ES2272636T3

ES2272636T3 - Procedimiento para la determinacion cuantitativa del grado de metilac ion de citosinas en posiciones cpg.

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Publication number: ES2272636T3
Application number: ES02090203T
Authority: ES
Inventors: Christian Piepenbrock; Joern Lewin; Armin Dr. Schmitt
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2022-06-05
Also published as: AU2003204553A1; DE50208138D1; US20040023279A1; AU2003204553B2; ATE339520T1; EP1369493A1; JP2004008217A; US8577615B2; EP1369493B1; DK1369493T3

Abstract

Procedimiento para la determinación del grado de metilación de una citosina que se ha de investigar, dentro de un dinucleótido CpG, que se encuentra dentro de una zona de secuencia del genoma, cuya secuencia es conocida, en el genoma de por lo menos una célula o de un organismo, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas: a) tratamiento de una muestra de ADN con un bisulfito y subsiguiente amplificación de un fragmento seleccionado de este ADN tratado, b) realización de un análisis de secuencias del material amplificado, en el cual el resultado se representa en forma de un electroferograma, c) determinación de una tasa de transformación de citosina no metilada en uracilo, como consecuencia de un tratamiento con un bisulfito, caracterizado porque las intensidades de señales de las bases, que modifican su comportamiento de hibridación mediante un tratamiento con un bisulfito, se pone en relación con las intensidades de señales de las bases, que no se modifican mediante un tratamiento con un bisulfito, haciéndose referencia para esto a la secuencia del mismo sentido ya conocida y/o a su secuencia complementaria inversa; d) cálculo del grado real de metilación de la citosina que se ha de investigar por determinación de la proporción de moléculas de ADN metiladas en una mezcla de moléculas de ADN metiladas y no metiladas, tomando en consideración la tasa de transformación determinada en la etapa c).

Description

Procedimiento para la determinación cuantitativa del grado de metilación de citosinas en posiciones de CpG.

El invento se refiere a un procedimiento para la determinación del grado de metilación de una citosina que se ha de investigar, en el genoma de por lo menos una célula o de por lo menos un organismo.

Estado de la técnica

La 5-metilcitosina es la base modificada covalentemente más frecuente en el ADN (ácido desoxirribonucleico) de células eucarióticas. Ella desempeña por ejemplo un cierto cometido en la regulación de la transcripción, en la impresión genómica y en la génesis de tumores. La identificación de 5-metilcitosina como parte componente de una información genética presenta por lo tanto un considerable interés. Las posiciones de la 5-metilcitosina no se pueden identificar sin embargo de por sí mediante secuenciación, puesto que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además de esto, en el caso de una amplificación por PCR (de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de una polimerasa) se pierde totalmente la información epigenética, que llevan las 5-metilcitosinas.

Se conocen varios procedimientos, que resuelven estos problemas. En la mayor parte de los casos, se lleva a cabo una reacción química o un tratamiento enzimático del ADN genómico, como consecuencia de la o del cual las bases de citosina se pueden diferenciar con respecto de las de metilcitosina. Un método corriente es la reacción de un ADN genómico con un bisulfito, que después de una hidrólisis en condiciones alcalinas conduce en dos etapas a una transformación de las bases de citosina en uracilo (Shapiro, R., Cohen, B. y Servis, R. (1970) Nature 227, 1047). La 5-metilcitosina permanece inalterada en estas condiciones. La transformación de citosina en uracilo conduce a una modificación de la secuencia de bases, a partir de la cual se pueden determinar por secuenciación entonces las 5-metilcitosinas originales (solamente éstas proporcionan todavía una banda en la traza de C).

Una recopilación acerca de las otras posibilidades adicionales conocidas de detectar 5-metilcitosinas, se puede tomar, en común con la bibliografía pertinente, del siguiente artículos de compendio: Rein, T., DePamphilis, M. L. y Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

La determinación de una sucesión de bases con ayuda de una adición de apropiados oligonucleótidos, que se fijan al ADN y que actúan como moléculas de cebadores, que luego se prolongan con ayuda de una polimerasa de ADN y suficiente cantidad de dNTP's así como de ddNTP's que conducen a la ruptura de la cadena, es asimismo estado de la técnica. Este método se denomina a continuación método de ruptura de cadena o también método de secuenciación de Sanger. La mayor parte de los modernos métodos de secuenciación, que permiten una automatización de la secuenciación, se basan en una combinación de este concepto con la reacción en cadena de una polimerasa (PCR) y con programas de evaluación asistidos por ordenador.

La amplificación de un ADN mediante una PCR es estado de la técnica. Asimismo, es estado de la técnica el análisis automático de secuencias. Principalmente, para la automatización se utiliza el método de secuenciación de Sanger y ciertamente se diferencian de manera fundamental cuatro reacciones, en las que al molde de ADN y a los cuatro dNTP's se les añade en cada caso una de las cuatro bases como ddNTP's. Esto conduce entonces a la interrupción de la reacción de una polimerasa en cada caso con este tipo de bases. Si se formulan cuatro tandas de reacción y por cada tanda se utilizan cebadores de oligonucleótidos específicamente marcados con fluorescencia, también después de haber mezclado las tandas terminadas de reacción, con detectores apropiados se puede determinar todavía a partir de cuál de las tandas procede la molécula. De esta manera es posible llevar a cabo la separación de esta mezcla según los tamaños en una traza.

Con el fin de evitar la marcación con fluorescencia de los cebadores de oligonucleótidos, que es relativamente costosa y cara, también los di-desoxi-nucleótidos (ddNTP's) de ruptura se pueden marcar con fluorescencia con diferentes colores. En este caso, es innecesaria incluso la separación en cuatro tandas de reacción y tienen lugar una junta a otra las cuatro reacciones de ruptura.

Después de haberse terminado la reacción, los productos de la reacción, marcados con fluorescencia, se pueden separar según sus tamaños por electroforesis en una traza de un gel de acrilamida. Los fragmentos de ADN, que se desplazan frente al detector en el orden de sucesión de sus tamaños, son irradiados por un láser, que excita al colorante fluorescente e induce la emisión de su longitud de onda específica. Éstos son registrados por el detector y traducidos en información de secuencias con apropiados programas de ordenador.

Los procedimientos automatizados, hoy en día corrientes, proporcionan, como resultado de esta acumulación de datos de emisión, un electroferograma, es decir una representación gráfica de estos datos, para cada uno de los cuatro colorantes. Puesto que cada colorante pertenece a un determinado ácido nucleico, se puede determinar a partir de esto la sucesión de bases en la secuencia original.

Algunos artículos, que describen el estado de la técnica en lo que se refiere a la "secuenciación con un bisulfito", es decir el análisis de secuencias de un ADN tratado con un bisulfito, se mencionan a continuación:

Por ejemplo, a la técnica de la secuenciación con un bisulfito se hace referencia tanto para el análisis de la metilación del promotor mínimo del receptor de andrógenos (Kinoshita y colaboradores, Methylation of the Androgen Receptor Minimal Promoter Silences Transcription in Human Prostate Cancer [La metilación del promotor mínimo de receptores de andrógenos silencia la transcripción en un cáncer de próstata humana] (2000), Cancer Research 60: 3623-3630) así como también para el análisis de la metilación del gen \pi de la glutatión-S-transferasa (Millar y colaboradores (1999); Detailed methylation analysis of the glutathion-S-transferase \pi (GSTP1) gene in prostate cancer [análisis detallado de la metilación del gen \pi de la glutatión-S-transferasa (GSTP1) en un cáncer de próstata]. Oncogene 18: 1313-1324) para la explicación de su cometido en el caso de un cáncer de próstata. En ambos artículos, los autores se refieren a un artículo de Susan J. Clark y colaboradores (High sensitivity mapping of methylated cytosines [Cartografiado con alta sensibilidad de citosinas metiladas] (1994) Clark y colaboradores; Nucleic Acids Res. 22: 2990-2997), en el que se describe el método de la secuenciación con un bisulfito.

El estado de la técnica, en lo que se refiere a la determinación cuantitativa de la metilación de citosina con ayuda de métodos de secuenciación, se puede tomar principalmente de un artículo de Paul y Clark, en el que se describe un método para la secuenciación mediando utilización de bases de timina y citosina marcadas diferentemente (Paul C.L. y Clark S.J. (1996) Cytosine methylation: quantitation by automated genomic sequencing and GENESCAN analysis [Metilación de citosina: cuantificación mediante secuenciación genómica automática y análisis por GENESCAN]. Biotechniques. 21(1): 126-33). El método es apropiado principalmente para llevar a cabo análisis cuantitativos del grado de metilación. Éste, sin embargo, no resuelve el problema de que, por causa de las diferentes tasas de incorporación de timina y citosina, así como mediante la utilización de diferentes colorantes, es muy difícil una cuantificación exacta. Éste es resuelto por medio de la normalización propuesta en el invento, que aquí se describe. Además, el método descrito por Clark y Paul no considera de ninguna forma la eficiencia, que influye esencialmente sobre el resultado, de la reacción de transformación, que transforma las citosinas no metiladas en bases con el comportamiento de hibridación de timinas. Sin embargo, exactamente la consideración de una tasa de conversión de bisulfito es una etapa esencial del método del presente invento.

