ES2272817T3 - Procedimiento de deteccion de microorganismos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para detectar unos microorganismos presentes en una muestra que comprende las etapas que consisten en: a) preparar un medio de cultivo adaptado a dichos microorganismos diana, b) verter dicho medio en un recipiente que presenta un fondo coloreado, c) inocular el medio de cultivo sólido de a) con dicha muestra o un inoculum derivado de la muestra e incubar, d) detectar la presencia de dichos microorganismos en dicho medio de cultivo utilizando el contraste entre el color de fondo del recipiente y las colonias aisladas.
Description
Procedimiento de detección de
microorganismos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para detectar unos microorganismos presentes en una
muestra, en el que se inocula con dicha muestra un medio de cultivo,
conteniendo dicho medio de cultivo preferentemente unos agentes
cromógenos que liberan unos cromóforos en presencia de los
microorganismos diana o de unos agentes fluorógenos, encontrándose
dicho medio de cultivo en un recipiente que presenta un fondo
coloreado, la detección es facilitada por el contraste entre el
fondo coloreado del recipiente y las colonias aisladas.
Es indispensable una detección rápida de
microorganismos presentes en unas muestras biológicas, alimenticias,
o en el medio hospitalario, con el fin de definir lo más rápidamente
posible las medidas a tomar en caso de contaminación.
Parece también importante poder diferenciar los
diferentes contaminantes, con el fin de poder proceder a unas
desinfecciones adecuadas.
Existen unos procedimientos, como el PCR, que es
rápido y específico, pero que precisa el empleo de aparatos como los
termocicladores, que no se puede utilizar siempre en el medio
hospitalario. Por otra parte, este método puede requerir una
preparación de las muestras a ensayar, lo que no es siempre fácil de
realizar.
Se han descrito unos procedimientos basados en
el cultivo de los microorganismos contaminantes en unos medios
adecuados, y en su identificación mediante la adición de agentes
cromógenos que liberan un cromóforo después de la acción de una
enzima específica del microorganismo.
Así, las solicitudes de patente WO 00/53799, WO
00/46345, WO 97/39103, WO 95/04156, WO 94/09152,
US-A-6 087 156, WO 98/48042 y
US-A-6130057describen unos medios de
cultivo para identificar los estafilococos, las bacterias anaerobias
o los coliformes enterohemorrágicos, las salmonelas u otros
microorganismos tales como los Candida.
De todas formas, siendo los medios utilizados
relativamente transparentes, a veces puede ser difícil determinar
los colores de los cromóforos liberados, debido a la falta de un
contraste suficiente. Así la utilización del medio C descrito en la
solicitud de patente WO 95/04156 permite una buena discriminación de
las diferentes levaduras Candida, pero los colores obtenidos son
claros, lo que puede ser problemático para ciertos usuarios.
Así mismo, el procedimiento descrito en la
solicitud WO 00/46345 para identificar los estafilococos puede
necesitar la adición de un agente de contraste en el medio de
cultivo, por ejemplo un opacificante.
Una necesidad de este tipo de contraste se hace
también sentir para unos medios para detectar las salmonelas, tal
como el Rambach Agar vendido por la sociedad Chromagar (Paris,
Francia).
Se ha propuesto en particular añadir kaolín para
opacificar los medios, en particular para detectar E. Coli,
con ayuda del fenilglucurónido. De todas formas, la adición de este
tipo de componente, además de que aumenta los costes de fabricación
del medio, puede plantear numerosos problemas para la fabricación
industrial de los medios de detección (en particular problemas de
precipitaciones).
El documento EP 0103915 describe un
procedimiento para la detección visual de una intensidad coloreada
de un líquido en una serie de recipientes con diferentes
concentraciones de colorantes, pudiendo dichos recipientes ser
coloreados.
La presente invención propone responder al
problema planteado por la falta de contraste observado entre las
colonias aisladas y el medio de cultivo, en particular cuando estas
colonias están coloreadas debido a la presencia de unos agentes
cromógenos en el medio de cultivo.
Así, la presente invención se refiere a un
procedimiento para detectar unos microorganismos presentes en una
muestra que comprende las etapas que consisten en:
\vskip1.000000\baselineskip
- a)
- preparar un medio de cultivo adaptado a dichos microorganismos diana,
- b)
- verter dicho medio en un recipiente que presente un fondo coloreado,
- c)
- inocular el medio de cultivo sólido de a) con dicha muestra o un inoculum derivado de la muestra e incubar,
- d)
- detectar la presencia de dichos microorganismos en dicho medio de cultivo utilizando el contraste entre el color de fondo del recipiente y las colonias aisladas.
