ES2273337T3 - Secuencias de adn codificantes de proteinas humanas tx y ty emparentadas con la enzima de conversion de la interleuquina -1-beta. - Google Patents
Secuencias de adn codificantes de proteinas humanas tx y ty emparentadas con la enzima de conversion de la interleuquina -1-beta. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS HUMANOS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD DE PROTEASA Y CAPAZ DE INDUCIR LA APOPTOSIS, EMPARENTADOS CON LA ENZIMA DE CONVERSION DE LA INTERLEUQUINA-1BETA.
Description
Secuencias de ADN codificantes de proteínas
humanas Tx y Ty emparentadas con la enzima de conversión de la
interleuquina-1beta.
La presente invención se refiere a una secuencia
de ADN codificante de una nueva proteína humana Tx emparentada con
la enzima de conversión de la interleuquina-1beta,
la proteína Tx, su procedimiento de producción, las composiciones
farmacéuticas que la contienen y sus aplicaciones como
medicamentos.
La interleuquina-1beta
(IL-1\beta) es una citoquina
pro-inflamatoria implicada en la patogenia de
múltiples enfermedades inflamatorias agudas o crónicas tal como la
poliartritis reumatoide, las enfermedades inflamatorias de
intestinos o el choque séptico (Dinarello et al., 1992,
Immunological Reviews, 127, 119-146).
Los monocitos y los macrófagos humanos
sintetizan la IL-1\beta en forma de un precursor
inactivo de 31kDa (pIL-1\beta). El
pIL-1\beta no posee secuencia señal convencional y
no puede ser secretado eficazmente por la célula más que después de
un corte entre el ácido aspártico 116 y la alanina 117. Este corte,
que genera la forma IL-1\beta activa de 17kDa, es
efectuado por una enzima específica denominada enzima que convierte
interleuquina-1beta (ICE por sus iniciales en
inglés) (Thornberry et al., 1992, Nature, 356,
768-774; Cerretti et al., 1992, Science, 256,
97-100). Esta enzima ha sido caracterizada en hombre
y en ratón (Nett et al., 1992, Journal of Immunology, 149,
3254-3259; Molineaux et al., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1809-1813). Esta es una
cisteína proteasa única que no presenta homología con las otras
tiol-proteasas conocidas. Posee igualmente una
especificidad particular para ciertos enlaces peptídicos
Asp-X de la pIL-1\beta.
La enzima ICE está compuesta por dos
sub-unidades de 20kDa (p20) y 10kDa (p10) cuya
asociación es necesaria en la actividad enzimática. Estas
sub-unidades provienen de la ruptura proteolítica de
una forma pro-enzima de 45kDa (p45). La enzima ICE
ella misma es capaz de romper su precursor p45 o la forma p30 de 30
kDa, que no posee los 119 aminoácidos de la parte
N-terminal de la pro-enzima, en
forma p20 más p10 activa. La secuencia completa de p45 ha sido
caracterizada por su ADNc así como la secuencia de aminoácidos
(Thornberry et al. ya citado). La caracterización del gen de
la ICE humano ha sido descrita (Cerretti et al., 1994,
Genomics, 20, 468-473).
Trabajos recientes han puesto en evidencia un
rol posible de la ICE en la regulación de la muerte celular
programada o apoptosis (Yuan et al., 1993, Cell, 75,
641-652). En efecto, la ICE presenta una homología
de 28% con Ced-3, una proteína de C. elegans
implicada en la apoptosis, y la sobreexpresión de la ICE murina en
fibroblastos de rata desencadena la apoptosis (Miura et al.,
1993, Cell, 75,653-660). Además, la expresión de la
proteína crmA, una serpina viral inhibidora de la ICE, en neuronas
ganglionarias de pollo transfectadas protege estas células de la
muerte por apoptosis inducida por la supresión del factor de
crecimiento (nerve growth factor) (Gagliardini et al., 1994,
Science, 263, 826-828). Estas observaciones sugieren
que la ICE u homólogas de esta proteína podrían estar implicadas en
la regulación de la muerte celular programada observada
principalmente en las enfermedades neuronales degenerativas tal como
la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson así como las
isquemias cerebrales (Barinaga, M, Science, 259, 762, 1993).
La evidencia de nuevas proteínas emparentadas
con la ICE que juegan un papel bien en la maduración de la
IL-1\beta bien en la apoptosis puede contribuir al
desarrollo de nuevos agentes terapéuticos o diagnósticos en
situaciones en las que están implicadas la
IL-1\beta o la apoptosis.
Una proteína similar a la enzima que convierte
IL-1beta (ICE) está codificada por el gen Nedd2 de
ratón (Kumar et al., Genes & Dev.
8:1613-1626, 1994).
Se han descrito
cisteína-proteasas de la misma familia después la
fecha de prioridad de la presente solicitud de patente (Munday et
al., J.Biol.Chem 270;15870-15876, número del 30
junio 1995).
La presente invención se refiere una nueva
proteína humana Tx que presenta una homología de 52% aproximadamente
con el precursor humano p45 de la ICE y que no permite la maduración
del precursor de la IL-1\beta en citoquina activa.
La proteína Tx posee dos funciones inesperadas: por una parte, es
una proteasa y es capaz principalmente de romper el precursor p30 de
la ICE en sub-unidades p10 y p20 y por otra parte,
es capaz de inducir la apoptosis en células, por ejemplo en células
Cos transfectadas.
Estas propiedades biológicas permiten prever la
utilización de la proteína Tx en el tratamiento de situaciones
patológicas que responden a la IL-1\beta o en las
que interviene la apoptosis.
La presente invención se refiere también a una
nueva proteína humana Ty que presenta una homología superior a 70%
con la proteína Tx. La proteína Ty es capaz de inducir la apoptosis
en células, por ejemplo células Cos transfectadas. La proteína Ty es
una proteasa que es capaz de autoromperse de manera
intermolecular.
La presente invención tiene por objetivo por lo
tanto una secuencia de ADN codificante de un polipéptido humano que
tiene una actividad proteasa y que tiene la secuencia nucleotídida
de la secuencia SEQ ID Nº 1:
así como una secuencia de ADN
codificante de un polipéptido humano que tiene la capacidad de
inducir la apoptosis y que tiene la secuencia nucleotídida de la
secuencia SEQ ID Nº 1
anterior.
La invención tiene por objetivo particularmente
una secuencia de ADN codificante de un polipéptido humano que tiene
una actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que tiene
la secuencia nucleotídida de la secuencia SEQ ID Nº 1 anterior.
La secuencia de ADN anterior que codifica una
proteína que tiene 377 aminoácidos es una secuencia de ADNc que
puede obtenerse por amplificación mediante PCR, a partir de ARN de
monocitos activados por el LPS o de polinucleares o de placenta
humanos, gracias a oligonucleótidos derivados de la secuencia de la
ICE y de la secuencia de genes homólogos previamente identificados,
según condiciones operatorias de la que se da una descripción
detallada más adelante.
La evidencia de la actividad proteasa así como
la de la capacidad para inducir la apoptosis se ilustran más
adelante en la parte experimental.
La patente describe principalmente una secuencia
de ADN que codifica un polipéptido humano que tiene una actividad
proteasa y capaz de inducir la apoptosis que tiene la secuencia que
comienza en el nucleótido 42 y que termina en el nucleótido 1172 de
la secuencia SEQ ID Nº 1 así como las secuencias de ADN que hibridan
con esta y que tiene las misma función.
