ES2272448T3 - Genes de la subunidad il-12p40 mutados para mejorar la actividad de il-12 y uso de los mismos en un coadyuvante de vacuna genetica. - Google Patents
Genes de la subunidad il-12p40 mutados para mejorar la actividad de il-12 y uso de los mismos en un coadyuvante de vacuna genetica. Download PDFInfo
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Abstract
Un gen que codifica una subunidad IL-12p40 humano mutado, en el que se sustituye la Asn-222, descrita en la SEC. DE ID Nº 1, que es esencial para la secreción de la IL-12p40 humana.
Description
Genes de la subunidad IL-12p40
mutados para mejorar la actividad de IL-12 y uso de
los mismos en un coadyuvante de vacuna genética.
La presente invención se refiere a genes de la
subunidad IL-12p40 mutante que producen
interleuquina 12 (IL-12) humana y de ratón muy
activa, el vector de expresión que contiene aquellos genes mutantes
y los procedimientos para usar los mismos para un coadyuvante de la
vacuna de ADN. De manera particular, esta invención se refiere a
los genes de la subunidad IL-12p40 mutante que
pueden segregar normalmente IL-12p70 inmunoactivo
pero reducen la secreción de IL-12p40 induciendo la
mutación de los aminoácidos Asn-222 (ratón) o
Asn-220 (humano) de IL-12p40
trabajando como un inhibidor competitivo para activar
IL-12.
IL-12 se segrega por el antígeno
que presentan las células (APC) tales como macrófagos, monolitos y
células B tras conseguir la estimulación apropiada, y trabaja como
un regulador para muchos tipos de respuestas inmunes in
vivo. De manera particular, IL-12 tiene un
amplio intervalo de actividades que incluyen la proliferación del
auxiliar T de tipo 1 activado (Th1) y las células asesinas naturales
(NK), la regulación de la producción de muchas citoquinas, la
inducción de las respuestas inmunes de la célula auxiliar T de tipo
1, la diferenciación de las células CD8 + T, la estimulación de las
células del tronco hematopoiético (Hsieh, C. S. y col.,
Science, 260:547-549, 1993), y, de manera
especial, la regulación de la respuesta inmune promoviendo la
actividad lítica de los linfocitos T citotóxicos (CTL y las células
NK (Robertson, M. J y J. Ritz., Oncologist,
1:88-97, 1999; Trinchieri, G., Annu. Rev.
Immunol., 13:251-276, 1995). De acuerdo con
informes recientes, las células mononuclerares de la sangre
periférica (PBMC) de pacientes infectados con el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) produjeron cinco veces menos
IL-12 biológicamente activa (Chehimi, J. y col.,
J. Exp. Med., 179: 1361-1366, 1994), y se
encontró que las infecciones micobacterianas y por Salmonera
carecían de la expresión del receptor IL-12 (de
Jong, R. y col., Science, 280:1435-1348.
Debido a estos papeles de IL-12, este podría inducir
una fuerte respuesta inmune in vivo frente a virus,
bacterias y diversos cánceres. Por tanto, los presentes inventores
pueden esperar el desarrollo de muchos agentes de tratamiento usando
la presente invención.
En función de la teoría que
IL-12 se relaciona con el crecimiento de la memoria
de Th1 y la memoria de las células CTL (Stobie, L. y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 97:8427-8432, 2000;
Mortarini, R. y col., Cancer Res.,
60:3559-3568, 2000; Mbawuike, I. N. y col., J.
Infect. Dis., 180:1477-1486, 1999), se cree que
IL-12 se va a usar como un coadyuvante de vacuna
efectivo o un agente de tratamiento frente a diversas enfermedades
que requieren la respuesta inmune celular. Considerando la
metástasis o reaparición, que es la parte más difícil del
tratamiento del cáncer. Es especialmente necesaria la inducción de
la memoria de la respuesta inmune. Sin embargo como no se ha
clarificado hasta hoy en día el mecanismo exacto de
IL-12, que se conecta con aquellos efectos. Pero
basándose en los datos actuales disponibles, existen algunos
indicios del mecanismo por el cual IL-12 sostiene
las células CD4+ Th1. En el supuesto de la diferenciación de Th1, se
estimula la producción de IFN-\gamma e
IL-2 disminuye. Debido a que IL-2 es
un factor de crecimiento potente e IFN-\gamma es
antiproliferativo, IL-12 podría funcionar para
sostener el crecimiento celular y la disponibilidad o para evitar
la apóptosis de las células T CD4+ e IFN-\gamma
(Fuss, I. J. y col., Gastroenterology,
117:1078-1088, 199; Marth, T. y col., J.
Immunol., 162:7233-7240, 1999). También,
IFN-\gamma que se aumenta mediante
IL-12 aumenta la expresión de IL-15
(Zhang, X. y col., Immunity, (:591-599,
1998), que se relaciona con la memoria de la célula CD8 + T.
Basándose en estos informes, IL-12 es muy útil en la
inmunización de la vacuna debido a que IL-12 se
relaciona no sólo con la respuesta inmune temprana sino también con
la memoria de la respuesta inmune.
La forma biológicamente funcional de
IL-12 es un heterodímero de 70 kDa,
IL-12p70, que está constituido por las subunidades
enlazadas de disulfuro p40 y p35. La subunidad p40 contribuye a la
homología de la secuencia de ayuda del amino con el receptor
IL-6, perteneciendo de esta manera a la superfamilia
del receptor de la citoquina, por cuanto la subunidad p35 tiene una
relación distante, pero significativa, con la colonia de
IL-6/granulocitos que estimula el factor de la
familia de las citoquinas (Gearing, D. P., y Cosman, D.,
Cell, 66:9-10, 1991).
El IL-12p40 se segrega como un
monómero y un homodímero en gran exceso sobre
IL-12p70, ambos in vitro (D’Andrea y col.,
J. Exp. Med., 176:1387-1398, 1992; Podlasky,
F. J. y col., Arch. Biochem. Biophys.,
294:230-237, 1992) e in vivo (Mattner, F.
y col., Eur. J. Immunol., 23:2202-2208, 1993;
Heinzel, F. P. y col., Infect. Immun.,
62:4244-4249, 1994). Se ha demostrado que
IL-12p40 antagoniza fuertemente las respuestas
mediadas por IL-12p70 enlazando competitivamente
con el receptor IL-12 in vitro (Gillessen, S.
y col., Eur. J. Immunol., 25:200-206, 1995;
Ling, P. y col., J. Immunol., 154:116-127,
1995), sugiriendo el papel crítico de IL-12p40 como
antagonista natural de IL-12p70.
Esto se sostiene mediante diversas observaciones
que incluyen una reducción en las respuestas de Th1 en el
IL-12p40 de ratones transgénicos (Yoshimoto, T. y
col., J. Immunol., 160:588-594, 1998), la
prevención del rechazo alogénico en mioblastos transplantados
construidos para producir IL-12p40 (Kato, K. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:9085-9089, 1996), y
la inhibición de la actividad de supresión del tumor de
IL-12p70 mediante la expresión de
IL-12p40 en adenovirus (Chen, L. y col., J.
Immunol., 159:351-359, 1997). En contraste,
existe un informe que describe un papel positivo de
IL-12p40 en las respuestas mediadas por
IL-12p70 dando como resultado el desarrollo de Th1
específico del aloantígeno, bajo ciertas condiciones (Piccotti, J.
R. y col., J. Immunol., 157:1951-1957,
1996). Además, se conoció por los inventores una función nueva de
IL-12p40 como molécula quimiotáctica del macrófago
(Ha, S. J. y col., J. Immunol., 163:
2902-2908, 1999).
Se han establecido diversos sistemas in
vivo con el fin de probar el efecto anticanceroso de
IL-12p70. Sin embargo, existe un efecto secundario
significativo que podría dar como resultado la muerte si se inyecta
de manera directa la proteína IL-12p70 recombinante
humana en un paciente con cáncer (Robertson, M. J. y Ritz, J.,
Oncologist, 1:88-97, 1996; Cohen, J.,
Science, 270:908, 1995). Para evitar este efecto secundario y
ser efectivos en la economía, se han llevado a cabo lotes de
estudio sobre la terapia génica usando el gen IL-12,
que prueba ahora que el tratamiento génico con
IL-12 es muy efectivo y no tiene peligro
(Rakhmilevich, A. L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93:6291-6296, 1996; Tahara, H. y col., J.
Immunol., 154:6466-6474, 1995; Lotze, M. T.
y col., Ann. N. Y. Acad. Sci., 795:440-454,
1996).
IL-12p70, una forma
biológicamente activa de IL-12, es esencial (Gulber,
U. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88:4143-4147) para la terapia génica que usa
IL-12 y, los ADNc de p35 y p40 deberán expresarse en
una célula en el mismo momento. Se han usado muchos procedimientos
para expresar de manera simultánea las subunidades p35 y p40
conjuntamente en una célula. Uno de ellos es usar el cassette de
expresión a través del cual p35 y p40 se sitúan en hilera
consecutiva y se expresan cada uno por el otro (Rakhmilevich, A. L.
y col., Pro. Natl. Acad. Sci. USA,
93:6291-6296, 1996). Otro es usar el emplazamiento
de entrada ribosómica interna (IRES) del virus de la
encéfalomiocarditis (EMCV) para la expresión simultánea de ambos
genes. Estos procedimientos son satisfactorios para la expresión de
IL-12p70 en una célula, pero tal como se ha
mencionado anteriormente, no son satisfactorios para eliminar la
posibilidad que el IL-12p40 expresado de manera
continua inhiba la acción biológica de
IL-12p70.
Para superar este defecto intrínseco, se propuso
de manera reciente el enlace genético de la subunidad p35 seguido
por la subunidad p40 por medio de una secuencia de ADN que codifica
un ligante de una proteína usada comúnmente en ingeniería de
anticuerpos (Lieschke, G. J. y col., Nat. Biotechnol.,
15:35-40, 1997; LODE, H. N. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 95:2475-2480, 1998; Lee, Y. L. y
col., Human Gene Ther., 9:457-465, 1998). Se
podría superar el efecto antagonístico del Il-12p40
excesivo frente a la actividad biológica de
IL-12p70 en el procedimiento anterior. No es todavía
bastante bueno tener el problema que la actividad del
IL-12p79 estuviera de 5-100 veces
más disminuida debido a que se puede cambiar su estructura cuando
p35 y p40 se enlazan conjuntamente. Para el tratamiento efectivo
frente al cáncer u otras enfermedades con el gen
IL-12, se requiere inducir el
IL-12p70 que tenga todavía la misma actividad y
evitar la secreción de IL-12p40. Se ha conocido la
glicosilación por contribuir al plegado, secreción, conformación,
estabilidad y actividad biológica de la proteína. Las subunidades
p35 y p40 del IL-12 humano expresan 219 y 328
aminoácidos que contienen 56 y 22 aminoácidos de secuencias señal
hidrófobas, de manera respectiva. El análisis de la secuencia de
aminoácidos del IL-12 humano revela tres y cuatro
emplazamientos de N-glicosilación supuestos dentro
de las subunidades p35 y p40, de manera respectiva (Podlasky, F. J.
y col., Arch. Biocem. Biophys., 294:230-237, 1992).
Stern y col. informaron que tras el tratamiento del
IL-12 humano con ácido trifluorometanosulfónico o la
glicosidasa F, IL-12p35 e IL-12p40
se redujeron en el peso molecular (Podlasky, F. J. y col., Arch.
Biochem. Biophys., 294:230-237, 1992). Esto sugiere
que la subunidades p35 y p40 del IL-12 humano se
componen de hidratos de carbono. En el mismo informe, se demostró
también que la digestión de IL-12p35 con neuramidasa
seguida por la
endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa
redujo su peso molecular mientras que IL-12p40 no se
vio afectada por dicho tratamiento. Estos experimentos indican que
la glicosilación de IL-12p35 se ve contribuida por
los oligosacáridos O-enlazados y que
IL-12p40 no tiene hidratos de carbono
O-enlazados. Y en el análisis de la
N-glicosilación en los residuos de aminoácidos
Asn-135 y Asn-222, se reveló que
Asn-222 es el emplazamiento de
N-glicosilación. Sin embargo, no se han definido los
emplazamientos exactos de N-glicosilación del
IL-12 humano y de ratón y sus efectos sobre la
síntesis, la secreción y la actividad biológica de
IL-12-.
Por otra parte, se han acelerado los estudios
que usan el gen IL-12 debido a que se requiere la
respuesta inmune mediada por células más bien que la respuesta
inmune humoral para la prevención y tratamiento de muchas
enfermedades víricas y bacterianas junto con la supresión de la
formación del cáncer. La hepatitis C es la enfermedad mediada por
virus representativa y una vez infectados con HCV, más del 50% de
los pacientes llegan a ser crónicos y finalmente conduce a la
cirrosis hepática o al cáncer de hígado (Alter, H. J. y col., N.