En un modo de realización preferido, la
invención se refiere a un procedimiento para detectar unos
microorganismos presentes en una muestra mediante la liberación
enzimática de cromóforos a partir de unos agentes cromógenos
presentes en un medio de cultivo adaptado a dichos microorganismos
que comprende las etapas que consisten
en:
en:
- a)
- preparar un medio de cultivo adecuado que contenga los agentes cromógenos apropiados para la detección de los microorganismos diana,
- b)
- verter dicho medio en un recipiente que presente un fondo coloreado,
- c)
- inocular el medio de cultivo sólido de a) con dicha muestra o un inoculum derivado de la muestra, e incubar,
- d)
- detectar la presencia de los microorganismos presentes en dicha muestra, en dicho medio de cultivo, utilizando el contraste asociado al color de fondo del recipiente respecto a la coloración debida a los cromóforos liberados.
En otro modo de realización, el medio de cultivo
contiene unos productos que le dan una coloración (por ejemplo, el
McConkey Agar...).
En otro modo de realización, el medio de cultivo
contiene unos agentes fluorógenos que liberan unos fluoróforos en
presencia de unos microorganismos diana. En particular se puede
utilizar el 4-metilumbelliferil, como fluoróforo,
por ejemplo unido a una galactosidasa
(4-metilumbelliferil-\beta-D-galactosidasa).
En un modo de realización preferido, el
recipiente según la invención tiene forma redonda y en particular de
una caja de Petri, de un diámetro que va de 40 mm a 210 mm.
Preferentemente, el diámetro del recipiente según la invención es
igual a 47 mm, 55mm, 90 mm, 100 mm ó 200 mm.
En un modo de realización preferido de la
invención, la superficie del recipiente es tal que es posible
inocular el medio de cultivo contenido en el recipiente de tal
manera que se obtiene el crecimiento de colonias aisladas. Así, la
superficie del recipiente según la invención es preferentemente
superior a aproximadamente 15-17 cm^{2}.
En un modo de realización de la presente
invención, dicho recipiente presenta un fondo coloreado opaco. En
otro modo de realización, dicho recipiente presenta un fondo
coloreado transparente. Preferentemente, dicho recipiente presenta
un fondo de un color escogido entre los colores azul, rojo,
amarillo, negro o blanco opaco.
En un modo de realización de la invención,
dichos cromóforos u otros productos coloreados son liberados por
hidrólisis debido a la acción de una enzima específica del
microorganismo sobre los agentes cromógenos presentes en el medio de
cultivo, y dicho(s) agente(s) cromógeno(s)
es(son) escogido(s) entre los substratos de las
enzimas asociados al metabolismo de los azúcares, y en particular en
el grupo constituido por los sustratos de la
\beta-glucosidasa, unos sustratos de la
\beta-galactosidasa, y unos sustratos de la
\beta-glucuronidasa, y unos sustratos de la
fosfatasa.
Preferentemente, dicho(s)
cromóforo(s) es(son) escogido(s) en el grupo
constituido por unos derivados indoxilo, halógenoindoxilo
(bromoindoxilo, cloroindoxilo, fluoroindoxilo, iodoindoxilo,
dicloroindoxilo, clorobromoindoxilo, tricloroindoxilo),
metilindoxilo, y la hidroxiquinolina, en particular entre los
siguientes derivados: 6-cloroindoxilo,
5-bromoindoxilo, 3-bromoindoxilo,
6-fluoroindoxilo, 5-iodoindoxilo,
4,6-dicloroindoxilo,
6,7-dicloroindoxilo,
5-bromo-4-cloroindoxilo,
5-bromo-6cloroindoxilo,
4,6,7-tricloroindoxilo,
N-metilindoxilo o
8-hidroxiquinolina.
Con el fin de poder limitar el crecimiento de
los microorganismos que no se buscan, es ventajoso que el medio de
cultivo contenga también unos factores selectivos para los
microorganismos buscados.
En un modo de realización particular, el medio
de cultivo contiene también una concentración elevada de sacarosa o
de glucosa.
