ES2272673T3 - Detecciones para el diagnostico de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
Detecciones para el diagnostico de la enfermedad de alzheimer. Download PDFInfo
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Abstract
Un método in vitro para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en una persona que comprende la identificación de la presencia de una anomalía en la regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S en las células no neuronales de una persona.
Description
Detecciones para el diagnóstico de la enfermedad
de Alzheimer.
La presente invención se refiere a detecciones
para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, y en particular
a las pruebas de diagnóstico basadas en la detección por la
presencia de cambios celulares que se producen al principio en la
patología de la enfermedad de Alzheimer.
A medida que aumentan las expectativas de vida
la enfermedad de Alzheimer (AD) se está convirtiendo en un problema
sanitario principal en el mundo occidental. Ha habido intensa
investigación orientada a identificar una curación fiable o medidas
preventivas para la enfermedad, hasta el momento sin éxito.
Uno de los problemas mayores en el diseño y
experimentación de cualquier agente terapéutico es la falta de
criterios de diagnóstico fiables que puedan identificar a los que
padecen AD lo suficientemente al principio para cualquier
intervención significativa. Sin embargo, las herramientas de
diagnóstico clínico disponibles actualmente no permiten un
diagnóstico preciso y fiable de la enfermedad de Alzheimer en otros
pacientes más que los gravemente enfermos. Además no permite la
identificación de pacientes con la enfermedad de Alzheimer
preclínica que pudieran beneficiarse de la intervención
preventiva.
Los criterios de diagnóstico clínico utilizados
más frecuentemente son los criterios NINCDS/ADRDA (McKhann, G.
et al., (1984) Neurology 34: 939-944),
originalmente diseñados a título de investigación. Estos criterios
son muy sensibles pero presentan una baja especificidad. Esto es
debido al hecho de que el valor previsible positivo de un
diagnóstico de "probable" o "posible" de la enfermedad de
Alzheimer es muy elevado, pero el valor previsible negativo es muy
bajo (13). En otras palabras, si un paciente cumplimenta los
requisitos de los criterios NINCDS/ADRDA para la enfermedad de
Alzheimer es muy probable que el paciente realmente no padezca la
enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, una proporción de los
pacientes que no cumplimentan estos criterios (p. ej. se consideran
referencias) se encuentra que padecen la enfermedad de Alzheimer en
un examen post mortem (13).
Como consecuencia de su baja especificidad, los
criterios NINCDS/ADRDA no son ideales para fines de diagnóstico
clínico. Además no son adecuados como criterios de diagnóstico para
pruebas clínicas con vistas a terapias preventivas o curativas que
puedan tener su mejor probabilidad de ser eficaces si se utilizan
antes de desarrollar una demencia significativa. Así continúa
existiendo necesidad de una prueba de diagnóstico fiable para la
enfermedad de Alzheimer, y en particular para una prueba que pueda
utilizarse en la detección precoz de personas con la enfermedad de
Alzheimer preclínica que puedan beneficiarse de la intervención
preventiva.
En los últimos años se está aceptando más
ampliamente que la base patógena de la enfermedad de Alzheimer es
la reentrada aberrante de diferentes poblaciones neuronales en el
ciclo de la división celular (14). En el ciclo celular rápido de
individuos jóvenes sanos la interrupción y rediferenciación puede
seguir a esta reentrada en el ciclo celular. En cambio, en
individuos con la enfermedad de Alzheimer el mecanismo de regulación
parece fracasar y las neuronas evolucionan en las últimas etapas
del ciclo celular conduciendo a la acumulación de una patología
relacionada con AD y/o la muerte neuronal (14).
Los estudios de los presentes inventores y de
otros indican que se produce anomalía de la regulación del ciclo
celular en la enfermedad de Alzheimer en el punto de control de la
transición G1/S (3). Los estudios previos sobre fibroblastos y
linfocitos de los pacientes con enfermedad de Alzheimer indican que
la regulación del ciclo de división celular puede interrumpirse en
otras células aparte de las neuronas en esta enfermedad (8, 9 y
17). Es sabido también que los pacientes de la enfermedad de
Alzheimer son más propensos a algunas formas de cáncer (4) y que
los pacientes con síndrome de Down, que desarrollan AD en la vida
adulta temprana, son más propensos a la leucemia que la población
general (7, 10). Es plausible sin embargo suponer que la anomalía
de la regulación del ciclo celular en las neuronas, incluso en las
etapas preliminares (preclínicas) de AD, puede reflejarse por la
malfunción de la regulación del ciclo celular similar en
linfocitos.
Los presentes inventores han demostrado ahora
que la sensibilidad in vitro de los linfocitos al tratamiento
con inhibidor G1 es significativamente menos eficaz en pacientes
con enfermedad de Alzheimer que en los pacientes de referencia.
Además, en las personas que presentan síntomas clínicos de
enfermedad de Alzheimer incipiente la respuesta a los linfocitos es
similar que la observada en los pacientes con enfermedad de
Alzheimer. Estos descubrimientos representan pruebas directas para
apoyar la hipótesis de que la anomalía de control de transición de
G1/S no se limita a las neuronas en los pacientes con la enfermedad
de Alzheimer, sino que se produce también en las células
periféricas, tales como linfocitos.
La observación de que la anomalía de la
regulación en la transición G1/S se produce también en las células
periféricas proporciona las bases de nuevas pruebas clínicas, útiles
en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, que se basan en
producir la activación del punto de control de la transición de G1/S
en células no neuronales, tales como los cultivos de linfocitos.
Como la anomalía de la regulación del ciclo celular en las neuronas
parece ser un episodio muy precoz en la patogénesis de la enfermedad
de Alzheimer, se prevé que dichas pruebas serán de utilidad para la
identificación de personas en las etapas preclínicas de la
enfermedad de Alzheimer que no cumplimentan los requisitos de los
criterios NINCDS/ADRDA para la demencia, pero se beneficiarían de
la intervención precoz con medidas preventivas para la enfermedad de
Alzheimer.
Según un primer aspecto de la invención se
proporciona un método para el diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer en un paciente humano que comprende la identificación de
la presencia de una anomalía en la regulación del ciclo celular en
la fase de transición G1/S en las células no neuronales de una
persona.
El método de la invención se realiza más
preferentemente in vitro o en células no neuronales aisladas
de la persona en el que se ha de ensayar. Las células no neuronales
pueden ser cualquier tipo de célula no neuronal que presente la
misma anomalía de la regulación del ciclo celular en la fase de
transición de G1/S que está presente en las neuronas en la
enfermedad de Alzheimer. En la forma de realización más preferida el
método se realiza en linfocitos aislados de la persona y cultivados
in vitro. Existen obvias ventajas prácticas en ser capaz de
demostrar la presencia de la anomalía de la regulación del ciclo
celular en un tipo de célula no neuronal. La utilización de
linfocitos es especialmente conveniente, ya que se aíslan fácilmente
de la muestra de sangre y pueden cultivarse in vitro. Otra
opción preferida es la utilización de fibroblastos, particularmente
fibroblastos de la piel que pueden obtenerse de forma conveniente a
partir de una biopsia de piel.
Cuando se utiliza el método de la invención para
diagnóstico, la presencia de una anomalía en la regulación del
ciclo celular en la fase de transición G1/S en un tipo de célula no
neuronal se considera una indicación de que la persona presenta la
enfermedad de Alzheimer. De manera típica, una reducción en la
eficacia del control del punto de control en la transición G1/S se
considera una indicación de que la persona presenta la enfermedad
de Alzheimer.
La disponibilidad de una prueba fiable para una
anomalía que se basa en la patología de la enfermedad de Alzheimer
mejorará significativamente la capacidad de diagnosticar la
enfermedad, y en particular permitirá el diagnóstico precoz. Los
criterios de diagnóstico operativos disponibles actualmente para la
enfermedad de Alzheimer solamente permiten el diagnóstico de AD
posible o probable muy tardío, cuando la demencia ya está presente.
Un diagnóstico definitivo de la enfermedad de Alzheimer puede
realizarse solamente tras un examen post mortem. Es evidente
a partir de la investigación de los presentes inventores que una
anomalía en el control del ciclo celular es detectable en las
células periféricas (no neuronales), tales como los linfocitos,
mucho antes de que aparezcan los síntomas clínicos de la demencia
totalmente desarrollados. Por consiguiente, el método de la
invención proporciona una herramienta para el diagnóstico precoz de
la enfermedad de Alzheimer, especialmente la detección de
individuos que están en las etapas preclínicas de la enfermedad, y
para la identificación de los individuos que no han desarrollado
todavía la enfermedad de Alzheimer como tal pero están "en
situación de riesgo" de hacerlo debido a la presencia de la
anomalía de la regulación del ciclo celular. Esto abre la
posibilidad de la intervención precoz con medidas preventivas, que
incluyen, entre otras, cambios en el estilo de vida y regímenes de
vitaminas y HRT para las mujeres
postmenopáusicas.
postmenopáusicas.
La disponibilidad de herramientas para
diagnóstico capaces de detectar cambios precoces en individuos que
no han desarrollado todavía la enfermedad de Alzheimer como tal
facilitarán también el desarrollo y experimentación de terapias
propuestas para interrumpir la evolución de la enfermedad en un
punto antes del desarrollo de una patología cerebral significativa.