Engl. J. Med., 321:1494-15000, 1989). Como hasta
hoy en día, únicamente se conoce el
\alpha-interferón como agente de tratamiento para
la hepatitis C, pero el efecto no es suficientemente bueno
(10-30% (Weiland, E. y col. J. Virol.,
66:3677-3682, 1992). De esta manera, se requieren de
manera urgente la vacuna o los agentes de tratamiento más efectivos
frente al HCV. De acuerdo con los informes del ensayo médico que
incluyen seres humanos y chimpancés, así como HCV se refiere a la
respuesta inmune humoral específica y a la respuesta inmune mediada
por células (Prince, A. M. y col., J. Infect. Dis.,
165;438-443, 1992), E1 y E2, las proteínas
estructurales de HCV, se informan como antígeno principal para
inducir la inmunidad protectora (Choo, Q. L. y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91:1294-1298, 1994). Una vez
más, se necesita de manera preferible la respuesta inmune mediada
por células que incluye CTL, para eliminar el HCV en comparación con
la respuesta inmune humoral (Cooper, S. y col., Immunity,
10:439-449, 199; Rinaldo, C. y col., J. Virol.,
69:5838-5842, 1995).
La inmunización mediante ADN es el procedimiento
más reciente para inducir la respuesta inmune mediada por células.
La inmunización mediante ADN se diferencia con una de las existentes
en que usa patógenos muertos o detoxificados o algunas partes del
patógeno en cuestión para insertar el ADN que codifica un componente
específico del patógeno de manera directa en el cuerpo humano. Se
conoce también la inmunización mediante ADN por inducir una fuerte
respuesta inmune frente a diversas infecciones por virus tales como
gripe, hepatitis B y el virus de la inmunodeficiencia humana
(Ulmer, J. B. y col., Science, 259:1745-1749,
1993; Michel, M. L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92:5307-5311, 1995; Irwin, M. J. y col., J.
Virol., 68:5306-5044, 1994). De manera
adicional, se informa también de la inmunización mediante ADN por
inducir la respuesta inmune especial frente a la cápsida y la
proteína E2 de HCV (Major, M. E. y col., J. Virol.,
69:5798-5805, 1995; Tedeschi, V. y col.,
Hepatology, 25:459-462, 1997).
Sin embargo, la inmunización mediante ADN se
limita en el uso debido a que la frecuencia de la expresión de un
antígeno es baja in vivo. Se usaron algún tipo de genes de
moléculas coestimuladoras que son necesarios para la activación de
las células inmunes para aumentar el efecto de la inmunización
mediante ADN (Geissler, M. y col., J. Immunol.,
159:5107-5113, 1997; Iwasaki, A. y col., J.
Immunol., 158:4591-4601, 1997; Lee, S. W. y
col., J. Virol., 72:8430-8436, 1997). Se usó
también el gen IL-12 para inducir la respuesta
inmune frente a HCV de manera efectiva (Lasartte, J. J. y col.,
J. Immunol., 162:270-277, 1999). Aquello, sin
embargo, ha proporcionado resultados insatisfactorios en lo que
respecta, de manera especial a la inmunización mediante ADN con
seres humanos y primates (Boyer, J. y col., Keystone Symposium on
DAN Vaccines 12 al 17 de Abril de 1998)
Los presentes inventores trabajaron mucho para
producir genes que puedan expresar IL-12p70 activo
mediante el control de la glicosilación y que puedan minimizar la
secreción de IL-12p40 disminuyendo la actividad
inmune mediante la acción de IL-12. Como resultado,
se obtuvo el gen mutante mediante la mutación de
Asn-222, el emplazamiento de glicosilación de
Asn-222, el emplazamiento de glicosilación de la
subunidad IL-12p40 en seres humanos y
Asn-220y el emplazamiento de glicosilación de la
subunidad IL-12p40 en ratones. Se usaron los genes
mutantes obtenidos que aumentan la expresión del
IL-12p79 activo y disminuyen la secreción de
IL-12p40 en un modelo de animal pequeño, el ratón,
junto con el gen E2 de HCV para la inmunización del ADN. Mediante
este ensayo, se indujo la mejor respuesta inmune mediada por
células e incluso se continuó esta respuesta inmune un período
largo. De esta manera, es cierto que el gen mutante de la presente
invención es muy útil como coadyuvante para la vacuna d ADN.
Es un objetivo de esta invención proporcionar el
gen mutante IL-12p40 que activa el papel básico de
Il-12 de tal manera que la activación de las
células CTL o la estimulación de la respuesta inmune a través las
células TH1 mediante mutación del emplazamiento de glicosilación
que es esencial en la secreción de IL-12p40 en seres
humanos o en ratón, para disminuir la secreción de
IL-12p40 que inhibe la activación de
IL-12p70 enlazando el receptor de
IL-12p70 de manera competitiva.
Es un objetivo adicional de esta invención
proporcionar un coadyuvante que mantenga e incremente la respuesta
inmune específica del antígeno mediante la inmunización con ADN
usando el vector de expresión que contiene el gen mutante
IL-12p40 y la vacuna de ADN conjuntamente.
La Fig. 1 muestra la homología de la secuencia
de aminoácidos entre seres humanos y ratón
IL-12p40.
La Fig. 2 muestra las subunidades p40 y p35 del
IL-12 humano de tipo salvaje, y unos cambios de
aminoácidos en los emplazamientos de
N-glicosilación supuestos de las subunidades p40 y
p35 en la presente invención.
La Fig. 3a muestre el resultado del análisis
western blot del IL-12p35 humano y sus derivados con
las mutaciones en los emplazamientos de
N-glicosilación supuestos en un lisado de células de
la presente invención.
La Fig. 3b muestra el resultado del análisis
western blot del IL-12p40 humano y sus derivados con
las mutaciones en los emplazamientos de glicosilación supuestos en
el lisado de células de la presente invención.
La Fig 3c muestra el resultado del análisis
western blot del IL-12p40 humano y sus derivados con
las mutaciones en los emplazamientos de
N-glicosilación supuestos en el sobrenadante celular
de la presente invención.
La Fig. 4 muestra un vector de expresión de la
presente invención que se inserta con la envoltura de glicoproteína
2 (E2) del gen del virus de la hepatitis C (HCV) y el gen
IL-12 de tipo salvaje o mutante de ratón.
La Fig. 5a muestra el resultado de una medida de
la valoración del anticuerpo de la IgG total con E2 de HCV en el
suero de ratón que se inmuniza con el vector de ADN de la presente
invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 5b muestra el resultado de una medida de
la valoracióndel anticuerpo de IgG1 con E2 de HCV en suero de ratón
que se inmuniza con el vector de ADN de la presente invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 5c muestra el resultado de una medida de
la valoración del anticuerpo de IgG2a con E2 de HCV en suero de
ratón que se inmuniza con el vector de ADN de la presente
invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 5d muestra el resultado de una medida de
la relación de la valoración de los anticuerpos de IgG2a e IgG1
(IgG2a/IgG1) con E2 de HCV con suero de ratón que se inmuniza con el
vector de ADN de la presente invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 6a muestra el resultado de una medida
del nivel de producción de IFN-\gamma de los
esplenocitos de ratón obtenidos 3 semanas después de la
inmunización con un vector de ADN de la presente invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 6b muestra el resultado de una medida
del nivel de producción de IFN-\gamma de los
esplenocitos de ratón obtenidos 6 semanas después de la
inmunización con el vector de ADN de la presente invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig 6c muestra el resultado de la medida del
nivel de producción de IFN-\gamma de los
esplenocitos de ratón obtenidos 10 semanas después de la
inmunización con el vector de ADN de la presente invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 7 muestra el resultado de la medida de
la actividad específica de los CTL con E2 de HCV usando células
tumorales CT26 construidas mediante ingeniería que expresan hghE2t
tras la inmunización con el vector de ADN de a presente
invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
a; justo después de la inmunización, b; 3
semanas después de la inmunización,
c; 6 semanas después de la inmunización, d; 10
semanas después de la inmunización,
e; 14 semanas después de la inmunización; f; 14
semanas después de la inmunización, control (células
CT26-neo).
La Fig. 8a muestra el resultado de la medida de
los niveles de IgG, IgG1 e IgG2 totales con E2 de HCV en suero de
ratón 2 semanas después de la estimulación con células tumorales
CT26 construidas mediante ingeniería que expresan hghE2t en ratones
inmunizados con el vector de ADN de la presente invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig 8b muestra el resultado de la medida de
la relación de las valoraciones de IgG2a e IgG1 (IgG2a/IgG1) con E2
de HCV en suero de ratón 2 semanas después de la estimulación con
células tumorales CT26 construidas mediante ingeniería que expresan
hghE2t en ratones inmunizados con el vector de ADN de la presente
invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 8c muestra el resultado de la medida del
cambio del nivel de producción de IFN-\gamma de la
célula tumorales que expresan hghE2t en ratones inmunizados con el
vector de ADN de la presente invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 8d muestra el resultado de la medida del
índice de supervivencia de los ratones estimulados con células
tumorales CT26 construidas mediante ingeniería genética que expresan
hghE2t tras la inmunización con el vector de ADN de la presente
invención.
GI; Ratón que se inmuniza con 200 \mug de
pTV2.
GII; Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.
GIII: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12wt.
GIV: Ratón que se inmuniza con 100 \mug de
pTV2-HCV-gDsE2t y 100 \mug de
pTV2.-mIL-12mut.
La Fig. 9 muestra una vista esquemática de la
función biológica de IL-12 in vivo.
| \ding{115}; p35 | \medcirc; p40 |
| \medcirc\medcirc; (p40) 2, | \ding{115}\medcirc; IL-12 (p70) |
Para alcanzar aquellos objetivos, la presente
invención proporciona genes de la subunidad del mutante
IL-12p40 de ser humano o ratón en los que se
sustituye Asn-222 (humano) o Asn-22º
(ratón) que son esenciales para la secreción de
IL-12p40 con otros aminoácidos.
La presente invención proporciona el constructo
y el vector de expresión del gen que contiene la secuencia IRES
para la coexpresión de los genes de la subunidad
IL-12p40 mutada humano o ratón y los genes de la
subunidad IL-12p35 de ser humano o ratón, de manera
respectiva.
Finalmente, la presente invención proporciona un
coadyuvante terapéutico o profiláctico para la inmunización
mediante ADN o terapia génica, que comprende un gen que codifica una
subunidad IL-12p40 humano o ratón, o un constructo
de gen o un vector de expresión que comprende dicho gen, en el que
se mutan el ASn -222 de la subunidad IL-12p40 de
ser humano o el Asn-220 de la subunidad
IL-12p40 de ratón esenciales para la secreción de
IL-12p40 y en el que usa el coadyuvante para la
estimulación de la respuesta inmune.
Las características adicionales de la presente
invención aparecerán a partir de ahora en el presente documento.
Una vez de nuevo, la presente invención es para
proporcionar genes del mutante IK-12p40 de ser
humano o ratón en los que se sustituyen Asn-222
(humano) o Asn-220 (ratón) juegan un papel muy
importante en la secreción del IL-12p40 humano que
tiene la SEC. Nº 1 o IL-12p40 en ratón que tiene
la SEC Nº 2 con otros aminoácidos.
Comparando con la secuencia de aminoácidos del
IL-12p40 humano y ratón, el Asn-220
del IL-12p40 de ratón se localiza en un contexto
muy similar al del Asn-222 del
IL-12p40 de ser humano (Fig. 1).
De manera más específica, se puede cambiar el
codón AAC que designa el Asn-222 de la subunidad
IL-12p40 humano con CUC, CAG o AUA, etc, y los
aminoácidos que se encuentran bajo cada uno de aquellos son Leu, Gln
e ILe. La presente invención proporciona ejemplos de ensayo que
demuestran que AAC se cambió en CTC o CAG sobre el ADNc, y de esta
manera se intercambió el codón con CUC o CAG. Finalmente, la
presente invención proporciona el gen mutante en el que se
sustituyó el Asn-222 con Leu-222
(hp40-N222L) o Gln-222
(hp40-N222Q).
El codón ACC que designa el
Asn-220 de la subunidad IL-12p40 en
ratón que se comparó con el Asn-222 de la subunidad
IL-12p40 humano se puede cambiar con CUC, CAG o AUA
y los aminoácidos que se encuentran bajo cada uno de aquellos son
Leu, Gln e i.e. La presente invención proporciona el gen mutante que
el que se sustituyó el aminoácido Asn-220 con
Leu-220 (mp40-N220L) cambiando AAC
con CTC sobre el ADNc.
Los genes mutantes, hp40-N222L,
hp40-N222Q y mp40-N220L de la
presente invención son secuencias que codifican los aminoácidos
señaladas como SEC. Nº 3, SEC. Nº 4 y SEC. Nº 5 de manera
respectiva.
La presente invención proporciona un constructo
de gen que contiene IRES para la expresión simultánea de la
subunidad por sí misma y el gen de la subunidad Il12p40 mutante y el
vector de expresión que incluye este constructo de gen.
Primero de todo, la presente invención
proporciona los genes hp40-N222L/IRES/hp35,
hp35/IRES/hp40-N222l y
mp35/IRES/mp40-N220L que contienen los genes que se
han explicado anteriormente. El gen
hp40-N222L/IRES/hp35 y el gen
hp35/IRES/hp40-N222L incluyen el gen que codifica la
subunidad p35 junto con la subunidad p40 de ser humano que tiene
Leu-222 en vez de Asn-222, mientras
que el gen mp35/IRES/mp40-N220L incluye el gen que
codifica la subunidad p35 junto con la subunidad p40 de ratón cuyos
emplazamientos ASn-220 se sustituyeron con
Leu-220. Ambos genes tienen la secuencia IRES para
la expresión simultánea de las subunidades. El IRES procedente de
EMCV (encéfalomiocarditis) es preferible para genes tales como
hp40-N222L/IRES/hp35,
hp35/Ireshp40-N222L y
mp35/IRES/mp40-N220L, pero no se limita a los
mismos. La secuencia IRES es importante en la coexpresión de los
genes que codifican la subunidad p40 y la subunidad p35.
