2017-03-22 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 用于检测青少年复发性呼吸道乳头瘤状病毒的试剂盒 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DE3779175D1 (de) | 1986-03-21 | 1992-06-25 | Pasteur Institut | Bestimmte, von einem papillomavirus-genom abgeleitete dns-sequenzen, deren anwendungen fuer in vitro-diagnostische zwecke und die herstellung von antigenzusammensetzungen. |
| US4889818A (en) * | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| CA1337336C (en) | 1987-05-26 | 1995-10-17 | Attila T. Lorincz | Human papillomavirus nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| US5182377A (en) | 1988-09-09 | 1993-01-26 | Hoffmann-La Roche Inc. | Probes for detection of human papillomavirus |
| US5210015A (en) * | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5840306A (en) * | 1995-03-22 | 1998-11-24 | Merck & Co., Inc. | DNA encoding human papillomavirus type 18 |
| DE69806024T2 (de) * | 1997-09-16 | 2003-02-13 | Delft Diagnostic Laboratory B.V., Delft | Erkennung und identifizierung von menschlichem papillomavirus durch pcr und typ-spezifischer reverser hybridisierung |
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