El procedimiento de la invención es utilizado
ventajosamente cuando el microorganismo diana es de la especie
Candida, en particular con el Chromagar Candida descrito en
el documento WO 95/04156. Se utiliza entonces un recipiente
coloreado, transparente u opaco, dependiendo el color de la
naturaleza de la levadura más buscada.
El procedimiento de la invención está también
particularmente adaptado cuando dicho microorganismo diana es de la
especie Staphylococcus y se escoge entonces preferentemente
dicho recipiente para que presente un fondo coloreado opaco,
preferentemente blanco opaco.
Se puede también utilizar el procedimiento
cuando dicho microorganismo diana es de la especie Vibrio, de la
especie de los coliformes y en particular de las bacterias E.
coli enterohemorrágicas.
Se utilizan en particular las enseñanzas de las
solicitudes de patente WO 00/53799, WO 00/46345, WO 97/39103, WO
95/04156, WO 94/09152, para definir los colores de los
microorganismos en función de la naturaleza de los medios
obtenidos.
La invención se refiere también a un kit de
detección de microorganismos, constituido por la combinación de un
recipiente que presenta un fondo coloreado con un medio de cultivo
que contiene preferentemente unos agentes cromógenos que liberan
unos cromóforos en presencia de dichos microorganismos diana.
La invención tiene también por objeto la
utilización de un recipiente que presenta un fondo coloreado como
soporte en el que se vierte un medio de cultivo que contiene
preferentemente unos agentes cromógenos que liberan unos cromóforos
después de la acción de unas enzimas específicas presentes en unas
cepas de microorganismos.
El color de los recipientes utilizados (en
general cajas de Petri) es ventajosamente escogido de tal manera que
presenta un contraste útil con las colonias de microorganismos, o
los cromógenos utilizados. El contraste útil es definido como un
contraste que ayuda a la discriminación de los colores de las
colonias, con respecto al fondo de la caja. Así, cuando el medio de
cultivo no contiene cromógenos, las colonias son generalmente claras
y el fondo del recipiente es mas bien oscuro.
El color de fondo de la caja es también escogido
en función del color de los cromóforos liberados. Así, el cromógeno
azul
5-bromo-4-cloro-3-indoxil
presenta una absorción a 615 nm, que se puede fácilmente diferenciar
cuando se utilizan cajas rojas (aproximadamente 515 nm). Para los
cromógenos que producen unas colonias malva, roja, o púrpura, se
utilizan unas cajas con un color tal que la longitud de onda está
alejada, por ejemplo unas cajas amarillas. Cuando se obtienen unas
colonias de color claro, se utilizan unas cajas de color oscuro y/o
opacas
| Cromógeno | Color | Absorción max (nm) | Color de la caja |
| (ejemplo) | |||
| 5-Bromo-4-Cloro-3-indoxil | Azul | 615 | Rojo |
| 5-Bromo-6-cloro-3-indoxil | Rojo púrpura | 565 | Amarillo |
| (Magenta) | |||
| 6-cloro-3-indoxil | Gris púrpura | 540 | Blanco opaco, |
| (Salmón) | o color oscuro |
Los cromóforos utilizables para la realización
de la presente invención tienen entonces la siguiente fórmula
general, y son obtenidos por oxidación de un agente cromógeno unido
a un sustrato enzimático. Estos cromóforos son insolubles, lo que
provoca la formación de un precipitado coloreado. Se observa que los
cromóforos pueden ser obtenidos después de la acción de las
glicosidadas, pero también después de la acción de las
fosfatasas.
Se puede obtener una lista de agentes cromógenos
del documento US nº 6.130.057.
Fórmula de cromóforos utilizables en el marco de
la invención:
Otra ventaja del procedimiento y del kit según
la invención es la posibilidad de localizar fácilmente las cajas que
comprenden ciertos agentes. En efecto, los medios que contienen unos
agentes cromógenos son incoloros antes de la reacción de los
microorganismos y liberación de los cromóforos. Su acondicionamiento
en unas cajas de color se ha mostrado por lo tanto útil para guardar
y volver a encontrar fácilmente los medios de interés, siendo
escogido el color de la caja en función de los y correlacionada con
los cromógenos presentes en el medio, y a los colores esperados en
presencia de microorganismos.
