ES2272086T5 - Vacuna multicomponente que comprende por lo menos dos antigenos de haemophilus influenzae. - Google Patents
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Abstract
Composición inmunógena para conferir protección en un huésped contra la enfermedad producida por Haemophilus influenzae, que comprende: por lo menos dos antígenos diferentes de Haemophilus influenzae, siendo por lo menos uno de dichos antígenos una adhesina y no siendo el otro de dichos antígenos unas adhesina.
Description
Vacuna multicomponente que comprende por lo
menos dos antígenos de Haemophilus influenzae.
La presente invención se refiere al campo de la
vacunología y, en especial, a la vacuna multicomponente que
comprende las proteínas recombinantes de Haemophilus
influenzae que es útil en la protección contra la enfermedad
producida por Haemophilus influenzae, incluyendo la otitis
media.
Haemophilus influenzae es la causa de
varias enfermedades humanas graves tales como la meningitis,
epiglotitis, septicemia y otitis media. Existen seis serotipos de
H. influenzae, denominados a a f, que se identifican por su
polisacárido capsular. H. influenzae tipo b (Hib) era la
causa principal de la meningitis bacteriana hasta la introducción
de varias vacunas y conjugadas de Hib en los años 80 (ref. 1). Las
vacunas basadas en el polisacárido capsular tipo b de H.
influenzae conjugado con la vacuna antidiftérica (ref. 2),
vacuna antitetánica (ref. 3 y patente US nº 4.496.538) o la
proteína de la membrana externa de Neisseria miningitidis
(ref. 4) han sido eficaces en la reducción de la meningitis
producida por el tipo b de H. influenzae. Los demás
serotipos de H. influenzae están asociados a la enfermedad
invasora con poca frecuencia, aunque parece que existe un aumento
de la frecuencia de la enfermedad producida por estas cepas a medida
que disminuye la frecuencia de la enfermedad por Hib (refs. 5, 6).
Las H. influenzae (NTHi) no encapsuladas ni tipificables son
también responsables de una amplia gama de enfermedades humanas
incluyendo otitis media, epiglotitis, neumonía y traqueobronquitis.
La incidencia de la enfermedad producida por NTHi no ha estado
afectada por la introducción de las vacunas Hib (ref. 7).
La otitis media es la enfermedad más frecuente
de la infancia precoz, experimentando la 60 a 70% de todos los
niños menores de 2 años, entre una y tres infecciones de oído (ref.
8). La otitis media crónica es responsable de las alteraciones
auditivas, del habla y cognitivas en los niños. Las infecciones por
H. influenzae suman aproximadamente el 30% de los casos de
otitis media aguda y aproximadamente el 60% de la otitis media
crónica. Solo en los Estados Unidos, el tratamiento de la otitis
media cuesta entre uno y dos billones de dólares al año, en
antibióticos y procedimientos quirúrgicos, tales como angilectomías,
adenoidectomías e inserción de tubos para timpanostomía. Se estima
que se gastan unos 30 billones de \textdollar adicionales al año
en terapias asociadas tales como terapia del habla y clases de
educación especiales. Además, muchos de los organismos causantes de
la otitis media se están volviendo resistentes al tratamiento con
antibióticos. Por lo tanto es deseable una vacuna profiláctica
eficaz contra la otitis media.
Durante la infección natural por NTHi, las
proteínas de la membrana externa expuestas en la superficie que
estimulan una respuesta del anticuerpo son dianas importantes en
potencia para los anticuerpos bactericidas y/o protectores y por lo
tanto potenciales vacunas experimentales. Barenkamp y Bodor (ref. 9)
demostraron que los sueros de niños convalecientes que padecen
otitis media debida a la NTHi, contenían anticuerpos contra
proteínas de alto peso molecular (HMW). Aproximadamente del 70 al
75% de las cepas de NTHi expresan las proteínas de HMW y la mayoría
de estas cepas contienen dos grupos de genes denominados
hmw1ABC y hmw2ABC (refs. 10 y 11). se ha demostrado
que las proteínas HMWA son adhesinas que median en el acoplamiento a
las células epiteliales humanas (ref. 12). La inmunización con una
mezcla de proteínas naturales HMW1A y HMW2A produjo protección
parcial en el modelo otitis media en la prueba de provocación
intravesicular con chinchilla (ref. 13).
La patente US nº 5.603.938 (Barenkamp), asignada
a St-Louis University a Washington University,
describe la clonación, expresión y secuenciado de los genes que
codifican las proteínas HMW1 y HMW2 de la cepa 12 de
Haemophilus no tipificable. Las proteínas HMW son una
familia de proteínas de Haemophilus no tipificable de peso
molecular de aproximadamente 100 a 125 kDa que se encuentran en las
cepas de Haemophilus no tipificable. Las proteínas HMW están
ausentes en las cepas encapsuladas de Haemophilus.
La producción de proteínas HMW naturales a
partir de cepas de H. influenzae es muy baja y se ha descrito
un método para producir proteínas HMW recombinantes (rHMW)
protectoras en el documento WO 00/20609. Se ha desarrollado
específicamente un modelo de colonización nasofaríngea en chinchilla
para demostrar la eficacia de las adhesinas en la vacuna (ref. 14)
y las proteínas rHMW son protectoras en este modelo descrito en el
documento WO 00/20609. Las proteínas rHMW1A y rHMW2A se presentan
para proporcionar protección equivalente entre sí y la proteína
rHMW1A se seleccionó para estudios de la vacuna adicionales. En esta
solicitud, rHMW se refiere a la proteína HMW1A recombinante de la
cepa 12 de NTHi, aunque la proteína HMW1A recombinante
correspondiente de otras cepas NTHi y la proteína rHMW2A
correspondiente de las cepas NTHi pueden ser empleadas por la rHMW.
Asimismo puede emplearse las proteínas naturales
correspondientes.
Cuando bajo sobrecarga ambiental, tal como
temperatura elevada, los organismos producen un exceso de respuesta
a la sobrecarga o de proteínas de choque térmico (hsp) se ha
demostrado que las hsp bacterianas son inmunógenos importantes, que
estimulan tanto los linfocitos B como los linfocitos T (ref. 16).
Las proteínas HtrA bacterianas o las del choque térmico DegP se
expresan en las condiciones de sobrecarga y la proteína HtrA de
H. influenzae se ha demostrado que es un antígeno
parcialmente protector en el modelo de prueba de provocación
intravesicular de la otitis media (ref. 17). Las proteínas HtrA son
serina proteasas y su actividad proteolítica las hace inestables.