Por secuencias que hibridan, se incluyen las
secuencias de ADN que hibridan bajo las condiciones de fuerte
estringencia y que codifican un polipéptido que tiene la misma
actividad. Las condiciones de estringencia comprenden por ejemplo
una hibridación a 65ºC, durante 18 horas en una solución 5X SSPE;
10X Denhardt; 100 \mug/ml DNAss; 1% SDS seguida de 3 lavados
durante 5 minutos con 2X SSC; 0,05% SDS, luego 3 lavados durante 15
minutos a 65ºC en 1X SSC; 0,1% SDS, según Maniatis et al.,
Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
El conocimiento de la secuencia SEQ ID Nº 1
permite reproducir la presente invención por ejemplo mediante
métodos conocidos de síntesis química o por cribado de un banco
genómico o de un banco de ADNc con ayuda de sondas de
oligonucleótidos de síntesis mediante las técnicas conocidas de
hibridación.
La invención se refiere también a un polipéptido
humano que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la
apoptosis y que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia
SEQ ID Nº 2
así como los alelos y los análogos
de esta
secuencia.
Por alelos y análogos, se incluyen las
secuencias modificadas por sustitución, deleción o adición de uno o
varios aminoácidos aunque estos productos conserven la misma
función.
La invención tiene por objetivo especialmente el
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia
SEQ ID Nº 2 y designada proteína Tx.
Uno de los aspectos de la invención se refiere
igualmente a un polipéptido según la invención tal como se ha
obtenido por la expresión en una célula huésped de un ADN
codificante para la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID
Nº 2.
Cuando el polipéptido de la invención se obtiene
por expresión en una célula huésped, esta se realiza según los
métodos conocidos de ingeniería genética y de cultivo celular.
La expresión puede realizarse en una célula
procariota, por ejemplo E. coli o en una célula eucariota,
por ejemplo una célula Cos que contiene la secuencia de ADN
codificante del polipéptido de la invención precedida de una
secuencia promotora conveniente.
La invención se refiere principalmente a un
polipéptido según la invención tal como se ha obtenido por la
expresión en una célula huésped eucariota.
La invención se refiere más especialmente a un
polipéptido según la invención cuya actividad proteasa corresponde a
la capacidad de madurar la enzima de conversión de la
IL-1beta. Un ejemplo de determinación de esta
actividad proteasa particular se describe más adelante.
La invención tiene también por objetivo un
vector de expresión que comprende una secuencia de ADN codificante
de un polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de
inducir la apoptosis así como una célula huésped transformada por un
vector anterior.
Los vectores de expresión son vectores conocidos
que permiten la expresión de la proteína bajo el control de un
promotor conveniente. Para las células procariotas, el promotor
puede ser por ejemplo el promotor lac, el promotor trp, el promotor
tac, el promotor \beta-lactamasa o el promotor PL.
Para las células de levadura, el promotor puede ser por ejemplo el
promotor PGK o el promotor AD. Para las células de mamíferos, el
promotor puede ser por ejemplo el promotor SV40 o los promotores de
adenovirus. Vectores de tipo Baculovirus pueden utilizarse también
para la expresión en células de insectos.
Las células huésped son por ejemplo células
procariotas o de células eucariotas. Las células procariotas son por
ejemplo E. coli, Bacillus o Streptomices. Las células huésped
eucariotas comprenden levaduras así como células de organismos
superiores, por ejemplo células de mamíferos o de células de
insectos. Las células de mamíferos son por ejemplo fibroblastos
tales como células CHO o BHK de hámster y de células Cos de mono.
Las células de insectos son por ejemplo células SF9.
La invención se refiere a un procedimiento que
comprende la expresión de la proteína Tx en una célula huésped
transformada por un ADN codificante de la secuencia de aminoácidos
de la secuencia SEQ ID Nº 2 y principalmente un procedimiento en el
que la célula huésped es una célula eucariota.
La patente describe también anticuerpos
dirigidos contra el polipéptido según la invención.
Los anticuerpos policlonales o monoclonales de
la invención pueden prepararse según los métodos conocidos y pueden
utilizarse por ejemplo para la valoración de la proteína Tx, por
ejemplo en un ensayo ELISA y como agentes de diagnóstico.
La nueva proteína Tx de la invención tiene
propiedades biológicas remarcables, en particular una actividad
proteasa, principalmente la capacidad para madurar la enzima de
conversión de la IL-1beta así como la capacidad para
inducir la apoptosis, como muestran los resultados dados más
adelante.
Estas propiedades biológicas hacen la proteína
Tx de la invención utilizable por ejemplo en el tratamiento de
enfermedades autoinmunes, en la cicatrización de llagas o en la
reducción de efectos secundarios de los tratamientos por irradiación
en los que la Il-1\beta está implicada o por
ejemplo en el campo de cánceres y de la infección en las que
interviene la apoptosis.
La presente invención tiene por lo tanto por
objetivo, a título de medicamento, el polipéptido según la
invención.
La invención se extiende a las composiciones
farmacéuticas que contienen como principio activo un medicamento
definido anteriormente y se refiere particularmente a las
composiciones farmacéuticas para modular la producción de
IL-1 beta o para modular la apoptosis.
El principio activo puede incorporarse a
excipientes usuales para la preparación de composiciones
farmacéuticas anteriores. Las composiciones pueden administrarse por
vía parenteral, oral o local.
Los polipéptidos de la invención también
permiten proyectar nuevos agentes terapéuticos constituidos por
inhibidores de estos polipéptidos y su utilización como medicamento,
por ejemplo en el tratamiento de la inflamación asociada a
enfermedades autoinmunes, el choque séptico o las enfermedades
neurodegenerativas.
La invención se refiere también a una secuencia
de ADN hibridante con la secuencia de ADN que comienza en el
nucleótido 42 y que se termina en el nucleótido 1172 de la secuencia
SEQ ID Nº 1 y que tiene la misma función.
La hibridación se obtiene por ejemplo en un
tampón 5xSSC, 10xDenhardt, 100 microg/ml ADN de esperma de salmón,
1% SDS durante una noche a 65ºC. Los lavados se efectúan a
continuación por ejemplo en un tampón 1xSSC, 0,1% SDS, dos veces 30
mn a 60ºC.
La invención se refiere particularmente a la
secuencia de ADN codificante de un polipéptido que tiene una
actividad proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que tiene la
secuencia nucleotídida de la secuencia SEQ ID Nº 22 y más
particularmente la secuencia que comienza en el nucleótido 104 y que
se termina en el nucleótido 1195 de la secuencia SEQ ID Nº 22.
La secuencia de ADN SEQ ID Nº 22 anterior, que
codifica una proteína que tiene 364 aminoácidos, es una secuencia de
ADNc que puede obtenerse, por ejemplo, por amplificación mediante
PCR, a partir de ADNc de rata o de placenta humana, gracias a
oligonucleótidos derivados de la secuencia ADNc Tx (SEQ ID Nº 1). Un
ejemplo detallado de preparación se da más adelante en la parte
experimental. El conocimiento de la secuencia SEQ ID Nº 22 permite
reproducir la presente invención por ejemplo mediante métodos
conocidos de síntesis química o de cribado de bancos genómicos o de
bancos de ADNc con ayuda de sondas de oligonucleótidos de síntesis
mediante las técnicas de hibridación.
La invención tiene igualmente por objetivo un
polipéptido humano que tiene una actividad proteasa y capaz de
inducir la apoptosis y que tiene la secuencia de aminoácidos de la
secuencia SEQ ID Nº 23 y designada proteína Ty.