La presente invención proporciona vectores de
expresión, por ejemplo,
pgx0-hp40-N222L/IRES/hp35 que
contiene hp40-N222L/IRES/hp35, así como
paso-hp35/IRES/hp40-N222L que
contiene hp35/IRES/hp40-N222L y
pTV2-mp35/IRES/mp40-N22L que
contiene mp35/IRES/mp40-N220L
La presente invención muestra un ejemplo en el
que el plásmido pGX0, un vector de vacuna de ADN llega a ser
posible usarse en el experimento médico insertando el gen resistente
a la kanamicina en vez del resistente a la ampicilina del vector de
vacuna del ADN pTV2 (Song, M. K. y col., J. Virol.,
74:2920-2925, 2000) y el gen
hp40-N222L/IRES/hp35 y el gen
hp35/IRES/hp40-N222L se insertaron en la parte de
este plásmido pGX40 que está lista para recibir los genes
anteriores. Y el gen mp35/IRES/mp40-N220 se insertó
en el gen anterior recibiendo parte del vector pTV2 de la vacuna de
ADN. Además de los plásmidos anteriores usados para fabricar
vectores de expresión, existen diversos vectores incluyendo los
procariotas o los eucariotas, que hacen posible el uso de un vector
diferente con un objetivo diferente. Es posible también cambiar el
tamaño y la secuencia del nucleótido del gen que se va a insertar
en el gen anterior recibiendo parte del vector de expresión.
Los vectores de expresión,
pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L y
pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35 de la
presente invención se depositaron en el Gene Bank del Korea
Research Institute of Bioscence and Biotechnology el 26 de Febrero
de 2001 (Nº de Acceso: KCTC 0969BP y KCTC 0970BP). Y el
pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L se
depositó el 29 de Febrero de 2000 (Nº de Acceso: KCTC 0745BP).
Ya que la coexpresión de p35 y p40 es esencial
para obtener un IL-12p70 biológicamente activo, los
vectores de expresión bicistrónicos,
pGX0-hp40/IRES/hp35 y
pGX0-hp35/IRES/hp40, se generaron usando IRES de
EMCV además de pCIN-hp35 o
pCIN-hp40 que expresan hp35 o hp40 de manera
respectiva. Para comprender la influencia de la
N-glicosilación sobre la síntesis, secreción y
actividad específica del IL-12 humano, se volvió a
colocar el residuo de aminoácido Asn en el emplazamiento supuesto
de N-glicosilación en la subunidad p35 y p40 con
otros residuos de aminoácidos mediante la mutagénesis dirigida al
emplazamiento (Fig. 2). Mediante el inmunoblot de la proteína de
tipo salvaje sobre la proteína mutante (Fig. 3a, 3b y 3c), se
aseguró que se usaban Asn-127, -141 de la subunidad
hp35 y Asn-222, -303 de la subunidad hp40 para la
N-gicosilación.
Para detectar el efecto de la
N-glicosilación de hp35 o hp40 sobre la síntesis de
la heterodimerización y secreción de IL-12p70, se
transfectaron las células con el vector de expresión
hiL-12 que contenía el gen de tipo salvaje o el gen
mutante, y a continuación se analizó mediante ELISA usando el
sobrenadante del cultivo y el lisado celular obtenido del
mismo.
Como resultado, se ha clarificado que el
Asn-127 de hp35 produce la disminución de a
heterodimerización y la secreción de IL-12p70. Sin
embargo, en comparación con el hp35 de tipo salvaje,
Asn-141 de hp35 no parece relativamente afectar
mucho a la heterodimerización y secreción de
IL-12p70 e IL12p40 (Tabla 1).
De manera adicional, la mutación de
Asn-135 o Asn-222 de la subunidad
hp40 disminuye de manera significativa la secreción de
IL-12p40, aunque no afecta la secreción de
IL-12p70. b. De manera especial, la secreción del
hp40 se reduce al grado de un 8% de manera relativa con el hp40 de
tipo salvaje mediante Asn-222. Aunque
Asn-135 de hp40 no es un emplazamiento de
N-glicosilación, produce todavía la disminución de
la secreción de hp40 cuyo Asn medio de Asn-135
juega por sí mismo un papel importante en la secreción de hp40,
Incluso aunque se sustituyó el aminoácido de
Asn-222 con Gln o Leu, se disminuyó todavía la
secreción de hp40, sugiriendo que fue debido a la pérdida de la
N-glicosilación en Asn-222 (Tabla
1). De esta manera, no se requiere la
N-glicosilación en Asn-222 para la
secreción del heterodímero hiL-12, sino que
únicamente se requiere hiL-12p79 para la secreción
de hiL-12p40.
Considerando todos aquellos resultados en
conjunto, los presentes inventores verificaron que la
N-glicosilación en Asn-222 es
necesaria para la secreción de hiL-12p40, pero no se
requiere para la secreción y heterodimerización de
hiL-12p70, en el tiempo medio la
N-glicosilación en Asn-127 de hp35
juega un papel importante en la secreción y heterodimerización de
hIL-12p70.
Para investigar el efecto sobre la actividad
biológica de la N-glicosilación de
hIL-12, se analizó la capacidad de inducción de
IFN-\gamma del hIL-12 de tipo
salvaje y sus derivados que contienen la mutación en el
emplazamiento supuesto de N-glicosilación mediante
ELISA.
Como resultado, en la cuestión de la capacidad
de inducción de IFN-\gamma, se incrementó la
capacidad de inducción de IFN-\gamma en el cultivo
sobrenadante obtenido mediante co-transfección con
los mutantes hp35 y hp40 de tipo salvaje en los que se mutaron
Asn-135 y/o Asn-222, en comparación
con el de tipo salvaje u otros mutantes hp40 (Tabla 1). Y, cuando
se suministró hp40 en el cultivo sobrenadante, el aumento de la
capacidad de inducción de IFN-\gamma bajó a un
nivel similar que la de tipo salvaje (Tabla 1). De esta manera, se
sugirió que estos resultados se atribuyeron al nivel relativamente
bajo de hIL-12p70, en el cultivo sobrenadante de
los mutantes que contenían hp40-N135Q y/o
hp40-N222Q, y no aumentó la actividad de hp70
producida a partir de la mutación de Asn-135 y/o
Asn-222 mediante la propia mutación.
Entre tanto, para examinar el efecto de la
glicosilación de hp40 en Asn-222 sobre la
disminución de la secreción de hIL-12p40, se
cotransfectaron las células con el vector de expresión que contenía
una cierta cantidad de gen mutante y diversas cantidades del ADN de
hp35 de tipo salvaje, a continuación se cultivó. Finalmente, se
midió la cantidad inducida de IFN-\gamma mediante
ELISA.
De manera general, no se segrega únicamente la
subunidad p35 sino que se secreta en forma de
IL-12p70 que enlaza con p40, mientras que la
subunidad p40 se secreta en forma de monómero u homodímero, lo que
sugiere que no es p35, sino la subunidad p40 un hecho principal que
induce la secreción de IL-12p79. En correspondencia
a esto, se aumentó la cantidad de secreción de
hIL-12p70 en proporción a la cantidad de ADN de hp35
transfectado en el hp40 de tipo salvaje y el
hp40-N222Q mutante (Tabla 1). Los que significa que
una vez que hp40 que tiene el defecto de secreción se enlaza con la
subunidad hp35, se puede secretar ésta en forma de
IL-12p70, y de esta manera, parece que la subunidad
p35 lleva a cabo su otra función en la secreción de
hIL-12p70. De acuerdo con un informe reciente, el
cambio conformacional de hp40 es debido al enlace con hp35 (Yoon, C.
y col., EMBO J., 19:3530-3534, 2000), que sugiere
también que la subunidad hp35 puede contribuir a la secreción de
IL-12p70. De manera concluyente, hp40, que incluye
la glicosilación en Asn-222 por sí misma tiene un
defecto en la secreción, pero una vez se enlaza con hp35, se puede
cambiar conformacionalmente hp40 en su forma y su cambio
conformacional podría exponer o generar la señal cubierta o la nueva
secreción, de manera respectiva, y a continuación inducir la
secreción del heterodímero.
Para disminuir la secreción de p40 induciendo la
co-expresión de p35 y p40 en una célula, y para
disminuir la cantidad de secreción de p40 induciendo la formación
de p40 en la que el gen p40 se localiza por detrás de IRES debido
al grado de expresión del gen usar IRES más bien para disminuir que
para usar el promotor del citomegalovirus (CMV) se construyeron los
vectores hp40/IRES/hp35 y hp35/IRES/hp40. Y también,
hp40-N222L/IRES/hp35 y
hp40/IRES/hp40-N222L en los que el gen hp40 se había
sustituido con el gen hp40-N222L en cada plásmido en
el que se generó (Tabla 1). Comparando hp40/IRES/hp35 con
hp40-N222L/IRES/hp35, se segregó menos hp40 hasta
el grado de un 5% en el último. Por otra parte, cuando hp35 y
hp40-N222L se electroporaron, se segregó hp40 hasta
el grado de un 8%. Cuando hp35 y hp40-N222L se
electroporaron, es posible que los dos plásmidos no se vayan a
transfectar ambos e una célula. Además, como el gen
hp40-N222L se expresó de manera única en una
célula, la pequeña cantidad de hp40 se segregó sin la secreción de
hp70. Por tanto se supuso que hp40 se segregaba más enhp40:N222L
más hp35 que en hp40-N222L/IRES/hp35 en el que los
genes hp35 y hp40-N222L se expresaban en el mismo
momento. Comparando hp40/IRES/hp35 con hp35/IRES/hp40 la secreción y
expresión de hp70 no fueron muy diferentes, pero la secreción y
expresión de hp40 estuvieron significativamente disminuidas en
hp35/IRES/hp40 debido a que la expresión de hp40 se deprimió al
localizarse el gen hp40 por detrás de IRES. En el caso de
hp35/IRES/hp40-N222L fabricado mediante la inserción
del gen hp40-N222L en vez del gen hp40, el nivel de
secreción de hp40 disminuyó fasta un 0,3%. De esta manera, se
confirmó a través del presente experimento que el
hp35/IRES/hp40-N222L es uno que puede mantener el
nivel de secreción de hp70 y al mismo tiempo minimizar la secreción
de hp40.
Un vector de vacuna de ADN puede contener y
expresar el gen E2 de HCV-1b, y el constructo de gen
que tiene el gen de la subunidad p40 que se muta en el
Asn-222 (humano) o el Asn-220
(ratón).
Para inspeccionar la posibilidad del uso del gen
mutante hIL-12 de la presente invención en la
terapia génica como una vacuna de ADN, se investigó la secuencia
del gen homólogo IL-12p40 (mp40) de ratón en el
Asn-222 del gen hp40. Se localizó el
Asn-220 de mp40 en un contexto muy similar al del
Asn-222 de hp40, pero no se ha conocido hasta ahora
que este aminoácido se N-glicósilara (Fig. 1). Por
tanto, los presentes inventores generaron un vector
pCIN-mp40-N220L que contenía el gen
mutante mp40, mp40-N220L, en el que se sustituyó el
aminoácido de Asn-220 con Leu mediante mutagénesis
dirigida al emplazamiento.
Para generar un vector que codifique las
subunidades p35 y p40 en ratón y que se use para la inmunización
mediante ADN, se construyó el vector mp35/IRES/mp40 insertando el
fragmento mp35/IRES/mp40 en el vector pTV2, un vector de expresión
eucariota usado como un vector de vacuna de ADN en animales pequeños
(Lee y col., J. Virol., 72:8430-8436, 1998; Cho
y col., Vaccine, 17:1136-1144, 1999). Y se
construyó el vector
pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L, que
contenía el gen mutante Asn-220 del
IL-12p40 de ratón que expresa p35 basándose en la
observación que el gen hp35/IRES/hp40-N222L puede
sostener la secreción de hp70 a la vez que puede minimizar la
secreción de hp40.
El vector
pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L de la
presente invención se depositó en el Gene Bank del Korea Research
Institute of Bioscience and Biotechnology el 29 de Febrero de 2000
(Nº de Acceso: KCTC 0745BP). Se construyó el vector de la vacuna de
ADN pTV2-HCV-E2 que puede expresar
la proteína HCV-E2 en células eucariotas (Song M.
K., y col., J. Virol., 74:2920-2925, 2000).
Como se ve en la Fig. 4 el vector de la vacuna de ADN
pTV2-HCV-E2 está constituido por el
origen de la replicación del virus 40 de simios (SV40 ori), el
promotor del citomegalovirus (CMV), la secuencia líder tripartita
(TPL) de adenovirus, la secuencia de clonación múltiple (MCS), la
secuencia de poliadenilación del SV40 (poli A) y el gen de
resistencia ala ampicilina (AmpR). Y también, se clonó el gen
HCV-E2 en el MCS de este vector. Se eliminó el
carboxil terminal (C-terminal) que contenía el
residuo de aminoácido hidrófobo del gen E2 usado en la presente
invención para facilitar la secreción de la proteína, el aminoacil
terminal (N-terminal) y se enlazaron la secuencia
señal (S) de la glicoproteína D (gD) del herpesvirus (HSV).
