ES2271946T3 - Cdna para metilenotetrahidrofolato reductasa humana. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA SONDA DE ADNC PARA LA REDUCTASA METILENTETRAHIDROFOLATO HUMANA (MTHFR), Y SUS USOS. LA SONDA DE LA PRESENTE INVENCION PUEDE SER USADA PARA LA IDENTIFICACION DE ANORMALIDADES DE SECUENCIAS EN PACIENTES O DEFICIENCIA MEDIA O SEVERA DE MTHFR, INCLUYENDO PACIENTES CARDIOVASCULARES Y PACIENTES CON SINTOMAS NEUROLOGICOS. UNA PROTEINA MTHFR HUMANA QUE HIBRIDIZA CON LA SONDA DE LA PRESENTE INVENCION PUEDE SER USADA PARA LA TERAPIA DE PACIENTES CON DEFICIENCIA DE MTHFR MEDIANTE APROXIMACIONES BIOQUIMICAS O FARMACOLOGICAS

Description

cDNA para metilenotetrahidrofolato reductasa humana.

Antecedentes de la invención (a) Ámbito de la invención

La invención se refiere a una sonda de cDNA para metilenotetrahidrofolato reductasa humana (MTHFR) y a sus usos.

(b) Descripción del estado de la técnica

Los derivados del ácido fólico son coenzimas para varias y decisivas reacciones de transferencia de un solo carbono entre las que se incluyen reacciones que intervienen en la biosíntesis de purinas, timidilato y metionina. La metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR; EC 1.5.1.20) cataliza la reducción por unión a NADPH (NADPH = Nicotinamida-Adenina Dinucleótido Fosfato) de 5,10-metilenotetrahidrofolato a 5-metiltetrahidrofolato, que es un cosustrato para la metilación de homocisteína a metionina. La enzima de hígado porcino, una flavoproteína, ha sido purificada hasta la homogeneidad, y es un homodímero de subunidades de 77 kDa. La proteólisis parcial del péptido porcino ha revelado dos dominios espacialmente distintos: un dominio N-terminal de 40 kDa y un dominio C-terminal de 37 kDa. Este último dominio contiene el sitio de fijación para el regulador alostérico S-adenosilmetionina.

La deficiencia hereditaria de la MTHFR, que es un trastorno recesivo autosómico, es el error ingénito más común del metabolismo del ácido fólico. Un bloqueo en la producción de metiltetrahidrofolato conduce a elevados niveles de homocisteína con niveles de metionina que van desde los bajos hasta los normales. Los pacientes con severas deficiencias de la MTHFR (con una actividad de un 0-20% en los fibroblastos) pueden tener fenotipos variables. Se ha informado en este grupo sobre retraso del desarrollo, retardo mental, anormalidades motoras y de la marcha, neuropatía periférica, ataques y trastornos psiquiátricos, si bien era asintomático al menos un paciente con severa deficiencia de la MTHFR. Los cambios patológicos en la forma severa incluyen los cambios vasculares que se han encontrado en otros estados con homocisteína elevada, así como reducidos niveles de neurotransmisores y metionina en el sistema nervioso central. Una más leve deficiencia de la MTHFR (con una actividad de un 35-50%) ha sido descrita en pacientes con enfermedad arterial coronaria (véase lo expuesto más adelante). Es probable la heterogeneidad genética, considerando las diversas características clínicas, los niveles variables de actividad enzimática y los diferentes perfiles de termoinactivación de la reductasa en las células de los pacientes.

La enfermedad arterial coronaria (CAD) es responsable de un 25% de las muertes de los canadienses. Los factores de riesgo cardiovascular (sexo masculino, historial familiar, tabaquismo, hipertensión, dislipoproteinemia y diabetes) constituyen aproximadamente de un 60 a un 70% de nuestra capacidad para discriminar a los pacientes de CAD de los sujetos sanos. Se ha demostrado también que la elevada homocisteína en plasma constituye un factor de riesgo independiente para la enfermedad cardiovascular.

La homocisteína es un aminoácido que contiene sulfhidrilo y es formado por la desmetilación de metionina. La homocisteína es normalmente metabolizada para ser así convertida en cisteína (transsulfuración), o bien es remetilada para ser así convertida en metionina. Los errores ingénitos del metabolismo (como en la severa deficiencia de la MTHFR) que ocasionan extremas elevaciones de la homocisteína en plasma, con homocistinuria, van asociados a enfermedad vascular prematura y a extensos fenómenos trombóticos arteriales y venosos. Las más leves elevaciones de la homocisteína en plasma (como en la leve deficiencia de la MTHFR) han sido asociadas al desarrollo de enfermedad vascular periférica, enfermedad cerebrovascular y CAD prematura.

La remetilación de la homocisteína para su conversión en metionina requiere el intermedio de ácido fólico 5-metiltetrahidrofolato, que es producido a partir de folato de 5,10-metilenotetrahidrofolato por medio de la acción de 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR). La deficiencia de la MTHFR redunda en una incapacidad para metabolizar la homocisteína para su conversión en metionina; siendo las consecuencias metabólicas de todo ello una elevada homocisteína en plasma y una reducida metionina. Las severas deficiencias de la MTHFR (menos de un 20% de la actividad de los controles) que han sido descritas anteriormente van asociadas a síntomas neurológicos de inicio temprano (retardo mental, neuropatía periférica, ataques, etc.) y a cambios ateroscleróticos y tromboembolismo. Más leves deficiencias de la MTHFR (un 35-50% de la actividad de los controles), con una forma termolábil de la enzima, se ven en pacientes con enfermedad cardiovascular sin obvias anormalidades neurológicas.

En un estudio efectuado con 212 pacientes con enfermedad arterial coronaria demostrada, la forma termolábil de la MTHFR fue encontrada en un 17% del grupo con CAD y un 5% de los controles. En un subsiguiente informe sobre 339 sujetos que fueron sometidos a angiografía coronaria, se halló una correlación entre la MTHFR termolábil y el grado de estenosis arterial coronaria. De nuevo, tradicionales factores de riesgo (edad, sexo, tabaquismo, hipertensión, etc.) no estaban significativamente asociados a la MTHFR termolábil. Todos los estudios sobre la MTHFR fueron llevados a cabo mediante análisis enzimáticos de la MTHFR en linfocitos, con mediciones de la actividad antes y después del tratamiento térmico para determinar la termolabilidad de la enzima.

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Puesto que el 5-metiltetrahidrofolato, que es el producto de la reacción de la MTHFR, es la forma primaria de folato circulatorio, una deficiencia de la MTHFR podría conducir a otros tipos de trastornos. Por ejemplo, la administración periconcepcional de folato a mujeres reduce la aparición y la recurrencia de defectos del tubo neural en su descendencia. Los defectos del tubo neural constituyen un grupo de malformaciones del desarrollo (meningomielocele, anencefalia, encefalocele) que surgen debido a la incapacidad de cierre del tubo neural. Se han descrito elevados niveles de homocisteína en plasma en madres de niños con defectos del tubo neural. La elevada homocisteína en plasma podría
ser debida a una deficiencia de la MTHFR, como se ha descrito anteriormente para la enfermedad cardiovascular.

Los neuroblastomas son tumores derivados de células de la cresta neural. Se ha descrito que muchos estos tumores presentan deleciones de la región lp36 del cromosoma humano, que es la región del genoma en la cual se ha mapeado la MTHFR. Es posible que las deleciones/mutaciones de la MTHFR sean responsables de la formación de este tipo de tumor o contribuyan a la misma. Las anormalidades de la MTHFR pueden también contribuir a la formación de otros tipos de tumores tales como los tumores colorrectales, puesto que se ha demostrado que los altos niveles de folato dietario están inversamente asociados al riesgo de contraer adenomas colorrectales.

La actividad de MTHFR es necesaria para la metilación de la homocisteína para su conversión en metionina. La metionina es necesaria para la formación de S-adenosilmetionina, que es dador primario de metilo para la metilación del DNA, de las proteínas, de los lípidos, de los neurotransmisores, etc. Las anormalidades en la MTHFR podrían conducir a unos más bajos niveles de metionina de S-adenosilmetionina, así como a elevados niveles de homocisteína. El desbaratamiento de los procesos de metilación podría redundar en una amplia variedad de estados tales como neoplasias, anomalías del desarrollo, trastornos neurológicos, etc.

La publicación Biochemical Medicine and Metabolic Biology 43/3, 1990, páginas 234 a 242, pretende aislar y purificar la proteína MTHFR. Sin embargo, esto ha sido posteriormente desacreditado, y se piensa que de hecho se trata de una ACADSB (acil-CoA deshidrogenasa) de cadena corta o ramificada.

Nat.Gen. 7/2, junio 1994, pp. 195-200, describe MTHFR, pero no MDHFR que tiene una mutación en el bp 167 (bp = par de bases), sino tan sólo en el bp 482 y en el bp 559.

A pesar de que el gen de MTHFR en Escherichia coli (metF) ha sido aislado y secuenciado, los estudios moleculares de la enzima en organismos superiores han venido estando limitados en ausencia de la disponibilidad de un cDNA eucariótico. En esta comunicación informamos sobre el aislamiento de un cDNA humano para MTHFR, que es su asignación cromosómica, y sobre la identificación de mutaciones en pacientes con deficiencia de la MTHFR. Este informe representa la primera descripción molecular de mutaciones en la deficiencia de la MTHFR.

Sería muy deseable contar con una sonda de cDNA para metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Esta sonda podría ser usada para la identificación de anormalidades secuenciales en individuos con severa o leve deficiencia de la MTHFR, incluyendo los pacientes cardiovasculares y los pacientes con síntomas o tumores neurológicos. La sonda sería también usada en terapia genética, aislamiento del gen y estudios de expresión para producir la proteína MTHFR. La sonda también aportaría la secuencia de aminoácidos de la proteína MTHFR humana, lo cual resultaría útil para la terapia de la deficiencia de la MTHFR mediante enfoques bioquímicos o farmacológicos.

Sería muy deseable contar con una descripción molecular de las mutaciones en la deficiencia de la metilenotetrahidrofolato reductasa.

Breve exposición de la invención

Un objetivo de la presente invención es el de aportar una sonda de cDNA para metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana.