Uno de los aspectos de la invención se refiere
igualmente a un polipéptido según la invención tal como se ha
obtenido por la expresión en una célula huésped de un ADN
codificante para la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID
Nº 23.
La invención se refiere también a las células
huésped, los vectores de expresión que permiten obtener la expresión
de la proteína Ty y cuyos ejemplos se han indicados anteriormente
para la expresión de la proteína Tx.
La invención se refiere también a un
procedimiento que comprende la expresión de la proteína Ty en una
célula huésped transformada por un ADN codificante para la secuencia
de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 23.
La invención se refiere también a los
anticuerpos policlonales o los anticuerpos monoclonales dirigidos
contra la proteína Ty.
La invención se refiere también a las
composiciones farmacéuticas que encierran la proteína Ty a título de
medicamento.
Las figuras anexas ilustran ciertos aspectos de
la invención:
La figura 1 representa la detección de
secuencias homólogas a la ICE mediante Southern Blot en el ADN
genómico humano derivado de PBMC digerido por las enzimas de
restricción BglII (línea A); PstI (línea B); HindIII (línea C);
BamHl (línea D). La detección se hace por hibridación con una sonda
ICE exón 6 marcada con ^{32}P.
La figura 2 representa la secuencia nucleotídida
del exón 6 del gen T2 (SEQ ID Nº 5).
La figura 3 representa la secuencia nucleotídida
del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) y la secuencia de aminoácidos
correspondiente (SEQ ID Nº 2).
La figura 4 representa la detección de ARNm Tx
por Northern Blot en los tejidos de la rata (línea A); del timo
(línea B); de la próstata (línea C); de testículo (línea D); de
ovario (línea E); del intestino delgado (línea F); de colon (línea
G); de leucocitos periféricos (línea H). La detección se hace por
hibridación con una sonda Tx exón 6'' marcada con ^{32}P.
La figura 5 representa la secreción de la
IL-1\beta madura en las células
Cos-1 que contienen constitutivamente el
pIL-1\beta y transfectadas con el vector
pcDL-SR\alpha296 que contiene ICE p45 (línea 2) o
Tx (línea 3), el vector pcDL-SR\alpha296 solo
(línea 4), el vector pcDNAI/Amp solo (línea 5), el vector pcDNAI/Amp
que contiene Tx (línea 6) o ICE p30 (línea 7) comparativamente con
un cultivo control sin ADN (línea 1). La IL-1\beta
madura se mide en pg/ml de líquido sobrenadante celular por ELISA
(A: incubación 16 horas; B : incubación 24 horas;
La figura 6 representa la ruptura del precursor
ICE p30 en células Cos-1 transfectadas por el vector
pcDL-SR\alpha296 solo (línea A) o que contiene el
mutante marcado T7-ICEp30C285S (línea B) o
cotransfectadas con el vector pcDL-SR\alpha296 que
contiene el mutante T7-ICEp30C285S y el vector que
contiene ICE p30 (línea C) o ICE p45 (línea D) o Tx (línea E). La
detección se hace por Western Blot con el anticuerpo
anti-T7 con un control que corresponde a una
transfección por el vector pcDL-SR\alpha296 que
contiene Tx solo (línea F).
La figura 7 representa la inducción de la
apoptosis por la proteína Tx en células Cos-1
transfectadas por el vector pcDL-SR\alpha296 solo
(7B) o que contiene Tx (7C) o ICE p45 (7D) comparativamente con un
cultivo control sin ADN (7A) después de un cultivo de 22 horas
(crecimiento x 400).
La figura 8 representa el ADN de las células
Cos-1 transfectadas por el vector
pcDL-SR\alpha296 que contiene ICE p45 (línea B) o
Tx (línea C) o por el vector solo (línea D) comparativamente con un
cultivo control sin ADN (línea A). La detección se hace por
coloración con BET después de migración sobre un gel de agarosa con
marcadores de tamaño ADN de fago lambda digerido por HindIII (Ml) y
ADN de fago \PhiX174 digerido por HindIII
(M2).
(M2).
La figura 9 representa la ruptura de la proteína
Ty mutada (T7TY\Delta67C245S) sin células Cos-1,
bien transfectadas por el vector pcDL-SR\alpha296
solo (línea B) o el vector pcDNAI/Amp solo (línea C) o el vector
pT7TY\Delta67C245S (línea E), bien
co-transfectadas por el vector pT7TY y el vector
pT7TY\Delta67C245S (línea F; 23 horas y línea G; 43 horas). La
detección se hace por Western Blot comparativamente con un cultivo
control sin ADN (línea A) y marcadores de pesos moleculares (línea
D; no detectables).
Los ejemplos siguientes ilustran la invención,
sin limitarla.
Se han identificado genes homólogos a ICE
mediante Southern Blot al utilizar una sonda de ADN que corresponde
al exón 6 del gen de ICE.
Se han descrito los límites del exón 6 de ICE
humano así como la organización intrón/exón completa del gen ICE
humano (Cerretti et al. ya citado). El exón 6 (235 pb)
corresponde a los nucleótidos 635 a 868 de la secuencia ADNc p45 de
la ICE descrita (Thornberry et al. ya citado).
La sonda ICE exón 6 se preparó por amplificación
por PCR con los oligonucleótidos siguientes:
que se eligieron al utilizar los
datos publicados (Thornberry et al. ya citado), sintetizados
y utilizados para amplificar por RT-PCR el ARN que
proviene de monocitos sanguíneos humanos, extraído y purificado con
ayuda de un kit RNA™ (Bioprobe), al utilizar las condiciones de
amplificación siguientes: enzima Biotaq (BioProbe); 30 ciclos (94ºC,
1 mn; 60ºC, 1 C 72ºC, lmn); Aparato PCR:
Perkin-Elmer (GeneAmp PCRSystem
9600).
El ADN exón 6 obtenido se purificó por
centrifugación sobre columna Spin X (Costar) y se marcó con ^{32}P
mediante la técnica de cebado aleatorio ("random priming") por
medio de un kit oligolabelling (Pharmacia Biotech).
La sonda ICE exón 6 radiomarcada obtenida se
utilizó como sonda de hibridación sobre un ADN genómico humano.
El ADN genómico humano se preparó a partir de
células mononucléicas de sangre periférica (PBMC) con el kit
TurboGen (Invitrogen) luego se cortó respectivamente con las enzimas
de restricción BglII, PstI, HindIII o BamHI (Boehringer Mannheim),
se migró sobre un gel de agarosa 0,9% en 1x TAE, se transfirió sobre
una membrana de nylon GeneScreen Plus (NEN Dupont) luego se hibridó
con la sonda ICE exón 6.
Las condiciones de hibridación son las descritas
por Maniatis et al. (ya citado) realizadas en 5x SSPE, 10x
Denhart, 100 \mug/ml DNAss, 1% SDS, una noche a 65ºC seguido de
lavados realizados sucesivamente en 2x SSC, 0,05% SDS, 30 mn a
temperatura ambiente luego 1x SSC, 0,1% SDS, 30 mn a 65ºC, lo que
corresponde a una fuerte estringencia. El tampón de lavado se
preparó a partir de soluciones almacenadas siguientes
- -
- 20x SSC: solución acuosa de cloruro de sodio 3M, citrato de sodio 0,3 M
- -
- 10% SDS: solución acuosa de dodecil-sulfato de sodio, Después de lavar, la membrana se expuso con una película Hyperfilm-MP (Amersham).