Para analizar el efecto de la mutación de
Asn-220 del IL-12p40 de ratón sobre
la secreción de IL-12p40 o IL-12p70,
se analizó el nivel de secreción del IL-12 de ratón
mediante ELISA con cultivos sobrenadantes y lisados de células
transfectadas con los vectores anteriores. Como resultado, los
mutantes mp40-N220L mostraron características
similares a los mutantes Asn-222 de hp40 en el punto
de secreción de IL-12p40 o IL-12p70
y su actividad biológica (Tabla 1).
Finalmente, la presente invención proporciona un
coadyuvante para la terapia génica o la inmunización mediante la
vacuna de ADN que comprende este constructo de gen que contiene el
gen de la subunidad mutante IL-12p40 cuyo
Asn-222 (humano) o Asn-220 (ratón)
se mutan para el uso como un estimulador inmune.
El coadyuvante puede ser útil como un
coadyuvante en una composición de vacuna para la prevención y
tratamiento frente a diversas enfermedades, por ejemplo, SIDA,
hepatitis C o hepatitis B, cáncer, gripe, tuberculosis y malaria,
que requieren esencialmente respuestas inmunes celulares para su
terapia.
En un informe anterior, la vacunación mediante
ADN del plásmido que codifica el antígeno E2 de HCV
(pTV2-gDsE2t) fue suficiente para inducir el
antígeno específico y las respuestas inmunes mediadas por células
después de 3 semanas tras la inmunización. Para determinar si el
gen mIL-12 mutante puede afectar la respuesta inmune
específica del antígeno eficiente in vivo en comparación con
el gen mIL-12 de tipo salvaje, y para inspeccionar
si se puede mantener el efecto durante un tiempo largo, se
inmunizaron y estimularon los ratones con el vector de vacuna de
AFN de la presente invención y se analizó la producción de E2 de HCV
específico del antígeno mediante ELISA. Como resultado, la vacuna
de ADN del E2 de HCV indujo niveles sistémicos de IgG, IgG1 e IgG2a
totales específicos de E2 de HCV significativamente mayores que los
valores control negativos, y la coinfección con el gen
mIL-12mut o el gen
mIL-12-wt mostró el nivel de IgG
total similar en comparación con únicamente la vacuna de ADN del E2
de HCV. Sin embargo, el nivel de IgG1 fue similar entre los grupos
inyectados con el ADN del E2 de HCV. En contraste el nivel de IgG2a
frente al E2 de HCV aumentó ligeramente en el grupo
mIL-12wt y aumentó significativamente en el grupo
mIL-12mut en comparación con el grupo inmunizado
únicamente con el ADN de E2 de HCV. De manera adicional, la
relación de IgG2a/IgG1, que se acepta de manera general como un
indicador indirecto de la inmunidad Th1, fue la más alta en el grupo
mIL-12mut, que mostró el modelo similar del nivel
de IgG2 (Fig. 5a, 5b, 5c, y 5d). Estos datos representan que el gen
mIL-12mut afectó de manera significativa el cambio
de las subclases IgG desde IgG1 a IgG2a en la respuesta inmune
humoral en comparación con mIL-12wt o únicamente el
grupo E2 de HCV, sugiriendo que el IL-12mut puede
inducir la respuesta inmune del tipo Th1. Y estos efectos se
mantuvieron durante 0, 3, 6, 10 semanas tras la inmunización del
estímulo.
Para investigar el efecto del gen
mIL-12mut sobre la respuesta inmune de Th1, que es
uno de los parámetros usados para evaluar la potencia de la
respuesta inmune mediada por células, se analizó la expresión
IFN-\gamma de los
esplenocitos.
esplenocitos.
Como resultado, el grupo inmunizado mediante ADN
de E2 de HCV sin el gen de la citoquina mostró un aumento de nivel
de IFN-\gamma en proporción a la concentración de
la proteína hghE2t, mientras que el grupo inmunizado mediante el
plásmido simulado no. De manera esperada, el nivel de inducción de
IFN-\gamma en el grupo mIL-12wt
estuvo más estimulado que únicamente en el grupo E2 de HCV y el
grupo mIL-12mut hasta 2-3 veces
mayor producción de IFN-\gamma que el grupo
mIL-12wt (Fig. 6a, 6b y 6c), sugiriendo que
mIL-12p70 incrementa la respuesta inmune de Th1
específica del antígeno.
Tal como se ha señalado anteriormente, el gen
mIL-12mut contribuyó a la respuesta inmune de Th1 a
largo plazo. Para determinar si la inducción de la respuesta inmune
de Th1 a largo plazo mediante la expresión del gen
mIL-12mut se correlaciona con la inmunidad CTL, e
igualmente, para encontrar si el gen mIL-12mut puede
afectar el mantenimiento de la actividad CTL en el modelo de
inmunización mediante ADN, los presentes inventores llevaron a cabo
el ensayo CTL con esplenocitos de ratones inmunizados mediante ADN
en diversas semanas tras la inmunización mediante el estímulo.
Como resultado, dos semanas después del
estímulo, todos los grupos, excepto el grupo inmunizado con el
plásmido simulado, mostraron una actividad CTL específica del
antígeno muy fuerte. Sin embargo, existió una pequeña diferencia
significativa entre únicamente E2 de HCV, mIL-12wt y
los grupos mIL-12mut. En el grupo coinmunizado con
mIL-12wt, estuvo más aumentada la respuesta CTL que
en el grupo únicamente con E2 de HCV en el período global,
indicando que el gen miL-12 jugó un papel en la
generación de los CTL estimulados. De manera interesante, la
diferencia en la actividad CTL entre el grupo
mIL-12mut y los otros dos grupos, únicamente E2 de
HCV y el grupo mIL-12wt, fue más y más extensa así
como el tiempo tras la inmunización mediante el estímulo fue más
largo. De manera especial, a las 10 semanas, la respuesta CTL fue
muy baja únicamente n E2 de HCV y en los grupos
mIL-12wt, sugiriendo que la frecuencia de los CTL
específicos del antígeno disminuyó de manera significativa tras un
período largo, mientras que el grupo mIL-12mut
mostró la actividad CTL 5 a 10 veces mayor que la de los otros dos
grupos, sosteniendo la respuesta CTL específica del antígeno (Fig.
7). Como control, cuando se usaron células CT26-neo
como célula diana, no se observó lisis en todos los grupos,
sugiriendo que la actividad CTL observada en este experimento es
específica de E2 de HCV.
Y, los presentes inventores midieron la
frecuencia de las células CD8 + específicas de E2 de HCV in
vivo para confirmar el efecto de la inducción y el
mantenimiento de las células CD8 + T específicas del antígeno
estimuladas por MIL-12. Se usaron dos tipos de
inmunoensayos. En primer lugar, uno es contando el número de células
que producen IFN-\gamma específicas del antígeno.
Para investigar si el estímulo de la actividad de los CTL se
origina a partir de la secreción de las células CD8 + T específicas
del antígeno, se aislaron las células CD8 +, y se tiñeron con
anticuerpo IFN-\gamma anti-ratón
conjugado con PE el anticuerpo emparejado con el isotipo conjugado
con PE control. Se analizaron las células teñidas mediante
citometría de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson), y a
continuación se observó la inducción de
IFN-\gamma. Como resultado, los ratones
coinmunizados con el gen mIL-12mut tuvieron un
estímulo de 3 a 7 veces en la frecuencia de las células que
producen IFN-\gamma de CD8 + en comparación con
únicamente E2 de HCV y los grupos mIL-12wt a las 0,
3, 6, 10 o 14 semanas tras la inmunización mediante el estímulo,
que mostró correlación en el resultado de la respuesta CTL. En
contraste, en el experimento control isotipo emparejado, no hubo
diferencia entre todos los grupos. De manera similar al resultado
del ensayo CTL, la diferencia de la frecuencia de las células CD8 +
T que producen IFN-\gamma entre los grupos de
inmunización, no fue extensa en las 2-3 semanas tras
la inmunización mediante estímulo. Estos datos demuestran que la
expresión del gen mIL-12mut sostiene la frecuencia
de la célula T que producen IFN-\gamma de CD8 +
durante un tiempo largo.
Para investigar la frecuencia de las células CD8
+ T específicas del antígeno, se midió la frecuencia de las células
CD8 + T específicas de E2 de HCV mediante otro procedimiento de
ensayo, el ensayo de dilución limitante (LDA). Se diluyeron los
esplenocitos de los ratones inmunizados mediante estímulo con
diversas concentraciones, y se cultivaron con células
CT-26 que expresaban E2. Y a continuación se midió
la actividad de los CTL de las células CD8 + T estimuladas
específicas del antígeno. El resultado del ensayo de dilución
limitante fue similar al del ensayo de la tinción intracelular. A
saber, se observó la frecuencia más alta de las células CD8 + T
específicas del antígeno en el grupo mIL-12mut
incluso en la etapa temprana de la inmunización, y esta frecuencia
permaneció durante las 14 semanas después de la inmunización
mediante el estímulo (Tabla 2).
Se observó también la frecuencia de las Células
CD8 + T específicas de E2 de HCV sin la inmunización mediante el
estímulo de acuerdo con el tiempo. La frecuencia global de la célula
CD8 + T específicas del antígeno disminuyo de manera ligera, pero
se observo la frecuencia más alta de las células CD8 + T específicas
del antígeno en el grupo mIL-12mut (Tabla 2).
\newpage
A este respecto, se puede sugerir que el papel
de IL-12p70 por sí mismo en la respuesta inmune
mediada por células in vivo es para inducir la activación de
Th1 y CTL desde el principio y para mantener está durante un largo
tiempo, mientras que IL-12p40 inhibe el
IL-12p70 como un antagonista in vivo.
Para confirmar la inmunidad de Th1 y CTL
inducida por el gen mIL-12mut in vivo, y para
examinar que la correlación de la inmunidad protectora con la
respuesta inmune de Th1 y CTL, se inyectó hghE2t que expresa las
células tumorales CT26-hghE2t en los grupos de
ratones inmunizados en las 12 semanas tras la inmunización mediante
el estímulo. 2 semanas después de la inyección, se determinaron los
niveles relativos de IgG, IgG1, e IgG2 específicas del antígeno y
la relación de IgG2a/IgG1 (Fig. 8a y Fig. 8b). Como resultado, se
observó el nivel más alto de la relación IgG2a/IgG1 en el grupo
mIL-12mut, sugiriendo que se puede inducir la
respuesta inmune de Th1 mediante mIL-12mut incluso
en la inyección del tumor.
Se ha medido también el tamaño del tumor durante
30 días. De manera particular, se determinó el crecimiento del
tumor local promedio midiendo el volumen y el diámetro de los
tumores con calibradores cada tres días. También se determinaron
los índices de supervivencia de esto ratones mediante observación
durante 70 días. El grupo de ratones inmunizados con
mIL-12mut indujo una fuerte respuesta inmune en Th1.
El grupo de inmunización con mIL-12wt desplegó un
crecimiento del tumor retardado en contraste con el grupo de
inmunización únicamente con pTV2-gDsE2t (Fig. 8c),
mientras que el grupo de inmunización con mIL-12mut
mostró el crecimiento del tumor retardado de manera significativa.
En el grupo control, la mayor parte de los ratones tuvieron el tumor
y murieron en el intervalo de 50 días, pero el 90% de ratones en el
grupo de mIL-12mut pudieron sobrevivir tras 70 días
(Fig. 8d). De esta manera, estos datos sugieren que las respuestas
de Th1 y CTL específicas de E2 de HCV inducidas por el gen
mIL-12mut de la presente invención confieren
protección in vivo frente al estímulo de las células
tumorales modificadas que expresan el antígeno específico.
Los presentes inventores verificaron que la
subunidad IL-12p40 mutante de ser humano o ratón
contenía el mutante Asn-222 (humano) o Asn.220
(ratón) que es esencial para la secreción de
IL-12p40, y es muy útil para la inmunización de la
vacuna de ADN y la terapia génica como coadyuvante. De esta manera,
la presente invención proporciona un coadyuvante que contiene el
gen IL-12p40 mutante de ser humano o ratón como
componente efectivo para la inmunización mediante ADN y la terapia
génica que puede inducir ka respuesta inmune específica del antígeno
para la prevención y tratamiento frente a diversas
enfermedades.
Este coadyuvante puede inducir la respuesta
inmune, si se usa con la vacuna de ADB, aumentando la secreción de
IFN-\gamma a partir de las células auxiliares T o
CD8 y la actividad de la hidrólisis de los linfocitos T citotóxicos
(CTL).
Las formas de realización práctica y de manera
presente de la presente invención son ilustrativas, tal como se
muestra en los siguientes ejemplos.
Se clonaron y amplificaron los ADNc de las
subunidades p35 (820 pb) y p40 (1050 pb) humanas usando la reacción
en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa
(RT-PCR, PCR System 2400, Perkin Elmer). Cada ADNc
amplificado se subclonó en la región Sma I del vector universal pSK
(Stratagene, La Jolla, California) y a continuación se
construyeron pSK-hp35 y
pSK-hp40.
