ES2272296T3 - Grupos de borrelia burgdorferi que producen la enfermedad de lyme en humanos. - Google Patents
Grupos de borrelia burgdorferi que producen la enfermedad de lyme en humanos. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende uno o más excipientes, adyuvantes, tampones, proteínas portadoras o conservantes o una combinación de los mismos y un agente inmunógeno, en la que el agente inmunógeno está constituido por uno o más polipéptidos OspC de cada una de las familias de OspC de Borrelia burgdorferi que se seleccionan del grupo formado por: A, B, I y K, en la que la familia A de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029860 y genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank AF029860, la familia B de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029861 y genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank AF029861, la familia I de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029869 y genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank AF029869 y la familia K de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de GenBank U08284 y genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank U08284.
Description
Grupos de Borrelia burgdorferi que
producen la enfermedad de Lyme en humanos.
La enfermedad de Lyme se inicia en el lugar de
una picadura de garrapata, produciendo una infección primaria en la
que el organismo se extiende a zonas secundarias al principio del
transcurso de la infección. La enfermedad de Lyme es un trastorno
multisistémico progresivo y es la enfermedad más común propagada por
vectores tanto en América del norte como en Europa. Esta enfermedad
se describió inicialmente como foco de los pacientes de artritis
pediátrica en Old Lyme, CT (Steere, A.C., y cols., Arth.
Rheum. 20:17 (1977)). La asociación de este syndrome con la
picadura de la garrapata de venado, Ixodes scapularis, llevó
a la identificación de la espiroqueta Borrelia burgdorferi
comoagente causante (Burgdorfer, W., y cols., Science,
216:1317-1319 (1982)). Al hacerse más eficaz el
aislamiento de la bacteria en los cultivos de muestras clínicas y de
campo, Baranton y colaboradores describieron tres genoespecies
patógenas, B. burgdorferi en sentido estricto B.
burgdorferi o B.b.s.s.), B. afzelii, y B.
garinii (Baraton, G., y cols., Int. J. Syst. Bacteriol.
42:378-383 (1992)). Éstas son miembros de un
complejo de especies, B. burgdorferi en el sentido amplio,
que está formado al menos por 10 genoespecies diferentes (Piken,
R.N., y cols., J. Invest. Dermatol.,
110:211-214 (1998); Postic, D., y cols., Int. J.
Syst. Bacteriol. 44:743-752 (1994);
Valsangiacomo, C.T., y cols., Int. J. Syst. Bacteriol.
47:1-10 (1997)). Se cree que B. Burgdorferi, B.
afzelii y B. garinii son todas patógenas y todas se encuentran
en Europa, pero B. burgdorferiis es la única genoespecie
patógena que se encuentra en América del norte. Cada una de estas
tres genoespecies está asociada a manifestaciones clínicas
diferenciadas (Van Dam, A. P. y cols., Clin. Infect. Dis.
17:708-717 (1993)). Esto implica que las diferencias
entre las genoespecies pueden desempeñar un papel importante en el
amplio espectro de manifestaciones clínicas que se observan en la
enfermedad de Lyme.
Cuando una garrapata infectada empieza a
alimentarse de un mamífero, se induce la síntesis de la proteína C
de la superficie exterior (OspC) (Schwan, T.G., y cols., Proc.
Natl. Acad. Sci. 2:2909-2913 (1995)). Así, al
inicio de la infección, OspC es la principal proteína de la membrana
exterior expresada por la espiroqueta (Fung. B.P., y cols.,
Infect. Immun. 62:3213-3221 (1994); Padula,
S.J., y cols., J. Clin. Microbiol.,
32:1733-1738 (1994)). Aunque se ha demostrado que
OspC tiene una exposición superficial limitada (Cox, D.L., y cols.
Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7973-7978 (1996);
Mathiesen, M. M. y cols., Infect. Immun.
66:4073-4079 (1998)), OspC es un inmunógeno potente.
La inmunización con OspC protege contra la infección por
Borrelia trasmitida por garrapatas (Gilmore Jr., R.D.,
Infect Immun. 64:2234-2239 (1999)). Sin
embargo, debido a que OspC es muy variable en su secuencia, la
protección se limita a la cepa de Borrelia burgdorferi que
expresa el mismo OspC inmunizador que codifica un alelo específico.
La exposición a cepas aisladas heterólogas, que expresan otros
alelos de ospC produce la infección (Probert, W.S., y cols.,
J. Infect. D., 175:400-405 (1997)). OspC es
muy diverso (Jauris-Heipke, S., y cols., Med.
Microbiol. Immunol. 182:37-50 (1993)). Livey y
cols. encontraron treinta y cuatro alelos en setenta y seis cepas
aisladas de B. burgdorferi en sentido amplio (Livey, I., y
cols., Mol. Microbiol. 18:257-269
(1995)).
Actualmente, la enfermedad de Lyme se trata con
antibióticos. Sin embargo tal tratamiento no siempre tiene éxito
para eliminar la infección. El tratamiento a menudo se retrasa
debido a un diagnóstico inadecuado con el efecto perjudicial de que
la infección progresa a una afección crónica, en la que el
tratamiento con antibióticos a menudo no es útil. Uno de los
factores que contribuyen al retraso en el tratamiento es la carencia
de herramientas de diagnóstico eficaces.
Además, aunque se sabe que los antígenos tales
como OspC son protectores, en algunos casos, la existencia de alelos
múltiples de estos antígenos entorpece mucho el desarrollo de
vacunas basadas en tales antígenos que protegerían contra más de una
cepa de Borrelia. Recientemente dos ensayos independientes de
vacunas de primera generación para la prevención de la enfermedad de
Lyme, han estudiado la eficacia y seguridad de una vacuna basada en
la proteína A de la superficie exterior recombinante (OspA) (Sigal,
L.H. y cols., N. Engl. J. Med.
339:216-222,1998; Steere, A.C. y cols., N. Engl.
J. Med. 339:209-215, (1998)). Sin embargo, una
vacuna formada por OspA recombinante puede necesitar frecuentes
inmunizaciones de refuerzo. La infección natural por B.
burgdorferi no provoca una respuesta de anticuerpos contra OspA,
al contrario que contra OspC. Lo que se necesita es una selección de
antígenos de Borrelia que pueda usarse para diagnosticar o
vacunar contra todas o la mayor parte de las formas de
Borrelia que provocan la enfermedad sistémica.
Las diferencias entre la frecuencia de B.
burgdorferi, B. garinii, y B. afzelii en las garrapatas y
en la infección en seres humanos ha llevado a la hipótesis de que
las diferentes genoespecies son patógenas de forma diferenciada
(Picken, R.N. y cols., J. Invest. Dermatol.
110:211-214, 1998; Van Dam, A.P. y cols., Clin.
Infect. Dis. 17:708-717. 1993). Sin embargo, el
número de cepas diferentes en una genoespecie dada y las diferencias
entre las cepas de una genoespecie dada, así como entre
genoespecies, obstaculizan el desarrollo de compuestos proteínicos
inmunógenos para usar como agentes de diagnóstico y vacunación en la
detección, prevención y el tratamiento de la enfermedad de Lyme. Un
número de investigadores han usado OspC como antígeno de
serodiagnóstico para la enfermedad de Lyme temprana (Fung, B.P. y
cols., Infect. Immun. 62:3213-3221, 1994;
Gerber, M.A. y cols., J. Infect. Dis.
171:724-727,1995; Padula, S.J. y cols., J. Clin.
Microbiol. 32:1733-1738, (1994)). En estas
pruebas, el uso de OspC como antígeno de diagnóstico arrojó
resultados muy específicos pero no sensibles. Sin embargo, estos
estudios incluyeron únicamente la cepa B. burgdorferi y por
lo tanto sólo un tipo de OspC. Las pruebas rutinarias para el
diagnóstico de la enfermedad de Lyme también usan un protocolo de
cepa única y por lo tanto un único alelo de OspC para la detección
de anticuerpos contra la espiroqueta. No está claro qué mezcla de
proteínas OspC debe usarse para preparar unas herramientas de
diagnóstico y vacunación útiles, eficaces contra más de una de las
cepas de Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme, o
contra la mayoría, o contra todas, las cepas invasoras de una
genoespecie. Preferiblemente, tal mezcla sería eficaz contra todas
las cepas invasoras de Borrelia que provocan la enfermedad de
Lyme.
El documento WO 94/25596 describe una estrategia
de formulación de vacuna contra Borrelia tomando en cuenta la
información serológica, genotípica y epidemiológica por la que se
agrupan las proteínas OspC de cepas diferentes de B.
burgdorferi. Los antígenos OspC se eligen para que constituyan
una muestra representativa de los grupos, de forma que la vacuna
resultante proporciona la mayor protección cruzada con el menor
número de antígenos.
La presente invención se refiere a una
composición de vacuna que comprende polipéptidos OspC de bacterias
Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme tal como se
reivindica en la reivindicación 1 y en las reivindicaciones
5-6. En otro aspecto la invención se refiere a un
procedimiento para detectar en una muestra de un huésped una
respuesta inmunitaria contra Borrelia asociada a la
enfermedad de Lyme tal como se reivindica en la reivindicación 7.
Las características preferidas del procedimiento se definen en las
reivindicaciones 6-9. En un aspecto adicional, la
invención se refiere a una proteína quimérica tal como se reivindica
en la reivindicación 10. Las características preferidas de la
proteína se definen en las reivindicaciones 11-13.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ácido nucleico
aislado tal como se reivindica en la reivindicación 14. Las
características preferidas del ácido nucleico se definen en las
reivindicaciones 15-16. En un aspecto adicional, la
invención se refiere a la composición que se reivindican en la
reivindicación 17. La composición que se describe en la presente
memoria comprende un polipéptido OspC o fragmento del mismo de al
menos dos familias de OspC de Borrelia burgdorferi que se
seleccionan del grupo formado por A, B, I y K, las características
preferidas de la vacuna se definen en las reivindicaciones
2-3. En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de una composición para la fabricación de un medicamento para
inmunizar a un animal contra la enfermedad de Lyme diseminada. Se
definen las características preferidas de uso. La composición que se
describe en la presente memoria comprende al menos un polipéptido
OspC o fragmento del mismo de cada una de las familias A y B de OspC
de Borrelia afzelii.
También se describe un procedimiento para
inmunizar a un animal contra la enfermedad de Lyme, que comprende
administrar una composición que comprende polipéptidos OspC de
bacterias Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme.
También se describe una composición que comprende un polipéptido
OspC o un fragmento del mismo de al menos dos familias de OspC de
Borrelia burgdorferi que se seleccionan del grupo formado
por: A, B, I y K, a excepción de la combinación formada por dos
proteínas OspC, en la que una proteína OspC es de la familia A de
OspC y la segunda proteína OspC es de la familia I de OspC. También
se describe una composición que comprende al menos un polipéptido
OspC o un fragmento del mismo de cada una de las familias A y B de
OspC de Borrelia afzelii. Las composiciones que se describen
en la presente memoria junto con excipientes y/o adyuvantes
adecuados se administra a un animal de tal forma que el animal
desarrolle una respuesta inmunitaria contra al menos un polipéptido
OspC de la composición.
También se describe un procedimiento para
detectar una respuesta inmunitaria contra bacterias Borrelia
que provocan la enfermedad de Lyme en una muestra de un huésped. El
procedimiento comprende poner en contacto una muestra de un huésped
con una composición que comprende polipéptidos OspC de cepas de
Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme, de tal forma que
los anticuerpos contra OspC, en dicha muestra, si estuvieran
presentes, se unen a dichos polipéptidos OspC. La composición
comprende al menos un polipéptido OspC o un fragmento del mismo de
cada una de las familias A, B, I y K de OspC de Borrelia
burgdorferi. Se mide la cantidad de anticuerpos que tienen
dichos polipéptidos OspC o fragmentos de los mismos unidos;
detectando así una respuesta inmunitaria contra bacterias
Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme.
También se describe un kit de diagnóstico que
comprende polipéptidos OspC de bacterias Borrelia que
provocan la enfermedad de Lyme. El kit de diagnóstico comprende al
menos un polipéptido OspC o un fragmento de diagnóstico del mismo de
cada una de las familias A, B, I y K de OspC de Borrelia
burgdorferi. De forma alternativa, la composición de diagnóstico
comprende al menos un polipéptido OspC o un fragmento de diagnóstico
del mismo de cada una de las familias A y B de OspC de Borrelia
afzelii.
También se describe una composición que
comprende al menos un polipéptido OspC o un fragmento del mismo de
cada una de las familias A y B de OspC de Borrelia afzelii.
También se describen composiciones que comprenden polipéptidos OspC
o sus fragmentos de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii,
Borrelia garinii y sus combinaciones.
También se describen proteínas quiméricas para
usar en los procedimientos que se describen en la presente memoria.
Se describen proteínas quiméricas que comprenden polipéptidos OspC
de dos o más familias de OspC de bacterias Borrelia que
provocan la enfermedad de Lyme. Las familias pueden comprender las
familias de OspC A, B, I y K de Borrelia burgdorferi. De
forma alternativa, las familias comprenden las familias A y B de
OspC de Borrelia afzelii. De forma alternativa, la
composición comprende polipéptidos quiméricos de OspC o sus
fragmentos de Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia
garinii y sus combinaciones.
Las proteínas quiméricas que se describen en la
presente memoria comprenden al menos un primer y un segundo
polipéptido de OspC, de tal forma que el primer polipéptido
comprende OspC desde aproximadamente la base 26 hasta
aproximadamente la base 630 de un primer gen ospC y el
segundo polipéptido comprende desde aproximadamente la base 28 hasta
aproximadamente la base 570 de un segundo gen ospC. Las
proteínas quiméricas que se describen en la presente memoria pueden
usarse en los procedimientos de inmunización y detección que se
describen en la presente memoria.