Descripción del problema y de su solución en un electroferograma: como antes se ha mencionado, la sucesión de las bases en la secuencia se representa como evolución de una curva. Teóricamente, cada uno de los picos de esta evolución de una curva corresponde a la aparición de una base en la secuencia original. Así, se colocan uno sobre otro cuatro gráficos de diferentes colores, a fin de determinar la secuencia total.

Puesto que en una secuencia individual, cada una de las posiciones puede ser ocupada solamente una vez y asimismo cada posición debe estar representada por al menos una base, en el caso ideal todas las señales deberían tener la misma intensidad. La intensidad de una señal es determinada por la magnitud de un pico, dicho más exactamente por el área de la superficie por debajo del pico. Éstas deberían ser uniformemente grandes, siempre y cuando que la incorporación de los nucleótidos de ruptura esté distribuida aleatoriamente y de manera uniforme. Sí, por el contrario, junto a una posición se llega a la incorporación favorecida de un nucleótido de ruptura, este producto se presenta multiplicado y el pico correspondiente se hace mayor. La sucesión de bases permanece sin embargo inalterada por esto.

También la diferente intensidad de los colorantes fluorescentes utilizados da lugar a diferentes intensidades de las señales. Esto carece de importancia para la determinación cuantitativa de la secuencia, propiamente dicha, pero si se investiga, sin embargo, una mezcla de secuencias que se diferencian en su sucesión de bases junto a posiciones individuales, y si se quiere determinar la relación de aquellas secuencias específicas entre ellas, la determinación correcta de la intensidad de los picos adquiere una decisiva importancia. La intensidad de los picos refleja el número de las moléculas en la mezcla de ADN, que tienen en esa posición esta base específica. Cuando, por ejemplo, dos alelos tienen diferentes nucleótidos junto a una posición, en el electroferograma se obtienen dos picos con la mitad de la intensidad en el mismo sitio, por lo tanto, por así decir, superpuestos. Este es el caso, por ejemplo, cuando se analizan mutaciones puntuales, que aparecen solamente en un alelo.

La determinación de la intensidad de los picos es, como consecuencia, siempre de importancia decisiva, cuando se tenga que cuantificar, a partir de una mezcla de secuencias similares, la proporción de una determinada sucesión de bases. Este es el caso cuando se requiere determinar el grado de metilación de una o varias citosinas. Como la determinación cuantitativa del grado de metilación de una citosina se ha de entender la determinación de la proporción de moléculas de ADN metiladas, en una mezcla de moléculas de ADN metiladas y no metiladas.

Mediante una apropiada reacción, por ejemplo por tratamiento con un bisulfito, se pueden diferenciar mediante una PCR las citosinas metiladas con respecto de las citosinas no metiladas, por causa de su diferente comportamiento de hibridación después de la transformación. Se establece, como consecuencia de esto, después de la PCR, la situación de tener ante sí una mezcla de moléculas, que se diferencian unas de otras en cuanto a nucleótidos individuales. Sí, por ejemplo, están metiladas en una posición de CpG un 20% de las moléculas, al realizar la secuenciación del ADN tratado con un bisulfito, junto a esa posición en el electroferograma que detecta la citosina debería aparecer un pico con una intensidad de señal de 20% y en el electroferograma que detecta la timina debería aparecer un pico con una intensidad de señal de 80% de la intensidad de señal que por lo demás es usual. Con el fin de poder hacerse referencia a las intensidades de pico para una cuantificación exacta, se debe presuponer no obstante que son idénticas las intensidades de señales obtenidas para los cuatro colores. Éste, sin embargo, no es el caso.

\newpage

Por el contrario, en ningún caso se puede suponer que los cuatro colorantes fluorescentes son detectados con la misma intensidad, ni tampoco que las cuatro tasas de incorporación son igualmente efectivas. En particular, al realizar la secuenciación de un ADN tratado con un bisulfito, se establece el problema de que hay relativamente muy pocas citosinas en la secuencia modificada y que estas señales, por lo tanto, aparecen esencialmente más intensas. Basándose en este extremado desequilibrio de los fragmentos de secuencias, marcados con diferentes colores, se llega por consiguiente a una sobrevaloración de la intensidad de señal de la marcación con citosina y se falsea por consiguiente el resultado del análisis de secuencias.

Con el fin de obtener una información más confiable sobre las secuencias, en particular, cuando no se quisiera obtener solamente una respuesta cualitativa de "si/no", sino que se quisiera determinar cuantitativamente la proporción de una base junto a una posición específica de la secuencia, es recomendable una normalización de las diferentes señales unas con otras. Sí, por el contrario, se trata de la determinación de la proporción de citosinas en una secuencia pobre en citosina, tratada con un bisulfito, se hace imperativamente necesaria la normalización, en particular, de la señal de citosina.

Otro problema esencial se establece por medio de la transformación de una citosina sin metilar en uracilo, que con frecuencia no se había efectuado hasta la conversión total. Una tasa de transformación de por ejemplo 80% tiene como consecuencia el hecho de que un 20% de las citosinas, que propiamente después de la transformación en uracilo y después de la PCR deberían dar una señal de timina, no hacen esto. Por consiguiente, sin embargo, una intensidad de señal de timina solamente de un 80%, en comparación con la intensidad media de señales de guanina en el sitio de una citosina no metilada, describe una posición de CpG, en la que la citosina no está metilada en un 100%. Sin el conocimiento de la tasa de transformación, y con la suposición de que la transformación hubiera discurrido totalmente, esta intensidad de señal se interpretaría como una posición de CpG sin metilar en un 80% y metilada en un 20%. Por consiguiente, la determinación de la tasa de transformación para efectuar la cuantificación exacta del grado de metilación de una citosina, es asimismo tan imperativamente necesaria como la normalización de las intensidades.

La parte predominante de la bibliografía especializada, que se ocupa de un "silenciamiento de genes" (en inglés gene silencing), es decir, de la regulación en sentido descendente de la transcripción de genes, y de la metilación, se basa en análisis cualitativos de la metilación, que se limitan al análisis de una posición o de unas pocas posiciones de CpG con ayuda de enzimas de restricción sensibles a la metilación. Los análisis que van más allá de esto, los cuales investigan por ejemplo los grados de metilación en diferentes alelos, se basan en la secuenciación de clones (Kinoshita y colaboradores, 2000; Cancer Research 60, 3623-3630): El ADN genómico que se ha de investigar es extraído y tratado con un bisulfito. Las zonas interesantes del ADN se amplifican mediante una PCR, y los materiales amplificados obtenidos se subclonan.

Si, por ejemplo, se debe de determinar el estado de metilación de alelos específicos, los materiales amplificados por una PCR de los ADN tratados con un bisulfito son subclonados y transformados en el seno de E. coli. A continuación de esto se investigan 10-25 colonias individuales de cada uno de los clones. En el caso del análisis de la metilación de un alelo, en el que pueden darse solamente los resultados cero, uno o dos, se obtiene ya después de la secuenciación de un número relativamente pequeño de colonias un resultado con poder informativo. En general resulta válido sin embargo el hecho de que cuantas más colonias se investiguen tanto más corresponde el resultado al grado de metilación realmente presente. En el documento citado (Kinoshita y colaboradores 2000) se aprovechan 10-25 cultivos en E. coli y cada vez se aísla su ADN de plásmido. Esta 10-25 muestras de ADN de plásmido se secuencian todas ellas individualmente y, con ayuda de los clones metilados y de los no metilados, se determina el grado de metilación del alelo.

La secuenciación múltiple de los ADN, y sobre todo también la etapa adicional de la clonación, hacen que este proceso resulte intenso en cuanto a costos, materiales y trabajo.

En los estudios ya mencionados (de Kinoshita y colaboradores 2000 y de Millar y colaboradores, 1999) se describen también intentos de determinar cuantitativamente el grado de metilación de una posición de CpG, sin tener que clonar. La interpretación de los datos se efectúa, sin embargo, en ambos casos sin tener que determinar la eficiencia de la reacción con un bisulfito y poder tomarla en consideración por consiguiente para el cálculo del grado real de metilación. Igual de poco se toma en consideración la distorsión de las intensidades de señales. Los métodos habituales explicados para la determinación de una metilación de ADN en una posición de CpG mediante secuenciación, por lo tanto, no solamente son caros y largos, sino que también, sobre todo en el caso de mezclas de muestras más complejas, conducen a unos resultados potencialmente falsos.

Además, Osman El-Maarri y colaboradores (en "A rapid, quantitative, non-radiactive bisulfite-SnuPE-IP RP HPLC assay for methyllation et specific CpG sites" ["Un análisis por HPLC RP con bisulfito-SnuPE-IP, rápido, cuantitativo y no radiactivo, de la metilación en sitios CpG específicos"] Nucleic Acids Research, 2002, volumen 30, Nº 6 e25) describen un procedimiento cuantitativo para el análisis de la metilación en específicas posiciones de CpG mediando utilización de productos de una PCR de un ADN genómico tratado con un bisulfito. En este caso se describe la cuantificación de la metilación mediante una SNuPE (single nucleotide primer extension = prolongación de cebadores de un único nucleótido).