Otro objetivo de la presente invención es el de aportar una descripción molecular de las mutaciones en la deficiencia de la metilenotetrahidrofolato reductasa.

Otro objetivo de la presente invención es el de aportar una secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos para metilenotetrahidrofolato reductasa humana.

Otro objetivo de la presente invención es el de aportar una potencial terapia para los individuos con deficiencia de la metilenotetrahidrofolato reductasa.

Otro objetivo de la presente invención es el de aportar un sistema para la síntesis de la proteína MTHFR in vitro.

Un objetivo adicional de la presente invención es el de aportar una tecnología/un protocolo para la identificación de cambios secuenciales en el gen de MPHFR.

Así, en un primer aspecto, la presente invención aporta una sonda de cDNA para una metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana que tiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que codifica una frecuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2, comprendiendo dicha sonda una secuencia que se hibrida en condiciones de rigor con dichas secuencias de MTHFR.

En un segundo aspecto, la invención también aporta un método de diagnosis de una deficiencia de la MTHFR en un paciente, comprendiendo dicho método los pasos de:

a) amplificar una muestra de DNA de un paciente o someter a transcripción inversa a una muestra de DNA de un paciente para así convertirla en DNA y amplificar dicho DNA; y

b) analizar el DNA amplificado del paso a) para determinar si el mismo contiene al menos una anormalidad de secuencia con respecto a la metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana que tiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 o una secuencia que codifique la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2, siendo dichas anormalidades indicativas de deficiencia genómica de la MTHFR.

La invención también aporta el uso de un vector recombinante que comprende la ID SEC Nº: 1 para la fabricación de un medicamento para la expresión de la proteína MTHFR (ID SEC Nº: 2) bajo el control de un promotor adecuado.

En un aspecto adicional, la invención aporta una proteína MTHFR humana que es codificada por la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2.

La invención aporta adicionalmente un ácido nucleico de metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana que tiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 y codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2.

La invención también aporta el uso de la proteína de la reivindicación 6 o del ácido nucleico de la reivindicación 7 para la fabricación de un medicamento para tratar pacientes con deficiencia de la MTHFR.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A a 1B ilustran la primera secuencia codificante de cDNA para metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR);

la Fig. 2 es la alineación de aminoácidos para metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana, de los genes metF de E. coli (ECOMETF) y S. typhimurium (STYMETF) y de un marco de lectura abierto no identificado en Saccharomyces cerevisiae que es transcrito divergentemente desde un gen de reparación por escisión (ysRAD1);

Las Figs. 3A y 3B ilustran los análisis con enzimas de secuenciación y de restricción para la sustitución de Arg por Ter;

las Figs. 4A y 4B ilustran los análisis con enzimas de secuenciación y de restricción para la sustitución de Arg por Gln;

las Figs. 5A y 5B ilustran los análisis con enzimas de cambio secuencial y de restricción para la sustitución de alanina por valina;

la Fig. 6 ilustra la secuencia disponible total del cDNA para MTHFR humana;

las Figs. 7A y 7B ilustran el análisis de la expresión del cDNA para MTHFR en E. coli, siendo respectivamente (7A) el análisis Western blot de tejidos y extractos bacterianos, y (7B) el análisis de la termolabilidad de extractos bacterianos;

las Figs. 8A a 8D ilustran la identificación de una mutación de sitio de corte y empalme 5' que conduce a una deleción en marco de 57 bp del cDNA;

las Figs. 9A a 9D ilustran el análisis diagnóstico con endonucleasa de restricción de 4 mutaciones;

las Figs. 10A a 10D ilustran los análisis de hibridación con oligonucleótidos aleloespecíficos de 2 mutaciones; y

la Fig. 11 ilustra la región de homología entre la metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana y la dihidrofolato reductasa (DHFR) humana.

Descripción detallada de la invención Secuenciación de péptidos de MTHFR porcina

MTHFR porcina nativa homogénea fue sometida a digestión con tripsina para generar un fragmento N-terminal de 40 kDa y un fragmento C-terminal de 31 kDa; siendo el fragmento de 31 kDa un producto proteolítico del fragmento de 37 kDa. Los fragmentos fueron separados mediante SDS-PAGE (SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico) y electroeluidos, y los fragmentos desnaturalizados fueron sometidos a digestión con lisil endopeptidasa (LysC). Los péptidos resultantes fueron separados mediante HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) de fase inversa y fueron sometidos a análisis secuencial mediante degradación de Edman (los detalles están contenidos en Goyette P et al., Nature Genetics, 1994, 7:195-200).

Aislamiento y secuenciación de cDNAs

Fueron sintetizados dos oligonucleótidos degenerados sobre la base de la secuencia de un péptido de MTHFR porcina de 30 aminoácidos (el primer péptido subrayado en la Fig. 2). Estos fueron usados para generar un producto de PCR (PCR = reacción en cadena de la polimerasa) de 90 bp que codifica el péptido predicho, mediante reacciones de transcripción inversa-PCR de 500 ng de RNA poliA+ de hígado de cerdo. Entonces fue sintetizado a partir de esta corta secuencia de cDNA un cebador de la PCR porcino-específico (no degenerado, antisentido). Usando este cebador y un cebador para brazos de fago, fue sometida a selección por PCR una biblioteca de cDNA \lambdagt10 de hígado humano (Clontech); suponiendo esta técnica la generación de cantidades de lisado de fago (50.000 pfu) (pfu = unidades formadoras de placas) que fueron hervidas por espacio de 5 minutos y fueron luego usadas directamente en reacciones PCR con estos dos cebadores. Los fragmentos de PCR fueron entonces secuenciados directamente (conjunto de materiales y utensilios Cycle Sequencing^{MF}, GIBCO) (MF = Marca de Fábrica), y fue identificado un clon positivo por comparación de la secuencia de aminoácidos deducida con la secuencia del péptido porcino (salvando las variaciones interespecies). El material positivo fue entonces cultivado de nuevo en placas de cultivo a más baja densidad y sometido a selección con el producto de PCR positivo radiomarcado mediante hibridación en placas hasta que fue identificada una placa perfectamente aislada. El DNA fago fue purificado y el inserto fue entonces subclonado en pBS+ (Bluescript) y secuenciado en ambas hebras (conjunto de materiales y utensilios Cycle Sequencing^{MF}, GIBCO y Sequenase^{MF}, Pharmacia). La secuencia de aminoácidos deducida del cDNA humano fue alineada con las secuencias de péptidos porcinos, los genes netF de E. coli (ecometf, número de accesión VO1502) y S. typhimurium (stymetf, número de accesión XO7689) y con un marco de lectura abierto previamente no identificado en Saccharomyces cerevisiae que es transcrito divergentemente con respecto al gen de reparación por escisión, ysRAD1 (número de accesión KO2070). Las alineaciones iniciales fueron llevadas a cabo usando BestFit^{MF} en el paquete informático GCG, y estas alineaciones fueron ajustadas manualmente para maximizar las
homologías.

En resumen, fueron diseñados cebadores oligonucleotídicos degenerados para amplificar una secuencia que corresponde a un segmento de 30 aminoácidos de un péptido porcino de la región N-terminal de la enzima (el primer péptido porcino en la Fig. 2). Fue obtenido un fragmento de cDNA porcino de 90 bp mediante transcripción inversa/PCR de RNA de hígado de cerdo. La secuenciación del fragmento de PCR confirmó su identidad por comparación de la secuencia de aminoácidos deducida con la secuencia de péptidos porcinos. Un cebador oligonucleotídico no degenerado, basado en la secuencia interna del cDNA porcino, fue usado en conjunción con cebadores para los brazos del fago para someter a selección a una biblioteca de cDNA \lambdagt10 de hígado humano por PCR. El inserto del clon positivo fue aislado y secuenciado. La secuencia constaba de 1266 bp con un marco de lectura abierto continuo.

Homología con la MTHFR de otras especies

La secuencia de aminoácidos deducida del cDNA humano fue alineada con los genes metF de E. coli y S. typhimurium, así como con un ORF (ORF = marco de lectura abierto) previamente no identificado en Saccharomyces cerevisiae que es transcrito divergentemente con respecto al gen de reparación por escisión, ysRAD1 (Fig. 2). Las secuencias que son homólogas a 5 péptidos porcinos están subrayadas en la Fig. 2. Tres segmentos (los residuos 61-94, 219-240 y 337-351) corresponden a la secuencia de péptidos internos del dominio N-terminal de 40 kDa de la enzima de hígado porcino. Los residuos 374-393 corresponden a la parte del lado de cabeza del péptido LysC del dominio C-terminal de la enzima de hígado porcino que es marcada cuando la enzima es irradiada con luz ultravioleta en presencia de (^{3}H-metil)AdoMet; y como se predice mediante los estudios de marcación AdoMet, este péptido está situado en un extremo (N-terminal) del dominio de 37 kDa. Fue también identificada una quinta región de homología (residuos 359-372), pero la localización del péptido porcino dentro de la proteína nativa no había sido determinada anteriormente.

La metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) es una enzima que interviene en el metabolismo de los aminoácidos, que es decisivo para mantener unas adecuadas reservas de metionina, así como para asegurar que la concentración de homocisteína no alcance niveles tóxicos. El alto grado de conservación de la secuencia, desde la E. coli hasta el Homo sapiens, atestigua la importancia de la MTHFR en estas especies. La enzima en E. coli (codificada por el locus metF) es un péptido de 33 kDa que fija el FAD reducido (FAD = dinucleótido de flavina y adenina) y cataliza la reducción de metilenotetrahidrofolato para su conversión en metiltetrahidrofolato. La enzima metF se diferencia de la enzima de mamífero en que no puede ser reducida por NADPH o NADH, y su actividad no es regulada alostéricamente por la S-adenosilmetionina. La enzima porcina nativa es susceptible de experimentar corte tríptico entre el dominio N-terminal de 40 kDa y el dominio C-terminal de 37 kDa, y este corte redunda en la pérdida de regulación alostérica por la adenosilmetionina, pero no redunda en pérdida de actividad catalítica. Puesto que la homología entre las enzimas bacteriana y de mamífero está dentro del dominio N-terminal, esta región debe contener el sitio de fijación de flavina y los residuos que son necesarios para fijar el sustrato de folato y catalizar su reducción. La estructura del dominio de la enzima humana no ha sido dilucidada, si bien se ha informado de que la enzima humana tiene una masa molecular de 150 kDa y es probable que sea un homodímero de 77 kDa.