Para generar un vector bicistrónico que
codifique los genes hp35 y hp40 se construyó el vector del
emplazamiento de entrada ribosómico interno-psK
(IRES). Ser subclonó el gen IRES del virus de la encefalomiocarditis
(EMCV) obtenido mediante RT-PCR entre los
emplazamientos Sma I y Pst I del plásmido pSK. Se cortó el vector
pSK-IRES mediante EcoRV y se añadió el extremo del
fragmento de ADN de p40 obtenido mediante tratamiento de
pSK-hp40 con Xba I y BamH I al mismo usando Taq ADN
polimerasa, a continuación se produjo pSK-hp40/IRES.
Y a continuación se construyó el plásmido
pSK-hp40/IRES/hp35 en el que los genes p40, IRES y
p35 se dispusieron en orden, mediante la inserción del fragmento de
ADN de p35 procedente del pSK-hp35 tratado con Nco I
y Sac I, para pSK-hp40/IRES.
Se construyó también
pSK-hp35/IRES/hp40. Se cortó el vector
psK-IRES mediante EcoRV, y se añadió al mismo el
fragmento de ADN de hp35 obtenido de
pSK-hp40/IRES/hp35 tratado con Nco I y Not I. Se
completó el plásmido pSK-hp35/IRES/hp40 añadiendo
el fragmento hp40 obtenido cortando pSK-hp40 con Nco
I y BamH I. Se clonaron los genes hp40/IRES/hp35 y hp35/IRES/hp40
en los emplazamientos Spe I/Not I y Xho I7Not I del vector pGX0
para crearlos vectores de expresión
pGX0-hp40/IRES/hp35 y
pGX0-hp35/IRES/hp40 que pueden expresar el
IL-12p70 activo en células de mamífero. Se
construyó el vector pGX0 insertando el gen de la antikanamicina en
el vector pTV2 (Song, M. K. y col., J. Virol.,
74:2920-2925, 2000).
Para crear el vector de expresión de la
subunidad p40 se cortó el vector
pCIN-hp40/IRES(hp35 mediante Sac II y Not I
(para eliminar el gen que codifica la subunidad p35), y se autoligó
con la T4 ADN polimerasa, y a continuación se nombró como
pCIN-hp40.
Para crear el vector de expresión de la
subunidad p35, se obtuvo el fragmento de ADN de p35 a partir del
vector pCIN-hp40/IRES/hp35 cortando y ligando con
Nco I y la T4 ADN polimerasa. Se insertó este fragmento de ADN de
p35 en los emplazamientos XhoI y Not i del enzima de restricción del
vector pCI-neo, y a continuación se nombró como
pCIN-hp35.
Para generar un vector bicistrónico que codifica
los genes p35 y p40 de ratón, se construyó el vector
pSK-IRES/mp40 insertando el fragmento de ADN de p40
obtenido del producto de la PCR de IL-12p40 de ratón
(Schoenhaunt, D. S. y col., J. Immunol.,
148:3433-3440, 1999) tratado con NcoI y BamH I en el
vector roto pSK-IRES que contenía IRES de EMCV. Y
se construyó el plásmido pSK-mp35/IRES/mp40
insertando el fragmento de ADN de p35 de ratón en
pSK-IRES/mp40 usando BamH I y la T4 ADN polimerasa.
Finalmente, se generó el vector de expresión
pCIN-mp35/IRES/mp40 que puede expresar el
IL-12p70 activo en células de mamífero insertando el
gen mp35/IRES/mp40 en los emplazamientos HhoI y NotI del vector
pCI-neo (Promega).
Para crear el vector de la subunidad p40 de
ratón de tipo salvaje, se obtuvo el fragmento de ADN de p40 a
partir del vector pSK-mp35/IRES/mp40 tratado con
NcoI y SacI, Se creó pGEX-KG-mp40
insertando este fragmento de ADN de p40 en el vector
pGEX-KG (Clontech) tratado con los mismos enzimas de
restricción. Se trató pGEX-KG-mp40
con EcoRI y NotI, y se insertó en los emplazamientos EcoRI y NotI
del vector pCI-neo. De esta manera, se generó el
vector de expresión pCIN-mp40.
Para crear el vector de expresión de la
subunidad p35 de ratón de tipo salvaje, se obtuvo el fragmento de
ADN de p35 a partir del vector pSK-mp35/IRES/mp40
tratado con XhoI y EcoRI. Se construyó el vector de expresión
pCIN-mp35 insertando este fragmento de ADN en los
emplazamientos XhoI y EcoRI del vector PcI-neo
tratado con los mismos enzimas de restricción.
Construcción de IL-12p40 e
IL-12p70 que tienen la glicosilación parcialmente
mutada. Se sustituyeron siete codones de Asn que se esperaban usar
como emplazamientos de N-glicosilación de las
subunidades hp35 y hp40 con codones no relacionados mediante la
mutagénesis dirigida al emplazamiento.
Para la construcción de los genes mutantes de la
glutamina para los emplazamientos supuestos de
N-glicosilación de hp40 y hp35, se llevaron a cabo
las sustituciones de los aminoácidos usando la PCR de acuerdo con el
procedimiento de Haraguchi y col (Haraguchi, y col., J. Immunol.,
163:2092-2098, 1999). Se usaron los cebadores para
la mutagénesis mediante la síntesis de los nucleótidos, tales como
T7 representado mediante la SEC DE ID Nº: 6, T3 representado
mediante la SEC DE ID Nº:7, hp40-N125Q (S)
representado mediante la SEC DE ID Nº:8, hp40-N125Q
(AS) representado mediante la SEC DE ID Nº:9,
hp40-N135Q (S) representado mediante la SEC DE ID
Nº:10, hp40-N135Q (AS) representado mediante la
SEC DE ID Nº:11, hp40-N222Q (S) representado
mediante la SEC DE ID Nº:12, hp40-N222Q (AS)
representado mediante la SEC DE ID Nº:13,
hp40-N303Q (S) representado mediante la SEC DE ID
Nº:14, hp40-N303Q (AS) representado mediante la
SEC DE ID Nº:15, hp40-N127Q (S) representado
mediante la SEC DE ID Nº:16, hp40-N127Q (AS)
representado mediante la SEC DE ID Nº:17,
hp40-N141Q (S) representado mediante la SEC DE ID
Nº:18, hp40-N141Q (AS) representado mediante la
SEC DE ID Nº:19, hp40-N251Q (S) representado
mediante la SEC DE ID Nº: 20 y hp40-N251Q (AS)
representado mediante la SEC DE ID Nº: 21. (S) y (AS) significan
cebadores sentido y antisentido, de manera respectiva.
Para construir los genes mutantes únicos de la
glutamina de hp40 y hp35, se usaron el cebador T7 y cada cebador
sentido para la PCR usando el PCIN-mp40 producido a
partir del ejemplo <2-2> o el pCINmp35
producido a partir del ejemplo <2-3> como
plantilla. De manera similar se usaron el cebador T3 y cada cebador
antisentido para la PCR. Se generaron dos fragmentos de la PCR que
comparten un emplazamiento común que contenían el punto mutacional.
Se llevó a cabo la segunda PCR con una mezcla de estos productos
como plantillas y los cebadores que los flaquean, dando como
resultado un producto de fusión. Se insertó este producto en el
plásmido pCI-neo. De manera similar, se construyeron
los genes mutantes dobles y triples de la glutamina usando genes
mutantes únicos o dobles de la glutamina como plantillas de la PCR.
Se verificaron los genes mutantes mediante el secuenciamiento del
ADN.
Para la construcción del gen
Il-12p70 de ratón que contenía el defecto de la
N-glicosilación en Asn-220 de mp40,
se sustituyó la región del gen mp40 en el plásmido
pCIN-mp35/IRES/mp40 producido a partir del ejemplo
<2-1> con mp40-N222L. En el
experimento de la mutagénesis para construir para construir
pCIN-mp40-N222L, se usaron
mp40-N220L (S) representado mediante la SEC DE ID
Nº: 22 y mp40-N220L (AS) representado mediante la
SEC DE ID Nº: 23 que contenían el emplazamiento Sac I como cebadores
para la PCR. Se verificaron los genes mutantes amplificados
mediante el tratamiento del enzima de restricción en el
emplazamiento de reconocimiento específico producido tras la
mutagénesis y el análisis de la secuencia de ADN.
La Fig. 2 muestra la composición de los
aminoácidos de los genes normal y mutante de la subunidad
IL-12p40 o IL-12p35 de la presente
invención. Se indicaron los emplazamientos supuestos de
N-gicosilación mediante la forma Y con el número de
aminoácidos y se demostraron los aminoácidos sustituidos en cada gen
mutante en un cuadrado.
Se cultivaron las células COS-7
(ATCC) en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM,
GIBCO-BRL) que contenía suero bovino fetal
inactivado térmicamente al 10%. Se llevó a cabo la transfección en
las células COS-7 mediante electroporación. Se
pulsó la suspensión de aproximadamente 5 x 10^{6} células en el
medio de cultivo a 250 V, 960 \muF en presencia de 20 \mug del
ADN espécimen en adición a 2 \mug de pNEB-SEAP
(fosfatasa alcalina segregada mediante pNEB, New England Biolabs),
que expresa la fosfatasa alcalina segregada y sirve como un control
interno (electroporador y cubetas de electroporación de 0,4 por
Bio-Lad).
A las 24 horas después de la transfección, se
sustituyó el medio con 1,5 ml de medio CHO-SFMII
libre de suero (GIBCO-BRL). Tras la incubación
durante otras 24 horas, se cosecharon los sobrenadantes y los
residuos celulares mediante centrifugación. Se usaron los
sobrenadantes para el ensayo SEAP y se volvieron a suspender los
residuos celulares en 200 \mul de solución de lisis (Promega). Se
midieron los niveles de IL-12p70 e
IL-12p40 en los sobrenadantes y los lisados
celulares mediante ELISA (R&D system). Para el inmunoemborronado
se llevó a cabo la electroforesis ángel de dodecil sulfato de sodio
al 10% o 12% - poliacrilamida (SDS-PAGE). Las
proteínas separadas del experimento anterior se
electrotransfirieron en membrana de nylon (Amersham). Se obtuvieron
las proteínas absorbidas en la membrana usando anticuerpo
IL-12 humano marcado con biotina (Amersham),
estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP
(PharMingen) y el kit ECL (Amersham). En la Tabla 1 se muestran los
resultados. Se midieron los niveles de expresión de
IL-12p70 o IL-12p40 mediante ELISA y
se presentaron de manera relativa al nivel de tipo salvaje, que se
ajusta de manera arbitraria a 100%.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
a; Se usó un total de 20 \mug de
cada constructo de ADN para la transfección en las células
COS-7 mediante la electroporación. Para la
transfección simultánea de dos constructos de ADN, se usaron 10
\mug de cada constructo de
ADN.
b; Se midieron los niveles de expresión del
IL-12p70 o Il-12p40 de humano y
ratón mediante ELISA y se presentaron en relación a los de tipo
salvaje, que se ajustan de manera arbitraria a 100%.
c; Se usó una cantidad igual de p70 en cada
sobrenadante de mutante en el ensayo de inducción del
IFN-\gamma. Se midieron los niveles del
IFN-\gamma inducido y se presentaron en relación
al nivel del tipo salvaje, que se ajusta de manera arbitraria a
100%.
d; IL-12p40 indica la forma de
p40 monomérica y homodimérica de IL-12p40 pero no la
parte de p40 de IL-12p70.
e; IL-12p70 indica el
heterodímero que está constituido por IL-12p35 e
IL-12p40.
f; el esqueleto del plásmido usado para la
expresión independiente de hIL-12p40,
hIl-12p35, y sus derivados, es
pCIN-neo y se describe como simulado.
g; <1 indica los valores por debajo del
intervalo detectable del ensayo ELISA.
h; Cuando se usó la cantidad igual de p70 en
cada mutante indicado (hp40-N135Q o
hp40-N222Q) y el sobrenadante de tipo salvaje en el
ensayo de inducción de IFN-\gamma se reconstituyó
el hp40 insuficiente en cada sobrenadante de mutante en comparación
con el de tipo salvaje con el sobrenadante de hp40 obtenido tras la
transfección con únicamente hp40.
i; los números en () significan cada cantidad
(\mug) de plásmido cotransfectado,
pCIN-hp40-N222Q y
pCIN-hp35, Se cotransfectaron un total de 20 \mug
de ADN y se suplemento una cantidad insuficiente de ADN con el
plásmido pCI-neo.
j; el esqueleto del plásmido usado para la
coexpresión de hIL-12p40 e hIL-12p35
o sus derivados es pGX0 y se describe como simulado.
k; el esqueleto del plásmido usado para la
coexpresión de mIL-12p40 y mIL-12p35
o sus derivados es pTV2 y se describe como simulado.
Como se ha visto en la Tabla 1, la mutación de
Asn-141 de p35 y Asn-303 de p40 no
se había efectuado sobre la secreción de IL-12p70 o
IL-12p40, pero la secreción de
IL-12p40 en los mutantes Asn-135 y
Asn-222 disminuyó. De manera especial, el mutante
Asn-222 mostró el mismo resultado que cuando se
sustituyó su aminoácido con Leucina (Leu) o glutamina (Gln),
indicando que es muy importante la pérdida de la
N-glicosilación en Asn-222.