Como lo muestra la figura 1, para cada una de
las enzimas de restricción se observaron tres a cuatro bandas
diferentes que correspondían a fragmentos de ADN de tamaño diferente
que aparentemente, para algunos de ellos, correspondían a genes
fuertemente homólogos a la ICE pero diferentes de este último ya que
un gen único no puede dar más que uno o como máximo dos bandas
distintas durante una hibridación con una sonda correspondiente a un
solo exón.
Para identificar los diferentes fragmentos de
ADN obtenidos anteriormente, los fragmentos del ADN genómico humano
extraído de células mononucléicas de sangre periférica (PBMC) luego
digerido por la enzima HindIII (Boehringer Mannheim) se prepararon
por electroforesis preparativa en gel de agarosa 1,5%, 1x TAE, según
las condiciones descritas por Maniatis et al. (ya citado). El
gel se cortó en 20 fracciones en la zona correspondiente a pesos
moleculares inferiores a 2,3kb luego se efectuó una amplificación
por PCR sobre el ADN eluido de cada una de las fracciones con ayuda
de oligonucleótidos ICE 6.5 (SEQ ID Nº 3) e ICE 6.3 (SEQ ID Nº 4)
descritos anteriormente, al utilizar las condiciones de
amplificación siguientes: 94ºC, 1 mn; 55ºC, 1 mn; 72ºC, 1 mn; 30
ciclos; polimerasa BioTaq.
Entre las 20 fracciones anteriores, se
retuvieron ocho fracciones que dieron la mejor amplificación por
PCR. El material amplificado se clonó gracias a la enzima
T4-DNA ligasa en el vector pCRII según las
instrucciones del proveedor con el kit TA Cloning (Invitrogen) y
secuencia mediante la técnica de Sanger con la enzima Sequenasa al
utilizar el material de electroforesis Macrophor (Pharmacia System).
Las secuencias determinadas se analizaron por medio de programas
informáticos GCG (Devereux et al. Nucleic Acids Research 12,
387-395 (1984)).
Entre las secuencias nucleotídida obtenidas,
identificamos una secuencia denominada T2 que presentaba 92% de
identidad en nucleótidos con la secuencia del exón 6 de ICE.
La secuencia nucleotídida T2 presentaba una fase
de lectura abierta sobre el conjunto del exón 6 (SEQ ID Nº 5)
representado en la figura 2, que conducía a buscar a identificar ARN
mensajeros que codifican una proteína T2 y a clonar el ADNc
correspondiente a T2.
Los ARN totales se extrajeron y purificaron con
ayuda de un kit RNA™ (Bioprobe) a partir, bien de monocitos
activados por LPS durante 18 horas, bien de placenta, bien de
polinucleares aislados de sangre periférica. Cada ADNc
correspondiente se sintetizó con ayuda de un oligonucleótido
poli-dT y de la enzima transcriptasa reversa al
utilizar el Kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer) según las
instrucciones del proveedor luego se amplificó por PCR al utilizar
los dos oligonucleótidos siguientes:
elegido en la secuencia codificante
del exón 6 de T2, de manera a amplificar específicamente una
secuencia de tipo T2 pero no una secuencia ICE,
y
elegido en el extremo 3' de la
región codificante del ADNc de ICE (hebra
complementaria).
Se obtuvo aproximadamente un fragmento de 600
pares de bases respectivamente a partir de cada una de las 3
preparaciones de ARN al utilizar las condiciones de amplificación
siguientes: 94ºC, 30 s; 60ºC, 30 s; 72ºC, 30 s; 30 ciclos con el Kit
GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer). Se clonó el fragmento al utilizar el
kit TA Cloning (Invitrogen) y se secuenció como se ha indicado
anteriormente. La secuencia nucleotídica así determinada no
corresponde a un ADNc T2 esperado sino a un nuevo ADNc que hemos
denominado Tx.
Las secuencias nucleotídicas de los extremos 5'
y 3' del ADNc de Tx se obtuvieron mediante la técnica PCR anclada a
partir de un ADNc de placenta.
El extremo 5' del ADNc de Tx se amplificó
utilizando el kit 5'-Race-Ready cDNA
(Human Quick-Clone cDNA) (Clontech) y los
oligonucleótidos de amplificación siguientes:
El extremo 3' del ADNc Tx se amplificó al
utilizar el kit 3' RACE System (Gibco-BRL), y los
oligonucleótidos de amplificación siguientes:
Estos dos pares de iniciadores respectivos se
definieron a partir de la secuencia parcial de Tx obtenida
anteriormente.
Los fragmentos de amplificación obtenidos se
clonaron luego al utilizar el kit TA Cloning (Invitrogen) y se
secuenciaron como se ha indicado anteriormente.
Las secuencias nucleotídicas se confirmaron
gracias a la utilización de oligonucleótidos TxA (SEQ ID Nº 10) y
TxB (SEQ ID Nº 11) anteriores y los oligonucleótidos siguientes:
que se eligieron en la secuencia
codificante de Tx (hebra codificante o hebra
complementaria).
La compilación del conjunto de las secuencias
obtenidas da la secuencia nucleotídica consensus del ADNc Tx (SEQ ID
Nº 1) representada en la figura 3. La secuencia así determinada
comprende 1291 nucleótidos que terminan por una secuencia de
poliadenilación. Presenta una fase de lectura abierta que comienza
por una metionina iniciadora en el nucleótido 42 y que termina por
un codón de terminación en el nucleótido 1172. Resulta una fase de
lectura abierta de 1131 nucleótidos codificante de una proteína de
377 aminoácidos.
La región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1)
se amplificó por RT-PCR a partir de ARN total bien
de monocitos, bien de polinucleares o bien de placenta al utilizar
los oligonucleótidos siguientes:
Estos iniciadores de amplificación se eligieron
según la secuencia consensus ADNc Tx determinada precedentemente (o
la hebra complementaria) y sintetizados al añadir sitios de clonage
respectivamente BamHl y Nco1 para el oligonucleótido TxP5 y Xba1 y
Xhol para el oligonucleótido TxP3.
El producto amplificado obtenido que tenía una
longitud de aproximadamente 1150 pares de bases fue digerido por las
enzimas BamHl y Xbal (Boehringer Mannheim) y clonó, al utilizar el
kit de ligación Amersham, en el vector pcDNAI/Amp (Invitrogen)
previamente digerido por las mismas enzimas de restricción BamH1 y
Xba1. El producto clonado fue enteramente secuenciado sobre las dos
hebras, por medio de los oligonucleótidos TxA, TxB, TxC, TxD, Tx1,
Tx2, Tx3, Tx4, Tx5 y Tx6 anteriores.
Para cada ARN de partida utilizado, la secuencia
nucleotídica obtenida fue idéntica a la secuencia codificante de la
secuencia consensus ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) anterior. No se observó
por lo tanto diferencia a partir de diferentes tejidos utilizados
que provenían de individuos diferentes.
La región codificante del ADNc Tx codificó la
proteína Tx cuya la secuencia deducida en aminoácidos (SEQ ID Nº 2)
se muestra en la figura 3. La secuencia de la proteína Tx comprende
377 aminoácidos que tienen un peso molecular calculado de 43,26
kDa.
La homología de la secuencia de la proteína Tx
con el precursor ICE p45 es como máximo de 52% de identidad en
aminoácidos al introducir discontinuidades en la alineación de las
secuencias.
Una muestra de E. coli
XL-1 azul que contenía la región codificante del
ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) en el vector pcDNAI/Amp (cDNA Tx/pcDNAI
13/07/94) se depositó en la CNCM el 29 julio 1994 bajo el número
I-1462.