Además, como componente de una vacuna multicomponente, la proteína
HtrA natural degrada los antígenos mezclados. En la patente US nº
5.506.139 (Loosmore et al.), asignada al cesionario de la
misma se han descrito completamente la mutagénesis dirigida al
sitio del gen htrA de H. influenzae (denominado
hin47) y las propiedades de los mutantes. Se ha demostrado
que el análogo de HtrA no proteolítico, H91A Hin47, es un antígeno
protector contra la bacteremia producida por H. influenzae
tipo b y contra la otitis media por H. influenzae no
tipificable (ref. 17). Dicho análogo se utiliza en la presente
memoria, aunque puede emplearse cualquier otro análogo no
proteolítico de la proteína Hin47. Se descubrió HtrA en todas las
cepas examinadas incluyendo todas las cepas encapsuladas de H.
influenzae.
Aunque el principal objetivo de una vacuna
profiláctica contra la enfermedad por H. influenzae,
incluyendo la otitis media, es prevenir el asentamiento de la
colonización nasofaríngea que incluye una adhesina como inmunógeno,
las proteínas HMW no están presentes en H. influenzae
encapsulada o en aproximadamente el 25% de las cepas NTHi. Por
consiguiente, una vacuna de combinación compuesta de por lo menos
una molécula de adhesina y un antígeno protector adicional hallado
en todas las cepas de H. influenzae, proporcionará mejor
cobertura frente a la enfermedad y un amplio espectro de protección
de la enfermedad.
Sería deseable proporcionar vacunas de
combinación eficaces que comprendan componentes de H.
influenzae que contengan cantidades relativas seleccionadas de
los antígenos seleccionados.
La presente invención se refiere al aporte de
una vacuna multicomponente para proteger contra la enfermedad
causada por infección con Haemophilus influenzae, incluyendo
la otitis media.
Según la presente invención, se proporciona una
composición inmunógena para dispensar protección en una enfermedad
contra el huésped producida por la infección por Haemophilus
influenzae, incluyendo la otitis media, que comprende
- 25 a 100 \mug de un análogo de la proteína Hin47 de Haemophilus influenzae que presenta una actividad de proteasa disminuida que es menor de aproximadamente el 10% de la que presenta la proteína Hin47 de tipo salvaje, y
- 25 a 100 \mug de una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa de Haemophilus influenzae no tipificable.
En dicha composición, la proteína HMW está
presente en una cantidad que aumente la respuesta inmunitaria en el
huésped a la proteína Hin47 mientras que no existe interferencia
entre los componentes con respecto a sus inmunogenicidades
individuales.
El análogo de la proteína Hin47 puede ser aquel
en el que por lo menos un aminoácido de la proteína Hin 47 de tipo
salvaje que contribuye a la actividad de proteasa se ha eliminado o
sustituido por un aminoácido diferente y que presenta
sustancialmente las mismas propiedades inmunógenas que la proteína
Hin47 de tipo salvaje.
Por lo menos dicho aminoácido puede
seleccionarse de entre el grupo constituido por los aminoácidos 91,
121 y 195 a 207 de la proteína Hin47 de tipo salvaje. Los mutantes
específicos que pueden utilizarse incluyen
serina-197 sustituida por alanina,
histidina-91 sustituida por alanina, lisina o
arginina y Asp-121 sustituida por alanina.
La proteína HMW de la cepa no tipificable de
Haemophilus influenzae puede ser una proteína HMW1 o HMW2 y
puede producirse de modo recombinante. Las proteínas HMW1 y HMW2
proceden de las cepas respectivas de Haemophilus influenzae
no tipificable y poseen pesos moleculares respectivos indicados en
la Tabla I siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
La composición inmunógena de la invención puede
formularse más con un adyuvante. Dicho adyuvante para su utilización
en la presente invención puede incluir (pero no se limita a)
fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, QuiI A, derivados
y componentes de los mismos, matriz ISCOM, fosfato cálcico,
hidróxido de calcio, hidróxido de cinc, análogo de glucolípido, un
éster octadecílico de un aminoácido, un muramil dipéptido,
polifosfaceno, ISCOPREP, DC-col, DDBA y una
lipoproteína y otros adyuvantes, incluyendo las toxinas bacterianas,
los componentes y derivados de las mismas descritos, por ejemplo en
el documento WO 95/34323. En circunstancias especiales, son
deseables los adyuvantes que provocan una respuesta a Th1. En el
documento 95/34308 se describen combinaciones ventajosas de
adyuvantes. El adyuvante preferentemente puede comprender fosfato de
aluminio o hidróxido de aluminio (conocido habitualmente como
alúmina).
Los componentes de la composición inmunógena
están presentes en cantidades apropiadas para proporcionar la
respuesta inmunitaria deseada. Los componentes pueden formularse
como vacuna para la administración in vivo al huésped.
Pueden formularse composiciones inmunógenas con
otros componentes antigénicos para proporcionar una vacuna
multivalente en la que el o los componente(s)
antigénico(s) adicional(es) dispensa(n)
protección contra la enfermedad producida por otro(s)
patógeno(s). Dichos antígenos adicionales deberían ser tales
que, y deberían estar presentes en cantidades que, la
inmunogenicidad de los componentes aislados de la vacuna resultante
no estuviera alterada por otros componentes aislados de la
composición. Dichos antígenos adicionales preferentemente son
antígenos purificados en cantidades definidas para producir una
vacuna del componente.
Dichos antígenos adicionales pueden ser los
hallados habitualmente en las vacunas protectoras multivalentes,
tales como el toxoide diftérico, el toxoide tetánico y antígenos de
la tos ferina, incluyendo el toxoide de la tos ferina, la
hemoaglutinina filamentosa, pertactina y/o aglutinógenos.
La vacuna multivalente resultante también puede
contener poliovirus no virulentos, tales como poliovirus
inactivados, que pueden ser poliovirus de tipo 1, de tipo 2 y/o de
tipo 3. La vacuna multicomponente puede comprender además un
conjugado del toxoide tetánico o toxoide diftérico y un polisacárido
capsular de Haemophilus influenzae, preferentemente
PRP-T.
La presente invención se extiende además a la
composición inmunógena de la invención cuando se utiliza como
vacuna.
Las ventajas de la presente invención incluyen
una vacuna multicomponente que puede dispensar protección contra
las enfermedades por Haemophilus influenzae encapsulada y no
encapsulada de manera segura y eficaz.
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto a partir de la descripción siguiente haciendo
referencia a los dibujos, en los que:
La Figura 1, que tiene los paneles A a E,
presenta las respuestas inmunitarias a anti-H91A,
Hin47 para las vacunas de la combinación H91A Hin47 + rHMW en
ratones. Panel A, rHMW no añadida; panel B, 0,3 \mug de rHMW
añadida; panel C, 1,0 \mug de rHMW añadida; panel D, 3,0 \mug de
rHMW añadida; panel E, 10 \mug de rHMW añadida. Las flechas
indican el momento de las inmunizaciones;
la Figura 2 es un gráfico de barras que presenta
el efecto sinérgico sobre la respuesta inmunitaria primaria a baja
dosis (0,3 \mug) de H91A Hin47 por la adición de rHMW;
la Figura 3, que tiene los paneles A a D,
presenta las respuestas inmunitarias a anti-rHMW
para las vacunas de la combinación H91A Hin47 + rHMW en ratones.