Nosotros predecimos que el punto de corte entre los dos dominios está situado entre los residuos 351 y 374 de la secuencia humana, sobre la base de la localización de los péptidos obtenidos de los dominios aislados de la enzima porcina. Se prevé que esta región, que contiene la altamente cargada secuencia KRREED, tendrá la más alta hidrofilicidad y probabilidad superficial de entre todas las regiones de la secuencia humana deducida.

Ha sido secuenciado el extremo N-terminal de la proteína porcina, y la región que codifica esta parte de la proteína falta en el cDNA humano. Estimamos que a este cDNA le faltan solamente unos pocos residuos en el extremo N-terminal, puesto que la masa molecular predicha de la secuencia deducida en el lado de cabeza con respecto al putativo sitio de corte (KRREED) es de 40 kDa, y la masa molecular medida del dominio N-terminal porcino es también de 40 kDa. Cuando son alineadas las secuencias bacteriana, de levadura y humana, la secuencia humana deducida contiene una extensión N-terminal de 40 aminoácidos; y sospechamos que esta extensión contiene determinantes para la fijación de NADPH. Muchas oxidorreductasas dependientes de nucleótidos piridínicos contienen tales determinantes en el extremo N-terminal de la proteína.

El extremo C-terminal de la secuencia humana contiene un péptido que es marcado cuando la proteína es irradiada con luz ultravioleta en presencia de AdoMet tritiado. La secuencia de cDNA sobre la que aquí informamos contiene tan sólo aproximadamente 7 kDa de la masa predicha de 37 kDa de este dominio, lo que indica que este cDNA está asimismo truncado en el extremo terminal 3'. Tampoco han sido detectados los de una serie de péptidos del dominio porcino C-terminal. Como podría ser de esperar, dado que las enzimas procarióticas no parecen ser reguladas alostéricamente por AdoMet, no hay homologías significativas entre la región C-terminal de este cDNA y las secuencias metF procarióticas. La alineación que se muestra en la Fig. 2 pone de manifiesto que las secuencias homólogas terminan justo antes del putativo sitio de corte de la enzima humana.

Asignación cromosómica

Para la localización del gen humano fue usada hibridación in situ con cromosomas humanos metafásicos. El análisis de la distribución de 200 granos de plata relevó una significante agrupación de granos, y concretamente de 40 granos, en la región p36.3-36.2 del cromosoma 1 (p < 0,0001), siendo la mayoría de granos, y concretamente 25 granos, observados dentro de lp36.3.

El aislamiento del cDNA humano nos ha permitido situar el gen en el cromosoma lp36.3. La observación de una fuerte señal en ese cromosoma con poco fondo sugiere en gran medida un único locus sin pseudogenes. El análisis Southern blot de DNA humano reveló fragmentos de aproximadamente 10 kb, prediciendo un gen de tamaño medio, puesto que este cDNA codifica aproximadamente la mitad de la secuencia codificante.

Adicionales secuencias de cDNA y constructos para el análisis de la expresión

Una biblioteca de cDNA de carcinoma de colon humano (obsequio de la Dra. Nicole Beauchemin, de la McGill University) fue sometida a selección mediante hibridación en placas con el cDNA de 1,3 kb original para obtener adicionales secuencias codificantes. Fue aislado un cDNA de 2,2 kb que contenía 1,3 kb de secuencia solapada con el cDNA original y 900 bp adicionales en el extremo 3' (Fig. 6). La secuencia de aminoácidos es idéntica a la del cDNA original para el segmento solapado (codones 1-415) exceptuando el codón 177 (ASP), que era un codón GLY en el cDNA original. El análisis de 50 cromosomas de control reveló un codón ASP en esta posición. El cDNA tiene un marco de lectura abierto de 1980 bp, a 100 bp de la región UTR 3' y una cola poli A.

Se llevó a cabo secuenciación en ambas hebras para todo el cDNA. Adicionales secuencias del lado 5' (de 800 bp) fueron obtenidas de una biblioteca de cDNA de riñón humano (Clontech), pero estas secuencias no contenían adicionales secuencias codificantes y fueron por consiguiente usadas solamente para la mutagénesis por PCR (como se describe más adelante) y no para el análisis de la expresión. Los dos cDNAs (de 2,2 kb y 800 bp) fueron ligados usando el sitio EcoRI en el bp 199, y fueron insertados en el vector Bluescript^{MF} (Stratagene). El cDNA de 2,2 kb fue subclonado en el vector de expresión pTrc99A (Pharmacia) usando el sitio NcoI en el bp 11 y el sitio XbaI en la región poliligadora de los vectores tanto Bluescript^{MF} como pTrc99A. La secuenciación fue llevada a cabo de una a otra parte de los sitios de clonación para verificar el constructo de tipo salvaje.

Utilidad de la invención en la identificación de mutaciones I. Identificación de dos primeras mutaciones en la deficiencia severa de la MTHFR

RNA total de fibroblastos de la piel de pacientes con deficiencia de la MTHFR fue sometido a transcripción inversa y amplificado mediante PCR para sus análisis por el método del polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP) (Orita, M. et al., Genomics, 1989, 5:8874-8879). Fueron diseñados cebadores para generar fragmentos de 250-300 bp y cubrir las secuencias de cDNA disponibles con pequeñas regiones de solapamiento para cada fragmento en ambos extremos. La primera mutación identificada mediante SSCP era una sustitución de C por T en el bp 559 en el paciente 1554; convirtiendo esta sustitución un codón de arginina en un codón de terminación (Fig. 3A). Puesto que la mutación abolió un sitio FokI, fue usada digestión de restricción para la confirmación del cambio y para someter a selección a adicionales pacientes con respecto a esta mutación; habiendo sido identificado de esta manera un segundo paciente (1627) (Fig. 3B). La configuración por SSCP para el paciente 1554 y la configuración por digestión de restricción para ambos pacientes era coherente con un estado mutante homocigótico o con un combinado genético que constaba de la mutación sin sentido con una segunda mutación que no producía RNA detectable alguno (alelo nulo). Para la confirmación son necesarios estudios con los progenitores.

La segunda sustitución (Fig. 4A) era una transición de G a A en el bp 482 en el paciente 1834 que convirtió un residuo de arginina en un residuo de glutamina. La sustitución creó un sitio PstI que fue usado para verificar la sustitución y para identificar a un segundo paciente (1863) con este cambio (Fig. 4B). El análisis del SSCP y la configuración por digestión de restricción eran coherentes con un estado heterocigótico para ambos pacientes. El codón de arginina que se ve afectado por este cambio es un residuo conservado evolutivamente, como se muestra en la Fig. 2. Esta observación, en conjunción con el hecho de que el cambio de codón no es conservativo, constituye un fuerte argumento en el sentido de indicar que la sustitución es un cambio patológico en lugar de un polimorfismo benigno. Además, fueron analizados 35 controles (de orígenes étnicos similares a los de los probandos) para detectar esta sustitución mediante análisis Southern blot de DNA digerido con PstI; y resultaron todos ellos
negativos.

Fue estudiada la familia del paciente 1834. Se comprobó que tanto el hermano sintomático como la madre del probando llevaban esta sustitución, mientras que el padre fue negativo con respecto al cambio (Fig. 4B). En la familia del 1863, se comprobó que la madre del probando era portadora, mientras que el padre y un hermano no afectado eran negativos.

Líneas celulares

La línea celular 1554 es de un varón del pueblo Hopi que ingresó a los tres meses de edad con homocistinuria, ataques, deshidratación, enturbiamiento corneal, hipotonía y sepsis por Candida. La distribución de folato en los fibroblastos cultivados puso de manifiesto una relación de Pediococcus cerivisiae/Lactobacillus casei (PC/LC) de 0,52 (Control 0,14). No había actividad de metilenotetrahidrofolato reductasa (MYHFR) mensurable (valores de control = 9,7 y 15,1 nmoles/h/mg de proteína; actividad residual tras tratamiento de los extractos de control a 55ºC por espacio de 20 min. = 28% y 31%).

La línea celular 1627 es de un varón de la tribu Choctaw que presentaba malnutrición, apnea, incapacidad para desarrollarse, deshidratación y homocistinuria a las cinco semanas de edad. Posteriormente se comprobó que este individuo tenía trombosis del seno sagital superior e hidrocefalia. La relación PC/LC era de 0,61 y la actividad específica de MTHFR era de 0,1 nmoles/h/mg de proteína. Hay consanguinidad por cuanto que se piensa que las abuelas materna y paterna son "parientes lejanos".

La línea celular 1779 es de un varón francocanadiense con homocistinuria que primeramente tenía debilidad de los miembros, incoordinación, parestesias y lapsos de memoria a la edad de 15 años, y quedó confinado a la silla de ruedas poco después de cumplir los veinte. Su hermano (línea celular 1834) también tiene homocistinuria, pero tiene 37 años de edad y es asintomático. La actividad específica de MTHFR era de 0,7 y 0,9 nmoles/h/mg de proteína para las líneas celulares 1779 y 1834, respectivamente; y la actividad residual tras tratamiento térmico a 55ºC era de un 0,9% y de un 0% para las líneas celulares 1779 y 1834, respectivamente.

La línea celular 1863 es de un varón blanco que fue diagnosticado a los 21 años de edad debido a un progresivo deterioro de la marcha, espasticidad, degeneración de la materia blanca cerebral y homocistinuria. Este sujeto tenía un hermano que murió a los 21 años de edad de enfermedad neurodegenerativa. La actividad específica de MTHFR en extractos de fibroblastos era de 1,76 nmoles/h/mg de proteína, y la actividad enzimática residual tras tratamiento a 55ºC era de un 3,6%.

