ES2273367T3 - Amplificacion multiplex de loci de repeticiones cortas en tandem. - Google Patents

Amplificacion multiplex de loci de repeticiones cortas en tandem. Download PDF

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA AMPLIFICACION SIMULTANEA DE MULTIPLES LOCI GENETICOS DISTINTOS, UTILIZANDO PCR U OTROS SISTEMAS DE AMPLIFICACION PARA DETERMINAR EN UNA REACCION MULTIPLEX, LOS ALELOS DE CADA LOCI CONTENIDOS EN LA REACCION MULTIPLEX. LOS LOCI GENETICOS ANALIZADOS COMPRENDEN LOS SIGUIENTES: HUMVWFA31, HUMLIPOL, HUMFXIII, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMTH01, HUMTPOX, HUMCSF1PO, D22S683, D20S481, D19S253, D17S1299, D17S1298, D16S753, D16S539, D16S40, D14S562, D14S548, D14S118, D13S317, D10S1239, D9S930, D7S820, D5S818, D4S2368, D3S1539.

Description

Amplificación multiplex de loci de repeticiones cortas en tándem.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere de manera general a la detección de marcadores genéticos en un sistema genómico. La presente invención se refiere más específicamente a la amplificación simultánea de múltiples loci genéticos polimórficos diferentes utilizando la reacción en cadena de la polimerasa u otros sistemas de amplificación para determinar en una reacción los alelos de cada locus contenido dentro del sistema multiplex.
En los últimos años, el descubrimiento y desarrollo de repeticiones cortas en tándem polimórficas (STR) como marcadores genéticos ha estimulado el avance en el desarrollo de mapas de ligamiento, en la identificación y caracterización de genes defectivos, y en la simplificación y precisión del tipado del ADN.
Muchos loci, por lo menos en el genoma humano, contienen regiones STR polimórficas (Adamson, D. et al., "A collection of ordered tetranucleotide-repeat markers from the human genome", Am. J. Hum. Genet. 57:619-628, 1995; Murray, J.C. et al., "A comprehensive human linkage map with centimorgan density", Science 265:2049-2054, 1994; Hudson, T.J., Engelstein, M., Lee, M.K., Ho, E.C., Rubenfield, M.J., Adams, C.P., Housman, D.E. y Dracopoli, N.C., "Isolation and chromosomal assignment of 100 highly informative human simple sequence repeat polymorphisms", Genomics 13:622-629, 1992). Los loci STR consisten de elementos cortos de secuencia repetida de 3 a 7 pares de bases de longitud. Se estima que existen 2.000.000 de STR triméricos y tetraméricos esperados con una frecuencia de hasta una vez cada 15 kilobases (kb) en el genoma humano (Edwards et al., "DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats", Am. J. Hum. Genet. 49:746-756, 1991; Beckman, J. S. y Weber, J.L., "Survey of human and rat microsatellites", Genomics 12:627-631, 1992). Prácticamente la mitad de los loci STR estudiados por Edwards et al. (1991) son polimórficos, lo que proporciona una fuente abundante de marcadores genéticos.
La variación en el número de unidades de repeticiones cortas en tándem en un locus particular causa que la longitud del ADN en ese locus varíe de alelo a alelo y de individuo a individuo. Este polimorfismo de longitud recuerda a un número variable de loci de repeticiones en tándem (VNTR) (Nakamura, Y. et al., "Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping", Science 235:1616-1622, 1987) y de loci minisatélites (Jeffreys, A.J. et al., "Hypervariable ``minisatellite'' regions in human DNA", Nature 314:67-73, 1985), ya que ambos contienen unidades repetidas considerablemente más largas que los loci STR. Este polimorfismo de longitud también recuerda a la forma de repetición dinucleótido de los loci microsatélites (Litt, M. y Luty, J.A., "A hypervariable microsatellite revealed by in-vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene", Am. J. Hum. Genet. 44:397-401, 1989; Tautz, D. et al., "Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation", Nature 322:652-656, 1986; Weber, J.L. y May, P.E., "Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction", Am. J. Hum. Genet. 44:388-396, 1989; Beckmann y Weber, 1992), una forma de loci microsatélites con unidades repetidas más cortas que los loci STR.
Los loci STR polimórficos resultan marcadores extremadamente útiles para la identificación de personas, el análisis de paternidad y el mapaje genético. Los loci STR pueden amplificarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando secuencias cebadoras específicas identificadas en las regiones que flanquean la repetición en tándem.