Panel A, H91A Hin47 no añadida; panel B, 0,3 \mug de H91A Hin47
añadida; panel C, 1,0 \mug de H91A Hin47 añadida; panel D, 3,0
\mug de H91A Hin47 añadida. Las flechas indican el momento de las
inmunizaciones;
la Figura 4 es un gráfico de barras que presenta
el efecto sinérgico sobre la respuesta inmunitaria primaria a alta
dosis (10 \mug) de rHMW por la adición de H91A Hin47;
la Figura 5, que tiene los paneles A a D,
presenta las respuestas inmunitarias a anti-HMW para
las vacunas de la combinación H91A Hin47 + rHMW en cobayas. Panel
A, rHMW no añadida; panel B, 25 \mug de rHMW añadida; panel C, 60
\mug de rHMW añadida; panel D, 100 \mug de rHMW añadida. Las
flechas indican el momento de las inmunizaciones;
la Figura 6, que tiene los paneles A a D,
presenta las respuestas inmunitarias a anti-rHMW
para las vacunas de la combinación H91A Hin47 + rHMW en cobayas.
Panel A, H91A Hin47 no añadida; panel B, 25 \mug de H91A Hin47
añadida; panel C, 50 \mug de H91A Hin47 añadida; panel D, 100
\mug de H91A Hin47 añadida. Las flechas indican el momento de las
inmunizaciones;
la Figura 7 presenta la protección de la vacuna
de la combinación H91A Hin47 + rHMW en el modelo de chinchilla de
la otitis media;
la Figura 8 presenta la protección de la vacuna
de la combinación H91A Hin47 + rHMW en el modelo de chinchilla de
colonización nasofaríngea.
\newpage
la Figura 9, que tiene los paneles A y B, son
análisis SDS-PAGE que presentan el perfil de
estabilidad de la vacuna de la combinación H91A Hin47 + rHMW los
días 0 (panel A) y 14 (panel B), en comparación con los componentes
aislados;
la Figura 10A es un gráfico de barras de la
respuesta inmunitaria a H91A y rHMW en presencia y ausencia de
Pentacel®;
la Figura 10B, que tiene los paneles A y B,
contiene un gráfico de barras de la respuesta inmunitaria al toxoide
de la tos ferina (PT), hemoaglutinina filamentosa (FHA), pertactina
(69 kDa), aglutinógenos con franjas (panel A), toxoide tetánico
(TT), toxoide diftérico (DT), polio tipo 1, polio tipo 2 y
PRP-T (panel B) en Pentacel® cuando el Pentacel® se
administra solo o con los dos componentes H91A + rHMW de la vacuna
contra H. influenzae;
la Figura 11 presenta un esquema de construcción
para la preparación del plásmido
DS-2150-1 que contiene el gen H91 A
hin47 mutante bajo el control de un activador de T7; y
la Figura 12 presenta un esquema de construcción
para la preparación del plásmido
BK-76-11 que contiene el gen A
hmw 1ABC bajo el control de un activador de T7.
La colonización de la nasofaringe es la primera
etapa en el desarrollo de la enfermedad para muchos patógenos
bacterianos o víricos, incluyendo Haemophilus influenzae, y
las vacunas que contienen moléculas de adhesina deberían protegerse
contra la primera etapa en la evolución de la enfermedad. Se ha
demostrado que las proteínas de elevado peso molecular (HMW),
encontradas en aproximadamente el 75% de H. influenzae no
tipificable, son adhesinas que son protectoras contra la
colonización cuando se administran en una composición de vacuna.
Las proteínas HMW no están presentes en las cepas encapsuladas de
H. influenzae o en aproximadamente el 25% de las cepas de
H. influenzae no tipificables, y por consiguiente no están lo
suficiente solas, para una vacuna que presenta amplia protección
para la cepa.
La proteína HtrA o Hin47 se encuentra en todas
las cepas de H. influenzae encapsuladas y no tipificables.
Hin47 es protectora contra la bacteremia causada por H.
influenzae tipo b y la otitis media causada por H.
influenzae no tipificable, pero no previene por sí misma la
colonización. Hin47 es proteolítica y no puede utilizarse en las
formulaciones de proteínas. Una vacuna de combinación que comprende
los antígenos HMW y Hin47 no proteolítico pueden formularse para
proteger contra la enfermedad significativa por H.
influenzae, incluyendo la otitis media. La presente invención
proporciona dicha vacuna de la combinación.
La patente US nº 5.506.139 (Loosmore et
al.) describe la preparación de análogos de la proteína Hin47
de Haemophilus influenzae que presentan una disminución de la
actividad de la proteasa que es menor de aproximadamente el 10% del
de la proteína Hin47 natural y que preferentemente presenta
sustancialmente las mismas propiedades inmunógenas que la proteína
Hin47 natural. La patente también describe el aislamiento,
purificación y caracterización de las moléculas de ácido nucleico
que codifican los análogos de Hin47. La proteína Hin47 natural se
conserva inmunológicamente entre las cepas no tipificables y de tipo
b de H. influenzae. La secuencia de aminoácidos de la
proteína Hin47 natural y la secuencia de nucleótidos del gen
hin47 codificador se describen en el documento WO 94/00149
publicado el 6 de enero de 1994.
Los análogos de Hin47 de la patente US nº
5.506.139 se preparan eliminando o sustituyendo por un aminoácido
diferente, por lo menos un aminoácido del Hin47 natural que
contribuye a la actividad de la proteasa o insertando por lo menos
un aminoácido en la proteína Hin47 natural, como se describe
específicamente en la presente memoria. Por lo menos un aminoácido
eliminado o sustituido puede seleccionarse de entre los aminoácidos
195 a 201 de Hin47 y específicamente puede ser la
serina-197, que puede ser eliminada o sustituida por
alanina. Además, por lo menos un aminoácido eliminado o sustituido
puede ser His-91 y puede ser eliminado o sustituido
por alanina, lisina o arginina. Además, por lo menos un aminoácido
eliminado o sustituido puede ser Asp-121 y puede
ser eliminado o sustituido por alanina.
En la patente US nº 5.869.302, asignada al
cesionario de la misma, se describen múltiples mutaciones efectuadas
en diferentes aminoácidos de la proteína Hin47 natural para
proporcionar el análogo de Hin47 no proteolítico.