Análisis de mutación

Fueron diseñados cebadores a partir de la secuencia de cDNA para generar fragmentos de 250-300 bp que estaban solapados en 50-75 bp en cada extremo. La parejas de cebadores fueron usadas en transcripción inversa-PCR de 5 \mug de RNA fibroblástico total del paciente. Los productos de PCR fueron analizados mediante un protocolo de SSCP rápido no isotópico (PhartSystem^{MF}, Pharmacia) que usa tinción directa con plata para la detección de hebras únicas. Todos los productos de PCR de los pacientes que presentaban un desplazamiento sobre geles de SSCP fueron purificados mediante NuSieve (FMC Bioproducts) y secuenciados directamente (conjunto de materiales y utensilios Cycle Sequencing^{MF}, GIBCO) para identificar el cambio. Si el cambio afectaba a un sitio de restricción, un producto de PCR era entonces sometido a digestión con la apropiada endonucleasa de restricción y analizado sobre geles de poliacrilamida. Para efectuar la selección para detectar la mutación de Arg a Gln en los controles, 5 \mug de DNA digerido con PstI fueron pasados por geles de agarosa al 0,8% y analizados mediante análisis Southern blot usando el cDNA radiomarcado mediante técnicas estándar.

II. Siete mutaciones adicionales en el locus de la metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) con correlaciones de genotipo:fenotipo en la deficiencia severa de la MTHFR

Se informa a continuación sobre la caracterización de 7 adicionales mutaciones en este locus: 6 mutaciones de sentido equivocado y un defecto de sitio de corte y empalme en el lado 5' que activa un sitio de corte y empalme críptico en la secuencia codificante. También presentamos un análisis preliminar de la relación entre genotipo y fenotipo para todas las 9 mutaciones hasta aquí identificadas en este locus. Una mutación sin sentido y 2 mutaciones de sentido equivocado (de prolina a leucina y de treonina a metionina) en el estado homocigótico van asociadas a una extremadamente baja actividad (0-3%) y al inicio de síntomas dentro del primer año. Otras mutaciones de sentido equivocado (de arginina a cisteína y de arginina a glutamina) van asociadas a una más alta actividad enzimática y a un más tardío inicio de los síntomas.

Se describen 7 mutaciones adicionales en el locus de MTHFR y se examina la asociación entre genotipo, actividad enzimática y fenotipo clínico en la severa deficiencia de la MTHFR.

Descripción de los pacientes

Se han descrito en la literatura publicada los hallazgos clínicos y de laboratorio relativos a los pacientes. La actividad residual de MTHFR fue medida previamente en fibroblastos cultivados en confluencia.

A la paciente 354, que era una muchacha afroamericana, le fue diagnosticado a los 13 años de edad leve retardo mental. A su hermana, la paciente 355, le fueron diagnosticados a los 15 años de edad anorexia, temblor, alucinaciones y abandono progresivo. En la paciente 354, la actividad residual de MTHFR era de un 19%, y en su hermana, la paciente 355, dicha actividad residual era de un 14% de los valores de control. La actividad residual tras calentamiento presentaba una termoestabilidad equivalente a la de la enzima de control.

La paciente 1807, que es una muchacha japonesa cuyos progenitores son primos hermanos, presentaba retraso en andar y en el habla hasta los 2 años de edad, ataques a los 6 años de edad y un trastorno de la marcha con neuropatía periférica a los 16 años de edad. La actividad residual de MTHFR era de un 3%, y la enzima era termolábil.

A la paciente 735, que era una muchacha afroindia, le fueron diagnosticados a los 7 meses de edad microcefalia, deterioro progresivo del desarrollo mental, apnea y coma. La actividad residual de MTHFR era de un 2% de los niveles de control. No fueron determinadas las propiedades térmicas.

Al paciente 1084, que era un varón caucásico, le fue diagnosticado a los 3 meses de edad un fibrosarcoma infantil. Este sujeto resultó ser hipotónico y devino apneico. El sujeto murió a los 4 meses de edad. No era detectable una actividad residual de MTHFR. No fueron determinadas las propiedades térmicas.

El paciente 356, que es el primer paciente con deficiencia declarada de la MTHFR, es un varón italoamericano que se presentó a los 16 años de edad con debilidad muscular, marcha anormal y movimientos espasmódicos de las extremidades superiores. La actividad residual de MTHFR era de un 20% de los valores de control; quedando la actividad rápida y exponencialmente inactivada a 55º.

Al paciente 458, que era un varón caucásico, le fueron diagnosticados a los 12 años de edad ataxia y rendimiento escolar marginal. La actividad residual de MTHFR era de aproximadamente un 10%, y la actividad era termolábil.

De la paciente 1396, que era una hembra caucásica, se decía que era torpe y presentaba un trastorno global del aprendizaje en la infancia. A la edad de 14 años, la paciente desarrolló ataxia, pie caído e incapacidad de andar. La paciente desarrolló trombosis de las venas profundas y émbolos pulmonares bilaterales. La actividad residual de MTHFR era de un 14%, y la enzima era termolábil.

Estructura genómica y cebadores intrónicos

La nomenclatura de los exones está basada en la secuencia de cDNA disponible en Goyette et al. (Nature Genetics, 1994, 7:195-200). El exón 1 ha sido designado arbitrariamente como la región de cDNA que va desde el bp 1 hasta el primer intrón. La identificación de los intrones fue llevada a cabo mediante amplificación de DNA genómico usando secuencias cebadoras de cDNA. Los productos de PCR que eran de tamaño mayor que los tamaños de cDNA previstos fueron secuenciados directamente.

Detección de las mutaciones

Los exones específicos (véase la Tabla 1 con respecto a las secuencias de los cebadores) fueron amplificados mediante PCR a partir de DNA genómico y analizados mediante el protocolo del SSCP. El análisis del SSCP fue llevado a cabo con el sistema Phastgel^{MF} (Pharmacia), un protocolo de SSCP rápido no isotópico como el anteriormente descrito (Goyette P et al., Nature Genetics, 1994, 7:195-200), o con productos de PCR marcados con ^{35}S pasados por acrilamida al 6%: geles de glicerol al 10% a temperatura ambiente (6 vatios, durante la noche). En algunos casos, el uso de endonucleasas de restricción para dividir el producto de PCR antes del análisis del SSCP facilitaba la detección de desplazamientos de banda. Los fragmentos de PCR con movilidad alterada fueron secuenciados directamente (conjunto de materiales y utensilios Cycle Sequencing^{MF}, GIBCO). Si el cambio de secuencia afectaba a un sitio para endonucleasa de restricción, el producto de PCR era entonces sometido a digestión con la enzima apropiada y analizado mediante PAGE (PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida). De otro modo, se llevaba a cabo hibridación con oligonucleótidos aleloespecíficos (ASO) sobre una transferencia de puntos del exón amplificado por PCR.

TABLA 1 Cebadores de la PCR para amplificación de DNA y análisis de mutación de MTHFR

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TABLA 2 Resumen de genotipos, actividad enzimática, edad al inicio y origen de los pacientes con deficiencia de la MTHFR

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(1) Mutación del sitio de corte y empalme 5'

La amplificación de cDNA, bp 653-939, a partir de RNA fibroblástico total transcrito inversamente, reveló 2 bandas en las hermanas 354 y 355: un fragmento de PCR más pequeño (de 230 bp) además del alelo de 287 bp normal (Fig. 8A). La Fig. 8A es el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida de productos de amplificación de cDNA, bp 653-939, a partir de RNA transcrito inversamente. Los controles tienen el fragmento de 287 bp esperado, mientras que las pacientes 354 y 355 tienen un fragmento de 230 bp adicional. La secuenciación del fragmento menor identificó una deleción en marco de 57 bp que retiraría 19 aminoácidos (Fig. 8B). La Fig. 8B es la secuenciación directa de los productos de PCR de la paciente 354. La deleción de 57 bp abarca las bp 736-792 del cDNA. Se ve en el punto de arranque de la deleción en el lado 5' un sitio de corte y empalme 5' casi perfecto (en caja). El análisis de la secuencia junto al punto de arranque de la deleción en el lado 5' en el fragmento no suprimido reveló una casi perfecta secuencia de consenso del sitio de corte y empalme 5' (AG/gcatgc). Esta observación sugería la presencia de una mutación de corte y empalme en el sitio de corte y empalme 5' natural que podría activar este sitio críptico, para generar el alelo suprimido. La secuencia a continuación del punto de arranque de la deleción, en el alelo mutante, correspondía exactamente a la secuencia del siguiente exón. La amplificación de DNA genómico, usando los mismos cebadores de amplificación que fueron usados para RNA transcrito inversamente, generó un producto de PCR de 1,2 kb que indicaba la presencia de un intrón. La secuenciación directa de este fragmento de PCR en la paciente 354 identificó una sustitución G \rightarrow A heterocigótica en el dinucleótido GT conservado del intrón en el sitio de corte y empalme 5' (Fig. 8C). La Fig. 8C es la secuenciación del sitio de corte y empalme 5' en un control y en la paciente 354. La paciente porta una sustitución G \rightarrow A heterocigótica en el sitio de corte y empalme 5' (en caja). Las secuencias intrónicas están en minúsculas. Esta sustitución abolió un sitio para la endonucleasa de restricción HphI, lo cual fue usado para confirmar la mutación en las 2 hermanas (Fig. 8D). La Fig. 8D es el análisis efectuado con endonucleasa de restricción HphI sobre productos de PCR de DNA para el exón 4 de las pacientes 354 y 355 y de 3 controles (C). El producto de PCR de 198 bp tiene 2 sitios HphI. Los productos de digestión para el alelo de control son de 151, 24 y 23 bp. Los productos de digestión para el alelo mutante son de 175 y 23 bp debido a la pérdida de un sitio HphI. Los fragmentos de 24 y 23 bp se han salido del gel.