Las pruebas para diagnóstico pueden también aplicarse en el
desarrollo de modelos animales de la enfermedad de Alzheimer
precoz, por ejemplo en la identificación de un modelo de ratón que
presente una anomalía análoga en la regulación del ciclo celular a
la que presenta en la enfermedad de Alzheimer.
La capacidad para identificar individuos que
tienen una anomalía de la regulación del ciclo celular en la
transición G1/S puede aplicarse a la selección de individuos que
deben incluirse en las pruebas clínicas. Las pruebas clínicas son
más probablemente para producir resultados significativos si los
individuos incluidos en la prueba se seleccionan aquellos que sea
más probable que se beneficien del tratamiento a prueba.
La identificación de la anomalía de la
regulación G1/S en los linfocitos extraídos de un paciente que
padece la enfermedad de Alzheimer incipiente o completamente
desarrollada puede indicar la presencia de problemas inmunitarios
en el paciente, o una probabilidad de que el paciente desarrolle
problemas inmunitarios a medida que evoluciona la enfermedad. La
disponibilidad de dicha información ayudará al médico a decidir si
intervenir con la terapia ayuda a aliviar/prevenir los problemas
inmunitarios que complican la enfermedad de Alzheimer.
El método de la invención es especialmente
preferido para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer
esporádica. Sin embargo, sería también útil en el diagnóstico de
formas de la enfermedad de Alzheimer familiar que presenta una
anomalía de la regulación del ciclo celular equivalente.
Generalmente esto no incluirá la enfermedad de Alzheimer familiar
asociada a mutaciones de presenilina-1 o
presenilina-2.
Existen varias maneras en las que para
identificar la presencia de una anomalía de la regulación del ciclo
celular en la fase de transición G1/S en las células no neuronales
según la invención. En una realización la identificación de la
presencia de la anomalía de la regulación del ciclo celular puede
llevarse a cabo en primer lugar induciendo a las células a que se
dividan, produciendo a continuación la interrupción del ciclo
celular mediante la adición de una sustancia inhibidora de la
división celular y ensayando la sensibilidad de los mecanismos
reguladores del ciclo celular G1/S de las células a la adición de la
sustancia inhibidora de la división celular.
Más preferentemente, la sustancia inhibidora de
la división celular será un inhibidor de G1 específico, por ejemplo
rapamicina. La división celular puede ser inducida mediante la
adición de un estímulo mitógeno, por ejemplo uno o más factores de
crecimiento. Si la prueba se realiza utilizando linfocitos entonces
puede usarse fitohemoaglutinina para inducir la división
celular.
En una realización adicional relacionada el
tratamiento con la sustancia inhibidora de la división celular
puede sustituirse por el tratamiento con un estímulo que produzca la
interrupción del ciclo celular en G1, por ejemplo un estímulo
medioambiental. La identificación de la presencia de la anomalía de
la regulación de G1/S se lleva a cabo por consiguiente: induciendo
a las células a que se dividan, exponiendo las células a un
estímulo que induzca la interrupción del ciclo celular en G1 y
ensayando la sensibilidad de los mecanismos reguladores del ciclo
celular de G1/S de las células a la adición del estímulo que produce
la interrupción del ciclo celular.
Los estímulos adecuados de la interrupción del
ciclo celular incluyen, entre otros, la radiación ionizante,
hipoxia, radiación ultravioleta, etc. En una realización preferida,
la interrupción del ciclo celular puede inducirse mediante
tratamiento de las células con H_{2}O_{2} para producir agresión
oxidativa. Como antes, la división celular puede inducirse mediante
la adición de un estímulo mitógeno, por ejemplo uno o más factores
de crecimiento. Puede utilizarse fitohemoaglutinina para inducir la
división celular en los linfocitos cultivados.
El fundamento subyacente de ambos métodos es en
primer lugar estimular a las células para que se dividan, después
intentar interrumpir el ciclo celular en la etapa G1 utilizando bien
un inhibidor de división celular u otro estímulo que produzca la
interrupción del ciclo celular y luego evaluar el efecto de dicho
tratamiento sobre el sistema regulador del ciclo celular. El efecto
sobre la regulación del ciclo celular puede evaluarse mediante una
variedad de medios diferentes, como se expone a continuación. El
tratamiento con un inhibidor de la división celular u otro estímulo
que induzca la interrupción del ciclo celular puede ser denominado
en esta memoria "tratamiento inhibidor del ciclo celular" o
"tratamiento inhibidor". Si una anomalía de la regulación del
ciclo celular en la transición G1/S está presente entonces éste
afectará la sensibilidad de las células para intentar interrumpir
el ciclo celular. En general, la presencia de una anomalía de la
regulación del ciclo celular en G1/S produce una sensibilidad
reducida al tratamiento con un inhibidor de la división celular u
otro estímulo que induce la interrupción del ciclo celular en G1, es
decir, el tratamiento inhibidor es menos eficaz para interrumpir el
ciclo celular en el punto de control de G1/S en las células con
dicha anomalía.
Varios métodos pueden realizarse antes y después
de la adición del estímulo mitógeno y antes y después de intentar
la interrupción del ciclo celular para determinar la sensibilidad de
las células al tratamiento inhibidor del ciclo celular. Una lista
no exhaustiva de métodos preferidos que pueden utilizarse según la
invención se proporciona a continuación, otros métodos adecuados
serán conocidos por los expertos en la materia:
(1) Ensayo de proliferación realizado para
evaluar si se ha producido la interrupción del ciclo celular y en
qué medida como resultado del tratamiento inhibidor. El ensayo de
proliferación puede realizarse según cualquiera de los protocolos
habituales conocidos en la materia. Un ejemplo especialmente
adecuado es el ensayo de supervivencia de MTT (comercialmente
disponible en Chemicon International Ltd., véase Mosmann, T. en
J. Immunol. Methods, 1983, vol.: 65,
55-63).
En una detección típica los ensayos de
proliferación se realizan en ambas células tratadas con un inhibidor
de división celular u otro estímulo que induzca la interrupción del
ciclo celular y las células de referencia no tratadas de la misma
persona. Como el tratamiento inhibidor será efectivo únicamente en
presencia de un sistema regulador G1/S intacto, la diferencia en el
grado de proliferación entre las células tratadas y no tratadas
será significativamente más pequeña en los pacientes con enfermedad
de Alzheimer que en los individuos de referencia de la misma edad.
En general, un cambio pequeño o ninguno en la actividad proliferante
de las células de la persona en presencia de tratamiento inhibidor,
indica una sensibilidad reducida a la inhibición del ciclo celular
en la fase G1, y por consiguiente la presencia de una anomalía de la
regulación en la transición G1/S. La presencia de dicha anomalía de
la regulación se considera a su vez como una indicación de que la
persona tiene la enfermedad de Alzheimer.
(2) Cálculo de la prolongación relativa de la
fase G1 del ciclo celular en células de la persona como resultado
de la exposición a un inhibidor de división celular o al estímulo
que induce la interrupción del ciclo celular. La prolongación
relativa de la fase G1 como resultado de la exposición al inhibidor
de la división celular o al estímulo que produce la interrupción
del ciclo celular se calcula utilizando la fórmula
RL=100f-100 (expresada en tanto por ciento).
"f" es la relación del tiempo en G1 para las células (células
no neuronales de una persona a prueba) expuestas al tratamiento
inhibidor con el inhibidor de la división celular o el estímulo que
induce la interrupción del ciclo celular (TG1_{tr}) frente al
tiempo en G1 para las células de referencia no tratadas (es decir,
también células no neuronales de la persona a prueba) no expuestas
al tratamiento inhibidor (TG1_{c}). f puede calcularse según la
relación
siguiente:
siguiente:
(5)f=TG1_{tr}/TG1_{c}=[ln2-ln(2-G1_{tr})][ln(2-G1_{c})]/[ln(2-G1_{tr})][ln2-ln(2-G1_{c})]
Pueden emplearse varias técnicas para obtener
los valores de TG1_{tr} y TG1_{c}. En una realización preferida
TG1_{tr} y TG1_{c} pueden obtenerse determinando la proporción
de células en varias fases del ciclo celular para ambas células
tratadas (células no neuronales de la persona a prueba tratada con
la sustancia inhibidora de la división celular o el estímulo que
induce la interrupción del ciclo celular) y células de referencia
no tratadas (células no neuronales de la misma persona no expuestas
a la sustancia inhibidora de la división celular o al estímulo que
induce la interrupción del ciclo celular). La proporción de células
en varias fases del ciclo celular puede determinarse fácilmente
mediante la incorporación de un análogo nucleotídico marcado,
preferiblemente bromodesoxiuridina (BrdU), seguido de clasificación
celular activada por fluorescencia (análisis FACS), o equivalente,
tal como se describe en los ejemplos adjuntos.
La presencia de una anomalía de la regulación
del ciclo celular en la fase de transición G1/S se indica mediante
una prolongación relativa reducida de la fase G1 en presencia de la
sustancia inhibidora de la división celular o del estímulo en
células de la persona a prueba, en comparación con las células de
referencia que no presentan anomalía de la regulación del ciclo
celular en la fase de transición G1/S (véase más arriba (1) para la
definición con más detalle de las células de referencia adecuadas).