En la presente invención, la mutación de
histidina 91 en alanina (denominada a veces en la presente memoria
"H91A") se emplea como ilustración de la proteína Hin47
mutante, si bien pueden utilizarse otros mutantes de Hin47 con
actividad de proteasa reducida como los descritos en la patente
mencionada anteriormente y en la solicitud.
La preparación de la proteína HMW de manera
recombinante (rHMW) se describe en el documento WO 00/20609
mencionado anteriormente.
La composición de vacunas multicomponente es
crítica. Los componentes de la vacuna pueden ser compatibles y
pueden combinarse en proporciones apropiadas para impedir la
interferencia antigénica y optimizar algunas sinergias posibles. Si
se administra con otras vacunas implantadas, no deben interferir con
la protección proporcionada por la vacuna contra otra(s)
enfermedad(es).
En la experimentación específica realizada en la
presente memoria, se compararon varias relaciones de antígeno para
una vacuna de dos componentes H91A Hin47 + rHMW, en dos especies
animales. Se observó la interferencia antigénica aumentando las
cantidades de H91A Hin47 cuando se combinaban con una dosis baja de
rHMW, sin embargo, este efecto desapareció a dosis mayores de rHMW.
Hubo un efecto sinérgico observado para aumentar las cantidades de
rHMW en la respuesta primaria del anticuerpo a una dosis baja de
H91A Hin47 y H91A Hin47 mejoró la respuesta primaria a rHMW, si la
rHMW no estaba presente en baja dosis. Estos descubrimientos son
sorprendentes porque un solo antígeno (H91A Hin47) pueden ser tanto
sorprendentes como un efecto potenciador en el otro antígeno (rHMW)
dependiendo de la dosis de rHMW presente. Fue también sorprendente
que rHMW aumentasen la respuesta vigorosa del anticuerpo a H91A
Hin47, ya que es un inmunógeno más débil.
Con referencia a la Fig. 1, se ilustra la
respuesta inmunitaria en ratones al antígeno Hin47 de H91A de los
dos componentes H91A Hin47 + vacuna rHMW. Las valoraciones de
anticuerpo elevado se consiguen con todas las combinaciones de la
vacuna en la extracción de sangre final, pero para la respuesta
primaria a dosis baja de H91A Hin47, parece existir una diferencia
entre las muestras con y sin rHMW. En relación con la Fig. 2, se
ilustra los análisis estadísticos del efecto sinérgico observado en
la respuesta inmunitaria primaria a H91A Hin47, al aumentar las
cantidades de rHMW que se añaden a una dosis de 0,3 \mug de H91A
Hin47.
Con referencia a la Fig. 3, se ilustra la
respuesta inmunitaria en ratones al antígeno rHMW de los dos
componentes H91A Hin47 + vacuna rHMW. Las valoraciones de
anticuerpo elevado se consiguen en la extracción de sangre final
con todas las combinaciones de la vacuna excepto en las que
contienen la dosis más baja de rHMW. Parece existir una disminución
drástica en la respuesta al anticuerpo cuando la dosis mayor de rHMW
se combina con cantidades crecientes de H91A Hin47. En relación con
la Fig. 4, se ilustra el análisis estadístico del efecto sinérgico
efectuado en la respuesta inmunitaria primaria a una dosis de 10
\mug de rMHV combinada con cantidades crecientes de H91A
Hin47.
Con referencia a la Figura 5, se ilustra la
respuesta inmunitaria en cobayas para el componente Hin47 de H91A
de las vacunas de combinación de Hin47 de H91 A + rHMW. No existe
diferencia estadística en la respuesta de Hin47
anti-H91A a cualquiera de las vacunas. En relación
con la Fig. 6, se ilustra la respuesta inmunitaria en cobayas al
componente rHMW de las vacunas de la combinación H91A Hin47 + rHMW:
no existe diferencia estadística en la respuesta
anti-HMW a ninguna de las vacunas.
Con relación a la Fig. 7, se ilustra la
protección proporcionada por una vacuna de la combinación H91A Hin47
+ rHMW en el modelo de la prueba de provocación intravesicular de
la otitis media, en comparación con la proteína proporcionada por
el componente H91A Hin47 solo. Ambas vacunas son protectoras en
parte. Con relación a la Fig. 8, se ilustra la protección
proporcionada por una vacuna de la combinación H91A Hin47 + rHMW en
el modelo de colonización nasofaríngeo, en comparación con la
protección por el componente rHMW solo. Ambas vacunas son muy
protectoras.
En relación con la Fig. 9, se ilustra el perfil
de estabilidad de la vacuna H91A Hin47 + rHMW los días 0 y 14. Los
dos antígenos permanecen adsorbidos en la alúmina en el último punto
de tiempo y no se degradan.
Con relación a las Figs. 10A y 10B, se ilustra
la respuesta inmunitaria en cobayas, a los antígenos H91 A Hin47 y
rHMW de la vacuna de H. influenzae de dos componentes
proporcionada sola o administrada conjuntamente con Pentacel®
(toxoide diftérico + toxoide tetánico + polio tipo 1 + polio tipo 2
+ polio tipo 3 + PRP-T + vacuna contra la tos
ferina acelular compuesta de toxoide de la tos ferina +
hemoaglutinina filamentosa + pertactina de 69 kDa + aglutinógenos
estriados). Se ilustra asimismo la respuesta inmunitaria a los
antígenos de Pentacel® administrados solos o administrados
conjuntamente con la vacuna de H. influenzae de dos
componentes. No existe ningún efecto sinérgico o supresor
significativo de las vacunas multicomponentes administradas
conjuntamente.
En el documento WO 98/00167, asignado al
cesionario del mismo, se describen las formulaciones de
Pentacel®.
Determinados vectores que contienen el ácido
nucleico que codifica una proteína de alto peso molecular de una
cepa no tipificable de Haemophilus que se describen y se
refieren a la que se ha depositado en la presente memoria con la
American Type Culture Collection (ATCC) situada en 10801 University
Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados
Unidos, de acuerdo con el Tratado de Budapest y antes de la
presentación de la presente solicitud. Las muestras de los vectores
depositados estarán disponibles al público y todas las limitaciones
impuestas o el acceso a los depósitos se recibirán en el momento de
la concesión de una patente basada en la presente solicitud de
patente de Estados Unidos. Además, el depósito se sustituirá si las
muestras viables no pueden ser distribuidas por el depositario.
La exposición anterior describe de forma general
la presente invención. Una comprensión más completa puede
conseguirse con relación a los Ejemplos específicos siguientes.
Los métodos de genética molecular, bioquímica de
proteínas, tecnología de inmunología y fermentación utilizados,
pero no descritos de manera explícita en esta exposición y estos
Ejemplos, se divulgan ampliamente en la bibliografía científica y
están comprendidos dentro de la capacidad de los expertos en la
materia.
Este Ejemplo describe la preparación del
componente de la vacuna H91A Hin47.