Se ha estudiado la expresión del ARNm
codificante de la proteína Tx en ocho tejidos diferentes por
Northern Blot al utilizar una sonda de ADN correspondiente a la
parte de Tx que se alinea con el exón 6 de la ICE ("Tx exón
6"). Esta sonda corresponde a los nucleótidos 595 a 811 de la
secuencia SEQ ID Nº 1.
La sonda "Tx exón 6" se preparó al
amplificar esta secuencia a partir del plásmido que contenía el ADNc
Tx al utilizar como iniciadores los oligonucleótidos T2.A (SEQ ID Nº
6) y TxC (SEQ ID Nº 12) anteriores.
Esta sonda se marcó con ^{32}P mediante el
método de cebado aleatorio "random priming" con el kit
Oligolabelling (Pharmacia BioTech) luego se utilizó para detectar
por hibridación ARNm Tx sobre una membrana que contenía 2 \mug de
ARN poliA+ respectivamente de diferentes tejidos humanos sobre una
membrana Multiple Tissue Northern Blot II (Clontech) según las
condiciones de hibridación dadas por el proveedor.
Como lo muestra la figura 4, se detectó una
señal de ARNm en la mayoría de los tejidos ensayados con
intensidades variables. Los leucocitos de la sangre periférica (H)
dan la señal más fuerte. La rata (A), el intestino delgado (F), el
timo (B) y el ovario (E) dan señales intermedias. La próstata (C) y
el colon (G) dan una señal muy débil y finalmente no se detectó
ninguna señal en el ARNm de testículo (D).
El ARNm que codifica la proteína Tx se expresa
por lo tanto en numerosos tejidos y más particularmente en las
células sanguíneas.
La capacidad de la proteína Tx para romper
eventualmente el precursor de IL-1\beta humaine se
ensayó en un sistema de transfección en células eucariotas con uno u
otro de los vectores de expresión pcDNAI/Amp y
pcDL-SR\alpha296.
La región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1)
se clonó primero en los sitios BamHl y Xbal del vector de expresión
eucariota pcDNAI/Amp (Invitrogen). Después de digestión con las
enzimas BamHl y Xbal, se aisló un inserto de 1150 pares de bases
aproximadamente y luego se purificó. Los sitios de restricción de
los extremos se rellenaron con ayuda de la T4 DNA Polimerasa
(Boehringer Mannheim). El ADNc obtenido se subclonó con ayuda de un
kit de ligación (Amersham) en el vector
pcDL-SR\alpha296 (Takebe et al., Molecular
and Cellular Biology, Vol 8, 466, 1988) abierto por la enzima Xbal
luego cuyos extremos se rellenaron con la T4 DNA Polimerasa.
Después de purificación al utilizar el kit plasmid maxi (QIAGEN), se
obtuvieron preparaciones de ADN plasmídico Tx en los dos
vectores.
Las células eucariotas utilizadas para la
transfección son una línea celular Cos-1 que expresa
constitutivamente la pIL-1\beta y que se ha
obtenido por transfección de un plásmido que contenía el gen de la
pIL-1\beta humana. La síntesis de
pIL-1\beta se mantuvo en esta línea al cultivar
las células en presencia de 0,5 mg/ml de sulfato de
G-418 en el medio de cultivo DMEM, SVF 10%,
glutamina, P/S, piruvato, HEPES.
Se incubaron 3x10^{6} células
Cos-1 a 37ºC en atmósfera húmeda a 5% de CO_{2} en
la cajas Petri y se transfectaron con 15 \mug de ADN plasmídico
previamente mezclado con 200 \mul de DEAE-Dextran
y diluido con 4 ml de PBS antes de ser añadido a las cajas. Después
de incubación de las células a 37ºC durante 30 minutos y adición de
8 ml de una solución de cloroquina 80 \muM en DMEM sin suero, las
células se incubaron durante 2,5 horas. La solución sobrenadante se
aspiró luego y las células se trataron durante dos minutos con DMSO
a 10% en DMEM sin suero. Después de lavar con el medio sin suero, se
añadieron 10 ml de medio de cultivo completo anterior. Después de
incubación, el líquido sobrenadante de las células transfectadas se
recogió a diferentes tiempos comprendidos entre 16 y 45
horas.
horas.
El IL-1\beta maduro presente
en los líquidos sobrenadantes se midió mediante un ensayo ELISA
IL1-\beta (R&D Systems) que permitió la
detección específica del IL-1\beta maduro.
La transfección se realizó con la región
codificante del ADNc Tx insertado en uno u otro de los dos vectores
anteriores en comparación con transfecciones que comprenden
respectivamente la región codificante del ADNc de ICE p45 o de ICE
p30 así como una transfección testigo con el vector solo
correspondiente que no contenía plásmido.
Como lo muestra el testigo 5, la transfección
del ADNc de la ICE p45 (columna 2) o p30 (columna 7) confirió a las
células la capacidad de secretar IL-1\beta maduro.
Por el contrario, cuando el ADNc Tx es transfectado en las mismas
condiciones (columnas 3 y 6), no se observó
IL-1\beta secretada como para las transfecciones
controles (columnas 1, 4, 5). Se obtuvieron resultados similares con
los dos vectores de expresión cualquiera que fuera el tiempo de
incubación (16 h: fig. 5A; 24 h: fig. 5B; 29 h y hasta 44 h) después
de la transfección.
La proteína Tx no posee la propiedad de
convertasa del IL-1\beta.
La capacidad de la proteína Tx para romper
eventualmente el precursor 30 kDa de la ICE (ICE p30) se ensayó en
un sistema de co-transfección en células eucariotas
al introducir simultáneamente en células Cos-l un
vecteur que contenía la región codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1)
y un vector que contenía un ADN codificante de una proteína ICE
modificada, insertándose cada ADN respectivamente en el vector de
expresión pcDL-SR\alpha296 anterior.
La proteína ICE se modificó doblemente: Por una
parte, para permitir una detección específica de la proteína ICE en
presencia de la proteína Tx, se fusionó un pequeño péptido T7 en el
extremo N terminal de la proteína ICE p30. La proteína así marcada o
sus productos de maduración se detecta mediante Western Blotting con
un anticuerpo monoclonal específico del péptido T7 (Tsai et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 8864, 1992). Por otra parte
para expresar la enzima en una forma incapaz de inducir su propia
maduración, se utilizó un mutante de la ICE p30, cuya cisteína Cys
285 del sitio activo se reemplazó por una serina (Wilson, K.P. et
al. Nature, 370, 28 July 1994, 270-275). Esta
enzima es entonces inactiva e incapaz de inducir su propia
maduración o de romper la pIL-1\beta. El mutante
se preparó por mutagénesis con ayuda de oligonucleótidos apropiados
y del kit de mutagénesis Transformer™ site-directed
mutagénesis kit (Clontech). La secuencia obtenida se verificó
enteramente. Se obtuvo así la ICE p30 marcada y mutada designada
T7-ICEp30C285S.
Las células Cos-1 se
transfectaron bien por el vector pcDL-SR\alpha296
que contenía T7-ICEp30C285S, bien por el vector
pcDL-SR\alpha296 que contenía Tx o
co-transfectaron por los dos vectores, siguiendo las
condiciones operatorias anteriores. Después de 22 horas de cultivo,
las células se recogieron, se lavaron y se lisaron en un tampón NaCl
10mM, Hepes 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaF 50-mM,
Triton X-100 0,2%, leupeptina 1 \mug/ml,
aprotinina 20 u/\mul y PMSF 1 mM. El lisado celular se centrifugó
a 400 g y 4ºC luego el líquido sobrenadante se sometió a una
electroforesis sobre un gel con 16% de poliacrilamida en
SDS-PAGE. Las proteínas del gel se transfirieron
luego sobre una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con el
anticuerpo monoclonal de ratón anti-T7 (Novagen)
durante 2 horas a temperatura ambiente. La membrana se lavó luego se
incubó 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo de cabra
anti-immunoglobulina de ratón conjugado a la
fosfatasa alcalina. Los anticuerpos fijados a la membrana se
revelaron luego por el sustrato de la fosfatasa alcalina
(Promega).