(2) Pacientes con sustituciones codificantes homocigóticas

El análisis del SSCP del exón 4 para la paciente 1807 reveló un fragmento que migraba anormalmente, el cual fue secuenciado directamente para revelar una sustitución C \rightarrow T homocigótica (bp 764) que convertía un residuo de prolina en un residuo de leucina. Este cambio crea un sitio para la endonucleasa de restricción MnlI que fue usado para confirmar el estado homocigótico de la mutación (Fig. 9A). La Fig. 9A es el análisis de restricción con MnlI de productos de PCR del exón 4 para la paciente 1807 y 3 controles (C). Fragmentos esperados: alelo de control, 90, 46, 44, 18 bp; alelo mutante, 73, 46, 44, 18, 17 bp. Una banda adicional en el fondo del gel es el cebador. Cincuenta cromosomas caucásicos de control independientes y 12 cromosomas japoneses de control fueron verificados mediante análisis de restricción, y fueron todos ellos negativos para esta mutación. La homocigosidad en este paciente es probablemente debida a la consanguinidad de los progenitores.

Las pacientes 735 y 1084 tenían la misma mutación en el exón 4, en un estado homocigótico: una sustitución
C \rightarrow T (bp 692) que convertía un residuo de treonina conservado evolutivamente en un residuo de metionina, y abolía un sitio para la endonucleasa de restricción NlaIII. Fue usada hibridación con oligonucleótidos aleloespecíficos con el exón 4 amplificado (Figs. 10A y 10B) para confirmar la mutación en estas 2 pacientes y para someter a selección a 60 cromosomas independientes que resultaron ser todos ellos negativos. La Fig. 10A es la hibridación del oligonucleótido mutante (692T) con los productos de PCR del exón 4 de las pacientes 735, 1084 y 30 controles. Solamente se hibridó con esta sonda el DNA de las pacientes 735 y 1084. La Fig. 10B es la hibridación del oligonucleótido normal (692C) con la transferencia de puntos separada de A. Todos los DNAs de control se hibridaron con esta sonda.

El paciente 356 presentó un desplazamiento en el análisis del SSCP del exón 5. La secuenciación directa reveló una sustitución C \rightarrow T homocigótica (bp 985) que convertía un residuo de arginina conservado evolutivamente en cisteína, y la sustitución abolió un sitio para la endonucleasa de restricción AciI. Esto fue usado para confirmar el estado homocigótico de la mutación en el paciente 356 (Fig. 9B) y su presencia en el estado heterocigótico en ambos progenitores. Cincuenta cromosomas de control independientes, analizados de la misma manera, dieron negativo para esta mutación. La Fig. 9B es el análisis de restricción con AciI de productos de PCR del exón 5 para el paciente 356, su padre (F), su madre (M) y 3 controles (C). Fragmentos esperados: alelo de control, 129, 105, 90, 68 bp; alelo mutante, 195, 129, 68 bp.

(3) Pacientes que son combinados genéticos

El paciente 458 es un heterocigoto combinado de una mutación en el exón 5 y una mutación en el exón 1. La sustitución en el exón 5 (C \rightarrow T en el bp 1015) redundó en la sustitución de un residuo de cisteína por un residuo de arginina, y esto abolió un sitio para la endonucleasa de restricción HhaI, lo cual fue usado para confirmar la mutación en el paciente 458 (Fig. 9C) y para demostrar que los 50 cromosomas de control eran negativos. La Fig. 9C es el análisis de restricción con HhaI de productos de PCR del exón 5 para el paciente 458 y 4 controles (C). Fragmentos esperados: alelo de control, 317 y 75 bp; alelo mutante 392 bp. El fragmento de 75 bp no aparece en la Fig. 9C. La segunda mutación era una sustitución G \rightarrow A heterocigótica (bp 167) que convertía un residuo de arginina en un residuo de glutamina. La hibridación con oligonucleótidos aleloespecíficos con el exón 1 amplificado confirmó el estado heterocigótico de esta mutación en el paciente 458 e identificó a un segundo paciente (1396) que portaba esta mutación también en estado heterocigótico (Figs. 10C y 10D). La Fig. 10C es la hibridación del oligonucleótido mutante (167A) con productos de PCR del exón 1 de los pacientes 458, 1396 y 31 controles. La Fig. 10D es la hibridación del oligonucleótido normal (167G) con la transferencia de puntos separada de C. Ninguno de los 62 cromosomas de control llevaba esta mutación.

La segunda mutación en la paciente 1396 fue identificada en el exón 6: una sustitución C \rightarrow T heterocigótica (bp 1081) que convertía un residuo de arginina en un residuo de cisteína y abolía un sitio para la endonucleasa de restricción HhaI. El análisis de restricción confirmó la sustitución heterocigótica en la paciente 1396 (Fig. 9D) y puso de manifiesto que los 50 cromosomas de control eran negativos. La Fig. 9D es el análisis de restricción con HhaI de productos de PCR del exón 6 para la paciente 1396 y 2 controles (C). Fragmentos esperados: alelo de control, 152, 86, 13 bp; alelo mutante 165, 86 bp. El fragmento de 13 bp se ha salido del gel.

(4) Adicionales cambios de secuencia

El análisis del exón 6 con HhaI, que ha sido mencionado anteriormente, reveló un polimorfismo del DNA. Este cambio es una sustitución T \rightarrow C en el bp 1068 que no altera al aminoácido (serina), pero crea un sitio de reconocimiento para HhaI. En un 9% de los cromosomas analizados se encontró T en el bp 1068. El análisis de la secuencia identificó 2 discrepancias con la secuencia de cDNA publicada: una sustitución G \rightarrow A en el bp 542 que convierte la glicina en un codón de aspartato, y un cambio C \rightarrow T en el bp 1032 que no altera al aminoácido (treonina). Puesto que todos los DNAs analizados (> 50 cromosomas) llevaban la A en el bp 542 y la T en el bp 1032, es probable que la secuencia del cDNA original contuviese algunos artefactos de clonación.

Correlación genotipo:fenotipo

La Tabla 2 resume el estado actual de las mutaciones en la severa deficiencia de la MTHFR. En 8 pacientes han sido identificadas ambas mutaciones, y en 5 pacientes (3 familias) ha sido identificada solamente 1 mutación. En conjunto, la correlación entre el genotipo, la actividad enzimática y el fenotipo es del todo coherente. Cinco pacientes con inicio de síntomas dentro de su primer año de vida tenían \leq 3% de la actividad de los controles. Tres de estos pacientes tenían mutaciones de sentido equivocado en el estado homocigótico: dos pacientes con la sustitución de treonina por metionina (C692T) y un paciente con la sustitución de prolina por leucina (C764T). La mutación sin sentido (C559T) en el estado homocigótico en los pacientes 1554 y 1627 (anteriormente descritos en Goyette P et al., Nature Genetics, 1994, 7:195-200) va también asociada a una severa forma neonatal, como era de esperar.

Los otros pacientes en la Tabla 2 tenían \geq 6% de la actividad de los controles e inicio de síntomas dentro o después de la 2ª década de vida; siendo la única excepción el paciente 1834, como se ha descrito anteriormente (Goyette P et al., Nature Genetics, 1994, 7:195-200). Los tres pacientes (356, 458 y 1396) con mutaciones de sentido equivocado (G167A, C985T, C1015T y C1081T) son similares a los anteriormente descritos (pacientes 1779, 1834 y 1863) que tenían una sustitución de arginina por glutamina y una segunda mutación no identificada (Goyette P et al., Nature Genetics, 1994, 7:195-200). Las hermanas con la mutación de corte y empalme en el lado 5' y una segunda mutación no identificada también tenían niveles de actividad situados dentro de la misma gama de valores e inicio de síntomas en la segunda década, pero la actividad es probablemente debida al segundo alelo no identificado.

Discusión

Los pacientes son de distintos orígenes étnicos. A pesar de que los pacientes 1554 y 1627 son ambos nativos americanos, las mutaciones se dan en distintos haplotipos, sugiriendo una mutación recurrente en lugar de identidad por descendencia. Puesto que la sustitución se da en un dinucleótido CpG, que es un "punto caliente" para la mutación, la mutación recurrente constituye una hipótesis razonable. Es difícil valorar si algunas mutaciones son específicas de la población puesto que las cifras son demasiado pequeñas en la actualidad.

La deficiencia de la MTHFR es el error ingénito más común del metabolismo del folato y constituye una causa importante de la homocisteineima hereditaria. El reciente aislamiento de un cDNA para MTHFR ha permitido el análisis mutacional en este locus, con los objetivos de definir dominios importantes para la enzima y de correlacionar el genotipo con el fenotipo en los pacientes con deficiencia de la MTHFR.

Nuestra definición de una sustitución que causa enfermedad, a diferencia de un polimorfismo benigno, está basada en 3 factores: (1) la ausencia del cambio en al menos 50 cromosomas de control independientes; (2) la presencia del aminoácido en la enzima bacteriana, que atestigua su importancia evolutiva; y (3) la cuestión de si el cambio de aminoácido es conservativo. A pesar de que la expresión de las sustituciones es necesaria para demostrar formalmente que las mismas no son benignas, los anteriores criterios nos permiten postular que los cambios que se describen en este informe es probable que afecten a la actividad.

Las 7 mutaciones aquí descritas (6 sustituciones de un solo aminoácido y una mutación de sitio de corte y empalme 5') hacen que el total sea de 9 mutaciones identificadas hasta la fecha en la severa deficiencia de la MTHFR y completan el análisis de mutaciones para 8 pacientes. La identificación de cada mutación en solamente una o dos familias apunta al sorprendente grado de heterogeneidad genética en este locus. Siete de las 9 mutaciones están situadas en dinucleótidos CpG, que son propensos a experimentar eventos mutacionales.

Mutación de sitio de corte y empalme 5'

La sustitución G \rightarrow A en el dinucleótido GT del sitio de corte y empalme 5' en las pacientes 354 y 355 redunda en una deleción en marco de 57 bp de la secuencia codificante, la cual debería suprimir 19 aminoácidos de la proteína. Esta deleción se da como resultado de la activación de un sitio de corte y empalme 5' críptico (AG/gc) incluso a pesar de que este sitio críptico no tiene una perfecta secuencia de consenso de sitio de corte y empalme 5' (AG/gt). Sin embargo, los GC (en lugar de los GT) como los 2 primeros nucleótidos de un intrón han sido descritos en varios sitios de corte y empalme que se dan de manera natural, tal como en los genes para la protrombina humana y la adenina fosforribosiltransferasa y dos veces dentro del gen para la mayor subunidad de RNA polimerasa II de ratón. Los restantes nucleótidos del sitio críptico se ajustan a una secuencia de consenso de sitio de corte y empalme normal con sus variaciones previstas (A_{60}G_{79}/g_{100}t_{100}a_{59}a_{71}g_{82}t_{50}). Es poco probable que la enzima sometida a deleción y resultante de este mRNA empalmado de manera aberrante tenga actividad alguna; estando conservados en la enzima de E. coli 8 de los 19 aminoácidos suprimidos. A pesar de que las 2 pacientes presentan una actividad residual de la enzima que es del orden de un 20% de la de los controles, la actividad es probablemente debida al segundo alelo no identificado en estas pacientes.