El mutante H91A Hin47 se preparó como se
describe en la patente US nº 5.506.139. En resumen, se sintetizó un
oligonucleótido 5' ATCAATAACAGCATTATTGGT 3' (SEC. ID nº: 1) que
cambiaría el resto de histidina en la posición 91 en la proteína
Hin47 por una alanina (ref. 17).
El plásmido
JB-1276-1-2 es un
plásmido a base de pUC que contiene el gen T7/hin47 en un
fragmento EcoR I y se utilizó para clonar el gen
hin47 en M13mp18 para la mutagénesis dirigida al sitio con el
kit de mutagénesis dirigida al sitio in vitro de Amersham.
La preparación del plásmido
JB-1276-1-2 se
describe en la patente US nº 5.506.139. La mutación del codón de
His91 en Ala91 se confirmó por secuenciado local. El gen
hin47 mutante de H91 A se subclonó en pT7-7
para generar el plásmido DS-127-19
(Fig. 11).
El plásmido con expresión de H91A Hin47
(DS-1277-19) utiliza la selección de
ampicilina. Se clonó el gen hin47 de T7/H91A en pBR328 de
modo que pudo utilizarse la selección de tetraciclina. El vector
DS-1312-12 era por lo tanto un
plásmido a base de pBR328 que contenían las secuencias del gen
hin47 de T7/H91A entre las secuencias EcoR I y
Cla I, con los genes operativos con resistencia a la
ampicilina y tetraciclina y que contiene una repetición de las
secuencias Hind III-BamH I que se encuentran tanto en
pBR328 como en pEVvrfl.
Se construyó un nuevo plásmido basado en
DS-1312-12 que utiliza la selección
de kanamicina. En la Figura 11 se presenta el esquema de
construcción. Se digirió el ADN del plásmido procedente de
DS-1312-12 con Hind III
generando dos fragmentos. El fragmento mayor de 5,9 kb contenía un
gen tetR sin activador, el gen ampR y el gen hin47 de
T7/H91A y se volvió a ligar en el propio vector
DS-2140-3 de autocreación. Se
digirió el plásmido DS-2140-3 con
Pst I y el gen kanR procedente del plásmido
pUC-4K (P-L Biochemicals) se
insertó en la secuencia Pst I, generando el plásmido
DS-2150-1 que es kanR y
sensible tanto a la ampicilina como a la tetraciclina.
Se preparó el ADN del plásmido de
DS-2150-1 en 50 ml de cultivo
utilizando un protocolo basado en el procedimiento de Holmes y
Quigley (ref. 18) y que incluía extracciones con fenol y cloroformo.
Las células BL21 (DE3) de E. coli se hicieron
electrocompetentes de la forma siguiente. En resumen, se inocularon
10 ml de cultivo de toda la noche en 500 ml de medio YT y se
cultivaron las células a 37ºC con agitación hasta que alcanzaron
una A_{620}=0,540. Se enfrió el cultivo en hielo durante 30 min.,
se centrifugó a 5.000 rpm durante 15 min. y el sedimento celular se
volvió a poner en suspensión en 500 ml de agua esterilizada enfriada
en hielo. La suspensión celular se centrifugó como anteriormente y
el sedimento celular se volvió a poner en suspensión en 250 ml de
agua esterilizada enfriada en hielo. Se centrifugó la suspensión
celular de nuevo, y las células se volvieron a poner en suspensión
en 10 ml de glicerol al 10%. La suspensión de glicerol se
centrifugó, y las células se volvieron a poner en suspensión en 1,5
ml de glicerol al 10%, se tomaron alícuotas como muestras de 40
\mul y se almacenaron a -70ºC.
Una alícuota de las células BL21 (DE3)
electrocompetentes se descongeló en hielo y se añadieron
aproximadamente 9 ng de ADN de
DS-2150-1. Se incubaron las muestras
en hielo durante 3 min., a continuación se transfirieron a una
cubeta con electrodo Gene Pulser de BioRad y se sometieron a un
impulso eléctrico. Se añadieron 900 \mul de SOC y la mezcla se
transfirió a un tubo de cultivo donde se incubó a 37ºC durante 1
hora antes de colocarse en placas con YT agar-agar
que contenían 25 \mug/ml de kanamicina. La placa se incubó durante
la noche a 37ºC y se utilizaron colonias aisladas para los estudios
de expresión.
Se cultivaron clones aislados en medio NZCYM a
una A_{600 \ nm} de aproximadamente 0,3 y se añadió lactosa al 1%
para producir la expresión. Se cultivaron las células durante 4
horas, a continuación se recogieron y se analizaron por SDS PAGE.
Se seleccionó el clon
DS-2171-1-1 como
clon representativo que expresaba grandes concentraciones de H91A
Hin47.
La E. coli que contiene
DS-2171-1-1 se
cultivó en 2 matraces de 2 l que contenían 250 ml de ECGM (que
contenía 8 g/l de glucosa, pH 6,5) y se incubaron agitando a 37ºC
durante aproximadamente 9 horas en la oscuridad a 250 rpm. El
fluido del cultivo (2\times250 ml) se incubó en un fermentador de
10 l y se cultivó el cultivo a 37ºC. Después de aproximadamente 10
horas de incubación, se añade lactosa al 1% (concentración final)
para la inducción, seguido de 4 horas más de incubación.
El fluido de cultivo se recogió en botellas
esterilizadas de transferencia, se concentró y se filtró por
diálisis de filtración en flujo cruzado frente al tampón Tris/HCl
50 mM, pH 8,0. Se lisan las células en el concentrado utilizando un
homogeneizador a alta presión (2 pasadas a 15.000 psi) para liberar
la proteína Hin47 H91A. El residuo celular se eliminó por
centrifugación a 15.000 rpm durante 1,5 horas. El sobrenadante se
clarificó más por centrifugación y se filtró a través de un filtro
con extremo inactivo de 0,22 \mum. Los productos pueden
congelarse almacenados a -70ºC hasta el tratamiento posterior.
Se añadió cloruro sódico (NaCl) a la muestra
clarificada hasta una concentración final de 100 mM. La muestra se
purificó a continuación en una columna de cromatografía de
intercambio aniónico (TMAE-Fractogel) equilibrada
con Tris 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 100 mM. Se obtuvo la
proteína H91A Hin47 en flujo a través.
Se cargó la capa acuosa en una columna cerámica
de hidroxiapatito tipo 1 (CHTP-1) equilibrada con
tampón de fosfato sódico 10 mM pH 8,0. Se lavó a continuación la
columna con tampón de fosfato sódico 150 mM pH 8,0 y se eluyó Hin47
H91A con tampón de fosfato sódico 175 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 1
M.