Se realizaron co-transfecciones
de la misma manera con el vector pcDL-SR\alpha296
que contenía T7-ICEp30C285S y el vector
pcDL-SR\alpha296 que contenía bien ICE p30, bien
ICE p45 en lugar de Tx.
Como lo muestra la figura 6, cuando la proteína
ICE p30 mutada (T7-ICEp30C285S) se expresó sola en
las células Cos transfectadas, la forma T7-p30 de la
enzima (PM aparente 35 kDa) puede detectarse (línea B).
La ausencia de banda correspondiente a la forma
p20 mostró que la enzima mutada es incapaz de romperse. Cuando las
células se co-transfectaron con el vector que
contenía la enzima ICE p30 (línea C) o p45 (línea D), se observó una
banda a un PM aparente de 26 kDa correspondiente al producto de
ruptura T7-p20 por la enzima activa. Cuando las
células se co-transfectaron con el vector que
contenía Tx (línea E), se observó igualmente la aparición de una
banda mayoritaria con un PM aparente de 26 kDa acompañado de dos
bandas menores a aproximadamente 31 kDa y 28 kDa. Las diferentes
bandas correspondían a los productos de ruptura de la forma p30 de
la ICE por la proteína Tx expresada en las células.
Estos resultados mostraron que la proteína Tx,
se expresa por una parte en las células Cos tranfectadas, por otra
parte posee una actividad proteasa. Además, la proteína Tx es capaz
de romper el precursor 30 kDa de la ICE y puede así contribuir a la
maduración in vivo de la pro-enzima de la ICE
y a la generación de la enzima en forma
activa.
activa.
La capacidad de la proteína Tx a inducir la
apoptosis se ensayó por transfección en células Cos y por examen
morfológico de las células cultivadas.
Se ha descrito la transfección de la ICE en
diferentes tipos celulares que conllevan la muerte de estas células
por apoptosis (Miura et al. ya citado).
Se realizó la transfección de células
Cos-1 por el vector
pcDL-SR\alpha296 que contenía la región
codificante del ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) así como la transfección con
el vector pcDL-SR\alpha296 que contenía ICE p45
como se ha descrito anteriormente. La morfología de las células se
observó después de una incubación de 22 horas.
Como muestra la figura 7, se observó la
aparición de células redondas que se desprendían del soporte y cuyo
aspecto morfológico es característico de células en apoptosis en los
cultivos de células Cos transfectadas con el ADNc de la ICE (7D). El
mismo cambio de morfología se observó en los cultivos de células Cos
transfectadas con el ADNc Tx (7C).
Se obtuvieron resultados morfológicos idénticos
cuando se utilizó el vector pcDNAI/Amp anterior para expresar ICE y
Tx en las células Cos-1 transfectadas.
Estos resultados se han confirmado por la
observación del ADN aislado a partir de células
Cos-1 transfectadas e incubadas 40 horas después de
la transfección. El ADN de las células se preparó con el kit
microTurboGen (Invitrogen), migrado sobre gel de agarosa 1,5% y se
coloreó con BET.
Como muestra la figura 8, el ADN de las células
transfectadas por ICE p45 (línea B) y por Tx (línea C) presenta el
aspecto característico "en escalera" de células en
apoptosis.
Células transfectadas sin ADN (7A y 8A) o con el
vector que no contenía ADNc (7B y 8D) no presenta ni la morfología
ni el ADN de células en apoptosis.
Estos resultados muestran que la proteína Tx
está implicada en la inducción de la apoptosis.
El ADN genómico humano extraído de células
mononucleares de sangre periférica fue digerido por el enzima Hind
III (Boehringer Mannheim), luego los fragmentos se separaron por
electroforesis preparativa en gel de agarosa 1%, TAE 1x, según las
condiciones descritas por Maniatis et al., ya citado. El gel
se cortó en 24 fracciones en la zona de los pozos de depósito que
correspondía a pesos moleculares superiores a 1,9kb luego se efectuó
una amplificación por PCR sobre el ADN eluido de cada una de las
fracciones con ayuda de oligonucleótidos T2A (SEQ ID Nº 6) e TxC
(SEQ ID Nº 12) ya descritos y al utilizar las condiciones de
amplificación siguientes: 94ºC, 30 sec; 55ºC, 30 sec; 72ºC, 1 mn;
30 ciclos; polimerasa BioTaq (BioProbe).
Entre las 24 fracciones anteriores, se
retuvieron 10 fracciones que dieron la mejor amplificación por PCR.
El material amplificado se purificó sobre gel de agarosa y se clonó
en el vector pCRII con el kit TA Cloning (Invitrogen) y se secuenció
por la técnica de Sanger con la enzima Sequenasa (Version 2.0 DNA
Sequencing Kit) al utilizar el sistema de electroforesis Macrophor
(Pharmacia System). Las secuencias determinadas se analizaron por
medio de programas informáticos GCG como se indica en el ejemplo
1.
Hemos identificado una secuencia nucleotídica
denominada Ty que presenta 94,9% de identidad en nucleótidos con la
secuencia ADNc Tx (SEQ ID Nº 1) y que conduce a buscar a clonar el
ADNc correspondiente a Ty.
Las secuencias nucleotídicas de los extremos 5'
y 3' del ADNc de Ty se obtuvieron respectivamente a partir de ADNc
de rata y de placenta humana mediante la técnica PCR anclada.
El extremo 3' del ADNc de Ty se amplificó al
utilizar el kit 3' RACE System (Gibco-BRL), y los
oligonucleótidos de amplificación siguientes:
Estos dos iniciadores se definieron a partir de
la secuencia parcial del exón 6 de la secuencia Ty obtenida
anteriormente.6 Los fragmentos amplificados se purificaron sobre gel
de agarosa, se clonaron en el vector pCRII y se secuenciaron como se
ha indicado anteriormente. La compilación de las secuencias
obtenidas ha permitido definir la parte 3' de la región codificante
del ADNc Ty así como la región 3' no codificante.
El extremo 5' del ADNc de Ty se amplificó al
utilizar el kit Human Spleen
5'-RACE-Ready cDNA (Clontech) y los
oligonucleótidos de amplificación siguientes:
Estos dos iniciadores se definieron a partir de
la secuencia de la región 3' del ADNc Ty obtenida anteriormente al
añadir sitios de restricción Xbal y Xhol para Ty5A1. Los fragmentos
de amplificación se clonaron luego al utilizar el kit TA Cloning
(Invitrogen) y se secuenciaron como se ha indicado
anteriormente.
Las secuencias nucleotídicas se confirmaron al
utilizar oligonucleótidos Ty5A1 (SEQ ID Nº 26) y Ty 3.1 (SEQ ID Nº
25) anteriores y los oligonucleótidos siguientes:
Estos oligonucleótidos se eligieron en la
secuencia codificante de Ty (hebra codificante o hebra
complementaria).
La compilación del conjunto de las secuencias
obtenidas da la secuencia nucleotídica consensus del ADNc Ty (SEQ ID
Nº 22).