Las células de referencia que no presentan anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S no deben
confundirse con las células "de referencia no tratadas"
utilizadas para el cálculo de RL, que son células de la persona a
prueba que no han sido expuestas al tratamiento inhibidor.
(3) Evaluación de la proteína reguladora del
ciclo celular o de la expresión de ARNm. La expresión de las
proteínas reguladoras del ciclo celular puede evaluarse utilizando
técnicas normalizadas bien conocidas en la materia tales como, por
ejemplo, inmunotransferencia, transferencia Western, ELISA o métodos
relacionados. La evaluación de la expresión de los ARNm
correspondientes que codifican las proteínas reguladoras del ciclo
celular puede realizarse también por medios de métodos normalizados
tales como, por ejemplo, técnicas de hibridación, análisis del
"chip del ADN" o métodos relacionados o técnicas basadas en la
ampliación tales como RT-PCR o ampliación basada en
la secuencia del ácido nucleico (NASBA). Los métodos adecuados para
la detección/cuantificación de los ARNm que pueden utilizarse de
acuerdo con la invención son bien conocidos por los expertos en la
materia. Algunos de estos métodos, por ejemplo
RT-PCR, se basan en la detección/cuantificación de
una copia de ADNc del ARNm apropiado.
La anomalía de la regulación del ciclo celular
presente en la enfermedad de Alzheimer puede producir cambios en el
modelo de expresión de las proteínas reguladoras del ciclo celular y
en sus ARNm correspondientes. La identificación de cambios en la
expresión de determinadas proteínas reguladoras del ciclo celular
y/o en los correspondientes ARNm puede utilizarse por consiguiente
en el diagnóstico para identificar la presencia de una anomalía de
la regulación del ciclo celular en G1/S. Además, la expresión de las
proteínas reguladoras del ciclo celular puede utilizarse como un
marcador de la evolución a lo largo del ciclo celular. Por
consiguiente, la sensibilidad de las células para el tratamiento
inhibidor puede evaluarse observando la expresión de una o más
proteínas reguladoras del ciclo celular, para determinar el alcance
al que el tratamiento inhibidor da lugar a la interrupción del
ciclo celular en las células de la persona de la prueba. Las
proteínas reguladoras adecuadas del ciclo celular comprenden CDKN3,
pl5ink4B, p16ink4A, p19ink4D, p27kip1, p21cip1, p57kip2 y TP53. Las
secuencias de estas proteínas, y los genes que las codifican, están
disponibles al público. Una lista de los números de registro de
OMIM de estas proteínas se proporciona en los Ejemplos adjuntos. Los
anticuerpos útiles para la detección de cada una de esas proteínas
están disponibles en el mercado.
(4) Evaluación de la viabilidad celular y de la
muerte celular por cualquier método conocido en la materia. Cuando
una célula proliferante se interrumpe en la transición G1/S, puede
resultar uno de los dos posibles fenómenos "aguas abajo", bien
la diferenciación o la muerte celular programada. Estos fenómenos
aguas abajo pueden utilizarse como indicación de la presencia en la
población celular de una anomalía de la regulación en la transición
G1/S, ya que si la regulación de la transición G1/S es anómala
entonces los efectos aguas abajo de la interrupción del ciclo
celular en G1/S serán también anormales. Un grado menor de muerte
celular o un grado mayor de viabilidad celular en respuesta al
tratamiento inhibidor en las células de la persona de la prueba, en
comparación con las células de referencia, se considera una
indicación de que la persona padece la enfermedad de Alzheimer.
(5) Evaluación de la proteína relacionada con la
muerte celular (inductora o preventiva) o de la expresión del ARNm
utilizando técnicas normalizadas. En esta realización, la expresión
de las proteínas relacionadas con la muerte celular, o los ARNm
correspondientes, se utiliza como evaluación indirecta de los
efectos aguas abajo del tratamiento con un inhibidor de la división
celular u otros estímulos que inducen la interrupción del ciclo
celular en la transición G1/S. Las proteínas relacionadas con la
muerte celular adecuadas incluyen miembros de la familia
bcl-2 de proteínas, de las que existen muchas
conocidas en la materia.
(6) Evaluación de la expresión de las proteínas
del elemento de respuesta al daño del ADN o de los ARNm
correspondientes utilizando técnicas normalizadas. Este método
puede utilizarse cuando el estímulo utilizado para inducir la
interrupción del ciclo celular en G1/S es el daño al ADN, por
ejemplo en tratamiento con un agente químico que produce el daño al
ADN o la exposición a radiación UV. En circunstancias normales la
presencia del daño al ADN inducirá que la célula interrumpa la fase
de transición G1/S e intente reparar el ADN dañado mediante la
activación de la serie de reacciones de respuesta al daño del ADN.
Las alteraciones en el modelo de expresión de las proteínas
implicadas en la respuesta normal al daño al ADN, o los ARNm
correspondientes, en respuesta a la presencia del ADN dañado pueden
utilizarse por consiguiente como una indicación de la presencia de
una anomalía de la regulación del ciclo celular en la fase de
transición G1/S. Los elementos de respuesta al daño al ADN
adecuados comprenden TP53, Gadd34, Gadd45A (126335), Gadd45B
(604948), Gadd45G (604949), Gadd153 (126337) y PCNA (176740). Una
lista de los números
\hbox{de registro de OMIM para estos
elementos de respuesta al daño al ADN se proporciona a
continuación.}
(7) Evaluación del contenido del ADN de las
células no neuronales, con o sin análisis del ciclo celular. En
esta realización, la medición del contenido de ADN de las células de
la persona de la prueba tratadas con un inhibidor de división
celular u otros estímulos que producen la interrupción del ciclo
celular proporciona una indicación indirecta de la presencia de una
anomalía de la regulación en la transición G1/S en dichas células.
El fundamento subyacente a este método es la diferencia en el
contenido de ADN entre las células en la fase G1 y las células en
la fase G2 que han pasado a través de la etapa de replicación del
ADN del ciclo celular. Cuando una población de células normales (es
decir, sin una anomalía de la regulación en G1/S) se trata para
inducir la interrupción del ciclo celular en G1 o en G1/S, la
mayoría de las células permanecerá en la fase G1. Sin embargo, si
las células presentan una anomalía de la regulación en G1/S, una
proporción de las células pasará a través del punto de control de
G1/S y experimentará la replicación del ADN. Así, un contenido de
ADN creciente en las células de una persona de la prueba, comparado
con las células de referencia que no presentan una anomalía de la
regulación en G1/S, después del tratamiento para inducir la
interrupción del ciclo celular en G1 se considera una indicación de
la presencia de una anomalía de la regulación en G1/S. La presencia
de dicha anomalía de la regulación se considera a su vez una
indicación de que la persona padece la enfermedad de Alzheimer.
La lista anterior de técnicas adecuadas para su
utilización en la experimentación de la sensibilidad de las células
no neuronales, especialmente los linfocitos cultivados, para el
tratamiento inhibidor con un inhibidor de división celular o el
estímulo que induce la interrupción del ciclo celular se pretende
que sea ilustrativa o más bien limitativa de la invención.
Más preferiblemente, el método de la invención
implicará la identificación de la presencia de al menos una
mutación o variante alélica en un gen regulador del ciclo celular
seleccionado del grupo consistente en CDKN3, p15ink4B, p16ink4A,
p19knk4D, p27kip1, p21cip1, p57kip2 y TP53.
El método de la invención no se limita a
identificar la presencia de alguna mutación específica o variante
genética, aunque la identificación de la presencia de
mutaciones/variantes específicas demuestra que está asociada a la
enfermedad de Alzheimer. La invención abarca la exploración del gen
regulador del ciclo celular, o una subzona del mismo, para la
presencia de mutaciones o variantes genéticas, incluyendo las
mutaciones/variantes anteriormente desconocidas. Para evitar dudas,
el término "gen" incluye las zonas reguladoras, en particular
la zona del activador. La presencia de una o más mutaciones o
variantes genéticas en un gen regulador del ciclo celular,
especialmente las mutaciones/variantes que producen un cambio en la
secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen o que
alteran la función de la proteína codificada o que alteran el nivel
de expresión de la proteína, se considera una indicación de que el
individuo padece la enfermedad de Alzheimer, basándose en que la
presencia de dicha mutación o variante es indicativa de una anomalía
de la regulación del ciclo celular.
Existen muchas técnicas conocidas en la materia
para la detección de la variación genética que pueden utilizarse,
según la invención, para explorar la presencia de variantes de
mutaciones/variantes alélicas en un gen regulador del ciclo celular
de una persona dada. Las técnicas adecuadas incluyen, por ejemplo,
el análisis del polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP),
el análisis heterodoble PCR-SSCP (HA), la
electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), el
secuenciado del ADN, la escisión por RNasa, la escisión química de
emparejamientos incorrectos (CCM), etc. (véase el estudio por
Schafer y Hawkins, Nature Biotechnology, vol.: 16, págs.
33-39, 1998).
El Ejemplo 2 adjunto describe la utilización de
PCR-SSCP para identificar las variantes polimórficas
en los genes p21cip y p57 e identificar de este modo una variante
polimórfica en el exón 2 del gen p21cip y dos variantes
polimórficas en el exón 2 del gen p57. Puede emplearse el mismo
método técnico para identificar variantes polimórficas en otros
genes con modificación apropiada, es decir, la selección de
cebadores de PCR específicos para el gen de
interés.
interés.