La proteína purificada Hin47 H91A se concentró
utilizando una membrana del corte de peso molecular 10 kDa seguido
de diafiltración con aproximadamente 10 volúmenes de solución salina
tamponada con fosfato (PBS), pH 7,5.
La proteína purificada Hin47 H91A en PBS se pasó
a través de un adsorbedor con membrana Q600 sartobind. Después de
pasar la solución, se regeneró la membrana utilizando KCl 1,0 M/NaOH
1,0 M seguido de lavado con KCl 1 M y equilibrando a continuación
con PBS. Se repitió el proceso dos veces. La proteína Hin47 H91A
concentrada diafiltrada se esterilizó por filtración a través de un
filtro con membrana de 0,22 \mum. La proteína esterilizada Hin47
H91A se enriqueció con fosfato de aluminio. El concentrado
purificado adsorbido se diluyó para producir la masa adsorbida a
100 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la preparación del
componente de vacuna rHMW.
La producción y purificación de la proteína HMW
se ha descrito en la solicitud de patente US nº 09/167.568 en
trámite presentada el 7 de octubre de 1998.
En resumen, el plásmido pHMW1-15
(ref. 10) contiene una secuencia Xba I en la secuencia del
activador T7 y una única secuencia BamH I en la secuencia de
codificación de la proteína madura HMW1A de la cepa 12 no
tipificable de Haemophilus. El fragmento Xba
I-BamH I de 1,8 kb de pHMWI-15 se eliminó y
se sustituyó por un fragmento Xba I-BamHI de
aproximadamente 114 bp generado a partir de los oligonucleótidos.
El plásmido
DS-1046-1-1
resultante de 11,3 kb, por lo tanto contiene el activador T7 unido
en el marco con el operón hmw1ABC que codifica la proteína
madura HMW1A de 125 kDa (Fig. 11).
El plásmido
DS-1046-1-1 contiene
el casete del gen hmw1ABC de T7 y tiene una secuencia única
Bgl II fuera de la zona de codificación del gen HMW1A
maduro. El plásmido
DS-2224-1-4 contiene
el gen cer de E. coli situado en un fragmento de
BamH I. Se aisló este fragmento y se ligó en la secuencia
Bgl II del plásmido
DS-1046-1-1 para
producir el plásmido BK-35-4 (Fig.
11). El casete con resistencia a la kanamicina fue escindido de pUC
4K por la restricción Sal I y se ligó en el plásmido
BK-35-4 restringido por Sal
I para producir el plásmido
BK-76-1-1.
Se introdujeron los plásmidos en las células
BL21 (DE3) de E. coli por electroporación utilizando un
aparato con BioRad. Se cultivaron las cepas a 37ºC en medio NZCYM a
una densidad óptica de A_{578}=0,3, a continuación fueron
inducidas mediante la adición de lactosa al 1,0% durante 4 horas.
Las muestras se ajustaron a una D.O. 0,2/\mul con lisis por
SDS-PAGE + tampón de carga y se cargó la misma
cantidad de muestra de proteína en los geles de
SDS-PAGE.
La proteína recombinante HMW se expresó como
cuerpos de inclusión en E. coli, y se purificaron por el
mismo procedimiento (Figura 12). Los sedimentos de las células de
E. coli procedentes de 500 ml de cultivo se volvieron a
poner en suspensión en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH
8,0, que contenía NaCl 0,1 M y se descompusieron por tratamiento
con ultrasonidos. El extracto se centrifugó a 20.000 g
durante 30 min y se descartó el sobrenadante resultante. Se extrajo
más el sedimento, en 50 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0
que contenía Triton X-100 al 0,5% y EDTA 10 mM, a
continuación se centrifugó a 20.000 g durante 30 min. y se
descartó el sobrenadante. Se continuó extrayendo el sedimento en 50
ml de Tris-HCl 50 mM, que contenía octilglucósido al
1%, a continuación se centrifugó a 20.000 g durante 30 min.
y se descartó el sobrenadante.
El sedimento resultante, obtenido después de las
extracciones anteriores, contiene los cuerpos de inclusión. El
sedimento se solubilizó en 6 ml de Tris-HCl 50 mM,
pH 8,0, que contenía guanidina 6 M y DTT 5 mM. Se añadieron doce ml
de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 a esta solución y la
mezcla se centrifugó a 20.000 g durante 30 min. El
sobrenadante se precipitó con polietilenglicol (PEG) 4.000 a una
concentración final del 7%. El sedimento resultante se eliminó por
centrifugación a 20.000 g durante 30 min. y se precipitó el
sobrenadante con (NH_{4})_{2}SO_{4} a una saturación
del 50%. Después de la adición de (NH_{4})_{2}SO_{4},
la solución experimentó la separación de fases yendo la proteína a
la fase superior, que se sometió continuación a centrifugación a
20.000 g durante 30 min. El sedimento resultante se disolvió
en 2 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía
guanidina HCl 6 M y DTT 5 mM y la solución transparente se purificó
en una columna de filtración con gel Superdex 200 equilibrada en
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía guanidina HCl 2
M. Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y las
que contenían la rHMW1 purificada se agruparon y se dializaron
durante la noche a 4ºC frente a PBS, a continuación se
centrifugaron a 20.000 g durante 30 min. La proteína
permaneció soluble en estas condiciones y se añadió glicerol a la
preparación de rHMW1 a una concentración final del 20% para
almacenamiento a -20ºC.
La concentración del componente de la vacuna
rHMW se ajustó a 400 \mug ml^{-1} en PBS (pH 7,3) y se
enriqueció con fosfato de aluminio hasta una concentración final de
3 mg ml^{-1}. Se prepararon diferentes dosis diluyendo la
solución madre con 3 mg ml^{-1} de fosfato de aluminio en PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la combinación de H91A
Hin47 y rHMW como una vacuna de dos componentes.
Se prepararon las vacunas que comprendían
combinaciones de H91A Hin47 y rHMW como se publica en la Tabla II
siguiente:
Se combinaron los componentes de la vacuna el
día 0, se mezclaron durante la noche a 4ºC y se tomaron alícuotas
el día 1. Las vacunas combinadas se almacenaron a 4ºC durante todo
el periodo de inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe el análisis de la
inmunogenicidad de las vacunas multicomponentes en animales.
Se inmunizaron por vía subcutánea (s.c.) grupos
de cinco ratones BALB/c (Charles River, Quèbec) los días 1, 29 y 43
con una de las vacunas para ratón descritas en el Ejemplo 3. Se
extrajeron muestras de sangre los días 0, 14, 28, 42 y 56.
Se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.)
grupos de 5 cobayas Hartley destetados (Charles River, Quèbec) los
días 1, 29 y 43 con una de las vacunas para cobayas descrita en el
Ejemplo 3. Se extrajeron muestras de sangre los días 0, 14, 28, 42
y 56.