La región codificante del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22)
fue amplificada por PCR a partir del ADNc de rata o de placenta
humano al utilizar los kits correspondientes
5'-RACE-Ready cDNA (Clontech), el
oligonucleótido Ty5A1 (SEQ ID Nº 26) anterior y el oligonucleótido
siguiente:
Estos iniciadores de amplificación se eligieron
según la secuencia consensus del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) determinada
anterior al añadir el sitio de clonage BamHl para TyP5.
El producto amplificado y purificado sobre gel
de agarosa que tenía una longitud de aproximadamente 1100 pares de
bases fue digerido por las enzimas de restricción BamHl y Xba1 luego
se clonó en el vector pcDNAI/Amp como se ha descrito en el ejemplo 1
y se secuenció como se ha indicado anteriormente. El producto
clonado se secuenció enteramente sobre las dos hebras con ayuda de
los oligonucleótidos SEQ ID Nº 28 a SEQ ID Nº 38 definidos
anteriormente.
Se obtuvo una secuencia idéntica a la secuencia
codificante de la secuencia consensus ADNc Ty (SEQ ID Nº 22). La
homología de la secuencia codificante del ADNc Ty con la secuencia
codificante del ADNc Tx obtenido en el ejemplo 1 es de 84% de
identidad en nucleótidos.
La región codificante del ADNc Ty codifica la
proteína Ty teniendo la secuencia deducida en aminoácidos SEQ ID Nº
23. La secuencia de la proteína comprende 364 aminoácidos que tienen
un peso molecular calculado de
41,8 kDa.
41,8 kDa.
La homología de secuencia de la proteína Ty con
la proteína Tx obtenida en el ejemplo 1 es de 75% de identidad en
aminoácidos.
Una muestra de E. coli
XL-1 azul que contiene la región codificante del
ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) en el vector pcDNAI/Amp (cDNA Ty/pcDNAI /Amp
30/6/95) se depositó en la CNCM el 5 julio 1995 bajo el
nºI-1068.
La capacidad de la proteína Ty para inducir la
apoptosis se ensayó según el modo operatorio indicado en el ejemplo
2, con ayuda de células Cos-1 transfectadas por el
vector pcDL-SR\alpha296 que contenía la región
codificante del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) denominado
pcDL-TY, y cuya preparación se realizó siguiendo las
condiciones descritas en el ejemplo 2 para el
sub-clonage del ADNc Tx.
La morfología de las células se observó después
de la incubación de 23 horas y de 43 horas y la observación del ADN
aislado se efectuó después de incubación de 43 horas.
Los resultados, obtenidos comparativamente con
células transfectadas por el vector que contenía la región
codificante de Tx o de ICE p45, son idénticas a los mostrados para
la proteína Tx en la figura 7 y en la figura 8 del ejemplo 2.
Estos resultados muestran que la proteína Ty
como la proteína Tx está implicada en la inducción de la
apoptosis.
La capacidad de la proteína Ty para autoromperse
de manera intermolecular se ensayó en un sistema de
co-transfección en las células eucariotas, en
condiciones análogas a las descritas para la ruptura del precursor
de la ICE para la proteína Tx del ejemplo 2, al introducir
simultáneamente en células Cos-1 un vector que
contenía la región codificante del ADNc Ty (SEQ ID Nº 22) y un
vector que contenía un ADN codificante de una proteína Ty
modificada, estando cada ADN insertado respectivamente en el vector
de expresión pcDL-SR\alpha296 y en el vector
pcDNAI/Amp descritos en el ejemplo 2.
La proteína Ty se modificó doblemente, por una
parte el codón Cys 245 fue mutado en un codón Serina por el método
de PCR "cavalgante", por otra parte el epítope tag T7
(MASMTGGQQMG) se introdujo en el extremo N-terminal
del fragmento de Ty correspondiente a los residuos 68 a 364 de la
secuencia SEQ ID Nº 23.
Los pares de iniciadores siguientes se
utilizaron para amplificar la matriz ADNc Ty:
a) por una parte,
T7TY:
| CGCGGATCCACCATGGCTTCTATGACAGGAGGTCAACAAATGGGACAAAAGAT | ||
| CACCAGTG TAAAACC | (SEQ ID Nº 40) |
\newpage
elegida en la secuencia codificante de Ty y
sintetizada al añadir un sitio de restricción BamH1 seguido de la
secuencia nucleotídica codificante del tag T7 y
TYC245SR:
| ATGTTTTTCACCTCTGGAGGCCTGGACAATGATGAC | (SEQ ID Nº 41) |
elegida en la secuencia codificante de Ty (hebra
complementaria) con una mutación C -> G en posición 17,
b) por otra parte,
TYC245S:
| GTCATCATTGTCCAGGCCTCCAGAGGTGAAAAACAT | (SEQ ID Nº 42) |
elegida en la secuencia codificante de Ty con
una mutación
- G -> C en posición 20 y
- Ty5A1 (SEQ ID Nº 26) anterior,
y al utilizar las condiciones de amplificación
siguientes: 94ºC, 1 mn; 60ºC, 1 C 72ºC, 1 mn; 30 ciclos; polimerasa
Vent (Biolabs).
Los dos productos de amplificación obtenidos
respectivamente se combinaron y amplificaron por PCR al utilizar los
iniciadores T7Ty y Ty5Al y las condiciones anteriores.
El producto de amplificación fue digerido con
las enzimas de restricción BamHl y Xbal luego clonado en el vector
pcDNAI/Amp digerido previamente por las mismas enzimas de
restricción. El plásmido resultante se denominó
pT7TY\Delta67C245S. La secuencia obtenida se verificó enteramente
por secuenciación de ADN.
El vector de expresión
pcDL-SR\alpha296 en el que se
sub-clonó la secuencia de ADNC Ty (SEQ ID Nº 22),
denominado plásmido pcDL-TY, se preparó como se ha
indicado anteriormente.
Las células Cos-1 fueron
transfectadas por el vector pT7TY\Delta67C245S, bien
co-transfectadas con este plásmido y el plásmido
pcDL-TY luego cultivadas durante 23 horas o 43
horas, lisadas y analizadas por electroforesis sobre gel de
poliacrilamida y Western blot al utilizar el anticuerpo monoclonal
anti-T7 de ratón, según las condiciones operatorias
descritas en el ejemplo 2, pero en las que el anticuerpo de cabra
anti-inmunoglobina de ratón está conjugado con la
peroxidasa de rábano en vez de fosfatasa alcalina. Los anticuerpos
ligados a la membrana se revelaron luego con el sistema de detección
Western ECL (Amersham) mediante autoradiografía.
Se realizaron co-transfecciones
de la misma manera con el vector pcDL-SR\alpha296
solo y el vector pcDNAI/Amp solo y las células se cultivaron durante
23 horas.
Como muestra la figura 9, cuando la proteína Ty
mutada se expresa sola en las células Cos transfectadas, se puede
detectar la forma T7Ty (PM aparente aproximadamente 30 kDa) (línea
E). La ausencia de banda de PM inferior muestra que la proteína Ty
mutada es incapaz de autoromperse. Cuando las células fueron
co-transfectadas con el vector que contiene Ty
(líneas F y G), se observó la aparición de una banda mayoritaria con
un PM aparente de 20 kDa correspondiente al producto de ruptura de
la proteína Ty mutada por la proteína Ty.