El documento de solicitud de patente internacional WO 98 56952 A describe un procedimiento para el diagnóstico del cáncer, que se basa en una diferente metilación de los ADN. En este caso, se describe la utilización de una Ms-SNuPE (methylation-sensitive single nucleotide primer extension = prolongación de cebadores de un único nucleótido, sensible a la metilación).

Descripción del invento

Los problemas y las desventajas del estado de la técnica, que se han expuesto, se resuelven mediante el procedimiento conforme al invento.

El problema planteado por esta misión se resuelve por lo tanto, conforme al invento, mediante un procedimiento para la determinación del grado de metilación de una citosina que se ha de investigar, de acuerdo con la reivindicación 1.

En este caso se prefiere, conforme al invento, que en el análisis de secuencias del material amplificado se determine solamente la secuencia de timina del ADN o que en la cadena complementaria inversa se determine solamente la secuencia de adenina del ADN, y que el resultado se represente en forma de un electroferograma.

Conforme al invento, la intensidad de señal I_{B} de una base B, pudiendo B ser o bien C, A, G o T y estableciendo por consiguiente el tipo de base, cuya intensidad se considera, como parte del área de la superficie por debajo del pico en el electroferograma, se describe por la siguiente fórmula, describiendo f(x) la evolución de la curva de la señal de intensidad a través de una unidad x, que reproduce el tiempo que describe después de una separación por cromatografía la distancia entre dos bases:

I_{B} = \int\limits^{W2}_{W1} f(x)dx

siendo W1 y W2 las coordenadas x de los puntos de inflexión situados más próximos al valor x del máximo f^{max} y estando situadas W1 a la izquierda y W2 a la derecha de este valor x.

Conforme al invento, sin embargo, también la intensidad de señal I_{B} se describe por la siguiente fórmula:

I_{B} = \int\limits^{M2}_{M1} f(x)dx

siendo M1 y M2 las coordenadas x de los mínimos situados más próximos al valor x del máximo f^{max} y estando situadas M1 a la izquierda y M2 a la derecha de este valor x.

Conforme al invento, la intensidad de señal I_{B} se describe, sin embargo, también por la siguiente fórmula:

I_{B} = \int\limits^{H2}_{H1} f(x)dx

siendo H1 y H2 las coordenadas x de los sitios en la evolución de la curva, que están situados más próximos al valor x del máximo f^{max}, en los que f(x) es una vez y media el valor de f^{max}, y estando situadas H1 a la izquierda y H2 a la derecha de este valor de x.

Finalmente, conforme al invento, la intensidad de señal I_{B} se describe también por la siguiente fórmula:

I_{B} = \int\limits^{D2}_{D1} f(x)dx

siendo

D1 = x – (x – x_links)/2

y

D2 = x + (x_rechts – x)/2,

realizándose que

: x es la coordenada x de la posición A de la intensidad de señal que se ha de determinar,

: x_links es la coordenada x del máximo del pico a la izquierda de ésta y

: x_rechts es la coordenada x del máximo del pico a la derecha de ésta.

Finalmente, conforme al invento, la intensidad de señal I_{B} de una señal junto a una posición A se puede calcular de nuevo como área de la superficie por debajo de la curva de señal, de acuerdo con la siguiente fórmula:

I_{B} = \int\limits^{X2}_{X1} f(x)dx

pudiéndose usar como valores límites X1 y X2 las coordenadas x de una combinación arbitraria de los valores ya descritos, W1, W2, H1, H2, M1, M2, D1 o D2, pero debiendo estar situada X1 a la izquierda y X2 a la derecha del valor x que determina la posición A.

Es conforme al invento también un procedimiento en el que el análisis de una secuencia se lleva a cabo de acuerdo con el método de ruptura de cadena.

Conforme al invento, se prefiere especialmente además que en la etapa b) se lleve a cabo un análisis de secuencias para por lo menos dos bases diferentes y siguiendo a ésta una etapa adicional, en la que se lleva a cabo una normalización de la intensidad media de señal de por lo menos un tipo de base (C, T, A o G) frente a la intensidad media de señales, que se obtiene para uno o varios de los demás tipos de bases, determinándose el valor medio a lo largo de un gran número de posiciones de este tipo de base dentro de una zona definida arbitrariamente del material amplificado. Como "un gran número de posiciones" se entienden, en conexión con este invento, por lo menos dos posiciones. Sin embargo, éstas pueden ser también más de dos, hasta llegar a un número hasta de 100 posiciones y más. Es decisivo, en este contexto, el hecho de que la formación del valor medio conduce a unos valores matemáticamente razonables y/o estadísticamente confiables.

En este caso se prefiere, además, que para la determinación de la tasa de transformación mencionada en la etapa c), se utilicen unas intensidades de señales previamente normalizadas.

Se prefiere especialmente en este contexto, además, que, para el cálculo del grado real de metilación de la citosina que se ha de investigar, se utilicen tanto las intensidades normalizadas de señales como también la tasa de transformación que se ha obtenido tomando en consideración las intensidades normalizadas de señales.

Conforme al invento, es muy especialmente preferido, en este contexto, que se normalice la intensidad de señal de las señales de citosina frente a la intensidad de señal de las señales de timina o, respectivamente, que al hacerse referencia a las informaciones sobre secuencias de la cadena complementaria inversa se normalice la intensidad de señal de las señales de guanina frente a la intensidad de señal de las señales de adenina.

Conforme al invento, el factor para la normalización f_{N} se calcula a partir de

f_{N} = <I_{C}{}^{CG}> \ / \ (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{CG}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{CG}>) \ / \ <I_{C}{}^{CG}>

o respectivamente, al hacerse referencia a la información de secuencias de la cadena complementaria inversa

f_{N} = <I_{C}{}^{CG}> \ / \ (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{CG}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{CG}>) \ / \ <I_{G}{}^{CG}>

siendo <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina (I_{T}) y siendo <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina (I_{A}) junto a unas posiciones, que también antes del tratamiento con un bisulfito eran de timina, y respectivamente de adenina;

reproduciendo <I_{T}^{CG}> y <I_{C}^{CG}> las intensidades medias de señales de timina y citosina junto a citosinas en posiciones de CpG, y reproduciendo <I_{A}^{CG}> y <I_{G}^{CG}> respectivamente las intensidades medias de señales de adenina y guanina junto a guaninas en posiciones de CpG; y siendo formado el valor medio en cada caso a lo largo de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia.

Conforme al invento, el factor para la normalización f_{N} se determina sin embargo también a partir de

f_{N} = <I_{C}{}^{C}> \ / \ (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{C}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{C}>) \ / \ <I_{C}{}^{C}>

f_{N} = <I_{G}{}^{G}> \ / \ (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{G}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{G}>) \ / \ <I_{G}{}^{G}>

reproduciendo <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina (I_{T}) y <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina (I_{A}) junto a posiciones, que también antes del tratamiento con un bisulfito eran de timina, y respectivamente de adenina;

reproduciendo <I_{T}^{C}> y <I_{C}^{C}> las intensidades medias de señales de timina y citosina junto a citosinas y <I_{A}^{G}> y <I_{G}^{G}> las intensidades medias de señales de adenina y guanina junto a guaninas, que no están situadas en posiciones de CpG, y siendo formado el valor medio en cada caso a lo largo de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia.

Además, el factor para la normalización f_{N} se calcula conforme al invento también a partir de

f_{N} = <I_{T}{}^{A, G}> \ / \ <I_{C}{}^{A, G}>

o a partir de su valor inverso,

f_{N}{}^{-1} = <I_{C}{}^{A, G}> \ / \ <I_{T}{}^{A, G}>

o respectivamente al hacerse referencia a la información de secuencias de la cadena complementaria inversa

f_{N} = <I_{A}{}^{T, C}> \ / \ <I_{G}{}^{T, C}>

o a partir de su valor inverso,

f_{N}{}^{-1} = <I_{G}{}^{T, C}> \ / \ <I_{A}{}^{T, C}>

reproduciendo <I_{T}^{A,G}> la intensidad media de señales de timina (I_{T}) y <I_{C}^{A,G}> la intensidad media de señales de citosina (I_{C}) junto a posiciones de adenina o guanina;

y reproduciendo respectivamente <I_{A}^{T,C}> la intensidad media de señales de adenina (I_{A}) y <I_{G}^{T,C}> la intensidad media de señales de guanina (I_{G}) junto a posiciones de timina o citosina; y siendo formado el valor medio en cada caso a lo largo de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia.