Los alelos de estos loci se diferencian por el número de copias de la secuencia repetida contenidas dentro de la región amplificada y se distinguen entre sí tras la separación electroforética mediante cualquier procedimiento de detección adecuado, incluyendo radioactividad, fluorescencia, tinción con plata, y colorimetría.
Para minimizar el trabajo, materiales y tiempo de análisis, resulta deseable analizar múltiples loci y/o más muestras simultáneamente. Un enfoque para conseguir este objetivo implica la amplificación de múltiples loci simultáneamente en una sola reacción. Estas amplificaciones "multiplex", según se denominan, han sido extensamente descritas en la literatura. Se han desarrollado extensamente los juegos de amplificación multiplex para el análisis de genes relacionados con enfermedades genéticas humanas, tales como la distrofia muscular de Duchenne (Chamberlain, J.S. et al., "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification", Nucleic Acids Res. 16:11141-11156, 1988; Chamberlain, J.S. et al., "Multiple PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy", en: PCR Protocols, A Guide to Methods and Application (editores Gelfand, D.H. et al.), 1989, páginas 272-281, Academic Press, San Diego, CA; Beggs, A.H. et al., "Detection of 98% DMD/BMD gene deletions by PCR", Hum. Genet. 86:45-48, 1990; Clemens, P.R. et al., "Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families, using dinucleotide repeat polymorphisms, Am. J. Hum. Genet. 49:951-960, 1991; Schwartz, J.S. et al., "Fluorescent multiple linkage analysis and carrier detection for Duchenne/Becker’s muscular dystrophy", Am. J. Hum. Genet. 51:721-729, 1992; Covone, A.E. et al., "Screening Duchenne and Becker muscular dystrophy patients for deletions in 30 exons of the dystrophin gene by three-multiplex PCR", Am. J. Hum. Genet. 51:675-677, 1992), el síndrome de Lesch-Nyhan (Gibbs, R.A. et al., "Multiple DNA deletion detection and exon sequencing of the hypoxanthine phosphoribosyltransferase gene in Lesch-Nyhan families", Genomics 7:235-244, 1990), la fibrosis quística (Estivill, X. et al., "Prenatal diagnosis of cystic fibrosis by multiplex PCR of mutaiton and microsatellite alleles", Lancet 338:458, 1991; Fortina, P. et al., "Non-radioactive detection of the most common mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene by multiplex polymerase chain reaction", Hum. Genet. 90:375-378, 1992; Ferrie, R.M. et al., "Development, multiplexing, and application of ARMS test for common mutations in the CFTR gene", Am. J. Hum. Genet. 51:251-262, 1992; Morral, N. y Estivill, X., "Multiplex PCR amplification of three microsatellites within the CFTR gene, Genomics 51:1362-1364, 1992) y el retinoblastoma (Lohmann, D. et al., "Detection of small RB1 gene deletions in retinoblastoma by multiplex PCR and high-resolution gel electrophoresis", Hum. Genet. 89:49-53, 1992). Se ha descrito la amplificación multiplex de marcadores microsatélite polimórficos (Clemens et al., 1991; Schwartz et al., 1992; Huang, T.H.-M. et al., "Genetic mapping of four dinucleotide repeat loci DXS435, DXS45, DXS454, DXS44, on the X chromosome using the multiplex polymerase chain reaction", Genomics 13:375-380, 1992) e incluso de marcadores STR (Edwards, A. et al., "Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups", Genomics 12:241-253, 1992; Kimpton, C.P. et al., "Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci", PCR Methods and Applications 3:13-22, 1993; Hammond, H.A. et al., "Evaluation of 13 STR loci for use in personal identification applications", Am. J. Hum. Genet. 55.175-189, 1994; Schumm, J.W. et al., "Development of nonisotopic multiplex amplification sets for analysis of polymorphic STR loci", 1994, en: "The Fourth International Symposium on Human Identification 1993", páginas 177-187; Oldroyd, N.J. et al., "A highly discriminating octoplex short tandem repeat polymerase chain reaction system suitable for human individual identification", Electrophoresis 16:334-337,
1995).