Estos resultados muestran que la proteína Ty por
una parte se expresa en las células Cos transfectadas, por otra
parte posee una actividad proteasa y que en particular es capaz de
romperse de manera intermolecular.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- DEPOSITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: ROUSSEL UCLAF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 102, Route de Noisy
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROMAINVILLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 93230
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 49.91.49.91
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 49.91.46.10
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencia de ADN codificante de una proteína humana Tx emparentada con la enzima de conversión de la interleuquina-1beta, proteína Tx, procedimiento de producción, composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 42
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) + Correcciones bajo WORDPERFECT 5.1 para SEQ ID NO 22 (ix)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE LA SOLICITUD: FR 9409567
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPOSITO: 02-AGOSTO-1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:42..1172
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 377 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACION DE LA PUBLICACION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Thornberry, Nancy A.
\hskip4.7cmBull, Herbert G.
\hskip4.7cmCalaycay, Jimmy R.
\hskip4.7cmChapman, Kevin T.
\hskip4.7cmHoward, Andrew D.
\hskip4.7cmKostura, Matthew J.
\hskip4.7cmMiller, Douglas K.
\hskip4.7cmMolineaux, Susan M.
\hskip4.7cmWeidner, Jeffrey R.
\hskip4.7cmAunins, John
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TITULO: Se requiere una nueva cisteína-proteasa heterodimérica para interleuquina-1beta que procesa en monocitos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 356
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PAGINAS: 768-774
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 30-ABRIL-1992
\vskip0.500000\baselineskip
- (K)
- RESIDUOS PERTINENTES EN LA SEQ ID NO: 3: DEL 1 HASTA 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACATGACTAC AGAGCTGGAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..20)
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACION DE LA PUBLICACION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Thornberry, Nancy A.
\hskip4.7cmBull, Herbert G.
\hskip4.7cmCalaycay, Jimmy R.
\hskip4.7cmChapman, Kevin T.
\hskip4.7cmHoward, Andrew D.
\hskip4.7cmKostura, Matthew J.
\hskip4.7cmMiller, Douglas K.
\hskip4.7cmMolineaux, Susan M.
\hskip4.7cmWeidner, Jeffrey R.
\hskip4.7cmAunins, John
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TITULO: Se requiere una nueva cisteína-proteasa heterodiméricas para interleuquina-1beta que procesa en monocitos-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 356
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PAGINAS: 768-774
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 30-ABRIL-1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCACGGCA GGCCTGGATG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 235 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:1..23
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nta= "SEQ ID NO 5 DE 8 A 30"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACAGAGCT GGAGGCATTT GCT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..24)
\vskip0.800000\baselineskip
- (x)
- INFORMACION DE LA PUBLICACION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- AUTORES: Thornberry, Nancy A.
\hskip4.7cmBull, Herbert G.
\hskip4.7cmCalaycay, Jimmy R.
\hskip4.7cmChapman, Kevin T.
\hskip4.7cmHoward, Andrew D.
\hskip4.7cmKostura, Matthew J.
\hskip4.7cmMiller, Douglas K.
\hskip4.7cmMolineaux, Susan M.
\hskip4.7cmWeidner, Jeffrey R.
\hskip4.7cmAunins, John
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TITULO: Se requiere una nueva cisteína-proteasa heterodiméricas para interleuquina-1beta que procesa en monocitos-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REVISTA: Nature
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- VOLUMEN: 356
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- PAGINAS: 768-774
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FECHA: 30-ABRIL-1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAATGTCCT GGGAAGAGGT AGAA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..21)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nta= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 753 A 773"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGCAGTTG CGGTTGTTGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..21)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 829 A 849"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTGACCCA CAGTTCCCCA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 695 A 711"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACTGTGCAT GATGAGA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 905 A 913"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:11..19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 915 A 923"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATGCTGTG TACAAGACC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 795 A 811"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTGGACAA TGATGAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nta= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 995 A 1011"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGATGAAGAT AGAGCCC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 204 A 220"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGTCATGG CAGACTC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/noa= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 249 A 265"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTTGAAGAA GCATTTG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARATERISTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CODIGOmisc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 330 A 346"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTGAGTCAG GAGAATC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 375 A 391"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCTCAGGA ATTCTTC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 503 A 519"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTGACTTT GACATCA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 587 A 603"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCTGACTC CATATCC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:13..33
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 DE 42 A 62"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCA CCATGGCAGA AGGCAACCAC AGA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (19..39)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 1 COMPLEMENTARIA DE 1155 A 1175"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTCTAGAC TCGAGTTATC AATTGCCAGG AAAGAGGTA
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1310 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:104..1195
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 364 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 685 A 703"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGTCTCAT GGCATCCTA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..20
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 712 A 731"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCGGAACT GCGCATAAAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (16..35)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 1229 A 1248"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTCTAGAC TCGAGGTGCT CTTTGATGTT GACAG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..20)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 939 A 958"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCTCCTCG TGGATCTTGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:1..16
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 124 A 139"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATGTTCTT CATGGT
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 290 A 306"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCTCAATA TGGACCA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 472 A 488"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTGGCTCTC ATCATAT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..18
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 634 A 651"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTTGCTGCC AGACCAGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 833 A 851"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTGCAGAG GTGAAAAAC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 1020 A 1038"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCCATCTT CATTACGGA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 1094 A 1110"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTTCTGTA CCTTCCG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..16)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 715 A 730"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTATGCGCA GTTCCG
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..18)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 521 A 538"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATAGTGA GCCCCATT
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 385 A 401"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTCACGAGG ACAAAGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..17)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 237 A 253"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGCAAAGAG TCTACCA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:10..33
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 101 A 124"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCA AGATGTTGGA ATACCTGGGC AAA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:46..68
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 305 A 327"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCA CCATGGCTTC TATGACAGGA GGTCAACAAA TGGGACAAAA GATCACCAGT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAAAACC
\hfill68
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (1..16)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 838 A 853"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:complemento (18..36)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 COMPLEMENTARIA DE 818 A 836"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGTTTTTCA CCTCTGGAGG CCTGGACAAT GATGAC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN:1..19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 818 A 836"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:21..36
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES:/nota= "SEQ ID NO 22 DE 838 A 853"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCATCATTG TCCAGGCCTC CAGAGGTGAA AAACAT
\hfill36
Claims (12)
1. Secuencia de ADN codificante de un
polipéptido que tiene una actividad proteasa y capaz de inducir la
apoptosis y que consiste en la secuencia nucelotídica de la
secuencia SEQ ID Nº 22.
2. Secuencia de ADN según la reivindicación 1,
que comienza en el nucleótido 104 y se termina en el nucleótido 1195
de la secuencia SEQ ID Nº 22.
3. Polipéptido humano que tiene una actividad
proteasa y capaz de inducir la apoptosis y que consiste en la
secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID Nº 23 y designada
proteína Ty.
4. Procedimiento que comprende la expresión de
la proteína Ty en una célula huésped transformada por un ADN
codificante para la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID
Nº 23.
5. ADN que consiste en la secuencia nucleotídica
SEQ ID Nº 1.
6. Composición farmacéutica que encierra a
título de medicamento el polipéptido según la reivindicación 3.
7. A título de medicamento el polipéptido según
la reivindicación 3.
8. Composición farmacéutica que encierra como
principio activo un medicamento según la reivindicación 7.
9. Composición farmacéutica según la
reivindicación 8, para modular la producción de
IL-1beta.
10. Composición farmacéutica según la
reivindicación 6, para modular la apoptosis.
11. Utilización del polipéptido según la
reivindicación 3, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades autoinmunes.
12. Utilización del polipéptido según la
reivindicación 3, o del polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 2 para la
fabricación de un medicamento para la cicatrización de llagas.
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