La identificación de la presencia de
mutaciones/variantes alélicas se realiza en una muestra de ADN
genómico aislada de la persona. El ADN genómico puede aislarse de
manera conveniente de una muestra de sangre completa utilizando
técnicas normalizadas bien conocidas en la materia. De manera
ventajosa, el procedimiento de exploración de la presencia de
mutaciones/variantes alélicas puede realizarse en el ADN genómico
preparado a partir de los linfocitos cultivados de la persona. En
el mismo cultivo de linfocitos puede analizarse
"funcionalmente" también la presencia de una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S, por
ejemplo determinando la sensibilidad al tratamiento inhibidor
utilizando un método según el primer aspecto de la invención.
Las asociaciones entre una variante polimórfica
dada y la sensibilidad a la enfermedad de Alzheimer pueden
confirmarse realizando estudios de asociación genética, por ejemplo
estudios de asociación basados en la familia o de
caso-referencia. La asociación de la enfermedad de
variantes polimórficas determinadas puede determinarse también
evaluando la relación entre el genotipo y la expresión de marcadores
de la evolución del ciclo celular en el cerebro. En los ejemplos
adjuntos, se evaluó la relación entre el genotipo y la expresión de
la ciclina B (un marcador de la evolución a través del ciclo hasta
la etapa G2) en los núcleos neuronales. Otros marcadores de la
evolución del ciclo celular podrían haberse utilizando con efecto
equivalente. En una realización específica, el método puede
conllevar el genotipado de una de las variantes polimórficas en los
genes p21 y p57 descritos en los ejemplos adjuntos. Estas
variantes, denominadas alelos A y B de p21E2, alelos A y B de p57E2A
y alelos A y B de P57E2B, pueden genotiparse basándose en los
análisis PCR-SSCP que utilizan las siguientes series
de cebadores en las condiciones especificadas en los ejemplos
adjuntos:
p21E2 A/B:
5'-CGGGATCCGGCGCCATGTCAGAACCGGC-3'
(SEQ. ID. nº: 1) y 5'-CCAGACAGGTCAGCC
CTTGG-3' (SEQ. ID. nº: 2)
CTTGG-3' (SEQ. ID. nº: 2)
P57E2A A/B: 5'-GGC CAT GTC CGA
CGC GTC-3' (SEQ. ID. nº: 3) y 5'-AGG
CGG CAG CGC CCC ACC TG-3' (SEQ. ID. nº: 4)
p57E2B A/B: 5'-ATT ACG ACT TCC
AGC AGG ACA TG-3' (SEQ. ID. nº: 5) y
5'-CTG GAG CCA GGA CCG GGA CTG-3'
(SEQ. ID. nº: 6)
En cada caso, los alelos A y B pueden
identificarse basándose en la movilidad electroforética diferencial
de los productos resultantes de la PCR en las condiciones definidas
en el Ejemplo 2, con referencia a la Figura 6. Sin embargo, no se
pretende limitar la invención a la utilización de
PCR-SSCP y pueden utilizarse otros métodos de
genotipado de las mismas variantes.
El alelo A de p21E2 y el alelo A de p57E2A están
asociados a la evolución creciente a través del punto de control de
G1/S, y por consiguiente con predisposición para la enfermedad de
Alzheimer.
Las identificaciones basadas en la detección de
la presencia de mutaciones o variantes alélicas en los genes que
codifican los genes reguladores del ciclo celular pueden implicar el
genotipado de dos o más variantes polimórficas, o pueden implicar
la identificación de la presencia de la variación genética en uno o
más genes reguladores del ciclo celular. Cualquier variación
genética que tenga un efecto desfavorable sobre la función de un
gen regulador del ciclo celular puede producir potencialmente una
derivación del punto de control de la transición G1/S y en
consecuencia la patología AD. La acumulación de la variación
genética en un gen regulador aislado, o a través de múltiples
genes, puede tener un efecto aditivo.
Las identificaciones basadas en la detección de
la presencia de mutaciones o variantes alélicas en los genes que
codifican los genes reguladores del ciclo celular pueden utilizarse
en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, posiblemente junto
con otras pruebas de diagnóstico, tal como la identificación de la
presencia de una anomalía de la regulación del ciclo celular.
Pueden utilizarse también para identificar individuos que tienen
una predisposición a la enfermedad de Alzheimer a causa de la
presencia de la(s) mutación o mutaciones o
variante(s) alélica(s) en un gen regulador del ciclo
celular.
El método de identificación de mutaciones o
variantes alélicas en un gen regulador del ciclo celular puede
utilizarse también para determinar cualquier base genética de la
enfermedad de Alzheimer en un paciente diagnosticado previamente de
la enfermedad de Alzheimer. En un tercer aspecto la invención
proporciona un método para la utilización en el diagnóstico de la
enfermedad de Alzheimer en una persona que comprende la
identificación de la presencia en el genoma de dicha persona de al
menos una mutación o variante alélica en un gen que codifica una
enzima para la reparación del ADN, en la que la presencia de una
mutación o variante alélica en dicho gen se considera una
indicación de la enfermedad de Alzheimer.
Los genes adecuados incluyen aquellos que
codifican las enzimas para la reparación del ADN Ku70, Ku80, Ku86,
NDHII, BLM, RECQL, RECQL4 y RECQL5. El término "gen" incluye
las zonas reguladoras, en particular la zona del activador.
De nuevo, el método de la invención no requiere
la identificación de la presencia de ninguna mutación o variante
genética determinada, si bien se contempla la identificación de la
presencia de determinados mutantes o variantes asociados a la
enfermedad de Alzheimer. El método puede implicar la exploración del
gen que codifica una enzima para la reparación del ADN o una
subzona de dicho gen, para la presencia de cualquier mutación o
variante genética, incluyendo las mutaciones/variantes previamente
desconocidas.
La presencia de una o más mutaciones o variantes
genéticas en el gen que codifica una enzima para la reparación del
ADN se considera una indicación de la enfermedad de Alzheimer,
porque las enzimas para la reparación del ADN actúan en la serie de
reacciones relacionadas con la regulación del ciclo celular. La
presencia de mutaciones o variantes alélicas en los genes que
codifican las enzimas de reparación del ADN es indicadora
indirectamente por consiguiente de una anomalía de la regulación
del ciclo celular.
La cantidad de mutaciones somáticas en el
cerebro en pacientes de AD se observa que está significativamente
asociada a la desregulación del ciclo celular y a la gravedad de la
patología de tipo AD (véanse los ejemplos adjuntos). Por
consiguiente, se sugiere que la anomalía para la reparación del ADN
puede conducir a la desregulación del punto de transición de G1/S
conduciendo por último al desarrollo de la enfermedad de
Alzheimer.
Las identificaciones basadas en la detección de
la presencia de mutaciones o variantes alélicas en genes que
codifican las enzimas de reparación del ADN pueden utilizarse para
el diagnóstico, particularmente en la identificación de individuos
con la enfermedad de Alzheimer preclínica. Identificaciones
similares pueden utilizarse también para identificar individuos que
están predispuestos a desarrollar la enfermedad de Alzheimer debido
a la presencia de mutación(es)/variante(s) en un gen
o genes que codifican las enzimas de reparación del ADN y también
para determinar cualquier base genética para el Alzheimer en un
paciente diagnosticado previamente de la enfermedad de
Alzheimer.
El procedimiento existente de identificación de
la presencia de mutaciones/variantes alélicas puede realizarse
utilizando cualquiera de las técnicas conocidas en la materia,
expuestas anteriormente.
En un aspecto adicional todavía, la invención
proporciona un método de identificación de compuestos con actividad
farmacológica potencial en el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer, método que comprende las etapas siguientes:
analizar la regulación de la transición G1/S en
células no neuronales, células que presentan una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S en
presencia y ausencia de un compuesto de ensayo, en el que se
identifica un compuesto de ensayo que produce la corrección de la
anomalía de la regulación en la transición G1/S en dichas células
que presenta actividad farmacológica potencial en el tratamiento de
la enfermedad de
Alzheimer.
Alzheimer.
El método de la invención puede realizarse
utilizando esencialmente cualquier célula no neuronal que presente
una anomalía de la regulación del ciclo celular análoga en la fase
de transición G1/S a la observada en las neuronas en la enfermedad
de Alzheimer. Las células adecuadas pueden incluir linfocitos
cultivados procedentes de un individuo, o de varios individuos, que
padecen la enfermedad de Alzheimer.
El "análisis" de la regulación de la
transición G1/S puede realizarse utilizando cualquiera de los
métodos descritos en relación con el primer aspecto de la
invención, adecuados para la identificación de la presencia de una
anomalía de la regulación de ciclo celular en G1/S. De manera
ventajosa, el método utilizado para el análisis de la regulación de
la fase de transición G1/S será el que pueda llevarse a cabo en
placas de microvaloración multi-pocillo, que
permita realizar la identificación del compuesto en formato medio a
grande. El método más preferido adecuado para su utilización en un
formato medio a grande es el ensayo de proliferación celular.