Conforme al invento, la tasa de transformación f_{CON} se calcula a partir de

f_{CON} = I_{T}{}^{C} \ / \ (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C})

y respectivamente

f_{CON} = <I_{T}{}^{C} \ / \ (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C})>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C}) \ / \ I_{T}{}^{C}

y respectivamente

<f_{CON}{}^{-1} = <(f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C}) \ / \ I_{T}{}^{C}>

f_{CON} = I_{A}{}^{G} \ / \ (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G})

y respectivamente

f_{CON} = <I_{A}{}^{G} \ / \ (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G})>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G}) \ / \ I_{A}{}^{G}

y respectivamente

f_{CON}{}^{-1} = <(f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G}) \ / \ I_{A}{}^{G}>

siendo f_{N}, dependiendo de cuál sea la normalización que se utilice, uno de los factores de normalización antes mencionados, reproduciendo I_{T}^{C} la intensidad de una señal de timina y I_{C}^{C} la intensidad de una señal de citosina de una citosina, que no se encuentra en una posición de CpG, y reproduciendo respectivamente I_{A}^{G} la intensidad de una señal de adenina e I_{G}^{G} la intensidad de una señal de guanina de una guanina, que no se encuentra en una posición de CpG, después de un tratamiento con un bisulfito,

y o bien siendo formado el valor medio a través de los correspondientes cocientes de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia o tomándose en consideración solamente una posición de citosina y respectivamente una posición de guanina.

Conforme al invento, la tasa de transformación f_{CON} se calcula también a partir de

f_{CON} = <I_{T}{}^{C}> \ / \ <I_{T}{}^{T}>

o a partir de su valor inverso,

f_{CON}{}^{-1} = <I_{T}{}^{T}> \ / \ <I_{T}{}^{C}>

f_{CON} = <I_{A}{}^{G}> \ / \ <I_{A}{}^{A}>

o a partir de su valor inverso,

f_{CON}{}^{-1} = <I_{A}{}^{A}> \ / \ <I_{A}{}^{G}>

reproduciendo <I_{T}^{C}> la intensidad media de señales de timina de una citosina, que no se encuentra en una posición de CpG, y reproduciendo <I_{A}^{G}> la intensidad media de señales de adenina de una guanina, que no se encuentra en una posición de CpG, después de un tratamiento con un bisulfito, y reproduciendo <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina junto a una posición de timina y <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina junto a una posición de adenina, y siendo formado el valor medio a lo largo de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia.

Conforme al invento, el grado de metilación f_{MET} se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula

f_{MET} = 1 - I_{T}{}^{CG} \ / \ (f_{CON}(f_{N}I_{C}{}^{CG} + I_{T}{}^{CG}))

f_{MET} = 1 - I_{A}{}^{CG} \ / \ (f_{CON}(f_{N}I_{G}{}^{CG} + I_{A}{}^{CG}))

reproduciendo I_{T}^{CG} e I_{C}^{CG} la intensidad de las señales de timina y citosina de la citosina investigada en una posición de CpG, y reproduciendo I_{A}^{CG} e I_{G}^{CG} respectivamente la intensidad de una señal de adenina y guanina de la guanina investigada en una posición de CpG; y correspondiendo un grado de metilación de 1 a una metilación del 100%.

Conforme al invento, el grado de metilación f_{MET} se calcula también de acuerdo con la siguiente fórmula

f_{MET} = 1 - I_{T}{}^{CG} \ / \ f_{CON}<I_{T}{}^{T}>

f_{MET} = 1 - I_{A}{}^{CG} \ / \ f_{CON}<I_{A}{}^{A}>

reproduciendo I_{T}^{CG} la intensidad de una señal de timina de una citosina en una posición de CpG y <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina junto a posiciones de timina; y reproduciendo I_{A}^{CG} respectivamente la intensidad de una señal de adenina de una guanina en una posición de CpG, y reproduciendo <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina junto a posiciones de adenina; y correspondiendo un grado de metilación de 1 a una metilación del 100%.

Además, se prefiere especialmente conforme al invento un procedimiento en el que se efectúa la orientación unas junto a otras de una sucesión de bases solamente de un tipo de base, en una secuencia de nucleótidos que contiene por lo menos tres diferentes nucleótidos, conocida solamente en parte, después de haberse determinado las distancias entre dos bases individuales arbitrarias, tomando ayuda de procedimientos estadísticos y teóricos de señales, con ayuda de procedimientos probabilísticos.

Dentro de la idea inventiva general entran por consiguiente dos variantes del procedimiento, que están estructuradas conforme al invento de la siguiente manera.

Por un lado, un procedimiento para la determinación del grado de metilación de una citosina que se ha de investigar en el genoma de por lo menos una célula o de por lo menos un organismo, en el que se realizan las siguientes etapas:

a): tratamiento de una muestra de ADN con un bisulfito y subsiguiente amplificación de un fragmento seleccionado de este ADN tratado;

b): realización de un análisis de las secuencias del material amplificado, en el cual se analizan las diferentes bases del ADN o bien en trazas separadas en el espacio o, por el contrario, se analizan dentro de una traza de una manera diferenciable por diferente marcación con colores, y en el que el resultado se representa en forma de un electroferograma;

c): normalización de la intensidad media de señales mediante un tipo de base (C, T, A o G) frente a la intensidad media de señales, que se obtiene para uno o varios de los demás tipos de bases, siendo determinado el valor medio a lo largo de un gran número de posiciones de este tipo de base dentro de una zona definida arbitrariamente del material amplificado;

d): determinación de una tasa de transformación de citosina en uracilo como consecuencia de un tratamiento con un bisulfito, caracterizada porque por lo menos una intensidad de señal normalizada en la etapa c) junto a posiciones, que modifican su comportamiento de hibridación mediante un tratamiento con un bisulfito, se pone en relación con por lo menos otra intensidad de señal, pudiendo hacerse referencia para esto tanto a la secuencia del mismo sentido como también a su secuencia complementaria inversa;

e): cálculo del grado real de metilación de la citosina que se ha de investigar tomando en consideración las intensidades normalizadas de señales y la tasa de transformación que se ha determinado en la etapa d).

Y, por otro lado, un procedimiento para la determinación del grado de metilación de una citosina que se ha de investigar en el genoma de por lo menos una célula o de un organismo, en el que se realizan las siguientes etapas:

b): realización de un análisis de las secuencias del material amplificado, en el que se determina solamente la secuencia de timina o en la cadena complementaria inversa se determina solamente la secuencia de adenina del ADN y el resultado se representa en forma de un electroferograma;

c): determinación de una tasa de transformación de citosina en uracilo como consecuencia de un tratamiento con un bisulfito, caracterizada porque la intensidad de las señales de las bases, que modifican su comportamiento de hibridación mediante un tratamiento con un bisulfito, se pone en relación con la intensidad de una señal de las bases, que no se modifican por un tratamiento con un bisulfito, pudiendo hacerse referencia para esto tanto a la secuencia del mismo sentido como también a su secuencia complementaria inversa;

d): cálculo del grado real de metilación de la citosina que se ha de investigar tomando en consideración la tasa de transformación que se ha determinado en la etapa c).

El invento se describe seguidamente con mayor detalle. El invento describe un procedimiento para la secuenciación cuantitativa de ácidos nucleicos tratados con un bisulfito, dicho más exactamente, un procedimiento para la determinación del grado de metilación de una o varias citosinas en la sucesión de bases 5'-CG-3', es decir en una denominada posición de CpG, cuando es conocida la secuencia genómica de la zona investigada del ADN. Especialmente, el invento describe un procedimiento para la determinación de la proporción de moléculas de ácidos nucleicos, que están metiladas en una posición de CpG, a partir de una mezcla de ácidos nucleicos, que tienen citosinas metiladas y no metiladas, basándose en un análisis de las secuencias de la mezcla de ácidos nucleicos, que se ha tratado con un bisulfito. El invento hace posible la validación de una información de secuencias en el caso de la secuenciación de un ADN tratado con un bisulfito. En particular, se describe cómo los datos, obtenidos con los usuales modos de secuenciación, se normalizan primeramente en lo que se refiere a su intensidad de señales, cómo a partir de estos datos se determina la tasa de transformación de citosina en uracilo como consecuencia de un tratamiento con un bisulfito, y cómo con ayuda de esta tasa de transformación se consigue una estimación esencialmente mejorada del grado de metilación realmente presente.

En el presente invento se determina en particular tanto cómo se normalizan unas frente a otras intensidades de señales de electroferogramas y también cómo, con ayuda de la información contenida en el electroferograma, se calcula la tasa de transformación de la reacción con un bisulfito. Se describe, cómo con ayuda de estos factores se puede dar una información esencialmente más exacta acerca de la proporción de citosinas metiladas en una mezcla de citosinas metiladas y no metiladas. Por consiguiente, el invento se manifiesta como extremadamente útil para el análisis de grados de metilación de muestras de ADN, y mejora con esto de una manera considerable, por ejemplo, también el diagnóstico de enfermedades que son específicas para metilaciones.