Se determinaron los títulos de anticuerpo de IgG
de Hin47 anti-H91A y de anti-rHMW
por ensayos de inmunosorbente con enzima ligada (ELISA). Se
cubrieron pocillos de microvaloración (NuncMAXISORB, Nunc,
Dinamarca) con 50 \mul de solución de proteínas (0,4 \mug
ml^{-1} para H91A Hin47 o 0,4 \mug ml^{-1} para rHMW). Los
anticuerpos secundarios utilizados eran fragmentos F (ab')_{2} de
anticuerpos IgG anti-ratón de cabra purificados por
afinidad (específicos para Fc) o IgG de anticobaya (específicos para
Fc) conjugados con peroxidasa de rábano picante (Jackson
ImmunoResearch Labs, Mississauga, Ontario). Las reacciones se
desarrollaron utilizando tetrametilbencidina (TMB/H2O2, ADI,
Mississauga, Ontario) y se midieron las absorbancias a 450 nm
(utilizando 540 nm como longitud de onda de referencia) en un
lector de microplacas Flow Multiskan MCC (ICN Biomedicals,
MIssissauga, Ontario). El título reactivo de un antisuero se definió
como la recíproca de la dilución que presenta continuamente un
aumento al doble de la absorbancia sobre el obtenido con la muestra
de suero preextraído.
En las Figuras 1 a 6 se ilustran los resultados
de los estudios de inmunogenicidad. Como se muestra en la Figura 1,
los sueros finales extraídos obtenidos de ratones inmunizados con
0,3, 1,0 ó 3,0 \mug de H91 A Hin47 tenían todos títulos de
anticuerpo elevados para H91 A Hin47, con independencia de la
cantidad de rHMW presente (0 a 10 \mug). Sin embargo, existe una
diferencia estadísticamente significativa en las respuestas
primarias de Hin47 anti-H91A. Como se muestra en la
Figura 2, existe un aumento de la respuesta primaria para H91A
Hin47 en presencia de cantidades crecientes de rHMW. Estos
descubrimientos son sorprendentes e indican que rHMW está
presentando un efecto sinérgico en la respuesta inmunitaria primaria
a H91A Hin47.
Como se muestra en la Figura 3, los sueros
finales extraídos de la sangre extraída de ratones inmunizados con
1, 3 ó 10 \mug de rHMW tenían todos un título de anticuerpo
elevado para rHMW, independientemente de la cantidad de H91A Hin47
presente (0 a 3 \mug). Sin embargo, a la dosis inferior de rHMW
(0,3 \mug), existe una inhibición estadísticamente significativa
de la respuesta inmunitaria a rHMW con cantidades crecientes de
H91A Hin47 añadidas. Este descubrimiento es sorprendente y sugiere
que H91 A Hin47 actúa como supresor inmunitario a bajas dosis de
rHMW. Por el contrario, a la dosis mayor de rHMW (10 \mug), la
adición de H91A Hin47 aumenta de manera significativa la respuesta
inmunitaria a rHMW (Fig. 4). Estos descubrimientos en los ratones,
indican que cantidades relativas de los dos componentes, H91A Hin47
y rHMW son críticas para obtener una buena respuesta inmunitaria a
ambos
antígenos.
antígenos.
A partir de los datos presentados en la presente
memoria, parecería que aproximadamente de 3 a aproximadamente 10
\mug de rHMW, más preferentemente aproximadamente 10 \mug,
presentan el efecto aumentado con aproximadamente 1 a
aproximadamente 3 \mug de H91 A Hin47.
La Figura 5 presenta los títulos de anticuerpo
de Hin47 anti-H91A obtenidos en cobayas. La adición
de rHMW no ejerce efecto sobre los títulos de anticuerpo de Hin47
anti-H91A. Asimismo, la adición de H91A Hin47 no
ejerce ningún efecto sobre los títulos de anticuerpo
anti-rHMW en cobayas (Fig. 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe la capacidad protectora de
una vacuna multicomponente en modelos de animal de la
enfermedad.
H91A Hin47 es parcialmente protectora en el
modelo de chinchilla de otitis media, tal como se describió en la
patente US nº 5.506.139 mencionada anteriormente. En este modelo, se
inmunizan i.m. chinchillas de 1 a 2 años (Moulton Chinchilla Ranch,
Rochester, Minnesota) los días 0, 14 y 28 con 30 \mug de H91A
Hin47 adsorbida en alúmina, y se sometieron a la prueba de
provocación el día 44 con 50 a 350 cfu de los organismos vivos
administrados en el espacio del oído medio a través de la vesícula
epitimpánica (ref. 11). Los animales se controlan por timpanometría
y se recoge el fluido del oído medio 4 días después de la prueba de
provocación, se mezcla con 200 \mul de medio BHI y las diluciones
se colocan en placas de agar-agar con chocolate que
se incuban durante 24 h a 37ºC. Los animales convalecientes o los
pseudoinmunizados con alúmina sola, se utilizan como referencias.
Para el estudio de la vacuna multicomponente, se mezclan 50 \mug
de H91A Hin47 con 50 \mug de rHMW como se describe en el Ejemplo
3 y las chinchilla se inmunizaron tal como se describió. Los
resultados del estudio de protección se presentan en la Figura 7 que
indican que existe una protección parcial proporcionada en el
modelo de la prueba de provocación intravesícular mediante la
combinación de H91 A Hin47 - rHMW.
Se ha demostrado en chinchillas jóvenes que la
colonización nasofaríngea con H. influenzae no tipificable
conduce a otitis media (ref. 14). rHMW es parcialmente protectora en
un modelo de prueba de provocación de colonización nasofaríngea de
chinchilla, descrito en el documento WO 00/20609 mencionado
anteriormente. En este modelo, se inmunizan i.m. animales los días
0, 14 y 28 con 25, 50 ó 100 \mug de rHMW adsorbida en alúmina, y
la prueba de provocación el día 44 con 10^{8} cfu de bacterias
vivas suministradas por vía intranasal (50 \mul por los
orificios
nasales).
nasales).
El lavado nasofaríngeo se realiza 4 días después
de la prueba de provocación utilizando 1 ml de solución salina
esterilizada como lavado. Se colocan 25 \mul de lavado en
agar-agar con chocolate en presencia de
estreptomicina y las placas se incuban a 37ºC durante 24 h. (La
cepa de la prueba de provocación se hizo resistente a la
estreptomicina por atenuación en serie, a fin de facilitar la
cuantificación de las bacterias recuperadas en presencia de la
flora natural que es destruida por la estreptomicina). Los animales
convalecientes o los que fueron pseudoinmunizados con alúmina sola,
se utilizan como referencias. Para el estudio de la vacuna
multicomponente, se mezclaron 50 \mug de rHMW con 50 \mug de H91
A Hin47 como se describe en el Ejemplo 3 y se inmunizaron las
chinchillas tal como se describe. Los resultados del estudio de
protección se presentan en la Figura 8 que indica que existe
todavía excelente protección proporcionada en el modelo de la prueba
de provocación de colonización nasofaríngea mediante la combinación
de H91A Hin47 + rHMW.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo describe el análisis de la
estabilidad de la vacuna de dos componentes.