Estos productos amplificados generalmente se separan mediante uno de entre varios procedimientos de electroforesis conocidos por los expertos en la materia. También se han descrito varios procedimientos bien conocidos de detección de los productos amplificados. Aunque se utiliza la tinción con bromuro de etidio o la tinción con plata de fragmentos amplificados en algunos casos, en otros resulta preferente utilizar procedimientos que marcan únicamente una de las dos cadenas del material amplificado. Entre los ejemplos de estos se incluyen el marcaje radioactivo o fluorescente de uno de los dos cebadores previamente a la amplificación de un locus. Uno de los enfoques más sofisticados a la detección es la utilización de diferentes marcajes fluorescentes que permiten la detección de materiales amplificados que representan diferentes loci, pero que existen en el mismo espacio, tras la electroforesis. Los productos de los diferentes loci se diferencian utilizando filtros u otros detectores discriminantes, que permiten la visualización de un marcaje fluorescente cada vez.
Se hace referencia a las publicaciones de patente internacional WO nº 93/18177 y nº 93/18178 de Fortina et al., que se refieren a procedimientos y a kits para el diagnóstico de enfermedades, tales como la fibrosis quística y la \beta-talasemia, respectivamente, utilizando un sistema multiplex específico de alelo de reacción en cadena de la polimerasa. Según Fortina et al., también se ha utilizado la PCR multiplex para la amplificación simultánea de múltiples secuencias diana, permitiendo la búsqueda de alelos mutantes en dos carriles de un gel de agarosa.
Ballabio, A. et al., "PCR Tests for Cystic Fibrosis Deletion", Nature 343:220, 1991, dan a conocer un ensayo de PCR multiplex específico de alelo en una sola probeta, utilizando dos cebadores fluorescentes diferentes etiquetados con un pigmento para la detección de la mutación F508 de la fibrosis quística.
Aunque existen procedimientos de amplificación multiplex para loci específicos, la utilización de procedimientos de amplificación multiplex resulta muy deseable para la detección de alelos en otros tipos de loci, tales como loci STR específicos. También resulta deseable identificar cebadores que hagan posible la amplificación multiplex de estos loci. La patente WO nº 96/10648 da a conocer la amplificación multiplex de loci de repeticiones cortas en tándem.
Breve descripción resumida de la invención
Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento y materiales para la amplificación simultánea de múltiples loci polimórficos diferentes de repetición corta en tándem (STR) mediante PCR u otros sistemas de amplificación, con el fin de determinar, en una reacción, los alelos de cada locus contenidos dentro del multiplex. Los análisis multiplex de los juegos de loci STR específicos dados a conocer en la presente invención no han sido descritos con anterioridad en los antecedentes de la técnica. Tampoco se ha producido ninguna descripción anterior de la secuencias para muchos de los cebadores dados a conocer posteriormente en la presente invención, todos los cuales se demuestra que resultan útiles para la amplificación multiplex de dichos loci STR.
También es un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento, un kit y cebadores específicos para las amplificaciones multiplex que comprenden loci especificados.
Éste y otros son objetivos de la presente invención, que se refiere a un procedimiento y a materiales para analizar o determinar simultáneamente los alelos presentes en cada locus individual de cada multiplex. En general, el procedimiento de la presente invención comprende las etapas de: (a) obtener por lo menos una muestra de ADN que debe analizarse, en la que la muestra de ADN presenta por lo menos dos loci que pueden amplificarse conjuntamente; (b) amplificar las secuencias STR en la muestra de ADN; y (c) detectar los materiales amplificados de una manera que revele la naturaleza polimórfica de los sistemas utilizados.
Más específicamente, el procedimiento de la presente invención es un procedimiento para determinar simultáneamente los alelos presentes en tres loci de repetición en tándem de una o más muestras de ADN, comprendiendo este procedimiento las etapas siguientes:
\newpage
(a) obtener por lo menos una muestra de ADN que debe analizarse, en la que la muestra de ADN presenta un conjunto de tres loci que pueden amplificarse conjuntamente, en la que el conjunto de loci se selecciona de entre un grupo específico o de conjuntos de loci dados a conocer en la presente invención;
(b) coamplificar el conjunto de loci en una reacción de amplificación multiplex, en la que el producto de la reacción es una mezcla de alelos amplificados de cada uno de los loci coamplificados en el conjunto; y
(c) evaluar los alelos amplificados en la mezcla para determinar los alelos presentes en cada uno de los loci analizados en el conjunto dentro de la muestra de ADN.