6 mutaciones de sentido equivocado

La sustitución Arg \rightarrow Cys (C1081T) en la paciente 1396 está dentro de una secuencia hidrofílica de la que anteriormente se ha postulado que es la región ligadora entre los dominios catalítico y regulador de MTHFR (Goyette P et al., Nature Genetics, 1994, 7:195-200). Estos 2 dominios son fácilmente separables mediante leve tripsinización de la enzima porcina. El dominio ligador, que es una región altamente cargada, es probable que esté situado en la superficie exterior de la proteína y sea por consiguiente más accesible a la proteólisis. Debido al hecho de que la sustitución
Arg \rightarrow Cys convierte un residuo hidrofílico cargado en un residuo polar no cargado, la misma no puede ser considerada como un cambio conservativo, y podría afectar a la estabilidad de la enzima.

Las 2 sustituciones Arg \rightarrow Cys identificadas en los pacientes 356 y 458 (C985T y C1015T, respectivamente) puede ser que intervengan en la fijación del cofactor FAD. Los anteriores trabajos sobre los que se informa en la literatura demostraron que el calentamiento de extractos de fibroblastos a 55º en ausencia del cofactor FAD inactivaba completamente la MTHFR. La adición de FAD a la mezcla de reacción antes de la termoinactivación les restituyó cierta actividad enzimática a los extractos de control y a los extractos de algunos pacientes, mientras que los extractos de los pacientes 356 y 458 no se vieron afectados. Sobre la base de estas observaciones, se sugirió que estos 2 pacientes tenían mutaciones que afectaban a una región de la proteína que intervenía en la fijación del FAD. Las 2 mutaciones se encuentran muy cerca una de otra, a 11 aminoácidos de distancia. En el paciente 356, el residuo Arg es conservado evolutivamente en E. coli y se encuentra en un tramo de 9 aminoácidos conservados, lo que sugiere un papel decisivo para este residuo; y el residuo Arg alterado en el paciente 458 no es conservado evolutivamente. El análisis de la estructura cristalina de la acil-CoA deshidrogenasa de cadena mediana (MCAD), que es una flavoproteína, ha definido residuos decisivos que intervienen en la fijación de FAD. Dos residuos consecutivos de la proteína MCAD, el Met165 y el Trp166, que intervienen en interacciones con FAD, pueden ser también identificados en la MTHFR, en el lado de cola respectivamente a 3 y 4 aminoácidos del residuo Arg alterado en el paciente 458.

La sustitución Thr \rightarrow Met (C692T) se encuentra en una región de alta conservación con la enzima E. coli y en una región de buena homología con la dihidrofolato reductasa humana (DHFR) (Fig. 11). En la Fig. 11, = es identidad; \bullet es homología; y \lozenge es identidad con la enzima DHFR bovina. Un asterisco (*) indica la situación de la sustitución Thr \rightarrow Met. Considerando el fenotipo de temprana iniciación de los pacientes, puede suponerse que el residuo de treonina es decisivo para la actividad o que el mismo contribuye a un importante dominio de la proteína. Esta región de homología en la DHFR contiene un residuo, el Thr136, del que se ha descrito que interviene en la fijación del folato. Este residuo Thr en la DHFR se alinea con un residuo Ser en la MTHFR que es un aminoácido con similares propiedades bioquímicas. La sustitución Thr \rightarrow Met está situada hacia el lado de cola a 8 aminoácidos de este codón Ser, en el centro de la región de homología entre las 2 enzimas. Establecemos por consiguiente la hipótesis de que la sustitución Thr \rightarrow Met puede alterar la fijación del sustrato de folato.

Las sustituciones G167A (Arg \rightarrow Gln) y C764T (Pro \rightarrow Leu) afectan ambas a aminoácidos no conservados. No puede determinarse en la actualidad su importancia en el desarrollo de la deficiencia de la MTHFR. Todas las mutaciones identificadas hasta la fecha están situadas en el extremo 5' de la secuencia codificante, que es la región de la que se piensa que codifica el dominio catalítico de la MTHFR. El análisis de las mutaciones ha sido útil para empezar a abordar los aspectos relativos a la relación existente entre la estructura y las propiedades funcionales de la enzima, así como para empezar a entender los diversos fenotipos en la severa deficiencia de la MTHFR.

III. Identificación de la mutación A \rightarrow V

Se usaron el análisis del SSCP y la secuenciación directa de fragmentos PCR para identificar una sustitución de C a T en el bp 677, cuya sustitución convierte un residuo de alanina en un residuo de valina (Fig. 5A). Los cebadores para el análisis del cambio A \rightarrow V son los siguientes: 5'-TGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA-3' (exónico) y 5'-AGGACGGTGC GGTGAGAGTG-3' (intrónico); generando estos cebadores un fragmento de 198 bp. La Fig. 5A ilustra la secuencia de dos individuos que son un homocigoto para el residuo de alanina y un homocigoto para el residuo de valina. Están ilustradas las hebras antisentido. Esta alteración crea un sitio HinfI (Fig. 5B), lo cual fue usado para someter a selección a 114 cromosomas francocanadienses no seleccionados; siendo la frecuencia alélica de la sustitución de 0,38. La sustitución crea una secuencia de reconocimiento para HinfI, lo cual da lugar a una digestión del fragmento de 198 bp que queda así convertido en un fragmento de 175 bp y un fragmento de 23 bp; habiéndose salido del gel el fragmento mencionado en último lugar. La Fig. 5B ilustra los tres posibles genotipos. Las frecuencias de los 3 genotipos eran las siguientes: -/-, 37%; +/-, 51%; y +/+, 12% (el (+) indica la presencia del sitio de restricción para HinfI y de un residuo de valina).

El residuo de alanina es conservado en la MTHFR porcina, así como en los correspondientes genes metF y stymetF de E. coli y S. typhimurium, respectivamente. El alto grado de conservación de este residuo y su situación en una región de alta homología con las enzimas bacterianas aludían a su importancia en la estructura o función de la enzima. Además, la frecuencia del genotipo (+/+) era coherente con la frecuencia de la variante de MTHFR termolábil que está implicada en la enfermedad vascular.

Material clínico

Para determinar la frecuencia de la mutación A \rightarrow V, fue analizado mediante PCR y digestión de restricción el DNA de 57 individuos de Quebec. Los individuos, que eran todos ellos francocanadienses, no fueron examinados clínica ni bioquímicamente.

Los 40 individuos que se analizan en la Tabla 3 habían sido descritos anteriormente en Engbersen et al. (Am. J. Hum. Genet., 1995, 56:142-150). De los 13 pacientes cardiovasculares, 8 tenían arterioesclerosis cerebrovascular y 5 tenían arterioesclerosis periférica. Cinco tenían MTHFR termolábil, mientras que 8 tenían MTHFR termoestable (con una actividad residual de más de un 33% tras calentamiento). Los controles y los pacientes eran todos ellos caucásicos holandeses de entre 20 y 60 años de edad. Ninguno de estos individuos usaba vitaminas que pudiesen alterar los niveles de homocisteína. Los análisis enzimáticos y las determinaciones de la homocisteína estaban también descritos por Engbersen et al. (Am. J. Hum. Genet., 1995, 56:142-150).

TABLA 3 Correlación entre el genotipo de MTHFR y la actividad de la enzima, la termolabilidad y el nivel de homocisteína en plasma

3

p < 0,01 según análisis de varianza de una vía

p < 0,01 según la prueba t para muestras apareadas para todas las combinaciones

\begin{minipage}[t]{150mm} p < 0,05 según prueba t para muestras apareadas para el grupo +/+ frente al grupo +/- o al grupo -/-; p > 0,05 para el grupo +/- frente al grupo -/-.\end{minipage}

n = 18 para este parámetro

n = 11 para este parámetro

La actividad de la enzima y la homocisteína en plasma fueron determinadas como se ha descrito anteriormente. Cada valor representa la media \mu el error característico. La gama de valores está indicada entre paréntesis debajo de la media.

Correlación de la mutación A \rightarrow V con la función alterada de la MTHFR

En un total de 40 pellets de linfocitos de pacientes con enfermedad vascular prematura y de controles fue llevado a cabo un análisis genotípico y fueron medidas la actividad y la termolabilidad de la enzima. Fueron seleccionados 13 pacientes vasculares de un estudio anterior (Engbersen et al., Am. J. Hum. Genet., 1995, 56:142-150), de entre los cuales se consideraba que 5 tenían MTHFR termolábil. De entre los de un gran grupo de referencia de 89 controles fueron estudiados los 7 individuos que tenían MTHFR termolábil, y fueron seleccionados de entre los del mismo grupo de referencia 20 controles adicionales con MTHFR normal. La Tabla 3 documenta la relación existente entre los genotipos y la actividad específica de la enzima, la termolabilidad y el nivel de homocisteína en plasma. La actividad media de MTHFR para los individuos homocigóticos para la sustitución (+/+) era de aproximadamente un 30% de la actividad media para los individuos (-/-), que son homocigóticos para el residuo de alanina. Los heterocigotos tenían una actividad media de MTHFR que era de un 65% de la actividad de los individuos (-/-); siendo este valor intermedio entre los valores para los individuos (-/-) y (+/+). Las gamas de valores de las actividades presentaban cierto solapamiento para los genotipos heterocigóticos y (-/-), pero los individuos homocigóticos (+/+) virtualmente no presentaban solapamiento con los grupos anteriores. Un análisis de varianza de una vía produjo un valor p < 0,0001; demostrando una prueba t de Bonferroni en parejas que los tres genotipos eran significantemente distintos con p < 0,01 para las tres posibles combinaciones.