Las células que presentan una anomalía de la
regulación en la transición G1/S se exponen a los compuestos de
ensayo y el efecto del compuesto de ensayo sobre la regulación de la
transición G1/S se evalúa con relación a referencias adecuadas, p.
ej. células no expuestas a ningún compuesto de ensayo. En una
identificación típica, el compuesto de ensayo se ensayará en un
intervalo de diferentes concentraciones.
No existe ninguna limitación en los tipos de
compuestos experimentales que deben ensayarse en los métodos de
identificación de la invención. Los compuestos de ensayo pueden
incluir compuestos que presentan una actividad farmacológica o
biológica conocida, compuestos que no presentan dicha actividad
identificada y moléculas o bancos de moléculas completamente nuevos
o pueden generarse mediante química combinatoria. Los compuestos
que son ADN, ARN, APN, polipéptidos o proteínas no están
excluidos.
La metodología básica para la identificación del
compuesto puede adaptarse también para su utilización en la
evaluación de la eficacia de una forma de tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer, por ejemplo para probar el efecto de un
agente farmacológico determinado sobre la regulación del ciclo
celular.
En una variación útil, el método de la invención
puede utilizarse específicamente para determinar si un agente
farmacológico es probable que sea de utilidad en el tratamiento de
la enfermedad de Alzheimer en una persona determinada. En este caso
el ensayo se realiza utilizando células no neuronales de la persona
que presenta una anomalía de la regulación del ciclo celular en la
fase de transición G1/S, más preferentemente linfocitos cultivados.
En las células se determina la presencia de la anomalía en la
regulación en la fase de transición G1/S en la transición G1/S en
presencia y ausencia de agente farmacológico. Los agentes
farmacológicos que producen "corrección" de la anomalía de la
regulación en la transición G1/S son identificados probablemente
para que sirvan en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en
el individuo. "Corrección" significa un grado significativo de
restablecimiento de la regulación del ciclo celular normal. Ésta
puede evaluarse con relación a las células de referencia, por
ejemplo las células del mismo tipo extraídas de un individuo de
referencia con la misma edad que no padezca la enfermedad de
Alzheimer o cualquier prueba de una anomalía de la regulación en la
transición G1/S o cualquier anomalía genética/variación alélica que
puede esperarse que predisponga a la enfermedad de Alzheimer.
La invención se entenderá más con relación a los
siguientes ejemplos experimentales, junto con las Figuras adjuntas,
en las que:
La Figura 1 ilustra las lecturas del citómetro
de flujo para linfocitos cultivados de una persona de referencia,
persona preAD y paciente de AD. Los resultados se muestran tanto
para las células tratadas con rapamicina como para las células no
tratadas de referencia. G1 indica que las células están en la fase
G1 del ciclo celular.
La Figura 2 ilustra la prolongación relativa
(panel izquierdo) y relativa corregida por la edad (panel derecho)
de la fase G1 del ciclo celular bajo la influencia de rapamicina en
linfocitos cultivados procedentes de personas preAD, AD, ADM,
possAD, DNOS y de referencia.
La Figura 3 ilustra los efectos del tratamiento
con rapamicina de 24 horas sobre la supervivencia celular en
linfocitos cultivados procedentes de personas preAD, AD, possADM,
DNOS y de referencia. Los valores absolutos se presentan en el
panel izquierdo, los valores corregidos por la edad en el panel
derecho.
La Figura 4 ilustra los efectos del tratamiento
con rapamicina sobre la supervivencia celular en linfocitos
cultivados procedentes de personas preAD, AD, possADM, DNOS y de
referencia. Los valores absolutos se presentan en el panel
izquierdo, los valores corregidos por la edad en el panel
derecho.
La Figura 5 ilustra los efectos del tratamiento
con H_{2}O_{2} sobre la supervivencia celular en linfocitos
cultivados procedentes de personas preAD, AD, possADM, DNOS y de
referencia. Los valores absolutos se presentan en el panel
izquierdo, los valores corregidos por la edad en el panel
derecho.
La Figura 6 ilustra el resultado de la
identificación por PCR-SSCP de polimorfismos en el
exón 2 de p21 y en el exón 2 de p57.
La Figura 7 ilustra la relación entre las
variantes A y B de p21 y la expresión de ciclina B en el cerebro.
Las barras en blanco indican el porcentaje de pacientes en los que
no se expresó la ciclina B en las neuronas. Las barras negras
indican el porcentaje de pacientes en los que se expresó la ciclina
B en los núcleos de las neuronas.
La Figura 8 ilustra la relación entre las
variantes A y B del exón 2A de p21 y la expresión de ciclina B en
el cerebro en pacientes con p21 normal. Las barras en blanco indican
el porcentaje de pacientes en los que no se expresó la ciclina B en
las neuronas. Las barras negras indican el porcentaje de pacientes
en los que se expresó la ciclina B en los núcleos de las
neuronas.
La Figura 9 ilustra la frecuencia de mutaciones
somáticas en relación con la evolución de AD y las proteínas del
ciclo celular en el cerebro. Eje x: etapas Braak de gravedad de AD;
eje y: porcentaje de cebadores que generan diferentes modelos de
RAPD en la sangre en comparación con el cerebro.
Referencia: individuos sanos con resultados
normales de la prueba cognitiva y neurofisiológica;
PreAD: individuos sanos con resultados de la
prueba neurofisiológica que sugieren AD incipiente;
PossAD: posible enfermedad de Alzheimer
diagnosticada por los criterios NINCDS;
AD: probable enfermedad de Alzheimer
diagnosticada por los criterios NINCDS;
ADM: posible enfermedad de Alzheimer (NINCDS) y
pruebas de otro tipo de demencia;
DNOS: pacientes con demencia que no cumplen los
requisitos de los criterios NINCDS por probable enfermedad de
Alzheimer.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El estudio incluía 102 personas que eran todas
participantes del Proyecto Oxford para investigar la memoria y el
envejecimiento (OPTIMA). El examen OPTIMA de rutina anual incluye un
examen físico, experimentación cognitiva y neurofisiológica. Se
registra el consumo de fármacos y cualquier infección simultánea. Se
extrajo sangre en heparina de litio o tubos al vacío con EDTA. Se
aislaron linfocitos según un protocolo habitual utilizando Ficall
(Sigma). Para estandarizar los métodos de cultivo para todos los
pacientes se congelaron los linfocitos separados y se almacenaron
para su análisis posterior.
Cuando los linfocitos fueron necesarios para el
cultivo, se descongelaron en un baño de agua a 37ºC y se lavaron
dos veces en RPMI (cualquier medio o tampón que soporte la
supervivencia de los linfocitos puede utilizarse para lavar las
células con efecto equivalente. La viabilidad celular (exclusión al
Tripano Blue) fue de manera típica aproximadamente del 80 al
90%.
Se realizó una primera serie de experimentos en
49 personas (Tabla 1a), mientras que una segunda serie de
experimentos se realizó en 55 personas (Tabla 1b). En la primera
serie de experimentos (49 personas) se colocaron dos cultivos de
linfocitos en paralelo procedentes de cada individuo en medio RPMI
enriquecido con 10% de FCS a una concentración de 1\times10^{6}
células por 1 ml de medio de cultivo. Se añadió fitohemoaglutinina
(PHA) a los cultivos a una concentración final de 22 \mug/ml para
activar los linfocitos. Se incubaron los cultivos durante 48 horas
a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO_{2}.
Después de 48 horas de incubación se trató un cultivo con 100 ng/ml
de rapamicina, mientras que el otro cultivo no tratado se mantuvo
como referencia. Después de 23 horas más de incubación se añadió
BrdU a una concentración de 10 \mug/ml a todos los cultivos.
Después de otra hora se "recogieron" los cultivos y se fijaron
en 70% de etanol enfriado en hielo. Se evaluó la incorporación de
BrdU utilizando inmunohistoquímica seguido de análisis FACS. Se
determinó la proporción de células en varias fases del ciclo
celular y se realizó la transformación de los datos para obtener la
prolongación relativa de la fase G1
(Figura 1).
(Figura 1).
Los cálculos (prolongación relativa de la fase
G1 del ciclo celular en cultivos tratados en comparación con los
cultivos de referencia) estaban basados en las suposiciones de que
las células estaban en fase exponencial de proliferación y en que
la fracción de crecimiento en los cultivos (relación de células en
división frente a células en reposo) fue 1,0 (5). Se supuso también
que la rapamicina solamente alteraba la longitud de la fase G1
(19). Basándose en estas suposiciones se calculó la prolongación
relativa de la fase G1 utilizando la fórmula:
RL=100f-100 (expresada en tanto por ciento). La
relación del tiempo G1 en los cultivos tratados frente a los
cultivos de
referencia:
referencia:
\vskip1.000000\baselineskip
(5).f=TG1_{tr}/TG1_{c}=[ln2-ln(2-G1_{tr})][ln(2-G1_{c})]/[ln(2-G1_{tr})][ln2-ln(2-G1_{c})]
\vskip1.000000\baselineskip
En la segunda serie de experimentos (53
personas) tras una incubación inicial de 48 horas (como
anteriormente) se montaron cuatro cultivos independientes. Los
cultivos de referencia se dejaron sin ningún tratamiento, una serie
de cultivos se trató con 100 ng/ml de rapamicina, la tercera serie
se trató con doxorrubiciba 1 \muM, mientras que la cuarta serie
se trató con H_{2}O_{2} \muM. La doxorrubicina induce daños al
ADN, que conducen a interrupciones en G2/M, en lugar de en G1/S. El
tratamiento con H_{2}O_{2} produce agresión oxidativa, que
conduce a una interrupción reversible y temporal del ciclo celular
en G1/S.