La Fig. 3a muestra los resultados de
inmunoemborronado de los lisados de células después que se
transfectaran los genes humanos de tipo salvaje y mutante en las
células COS-7. Las columnas 1 y 2 muestran los
resultados de los lisados de células transfectadas con
pCI-neo y pCIN-hp35 de manera
respectiva. Las columnas 3, 4, 5 y 6 muestran los resultados de los
lisados de células transfectadas con los vectores de expresión que
contienen el gen mutante tal como pCIN-hp35.N217Q,
pCIN-hp35-N141Q,
pCIN-hp35-N251Q y
pCIN-hp35-N217m 251Q, de manera
respectiva. De manera aproximada, la banda de 33,2 kDa en la columna
2 y 5 es la proteína de la subunidad p35
N-glicosilada. Cuando se inhibió la
N-glicosilación mediante tunicamicina, tal como se
muestra en la columna 3 y 4, se formó una banda de 28 kDa. Por
tanto, los aminoácidos Asn-127 y
Asn-141 son el emplazamiento de la
N-glicosilación.
La Fig. 3b muestran los resultados del
inmunoborrado de los lisados de células obtenidos a partir de las
células COS-7 transfectadas con los genes humanos
de tipo salvaje y mutante. Las columnas 1 y 2 muestran los
resultados de los lisados de células transfectadas con
pCI-neo y pCIN-hp40 de manera
respectiva. Las columnas 3, 4, 5 y 6 muestran los resultados de los
lisados de células transfectadas con los vectores de expresión que
contienen el gen mutante tal como
pCIN-hp40-N125Q,
pCIN-hp40-N135Q,
pCIN-hp40-N222Q y
pCIN-hp40-N303Q de manera
respectiva. De nuevo, las columnas 7, 8, 9 y 10 muestran los
resultados de los lisados de células transfectadas con los genes
mutantes doble o triple. Se muestra un resultado de los lisados de
células transfectadas con pCIN-hp40 y tunicamicina,
un agente antagónico frente a la
N-glicosilación.
\newpage
En muchos informes, se conocen las bandas
3-4 que tienen 36.45 kDa en un ensayo de
inmunoemborronado de IL-12p40. De manera similar,
se muestran las bandas de 36, 37,5, 40 y 43,1 kDa en el ensayo de
inmunoemborronado de los lisados de células transfectadas con el
Il-12p40 y el IL-12p35 de tipo
salvaje. En los lisados de células tratados con tunicamicina,
únicamente permaneció la banda de 36 kDa mientras que las otras tres
bandas desaparecieron (Columna 11). De esta manera, esta banda es
la subunidad p40 que no está glicosilada. Las bandas obtenidas de
la mutación de Asn-125 o Asn-135,
fueron casi las mismas que aquellas de tipo salvaje (Columnas 3, 4).
Las bandas se dispusieron en Asn-222 y
Asn-303 (Columnas 5, 6), indicando que los
aminoácidos de 135, 222 y 303-Asn son el
emplazamiento de N-glicosilación.
La Fig. 3c muestra los resultados del
inmunoemborronado de los sobrenadantes obtenidos a partir del
cultivo de las células COS-7 transfectadas con los
genes IL-12p40 humanos de tipo salvaje y mutante.
Las explicaciones para cada columna son las mismas que en la Fig.
3b. Similares al resultado de los lisados de células, se fabricaron
las bandas 3-4 que tienen 36-45 kDa.
Las bandas obtenidas de la mutación de Asn-125 o
Asn-135, fueron casi las mismas que aquellas de
tipo salvaje (Columnas 3, 4). Se dispusieron las bandas en
Asn-222 y Asn-303 (Columnas 5, 6).
De manera especial, no se segregaron los mutantes
Asn-135 y Asn-222 en el medio de
cultivo de células, al contrario que con los resultados de los
lisados de células. Este resultado es consistente con el resultado
de cuantificación obtenido mediante ELISA.
Los vectores de expresión,
pGX0-hp35/IRES/hp40-N222L y
pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35, que
contienen el gen mutante de la presente invención en el que el
Asn-222 se sustituyó con Leu-222, se
depositaron en el Gene Bank del Korea Research Institute of
Bioscence and Biotechnology el 29 de Febrero de 2001 (Nº de Acceso:
KCTC 0969BP y KCTC 0970BP).
Se analizó el efecto de la
N-glicosilación de hp35 sobre la síntesis,
heterodimerización, y secreción de hIL-12p70
mediante ELISA con los sobrenadantes del cultivo y los lisados de
células transfectadas con los vectores de expresión
hiL-12 que incluyen el gen hp35 de tipo salvaje o
sus genes mutantes de la N-glicosilación.
Como se ha visto en la Tabla 1, la eliminación
de los residuos potenciales de la N-glicosilación de
hp35, excepto para el Asn-217, no afecta de manera
significativa la síntesis, heterodimerización y secreción de
hIL-12p70. Sin embargo, la desglicosilación de
Asn-127 mostró que disminuía la heterodimerización y
la secreción de hIL-12p70 en algún grado, debido a
los niveles de expresión de hp35-N217Q y
hp35-N217, 141Q sobre western blot, en el que se
normalizó la eficiencia de la transfección, fueron similares a
aquellos de los otros mutantes. De acuerdo con esto, estos
resultados indican que la N-glicosilación en
Asn-127 de hp35 es importante para la
heterodimerización y secreción de hIL-12p70, pero no
en Asn-141.
Para determinar el efecto de la
N-glicosilación de hp40 sobre la síntesis,
heterodimerización, y secreción de hIL-12p70, se
analizaron mediante ELISA los niveles de hIL-12p70 e
hIL-12p40 existentes en los sobrenadantes del
cultivo y los lisados de células transfectadas con los vectores de
expresión que incluyen el gen hp40 de tipo salvaje o sus genes
mutantes de la N-glicosilación.
La mutación de Asn-135 o
Asn-222 tuvo un pequeño efecto sobre la secreción de
hIL-12p70, tal como se ha visto en la Tabla 1,
debido a que el nivel extracelular de hIL-12p70 de
estos mutantes fue similar al del hp40 de tipo salvaje. De manera
interesante, la secreción de hIL-12p40 en los
mutantes Asn-135 y Asn-222 diminuyó
de manera significativa, de manera especial, el mutante
Asn-222 mostró el nivel de secreción menor de
aproximadamente un 9% en comparación con el del hp40 de tipo
salvaje, indicando que se necesita la
N-glicosilación en Asn-222 para la
secreción de hIL-12p40 sólo. También, los mutantes
dobles y triples que contenían Asn-135 y/o
Asn-222 mostraron el bajo nivel de
hIL-12p40, pero no el de hIL-12p70.
En contraste, aparecieron los otros mutantes para producir una
cantidad igual de hIl-12p40 e
hIL-12p70 en los lisados de células en comparación
con el hp40 de tipo salvaje. Las mutaciones de
Asn-125 y Asn-303 no producen
diferencias significativas en la expresión, heterodimerización y
secreción de hIL-12p40 e
hIL-12p70.
En conjunto, estos datos indican que la
N-glicosilación de hp40 en Asn 222 es crítica para
la secreción de IL-12p40, pero no se requiere para
la heterodimerización y secreción de IL-12p70,
mientras que la N-glicosilación de hp35 en
Asn-127 es importante para la heterodimerización y
secreción de Il-12p70. Esto es consistente también
con el informe que la N-glicosilación de hp35 parece
ser un requerimiento clave para la secreción de
IL-12p70 (Carra, G., y col., J. Immunol.,
164:4752-4761, 2000).
Para investigar el papel de la
N-gicosilación de hIL-12 en su
actividad biológica se analizó la capacidad de inducción de
IFN-\gamma del hIL-12 de tipo
salvaje y sus derivados en los emplazamientos supuestos de
N-gicosilación. Los sobrenadantes del cultivo que
contenían igual cantidad del hIL-12p70 de tipo
salvaje y sus mutantes, se incubaron 100 ng/ml de cada un con PLB
humanas. Se determinó el nivel del IFN-\gamma
inducido en cada sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Tal como
se ha visto en la Tabla 1, existe una diferencia pequeña entre el
tipo salvaje y todos sus derivados en términos de inducción de
IFN-\gamma. Sin embargo, los derivados de hp40
mutados en Asn-135 y/o Asn-222
mostraron algún aumento en la inducción de
IFN-\gamma en comparación con el tipo salvaje o
los otros mutantes de hp40. Esto es probablemente debido al hecho
que el nivel de hIL-12p40, que se conoce por ser un
antagonista de hIL-12p70, en los sobrenadantes del
cultivo de los mutantes que contenían hp40-N135Q
y/o hp-40-N222Q fue relativamente
mucho más bajo que los de los otros mutantes.
Para investigar como la desglicosilación en
Asn-222 de hp40 disminuye la secreción de
hIL-12p40, pero no la de hIL-12p70,
los presentes inventores cotransfectaron la cantidad restringida del
plásmido que expresa hp40-N222Q con cantidades
diversas del ADN de hp35 de tipo salvaje. Se aislaron células
mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) mediante la
centrifugación con gradiente de densidad de
Ficoll-Hypaque (Sigma) a partir de sangre fresca y
se volvieron a suspender en medio RPMI-1640
(GIBCO-BRL) suplementado con FBS inactivado
térmicamente y penicilina/estreptomicina
(GIBCO-BRL), Para el ensayo de inducción de
IFN-\gamma humano, se incubaron células PBM
humanas (4 x 10^{5}) con los sobrenadantes del cultivo que
contenían 100 ng/ml de IL-12p70 humano o sus
derivados mutantes durante 16 horas.
Para la detección del
IFN-\gamma de ratón, se obtuvieron los bazos de
ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad y se incubaron 1 x
10^{5} esplenocitos con los sobrenadantes del cultivo que
contenían 100 ng/ml de IL-12p70 de ratón o sus
derivados mutantes durante 24 horas. Se estimaron las cantidades de
IFN-\gamma inducido de humano o ratón mediante el
kit ELISA de IFN-\gamma de humano y ratón (R&D
systems), de manera respectiva. En la Tabla 1 se proporcionan los
resultados, Los números de la Tabla 1 son la cantidad de
IFN-\gamma medida mediante ELISA y presentada en
relación con el nivel de tipo salvaje, que se ajusta de manera
arbitraria a 100%.
De manera general, se sabía que la subunidad p35
no segregaba sóla y se secreta como una forma de
IL-12p70 en asociación con la subunidad p40,
mientras que la subunidad p40 se secreta en la forma de monómero u
homodímero, sugiriendo que la subunidad p40 es el factor principal
en la secreción de IL-12p70. Tal como se muestra en
la Tabla 1, el nivel de secreción de hIL-12p70
aumentó en proporción a la cantidad de ADN de hp35 transfectado en
el caso del hp40 y hp40-N222Q de tipo salvaje. Este
resultado indica que la subunidad hp40 con defecto de secreción se
secretó en forma de IL-12p70 si se asociaba éste con
la subunidad hp35, sugiriendo que la subunidad hp35 proporciona
también otra ayuda para la secreción de hIL-12p70.
De manera reciente, el informe de que tiene lugar el cambio
conformacional en la subunidad hp40 tras el enlace de hp35 sugiere
la posibilidad de la contribución de la subunidad hp35 en la
secreción de IL-12p70 (Yoo, C. y col., EMBO
J. 19:3530-3534, 2000). En función de este
informe y de los datos de la presente invención, se verificó que el
hp40 que contiene la desglicosilación en Asn-222 es
defecto en la secreción del mismo pero se puede segregar en
asociación con el hp35 debido al cambio conformacional de la región
hp40 y la subsiguiente exposición o generación de cubierta o la
nueva señal de secreción, de manera respectiva.
Para inspeccionar la posibilidad del uso del gen
mutante hIL-12 de la presente invención en la
terapia génica como una vacuna de ADN, se investigó la secuencia
del gen IL-12p40 (mp40) de ratón homólogo con el
Asn-222 del gen hp40. Se localizó el Asn 220 de
mp40 en un contexto muy similar al del Asn-222 de
hp40, pero no se conoce hasta ahora que este aminoácido sea
N-glicosilado. Por tanto, los inventores generaron
el gen mutante mp40, mp40-N220L, en el que se
sustituyó el Asn en 220 en la secuencia de aminoácidos con Leu
mediante la mutagénesis dirigida al emplazamiento. Para la
mutagénesis, se usaron como cebadores la SEC. Nº 22 y la SEC Nº
23. Para una fácil identificación del gen mutante, se generó el
emplazamiento de restricción Sac I. Se verificaron los genes
mutantes amplificados mediante el tratamiento del enzima de
restricción para el emplazamiento de reconocimiento específico
producido tras la mutagénesis y el análisis de la secuencia de ADN.
De manera eventual, se construyó el vector
pCIN-mp40.N220L que contiene el gen mutante
IL-12p40 de ratón que se puede expresar en células
animales.