En la presente memoria se describe el número
mínimo de familias de Borrelia burgdorferi y Borrelia
afzelii que son responsables de la enfermedad sistémica en los
seres humanos y es útil para vacunas y kits de diagnóstico. En la
presente memoria se describe una combinación de proteínas que,
cuando se usa como vacuna, evita que la enfermedad de Lyme se
convierta en sistémica. Las proteínas y proteínas quiméricas que se
describen en la presente memoria pueden ser eficaces en la
prevención de la enfermedad de Lyme así como tener un efecto
terapéutico sobre la infección establecida, por ejemplo después de
que el paciente nota la picadura de la garrapata. Las proteínas y
proteínas quiméricas que se describen en la presente memoria se
espera que actúen a nivel de la garrapata así como al nivel del
huésped en la prevención tanto de la infección como de la enfermedad
debida a Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii y/o
Borrelia garinii. La descripción de la presente memoria
permite desarrollar una vacuna a nivel mundial que comprende sólo
seis proteínas necesarias para generar una respuesta inmunitaria
contra todas.
También se describen herramientas de diagnóstico
mejoradas. Ahora es posible preparar herramientas de diagnóstico,
que comprenden antígenos de OspC que representan las cuatro familias
patógenas de Borrelia burgdorferi y/o las dos familias
patógenas de Borrelia afzelii, que detectan así la exposición
clínicamente importante a bacterias patógenas y a la vez pasan por
alto las familias que no provocan la enfermedad patógena.
Tal como se demuestra en la presente memoria,
una proporción significativa, si no todas, las infecciones
sistémicas por B. burgdorferi en sentido estricto en seres
humanos se asocian a cuatro grupos de ospC y una porción
significativa, si no todas, las infecciones sistemáticas por B.
afzelii en seres humanos se asocian a dos grupos de ospC.
Se sabe que las vacunas contra OspC son protectoras, pero son
limitadas debido a la diversidad de ospC (Probert, W.S. y
cols., J. Infect. D. 175:400-405, (1997)).
Los polipéptidos que se describen en la presente memoria
proporcionan proteínas, sus fragmentos y proteínas quiméricas
inmunógenos para vacunas y diagnósticos muy protectores. Se describe
una vacuna que incluye una o más de estas cuatro formas de OspC. La
vacunas deberían ser un segundo nivel importante de protección
contra la infección diseminada de la espiroqueta B.
burgdorferi. Además, los análisis del polimorfismo
conformacional de cadena única (SSCP) que se describen en la
presente memoria pueden proporcionar una herramienta rápida y
poderosa para controlar la eficacia de las vacunas al detectar
grupos ospC invasivos raros o nuevos.
Los nuevos ensayos de diagnóstico de la presente
invención, basados en los grupos de ospC principales A, B, I
y K son útiles para identificar a los que presentan riesgo de
padecer una enfermedad progresiva. Dado que las proteínas OspC son
antigénicamente variables, los individuos infectados con una cepa
pueden producir una respuesta de anticuerpos que no reaccionan con
una proteína OspC de un grupo principal diferente. La detección de
anticuerpos usando preparaciones de antígenos, que incorporan una
mezcla adecuada de clones invasores de B. burgdorferi serán
mucho más sensibles que los presentes protocolos de cepa única. Las
composiciones que se describen en la presente memoria no solo
provocan respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células,
sino que las composiciones también son capaces de detectar tanto
respuestas inmunitarias humorales como las mediadas por células
cuando se usan para analizar una muestra de un huésped.
Se describen tanto los polipéptidos OspC
lipidados, como sus fragmentos y las proteínas quiméricas que
comprenden dos o más polipéptidos OspC, en los que la proteína
quimérica tiene una señal de lipidación, tal como la señal de
lipidación de las proteínas B de la superficie exterior en el
extremo 5' del gen que codifica la quimera. Además, se describen
polipéptidos OspC no lipidados, sus fragmentos y proteínas
quiméricas que comprenden dos o más polipéptidos OspC, en los que el
gen que codifica la proteína quimérica no comprende una señal de
lipidación y la proteína quimérica no está lipidada. Los
polipéptidos OspC no lipidados, sus fragmentos y sus proteínas
quiméricas son ventajosos debido a unos procedimientos de producción
más simples, unos rendimientos mejorados de proteína y una
purificación más simple. Las proteínas quiméricas no lipidadas que
se describen en la presente memoria, de forma inesperada, provocan
una respuesta inmunitaria contra cepas de Borrelia que
provocan la enfermedad de Lyme al menos tan amplia como las
proteínas OspC lipidadas que se usan como control positivo. Además,
las proteínas OspC quiméricas provocan una respuesta inmunitaria
contra más de una genoespecie de cepas de Borrelia que
provocan la enfermedad de Lyme, que incluyen genoespecies y cepas
que no se usan para generar el inmunógeno quimérico de OspC.
La Figura 1 es un diagrama esquemático de la
distribución de la frecuencia de los grupos de ospC
principalesentre las cepas de B. burgdorferi aisladas en
garrapatas Ixodes scapularis del este de Long Island.
La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad del suero de ratones inmunizados con las proteínas de
Borrelia o las proteínas recombinantes quiméricas de Borrelia que se
indican (eje X) contra los antígenos OspC que se indican (leyenda)
donde el suero es de la primera extracción de sangre.
La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad del suero de ratones inmunizados con las proteínas de
Borrelia o las proteínas recombinantes quiméricas de Borrelia que se
indican (eje X) contra los antígenos OspC que se indican (leyenda)
donde el suero es de la segunda extracción de sangre.
La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad del suero de ratones inmunizados con las proteínas de
Borrelia o las proteínas recombinantes quiméricas de Borrelia que se
indican (eje X) contra las cepas de Borrelia burgdorferi en
sentido estricto que se indican (leyenda).
La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad del suero de ratones inmunizados con las proteínas de
Borrelia o las proteínas recombinantes quiméricas de Borrelia que se
indican (eje X) contra las cepas de Borrelia burgdorferi en
sentido estricto que se indican (leyenda).
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad del suero de ratones inmunizados con las proteínas de
Borrelia o las proteínas recombinantes quiméricas de Borrelia que se
indican (eje X) contra las cepas de Borrelia afzelii que se
indican (leyenda).
La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra
la reactividad del suero de ratones inmunizados con las proteínas de
Borrelia o las proteínas recombinantes quiméricas de Borrelia que se
indican (eje X) contra las cepas indicadas de Borrelia
garinii (leyenda).
La Figura 8 es una Tabla que compara la
reactividad de las proteínas lipidadas OspC C1 y C2 contra el suero
de pacientes con la afección que se indica con la reactividad de las
proteínas quiméricas no lipidadas de la presente invención, donde el
número entre paréntesis es el número total de sueros analizados en
esa categoría.
Tal como se describe en la presente memoria,
inicialmente se encontraron diecinueve grupos de ospC en
B. burgdorferi en sentido estricto en una pequeña
población de garrapatas (Wang, I-N., y cols.,
Genetics, 151:15-30 (1999)). Los principales
grupos de ospC se definieron usando la de que los alelos de
ospC son muy similares, con una divergencia entre las
secuencias inferior al 2%, o muy diferentes, con una divergencia
entre las secuencias superior al 8%, y la mayoría con una
divergencia entre las secuencias superior al 14%.
Basándose en divergencias entre las secuencias,
los alelos de ospC pueden agruparse en veintiún grupos
principales (Tabla II). Para evaluar si las diferencias entre las
cepas definidas por un grupo de ospC están ligadas a la
capacidad invasiva y patógena, se compararon las distribuciones de
las frecuencias de los principales grupos de ospC presentes
en garrapatas, en lesiones cutáneas primarias de eritema migrans
(EM), y en zonas secundarias, principalmente a partir de sangre y
fluido espinal. Tal como se describe en la presente memoria, la
distribución de las frecuencias de los grupos de ospC de
garrapatas es significativamente diferente de la de la zona primaria
de infección que, a su vez es significativamente diferente de las
zonas secundarias. Los grupos de ospC principales A, B, I y K
presentaban una frecuencia mayor en a las que en las garrapatas y
eran los únicos grupos encontrados en las zonas secundarias de la
infección. Por lo tanto, en la presente memoria se definen tres
categorías de grupos de ospC principales. Una categoría es
habitual en las garrapatas pero provoca enfermedad en seres humanos
muy raramente, si es que lo hace, una segunda categoría que provoca
sólo infección local en la zona de picadura de la garrapata, y una
tercera categoría que provoca enfermedad sistémica o diseminada.
Aunque muchos grupos de ospC que se encuentran en las
garrapatas se encontraron también en lesiones cutáneas primarias,
las distribuciones de las frecuencias son significativamente
diferentes entre las garrapatas y las lesiones cutáneas primarias
(Tabla III). Todos los grupos de ospC se encontraron de forma
más o menos habitual en las garrapatas. Sin embargo, sólo cuatro
grupos se encuentran habitualmente en las lesiones cutáneas o en las
infecciones secundarias (Tablas III y IV). Tal como se describe en
la presente memoria, las lesiones cutáneas primarias albergaban
grupos de Borrelia que raramente o nunca tienen grupos de
ospC distintos de A, B, I o K. De forma más importante, sólo
se encontraron estos cuatro grupos de ospC en las zonas
secundarias. El hallazgo de que todas las infecciones sistémicas por
B. burgdorferi en sentido estricto están asociadas a cuatro
grupos de ospC tiene importancia en el diagnóstico,
tratamiento y prevención de la enfermedad de Lyme.
Existen indicios de que ospC se ha
transferido entre cepas e incluso entre genoespecies (Wang
I-N, y cols., Genetics,
151:15-30 (1998)). Esto no es cierto para los genes
cromosómicos de Borrelia (Dykhuizen, D.E., y cols., Proc.
Natl. Acad Sci., 30:10163-10167 (1999); Maynard
Smith, J. y Smith. N.H., Mol. Biol. Evol.,
15:590-599 (1998)). Sin embargo, los alelos
ospA y ospC de B. Burgdorferi en sentido
estricto están casi completamente ligados (Wang I-N.
y cols., Genetics, 151:15-30 (1999)). Esto sugiere
que una vez se ha transferido un alelo de ospC a un entorno
particular, existe poca o ninguna selección para otro evento de
recombinación similar. Así, cada grupo de ospC principal
representa una población clónica que desciende de una única
recombinación.
El veinte por ciento del eritema migrans sin
tratamiento desapareció de forma espontánea sin provocar ninguna
complicación sistémica (Steere, A.C. y cols., Arth. Rheum.
20:7-17. (1977)). Tal como se demuestra en la
presente memoria, esto no es significativamente diferente (p =
0,25 para una prueba de contingencias de 2 por 2 con dicotomía
doble) del porcentaje de cepas no invasoras que se encuentra en la
piel, lo que sugiere que los eritemas migrans que desaparecieron de
forma espontánea están provocados por clones no invasores.
Existe una extensa diversidad genética y
antigénica de ospC en las tres genoespecies patógenas de
B.burgdorferi en sentido amplio (Livey, I. y cols., Mol.
Microbiol. 18:257-269,1995; Masuzawa, T. y
cols., Clin. Diagn. Lab. lmmunol. 4:60-63,
1997; Picken, R.N. y cols., J. Invest. Dermatol.
110:211-214, 1998; Theisen, M. y cols., J. Clin.
Microbiol. 31:2570-2576, 1993; Wang,
I-N. y cols., Genetics
151:15-30 (1999). Tal como se demuestra en la
presente memoria, solo cuatro grupos de alelos de ospC están
ligados tanto a la infectividad como a la invasividad, y esa
invasividad está limitada a un pequeño número de clones de
ospC. Está claro que los alelos ospA y ospC
están estrechamente relacionados a pesar de que están en plásmidos
diferentes (Wang, I-N. y cols., Genetics
151:15-30 (1999)). Si la invasividad la provoca la
variación alélica en otro locus, esta variación probablemente esté
estrechamente ligada a la variación de ospC. Así, ospC
es un buen marcador para la capacidad patógena en seres humanos y
quizá sea determinante. Estos hallazgos tienen implicaciones
importantes no sólo para nuestro conocimiento de la patogénesis de
esta enfermedad sino para su diagnóstico y prevención.
La espiroquetemia es un fenómeno transitorio,
pero presumiblemente clave como germen de las zonas cutáneas
secundarias, el corazón, las articulaciones y el sistema nervioso,
donde estas Borrelia provocan las manifestaciones clínicas
secundarias y terciarias de la enfermedad de Lyme. Los cuatro grupos
invasores de Borrelia burgdorferi se encontraron en cepas
aisladas en sangre y FCE. La única cepa aislada en articulaciones
pertenecía al grupo A. Sin embargo, puede inferirse que los grupos
que no se encuentran en la sangre no se encontrarán en las
articulaciones dado que la mayoría sino toda la diseminación de
Borrelia a las zonas secundarias es mediante la sangre.
Normalmente, se usan organismos modelo como
sustitutos para los experimentos en seres humanos. Sin embargo, esta
substitución funciona solo en tanto en cuanto las propiedades del
organismo modelo y de los seres humanos sean iguales para los
fenómenos estudiados. El sistema inmunitario humano desempeña un
papel crítico que se espera que sea diferente de la respuesta
inmunitaria en organismos modelo, en particular en el ratón. Los
seres humanos son huéspedes accidentales y habitualmente finales
mientras que el ratón es un huésped reservorio crítico. El campo de
la genética poblacional ha desarrollado procedimientos sólidos para
alcanzar conclusiones a partir de los datos de estudios.