Los tres genotipos eran todos ellos significantemente distintos (p < 0,01) con respecto a la termolabilidad de la enzima. La actividad residual media tras termoinactivación por espacio de 5 minutos a 46º era de un 67%, un 56% y un 22% para los genotipos (-/-), (+/-) y (+/+), respectivamente. Mientras que el grado de termolabilidad presenta cierto solapamiento para los individuos (-/-) y los heterocigotos, los individuos con dos alelos mutantes presentaban una gama de valores claramente inferior. Cada individuo con el genotipo (+/+) presentaba una actividad residual < 35% tras calentamiento y una actividad específica < 50% de la del genotipo (-/-).

Las concentraciones de homocisteína total tras ayuno y 6 horas después de la carga de metionina fueron medidas en plasma mediante cromatografía de líquidos de alta resolución usando detección por fluorescencia. Los niveles de homocisteína en ayunas en los individuos (+/+) eran casi el doble del valor para los individuos (+/-) y (-/-). Las diferencias entre genotipos para la homocisteína en plasma se mantenían cuando la homocisteína fue medida a las 6 horas de la carga de metionina. Un análisis de varianza de una vía produjo un valor p < 0,01 para los niveles de homocisteína en ayunas y post-metionina. Una prueba t de Bonferroni en parejas demostró que solamente los individuos mutantes homocigóticos tenían niveles de homocisteína significantemente elevados (p < 0,05).

Mutagénesis por PCR para la expresión de la mutación A \rightarrow V in vitro

Fue usada para crear la mutación de A a V mutagénesis por PCR usando como plantilla el vector Bluescript^{MF} con contenido de cDNA. Fue usada para reducir los errores de la PCR Vent^{MF} polimerasa (NEB). Fueron usados los cebadores siguientes: cebador 1, bp -200 a -178, sentido; cebador 2, bp 667 a 687, antisentido, que contiene un emparejamiento incorrecto, A, en el bp 677; cebador 3, 667 a 687, sentido, que contiene un emparejamiento incorrecto, T, en el bp 677; cebador 4, bp 1092 a 1114, antisentido. La PCR fue llevada a cabo usando los cebadores 1 y 2 para generar un producto de 887 bp, y usando los cebadores 3 y 4 para generar un producto de 447 bp. Los dos fragmentos de PCR fueron aislados mediante un gel de agarosa al 1,2% mediante Geneclean^{MF} (BIO 101). Usando los cebadores 1 y 4 y los 2 primeros fragmentos de PCR como plantilla, fue llevada a cabo una reacción PCR final para generar una banda de 1,3 kb que contenía la mutación. El fragmento de 1,3 kb fue sometido a digestión con NcoI y MscI, y fue insertado en el vector de expresión con contenido de cDNA de tipo salvaje sustituyendo las secuencias entre el sitio NcoI en el bp 11 y el sitio MscI en el bp 943. Fueron secuenciados todo el fragmento de sustitución y los sitios de clonación para verificar que no habían sido introducidos por la PCR cambios adicionales.

Análisis de la expresión de cDNA de tipo salvaje y mutagenizado

Se hicieron durante la noche a 37ºC en 2 x medio YT con 0,05 mg/ml de ampicilina cultivos de vector con contenido de JM105^{MF} en solitario, vector + cDNA de MTHFR de tipo salvaje, o vector + cDNA mutagenizado. Cultivos recientes de 10 ml de cada uno fueron inoculados con aproximadamente 50 \mul de cultivos llevados a cabo durante la noche para una densidad óptica de 0,05, y fueron cultivados a 37ºC hasta una densidad óptica de 1 a 420 nm. Los cultivos fueron entonces inducidos por espacio de 2 horas con IPTG (IPTG = isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido) 1 mM y pelletizados. Las células fueron puestas nuevamente en suspensión en tampón TE con 2 \mug/ml de aprotinina y 2 \mug/ml de leupeptina (3,5 x el peso de las células en húmedo). Las suspensiones celulares fueron sonicadas en hielo 3 veces por espacio de 15 seg. cada vez para así romper y abrir las membranas celulares, y fueron luego centrifugadas por espacio de 30 minutos a 4ºC para pelletizar los residuos celulares y las células no lisadas. El supernatante fue retirado y analizado para determinar la concentración de proteína con el análisis de proteínas Bio-Rad^{MF}. Fue llevado a cabo un análisis Western usando el conjunto de materiales y utensilios Amersham ECL^{MF} según las instrucciones del proveedor, usando antisuero generado contra MTHFR de hígado porcino purificada. Los análisis enzimáticos fueron llevados a cabo mediante procedimientos establecidos, y la termolabilidad fue valorada pretratando los extractos a 46ºC por espacio de 5 minutos antes de determinar la actividad. Las actividades específicas (nmoles de formaldehído/h/mg de proteína) fueron calculadas para los 2 constructos que contenían cDNA tras sustracción de los valores obtenidos con vector solamente (para restar la actividad de fondo de MTHFR de E. coli).

El cDNA de MTHFR (2,2 kb) (Fig. 6) tiene un marco de lectura abierto de 1980 bp, que predice una proteína de 74,6 kDa. Se ha demostrado que la enzima de hígado porcino purificada tiene subunidades 77 kDa. El análisis Western (Fig. 7A) de varios tejidos humanos y de hígado porcino ha revelado un polipéptido de 77 kDa en todos los tejidos estudiados, así como un polipéptido adicional de aproximadamente 70 kDa en hígado fetal humano y en hígado porcino, sugiriendo la presencia de isozimas. Dos \mug de proteína de extracto bacteriano fueron usados para los carriles 1-3. Los tejidos (carriles 4-8) fueron preparados por homogeneización en sucrosa 0,25M con inhibidores de proteasa (2 \mug/ml de aprotinina y otros tantos de leupeptina), siendo efectuada a continuación sonicación (3 x 15 seg.) en hielo. Los extractos fueron centrifugados por espacio de 15 min. en una microcentrífuga a 14.000 g, y fueron usados 100 \mug de proteína supernatante para el análisis Western. h = humano; p = porcino.

El cDNA de tipo salvaje y un cDNA mutagenizado que contenía la sustitución A \rightarrow V fueron expresados en E. coli para producir una proteína de aproximadamente 70 kDa (Fig. 7A) que comigra con el polipéptido más pequeño anteriormente mencionado. El tratamiento de los extractos a 46ºC por espacio de 5 minutos reveló que la enzima que contenía la sustitución era significativamente más termolábil que la enzima de tipo salvaje (p < 0,001; Fig. 7B). Fueron llevados a cabo dos experimentos independientes (con 3-4 réplicas para cada constructo para cada experimento) para medir la actividad termoestable de los cDNAs de MTHFR de tipo salvaje y de MTHFR A \rightarrow V mutagenizada. Los valores que se indican representan la media \mu el error característico para cada experimento, como porcentaje de actividad residual tras el calentamiento. Las medias de las actividades específicas antes del calentamiento (expresadas como nmoles de formaldehído/h/mg de proteína) eran las siguientes: Exp. 1, 3,8 y 5,3 para MTHFR y MTHFR A \rightarrow V, respectivamente; Exp. 2, 6,2 y 7,5 para MTHFR y MTHFR A \rightarrow V, respectivamente. Los experimentos de expresión no estaban destinados a medir las diferencias de la actividad específica antes del calentamiento, puesto que la variación en los rendimientos de expresión podría contribuir a crear dificultades de interpretación. Curiosamente, sin embargo, la actividad específica para el constructo mutante era más alta en ambos experimentos. Es posible que la proteína mutante tenga una estabilidad incrementada en E. coli, o que los cuerpos de inclusión en nuestros extractos contribuyesen a crear diferencias en la recuperación de la enzima correctamente ensamblada.

Estos estudios han identificado una sustitución común en el gen de MTHFR que redunda en termolabilidad in vitro e in vivo. La mutación, en el estado heterocigótico u homocigótico, está correlacionada con la reducida actividad de la enzima y la incrementada termolabilidad de la MTHFR en los extractos de linfocitos. Se observó una significante elevación de la homocisteína en plasma en los individuos que eran homocigóticos para la mutación. No fueron observadas entre los heterocigotos y los individuos (-/-) diferencias estadísticamente significantes para los niveles de homocisteína, y esta observación no es sorprendente, puesto que la homocisteína en plasma puede verse influenciada por varios factores ambientales entre los que se incluyen la toma de folato, vitamina B_{12}, vitamina B_{6} y metionina, así como por la variación genética en otros loci, tal como en el caso del gen de la cistationina-\beta-sintasa.

La sustitución de alanina por valina conserva la hidrofobicidad del residuo y va asociada a pequeños cambios de la actividad, en contraste con los cambios no conservativos, tales como el anteriormente descrito cambio de arginina por glutamina en la MTHFR, que va asociado a una mayor disminución de la actividad de la enzima y a hiperhomocisteinemia severa. El residuo de alanina está situado en una región de homología con los genes metF bacterianos. Hemos observado también la misma región de homología en el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) humana (Fig. 11), a pesar de que el propio residuo de alanina no es conservado; y esta región de aminoácidos 130-149 de DHFR contiene T136, que se ha visto implicado en la fijación del folato en un análisis de la estructura cristalina de la DHFR humana recombinante. Es tentador especular con que esta región en la MTHFR también intervenga en la fijación del folato, y con que la enzima pueda ser estabilizada en presencia de folato. Esta hipótesis es compatible con la perfectamente documentada influencia del folato en los niveles de homocisteína y con la descrita corrección de la hiperhomocisteinemia leve mediante ácido fólico en individuos con enfermedad vascular prematura y en individuos con MTHFR termolábil.

A pesar de que nuestro cDNA no es lo suficientemente largo como para codificar el polipéptido MTHFR de mayor tamaño, el mismo es capaz de dirigir la síntesis de la isozima de menor tamaño. El codón de inicio ATG para este polipéptido está dentro de una buena secuencia de consenso para la iniciación de la traducción. Quedan por determinar las cuestiones de si la isozima está limitada al hígado y de cuál es su papel en este tejido.