Para generar un vector que codifique las
subunidades p35 y p40 de ratón y que se use para la inmunización
del ADN, se usó un vector de expresión eucariota, el vector pTV2
como un vector de vacuna de ADN en animales pequeños (Lee, y col.,
J. Virol., 72:8430-8436, 1998; Cho, y col., Vaccine,
17:1136-1144, 1999), se trató con Asp718 y Not I,
Se construyó el vector pTV2-mp35/IRES/mp40
insertando el fragmento mp35/IRES/mp40 obtenido a partir del
pSK-mp35/IRES/mp40 tratado con los enzimas de
restricción en el anterior. Y, se generó el vector
pSK-mp35/IRES/mp40-N220L que
contenía el gen mutante Asn-220, que puede expresar
p35, insertando el fragmento mp40-N220L en el
pSK-mp35/IRES/mp40 tratado con NcoI y NotI. Para
eliminar el fragmento mp40, se trató el vector
pTV2-mp35/IRES/mp40 con EcoRV y NotI, seguido por la
adición de mp40-N220L. Como resultado, se construyó
pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L.
El vector
pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L de la
presente invención se depositó en el Gene Bank of Korea Research
Institute of Bioscence and Biotechnology el 29 de Febrero de 2000
(Nº de Acceso: KCTC 0745BP).
Se construyó el vector de la vacuna de ADN
pTV2-HCV-E2 que puede expresar la
proteína HCV-E2 en células eucariotas (Song M. K.,
y col., J. Virol., 74:2920-2925, 2000). Tal como se
ha visto en la Fig.4, el vector de la vacuna de ADN
pTV2-HCV-E2 está constituido por el
origen de la replicación del virus 40 de simios (SV40 ori), el
promotor del citomegalovirus (CMV), la secuencia líder tripartita
(TPL) del adenovirus, la secuencia de clonación múltiple (MCS), la
secuencia de poliadenilación del SV40 (poli A) y el gen de
resistencia a la ampicilina (AmpR). Y también, se clonó el gen E2
de HCV en la MCS de este vector. Se eliminó el carboxil terminal
(C-terminal) que contiene el residuo de aminoácido
hidrófobo del gen E2 usado en la presente invención para facilitar
la secreción de la proteína. Y para ayudar a la expresión de la
proteína y a la secreción celular, se enlazaron el aminoacil
terminal y la secuencia señal (S) de la glicoproteína D (gD) del
herpesvirus (HSV).
Se transfectaron los vectores relacionados en la
Tabla 1 en las células COS-7 usando el mismo
procedimiento del <Ejemplo 4>. Se analizaron los
sobrenadantes del cultivo y los lisados de células mediante ELISA
(PharMingen). En la Tabla 1 se muestran los niveles de expresión del
IL-p12p70 y 40 de tipo salvaje. <1 en
pCI-neo significa que no se detectaron las proteínas
mediante ELISA.
Tal como se ha visto en la Tabla 1, los mutantes
mp40-N220l mostraron características similares al
mutante Asn-222 de hp40 en el punto de la secreción
de IL-12p40 e IL-12p70 y en su
actividad biológica.
Para aplicar el gen mutante
mp40-N222L en el modelo de la vacuna de ADN y
comparar este con el gen mp40 de tipo salvaje en una vista de la
inducción de las respuestas inmunes de Th1 y CTL, estos inventores
insertaron los genes mp35/IRES/mp40 (mIL-12wt) o
mp35/IRES/mp40-N220L (mIL-12mut) en
el vector de la vacuna de ADN de pTV2 y se observaron sus
características in vitro. En resumen, tal como se ha visto en
la Tabla 1, el gen mIL-12mut
(mp40-N220 mutante) en el vector pTV2, mostró
también características similares con el mutante
Asn-222 de hp40 en el punto de la secreción de
IL-12p40 e IL-12p70 y en su
actividad biológica.
En un informe anterior, la vacunación con ADN de
plásmido que codifica el antígeno HCV-E2
(pTV2-gDsE2t) fue suficiente para inducir las
respuestas inmunes humoral específica del antígeno y mediada por
células tres semanas después de la inmunización (Song, M. K. y
col., J. Virol., 74:2920-2925, 2000). Para
determinar si el gen mIL-12mut puede afectar
también la respuesta inmune específica del antígeno in vivo
comparada con el gen mIL-12wt, los ratones se
inmunizaron inicialmente, y se estimularon con
pTVmut-mIL-12mut o con
pTVmut-mIL-12wt, junto con el
plásmido pTV2-gDsE2t dos semanas después.
Para inspeccionar la inducción de respuesta
inmune por la vacuna de ADN mediante el vector de expresión que
contiene los genes mutantes de la presente invención, se inmunizaron
ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad con diferentes ADN de pTV2
o pTV2- gDsE2t con ADN mIL-12 mutante o
mIL-12 de tipo salvaje. De manera particular, se
inyectó en los músculos tibiales anteriores de cada ratón un total
de 200 \mug de ADN, formulado a un volumen final de 100 \mul de
solución salina tamponada con fosfato, y se estimularon con el
tiempo con una dosis idéntica de ADN en un intervalo de 4 semanas.
Se monitorizaron las respuestas inmunes humorales 3 semanas después
del estímulo de inmunización mediante ELISA. En particular, se
recubrió cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Dynex
Technologies) con 100 ng de proteína hghE2t, que es una proteína de
fusión de la hormona del crecimiento humana (hgh) y un HCV E2 (HCV
E2t) truncado en el extremo C-terminal. El suero
procedente de los ratones inmunizados se diluyó a 1:100 para
reacción con la proteína hghE2t y se introdujo para la determinación
de los niveles relativos de IgG específicos de HCV E2t y de sus
subclases, tales como IgG1 e IgG2a.
Como se muestra en las Figuras 5a, 5b, 5c y 5d,
la vacuna de ADN de HCV E2 indujo IgG total específico de HCV E2
sistémico, con niveles IgG1 e IgG2a significativamente más elevados
que los valores de control negativo, y la
co-inyección con el gen mIL-12 mut o
mIL-12wt mostró niveles similares de IgG total en
los grupos inyectados con ADN de HCV E2, Por el contrario, el nivel
de IgG2a frente al de HCV E2 se incrementó ligeramente en el grupo
mIL-12wt en comparación con el grupo únicamente
inmunizado con ADN de HCV E2, Además, la relación IgG1/IgG2a, que
se acepta por lo general como un indicador indirecto de la inmunidad
Thl, fue la más elevada en el grupo mIL-12 mut,
pero mostró el modelo similar del nivel IgG2a. Estos datos
representan que el gen mIL-12 mut afecta de forma
significativa el desplazamiento de las subclases de IgG desde IgG1 a
IgG2a en la respuesta humoral inmune comparada con el grupo
mIL-12 wt o HCV E2 únicamente, sugiriendo que el
IL-12 mut puede inducir respuesta inmune tipo
Thl.
Para investigar el efecto del gen
mIL-12 mut sobre la respuesta inmune de Thl, que es
uno de los parámetros usados para evaluar la potencia de la
inmunidad mediada por células, se midió la expresión de
IFN-\gamma en esplenocitos. 1 x 10^{5}
esplenocitos obtenidos a las 8 semanas tras el estímulo de
inmunización se añadieron a una placa de 96 pocillos con fondo en
U. A continuación, se añadieron a cada pocillo entre 1 y 5 \mug de
proteína hgh-E2t purificada a partir de células
CHO, y las células se incubaron a 37ºC, en un incubador con CO_{2}
al 5% durante 3 días. A continuación, los sobrenadantes de las
células se aseguraron y usaron en la detección de los niveles de
IFN-\gamma usando un kit ELISA (R&D systems).
Se sabía que el IFN-\gamma inducido tras
estimulación con un antígeno específico se produce a partir de la
célula CD4 + T específica del antígeno, y es el indicador de la
respuesta inmune de Thl.
Tal como se muestra en la Fig. 6, el grupo
inmunizado con ADN de HCV E2 sin el gen de la citoquina mostraron
un nivel aumentado de IFN-\gamma, en comparación
con la concentración de proteína hgh-E2t, mientras
que el grupo inmunizado con el plásmido simulado no lo hizo. Tal
como se esperaba, el nivel de inducción de
IFN-\gamma, en el grupo mIL-12 wt
se estimuló más que en el grupo sólo con HCV E2, y el grupo
mIL-12 mut mostró una producción de
IFN-\gamma hasta 2 - 3 veces superior que el grupo
mIL-12 wt, sugiriendo que mIL-12p70
incrementa la repuesta inmune específica del antígeno Thl y que
mIL-12p40 inhibe la inducción de la repuesta inmune
a Thl mediante IL-12p70 in vivo.
Tal como se ha señalado más arriba, el gen
mIL-12 mut contribuye a la repuesta inmune a Thl a
largo plazo en la inmunización con ADN HCV E2, Para determinar si
la repuesta inmune a Thl a largo plazo inducida por la expresión
del gen mIL-12 mut se correlaciona con la inmunidad
CTL y la principal respuesta inmune mediada por células, y por
tanto el gen mIL-12 mut puede afectar al
mantenimiento de la actividad CTL en el modelo de inmunización del
ADN, los presentes inventores llevaron a cabo el ensayo CTL con
esplenocitos inmunizados con ADN de ratón en varias semanas tras el
estímulo de inmunización. Los esplenocitos (2 x 10^{7}) se
reestimularon in vitro a 37ºC con células
CT26-hghE2t (1 x 10^{6})
C-tratadas con mitomicina, que expresan la forma
truncada de la proteína 2 de la envoltura HCV (E2t). Tras 5 días de
cultivo in vitro, se ensayaron las células efectoras en un
ensayo convencional de citotoxicidad frente a diferentes células
diana, tales como CT26-hghE2t o
CT26-neo. Se plaquearon diferentes números de
células efectoras por triplicado para conseguir la relación E/T
deseada. Se añadió a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con
fondo en U células diana (5 x 10^{3}) marcadas con ^{13}Cr, y
tras 6 horas de incubación a 37ºC, se cosechó el sobrenadante y se
contó en un contador g (Wallac, Turkum Finlandia). Se calculó el
porcentaje de lisis específica mediante la siguiente fórmula
matemática 1, incubando las células diana con sólo el medio de
cultivo. La lisis máxima se obtuvo exponiendo las células diana a
NET-P40 al 1%.
Fórmula matemática
1
Porcentaje de
lisis específica = (lisis experimental - lisis mínima) x 100 /
(lisis máxima - lisis
mínima)
Como resultado, tal como se muestra en la Fig.
7, dos semanas después del estímulo, todos los grupos excepto el
del plásmido simularos mostraron una actividad CTL específica del
antígeno muy fuerte. Sin embargo, hubo pocas diferencias entre los
grupos HCV E2 sola, mIL-12 wt y
mIL-12 mut. La respuesta CTL se indujo más en el
grupo mIL-12 wt co-inmunizado que
en el grupo con solo HCV E2 en el periodo total, indicando que el
gen mIL-12 juega un papel en la generación mejorada
de CTL. De manera interesante, la diferencia en la actividad CTL
entre el grupo mIL-12 mut y los otros dos grupos,
HCV E2 sólo y el grupo mIL-12 wt resultó cada vez
mayor a medida que aumentaba el tiempo tras el estímulo de
inmunización. De manera especial, a las 10 semanas, la respuesta
CTL fue muy baja en los grupos HCV E2 sólo y mIL-12
wt, sugiriendo que la frecuencia de CTL específica del antígeno
disminuyó de manera significativa a largo plazo, mientras que el
grupo mIL-12 mut mostró de 5 a 10 veces más
actividad CTL que el resto de los dos grupos que sostienen la
respuesta CTL específica del antígeno. Como control, cuando se
usaron células CT26-neo como células diana, no se
observó lisis en ningún grupo, lo que sugiera que la actividad CTL
observada en este experimento es específica de HCV E2,
Para investigar si la mejora a largo plazo de la
actividad CTL se origina en la frecuencia de las células CD8 + T
específicas del antígeno, y para la determinación de la frecuencia
de CD8 + específica del antígeno en linfocitos T, se llevó a cabo
el siguiente experimento. Los esplenocitos (2 x 10^{7}) obtenidos
en la semana indicada tras el estímulo de inmunización se
estimularon con células CT26-hghE2t (1 x 10^{6})
en presencia de 10 U/ml de IL-12 recombinante
(Pharmingen) durante 40 horas, y a continuación se añadieron 4
\mul de GolgiStop^{TM} (Pharmingen), y las células se incubaron
otras 8 horas a 37ºC. Para la purificación directa de las células
CD8 + T, los esplenocitos estimulados se incubaron con perlas
anti-CD8 (Miltenyi Biotech, Inc), y a continuación
se hicieron pasar a través de una columna del sistema miniMacs
(Miltenyi Biotech, Inc), y se aislaron el resto de las células CD8
+ T. Para bloquear la tinción no específica, las células se
preincubaron con Fc Block^{TM} (Pharmingen) y se tiñeron con CD
(antiratón FITC conjugado. Tras la incubación, las suspensiones
celulares se fijaron y permeabilizaron con Cytofix/Cytoperm^{TM}
(Pharmingen) antes de la adición de mAb
IFN-\gamma anti ratón PE-conjugado
o mAb correspondiente al isótopo PE-conjugado de
control. Las células teñidas se analizaron mediante citometría de
flujo de FASCalibur (Becton Dickinson), y a continuación se observó
la inducción de IFN-\gamma.
a; ratones hembra BALB/c de seis a
ocho semanas de edad se inmunizaron con varios plásmidos de la
presente invención a intervalos de 4
semanas.
b; la expresión de cada grupo es como sigue:
Grupo I; pTV2, Grupo II;
pTV2-HCV-E2t + pTV2, Grupo III;
pTV2-HCV-E2t +
pTV2-mIL-12wt, Grupo IV;
pTV2-HVC-E2t-pTV2-mIL-12mut.
c; 2 x 10^{7} esplenocitos obtenidos a partir
de ratones inmunizados con ADN se reestimularon con células
CT26-hghE2t tratadas con mitomicina in vitro,
Tras 48 h de cultivo, las células CD8 + T se aislaron usando
MACSing. Tras fijación y permeabilización, las células se tiñeron
con anticuerpos anti-CD8 y anti-
IFN-\gamma. Las células CD8 + T vivas se
activaron poniendo las células con FSC y CD8 y, a continuación, se
calculó el porcentaje de células CD8 + T productoras de
IFN-\gamma poniendo las células CD8 + T vivas con
CD8 y IFN-\gamma. Los datos se representan como
el valor promedio obtenido con dos ratones por grupo en dos
experimentos independientes.
d; los esplenocitos obtenidos a partir de
ratones inmunizados con ADN se diluyeron, se mezclaron con células
CT26-hghE2t tratadas cib C, y se incubaron durante 5
días. Se determinó la especificidad del CTL resultante mediante
lisis específica de células CT26-hghE2t marcadas con
^{51}Cr. Se puntuaron los pocillos como positivos para el
reconocimiento de CTL si el nivel de lisis específica excede el
valor medio de lisis mas 3SD obtenida para ratones nativos. La
frecuencia del precursor CTL por a x 10^{7} células de bazo se
calculó mediante análisis de regresión del número de pocillos
negativos en cada dilución de células respondedoras. Los datos se
representan como el valor promedio obtenido con dos ratones por
grupo en dos experimentos independientes.