Los polipéptidos quiméricos que se describen en
la presente memoria provocan respuestas inmunitarias específicas
contra OspC. Los polipéptidos quiméricos también provocan una
respuesta inmunitaria contra cepas de Borrelia que provocan
la enfermedad de Lymede la misma genoespecie que la representada por
el OspC quimérico así como contra bacterias Borrelia que
provocan la enfermedad de Lymede diferentes genoespecies que la
representada por el OspC quimérico. La respuesta inmunitaria incluye
respuestas humorales, respuestas secretoras, respuestas mediadas por
células y sus combinaciones en un animal tratado con las
composiciones que se describen en la presente memoria. Las
composiciones pueden incluir componentes adicionales adecuados para
el uso in vitro e in vivo. Estos componentes
adicionales incluyen tampones, proteínas portadoras, adyuvantes,
conservantes y sus combinaciones.
Las composiciones inmunógenas que se describen
en la presente memoria pueden usarse para inmunizar animales que
incluyen seres humanos. Las inmunizaciones se entiende que provocan
respuestas inmunógenas específicas tal como se describe
anteriormente. Tal como se describe en la presente memoria, una
respuesta inmunógena incluye respuestas que producen al menos algún
nivel de inmunidad en el animal tratado, donde el animal fue tratado
con una composición que comprende al menos una proteína o proteína
quimérica. El animal tratado desarrolla inmunidad contra la
infección por bacterias Borrelia que provocan la enfermedad
de Lyme, en la que las proteínas quiméricas que se describen en la
presente memoria provocan respuestas contra Borrelia burgdorferi,
Borrelia afzelii y Borrelia garinii.
La inmunidad, tal como se describe en la
presente memoria, se entiende que significa la capacidad del animal
tratado de resistir la infección, de resistir la infección
sistémica, de superar la infección tal como la infección sistémica o
de superar la infección tal como la infección sistémica de forma más
fácil o más rápida cuando se compara con los individuos no
inmunizados o no tratados. La inmunidad también puede incluir una
capacidad mejorada del individuo tratado de mantener una infección
con síntomas clínicos menores de infección sistémica o sin ellos. El
individuo puede ser tratado con las proteínas quiméricas que se
describen en la presente memoria bien de forma proactiva, por
ejemplo una vez al año o quizá tratarse después de sufrir una
picadura de garrapata.
Para usar como vacuna, la composición que se
describe en la presente memoria pude incluir adyuvantes adecuados,
notorios en la técnica, para potenciar la capacidad inmunógena, la
potencia o semivida de las proteínas quiméricas en el animal
tratado. Los adyuvantes y su uso son notorios en la técnica (véase
por ejemplo la Publicación de PCT WO 96/40290). La composición puede
prepararse mediante procedimientos conocidos para la preparación de
vacunas. Por ejemplo, las proteínas o proteínas quiméricas OspC a
usar en las composiciones pueden aislarse y/o purificarse mediante
técnicas conocidas tales como cromatografía por exclusión de tamaño,
cromatografía de afinidad, electroforesis preparativa, precipitación
selectiva o sus combinaciones. Las proteínas o proteínas quiméricas
preparadas pueden mezclarse con otros reactivos adecuados tal como
se describe anteriormente, donde la proteína quimérica está en una
concentración adecuada. La dosificación de proteína o proteína
quimérica variará desde 1 \mug a 500 \mug y depende de la edad,
peso y/o estado físico del animal a tratar. La dosificación óptima
puede determinarse mediante técnicas de optimización rutinarias,
usando modelos animales adecuados.
La composición a usar como vacuna puede
administrarse mediante cualquier técnica adecuada. La administración
es mediante inyección, por ejemplo inyección subcutánea,
intramuscular, intravenosa, o intraperitoneal. De forma alternativa,
la composición puede administrarse a las mucosas, por ejemplo
exponiendo la mucosa nasal a gotas nasales que contengan las
proteínas o proteínas quiméricas de la presente invención. En una
realización alternativa, la composición inmunógena puede
administrarse mediante administración oral. De forma alternativa
las proteínas quiméricas pueden administrarse mediante inmunización
con ADN.
\newpage
Al igual que muchas proteínas de la superficie
exterior de Borrelia, OspC se produce en la espiroqueta
Borrelia con lipidación en 5'. Los polipéptidos quiméricos
que se describen en la presente memoria pueden producirse tanto en
forma lipidada como no lipidada. La señal de lipidación codificada
por el ospC natural se elimina de la secuencia codificante,
de tal forma que el gen o gen quimérico codifique un OspC o
polipéptido quimérico OspC no lipidado. De forma alternativa, la
señal de lipidación del gen ospC natural es sustituida por
la señal de lipidación del gen ospB. Así, se produce una
proteína OspC o una proteína quimérica OspC lipidada.
Los polipéptidos que se describen en la presente
memoria pueden expresarse de forma recombinante en huéspedes
microbianos adecuados, donde dichos huéspedes incluyen, pero sin
limitación, huéspedes bacterianos, tales como E. coli,
huéspedes fúngicos S. cerevisiae, o huéspedes de cultivo
celular tales como un cultivo de células de mamífero o un cultivo de
células de insectos.
Aunque la carencia de señal de lipidación
permite producir grandes cantidades de proteínas OspC y proteínas
quiméricas OspC, anteriormente se creyó que la carencia de señal de
lipidación hacía que las proteínas de la superficie exterior de
Borrelia fueran menos o nada inmunógenas. Sin embargo, tal
como se describe en la presente memoria, los polipéptidos quiméricos
no lipidados, de forma inesperada, provocan una inmunogenidad tan
amplia como la proteína OspC lipidada (Figuras 2 y 3) y mayor
inmunogenidad contra cepas de otras genoespecies (Figura
5-7) comparadas con los controles positivos, que
fueron de OspC lipidada de B31 y OspC lipidada de C12.
Las proteínas y proteínas quiméricas que se
describen en la presente memoria también son antigénicas y por lo
tanto son útiles para detectar o diagnosticar la presencia de
bacterias Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme,
especialmente de Borrelia de grupos capaces de provocar
síntomas diseminados de la enfermedad de Lyme. Tal como se describe
en la presente memoria, síntomas diseminados se refiere a la
infección más allá de la lesión cutánea de eritema migrans, por
ejemplo la infección en la sangre, SNC o las membranas sinoviales.
Tal como se describe en la presente memoria, antigénico se refiere a
la capacidad de un compuesto de unirse a productos de una respuesta
inmunitaria, tales como anticuerpos, receptores de los linfocitos T
o ambos. Tales respuestas pueden medirse usando ensayos de detección
de anticuerpos estándar, tales como ELISA o ensayos de activación de
linfocitos T
estándar.
estándar.
En la presente memoria también se describen
composiciones que comprenden polipéptidos OspC de bacterias
Borrelia que provocan la enfermedad de Lymey polipéptidos
quiméricos OspC. Las composiciones pueden incluir uno o más
polipéptidos OspC o fragmentos de los mismos de al menos dos grupos
de ospC de Borrelia burgdorferi, que también se
denominan familias en la presente memoria, que se seleccionan del
grupo formado por A, B, I y K, a excepción de la combinación formada
por dos polipéptidos OspC de las familias A y I. De forma
alternativa, las composiciones pueden incluir al menos un
polipéptido OspC o un fragmento del mismo de cada una de las
familias de OspC de Borrelia burgdorferi A, B, I y K. De
forma alternativa, la composición puede incluir al menos un
polipéptido OspC o un fragmento del mismo de cada una de las
familias de OspC de Borrelia afzelii A y B. De forma
alternativa, la composición puede incluir polipéptidos OspC de al
menos un grupo o miembro de la familia de ospC de Borrelia
burgdorferi que se selecciona del grupo formado por A, B, I y K
y al menos un miembro de la familia de OspC de Borrelia
afzelii que se selecciona del grupo formado por A y B.
Tal como se describe en la presente memoria, las
familias de ospC comparten una homología de aproximadamente
el 98% a nivel de los ácidos nucleicos entre cepas de la misma
familia y comparten una homología no superior a aproximadamente el
92% al nivel de los ácidos nucleicos entre cepas de diferentes
familias. La determinación de la homología excluye cualesquiera
secuencias distintas de ospC. Los miembros de la misma
familia de ospC tienen perfiles antigénicos similares, por
ejemplo provocan una respuesta inmunitaria contra cepas similares de
Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme. Las proteínas
quiméricas que se describen en la presente memoria de forma
inesperada provocan una respuesta inmunitaria contra bacterias
Borrelia que provocan la enfermedad de Lymede genoespecies
diferentes a las genoespecies de las que se derivaron los
polipéptidos que los componen. La familia A de OspC de Borrelia
burgdorferi puede comprender las cepas B31, CA4, HII, IP1, IP2,
IP3, L5, PIF, PKA, TXGW y las cepas de Borrelia que contienen
el alelo de ospC OC1. La familia B de OspC de Borrelia
burgdorferi puede comprender las cepas 35B808, 61BV3, BUR, DK7,
PB3, ZS7 y las cepas que contienen los alelos de ospC OC2 y
OC3. La familia I de OspC de Borrelia burgdorferi puede
comprender las cepas 297, HB 19 y las cepas que contienen el alelo
de ospC OC10, en la que la cepa 297 se caracteriza por un
ospC con n.º de acceso de GenBank L42893. La familia K de
OspC de Borrelia burgdorferi puede comprender las cepas 272,
297, 2 83 54, KIPP, MUL y las cepas que contienen los alelos OC12 y
OC13 de ospC, en la que la cepa 297 se caracteriza por un
ospC con n.º de acceso de GenBank U08284.
Dichas composiciones pueden comprender un
polipéptido OspC o un fragmento del mismo de cada una de las
familias A y B de OspC de Borrelia afzelii. La familia A de
OspC de Borrelia afzelii puede comprender las cepas Pbo,
Pwud, Pko, Pgau, DK2, DK3, DK21, DK8, Bfox y JSB. La familia B de
OspC de Borrelia afzelii puede comprender las cepas DK5, ACA
1, DK9, XB 18h, Ple y 143M. Tal como se describe anteriormente para
Borrelia burgdorferi las composiciones también incluyen
polipéptidos quiméricos OspC de las familias A y B de Borrelia
afzelii.
El polipéptido OspC puede ser un OspC quimérico
que comprende al menos una región variable o porción de la misma de
una proteína OspC de al menos un gen ospC. De forma
alternativa, la región variable del polipéptido OspC puede estar
codificada por un ácido nucleico que comprende los dos tercios 3'
del gen ospC, desde aproximadamente el nucleótido 150 hasta
aproximadamente el nucleótido 519 de un gen ospC (o desde
aproximadamente el codón 50 hasta aproximadamente el codón 173). De
forma alternativa, dicha región variable del polipéptido OspC está
codificada por un ácido nucleico, en la que el ácido nucleico
comprende, por ejemplo, desde el nucleótido 244 hasta
aproximadamente el nucleótido 519 (o desde aproximadamente el codón
81 hasta aproximadamente el codón 173), el ácido nucleico desde
aproximadamente el nucleótido 337 hasta aproximadamente el
nucleótido 519 (o desde aproximadamente el codón 112 hasta
aproximadamente el codón 173), el ácido nucleico desde
aproximadamente el nucleótido 418 hasta aproximadamente el
nucleótido 519 (o desde aproximadamente el codón 139 a
aproximadamente el codón 173), el ácido nucleico desde
aproximadamente el nucleótido 244 hasta aproximadamente el
nucleótido 418 (o desde aproximadamente el codón 81 hasta
aproximadamente el codón 139), el ácido nucleico desde
aproximadamente el nucleótido 337 hasta aproximadamente el
nucleótido 418 (o desde aproximadamente el codón 112 hasta
aproximadamente el codón 139), y el ácido nucleico desde
aproximadamente el nucleótido 150 hasta aproximadamente el
nucleótido 243 (o desde aproximadamente el codón 50 hasta
aproximadamente el codón 81) de un gen ospC.
Los polipéptidos quiméricos OspC que se
describen en la presente memoria comprenden dos o más polipéptidos
en los que un primer polipéptido es de un primer gen ospC
desde aproximadamente el nucleótido 26 (o aproximadamente el codón
8) hasta aproximadamente el nucleótido 630 (o aproximadamente el
codón 210). De forma alternativa, el primer polipéptido es desde
aproximadamente el nucleótido 28. De forma alternativa, el primer
polipéptido es desde aproximadamente el nucleótido 53. De forma
alternativa, el primer polipéptido es desde aproximadamente el
nucleótido 55. De forma alternativa, el primer polipéptido es hasta
aproximadamente el nucleótido 621 de un primer gen ospC. De
forma alternativa, el primer polipéptido es hasta aproximadamente el
nucleótido 582 de un primer gen ospC. De forma alternativa,
el primer polipéptido es hasta aproximadamente el nucleótido 576 de
un primer gen ospC.
El OspC quimérico que se describe en la presente
memoria comprende además un segundo polipéptido, en el que el
segundo polipéptido se deriva de un segundo gen ospC desde
aproximadamente el nucleótido 28 (o aproximadamente el codón 9)
hasta aproximadamente el nucleótido 571 (o aproximadamente el codón
190).