Después de 20 horas de incubación se montó un
ensayo de supervivencia MTT de 4 horas de duración (Chemicon
Internacional Ltd.). Los resultados se leen utilizando un lector de
microplacas (filtro 570, filtro de referencia 630). La relación
entre el número de células en los cultivos tratados frente a las
referencias se expresó en porcenta-
je.
je.
Todos los experimentos se realizaron a ciegas
para el diagnóstico clínico de los pacientes.
Los resultados se analizaron en relación con el
diagnóstico clínico proporcionado por los médicos involucrados en
el proyecto OPTIMA.
Se realizó el análisis estadístico utilizando el
paquete informático Statgraphics. Se llevaron a cabo ensayos ANOVA
para examinar el efecto del diagnóstico clínico sobre los parámetros
del cultivo celular. Se realizó también una segunda serie de
análisis para controlar el efecto de la edad sobre los resultados.
La corrección de la edad permite cualquier variación relacionada
con la edad en el parámetro concreto a ensayo. El efecto de la edad
sobre un parámetro dado se determina observando los efectos de la
edad sobre el parámetro en personas sanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los diagnósticos clínicos de los pacientes
incluidos en las dos series de experimentos se resumen en las tablas
1a y 1b. La prolongación relativa de la fase G1 bajo la influencia
del inhibidor G1 específico rapamicina fue significativamente
dependiente en el diagnóstico clínico de los pacientes (Anova p =
0,04, prueba de Kruskall-Wallis p = 0,017) (Figura
2). Los valores mayores, que indican la inhibición de G1 más eficaz
por rapamicina, se encontraron en personas diagnosticadas como
referencias, otros síndromes de demencia aparte de AD y posibles
pacientes de la enfermedad de Alzheimer. Los pacientes
diagnosticados que sufren de AD (probable AD por NINCDS) y aquellos
con AD y en los que coexiste otra patología (ADM) se observó que
presentaban un bloque G1 eficaz menos significativamente que las
personas de referencia y los pacientes que padecen DNOS o possAD
diagnosticados por los criterios NINCDS (Figura 2). Las diferencias
entre las categorías de diagnóstico clínico son similares aun
cuando el retardo de G1 relativo se corrigió por la edad (Figura
2).
En la segunda serie de experimentos el número de
células después del tratamiento con rapamicina presentaban el
modelo esperado de números de células mayores en cultivos AD y poss
AD, en comparación con los cultivos de referencia (Figura 3). Sin
embargo, la sensibilidad del sistema de análisis MTT es
relativamente baja. El tratamiento con doxorrubicina no produjo
diferencias significativas entre los grupos de pacientes (Figura
3). A diferencia del tratamiento con doxorrubicina, la reducción del
número de células mediante el tratamiento con H_{2}O_{2}
dependía del diagnóstico clínico. Los pacientes que padecen AD,
preAD y possAD tenían un número de células significativamente mayor
que las personas de referencia como resultado del tratamiento con
H_{2}O_{2}. Los pacientes de DNOS presentaban amplias
variaciones y no eran diferentes de los demás grupos de pacientes
(Figura 4).
| Diagnóstico clínico | Nº de pacientes |
| Referencia | 14 |
| PreAD | 13 |
| PossAD | 3 |
| AD | 9 |
| ADM | 7 |
| DNOS | 3 |
| Diagnóstico clínico | Nº de pacientes |
| Referencia | 16 |
| PreAD | 18 |
| ADM | 3 |
| AD | 11 |
| DNOS | 5 |
| Clave: | |
| Referencia: individuos sanos con resultados normales de la prueba cognitiva y neurofisiológica; | |
| PreAD: individuos sanos con resultados de la prueba neurofisiológica que sugieren AD incipiente; | |
| PossAD: posible enfermedad de Alzheimer diagnosticada por los criterios NINCDS; | |
| AD: probable enfermedad de Alzheimer diagnosticada por los criterios NINCDS; | |
| ADM: posible enfermedad de Alzheimer (NINCDS) y pruebas de otro tipo de demencia; | |
| \begin{minipage}[t]{158mm} DNOS: pacientes con demencia que no cumplen los requisitos de los criterios NINCDS por probable enfermedad de Alzheimer. \end{minipage} | |
En este estudio los efectos de un inhibidor de
G1 específico (rapamicina) (16, 19) sobre la longitud de la fase G1
en linfocitos se analizaron utilizando el ensayo de incorporación de
BrdU y el análisis FACS. Se evaluó también la reducción del número
de células en los cultivos después del tratamiento con rapamicina.
En un segundo método, se produjo la inhibición de G1 por agresión
oxidativa y se midió la reducción del número de células en el
sistema de cultivo.
Los resultados de la primera serie de
experimentos indican la interrupción del ciclo celular inducida por
el inhibidor de G1 indicada por la prolongación de la fase G1 del
ciclo celular, es significativamente menos eficaz en los pacientes
que padecen la enfermedad de Alzheimer que en los individuos de
referencia. También es evidente que estos cambios aparecen al
principio, en la etapa en la que los pacientes no son aún
clínicamente dementes pero presentan síntomas de pérdida de memoria
rápida específica, que se sabe que es el primer síntoma explícito
de demencia.
El bloque G1 inducido por rapamicina depende de
la expresión y actividad del CDKI de p27kip1 que inhibe la
actividad del complejo CyclinE/cdk2 (16, 19). Por consiguiente la
prolongación relativa de la fase G1 bajo la influencia de la
rapamicina, dependerá de la expresión/actividad de este CDKI (19).
El hecho de que esta prolongación relativa de G1 sea
significativamente menor en el paciente de la enfermedad de
Alzheimer que en los individuos viejos sanos apoyaría la hipótesis
de los investigadores de que una anomalía del punto de control de
G1/S en las neuronas puede estar acompañada por un daño en el
control del ciclo celular similar en otros tipos de células en
estos pacientes. También es evidente que la anomalía en el control
del ciclo celular es detectable en las células periféricas mucho
antes de que aparezcan los síntomas de demencia completamente
desarrollada. Esto hace posible que pueda utilizarse un ensayo
basado en la estimulación mitógena de los linfocitos periféricos
seguido de un bloque de transición G1/S ensayado para la detección
precoz de pacientes que pueden estar en situación de riesgo de
desarrollar patología tardía del cerebro de tipo AD.
Las diferencias en los números de células
inducidas por H_{2}O_{2} fueron significativamente diferentes
en los grupos de pacientes del estudio indicando que los linfocitos
de las personas de referencia presentan una respuesta más
pronunciada a la agresión oxidativa. Se ha demostrado que el
tratamiento con H_{2}O_{2} 120 mM induce una interrupción del
ciclo celular reversible y temporal en el punto de transición de
g1/S (6) al permitir tiempo para la reparación del daño del ADN.
Los resultados de los investigadores indican que este mecanismo no
es completamente eficaz en los pacientes de la enfermedad de
Alzheimer. Esta respuesta inadecuada a la agresión oxidativa está
también presente en las personas que padecen AD preclínica. La
respuesta alterada a la agresión oxidativa puede también ser un
reflejo del daño al ADN preexistente más sustancial en los pacientes
de AD (11). Sin embargo, esta posibilidad se excluye por el hecho
de que el daño al ADN inducido por doxorrubicina, que induce una
interrupción de G2/M más bien que una interrupción de G1, no es
diferente en los grupos de pacientes de los investigadores. Los
resultados de este estudio se interpretan por consiguiente indicando
una anomalía específica en la regulación del punto de transición
de
G1/S.
G1/S.
En resumen, los resultados de este estudio
indican que la respuesta de los linfocitos activados a la inhibición
de G1 está significativamente alterada en los pacientes de la
enfermedad de Alzheimer. Además estas alteraciones aparecen al
principio antes del comienzo de un síndrome de demencia totalmente
desarrollado identificando a las personas que probablemente
desarrollarán más tarde la enfermedad de Alzheimer. Los resultados
indican que una prueba de diagnóstico que se basa en la detección
de la integridad del punto de control de la transición de G1/S
puede permitir la identificación de pacientes que están en situación
de riesgo de desarrollar AD más tarde. La ventaja de este
procedimiento de diagnóstico se basaría en su capacidad para
identificar este grupo, abriendo la posibilidad de la intervención
preventiva para estas personas.
Los protocolos descritos en el Ejemplo 1 para la
separación y el cultivo de linfocitos, inducción de la división
celular, inducción de la interrupción del ciclo celular mediante
tratamiento con un inhibidor de la división celular o hipoxia
inducida por H_{2}O_{2}, incorporación de BrdU/análisis FACS y
ensayo de supervivencia de MTT, o menores adaptaciones de los
mismos, pueden utilizarse todos para diagnóstico en la prueba de la
presencia de una anomalía de la regulación en la transición
G1/S.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se amplió el exón 2 de p21cip del ADN genómico
(extraído del cerebro o de la sangre) utilizando los cebadores
5'-CGGGATCCGGCGCCATGTCAGAACCGGC-3'
(SEQ. ID. nº: 1) y
5'-CCAGACAGGTCAGCCCTTGG-3' (SEQ. ID.
nº: 2). Se realizó la ampliación por PCR en un volumen final de 50
\mul utilizando 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa, MgCl_{2}
1,5 mM, gelatina al 5%, 200 \muM de cada NTPd en tampón de PCR
(Tris-HCl 75 mM, pH 8,8,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM y Tween al 0,01%). El
comienzo en caliente (95ºC durante 5') fue seguido de 30 ciclos de
95ºC 1 min, 65ºC 1 min y 72ºC 1 min.