El invento se extiende al análisis tanto de mezclas de ADN en células individuales como también de mezclas de ADN a partir de un gran número de células, que pueden proceder o bien de un organismo o de diferentes organismos. El método para la determinación del grado de metilación de por lo menos una citosina que se ha de investigar en el genoma de por lo menos una de tales células, que se ha descrito en esta solicitud, presupone que es conocida la secuencia genómica de nucleótidos del ADN no tratado con un bisulfito. En la primera etapa del método, la muestra de ADN genómico que se ha de investigar se trata con un bisulfito, modificándose las bases de citosina no metiladas de tal manera que en la subsiguiente PCR éstas presentan un comportamiento de hibridación como el de las bases de timina, mientras que las bases de 5-metilcitosina permanecen inalteradas. Los materiales amplificados de ADN bicatenario, obtenidos mediante una PCR, contienen, en vez de una citosina no metilada, en la cadena del mismo sentido, una timina, y de manera correspondiente, en la cadena complementaria inversa, una adenina. Como consecuencia de esto, por medio de la determinación de las intensidades de señales de timina junto a posiciones originales de citosina en una posición de CpG se puede determinar la magnitud de la proporción de las citosinas no metiladas junto a esta posición de CpG en la presente mezcla.

Es objeto del invento una primera variante de procedimiento conforme al invento, en la que en primer lugar se secuencian los materiales amplificados y los productos de reacción marcados se analizan seguidamente según sus tamaños ya sea en trazas separadas en el espacio o, por el contrario, se analizan de una manera diferenciable por una diversa marcación en colores dentro de una traza. Por ejemplo, se pueden utilizar cuatro diferentes ddNTP's marcados con fluorescencia; sin embargo, también es posible restringir el análisis a la determinación de menos que cuatro sucesiones de bases. El análisis de las secuencias termina de acuerdo con el estado de la técnica, de modo correspondiente, con la obtención de los electroferogramas, a los que se refiere usualmente sólo para la determinación cuantitativa de la sucesión de bases. En el presente invento se describe cómo, a partir de este electroferograma y a partir de la comparación de estos datos con la secuencia original, es decir la secuencia del ADN no tratado con un bisulfito, también se pueden obtener informaciones cuantitativas en lo que se refiere al grado de metilación de una citosina.

En primer lugar, se efectúa para esto una normalización de los datos de los electroferogramas. La intensidad media de señales de por lo menos un tipo de base (C, T, A o G), se pone en relación con la intensidad media de señales de uno o varios de los demás tipos de bases. En una variante especialmente preferida del método, se pone en relación la intensidad de una señal de citosina con la de una señal de timina. El valor medio se calcula en este caso cada vez a través de los valores de las intensidades de señales de las bases, que se encuentran en una zona arbitrariamente definida del material amplificado. Éste puede abarcar todo el material amplificado, o sin embargo también solamente un pequeño segmento del mismo.

A partir de las intensidades normalizadas de señales se calcula en la siguiente etapa una tasa de transformación de citosina en uracilo como consecuencia de un tratamiento con un bisulfito (f_{CON}). Ésta describe la relación de las bases de citosinas no metiladas, cuyo comportamiento de hibridación había sido modificado mediante un tratamiento con un bisulfito, en el comportamiento de hibridación de la timina, con respecto a todas las bases de citosinas no metiladas, independientemente de si su comportamiento de hibridación se hubiera o no modificado, dentro de una zona definida de una secuencia. La zona que se ha de considerar puede comprender la longitud de todo el material amplificado o, por el contrario, solamente una parte del mismo.

Tomando en consideración la normalización, y con ayuda de esta tasa de transformación f_{CON}, se determina en la última etapa el grado real de metilación f_{MET} o por lo menos uno más próximo a la realidad.

Es objeto del invento una segunda variante afín de procedimiento para la determinación de este grado de metilación, para el caso de que junto a la conocida secuencia genómica de nucleótidos del ADN no tratado con un bisulfito, cuyo conocimiento es premisa para la determinación del grado de metilación, se deben o pueden referirse para el análisis solamente los electroferogramas de timina del ADN tratado con un bisulfito. Es objeto del invento descubrir cómo sin el conocimiento acerca de las sucesiones de bases de citosina, guanina y adenina, solamente a partir del electroferograma de timina, se puede determinar primeramente una tasa de transformación f_{CON}, y cómo, con la ayuda de ésta, se puede calcular el grado de metilación. Para este caso, el cálculo de la tasa de transformación es de una importancia tanto mayor, por cuanto que una normalización de los datos no es posible ni necesaria.

Se prefieren unas variantes de ambos métodos, caracterizadas porque las intensidades de señales de citosina se normalizan frente a las intensidades de señales de timina.

El cálculo de los factores de normalización, para la normalización de intensidades de señales, así como el cálculo de las tasas de transformación, se basan en el conocimiento más exacto que sea posible de las intensidades de señales propiamente dichas.

En una variante preferida del primer método, se calculan los factores de normalización de la siguiente manera:

: Puesto que el electroferograma constituye una evolución de una curva, que representa el número de las señales detectadas por unidad de tiempo, que a su vez (como característica inherente del método de secuenciación) refleja la distancia en el espacio entre dos bases, la intensidad de una señal, y por consiguiente el número de las moléculas que llevan esa señal, se puede calcular por medio del área de la superficie por debajo del pico, y por lo tanto por debajo del máximo local de esta evolución de una curva. Por integración de esta evolución de una curva se puede describir de un modo óptimo el área de superficie considerada. Estas dimensiones de las áreas se establecen por los límites de integración X1 y X2. Las integrales se forman en cada caso desde un valor X1 situado a la izquierda del máximo local, hasta un valor X2 situado a la derecha del máximo local. Para el cálculo de la intensidad de una señal son especialmente preferidos en este caso, para la integración de las áreas de superficie por debajo de los máximos locales, los siguientes valores límites posibles.

El procedimiento se efectúa correspondientemente de manera especialmente preferida cuando las cifras de medición para la intensidad de una señal se obtienen

-: por integración del área de la superficie por debajo de la evolución de una señal desde el punto de inflexión situado más próximo a la izquierda del máximo local hasta el punto de inflexión situado más próximo a la derecha del mismo,

-: por integración del área de la superficie por debajo de la evolución de una señal desde el mínimo local situado más próximo a la izquierda del máximo local hasta el mínimo situado más próximo a la derecha del mismo,

-: por integración del área de la superficie por debajo de la evolución de una señal desde el punto de mitad de altura situado más próximo a la izquierda del máximo local, es decir la coordenada x del valor que es la mitad de altura (1/2 f(x)) del máximo local, hasta el punto de mitad de altura situado más próximo a la derecha del máximo local,

-: por integración del área de la superficie por debajo de la evolución de una señal desde un valor D1 a un valor D2, describiendo D1 y D2 las coordenadas x que en cada caso están situadas exactamente en el centro entre dos máximos locales, encontrándose D1 a la izquierda del máximo que se ha de determinar y D2 a la derecha del máximo que se ha de determinar,

-: o por integración de la superficie por debajo de la evolución de una señale mediante inclusión de una combinación arbitraria de los valores límites descritos.

Se prefiere una variante de ambos procedimientos, la cual está caracterizada porque la información utilizada de secuencias del tratamiento con un bisulfito se había determinado con ayuda del método de ruptura de cadena.

Se prefiere especialmente un procedimiento, en el que el factor de normalización se calcula a partir de la relación de la intensidad media de señales de citosina junto a citosinas en una posición de CpG y de la diferencia de la intensidad media de señales de timina junto a timinas y de la intensidad media de señales de timina junto a citosinas en una posición de CpG:

f_{N} = <I_{C}{}^{CG}> \ / \ (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{CG}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{CG}>) \ / \ <I_{C}{}^{CG}>

Es manifiesto, y por consiguiente se incluye en la variante preferida, el hecho de que las intensidades de señales de timina y citosina se pueden reemplazar en este caso por intensidades de señales de adenina y guanina, en el caso de que para la realización del método se hubiera referido a los datos de secuencia de la cadena inversa complementaria

f_{N} = <I_{C}{}^{CG}> \ / \ (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{CG}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{CG}>) \ / \ <I_{G}{}^{CG}>

Es muy especialmente preferida una variante el primer procedimiento, la cual está caracterizada porque el factor de normalización se puede calcular a partir de la relación de la intensidad media de las señales de citosina junto a citosinas situadas fuera de posiciones de CpG, y de la diferencia de la intensidad media de señales de timina junto a timinas y de la intensidad media de señales de timina junto a citosinas situadas fuera de una posición de CpG:

f_{N} = <I_{C}{}^{C}> \ / \ (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{C}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{C}>) \ / \ <I_{C}{}^{C}>

También en este caso es manifiesto, y por consiguiente está incluido en la variante preferida, el hecho de que las intensidades de señales de timina y citosina se pueden reemplazar aquí por intensidades de señales de adenina y guanina, en caso de que para la realización del método se hubiera referido a los datos de secuencias de la cadena inversa complementaria

f_{N} = <I_{G}{}^{G}> \ / \ (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{G}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{G}>) \ / \ <I_{G}{}^{G}>

Es especialmente preferida además una variante del procedimiento, la cual está caracterizada porque el factor de normalización se puede calcular a partir de la relación de las intensidades medias de señales de timina y citosina junto a posiciones de adenina y guanina:

f_{N} = <I_{T}{}^{A, G}> \ / \ <I_{C}{}^{A, G}>

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = <I_{C}{}^{A, G}> \ / \ <I_{T}{}^{A, G}>

A la inversa, al hacerse referencia a los datos de secuencias de tratamiento con un bisulfito de la cadena inversa complementaria, resulta válido que es preferido el cálculo de este factor de normalización a partir de la relación de las intensidades medias de señales de adenina y guanina junto a posiciones de timina y citosina:

f_{N} = <I_{A}{}^{T, C}> \ / \ <I_{G}{}^{T, C}>

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = <I_{G}{}^{T, C}> \ / \ <I_{A}{}^{T, C}>

Para todos los cálculos mencionados de los valores medios resulta válido el hecho de que éstos son formados siempre a lo largo de una zona de secuencia fijamente establecida, que puede tanto abarcar la longitud de todo el material amplificado como también consistir en solamente un número mínimo de bases.