Se entiende que los polipéptidos que comprenden
el polipéptido quimérico pueden incluir nucleótidos adicionales o
menos nucleótidos del gen ospC dado del que se deriva el
polipéptido para simplificar la construcción del gen que codifica el
polipéptido quimérico, por ejemplo para permitir el uso de sitios de
restricción por endonucleasas convenientes o para permitir el ligado
de fragmentos génicos de tal forma que se cree una región
codificante contigua. Basándose en las directrices que se
proporcionan en la presente memoria, una persona de experiencia
ordinaria en la técnica fácilmente sería capaz de añadir o eliminar
nucleótidos de los extremos de los fragmentos génicos que codifican
los polipéptidos de la proteína quimérica OspC generando proteínas
quiméricas sin ninguna experimentación o solo con experimentación
rutinaria. Además, puede haber desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 10 aminoácidos adicionales en los extremos N- y/o C-
de los polipéptidos y proteínas quiméricas que se describen en la
presente memoria y todavía mantener las propiedades que se describen
en la presente memoria.
También se describen variantes o versiones
alteradas de los polipéptidos OspC y ácidos nucleicos que codifican
dichos polipéptidos. Tal como se usa en la presente memoria, una
variante de un polinucleótido o polipéptido se refiere a una
molécula que es sustancialmente similar o a la molécula entera o a
un fragmento de la misma. Por ejemplo, cuando la molécula es un
polipéptido, variante se refiere a una secuencia de aminoácidos que
tiene uno o más amino ácidos alterados, en la que se mantiene una
función biológica, estructura o capacidad antigénica de dicha
secuencia o combinación de las mismas en la variante. La variante
puede tener cambios "conservadores", en los que un aminoácido
sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares,
por ejemplo, sustitución de leucina por isoleucina. O una
variante puede tener cambios "no conservadores", por
ejemplo, sustitución de una glicina por un triptófano.
Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o
inserciones de aminoácidos, o ambas. De forma similar, cuando la
molécula es un polinucleótido, variante se refiere a una secuencia
que tiene uno o más nucleótidos alterados. La variante puede tener
variaciones silentes, en las que el cambio no altera el aminoácido
codificado por el triplete que comprende dicha variación o la
variación no es silente, es decir, se generan alteraciones en los
aminoácidos codificados.
Tal como se usa en la presente memoria, la
expresión "versión alterada" se refiere a una secuencia de
polinucleótidos o una secuencia de polipéptidos, en la que dicha
secuencia tiene una o más diferencias respecto a una versión nativa
o natural de dicha secuencia.
También se describe una molécula de ácido
nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es
homóloga a una o más de las secuencias quiméricas que se describen
en la presente memoria, o sus complementos. Tal secuencia de
nucleótidos muestra una homología o identidad entre las secuencias
de al menos aproximadamente el 80%, con una de las secuencias
quiméricas de OspC, de tal forma que la proteína codificada mantiene
la capacidad antigénica e inmunógena de la proteína quimérica no
alterada. Preferiblemente, las secuencias homólogas comparten al
menos aproximadamente una homología o una identidad entre las
secuencias del 90% respecto al ospC quimérico no alterado
correspondiente. Secuencias particularmente preferidas tienen una
homología de al menos aproximadamente el 95% o tienen esencialmente
la misma secuencia.
Los ácidos nucleicos alterados y los ácidos
nucleicos homólogos se hibridan con el ospC
quiméricoencondiciones muy estrictas. Ausubel, F.M., y cols.,
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Assoc. y Wiley-Interscience 1987, y Sup. 49, 2000
contienen una descripción general de lo estricto de las condiciones
de hibridación. Factores tales como la longitud de la sonda, la
composición base, el porcentaje de no coincidencias entre las
secuencias que se hibridan, la temperatura y la potencia iónica
influyen en la estabilidad de los híbridos de los ácidos nucleicos.
Así, lo estricto de las condiciones, suficientes para permitir la
hibridación de los oligonucleótidos con la plantilla, puede variarse
mediante optimización rutinaria generando condiciones muy
estrictas.
De forma alternativa, lo estricto de las
condiciones se describe en el documento WO 98/40404. En particular,
en el documento WO 98/40404 se proporcionan ejemplos de condiciones
muy estrictas, estrictas, reducidas y menos estrictas en la Tabla
de la página 36. Ejemplos de lo estricto de las condiciones se
muestran en la Tabla I a continuación que es del documento WO
98/40404 de Jacobs y cols.: lascondiciones muy estrictas son
las que son al menos tan estrictas como por ejemplo, las condiciones
A-F; las condiciones estrictas son al menos tan
estrictas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y
las condiciones estrictas reducidas son al menos tan estrictas como,
por ejemplo, las condiciones M-R.
\vskip1.000000\baselineskip
\ddagger La longitud del híbrido es la
anticipada para la(s) región(es) hibridada(s)
de los polinucleótidos que se hibridan. Cuando se hibrida un
polinucleótido con un polinucleótido diana de secuencia desconocida,
la longitud el híbrido se asume que es la del polinucleótido que se
hibrida. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida,
la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias
de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de
complementariedad óptima de las secuencias.
\dagger: SSPE (1xSSPE es NaCl 0,15 M,
NaH_{2}PO_{4} 10 mM y EDTA 1,25 Mm a pH 7,4) puede sustituir a
SSC (1 x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM) en los tampones
de hibridación y de lavado; los lavados se realizan durante 15
minutos después de que se ha completado la hibridación.
*T_{B} - T_{R}: La temperatura de
hibridación para los híbridos que se prevé que son de menos de 50
pares de bases de longitud debería ser de 5-10ºC
menos que la temperatura de fusión (T_{f}) del híbrido, donde
T_{f} se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para
los híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, T_{f}(ºC)
= 2(n.º de bases A + T) + 4(n.º de bases G + C). Para
los híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, T_{f}(ºC)
= 81,5 + 16,6(log_{10}[Na+]) +
0,41(%G+C)-(600/N), donde N es el número de bases del
híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en el tampón de
hibridación ([Na+] para 1 x SSC = 0,165 M).
Tal como se usa en la presente memoria,
"aislado" se refiere un ácido nucleico o polipéptido que ha
sido extraído de su entorno original (por ejemplo, el entorno
natural si es una molécula natural). Por ejemplo, el polinucleótido
o ADN o polipéptido, que se separa de algunos o todos los materiales
coexistentes en el sistema natural. Un polinucleótido aislado puede
ser parte de un vector y/o composición, y todavía estar aislado
porque el vector o composición no es parte de su entorno natural.
Del mismo modo, los polipéptidos pueden ser parte de una
composición y todavía estar aislados porque la composición no es
parte de su entorno natural.
Las proteínas quiméricas que se describen en la
presente memoria comprenden las proteínas o polipéptidos OspC tal
como se describen anteriormente de dos o más familias de OspC de
Borrelia que provocan la enfermedad de Lymetal como se
describe en Tabla II. Dichas familias pueden comprender las familias
de OspC de Borrelia burgdorferi A, B, I y K y las familias de
OspC de Borrelia afzelii A y B. Las proteínas quiméricas que
se describen en la presente memoria comprenden, por ejemplo, un
primer polipéptido OspC codificado por un ácido nucleico que
comprende una secuencia desde aproximadamente el codón 18 hasta
aproximadamente el codón 210 de un primer gen ospC. De forma
alternativa, la secuencia es desde aproximadamente el codón 8. De
forma alternativa, la secuencia es hasta aproximadamente el codón
207. De forma alternativa, la secuencia es hasta aproximadamente el
codón 194. De forma alternativa, la secuencia es hasta
aproximadamente el codón 192. Las proteínas quiméricas que se
describen en la presente memoria además comprenden, por ejemplo, un
segundo polipéptido OspC que comprende un polipéptido variable OspC
codificado por fragmentos de ácido nucleico tal como se describe
anteriormente. De forma alternativa, la proteína quimérica comprende
dos o más polipéptidos variables OspC tal como se describe
anteriormente.
Las proteínas quiméricas que se describen en la
presente memoria además comprenden, por ejemplo, un segundo
polipéptido OspC codificado por un ácido nucleico que comprende una
secuencia desde aproximadamente el codón 9 hasta aproximadamente el
codón 190 de un segundo gen ospC.
Para las proteínas quiméricas que se describen
en la presente memoria, al menos dos de dichos polipéptidos OspC o
sus fragmentos inmunógenos están fusionados en una única proteína,
una proteína quimérica, codificada por un único ácido nucleico, en
el que no se encuentran dos polipéptidos adyacentes en dicha
proteína de fusión en la misma configuración en una proteína OspC
natural.
De forma alternativa, las proteínas OspC o las
proteínas quiméricas que se describen en la presente memoria de
Borrelia burgdorferi y Borrelia afzelii están
combinadas en una composición.
También se describe un procedimiento para
detectar una respuesta inmunitaria contra bacterias Borrelia
que provocan la enfermedad de Lymeen una muestra de un huésped. El
procedimiento comprende poner en contacto la muestra del huésped con
una composición que comprende polipéptidos OspC de cepas de
Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme, de tal
forma que los anticuerpos contra OspC de dicha muestra, si
estuvieran presentes, se unen a dichos polipéptidos OspC. La
composición puede comprender uno o más polipéptidos OspC o un
fragmento de los mismos de diagnóstico de dos familias de OspC de
Borrelia burgdorferi que se seleccionan del grupo formado por
A, B, I y K, excluyendo la composición formada por dos proteínas
OspC en la que una proteína OspC es de la familia A de OspC y la
segunda proteína OspC es de la familia I de OspC. Se detectan o
miden los anticuerpos que se unen a los polipéptidos OspC de la
composición; detectando así una respuesta inmunitaria contra
bacterias Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme. De
forma alternativa, la composición puede comprender al menos dos
polipéptidos OspC de Borrelia o fragmento de diagnóstico de
los mismos de dos familias de OspC de Borrelia afzelii que se
seleccionan del grupo formado por A y B. De forma alternativa, la
composición puede comprender polipéptidos OspC de Borrelia
burgdorferi y Borrelia afzelii. De forma alternativa, la
composición puede comprender uno o más polipéptidos de cada una de
las familias A, B, I y K de Borrelia burgdorferi y de las
familias A y B de Borrelia afzelii. La composición también
puede comprender uno o más de los polipéptidos quiméricos que se
describen en la presente memoria.
También se describen kits que comprenden uno o
más polipéptidos OspC o polipéptidos quiméricos OspC o sus
combinaciones, junto con tampones y reactivos de detección de
anticuerpos adecuados para la detección o diagnóstico de cepas de
Borrelia que provocan la enfermedad de Lyme. Los kits pueden
comprender ácido nucleico lo suficientemente homólogo a los
polipéptidos OspC o a los polipéptidos quiméricos OspC para
detectar el ácido nucleico que codifica los genes ospC de
las cepas de Borrelia que provocan la enfermedad de
Lyme junto con reactivos para detectar la hibridación positiva con
ADN diana o reactivos para ADN específico, por ejemplo.
En el contexto de un kit detección,
"homólogo" se refiere a dos o más secuencias que comparten una
similitud sustancial pero no son idénticas. Dos secuencias de ADN
son "substancialmente similares" cuando al menos
aproximadamente el 95% (preferiblemente al menos aproximadamente el
98%) de los nucleótidos coinciden en una longitud definida de las
secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas
pueden identificarse comparando las secuencias usando programas
informáticos disponibles en bancos de datos de secuencias o en un
experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, en condiciones
estrictas tal como se definen para ese sistema particular. La
definición de las condiciones de hibridación está dentro de la
experiencia de la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel y
cols., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, Inc., Nueva York; Sambrook y cols., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press. Para esta descripción, se consideran sustancialmente
homólogas las secuencias de aminoácido que tienen, por ejemplo, una
similitud superior al 90 por ciento.
Las composiciones de vacuna que se describen en
la presente memoria provocan respuestas inmunitarias humorales y
mediadas por células en un huésped. Además, las composiciones de
diagnóstico que se describen en la presente memoria son capaces de
detectar tanto las respuestas inmunitarias humorales como las
mediadas por células de una muestra de un huésped usando técnicas de
inmunodiagnóstico estándar.
Ejemplo
1
Se aislaron ciento cuarenta cepas de B.
burgdorferi a partir delesionesprimarias de eritema migrans
(EM), sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) de los pacientes en
observación en el Centro para la enfermedad de Lyme de Stony Brook,
Nueva York, el Centro para el Diagnóstico de la Enfermedad de Lyme
en el New York Medical College, Valhalla, Nueva York o las prácticas
privadas de los dos médicos colaboradores en el extremo este de Long
Island o se obtuvieron en los Centros para el control de
enfermedades (CDC). Todos los pacientes cumplían la definición para
la vigilancia de los Centros para el Control de Enfermedades para la
enfermedad de Lyme (CDC, Morb. Mortal. Wkly. Rep.
46:20-21, (1997)). Las cepas aisladas de piel,
sangre y LCR se obtuvieron usando técnicas estándar (Barbour, A.G.,
Yale J. Biol. Med. 57:521-525, 1984; Berger,
B.W. y cols., J. Clin. Microbiol. 30:359-361,
1992; Wormser, G.P. y cols., J. Clin. Microbiol.
36:296-298 (1998)). Se obtuvieron biopsias mediante
sacabocados (punch) el borde de avance de la lesión de eritema
migrans y se incubaron en medio BSK-H (Sigma, St.