Claims (20)
1. Procedimiento para detectar unos
microorganismos presentes en una muestra que comprende las etapas
que consisten en:
- a)
- preparar un medio de cultivo adaptado a dichos microorganismos diana,
- b)
- verter dicho medio en un recipiente que presenta un fondo coloreado,
- c)
- inocular el medio de cultivo sólido de a) con dicha muestra o un inoculum derivado de la muestra e incubar,
- d)
- detectar la presencia de dichos microorganismos en dicho medio de cultivo utilizando el contraste entre el color de fondo del recipiente y las colonias aisladas.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene unos
agentes fluorógenos que liberan unos fluoróforos en presencia de
dichos organismos diana.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene unos
agentes cromógenos apropiados para la detección de unos
microorganismos diana, mediante la liberación enzimática de
cromóforos a partir de dichos agentes cromógenos.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho recipiente
presenta un fondo de un color coloreado opaco.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho recipiente
presenta un fondo coloreado transparente.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho recipiente
presenta un fondo de un color escogido entre los colores azul, rojo,
amarillo, negro, o blanco opaco.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque dichos
cromóforos son liberados por hidrólisis debido a la acción de una
enzima específica del microorganismo sobre los agentes cromógenos
presentes en el medio de cultivo.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el(los) dicho(s)
agente(s) cromógeno(s) es (son) escogido(s)
entre los sustratos de las enzimas asociados al metabolismo de los
azúcares, y en particular en el grupo constituido por unos sustratos
de la \beta-glucosidasa, de unos sustratos de la
\beta-galactosidasa, y de unos substratos de la
\beta-glucuronidasa.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 3 a 8, caracterizado porque dicho(s)
cromóforo(s) es (son ) escogido(s) en el grupo
constituido por los derivados indoxilo, halógenoindoxilo
(bromoindoxilo, cloroindoxilo, fluoroindoxilo, yodoindoxilo,
dicloroindoxilo, clorobromoindoxilo, triclorindoxilo),
metilindoxilo, y la hidroxiquinolina, en particular entre los
siguientes derivados: 6-cloroindoxilo,
5-bromoindoxilo, 3-bromo indoxilo,
6-fluoroindoxilo, 5 iodoindoxilo,
4,6-dicloroindoxilo, 6,7 dicloroindoxilo,
5-bromo-4 cloroindoxilo,
5-bromo-6-cloroindoxilo,
4,6,7-triclotroindoxilo,
N-metil-indoxilo ó
8-hidroxiquinolina.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el medio de
cultivo contiene también unos factores selectivos para los
microorganismos buscados.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el
microorganismo diana es de la especie Candida.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4 y 7 a 10, caracterizado porque dicho
organismo diana es de la especie Staphylococcus y que dicho
recipiente presenta un fondo coloreado opaco, preferentemente blanco
opaco.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho
microorganismo diana es de la especie Vibrio.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho
microorganismo diana es de la especie de los coliformes y en
particular de las bacterias E. coli enterohemorrágicas.
15. Kit para la detección de microorganismos,
constituido por la combinación de un recipiente que presenta un
fondo coloreado y de un medio de cultivo, siendo escogido el color
de dicho recipiente tal que presenta un contraste útil con el color
de las colonias aisladas.
\newpage
16. Kit según la reivindicación 15,
caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene unos
agentes fluorógenos que liberan unos fluoróforos en presencia de
dichos microorganismos diana.
17. Kit según la reivindicación 15,
caracterizado porque dicho medio de cultivo contiene unos
agentes cromógenos que liberan unos cromóforos en presencia de
dichos microorganismos diana, siendo escogido el color de dicho
recipiente de tal manera que presente un contraste útil con el color
de los cromóforos liberados.
18. Utilización de un recipiente que presenta un
fondo coloreado como soporte en el que se vierte un medio de cultivo
apropiado para el crecimiento de microorganismos, permitiendo el
color de fondo del recipiente un contraste con las colonias de
dichos microorganismos.
19. Utilización según la reivindicación 18,
caracterizada porque dicho medio de cultivo contiene unos
agentes fluorógenos que liberan unos fluoróforos en presencia de
dichos microorganismos diana.
20. Utilización según la reivindicación 18,
caracterizada porque dicho medio de cultivo contiene unos
agentes cromógenos que liberan unos cromóforos después de la acción
de las enzimas específicas presentes en unas cepas de
microorganismos, siendo escogido el color de dicho recipiente de tal
manera que presenta un contraste útil con el color de los cromóforos
liberados.
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