El método comprende, en una etapa adicional, la determinación de una tasa de transformación f_{CON}.

En particular es preferida una variante del primer método, que está caracterizada porque se calcula una tasa de transformación f_{CON} a partir de la relación de las citosinas transformadas en timina y de la suma de todas las citosinas transformadas y no transformadas, dentro de una zona definida de una secuencia. Para esto se calculan la relación entre las intensidades de señales de timina junto a unas posiciones, que antes del tratamiento con un bisulfito estaban ocupadas por citosina y no son posiciones de CpG, y la suma de estas intensidades de señales de timina y de señales de citosina normalizadas junto a las mencionadas posiciones:

f_{CON} = I_{T}{}^{C} \ / \ (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C})

y respectivamente

f_{CON} = <I_{T}{}^{C} \ / \ (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C})>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C}) \ / \ I_{T}{}^{C}

y respectivamente

f_{CON}{}^{-1} = <(f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C}) \ / \ I_{T}{}^{C}>

f_{CON} = I_{A}{}^{G} \ / \ (f_{NG}{}^{G} + I_{A}{}^{G})

y respectivamente

f_{CON} = <I_{A}{}^{G} \ / \ (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G})>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G}) \ / \ I_{A}{}^{G}

y respectivamente

f_{CON}{}^{-1} = <(f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G}) \ / \ I_{A}{}^{G}>

Además, es preferida una variante de ambos métodos, la cual está caracterizada porque esta tasa de transformación se puede calcular también únicamente tomando ayuda de las intensidades de señales de timina. Para esto, se forma la relación de la intensidad de una señal de timina junto a una posición, que estaba ocupada por citosina antes del tratamiento con un bisulfito, pero que no se encuentra en una posición de CpG, y de la intensidad de una señal de timina junto a una posición de timina.

f_{CON} = <I_{T}{}^{C}> \ / \ <I_{T}{}^{T}>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = <I_{T}{}^{T}> \ / \ <I_{T}{}^{C}>

f_{CON} = <I_{A}{}^{G}> \ / \ <I_{A}{}^{A}>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = <I_{A}{}^{A}> \ / \ <I_{A}{}^{G}>

Para todas las variantes preferidas mencionadas de los procedimientos para el cálculo de la tasa de transformación, resulta válido el hecho de que para esto se hace referencia o bien a valores medios a través de varias de tales posiciones en una zona definida de secuencia, o por el contrario se hace referencia a valores individuales, con el fin de determinar o bien la tasa de transformación para una zona de una secuencia o la tasa de transformación de una citosina
individual.

Asimismo preferida es una variante del primer método, la cual está caracterizada porque con ayuda del factor de normalización determinado y de la tasa de transformación para cada citosina dentro de la zona investigada de una secuencia, que se encuentra en una posición de CpG, se calcula un grado de metilación f_{MET}, que toma en consideración tanto la eficiencia a veces restringida de la reacción con un bisulfito como también las intensidades de señales que en parte están fuertemente falseadas. Esto se consigue mediante la utilización de la siguiente fórmula:

f_{MET} = 1 - I_{T}{}^{CG} \ / \ (f_{CON}(f_{N}I_{C}{}^{CG} + I_{T}{}^{CG}))

En este caso, todas las intensidades de señales I se refieren a la citosina en una posición de CpG; I^{CG}. I_{T}^{CG} describe la intensidad de una señal de la timina junto a esta citosina, es decir la proporción de la citosina transformada. Este valor es aproximado por inclusión de la tasa de conversión f_{CON} en el valor real. I_{C}^{CG} describe la intensidad de una señal de citosina junto a esta citosina en una posición de CpG. I_{C}^{CG} describe tanto a las citosinas metiladas como también a las no metiladas, pero no a las citosinas no transformadas en una posición de CpG, y es aproximado por inclusión de un factor de normalización f_{N} en el valor real. Finalmente, f_{MET} describe exactamente la tasa de citosinas realmente metiladas, pudiendo adoptar f_{MET} unos valores situados entre 0 y 1.

Si la citosina en la posición de CpG está totalmente metilada (metilación de 100%), esto corresponde a una f_{MET} de 1. Este caso se presenta cuando no se obtiene ninguna señal de timina (por lo tanto I_{T}^{CG} = 0). Entonces se realiza
que:

f_{MET} = 1 - 0 \ / \ (f_{CON}(f_{N}I_{C}{}^{CG} + 0)) = 1

Si la citosina en la posición de CpG no está metilada (metilación de 0%), esto corresponde a una f_{MET} de 0. En el caso de una transformación efectuada al 100%, es decir de una tasa de transformación f_{CON} = 1, no se obtiene ninguna señal de citosina, y se realiza que: f_{N} I_{C}^{CG} = 0. De esta manera resulta que

f_{MET} = 1 - I_{T}{}^{CG} \ / \ (f_{CON}I_{T}{}^{CG}) = 1 - 1/f_{CON} = 0

pero si no ha tenido lugar ninguna conversión al 100%, se obtienen siempre también señales de citosina incluso cuando las citosinas no están metiladas.

En el caso de una posición de citosina metilada solamente en un 50% y de una transformación efectuada al 100%, las proporciones de la señal de citosina normalizada y de la señal de timina son de igual magnitud. Se realiza
que:

\quad: f_{MET} = 1 – I_{T}^{CG} / (f_{CON} (f_{N}I_{C}^{CG} + I_{T}^{CG}))

\quad: f_{MET} = 1 – I_{T}^{CG} / (f_{CON} (2 * I_{T}^{CG}))

\quad: f_{MET} = 1 – 1 / (f_{CON} * 2)

\quad: f_{MET} = 1 – 1 / 2

Siempre es válido que al hacerse referencia a la información de secuencias de la cadena complementaria inversa, pasan a utilizarse las mismas fórmulas, pero que todas las timinas deben ser reemplazadas por adeninas y todas las citosinas deben ser reemplazadas por guaninas, es decir por ejemplo:

f_{MET} = 1 - I_{A}{}^{CG} \ / \ (f_{CON}(f_{N}I_{G}{}^{CG} + I_{A}{}^{CG}))

Además, es preferida una variante del segundo método, que está caracterizada porque en el caso de basarse solamente en una sucesión de bases, a saber la secuencia de timina, del ADN tratado con un bisulfito, se calcula un grado de metilación f_{MET} de acuerdo con la siguiente fórmula:

f_{MET} = 1 - I_{T}{}^{CG}/f_{CON} <I_{T}{}^{T}>

Para esto se recurre a la intensidad media de señales de timina junto a timinas <I_{T}^{T}>. Respectivamente, al hacerse referencia a la información de secuencias de la cadena complementaria inversa, es válida esta fórmula

f_{MET} = 1 - I_{A}{}^{CG} / f_{CON} <I_{A}{}^{A}>

recurriéndose a la intensidad media de señales de adenina junto a adeninas <I_{A}^{A}>.

En ambos casos es válido que f_{MET} puede adoptar unos valores entre 0 y 1, y un grado de metilación de 1 corresponde a una metilación al 100%.

En el caso de la variante del método, que se utiliza en el caso de presentarse solamente una sucesión de bases, a saber la secuencia de timina, o respectivamente, al hacerse referencia a la cadena complementaria inversa, la secuencia de adenina, se establece la dificultad de poder asignar inequívocamente las intensidades de señales. Una secuencia que, a lo largo de una zona más larga no tiene ninguna timina y eventualmente sólo tiene señales mínimas, las denominadas señales erróneas, su secuencia genómica conocida de nucleótidos puede asignarse sólo con dificultades. Todavía más difícil es esto, cuando se considera que la presente secuencia de una sola base se tiene que asignar a una secuencia de nucleótidos tratados con un bisulfito, que es solamente condicionadamente conocida.