Louis, MO) a 34ºC para crear un cultivo. Existía poco sesgo en los
cultivos según se determinó por análisis directo de los tejidos de
las biopsias comparando con las cepas aisladas cultivadas (Seinost,
G. y cols., Arch. Derm., 135:1329-1333,
(1999)), al contrario que el aislamiento de B. burgdorferi a
partir de garrapatas que no habían sido alimentadas (Norris, D.E. y
cols., J. Clin. Microbiol. 35:2359-2364,
(1997)). Además, se extrajeron veintidós secuencias de OspC de B.
burgdorferi en sentido estricto de GenBank. Los datos de las
garrapatas que se usaron eran o de GenBank o del estudio de Wang y
cols.(Wang, I-N. y cols., Genetics
151:15-30 (1999)).
Para aislar el ADN genómico de Borrelia,
se recolectaron células en fase de crecimiento exponencial por
centrifugación a 10.000 RPM durante 30 minutos a 4ºC. El sedimento
de bacterias se resuspendió en tampón de Tris/solución salina (Tris
10 mM (a pH 7,5), NaCl 150 mM). Después se sedimentaron las
bacterias y se volvieron a suspender en TNE (Tris 10 mM (pH 7,5),
NaCl 150 mM, EDTA 1 mM). Se añadieron lisozima de preparación
reciente (20 mg/mlen TNE), dodecil sulfato sódico (10%) y proteínasa
K (20 mg/ml) y la mezcla se incubó a 50ºC durante una hora, seguido
de tratamiento con ARNasa. El ADN se extrajo con fenol/cloroformo,
se precipitó con etanol y se resuspendió en tampón TE.
El gen ospC se amplificó usando PCR, tal
como se describe anteriormente (Wang, I-N. y cols.,
Genetics 151:15-30(1999)). El gen
ospC se amplificó usando dos cebadores externos:
5'-AAA GAA TAC ATT AAG TGC GAT
ATT-3' (+), SEC. ID. N.º: 1, empezando en la base 6;
y 5'-GGG CTT GTA AGC TCT TTA ACT
G-3' (-), SEC. ID. N.º: 4, terminando en la base
602. La mitad 5' de ospC se amplificó usando la SEC. ID.
N.º: 1 y el cebador inverso, 5'-CAA TCC ACT TAA TTT
TTG TGT TAT TAG-3' (-) SEC. ID. N.º: 2; terminando
en la base 345. La mitad de 3' de ospC se amplificó usando el
cebador, 5'-TTG TTA GCA GGA GCT TAT GCA ATA
TC-3' (+), SEC. ID. N.º: 3, empezando en la base
289, y la SEC. ID. N.º: 4 como cebador inverso. Los cebadores
externos amplificaron un fragmento de 597 pb. La amplificación de la
mitad 5' produjo un fragmento de 340 pb mientras que la
amplificación de la mitad 3' produjo un fragmento de 314 pb. Todos
los números de las bases y los tamaños de los fragmentos
amplificados se basan en la secuencia ospC de la cepa B31
(número de acceso de GenBank U01894), con el codón de inicio como
base 1.
La amplificación se realizó en 50 \mul de una
solución que contenía tampón para PCR Perkin-Elmer
Cetus 10x (Tris-HCl 100 mM (pH 8,3), KCl 500 mM),
MgCl_{2} 2,5 mM, desoxinucleósido trifosfatos a 0,2 mM por
nucleótido, 2,5 U de polimerasaTaq
(Perkin-Elmer/Cetus) y 0,5 \muM de cada cebador.
La reacción de amplificación se realizó durante cuarenta ciclos en
un ciclador térmico de ADN (PTC-100: MJ Research,
Inc., Watertown, MA) con un perfil de amplificación de:
desnaturalización a 95ºC durante 40 segundos, hibridación a 54ºC
durante 35 segundos, y extensión a 72ºC durante 1 minuto, después de
una etapa inicial de desnaturalización a 96ºC durante 2 minutos. Se
incluyeron controles negativos en cada experimento para controlar la
contaminación.
Se eligió el análisis por SSCP para caracterizar
la variación genética de los fragmentos aislados del gen ospC
basándose en su velocidad de detección satisfactoriamente alta de
los polimorfismos y mutaciones puntuales de ADN en una variedad de
posiciones en fragmentos de ADN (Orita, M. y cols., Proc. Natl.
Acad Sci. 86:2766-2770. (1989)). Se han
detectado mutaciones puntuales en fragmentos de hasta 800 pb de
longitud (Michaud. J. y cols., Genomics.
13:389-394, (1992)). Sin embargo, existen indicios
de que la capacidad del análisis por SSCP de detectar mutaciones
comienza a declina de forma significativa cuando loa fragmentos de
PCR se aproximan a 400 pb de tamaño (Hayashi, K., PCR Methods
& Applications 1:34-38, (1991)). Por lo
tanto, para lograr una alta eficacia de detección del polimorfismo
de los nucleótidos, la longitud de los productos de la PCR que se
usaron en la presente memoria era de 340 pb de la mitad 5' y 314 pb
de la mitad 3' de OspC.
Se analizaron fragmentos del gen ospC de
todas las ciento cuarenta cepas para determinar las variaciones
genéticas mediante el protocolo de SSCP frío que se describe en
Hongyo y cols. (Hongyo, T. y cols., Nucleic. Acid Res.
21:3637-3642. (1993)). En resumen, se añadieron de 5
a 15 \mul del producto de la PCR a una mezcla que contenía 4
\mul 5 x tampón de muestras TBE Ficoll (NOVEX, San Diego, CA) y
0,4 \mul de hidróxido de metilmercurio 1 \muM (Alfa Aesaer, Ward
Hill. MA). La cantidad del producto de la PCR que se usó para el
análisis por SSCP se estimó después de visualizar el producto de la
PCR en un gel de agarosa con bromuro de etidio. La mezcla de muestra
se calentó a 95ºC durante 4 minutos, después se enfrió sobre hielo
antes de cargar los 20 \mul completos en el pocillo de muestras
del gel. Las bandas más nítidas se observaron cuando la muestra se
aplicó a un gel TBE al 20% previamente formado (NOVEX) en un sistema
de electroforesis (ThermoFlow ETC Unit, NOVEX) con tampón de
procesamiento 1,25 x TBE. La electroforesis de los productos del
SSCP se realizó a temperatura constante de 8ºC durante 17 h a 240
voltios para revelar los desplazamientos de movilidad discernibles.
Los geles se tiñeron con 0,5 \mul/ml de bromuro de etidio en 1x
tampón TBE durante 25 minutos y se destiñeron en agua destilada
durante 30 minutos. Las bandas teñidas se visionaron usando una caja
de tinción UV a 340 nm. Las muestras que mostraban más de dos bandas
de SSCP se volvieron a amplificar para determinar si las bandas
encontradas eran alelos reales o producto de artefactos de la PCR.
Se realizó
un análisis por SSCP en paralelo para detectar incluso los desplazamientos pequeños de la movilidad electroforética.
un análisis por SSCP en paralelo para detectar incluso los desplazamientos pequeños de la movilidad electroforética.
El gen ospC o representantes de cada
clase de movilidad se volvieron a amplificar. Los fragmentos de la
PCR bicatenarios se purificaron mediante electroforesis en gel de
agarosa y se sometieron a secuenciación automatizada de ADN usando
reacciones de terminación con didesoxi fluorescente y los cebadores
directos e inversos que se usaron originariamente para la
amplificación por PCR.
Se realizó el análisis de X^{2} de las tablas
de contingencias. Este análisis prueba las diferencias
significativas entre las distribuciones de las frecuencias. Las
tablas eran de 2xN donde N es el número de grupos de ospC
principales que se distinguen. El número medio esperado para cada
elemento de la tabla debe ser aproximadamente seis o mayor para una
prueba sin sesgos (Zar, J.H., Biostatistical Analysis, 3ª ed,
página 206, (1996)). Esto quiere decir que el número de
observaciones debería ser mayor de 6 veces 2N. Cuando el número
medio esperado era inferior a seis, se combinaron los grupos de
ospC principales con el menor número en la muestra hasta que
los números de observaciones eran aproximadamente iguales o mayores
de 12N.
Ciento treinta y dos cepas aisladas de B.
burgdorferi en sentido estricto de muestras de piel, sangre, y
LCR de pacientes (Tabla II) se propagaron in vitro y se
usaron como fuente de ADN para el análisis. El genotipo ospC
de cada cepa se determinó mediante análisis por SSCP frío a partir
del extremo 5' (340 pb) del gen y se confirmó por análisis de SSCP
del extremo 3' (314 pb) de ospC. En todas las cepas aisladas
de B. burgdorferi, la variación genética en el extremo 5' del
gen se correspondía con la variación en el extremo 3'.
Subsiguientemente se secuenciaron al menos dos muestras
representativas de cada clase de motilidad del SSCP. Las secuencias
de las mismas clases de motilidad eran idénticas en todas las
muestras y cada clase de motilidad tenía una secuencia distinta. Por
lo tanto, la sensibilidad y especificidad del análisis por SSCP era
del 100%. A cada clase de motilidad en el SSCP se le dio el nombre
de un alelo. Wang y cols. recientemente han descrito 13
alelos de ospC (Wang, I-N. y cols.,
Genetics 151:15-30). En la presente memoria
se describen cinco clases de motilidad adicionales de ospC
(OC), OC14-18. OC14 tiene la misma secuencia de
ospC que el ospC de la cepa 2591.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
^{1}Se proporciona una única secuencia de
GenBank de cada tipo como ejemplo.
^{2}Número de cada grupo de ospC
principal que se observa en sangre, líquido sinovial o líquido
cefalorraquídeo. Este incluye tanto los datos de SSCP como los datos
de la bibliografía, incluido GenBank.
*Los grupos P a S de B. burgdorferi en
sentido estricto solo se encuentran en Europa. Los grupos R y S se
excluyen del análisis debido a que en B. afzelii y B.
garinii se encuentran alelos casi idénticos de ospC, lo
que demuestra que estos grupos se crearon recientemente por la
transferencia entre especies.
De las ciento treinta y dos cepas primarias
aisladas en pacientes con la enfermedad de Lyme de este estudio, la
mayoría contenían solamente una única cepa. Siete muestras de piel y
una de LCR contenían dos cepas diferentes según se determinó
mediante análisis por SSCP, proporcionando así un total de ciento
cuarenta cepas diferentes. Los pares de alelos de ospC que se
encontraron en especimenes de biopsias de eritema migrans con
infecciones múltiples eran (OC1, OC12), (OC1, DC14), 2x(OC2,
OC3), 2x(OC2, OC12), y (OC8, OC18). La muestra de LCR
NY940657 contenía los alelos de ospC OC1 y OC12. Para la
muestra de LCR 297, que se aisló en Connecticut, había dos
secuencias de ospC publicadas en GenBank: L42893, que es
análoga a OC10 y U08284, que es análoga a OC12. La diferencia entre
los pares de las secuencias de ospC de ambas cepas es del
16,4%, lo que sugiere una infección del SNC por dos cepas SNC en
esta muestra. En total, el 5,5% de todas las cepas aisladas que se
describen en la presente memoria contenían dos cepas. Debido a que
hasta el 50% de las garrapatas aisladas en la naturaleza están
infectadas con múltiples cepas, la exposición a múltiples cepas en
una única picadura de garrapata es habitual, lo que suscita la
posibilidad de que las diferentes cepas sean diferencialmente
patógenas.
A estas ciento cuarenta cepas para las que se
determinó el alelo de ospC en la presente memoria, se
añadieron veintidós cepas de secuencia ospC conocida de
GenBank dando un total de ciento sesenta y dos. Cincuenta y una de
estas cepas se obtuvieron en el este de Long Island; setenta y siete
se obtuvieron en Westchester County, Nueva York, y el resto de otras
áreas endémicas de los Estados Unidos (veintidós cepas) y Europa
(doce cepas). Las cepas aisladas se dividieron en: las de las zonas
de infección, las de las lesiones de piel de eritema migrans (ciento
dieciocho cepas aisladas), y las de zonas secundarias, en las que la
infección se había diseminado (cuarenta y cuatro cepas aisladas).
Este último grupo incluía, por ejemplo, veinte de líquido
cefalorraquídeo (LCR), veintitrés de sangre y una de líquido
sinovial.
Sorprendentemente, tal como se describe en la
presente memoria, las diferencias entre las secuencias de
ospC entre las familias de B. burgdorferi en sentido
estricto se podían clasificar en dos grupos. Los pares de genes
ospC de la misma familia diferían en las secuencias de ácidos
nucleicos en menos del dos por ciento mientras que los pares de
genes ospC de familias distintas diferían en la secuencia de
ácidos nucleicos en más del ocho por ciento. Wang y cols.,
definieron diecinueve grupos de ospC principales, denominados
A a S (Wang, I-N. y cols., Genetics
151:15-30 (1999)). Tal como se describe en la
presente memoria, se proporcionan dos grupos de ospC
adicionales, denominados T y U. OC16 representa el grupo principal T
y OC17 representa el grupo principal U (Tabla I). Las diferencias
más bajas entre pares del grupo T y U con cualquier otro grupo de
ospC principal son del 16,1% y 20,5%
respectiva-
mente.
mente.
Tal como se describe en la presente memoria, los
clones que representan grupos diferentes de ospC de
Borrelia burgdorferi son patógenos de forma diferencial. Esto
se demuestra por las distintas frecuencias entre los diversos grupos
de ospC principales en las garrapatas, en la infección
inicial de la piel, y en las infecciones diseminadas.