Como se muestra en la Tabla 2, los ratones
co-inmunizados con el gen mIL-12 mut
tienen una mejora entre 3 y 7 veces en la frecuencia de células CD8
+ productoras de IFN-\gamma comparadas con los
grupos de HCV E2 sólo y mIL-12 wt a las 0, 3, 6, 10
ó 14 semanas tras el estímulo de inmunización correlacionándose con
el resultado de la respuesta CTL. Por el contrario, en un
experimento de control emparejado por isotipos, no existió
diferencia entre todos los grupos. A semejanza del resultado del
ensayo CTL, la frecuencia de las células CD8 + T productoras de
IFN-\gamma entre los grupos de inmunización no fue
muy diferente a las 2-3 semanas tras la estimulación
inicial. Estos datos demuestran que la expresión del gen
mIL-12mut sustenta la frecuencia de células T
productoras de CD8+ IFN-\gamma tras inmunización
con ADN durante un periodo de tiempo largo. A este efecto, debe
sugerirse que el papel in vivo del propio
IL-12p70 en la respuesta inmune mediada por células
es el mantenimiento a largo plazo de Thl y CTL, mientras que
IL-12p40 inhibe el IL-12p70 como
antagonista in vivo.
Para investigar la frecuencia de otras células T
CD8+ específicas, se llevó a cabo un ensayo de dilución limitante
(LDA). En este experimento, se midió la frecuencia de células T con
especificidad al antígeno CD8+ usando la capacidad de lisis de las
células CD8 + T HCV E2 específicas (Kuzushima, K. y col.,
Blood, 94:3094-3100, 1999). Los esplenocitos de
los ratones inmunizados con el estímulo se diluyeron a diferentes
concentraciones, y se colocaron en pocillos de una placa de 96
pocillos con fondo en U hasta 20 pocillos/dilución. Las células
CT-26 que expresan E2 se trataron con mitomicina
(500 \mug/\mul) para bloquear la división celular, y se
activaron con esplenocitos diluidos durante 5 días. Se añadió a
cada pocillo de la placa de 96 pocillos anterior con fondo en U
células diana (5 x 10^{3}) marcadas con ^{13}Cr, y tras 6 horas
de incubación a 37ºC, se cosechó el sobrenadante y se contó en un
contador \gamma (Wallac, Turkum Finlandia). Se calculó la
frecuencia CTL, y se consideró positiva, cuando el nivel de lisis
específica fue mayor que la del valor promedio de lisis + 3 x
desviaciones estándar (Kuzushima, K. y col., Blood,
94:3094-3100, 1999).
El resultado del ensayo de dilución limitante
fue similar al resultado del ensayo de tinción intracelular. Es
decir, la mayor frecuencia de células CD8 + T específicas del
antígeno se observó en el grupo mIL-12 incluso en
los primeros estadíos de inmunización, y esta frecuencia ha
permanecido a lo largo de 14 semanas tras el estímulo de
inmunización (Tabla 2).
Para confirmar la inmunidad Thl y CTL inducida
por el gen mIL-12mut gene in vivo, y para
examinar la correlación de la inmunidad protectora con la inmunidad
Thl y CTL, se inyectaron células tumorales
CT26-hghE2t que expresan hghE2t en los grupos de
ratones inmunizados a las 12 semanas tras el estímulo de
inmunización. 2 semanas después, se determinaron los niveles de
IgG, IgGl, IgG2 y la relación IgG2a/IgG1 específica del antígeno, y
se midió el tamaño del tumor durante 30 días. De manera particular,
se determinó el crecimiento medio del tumor local midiendo el
volumen y diámetro de los tumores con calibres cada tres días.
Igualmente, se determinaros los índices de supervivencia de estos
ratones por observación durante aproximadamente 70 días.
Como se muestra en las Figs. 8a, 8b y 8c, el
grupo de ratones inmunizados con mIL-12mut indujeron
una fuerte respuesta inmune Thl. El grupo de inmunización
mIL-12wt mostró un crecimiento retardado del tumor,
en contraste con el grupo únicamente con inmunización
pTV2-gDsE2t, mientras que el grupo de inmunización
mIL-12mut mostró un mostró un crecimiento del tumor
retardado de forma significativa. En el grupo de control, la mayoría
de los ratones tuvieron un tumor y murieron en los 50 días,
mientras que el 90% de los ratones del grupo
mIL-12mut pudo sobrevivir tras 70 días. De esta
forma, estos datos sugieren que las respuestas Thl y CTL específicas
de HCV E2 inducidas por el gen mIL-12mut confiere
protección in vivo frente al estímulo de células tumorales
modificadas que expresan el antígeno específico. Aunque no es fácil
evaluar los efectos relativos de las respuestas Thl y CTL sobre la
protección tumoral in vivo, es posible que las células CD8 +
CTL y Thl E2 específicas puedan matar directamente las células
CT26hghE2t y ayudar a las CTL, de forma respectiva, como se muestra
en el ensayo in vitro Thl y CTL. Igualmente, los anticuerpos
IgG2a que se enlazan fuertemente con FC-\gamma R
en los macrófagos y células asesinas naturales, pueden mediar en la
citotoxicidad mediada por células dependiente de los
anticuerpos.
Tal como se ha descrito anteriormente en el
presente documento, la presente invención se refiere a la subunidad
IL-12p40 de gen mutante que puede producir
interleuquina 12 (IL-12) de origen humano y de ratón
con actividad elevada, y al vector de expresión que incluye el gen
mutante anterior, así como al uso de estos como coadyuvante de
vacuna de ADN. De forma particular, se refiere al gen mutante
IL-12p40 que inhibe la secreción de
IL-12p40 pero que de manera normal secreta
IL-12p70 activa mediante una mutación en el
aminoácido Asn-222 (humano) o Asn220 (de ratón) del
IL-12p40, que actúa como un inhibidor competitivo de
la forma activa de IL-12, IL12p70. El gen mutante
IL-12p40 de la presente invención puede inducir una
respuesta inmune mediada por células optima en estadíos iniciales
durante un amplio intervalo si se inmuniza con la vacuna de ADN. Por
tanto, el gen mutante IL-12p40 de la presente
invención puede ser útil en vacunas de ADN y terapia génica para
varias enfermedades, por ejemplo, SIDA; hepatitis C o hepatitis B,
cáncer, gripe, tuberculosis y malaria, que esencialmente requieren
una respuesta inmune celular para su terapia.
<110> Pohang University of Science and
Technology, y col.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes de la subunidad
IL-12p40 mutados para mejorar la actividad de
IL-12 y el uso de la misma
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcomo coadyuvante de vacuna de ADN
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
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<150> KR 2000-13133
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 900
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<212> ADN
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<213> Ratón
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 328
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<212> PRT
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<213>
IL-12p40-N222L humano
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 328
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<212> PRT
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<213>
IL-12p40-N222Q humano
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 335
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<212> PRT
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<213>
IL-12p40-N222L de ratón
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<400> 5
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador T7
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<400> 6
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\hfill24
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<210> 7
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador T3
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador sentido
hp40-N125Q
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipcccaaacaga aaacgtttct a
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<210> 9
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido
hp40-N125Q
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcgttttctgt ttgggttctt t
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<210> 10
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido
hp40-N135Q
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
ho40-N125Q
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<210> 12
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador sentido
hp40-N222Q
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<400> 12
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\hfill21
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<210> 13
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<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
hp40-N222Q
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipggtgtactgt tcatacttga g
\hfill21
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<210> 14
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido
hp40-N303Q
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<400> 14
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\hfill21
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<210> 15
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
hp40-N303Q
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<400> 15
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\hfill21
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<210> 16
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<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido
hp40-N127Q
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipaccaagcagg agagttgcct a
\hfill21
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
hp40-N125Q
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipactctcctgc ttggttaatt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido
hp40-N141Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataactcagg ggagttgcct g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
hp40-N141Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipactcccctga gttatgaaag a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido
hp40-N251Q
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskiptatctgcagg cttcctaaaa a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido
hp40-N251Q
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<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagcctgc agatagctca t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> cebador sentido
mp40-N220L
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<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskiptatgagctct acagcaccag c
\hfill21
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<210> 23
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<211> 24
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<212> ADN
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<223> cebador antisentido
mp40-N220L
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\hskip-.1em\dddseqskipgctgtagagc tcatattttt actg
\hfill24
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Claims (16)
1. Un gen que codifica una subunidad
IL-12p40 humano mutado, en el que se sustituye la
Asn-222, descrita en la SEC. DE ID Nº 1, que es
esencial para la secreción de la IL-12p40
humana.
2. Un gen que codifica una subunidad
IL-12p40 de ratón mutado, en el que se sustituye la
Asn-220, descrita en la SEC. DE ID Nº 2, que es
esencial para la secreción de la IL-12p40 de
ratón.
3. El gen de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que se sustituye la Asn-222 con
Leu-222, Gin-222 o
Ile-222.
4. El gen de acuerdo con la reivindicación 2, en
el que se sustituye la Asn-220 con
Leu-220, o Ile-220.
5. Un constructo de gen que contiene un
emplazamiento de entrada interno de ribosoma (IRES) entre el gen de
la reivindicación 1 y el gen que codifica la subunidad
IL-12p35 humana.
6. Un constructo de gen que contiene un IRES
entre el gen de la reivindicación 2 y el gen que codifica la
subunidad IL-12p35 de ratón.
7. Un vector de expresión que contiene el
constructo de gen de la reivindicación 5.
8. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el vector de expresión es
pGX0-hp35/IRES/
hp40-N222L que tiene el número de acceso KCTC 0969BP, y en el que la Asn-222 de la IL-12p40 humana se sustituye con Leu-222.
hp40-N222L que tiene el número de acceso KCTC 0969BP, y en el que la Asn-222 de la IL-12p40 humana se sustituye con Leu-222.
9. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el vector de expresión es
pGX0-hp40-N222L/IRES/hp35 que tiene
el número de acceso KCTC 0970BP, y en el que la
Asn-222 de la IL-12p40 humana se
sustituye con Leu-222.
10. Un vector de expresión que contiene el
constructo de gen de la reivindicación 6.
11. El vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que el vector de expresión es
pTV2-mp35/IRES/mp40-N220L que tiene
el número de acceso KCTC 0745BP, y en el que la
Asn-220 de la IL-12p40 de ratón se
sustituye con Leu-220.
12. Un coadyuvante de ADN terapéutico o
profiláctico para la inmunización con ADN o terapia génica, que
comprende un gen según se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, un constructo de gen se define
en las reivindicaciones 5 ó 6, o un vector de expresión según se
define en una cualquiera de las reivindicaciones
7-11, en el que la Asn-222 de la
subunidad IL-12p40 humana o la
Asn-220 de la de la subunidad
IL-12p40 de ratón, esencial para la secreción de
IL-12p40, está mutada.
13. El coadyuvante de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el coadyuvante puede inducir respuesta
inmune aumentando la actividad de hidrólisis de los linfocitos T
citotóxicos.
14. El coadyuvante de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el coadyuvante puede inducir respuesta
inmune aumentando la secreción de IFN-\gamma desde
las células T auxiliares.
15. El coadyuvante de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el coadyuvante puede inducir respuesta
inmune aumentando la secreción de IFN-\gamma desde
las células CD8 +.
16. El coadyuvante de acuerdo con la
reivindicación 12, para uso como coadyuvante en una composición de
vacuna frente a varias enfermedades como cáncer, SIDA; hepatitis B o
hepatitis C, gripe, tuberculosis y malaria.
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