El primer segmento del exón 2 de p57 (exón
2Ap57) se amplió a partir del ADN genómico (extraído del cerebro o
de la sangre) utilizando los cebadores 5'-GGC CAT
GTC CGA CGC GTC-3' (SEQ. ID. nº: 3) y
5'-AGG CGG CAG CGC CCC ACC TG-3'
(SEQ. ID. nº: 4). Se realizó la ampliación por PCR en un volumen
final de 50 \mul utilizando 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa,
MgCl_{2} 1,5 mM, DMSO al 10%, 200 \muM de cada NTPd en tampón de
PCR (Tris-HCl 75 mM, pH 8,8,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM y Tween al 0,01%). El comienzo
en caliente (95ºC durante 5 min) fue seguido de 30 ciclos de 95ºC
30 s, 52ºC 30 s y 72ºC 30 s.
El segundo segmento del exón 2 de p57 (exón
2Bp57) se amplió a partir del ADN genómico (extraído del cerebro o
de la sangre) utilizando los cebadores 5'-ATT ACG
ACT TCC AGC AGG ACA TG-3' (SEQ. ID. nº: 5) y
5'-CTG GAG CCA GGA CCG GGA CTG-3'
(SEQ. ID. nº: 6). Se realizó la ampliación por PCR en un volumen
final de 50 \mul utilizando 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa,
MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada NTPd en tampón de PCR
(Tris-HCl 75 mM, pH 8,8,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM y Tween al 0,01%). El comienzo
en caliente (95ºC durante 5 min) fue seguido de 30 ciclos de 95ºC
30 s, 53ºC 30 s y 72ºC 30 s.
Para la identificación inicial se añadieron 4
\mul de producto de PCR a 16 \mul de disolución de
desnaturalización (formamida desionizada al 95%, NaOH 10 mM, azul
de bromofenol al 0,01% y xileno cianol FF al 0,01%) correspondiente
a 20 \mul para la carga del gel. Se incubó la mezcla durante 5 min
a 95ºC y se aplicó a un gel de metaphor agarosa (2% para el exón 2
de p21 y 3% para el exón 2A del p57 y exón 2B de p57) que contenían
Gelstar 1:10.000. El aparato de electroforesis se mantuvo en un
refrigerante normal a una temperatura constante de 4ºC. La
electroforesis se realizó utilizando 1\timesTBE
(Tris-borato 45 mM/EDTA 1 mM) a 5 V/cm durante 2
horas. Los modelos de SSCP que aparecen en el gel es detectaron por
luz UV.
Se obtuvieron polimorfismos en el exón 2 del gen
cip de p21 y en el exón 2 de los genes kip2 del p57 (Figura 6). El
polimorfismo detectado en el exón 2 de p21cip (variante A) estaba
significativamente asociado a la desregulación del ciclo celular en
las neuronas (Figura 7), es decir la evolución del ciclo celular a
través de la transición G1/S en la fase G2, indicada por la
positividad de ciclina B. En los pacientes con p21cip normales
(variante B) el polimorfismo en el exón 2A de p57 está asociado a la
positividad de la ciclina B (Figura 8), lo que indica la evolución
del ciclo celular a través de la transición G1/S en la fase G2.
Ejemplo
3
Las mutaciones somáticas en las neuronas se
identificaron utilizando métodos de identificación genética. Se
extrajo ADN del cerebro y de la sangre de todos los pacientes. Se
realizó la ampliación por PCR en ambas muestras de cada paciente.
Se utilizaron cebadores de clase 10 para ampliar al azar secuencias
de ADN polimórficas (cebadores listados en la tabla 2). La
ampliación por PCR se realizó en un volumen final de 50 \mul
utilizando 1,25 unidades de Taq ADN polimerasa, MgCl_{2} 1,5 mM,
200 \muM de cada NTPd en tampón de PCR (Tris-HCl
75 mM, pH 8,8, (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM y Tween al
0,01%). El comienzo en caliente (95ºC durante 5 min) fue seguido de
40 ciclos de 94ºC 30 s, anterior 1 min y 72ºC 2 min. La temperatura
de hibridación (AnT) varió entre 33ºC y 39ºC dependiendo del
cebador. El producto de la PCR se aplicó a un gel de agarosa al 2%
que contenía Gelstar 1:10.000. La electroforesis se realizó
utilizando 1\timesTBE (Tris-borato 45 mM/EDTA 1
mM) a 6,5 V/cm durante 2 horas. Las características de la secuencia
RAPD se detectaron por luz ultravioleta. Las diferencias entre las
secuencias RAPD del ADN de la sangre y del cerebro se compararon
para cada paciente y se expresaron como % de cebadores que conducen
a diferentes perfiles de RAPD (perfiles de RAPD no mostrados).
Se observó que la cantidad de mutaciones
somáticas en el cerebro en pacientes de AD estaba significativamente
asociada a la desregulación del ciclo celular y a la gravedad de la
patología de tipo AD (Figura 9). Por consiguiente, se sugiere que
la insuficiencia de la reparación del ADN puede conducir a la
desregulación del punto de transición G1/S que conduce finalmente
al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer.
Los descubrimientos de genotipado están en
concordancia con los descubrimientos anteriores en los linfocitos
de los pacientes de AD que indican que existe una disfunción
detectable en el control de la regulación de G1/S producido por
CDKI que induce inhibidores o por agresión oxidativa al ADN.
| Secuencia | SEQ ID nº |
| 5'-CCGGCTACGG-3' | 7 |
| 5'-CAGGCCCTTC-3' | 8 |
| 5'-TACGGACACG-3' | 9 |
| 5'-AGCTTCAGGG-3' | 10 |
| 5'-AGGCATTCCC-3' | 11 |
| 5'-GGTCTGAACC-3' | 12 |
| 5'-TAGGCTCACG-3' | 13 |
| 5'-ACGGTACACT-3' | 14 |
| 5'-GTCCTCAACG-3' | 15 |
| 5'-CAATGCGTCT-3' | 16 |
| Gen/proteína | Número de registro |
| CDK3 | 123832 |
| p15ink4B | 600431 |
| p16ink4A | 600160 |
| p19ink4D | 600927 |
| p27kip1 | 600778 |
| p21cip1 | 116899 |
| p57kip2 | 600856 |
| TP53 | 191170 |
| Gadd45A | 126335 |
| Gadd45B | 604948 |
| Gadd45G | 604949 |
| Gadd153 | 126337 |
| PCNA | 175740 |
| Ku70 | 152690 |
| KU80 | 194364 |
| Ku86 | 604611 |
| NDHII | 603115 |
| BLM | 604610 |
| RECQL | 600537 |
| RECQL4 | 603780 |
| RECQL5 | 603781 |
1. Araga S, Kagimoto H,
Funamoto K y Takahashi K (1990) Jpn J
Med 29: 572-5
2. Arendt T, Holzer M. y
Gartner U (1998) J Neural Transm 105:
949-60
3. Arendt T, Rodel L,
Gartner U y Holzer M (1996) Neuroreport
7: 3047-9
4. Burke WJ, McLaughlin JR,
Chung HD, Gillespie KN, Grossberg GT,
Luque FA y Zimmerman J (1994) Alzheimer Dis
Assoc Disord 8: 22-8
5. Darzynkiewicz Z (1993) En
Fantes y Brooks R (eds) The cell cycle. Oxford University
Press, Oxford, págs. 43-68
6. Davies KJ (1999) IUBMB
Life 48: 41-7
7. Drabkin HA. y Erickson P
(1995) Prog Clin Biol Res 393:
169-76
8. Eckert A, Hartmann H,
Forstl H y Muller WE (1994) Life Sci
55: 2019-29
9. Fischman HK, Reisberg B,
Albu P, Ferris SH y Rainer JD (1934)
Biol Psychiatry 19: 319-27
10. Fong CT y Brodeur GM
(1987) Cancer Genet Cytogenet 28:
55-76
11. Mecocci P, Polidori MC,
Ingegni T, Cherubini A, Chionne F,
Cecchetti R y Senin U (1998) Neurology
51: 1014-1017
12. Melaragno MI, Smith MdA,
Kormann Bortolotto MH y Toniolo Neto JT (1991)
Gerontology 37 293-8
13. Nagy Z, Esiri MM,
Hindley NJ, Joachim C, Morris JH, King
EM-F, McDonald B, Litchfield S,
Barnetson L, Jobst KA y Smith AD (1998)
Dementia 9: 219-226
14. Nagy Z, Esiri MM y
Smith AD (1998) Neurosciencie 04;
131-739
15. Payao SL, Smith MD y
Bertolucci PH (1998) Gerontology 44:
267-71
16. Sherr CJ (1994) Stem
Cells 12: 47-55; debate
55-7
17. Tatebayashi Y, Takeda M,
Kashiwagi Y, Okochi M, Kurumadani T,
Sekiyama A Kanayama G, Hariguchi S y
Nishimura T (1995) Dementia 6:
9-16
18. Trieb K, Ransmayr G,
Sgonc R, Lassmann H y Grubeck Loebenstein B
(1996) Neurobiol Aging 17: 541-7
19. Wagner EF, Hleb M,
Hanna N y Sharma S (1998) J Immunol
161: 1123-31
Claims (29)
1. Un método in vitro para el diagnóstico
de la enfermedad de Alzheimer en una persona que comprende la
identificación de la presencia de una anomalía en la regulación del
ciclo celular en la fase de transición G1/S en las células no
neuronales de una persona.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que una reducción en la eficacia del control del punto de control
en la transición G1/S se considera una indicación de que la persona
padece la enfermedad de Alzheimer.