Las cepas de GenBank y de la bibliografía para
las que se han determinado las secuencias de ospC se
muestrearon ampliamente por todo el abanico geográfico de las
especies y se eligieron independientemente de si eran de garrapatas
o de seres humanos. Estas cepas proporcionaron una muestra pequeña
pero aleatoria de las frecuencias de los grupos de ospC
principales en las garrapatas y los seres humanos. Tal como se
demuestra en la presente memoria, se encontró que la frecuencia de
los grupos de ospC principales de las cepas aisladas en seres
humanos era significativamente diferente de la frecuencia que se
encontró en las garrapatas de Long Island. La Tabla III muestra que
la distribución de la frecuencia de las cepas de piel del este de
Long Island difiere significativamente de la de las cepas de las
garrapatas que se recogieron en la misma zona.
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El análisis que se proporciona en la presente
memoria de todos los grupos de ospC que se presentan en este
estudio demostró que la mayoría de los grupos se encuentran tanto en
las garrapatas como en los seres humanos (Tabla II). Sin embargo,
los grupos principales A, B, I y K predominaban en los seres
humanos, y los grupos A y K eran los que más frecuentemente se
encontraban. (Figura 1).
El patrón de la capacidad patógena de los
diversos clones tal como se demuestra mediante la frecuencia en la
zona primaria de infección, la piel, comparada con la frecuencia en
las zonas secundarias reveló que sólo se encontraban cuatro grupos
principales (A, B, I y K) tanto en la piel como en las zonas
secundarias (compárense las Tablas III y IV). Todos los otros grupos
principales se encontraban solo en la piel. Cuando todos los grupos
con tres o menos cepas aisladas se combinan formando el grupo
combinado de la Tabla IV, una prueba de contingencia de 2 por 8 que
compara la distribución de la frecuencia en la piel con las zonas
secundarias da una significación de p<0,005. Cuando no se
combinan los grupos, una prueba de contingencia de 2 por 15 todavía
es significativa (X^{2} = 24,07 con 14 grados de libertad,
p<0,05). La distribución de las cepas de zonas primarias y
secundarias indicaba que sólo algunos de los grupos principales, A.
B, I y K provocan la enfermedad diseminada. Tal como se describe en
la presente memoria, éstos se denominan clones invasivos, mientras
que los otros clones se denominan clones no
invasivos.
invasivos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se describe en la presente memoria, los
diferentes clones de B. burgdorferi en sentido estricto,
definidos por los grupos de ospC, son patógenos de forma
diferencial. Algunos grupos, muy raramente, o nunca, provocan
enfermedad en los seres humanos por ejemplo los grupos de
ospC D, E, F y L. Algunos grupos provocan una infección local
en la zona de picadura de la garrapata, pero no enfermedad
sistémica, por ejemplo los grupos de ospC G, H, J y T.
Finalmente, existen algunos grupos que son responsables de la
enfermedad sistémica; estos son los grupos de ospC A, B, I y
K. Los hallazgos de los presentes inventores indican que todas las
infecciones sistémicas por B. burgdorferi en sentido
estricto en seres humanos son provocadas por cepas de estos cuatro
grupos de ospC.
La Figura 1 muestra la distribución de las
frecuencias de los grupos de ospC principales entre las cepas
aisladas de B. burgdorferi en garrapatas Ixodes
scapularis del este de Long Island, n = 72, (A); en lesiones de
eritema migrans, n = 118, (B); y en zonas secundarias de infección,
n = 44, (C). El porcentaje de grupo A más K aumentó del 23% en las
cepas aisladas en garrapata, al 47% en las cepas aisladas en la piel
y al 84% en las zonas secundarias. La longitud de la barras de la
Figura 1 reflejan este aumento, manteniendo constante la longitud de
los grupos A y K combinados. En la piel, se han combinado los grupos
C, D, E, M, N, O, T y U dado que sus frecuencias individuales son de
0,025 o menores. Esta combinación de grupos, cuando se concentra
forma el 12,7% del número total de
cepas.
cepas.
Se realizó un análisis similar para Borrelia
afzelii. Elanálisis incluía los alelos de ospC de 21
cepas de GenBank y 12 cepas secuenciadas para este estudio. Estas
secuencias podían clasificarse en 20 grupos principales donde un
grupo se define por una diversidad entre las secuencias inferior al
1% dentro del grupo y una diferencia entre las secuencias de al
menos el 7,7% entre grupos diferentes. Hay dos excepciones a esta
regla que fueron provocadas por una deleción en un gen ospC y
una transferencia entre especies de una pequeña parte de ADN en otro
gen ospC. Cuando se eliminaron estas secciones anómalas,
todos los alelos de ospC se podían clasificar en 20 grupos.
Sólo dos grupos contenían cepas con infecciones crónicas - los
grupos A y B. Por analogía con el estudio de B. burgdorferi,
parece que sólo dos grupos son patógenos en B. afzelii.
\newpage
Ejemplo
2
Escherichia coli (cepa BL21 (pLysS) o
cepa B834 (DE3)) fueron transformadas con el plásmido que codificaba
las proteínas recombinantes quiméricas de Borrelia (RCBP) y
se cultivaron en 10 ml de medio LB (5 g/l de NaCl, 10 g/l de
triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 25 mg/l de cloramfenicol y
50 mg/l de ampicilina) a 37ºC, agitando. Cuando se alcanzó una
densidad óptica a 600\lambda de 0,3-0,4 unidades,
se indujo la expresión de recombinantes proteínas añadiendo IPTG
(B-D-tiogalactopiranosida
isopropílico) hasta una concentración final de 0,5 mM y las células
se cultivaron durante tres horas más. Los cultivos se recolectaron
por centrifugación a 3800 x g durante cinco minutos. Las células se
volvieron a suspender en NaPO_{4} 20 mM, a pH 7,7 y se almacenaron
a -20ºC hasta la mañana siguiente. Una vez descongelados, los
extractos en bruto se incubaron con ADNasa (2 \mug/ml)en
presencia de MgCl_{2} 2,5 mM a temperatura ambiente durante
treinta minutos, se centrifugaron a 14000 rpm (Eppendorf 5417C)
durante cinco minutos y 5 \mul de la muestra de proteína se pasó
por SDS-PAGE que o se tiñó con azul de Commassie o
se usó para la inmunotransferencia. Las muestras de proteína se
solubilizaron, habitualmente con un tampón que contenía
dodecilsulfato sódico (SDS) y en casos seleccionados con agentes
reductores tales como ditiotreitol (DTT) o
2-mercaptoetanol (2-ME). Tras la
solubilización, el material se separó por SDS-PAGE.
Las proteínas después se transfirieron por electroforesis a una
membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF,
Immobilon-P®, Millipore). La transferencia de
proteínas se controló mediante un procedimiento de tinción
reversible, Ponceau S. Se preparó la membrana teñida y la membrana
se destiñó empapando en agua durante 10 minutos. Todos los sitios de
unión no específicos de las proteínas y de la membrana se bloquearon
sumergiendo la membrana en una solución que contiene un agente de
bloqueo de proteína o detergente (leche al 5% en solución salina
tamponada con Tris (TBS) Tween-20® al 0,1 %).
Después, las membranas se incubaron con anticuerpo primario (o un
anticuerpo monoclonal o suero humano de eritema migrans por
enfermedad de Lyme). La membrana se lavó y los complejos de
anticuerpo y antígeno se identificaron usando la enzima fosfatasa
alcalina (AP) acoplada a anticuerpos secundarios, bien contra
inmunoglobulina G (contra IgG de ratón) para detectar el anticuerpo
monoclonal o contra IgA+IgG+lgM humanas para detectar los
anticuerpos en suero. Después se usó un sustrato cromógeno para la
fosfatasa alcalina para visualizar la actividad.
Ejemplo
3
Se usó una solución de RCBP purificadas en
tampón de fosfato sódico, a pH 9,0 para recubrir placas de
micropocillos comerciales (MaxiSorp®, Nunc). Las proteínas
recombinantes OspC de Borrelia se describen en la Tabla V. El
procedimiento de recubrimiento fue el siguiente: se añadieron 100
\mul de una solución que contenía la concentración apropiada de
cada RCBP a cada pocillo y la placa de micropocillos se incubó
durante una hora a temperatura ambiente o 4ºC hasta la mañana
siguiente. La solución de antígeno se eliminó de los pocillos, la
placa se lavó tres veces con solución salina tamponada con fosfato
(PBS) a pH 9,0, y se añadieron 200 \mul de solución de bloqueo
(fracción V BSA al 2% (Sigma) en PBS). Tras una incubación de 30
minutos a 37ºC, las placas se lavaron tres veces con PBS, se
envolvieron en plástico y se almacenaron a 4ºC hasta su uso. Se
midió la unión de las RCBP individuales usando anticuerpos
monoclonales específicos para OspA u OspC seguido (después de lavar)
de un anticuerpo secundario de cabra contra anticuerpo de ratón
conjugado con fosfatasa alcalina. Se encontró que el límite superior
de la unión a proteínas superaba el intervalo de operación del
anticuerpo monoclonal que se usó para medirlo, y se encontró que el
protocolo de bloqueo estándar saturaba con éxito esta elevada
capacidad de unión a proteínas, arrojando lecturas de ruido de fondo
bajas en los pocillos de control. Los resultados de estos
experimentos indicaron que una concentración de proteína de 0,5
\mug/ml en el tampón de recubrimiento era óptima para cada una de
las RCBP analizadas. No se encontró que fuera necesario inmovilizar
las proteínas quiméricas en una relación molar específica entre unas
y otras; sólo que debía haber suficiente de cada proteína unida de
forma que los epítopos de esa proteína quimérica no fueran
limitantes en los ensayos de ELISA subsiguientes usando suero de
pacientes. Con fines prácticos, se encontró que estas condiciones se
cumplían cuando el ensayo de captura con anticuerpos monoclonales
alcanzaba una absorbancia de aproximadamente 1,5 unidades o más para
cada anticuerpo monoclonal de ratón, con un epítopo específico
representado en una de las proteínas quiméricas sobre la superficie
del pocillo. Si fuera necesario, sin embargo, pueden ajustarse las
concentraciones de las proteínas individuales de la mezcla para
lograr los niveles deseados de proteína inmovilizada usando
optimización rutinaria. Aunque la cantidad de cada RCBP unida a la
superficie del pocillo y la cantidad de cualquier epítopo expuesto a
la solución varía algo de una proteína a otra, se encontró que la
cantidad de epítopo unido no era limitante dentro del intervalo
operativo del ELISA.
El procedimiento estándar para las pruebas de
ELISA era el siguiente: se diluyeron muestras de suero humano 1:100
en diluyente de especimenes (suero bovino fetal al 10% en PBS a pH
9,0) y se añadieron 100 \mul de cada muestra a los micropocillos
de una placa ELISA que había sido recubierta con antígeno tal como
se describe anteriormente. Tras la incubación durante 1 hora a 37ºC,
las muestras se retiraron y las placas se lavaron tres veces en
TBS-Tween™ (Tris 0,5 M a pH 7,2; NaCl 1,5 M; Tween™
al 0,5%). Antisuero de cabra contra Ig humanas conjugadas con
fosfatasa alcalina específico para IgM (Fc) o IgG (Fab), (Jackson
Immuno Research Laboratories) se diluyó 1:1000 en PBS, a pH 7,4 y se
añadieron 100 \mul de la solución a cada pocillo. Tras la
incubación durante treinta minutos a 37ºC, las placas se lavaron
tres veces con TBS-Tween™ y se añadieron 100 \mul
de la solución sustrato (5 mg de comprimidos de
p-nitrofenilfosfato disueltos en 1 X tampón de
sustrato dietanolamina proporcionando una solución de 2 mg/ml -
Kirkegaard Perry Laboratory) a cada pocillo pocillo. Las placas se
incubaron durante treinta minutos a 37ºC y se añadieron 100 \mul
de solución de terminación (EDTA al 5%) a cada pocillo. Se leyó la
absorbancia a 410 nm en un lector de microplacas (Dynatech). Una
muestra se consideraba positiva si producía una absorbancia media
superior a la media de los controles negativos más tres desviaciones
típicas. Se midió la reactividad cruzada contra suero de pacientes
con sífilis, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide así
como trabajadores de campo de zonas endémicas y trabajadores de
campo de zonas no endémicas.
Usando la prueba ELISA que se describe
anteriormente, se analizó el suero de diversos pacientes. Los
pacientes con eritema migrans agudo (EMA) tenían infecciones
tempranas, localizadas, tipificadas por la presencia de eritema
migrans (EM) bien definido en pacientes de un área endémica. Los
pacientes con infecciones diseminadas tempranas (AD), y diseminadas
agudas (AgD) se tipificaron en base al EM y uno de los siguientes:
lesiones de EM adicionales, bloqueo de AV, anormalidades
neurológicas (por ejemplo, parálisis del VII par craneal) o
meningitis. Los pacientes agudos convalecientes (AgC) se obtuvieron
de los mismos pacientes que los AD y AgD, 2-4
semanas después. También se analizó el suero de los CDC de pacientes
con sífilis bien documentada (S), también se obtuvo suero de SUNY en
Stony Brook, División de Reumatología de pacientes con Lupus
eritematoso sistémico (LES) bien documentado o de pacientes con
artritis reumatoide (AR) bien documentada. Los sueros de
trabajadores del campo de zonas endémicas (End), se obtuvieron de
trabajadores que trabajaban en el campo de Long Island, que es
endémico para la enfermedad de Lyme. Se obtuvieron sueros de zonas
no endémicas (NEnd), de trabajadores que trabajaban en el campo de
Arizona, que no es endémico para la enfermedad de Lyme. Además, se
analizó el suero de trabajadores del campo de zonas endémicas (End)
y de trabajadores del campo de zonas no endémicas (NEnd). Los
polipéptidos de la presente invención se usaron para analizar estos
diversos sueros tal como se resume en la Figura 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Ratones BALB/c hembra, de cuatro a cinco semanas
de edad, se inmunizaron con 5 \mug de proteínas quiméricas OspC en
100 \mul de adyuvante de hidróxido de aluminio por inyección SC
(subcutánea). Se usaron cinco ratones para cada grupo. Para el
control negativo, se inmunizaron cinco ratones BALB/c hembra con 100
\mul de hidróxido de aluminio solo. Dos semanas después de la
inmunización, los ratones recibieron un refuerzo con el mismo
antígeno y dos semanas después de eso se administró un refuerzo
igual. Una semana después de cada refuerzo, se extrajo sangre de
cada ratón (incluidos los controles negativos) y se analizó el
suero, usando el procedimiento de ELISA que se describe
anteriormente, para determinar la presencia de los anticuerpos
contra las respectivas proteínas quiméricas OspC.