La H91A Hin47 adsorbida (400 \mug de proteína
+ 3 mg de fosfato de aluminio por ml) y rHMW (400 \mug de
proteína + 3 mg de fosfato de alúmina por ml) se mezclaron 1:1 hasta
una concentración final de 100 \mug de cada proteína + 3 mg de
fosfato de alúmina por ml como se describe en el Ejemplo 3. Las
proteínas H91A Hin47 y rHMW adsorbidas de forma individual se
ajustaron también a una concentración final de 100 \mug de
proteína + 3 mg de fosfato de aluminio/ml. Las muestras se
almacenaron a 4ºC y se tomaron alícuotas de 0,5 ml el día 0 y cada
dos semanas para análisis por SDS-PAGE. Se
microcentrifugaron las alícuotas a 10.000 rpm durante 10 min para
separar el sobrenadante del sedimento de alúmina. Se disolvió el
sedimento en tampón de muestra de SDS-PAGE y el
sobrenadante se precipitó en primer lugar con acetona, después se
disolvió en tampón de muestra de SDS-PAGE. Se
analizaron cantidades equivalentes de sobrenadante y sedimento
suponiendo que la proteína se adsorbía al 100% o no se adsorbía. En
la Fig. 9 se presentan los resultados del estudio de estabilidad
los cuales indican que después de dos semanas, no existe degradación
de las proteínas y ambas son todavía completamente adsorbidas en la
alúmina.
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo ilustra la respuesta inmunitaria
para administración conjunta de la vacuna de H. influenzae
de dos componentes con Pentacel®.
Se inmunizaron i.m. grupos de 5 cobayas Hartley
(Charles River, Quèbec) los días 1 y 21 con una vacuna de dos
componentes H91A Hin47 + rHMW, vacuna Pentacel (vacuna comercial de
Connaught Laboratories Limited que contiene PT + FHA + 69 kDa +
Aggs en pesos de 20:20:5:3 \mug; toxoide diftérico a 15 Lf;
toxoide tetánico a 5 Lf; IPV que contiene los tipos 1, 2 y 3 de
poliovirus inactivado a 40, 8 y 32 unidades de
D-antígeno respectivamente; 10 \mug de conjugado
PRP-T de polisacárido de tipo B de H.
influenzae conjugado con toxoide tetánico a 20 \mug) o vacuna
de dos componentes H91A Hin47 + rHMW + Pentacel. La vacuna de dos
componentes contenía 50 \mug de cada uno de H91 A Hin47 y rHMW.
Los animales recibieron las vacunas de dos componentes + Pentacel
se les inyectó en ambas ijadas. Se extrajeron muestras de sangre el
día 1, antes de la inyección y después el día 28.
Se determinaron los títulos de anticuerpo IgG
anti-H91A Hin47 y anti-rHMW por
ELISA como se describe en el Ejemplo 4. Los títulos de anticuerpo
IgG del componente anti-Pentacel fueron determinados
por ELISA, esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 4. Se
recubrieron placas de microvaloración con 5 \mug ml^{-1} de
antígeno para PT, FHA 69 kDa, Aggs y PRP; la dilución 1/20 de 2,5
Lf ml^{-1} para toxoide diftérico; 1,3 Lf ml^{-1} de toxoide
tetánico; dilución 1/50 de 25,6 EU ml^{-1} de polio tipo 1; o
dilución 1/50 de 15,1 EU ml^{-1} de polio tipo 2. No pudo
demostrarse una relación de señal a ruido para la polio tipo 3. El
anticuerpo secundario utilizado fue fragmentos
F(ab)_{2} de IgG (H+L) anticobaya de mono conjugado
con peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research Labs).
Las referencias negativas fueron los sueros preextraídos o el
antisuero contra un antígeno irrelevante del RSV. Los resultados se
observan en las Figuras 10A y 10B.
En el sumario de esta exposición, la presente
invención proporciona una vacuna multicomponente contra
Haemophilus influenzae que presenta un amplio espectro de
eficacia y que comprende dos antígenos diferentes de Haemophilus
influenzae como se ha descrito anteriormente.
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Claims (9)
1. Composición inmunógena para conferir
protección en un huésped contra la enfermedad producida por
Haemophilus influenzae, que comprende:
- 25 a 100 \mug de un análogo de la proteína Hin47 de Haemophilus influenzae que presenta una actividad de proteasa disminuida que es inferior a aproximadamente 10% de la de la proteína Hin47 de tipo salvaje, y 25 a 100 \mug de una proteína de alto peso molecular (HMW) de una cepa de Haemophilus influenzae no tipificable.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho análogo de la proteína Hin47 es aquel en el que por lo
menos un aminoácido de la proteína Hin 47 de tipo salvaje que
contribuye a la actividad de proteasa se ha eliminado o sustituido
por un aminoácido diferente y que tiene sustancialmente las mismas
propiedades inmunógenas que la proteína Hin47 de tipo salvaje.
3. Composición según la reivindicación 2, en la
que dicho por lo menos un aminoácido se selecciona de entre los
aminoácidos 91, 121 y 195 a 201 de la proteína Hin47 de tipo
salvaje.
4. Composición según la reivindicación 2, en la
que dicho análogo de la proteína Hin47 es aquel en el que la
serina-197 se sustituye por alanina; la
histidina-91 se sustituye por alanina, o por lisina
o arginina; o Asp-121 se sustituye por alanina.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha proteína HMW es una proteína
HMW1 o HMW2 de una cepa no tipificable de Haemophilus
influenzae, produciéndose dicha proteína HMW de manera
recombinante o de otra manera.
6. Composición según la reivindicación 5, en la
que dichas proteínas HMW1 y HMW2 proceden de las cepa respectiva de
Haemophilus influenzae no tipificable y poseen los pesos
moleculares respectivos indicados a continuación:
7. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores y que comprende hidróxido de aluminio,
fosfato de aluminio u otro adyuvante.
8. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores y que comprende como por lo menos un
componente antigénico adicional para conferir protección contra la
infección producida por otro patógeno, (i) toxoide diftérico, (ii)
toxoide tetánico, (iii) toxoide de la tos ferina, hemoaglutinina
filamentosa, pertactina y aglutinógenos; (iv) poliovirus no
virulento; (v) PRP-T o (vi) uno o varios otros
compuestos antigénicos para conferir dicha protección.
9. Composición inmunogénica según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores para su utilización como vacuna.
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