3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en
el que la identificación de la presencia de una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S se
realiza:
induciendo la división celular en las células no
neuronales y ensayando la sensibilidad de las células a una
sustancia inhibidora de la división celular, en el que la
sensibilidad reducida a la sustancia inhibidora de la división
celular en las células de la persona, comparada con la de las
células de referencia que no presentan una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S, se
considera una indicación de la presencia de una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S.
4. Un método según la reivindicación 3, en el
que la sustancia inhibidora de la división celular es un inhibidor
específico de G1.
5. Un método según la reivindicación 1 o 2, en
el que la identificación de la presencia de una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S se
realiza:
induciendo la división celular en las células no
neuronales y ensayando la sensibilidad de las células a un estímulo
que induce la interrupción del ciclo celular, en el que una
sensibilidad reducida a dicho estímulo en las células de la
persona, comparada con la de las células de referencia que no
presentan una anomalía de la regulación del ciclo celular en la
fase de transición G1/S, se considera una indicación de la presencia
de una anomalía de la regulación del ciclo celular en la fase de
transición G1/S.
6. Un método según la reivindicación 5, en el
que el estímulo que induce la interrupción del ciclo celular se
selecciona de la agresión oxidativa, radiación ionizante, hipoxia o
radiación ultravioleta.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que la sensibilidad de las células a
la sustancia inhibidora de la división celular o al estímulo que
induce la interrupción del ciclo celular se determina mediante un
ensayo de proliferación celular, la actividad proliferante
relativamente elevada en las células de la persona, comparada con
la de las células de referencia que no presentan una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S, después
del tratamiento con el inhibidor de la división celular o
considerándose el estímulo que induce la interrupción del ciclo
celular una indicación de la presencia de una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S.
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que la sensibilidad de las células a
la sustancia inhibidora de la división celular o al estímulo que
induce la interrupción del ciclo celular se determina calculando la
prolongación relativa de la fase G1 del ciclo celular en las células
de la persona, una prolongación relativa reducida de la fase G1 en
presencia de la sustancia inhibidora de la división celular o del
estímulo en dichas células, comparado con la de las células de
referencia que no presentan una anomalía de la regulación del ciclo
celular en la fase de transición G1/S, considerándose una indicación
de la presencia de una anomalía de la regulación del ciclo celular
en la fase de transición G1/S.
9. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que la sensibilidad de las células a
la sustancia inhibidora de la división celular o al estímulo que
induce la interrupción del ciclo celular se determina por análisis
de la expresión de una proteína reguladora del ciclo celular o de un
ARNm que codifica una proteína reguladora del ciclo celular.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que la proteína reguladora del ciclo celular se selecciona del
grupo constituido por CDKN3, pl5ink4B, p16ink4A, p19ink4D, p27kip1,
p21cip1, p57kip2 y TP53.
11. Un método según la reivindicación 5, en el
que el estímulo que induce la interrupción del ciclo celular es un
daño al ADN y la sensibilidad de las células a este estímulo se
determina mediante análisis de la expresión de un elemento de
respuesta al daño al ADN.
12. Un método según la reivindicación 11, en el
que el elemento de respuesta al daño al ADN se selecciona del grupo
constituido por TP53, Gadd34, Gadd45A, Gadd45B, Gadd45G, Gadd153 y
PCNA.
13. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que la sensibilidad de las células a
la sustancia inhibidora de la división celular o al estímulo que
induce la interrupción del ciclo celular se determina por
evaluación de la viabilidad celular o de la muerte celular, en el
que el aumento de la supervivencia celular o un grado reducido de
la muerte celular en dichas células, comparado con la de las células
de referencia que no presentan una anomalía de la regulación del
ciclo celular en la fase de transición G1/S, después de la
exposición del inhibidor de la división celular o de otros estímulos
que inducen la interrupción del ciclo celular se considera una
indicación de la presencia de una anomalía de la regulación del
ciclo celular en la fase de transición G1/S.
14. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que la sensibilidad de las células a
la sustancia inhibidora de la división celular o al estímulo que
provoca la interrupción del ciclo celular se determina por análisis
de la expresión de una proteína relacionada con la muerte celular o
de un ARNm que codifica una proteína relacionada con la muerte
celular.
15. Un método según la reivindicación 14, en el
que la proteína relacionada con la muerte celular es un miembro de
la familia bcl-2 de proteínas.
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6, en el que la sensibilidad de las células a
la sustancia inhibidora de la división celular o al estímulo que
provoca la interrupción del ciclo celular se determina por
evaluación del contenido de ADN de las células con o sin análisis
del ciclo celular.
17. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que las células no neuronales son
linfocitos.
18. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, para el diagnóstico de la enfermedad de
Alzheimer esporádica.
19. Un método de identificación in vitro
de compuestos con actividad farmacológica potencial en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, método que comprende las
etapas siguientes:
analizar la regulación de la transición G1/S en
células no neuronales, células que presentan una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S, en
presencia y ausencia de un compuesto de ensayo, en el que se
identifica que un compuesto de ensayo que produce la corrección de
la anomalía de la regulación en la transición G1/S en dichas
células, presenta actividad farmacológica potencial en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
20. Un método de determinación in vitro
si un agente farmacológico es probable que sea de utilidad en el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en una persona
determinada, método que comprende:
analizar la regulación de la transición G1/S en
células de dicho individuo, cuyas células no son neuronales que
presentan una anomalía de la regulación del ciclo celular en la fase
de transición G1/S, en presencia y ausencia del agente
farmacológico que produce la corrección de la anomalía de la
regulación en la transición G1/S en dichas células se identifica
como probable que sea beneficioso en el tratamiento de la enfermedad
de Alzheimer en dicho individuo.
21. Un método de identificación de la
predisposición de una persona a la enfermedad de Alzheimer que
comprende la identificación de la presencia en el genoma de dicha
persona de al menos una mutación o variante alélica en un gen
regulador del ciclo celular.
22. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, que comprende la identificación de la
presencia de mutaciones o variantes alélicas en al menos un gen
seleccionado de: CDKN3, pl5ink4B, p16ink4A, p19ink4D, p27kip1,
p21cip1, p57kip2 y TP53.
23. Un método según la reivindicación 22, que
comprende el genotipado de uno o más del polimorfismo A/B de p21E2,
del polimorfismo A/B de p57E2A o del polimorfismo A/B de p57E2B.
24. Un método para su utilización en el
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en una persona que
comprende la identificación de la presencia en el genoma de dicha
persona de al menos una mutación o variante alélica en un gen que
codifica una enzima para la reparación del ADN, en el que la
presencia de una mutación o variante alélica en dicho gen se
considera una indicación de la enfermedad de Alzheimer.
25. Un método de determinación de cualquier base
genética de la enfermedad de Alzheimer en una persona, que
comprende la identificación de la presencia de mutaciones o
variantes alélicas en el genoma de dicha persona en un gen que
codifica una enzima de reparación del ADN.
26. Un método de identificación de la
predisposición a la enfermedad de Alzheimer en una persona, que
comprende la identificación de la presencia de al menos una mutación
o variante alélica en el genoma de dicha persona en un gen que
codifica una enzima de reparación del ADN.
27. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 26 que comprende la identificación de la
presencia de mutaciones o variantes alélicas en al menos un gen
seleccionado de: Ku70, Ku80, Ku86, NDHII, BLM, RECQL, RECQL4 y
RECQL5.
28. Un método de identificación de compuestos
con actividad farmacológica potencial en el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer, cuyo método comprende las etapas
siguientes:
analizar la regulación de la transición G1/S en
células no neuronales, cuyas células presentan una anomalía de la
regulación del ciclo celular en la fase de transición G1/S, en
presencia y ausencia de un compuesto de ensayo que produce la
corrección de la anomalía de la regulación en la transición G1/S en
dichas células se identifica que posee actividad farmacológica
potencial en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
29. Un método de determinar si un agente
farmacológico es probable que sea de utilidad en el tratamiento de
la enfermedad de Alzheimer en una persona determinada, cuyo método
comprende:
analizar la regulación de la transición G1/S en
células de dicho individuo, cuyas células son células no neuronales
que presentan una anomalía de la regulación del ciclo celular en la
fase de transición G1/S, en presencia y ausencia del agente
farmacológico, en el que un agente farmacológico que produce la
corrección de la anomalía de la regulación en la transición G1/S en
dichas células se identifica como probable que sea beneficioso en
el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en dicho individuo.
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