Los Ratones se inmunizaron con proteínas
quiméricas según la Tabla VI siguiente.
Se usaron varios tipos de OspC únicas de B.
burgdorferi en sentido estricto, OspCB31, OspC2, OspC5, OspC7,
OspC10, OspC12 y una única OspC de B. afzelii, Ctro, como
antígenos en un ELISA para analizar el suero extraído a los ratones
inmunizados. Tal como se muestra en las Figuras 2 y 3, unlipC2C10 y
unlipC2C12 provocaron una respuesta inmunitaria en forma de
anticuerpos, (una respuesta humoral) contra un amplio abanico de
familias de OspC, después de la primera y segunda extracciones de
sangre, respectivamente. Después, se usó el suero de ratones
inmunizados con unlipC2C10, unlipC2C12, LipCB31 y LipC12 para
analizar polipéptidos de OspC únicos de varias cepas de las tres
especies génicas de Borrelia: Borrelia burgdorferi, Borrelia
afzelii y Borrelia garinii.
Tal como se muestra en la Figura 4, se
analizaron 13 cepas diferentes de B. burgdorferi en sentido
estricto (B.b.s.s.) para determinar la reactividad con los
sueros que se describen anteriormente. Los sueros de los ratones
inmunizados con LipCB31 y LipC12, que era el tratamiento de
referencia de este experimento, detectaron 12/13 de las cepas
B.b.s.s analizadas. Los sueros de ratones inmunizados con
C2C12 no lipidada detectaron 8/13de las cepas analizadas. El uso de
las formas no lipidadas de estas proteínas como inmunógenos de
vacunación o como antígenos de diagnóstico es deseable porque el
rendimiento del producto por vector de expresión es mucho mayor y
las proteínas son mucho más fáciles de purificar. Estas dos razones
por sí solas hacen la producción de estas proteínas menos
costosa.
Tal como se muestra en la Figura 5, las
proteínas quiméricas unlipC2C10 y unlipC2C12 de la presente
invención provocaron una respuesta inmunitaria que detectó 5/6, y
6/6 de las cepas analizadas, comparadas con las proteínas lipidadas
LipC12 y LipCB31 del tratamiento de referencia, que detectaron 5/6 y
3/6de las cepas, respectivamente. Cuando se comparan con la OspC2
parental no lipidada (rOspC2), las proteínas quiméricas unlipC2C10 y
unlipC2C12 provocaron una respuesta inmunitaria y detectaron más
cepas que el tratamiento de referencia ((0/6) comparado con
(5/6)y (6/6) respectivamente). Este resultado no estaba
previsto ni era de esperar.
En otro experimento, tal como se muestra en las
Figuras 6 y 7, las proteínas quiméricas de la presente invención
provocaron una respuesta inmunitaria significativa en todas las 18
cepas diferentes de B. afzelii (Fig. 6) y todas las 21 cepas
diferentes de B. garinii (Fig. 7). Por ejemplo, las quimeras
unlipC2C10 y unlipC2C12 detectaron 12 y 18 de las 18 cepas de B.
afzelii, respectivamente, comparado con 0/18 detectadas por la
C2 parental no lipidada. Las mismas quimeras detectaron 14 y 20 de
las 21 cepas de B. garinii, respectivamente, comparadas con
0/21 detectadas por la C2 parental no lipidada. Además, los
tratamientos de referencia LipCB31 y LipC12 detectaron 2 y 17 de las
18 cepas de B. afzelii, respectivamente y 2 y 15 de las 21
cepas de B. garinii. Estos resultados indican que, al
contrario que LipOspCB31, LipOspC12 y unlipOspC2, la C2C10 no
lipidada y la C2C12 no lipidada que se usaron como inmunógenos
provocaron una respuesta inmunitaria significativa en todas las
diferentes cepas de B. burgdorferi, B. afzelii y B.
garinii que se analizaron.
Se construyeron quimeras adicionales que se
recogen en la Tabla VII.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Research Foundation of the State
University of New York Brook Biotechnologies, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Dattwyler, Raymond J.
\hskip1cm Seinost, Gerald
\hskip1cm Dykhuizen, Danial
\hskip1cm Luft, Benjamin J.
\hskip1cm Maria J.C.
Gomes-Solecki
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Grupos de Borrelia
burgdorferi y Borrelia afzelii que provocan la enfermedad
de Lyme en los seres humanos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2631.1002-003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/140.042
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-06-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagaataca ttaagtgcga tatt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatccactt aatttttgtg ttattag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgttagcag gagcttatgc aatatc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcttgtaa gctctttaac tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 573
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(573)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(557)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 579
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(579)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 582
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(582)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(576)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 576
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(576)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 573
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(573)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(553)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 582
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(582)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1128)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 374
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1124)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1137)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1133)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1112)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1113)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1112
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de OspC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1112)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
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<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera de ospC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1209)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 401
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera de ospC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1205
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera de ospC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1205)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera de ospC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera de ospC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SC
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1236)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 410
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Quimera de ospC
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
Claims (17)
1. Una composición de vacuna que comprende uno o
más excipientes, adyuvantes, tampones, proteínas portadoras o
conservantes o una combinación de los mismos y un agente inmunógeno,
en la que el agente inmunógeno está constituido por uno o más
polipéptidos OspC de cada una de las familias de OspC de Borrelia
burgdorferi que se seleccionan del grupo formado por: A, B, I y
K, en la que la familia A de OspC de Borrelia burgdorferi se
caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029860 y
genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con
el número de acceso de GenBank AF029860, la familia B de OspC de
Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de
acceso de GenBank AF029861 y genes ospC que tienen una
identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank
AF029861, la familia I de OspC de Borrelia burgdorferi se
caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029869 y
genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el
número de acceso de GenBank AF029869 y la familia K de OspC de
Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de
acceso de GenBank U08284 y genes ospC que tienen una
identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank
U08284.
2. La composición de reivindicación 1:
(a) en la que dicho polipéptido OspC comprende
la región variable de la proteína OspC codificada por los
nucleótidos 150-519 de un gen ospC; o
(b) en la que dicho polipéptido OspC está
codificado por un ácido nucleico que comprende desde el nucleótido
26 hasta aproximadamente el nucleótido 621 de un gen ospC;
o
(c) en la que dicho polipéptido OspC está
codificado por un ácido nucleico que comprende desde el nucleótido
53 hasta el nucleótido 570 de un gen ospC; o
(d) en la que al menos dos de dichos
polipéptidos OspC están fusionados en una única proteína, codificada
por un único ácido nucleico, en la que los polipéptidos de dicha
proteína de fusión no se encuentran en la misma configuración en una
proteína OspC natural.
3. La composición de reivindicación 2, en la
que
(a) la familia A de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende las cepas B31, CA4, HII, IPI, IP2, IP3,
L5, PIF, Pka, Txgw y las cepas que contienen alelo de ospC
OC1; o
(b) la familia B de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende las cepas 35B808, 61BV3, BUR, DK7, PB3,
ZS7 y las cepas que contienen los genes ospC OC2 y OC3;
o
(c) la familia I de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende la cepa HB19, las cepas que contienen gen
ospC OC10 y el número de acceso de GenBank L42893, o
(d) la familia K de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende las cepas 272, 28354, KIPP, MUL, las cepas
que contienen el gen ospC OC12 y OC13 y el número de acceso
de GenBank U08284.
4. Uso de una composición para la fabricación de
un medicamento para inmunizar un animal contra la enfermedad de Lyme
diseminada, en el que dicha composición comprende uno o más
excipientes, adyuvantes, tampones, proteínas portadoras o
conservantes o una combinación de los mismos y un agente inmunógeno
en el que el agente inmunógeno está formado por uno o más
polipéptidos OspC de cada una de las familias de OspC de Borrelia
burgdorferi que se seleccionan del grupo formado por: A, B, I y
K, en la que el familia A de OspC de Borrelia burgdorferi se
caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029860 y
genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el
número de acceso de GenBank AF029860, la familia B de OspC de
Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de
acceso de GenBank AF029861 y genes ospC que tienen una
identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank
AF029861, la familia I de OspC de Borrelia burgdorferi se
caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029869 y
genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el
número de acceso de GenBank AF029869 y la familia K de OspC de
Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de
acceso de GenBank U08284 y genes ospC que tienen una
identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank
U08284 de tal forma que el animal genera una respuesta inmunitaria
contra los polipéptidos OspC.
5. El uso de la reivindicación 4, en el que
(a) uno o más de dichos polipéptidos OspC
comprende la región variable de la proteína OspC codificada por los
nucleótidos 150-519 de un gen ospC; o
(b) uno o más de dichos polipéptidos OspC está
codificado por un ácido nucleico que comprende desde el nucleótido
26 hasta el nucleótido 621 de un gen ospC; o
\newpage
(c) uno o más de dichos polipéptidos OspC o un
fragmento del mismo está codificado por un ácido nucleico que
comprende desde el nucleótido 53 hasta el nucleótido 570 de un gen
ospC; o
(d) al menos dos de dichos polipéptidos OspC
están fusionados en una única proteína, codificada por un único
ácido nucleico, en la que los polipéptidos de dicha proteína de
fusión no se encuentran en la misma configuración en una proteína
OspC natural.
6. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 4-5, en el que
(a) la familia A de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende las cepas B31, CA4, HII, IPI, IP2, IP3,
L5, PIF, Pka, Txgw y las cepas que contienen alelo de ospC
OC1; o
(b) la familia B de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende cepas 35B808, 61BV3, BUR, DK7, PB3, ZS7 y
las cepas que contienen los genes ospC OC2 y OC3; o
(c) la familia I de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende la cepa HB19, las cepas que contienen gen
ospC OC10 y el número de acceso de GenBank L42893; o
(d) la familia K de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende las cepas 272, 28354, KIPP, MUL, las cepas
que contienen el gen ospC OC12 y OC13 y el número de acceso
de GenBank U08284.
7. Un procedimiento para detectar, en una
muestra de un huésped, una respuesta inmunitaria contra
Borrelia asociada a la enfermedad de Lyme diseminada que
comprende:
a) poner en contacto la muestra del huésped con
una composición que comprende los polipéptidos OspC de cepas de
Borrelia asociadas a la enfermedad de Lyme diseminada, de tal
forma que los anticuerpos contra OspC, si estuvieran presentes en
dicha muestra, se unen a dichos polipéptidos OspC, en el que dicha
composición está formada por uno o más polipéptidos OspC de cada una
de las familias de OspC de Borrelia burgdorferi que se
seleccionan del grupo formado por A, B, I y K, en el que la familia
A de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por
el número de acceso de GenBank AF029860 y genes ospC que
tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de
GenBank AF029860, la familia B de OspC de Borrelia
burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de
GenBank AF029861 y genes ospC que tienen una identidad de al
menos el 98% con el número de acceso de GenBank AF029861, la familia
I de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por
el número de acceso de GenBank AF029869 y genes ospC que
tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de
GenBank AF029869 y la familia K de OspC de Borrelia
burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de
GenBank U08284 y genes ospC que tienen una identidad de al
menos el 98% con el número de acceso de GenBank U08284, y
b) detectar los anticuerpos que se han unido a
dichos péptidos OspC; detectando así una respuesta inmunitaria
contra Borrelia asociada a la enfermedad de Lyme
diseminada.
8. El procedimiento de reivindicación 7, en el
que
(a) uno o más de dichos polipéptidos OspC
comprenden la región variable de la proteína OspC codificada por los
nucleótidos 150-519 de un gen ospC; o
(b) uno o más de dichos polipéptidos OspC están
codificados por un ácido nucleico que comprende desde el nucleótido
26 hasta el nucleótido 621 de un gen ospC; o
(c) uno o más de dichos polipéptidos OspC o un
fragmento de los mismos están codificados por un ácido nucleico que
comprende desde el nucleótido 53 hasta el nucleótido 570 de un gen
ospC; o
(d) al menos dos de dichos polipéptidos OspC
están fusionados en una única proteína, codificada por un único
ácido nucleico, en la que los polipéptidos de dicha proteína de
fusión no se encuentran en la misma configuración en una proteína
OspC natural.
9. El procedimiento de reivindicación 8, en la
que
(a) la familia A de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende las cepas B31, CA4, HII, IPI, IP2, IP3,
L5, PIF, Pka, Txgw y las cepas que contienen alelo de ospC OC
1; o
(b) la familia B de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende cepas 358808, 61BV3, BUR, DK7, PB3, ZS7 y
las cepas que contienen los genes ospC OC2 y OC3; o
(c) la familia I de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende la cepa HB19, las cepas que contienen gen
ospC OC10 y el número de acceso de GenBank L42893, o
(d) la familia K de OspC de Borrelia
burgdorferi comprende las cepas 272, 28354, KIPP, MUL, las cepas
que contienen el gen ospC OC12 y OC13 y el número de acceso
de GenBank U08284.