Estos datos han identificado un cambio genético común en la MTHFR que redunda en termolabilidad; no abordando nuestros experimentos directamente la relación existente entre este cambio y la enfermedad vascular. Sin embargo, este polimorfismo representa un análisis diagnóstico para la evaluación de la termolabilidad de la MTHFR en hiperhomocisteinemia. Son necesarios estudios comparativos a gran escala para evaluar la frecuencia de este cambio genético en varias formas de enfermedad arterial oclusiva y para examinar la interacción entre este marcador genético y los factores dietarios. Tienen que ser examinadas poblaciones perfectamente definidas, puesto que el limitado conjunto de datos sugiere hasta la fecha que pueden existir frecuencias alélicas específicas de la población. Más importante es sin embargo el hecho de que la identificación de un candidato a factor de riesgo genético para la enfermedad vascular, que puede verse influenciada por la toma de nutrientes, representa un paso decisivo en el diseño de terapias apropiadas para la forma homocisteinémica de la arterioesclerosis.

cDNA para MTHFR y su utilidad potencial

Un cDNA humano para MTHFR (2,2 kb) ha sido aislado como hemos descrito en Goyette et al. (Nature Genetics, 1994, 7:195-200) y en Frosst et al. (Nature Genetics, 1995, 10:111-113). El cDNA ha sido expresado in vitro para producir una proteína MTHFR de aproximadamente 70 kDa (Fross P et al., Nature Genetics, 1995, 10:111-113).

Usando la secuencia del cDNA fueron identificadas mutaciones en pacientes con severa y leve deficiencia de la MTHFR (Goyette P et al., Nature Genetics, 1994, 7:195-200; Goyette P et al., Am. J. Hum. Genet., 1995, 56:1052-1059; Frosst P et al., Nature Genetics, 1995, 10:111-113).

\newpage

La secuencia del cDNA es un necesario punto de partida para la detección de cambios de la secuencia de la MTHFR que identificasen a los individuos que están en situación de riesgo de contraer enfermedades cardiovasculares y neurológicas, así como de padecer otros trastornos afectados por el metabolismo del ácido fólico. Los análisis diagnósticos mediante análisis del DNA son más eficaces y precisos que las pruebas efectuadas mediante análisis enzimáticos/bioquímicos. Se requiere menos sangre, y se dispone de los resultados en un periodo de tiempo más corto. Las pruebas podrían ser llevadas a cabo como una operación rutinaria en cualquier laboratorio que lleve a cabo diagnósticos genético-moleculares, sin los reactivos especializados y sin la pericia especializada que son necesarios para un análisis basado en enzimas.

La segunda utilidad importante del cDNA radicaría en el diseño de protocolos terapéuticos para la corrección de la deficiencia de la MTHFR. Estos protocolos podrían implicar directamente al gen, como en las pruebas de terapia genética o en el uso de reactivos que pudiesen modificar la expresión génica. Como alternativa, la terapia podría requerir el conocimiento de la secuencia de aminoácidos (sacada de la secuencia del cDNA), como en el uso de reactivos que modificasen la actividad de la enzima. La identificación de secuencias y/o cambios de secuencia en regiones específicas del cDNA o de la proteína, tales como los sitios de fijación del FAD o los sitios de fijación del folato, es útil para diseñar protocolos terapéuticos que atañan a los susodichos nutrientes.

Utilidad de la invención en los estudios clínicos y diagnósticos

Fueron estudiados pacientes con enfermedad arterial coronaria en Montreal (n = 153) para examinar la frecuencia de la sustitución de alanina por valina. El catorce por ciento de los pacientes eran homocigóticos para esta mutación. Un análisis de 70 individuos de control (exentos de enfermedad cardiovascular) demostró que solamente un siete por ciento de estos individuos eran homocigóticos para la mutación de alanina a valina.

El análisis de los niveles de homocisteína en 123 hombres del susodicho grupo de pacientes indicó que el alelo mutante incrementaba significantemente los niveles de homocisteína haciendo que pasasen de ser de 10,2 micromoles/l en los hombres normales homocigóticos a ser de 11,5 y 12,7 en los heterocigotos y en los mutantes homocigóticos, respectivamente.

Han sido examinadas para determinar la presencia de la mutación de alanina a valina familias con un niño con espina bífida, que es un defecto del tubo neural. Aproximadamente las de un 16% de las madres que tenían un hijo con espina bífida eran homocigóticas para esta mutación, mientras que tan sólo los de un 5% de los individuos de control eran homocigóticos. Los padres de los niños que tenían espina bífida también presentaban una incrementada prevalencia del genotipo mutante homocigótico (10%), al igual como lo hacían los propios niños afectados (13%).

La Tabla 4 indica el efecto interactivo del ácido fólico con el cambio de alanina a valina de los mutantes homocigóticos. En un estudio de familias de Framingham, Massachusetts y Utah, los individuos que eran mutantes homocigóticos pero tenían niveles de folato de más de 5 ng/ml no presentaban incrementados niveles de homocisteína en comparación con los individuos que tenían el genotipo normal o heterocigótico. Sin embargo, los individuos que eran mutantes homocigóticos pero tenían niveles de folato de menos de 5 ng/ml tenían niveles de homocisteína que eran significantemente más altos que los de los otros genotipos.

TABLA 4 Niveles medios de homocisteína en ayunas y post-carga de metionina para distintos genotipos de MTHFR

4

El Ejemplo III proporciona datos preliminares para la intervención terapéutica mediante suplementación de ácido fólico a los individuos que son homocigóticos para el cambio de alanina a valina. Los datos sugieren que unos más altos niveles de folato en plasma conducirían a una normalización de los niveles de homocisteína en los individuos mutantes y podrían impedir que se produjesen trastornos que van asociados a los altos niveles de homocisteína, tales como la enfermedad cardiovascular, los defectos del tubo neural y posiblemente otros trastornos. La suplementación de ácido fólico para los individuos mutantes podría también restablecer los niveles normales de metionina y S-adenosilmetionina. Esto sería relevante para los trastornos que se ven influenciados por la metilación, tales como las neoplasias, las anomalías del desarrollo, la enfermedad neurológica, etc.

Si bien la invención ha sido descrita en conexión con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que la invención puede ser objeto de adicionales modificaciones, y que esta solicitud pretende englobar cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención que sigan en general los principios de la invención, incluyendo todas aquellas variaciones que con respecto a la presente descripción estén enmarcadas dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y que puedan ser aplicadas a las características esenciales que han sido expuestas anteriormente y a continuación dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: McGILL UNIVERSITY

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 845 Sherbrooke Street West

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Montreal

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Quebec

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): H3A 1B1

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 514-398-4200

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 514-398-8479

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: ROZEN, Rima

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9 Fairfield Cr.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Montreal West

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Quebec

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): H4X 1R5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: GOYETTE, Philippe

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 4368 Harvard

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Montreal

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Quebec

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canadá

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): H4A 2X1

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: cDNA PARA TILENOTETRAHIDROFOLATO

\hskip6cm

REDUCTASA HUMANA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO INFORMÁTICO: PatentIn Lanzamiento Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.800000\baselineskip

NÚMERO DE SOLICITUD: WO PCT/CA95/00314

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9410620.0

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 26 MAYO 1994Ç

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2220 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(xi)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

SITUACIÓN: 1...1980

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:

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6

7

8

9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 660 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGIA: lineas

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:

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10

11

12

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2219 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULA: DNA (genomic)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CODIGO: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 13...1983

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

16

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 656 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:

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17

18

19

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCTCAACC CCTGCTTGGA GG

\hfill

22

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGACAGTTTG CTCCCCAGGC AC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGACGGTCG GGTGAGAGTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACTGTGGTT GGCATGGATG ATG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTGCTCTT GGACCCTCCT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTTCCGGC TCCCTCTAGC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCCCGCTC CCAAGAACAA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGGAGAA GGTGTCTGCG GGA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ORIENTACIÓN: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TIPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGACGGTGC GGTGAGAGTG

\hfill

20

Claims (13)

1. Sonda de cDNA para una metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana que tiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2, comprendiendo dicha sonda una secuencia que se hibrida en condiciones de rigor con dichas secuencias de MTHFR.

2. Método de diagnosis de una deficiencia de la MTHFR en un paciente, comprendiendo dicho método los pasos de:

a) amplificar una muestra de DNA de un paciente o someter a transcripción inversa a una muestra de RNA de un paciente para así convertirla en DNA y amplificar dicho DNA; y

b) analizar el DNA amplificado del paso a) para determinar si el mismo contiene al menos una anormalidad de secuencia con respecto a la metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana que tiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 o una secuencia que codifique la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2, siendo dichas anormalidades indicativas de deficiencia genómica de la MTHFR.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha deficiencia de la MTHFR va asociada a un trastorno seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de trastornos cardiovasculares y neurológicos, tumores y trastornos influenciados por el metabolismo del ácido fólico.

4. El método de la reivindicación 2, en el que dicha anormalidad secuencial comprende una mutación seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de

20

5. Uso de un vector recombinante que comprende la ID SEC Nº: 1 para la fabricación de un medicamento para la expresión de la proteína MTHFR (ID SEC Nº: 2) bajo el control de un promotor adecuado.

6. Proteína MTHFR humana que es codificada por la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2.

7. Ácido nucleico de metilenotetrahidrofolato reductasa (MTHFR) humana recombinante que tiene una secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 1 y codifica la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 2.

8. Uso de la proteína de la reivindicación 6 o del ácido nucleico de la reivindicación 7 para la fabricación de un medicamento para tratar pacientes con deficiencia de la MTHFR.

9. El método de la reivindicación 2, en el que dicho paciente tiene menos de un año de edad.

10. El método de la reivindicación 2, en el que dicho paciente tiene al menos un año de edad.

11. El método de la reivindicación 2, en el que dicha deficiencia de la MTHFR va asociada a un incrementado riesgo de que aparezca un defecto del tubo neural en un descendiente de dicho paciente.

12. El método de la reivindicación 3, en el que dichos tumores son seleccionados de entre los miembros del grupo que consta de neuroblastomas y carcinomas colorrectales.

13. El método de la reivindicación 4, en el que dicha anormalidad secuencial consta de la anormalidad secuencial 677C-T.