Por lo tanto, en lo que se refiere a este objeto adicional del invento, se prefiere especialmente una variante del método, en la que primeramente, con métodos estadísticos y teóricos de señales, se determina la distancia entre dos picos, es decir entre dos posiciones potenciales de bases, y después de esto, con ayuda de procedimientos probabilísticos se lleva a cabo la asignación a las posiciones conocidas, que se derivan de la secuencia genómica.

Los siguientes Ejemplos explican el invento.

Ejemplo 1

Investigación del grado de metilación del gen p16 mediante un análisis de secuencias

El siguiente Ejemplo se refiere a un fragmento del gen p16, en el que se investigan determinadas posiciones de CpG en lo que se refiere a su grado de metilación. En este ejemplo, el ADN se obtuvo del comercio y se aisló previamente por el ofertante a partir de una sangre humana.

En la primera etapa, una secuencia genómica se trata mediando utilización de un bisulfito (hidrógeno-sulfito, disulfito) de tal manera que todas las citosinas no metiladas en la posición 5 de la base se modifican de tal manera que resulta una base diferente en lo que se refiere al comportamiento de apareamiento de bases mientras que las citosinas metiladas en posición 5 permanecen inalteradas. Si para la reacción se utiliza un bisulfito, entonces en las bases de citosina no metiladas tiene lugar una reacción por adición. Además, deben estar presentes un reactivo o disolvente desnaturalizante así como un capador de radicales. Una subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas conduce entonces a la transformación de las citosinas no metiladas en uracilo. Este ADN transformado sirve para diferenciar las citosinas metiladas con respecto de las citosinas no metiladas y detectar a éstas con ello. En la segunda etapa del procedimiento, la muestra tratada de ADN se diluye con agua o con una solución acuosa. De manera preferida, se lleva a cabo a continuación una desulfonación del ADN. En una etapa adicional, la muestra de ADN se amplifica en una reacción en cadena de una polimerasa, preferiblemente con una polimerasa de ADN estable frente al calor. En el presente caso, se investigan citosinas del gen p16. Para esto, con los oligonucleótidos cebadores específicos P1 (véase Seq ID 1) y P2 (véase Seq ID 2) se amplifica un fragmento definido con una longitud de 256 pb (pares de bases). El presente producto de la PCR es una mezcla de ADN procedentes de materiales amplificados, los cuales tienen o bien citosinas o timinas junto a las posiciones de CpG que se han de investigar. Esta mezcla de materiales amplificados sirve como molde para una subsiguiente reacción de secuenciación cíclica. Para la reacción de secuenciación se utilizan los mismos oligonucleótidos cebadores que para la reacción en cadena de una polimerasa. El resultado de la secuenciación está reproducido en la Figura 1 en forma de electroferogramas.

En la Figura 1 se representan en la parte superior (par A de electroferogramas) dos electroferogramas que reproducen una zona parcial de la secuencia del gen p16, en el estado de metilación que se presentaba al realizar la adquisición en el comercio de la mezcla de ADN. En la parte inferior de la Figura (par B de electroferogramas) se representan dos electroferogramas que representan a la misma zona de la secuencia.

La diferencia con la parte superior de la Figura consiste en que el ADN, que se presenta como fundamento de esta secuenciación, había sido metilado en sentido creciente en una etapa anterior. Los grados de metilación de las citosinas alcanzan según esto casi un 100%.

Los electroferogramas en cada caso superiores de los pares A y B de electroferogramas describen las secuencias, como se generan por el programa lógico (software) del aparato automático de secuenciación. Ellos muestran por lo tanto un electroferograma obtenido de una manera habitual. Los electroferogramas en cada caso inferiores de los pares A y B de electroferogramas describen las secuencias, como se representan después de la aplicación del invento que aquí se describe. La aparición de señales ajenas, es decir el ruido de fondo, se reduce de una manera manifiesta.

Por debajo de los electroferogramas se indican dos secuencias como una sucesión de letras, que indican las respectivas bases. La sucesión de bases en cada caso superior se refiere al electroferograma inferior, es decir optimizado, y la sucesión de bases en cada caso inferior, por el contrario, muestra la secuencia teóricamente esperada, como es esperada en el caso de una secuencia genómica conocida después de un tratamiento con un bisulfito, y sirve para la comparación de los datos generados por el aparato automático de secuenciación.

A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina, T representa timina y t está situado junto a unas posiciones de bases, que tan sólo después de un tratamiento con un bisulfito muestran el comportamiento de hibridación de una timina, pero que anteriormente en la secuencia genómica eran sin embargo citosinas. (En la representación en colores, las bases se representan en cuatro diferentes colores: timina = T = rojo, citosina = C = azul, adenina = A = verde, guanina = G = negro).

Por debajo de la sucesión de bases se reproducen unos números. Éstos indican el respectivo grado porcentual de metilación de una citosina en una posición de CpG, como se calcula después de haber aplicado el método que aquí se ha descrito.

Ejemplo 2

Representación de electroferogramas después de una secuenciación con un bisulfito, con o sin utilización del procedimiento conforme al invento

En la Figura 2 se reproducen dos complejos electroferogramas uno sobre otro. Los números situados junto al borde inferior de la Figura describen la posición de una base dentro del material amplificado secuenciado y sirven como orientación. En la Figura 2, ambos electroferogramas se extienden desde la base 322 hasta la base 379. El electroferograma superior describe la sucesión de las cuatro diferentes bases (en cuatro diferentes colores: timina = T = rojo, citosina = C = azul, adenina = A = verde, guanina = G = negro) sin normalización ni consideración de la tasa de transformación, es decir sin aplicar el presente invento. El electroferograma situado debajo describe los datos, como se representan después de aplicación de una variante del invento que aquí se describe. Se puede reconocer con claridad que las señales de citosina en el electroferograma superior son todas ellas esencialmente mayores que en el electroferograma inferior, después de que se hubiera normalizado la intensidad de una señal de citosina. Asimismo, también el "ruido" se hace menor, por ejemplo bien reconocible en el intervalo de 373 a 379 pb. Los datos porcentuales situados por debajo de las citosinas en una posición de CpG indican el grado de metilación de la citosina después de un cálculo con ayuda del método que aquí se describe.

Claims

1. Procedimiento para la determinación del grado de metilación de una citosina que se ha de investigar, dentro de un dinucleótido CpG, que se encuentra dentro de una zona de secuencia del genoma, cuya secuencia es conocida, en el genoma de por lo menos una célula o de un organismo, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas:

a): tratamiento de una muestra de ADN con un bisulfito y subsiguiente amplificación de un fragmento seleccionado de este ADN tratado,

b): realización de un análisis de secuencias del material amplificado, en el cual el resultado se representa en forma de un electroferograma,

c): determinación de una tasa de transformación de citosina no metilada en uracilo, como consecuencia de un tratamiento con un bisulfito, caracterizado porque las intensidades de señales de las bases, que modifican su comportamiento de hibridación mediante un tratamiento con un bisulfito, se pone en relación con las intensidades de señales de las bases, que no se modifican mediante un tratamiento con un bisulfito, haciéndose referencia para esto a la secuencia del mismo sentido ya conocida y/o a su secuencia complementaria inversa;

d): cálculo del grado real de metilación de la citosina que se ha de investigar por determinación de la proporción de moléculas de ADN metiladas en una mezcla de moléculas de ADN metiladas y no metiladas, tomando en consideración la tasa de transformación determinada en la etapa c).

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en el análisis de secuencias del material amplificado se determina solamente la secuencia de timina del ADN, o en la cadena complementaria inversa se determina solamente la secuencia de adenina del ADN, y el resultado se representa en forma de un electroferograma.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la intensidad de señal I_{B} de una base B, pudiendo B ser o bien C, A, G o T y estableciendo por consiguiente el tipo de base, cuya intensidad se considera, como parte del área de la superficie por debajo del pico en el electroferograma, se describe mediante la siguiente fórmula, describiendo f(x) la evolución de la curva de la señal de intensidad a lo largo de una unidad x, que indica el tiempo, que después de una separación por cromatografía describe la distancia entre dos bases:

I_{B} = \int\limits^{W2}_{W1} f(x)dx

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la intensidad de señal I_{B} se describe por la siguiente fórmula:

I_{B} = \int\limits^{M2}_{M1} f(x)dx

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la intensidad de señal I_{B} se describe por la siguiente fórmula:

I_{B} = \int\limits^{H2}_{H1} f(x)dx

siendo H1 y H2 las coordenadas x de los sitios situados más próximos al valor x del máximo f^{max} en la evolución de la curva, en los que f(x) es una vez y media f^{max} y estando situadas H1 a izquierda y H2 a la derecha de este valor x.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la intensidad de señal I_{B} es descrita por la siguiente fórmula:

I_{B} = \int\limits^{D2}_{D1} f(x)dx

\newpage

siendo

D1 = x – (x – x_links)/2

y

D2 = x + (x_rechts – x)/2

realizándose que

: x_links es la coordenada x del máximo del pico a la izquierda de ésta y

: x_rechts es la coordenada x del máximo del pico a la derecha de ésta.

7. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la intensidad de señal I_{B} de una señal junto a una posición A se calcula de nuevo como área de la superficie por debajo de la curva de señal de acuerdo con la siguiente fórmula,

I_{B} = \int\limits^{X2}_{X1} f(x)dx

pudiéndose utilizar como valores límites X1 y X2 las coordenadas x de una combinación arbitraria de los valores W1, W2, H1, H2, M1, M2, D1 o D2 ya descritos, pero debiendo estar situadas X1 a la izquierda y X2 a la derecha del valor x que determina la posición A.

8. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el análisis de las secuencias se lleva a cabo de acuerdo con el método de ruptura de cadena.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) se lleva a cabo un análisis de las secuencias para por lo menos dos bases diferentes, y siguiendo a éste una etapa adicional, en la que se lleva a cabo una normalización de la intensidad media de señales de por lo menos un tipo de base (C, T, A o G) frente a la intensidad media de señales, que se obtiene para uno o varios de los restantes tipos de bases, determinándose el valor medio a lo largo de por lo menos dos posiciones de este tipo de base dentro de una zona definida arbitrariamente del material amplificado.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque para la determinación de la tasa de transformación mencionada en la etapa c) se utilizan intensidades de señales previamente normalizadas.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque para el cálculo del grado real de metilación de la citosina que se ha de investigar se utilizan tanto las intensidades normalizadas de señales como también la tasa de transformación obtenida mediando consideración de las intensidades normalizadas de señales.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la intensidad de señal de las señales de citosina se normaliza frente a la intensidad de señal de las señales de timina, o respectivamente, al hacerse referencia a las informaciones de secuencias de la cadena complementaria inversa, la intensidad de señal de las señales de guanina se normaliza frente a la intensidad de señal de las señales de adenina.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el factor para la normalización f_{N} se calcula a partir de

f_{N} = <I_{C}{}^{CG}> \ / \ (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{CG}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{CG}>) \ / \ <I_{C}{}^{CG}>

f_{N} = <I_{G}{}^{CG}> \ / \ (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{CG}>)

\newpage

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{CG}>) \ / \ <I_{G}{}^{CG}>

siendo <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina (I_{T}) y siendo <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina (I_{A}) junto a unas posiciones, que también antes del tratamiento con un bisulfito eran de timina y respectivamente de adenina;

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el factor para la normalización f_{N} se calcula a partir de

f_{N} = <I_{C}{}^{C}> \ / \ (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{C}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{T}{}^{T}> - <I_{T}{}^{C}>) \ / \ <I_{C}{}^{C}>

f_{N} = <I_{G}{}^{G}> \ / \ (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{G}>)

o a partir de su valor inverso

f_{N}{}^{-1} = (<I_{A}{}^{A}> - <I_{A}{}^{G}>) \ / \ <I_{G}{}^{G}>

reproduciendo <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina (I_{T}) y <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina (I_{A}) junto a posiciones, que también antes del tratamiento con un bisulfito eran de timina y respectivamente de adenina;

reproduciendo <I_{T}^{C}> y <I_{C}^{C}> las intensidades medias de señales de timina y citosina junto a citosinas y <I_{A}^{G}> y <I_{G}^{G}> las intensidades medias de señales de adenina y guanina junto a guaninas, que no están situadas junto a posiciones de CpG, y siendo formado el valor medio en cada caso a lo largo de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el factor para la normalización f_{N} se calcula a partir de

f_{N} = <I_{T}{}^{A, G}> \ / \ <I_{C}{}^{A, G}>

o a partir de su valor inverso,

f_{N}{}^{-1} = <I_{C}{}^{A, G}> \ / \ <I_{T}{}^{A, G}>

f_{N} = <I_{A}{}^{T, C}> \ / \ <I_{G}{}^{T, C}>

o a partir de su valor inverso,

f_{N}{}^{-1} = <I_{G}{}^{T, C}> \ / \ <I_{A}{}^{T, C}>

\newpage

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la tasa de transformación f_{CON} se calcula a partir de

f_{CON} = I_{T}{}^{C} \ / \ (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C})

y respectivamente

f_{CON} = <I_{T}{}^{C} \ / \ (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C})>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = (f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C}) \ / \ I_{T}{}^{C}

y respectivamente

f_{CON}{}^{-1} = <(f_{N}I_{C}{}^{C} + I_{T}{}^{C}) \ / \ I_{T}{}^{C}>

f_{CON} = I_{A}{}^{G} \ / \ (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G})

y respectivamente

f_{CON} = <I_{A}{}^{G} \ / \ (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G})>

o a partir de su valor inverso

f_{CON}{}^{-1} = (f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G}) \ / \ I_{A}{}^{G}

y respectivamente

f_{CON}{}^{-1} = <(f_{N}I_{G}{}^{G} + I_{A}{}^{G}) \ / \ I_{A}{}^{G}>

realizándose que dependiendo de qué normalización se utilice, f_{N} es el factor de normalización de acuerdo con la reivindicación 13, 14 ó 15;

reproduciendo I_{T}^{C} la intensidad de una señal de timina y I_{C}^{C} la intensidad de una señal de citosina de una citosina, que no se encuentra en una posición de CpG, y reproduciendo respectivamente I_{A}^{G} la intensidad de una señal de adenina e I_{G}^{G} la intensidad de una señal de guanina de una guanina, que no se encuentra en una posición de CpG, después de un tratamiento con un bisulfito, y o bien siendo formado el valor medio a través de los correspondientes cocientes de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia, o tomándose en consideración solamente una posición de citosina y respectivamente una posición de guanina.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tasa de transformación f_{CON} se calcula a partir de

f_{CON} = <I_{T}{}^{C}> \ / \ <I_{T}{}^{T}>

o a partir de su valor inverso,

f_{CON}{}^{-1} = <I_{T}{}^{T}> \ / \ <I_{T}{}^{C}>

\newpage

f_{CON} = <I_{A}{}^{G}> \ / \ <I_{A}{}^{A}>

o a partir de su valor inverso,

f_{CON}{}^{-1} = <I_{A}{}^{A}> \ / \ <I_{A}{}^{G}>

reproduciendo <I_{T}^{C}> la intensidad media de señales de timina de una citosina, que no se encuentra en una posición de CpG, y reproduciendo <I_{A}^{G}> la intensidad media de señales de adenina de una guanina, que no se encuentra en una posición de CpG después de un tratamiento con un bisulfito, y reproduciendo <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina junto a una posición de timina y <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina junto a una posición de adenina, y siendo formado el valor medio a lo largo de todas las posiciones consideradas dentro de una zona definida arbitrariamente de una secuencia.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, según una de las reivindicaciones 13 a 15 y según una de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que el grado de metilación f_{MET} se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula

f_{MET} = 1 - I_{T}{}^{CG} / (f_{CON}(f_{N}I_{C}{}^{CG} + I_{T}{}^{CG}))

f_{MET} = 1 - I_{A}{}^{CG} / (f_{CON}(f_{N}I_{G}{}^{CG} + I_{A}{}^{CG}))

reproduciendo I_{T}^{CG} e I_{C}^{CG} la intensidad de las señales de timina y citosina de la citosina investigada en una posición de CpG, y reproduciendo I_{A}^{CG} e I_{G}^{CG} respectivamente la intensidad de una señal de adenina y guanina de la guanina investigada en una posición de CpG; correspondiendo un grado de metilación de 1 a una metilación del 100%, realizándose, para el cálculo de un grado de metilación f_{MET}, que los componentes de la tasa de transformación f_{CON} y del factor de normalización f_{N}, que se utilizan para esto, se refieren en cada caso a la misma cadena que la del grado de metilación determinado.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, según una de las reivindicaciones 13 a 15 y según una de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que el grado de metilación f_{MET} se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula

f_{MET} = 1 - I_{T}{}^{CG} / f_{CON}<I_{T}{}^{T}>

f_{MET} = 1 - I_{A}{}^{CG} / f_{CON}<I_{A}{}^{A}>

reproduciendo I_{T}^{CG} la intensidad de una señal de timina de una citosina en una posición de CpG y <I_{T}^{T}> la intensidad media de señales de timina junto a posiciones de timina; y reproduciendo I_{A}^{CG} respectivamente la intensidad de una señal de adenina de una guanina en una posición de CpG, y reproduciendo <I_{A}^{A}> la intensidad media de señales de adenina junto a posiciones de adenina; correspondiendo un grado de metilación de 1 a una metilación del 100%, realizándose, para el cálculo de un grado de metilación f_{MET}, que los componentes de la tasa de transformación f_{CON} y del factor de normalización f_{N}, que se utilizan para esto, se refieren en cada caso a la misma cadena que la del grado de metilación determinado.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la orientación unas junto a otras de una sucesión de bases solamente de un tipo de bases, se efectúa junto a una secuencia de nucleótidos que corresponde a esta secuencia en un ADN no transformado, solamente conocida en parte y que contiene por lo menos tres diferentes nucleótidos, después de haber determinado las distancias entre dos bases individuales arbitrarias tomando ayuda de procedimientos estadísticos y teóricos de señales, con ayuda de procedimientos probabilísticos.