10. Una proteína quimérica formada por los
polipéptidos OspC de cada una de las familias de OspC que se
seleccionan del grupo formado por A, B, I y K, en la que la familia
A de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por
el número de acceso de GenBank AF029860 y genes ospC que
tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de
GenBank AF029860, la familia B de OspC de Borrelia
burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de
GenBank AF029861 y genes ospC que tienen una identidad de al
menos el 98% con el número de acceso de GenBank AF029861, la familia
I de OspC de Borrelia burgdorferi se caracteriza por
el número de acceso de GenBank AF029869 y genes ospC que
tienen una identidad de al menos el 98% con el número de acceso de
GenBank AF029891 y la familia K de OspC de Borrelia
burgdorferi se caracteriza por el número de acceso de
GenBank U08284 y genes ospC que tienen una identidad de al
menos el 98% con el número de acceso de GenBank U08284.
11. La proteína quimérica de la reivindicación
10, que comprende:
a) un primer polipéptido OspC codificado por un
ácido nucleico que comprende una secuencia desde el nucleótido 26
hasta el nucleótido 621 de un gen ospC de una primera familia
de OspC y un segundo polipéptido OspC codificado por un ácido
nucleico que comprende una secuencia desde el nucleótido 28 hasta el
nucleótido 570 de un gen ospC de una segunda familia de OspC;
o
b) un primer polipéptido OspC codificado por un
ácido nucleico que comprende una secuencia desde el nucleótido 53
hasta el nucleótido 570 de un gen ospC de una primera familia
de OspC y un segundo polipéptido OspC codificado por un ácido
nucleico que comprende una secuencia desde el nucleótido 28 hasta el
nucleótido 570 de un gen ospC de una segunda familia de
OspC.
12. La proteína quimérica de la reivindicación
10 u 11, en la que dicha proteína no está lipidada.
13. Una proteína quimérica OspC que se
selecciona del grupo formado por: SEC. ID N.º: 24, 26, 28, 30, 34,
36, 42, 52, 54, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 78, 80, 82, 84 y 86.
14. Un ácido nucleico aislado que codifica una
proteína quimérica en la que dicha proteína está formada por:
polipéptidos OspC de cada una de las familias de OspC que se
seleccionan del grupo formado por las familias A, B, I y K de OspC
de Borrelia burgdorferi, en el que la familia A de OspC de
Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de
acceso de GenBank AF029860 y genes ospC que tienen una
identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank
AF029860, la familia B de OspC de Borrelia burgdorferi se
caracteriza por el número de acceso de GenBank AF029861 y
genes ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el
número de acceso de GenBank AF029861, la familia I de OspC de
Borrelia burgdorferi se caracteriza por el número de
acceso de GenBank AF029869 y genes ospC que tienen una
identidad de al menos el 98% con el número de acceso de GenBank
AF029869 y la familia K de OspC de Borrelia burgdorferi se
caracteriza por el número de acceso de GenBank U08284 y genes
ospC que tienen una identidad de al menos el 98% con el
número de acceso de GenBank U08284.
15. El ácido nucleico aislado de la
reivindicación 14, en el que:
a) dicho ácido nucleico comprende una secuencia
desde el nucleótido 26 hasta el nucleótido 621 de un gen ospC
de una primera familia de ospC y una secuencia desde el
nucleótido 28 hasta el nucleótido 570 de un gen OspC de una segunda
familia de OspC; o
b) dicho ácido nucleico comprende una secuencia
desde el nucleótido 53 hasta el nucleótido 570 de un gen ospC
de una primera familia de OspC y un ácido nucleico que comprende una
secuencia desde el nucleótido 28 hasta el nucleótido 570 de un gen
ospC de una segunda familia de OspC.
16. Un ácido nucleico aislado que se selecciona
del grupo formado por: SEC. ID. N.º: 23, 25, 27, 29, 33, 35, 51, 53,
59, 63, 65, 69, 77, 79, 81, 83 y 85.
17. Una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 3 para usar en terapia,
por ejemplo la terapia de la enfermedad de Lyme diseminada.
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Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7060281B1 (en) | 1999-06-18 | 2006-06-13 | Research Foundation Of The State University Of New York | Groups of barrelia burgdorferi and borrelia afzelii that cause lyme disease in humans |
| EP1939294A1 (en) | 2000-08-18 | 2008-07-02 | Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi |
| GB2414667A (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-07 | Isis Innovation | Vaccine compositions of N. meningitidis PorA and FetA antigens |
| US8821893B2 (en) * | 2004-07-02 | 2014-09-02 | Bio Peptides, Corp. | Oral vaccine for Borrelia |
| JP5390189B2 (ja) * | 2005-11-29 | 2014-01-15 | ヴァージニア コモンウェルス ユニバーシティ | 多価キメラｏｓｐｃワクシノーゲンおよび診断用抗原 |
| EP1981513B1 (en) | 2006-01-19 | 2015-05-27 | Mary Kay, Inc. | Compositions comprising kakadu plum extract or acai berry extract |
| WO2008116468A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Dako Denmark A/S | Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| EP3620465B1 (en) | 2007-07-03 | 2025-02-19 | Dako Denmark A/S | Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers |
| US10611818B2 (en) | 2007-09-27 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| DK2254592T3 (da) | 2008-02-28 | 2019-09-09 | Dako Denmark As | MHC-multimerer til Borrelia-diagnostik og sygdom |
| US20110105355A1 (en) | 2008-04-22 | 2011-05-05 | Research Foundation Of State University Of New York | Borrelia burgdorferi cell envelope protein array |
| WO2010009735A2 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Dako Denmark A/S | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| WO2010037402A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| WO2010132758A2 (en) * | 2009-05-14 | 2010-11-18 | Gomes-Solecki Maria J | Ospc-based diagnostic test for lyme disease |
| US8048456B2 (en) | 2009-08-28 | 2011-11-01 | Mary Kay Inc. | Skin care formulations |
| FR2949472B1 (fr) | 2009-08-28 | 2013-08-09 | Biomerieux Sa | Proteines utilisees pour le diagnostic d'une borreliose de lyme |
| US20160097768A1 (en) | 2010-10-20 | 2016-04-07 | Virginia Commonwealth University | Polyvalent chimeric ospc vaccinogen and diagnostic antigen |
| US8808705B2 (en) * | 2010-10-20 | 2014-08-19 | Virginia Commonwealth University | Polyvalent chimeric OspC vaccinogen and diagnostic antigen |
| WO2013067448A2 (en) | 2011-11-03 | 2013-05-10 | Vca Antech Inc. | Compositions and methods to detect various infectious organisms |
| CA2863661C (en) * | 2012-02-01 | 2021-06-01 | Biopeptides Corp | Diagnostic peptides for lyme disease |
| US9562079B2 (en) | 2012-04-18 | 2017-02-07 | Zoetis Services Llc | Vaccines and methods to treat lyme disease in dogs |
| RU2514230C1 (ru) * | 2012-12-14 | 2014-04-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт биохимии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ биохимии" СО РАМН) | Рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса borrelia burgdorferi sensu lato, и способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза |
| JP2017531657A (ja) | 2014-10-07 | 2017-10-26 | ザ リサーチ ファンデーション フォー ザ ステート ユニバーシティ オブ ニューヨーク | 組換えボレリアタンパク質およびその使用のための方法 |
| EP3359558B1 (en) | 2015-10-06 | 2023-12-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Borrelia immunoassays and materials therefor |
| WO2020127222A2 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | Immudex Aps | Panel comprising borrelia mhc multimers |
| WO2025015077A1 (en) | 2023-07-10 | 2025-01-16 | Dynavax Technologies Corporation | Lyme disease vaccines comprising an adjuvant and borrelia outer surface protein a and c antigens |
| WO2025015042A1 (en) | 2023-07-10 | 2025-01-16 | Dynavax Technologies Corporation | Lyme disease vaccines comprising an adjuvant and a borrelia outer surface protein a antigen |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5646016A (en) * | 1991-02-06 | 1997-07-08 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin, thioredoxin-like molecules, and modified thioredoxin-like molecules |
| US6221363B1 (en) | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| EP0686265A4 (en) | 1993-02-26 | 2001-08-22 | Cambridge Biotech Corp | METHOD FOR INDUCING IMMUNITY AGAINST LYME DISEASE AND A COLORIMETRIC TEST FOR ANTISERA'S BORRELIAZIDE ACTIVITY |
| FI955150A7 (fi) | 1993-04-29 | 1995-12-28 | Baxter Ag | OspC-antigeenirokotteiden immunogeenisia formulaatioita lyymisairauden ehkäisyyn ja hoitoon ja rekombinanttimenetelmiä antigeenien valmistam iseksi |
| AU8127494A (en) * | 1993-11-01 | 1995-05-23 | Associated Universities, Inc. | Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides: uses therefor |
| AU2207195A (en) * | 1994-04-05 | 1995-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modified receptors that continuously signal |
| AR003941A1 (es) * | 1995-04-19 | 1998-09-30 | Polymun Scient Immunbilogische Forschung Gmbh | Anticuerpos monoclonales humanos neutralizadores de hiv-1 |
| US5804427A (en) * | 1995-05-19 | 1998-09-08 | University Of Massachusetts | Cytokine-, stress-, and oncoprotein-activated human protein kinase kinases |
| US5683903A (en) * | 1995-05-30 | 1997-11-04 | Smithkline Beecham Corporation | Attachment enhanced 293 cells |
| US6251405B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-06-26 | Connaught Laboratories, Inc. | Immunological combination compositions and methods |
| US5849891A (en) * | 1995-07-28 | 1998-12-15 | National Science Council | Satellite RNA from bamboo mosaic virus as a vector for foreign gene expression in plants |
| GB9517585D0 (en) * | 1995-08-29 | 1995-11-01 | Cookson William O C | Atopy diagnosis and therapy |
| US5756294A (en) * | 1995-09-25 | 1998-05-26 | Oncormed, Inc. | Susceptibility mutation for breast and ovarian cancer |
| GB9526218D0 (en) * | 1995-12-21 | 1996-02-21 | Gene Shears Pty Ltd | DNA Sequences |
| WO1997039105A1 (en) * | 1996-04-18 | 1997-10-23 | The Johns Hopkins University | Mad-related genes in the human |
| DE69718903T2 (de) | 1996-05-02 | 2003-12-04 | Dakocytomation Denmark A/S, Glostrup | Verwendung von aus osp-c abgeleiteten peptidefragmenten für diagnostische methoden |
| US6110703A (en) * | 1996-07-05 | 2000-08-29 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of polypeptides |
| US5824318A (en) * | 1996-07-24 | 1998-10-20 | American Cyanamid Company | Avirulent herpetic viruses useful as tumoricidal agents and vaccines |
| WO1998011216A1 (en) * | 1996-09-11 | 1998-03-19 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Novel semaphorin gene: semaphorin y |
| US6131578A (en) * | 1996-10-02 | 2000-10-17 | King; George L. | Inhibitors of UDP-G1cNAc:Ga1β1-3Ga1NAcαR β1-6 N-acetylglucosaminyltransferase (core 2 G1cNAc-T) and use of the inhibitors to prevent or treat cardiomyopathy associated with diabetes |
| AU6546898A (en) | 1997-03-11 | 1998-09-29 | Genetics Institute Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
| US6420108B2 (en) * | 1998-02-09 | 2002-07-16 | Affymetrix, Inc. | Computer-aided display for comparative gene expression |
| DE19740735A1 (de) | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6194556B1 (en) * | 1997-12-11 | 2001-02-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Angiotensin converting enzyme homolog and therapeutic and diagnostic uses therfor |
| US6150081A (en) * | 1997-12-24 | 2000-11-21 | Fuji Photo Film B.V. | Silver halide emulsions with recombinant collagen suitable for photographic application and also the preparation thereof |
| WO1999041378A1 (en) * | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Members of the d52 gene family |
| WO1999050399A2 (en) * | 1998-04-01 | 1999-10-07 | Danisco A/S | Non-maltogenic exoamylases and their use in retarding retrogradation of starch |
| US6245525B1 (en) * | 1998-07-27 | 2001-06-12 | Ludwig Institute For Cancer Research | Tumor associated nucleic acids and uses therefor |
| WO1999055840A1 (en) * | 1998-04-27 | 1999-11-04 | The Regents Of The University Of California | A transcription factor and method for regulation of seed development, quality and stress-tolerance |
| EP1100922B1 (en) | 1998-07-31 | 2008-02-20 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. | Uses of the borreliacidal epitope(s) of borrelia burgdorferi outer surface protein c (ospc) as vaccine |
| US6627193B1 (en) * | 1999-01-13 | 2003-09-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and compositions for control of blood coagulation |
| US6468773B1 (en) * | 1999-05-19 | 2002-10-22 | Genencor International, Inc. | Mutant 1,3-propandiol dehydrogenase |
| US7060281B1 (en) * | 1999-06-18 | 2006-06-13 | Research Foundation Of The State University Of New York | Groups of barrelia burgdorferi and borrelia afzelii that cause lyme disease in humans |
| US6470277B1 (en) * | 1999-07-30 | 2002-10-22 | Agy Therapeutics, Inc. | Techniques for facilitating identification of candidate genes |
| US6472154B1 (en) * | 1999-12-31 | 2002-10-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Polymorphic repeats in human genes |
| US6337208B1 (en) * | 2000-01-03 | 2002-01-08 | Stefan Graupner | Cloning vector |
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