En una realización de la presente invención, se amplifican conjuntamente tres loci STR, y el conjunto de tres loci coamplificados se selecciona de entre el grupo de conjuntos que consiste de:
D3S1539, D19S253, D13S317;
D10S1239, D9S930, D20S481;
D10S1239, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S30, D4S2368;
D16S539, D7S820, D13S317; y
D10S1239, D9S930, D13S317.
En una realización más preferente del procedimiento de la presente invención, la muestra de ADN presenta cuatro loci STR que pueden amplificarse conjuntamente, y el conjunto de loci coamplificados se selecciona entre el grupo de loci que consiste de:
D3S1539, D4S2368, D5S818, D7S820, D9S930, D10S1239, D13S317, D14S118, D14S548, D14S562, D16S490, D16S539, D16S753, D17S1298, D17S1299, D19S253, D20S481, D22S683, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01, HUMFESFPS, HUF13A01, HUMBFXIII, HUMLIPOL, HUMvWFA31.
El conjunto de cuatro loci STR amplificados conjuntamente más preferentemente es un conjunto seleccionado de entre los conjuntos de cuatro loci, que comprenden:
D321539, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818;
D20S481, D7S820, D13S317, D5S818;
DS930, D7S820, D13S317, D5S818;
D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S118, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S562, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S548, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S490, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1299, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818;
D22S683, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S753, D7S820, D13S317, D5S818;
D3S1539, D19S253, D13S317, D20S481;
D3S1539, D19S253, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S930, D452368, D20S481; y
D16S539, D7S820, D13S317, HUMvWFA31.
Más preferentemente, el conjunto de loci STR amplificados conjuntamente es un conjunto de seis loci, seleccionados de entre los conjuntos de loci que comprenden:
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS.
Todavía más preferentemente, el conjunto de loci STR amplificados conjuntamente es un conjunto de siete loci, seleccionados de entre los conjuntos de loci que comprenden:
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII.
Todavía más preferentemente, el conjunto de loci STR amplificados conjuntamente es un conjunto de ocho loci, seleccionados de entre los conjuntos de loci que comprenden:
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HMTPOX, HUMTH01, HUMvWFA31; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII, HUMLIPOL.
La etapa de reacción de amplificación multiplex del procedimiento preferentemente se lleva a cabo utilizando una pareja de cebadores que flanquean cada locus en el conjunto de loci coamplificado en la reacción. Más preferentemente, se seleccionan parejas de cebadores para la reacción de amplificación multiplex que produce alelos de cada locus que no se solapan con los alelos de los demás loci en el conjunto coamplificado, cuando se separan los alelos mediante electroforesis en gel. Todavía más preferentemente, la secuencia de una de cada pareja de cebadores utilizada en la reacción de amplificación multiplex se selecciona de entre un grupo de secuencias de cebadores que consiste de:
SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2, cuando uno de los loci en el conjunto es D7S820;
SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4, cuando uno de los loci en el conjunto es D13S317;
SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, cuando uno de los loci en el conjunto es D5S818;
SEC ID nº 7 y SEC ID nº 8, y SEC ID nº 49 cuando uno de los loci en el conjunto es D3S1539;
SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10, cuando uno de los loci en el conjunto es D17S1298;
SEC ID nº 11 y SEC ID nº 12, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, cuando uno de los loci en el conjunto es D20S481;
SEC ID nº 13 y SEC ID nº 14, SEC ID nº 55, SEC ID nº 61, cuando uno de los loci en el conjunto es D9S930;
SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16, SEC ID nº 54, cuando uno de los loci en el conjunto es D10S1239;
SEC ID nº 17 y SEC ID nº 18, cuando uno de los loci en el conjunto es D14S118;
SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20, cuando uno de los loci en el conjunto es D14S562;
SEC ID nº 21 y SEC ID nº 22, cuando uno de los loci en el conjunto es D14S548;
SEC ID nº 23 y SEC ID nº 24, cuando uno de los loci en el conjunto es D16S490;
SEC ID nº 25 y SEC ID nº 26, cuando uno de los loci en el conjunto es D16S753;
SEC ID nº 27 y SEC ID nº 28, cuando uno de los loci en el conjunto es D17S1299;
SEC ID nº 29 y SEC ID nº 30, SEC ID nº 58, cuando uno de los loci en el conjunto es D16S539;
SEC ID nº 31 y SEC ID nº 32, cuando uno de los loci en el conjunto es D22S683;
SEC ID nº 33 y SEC ID nº 34, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMCSFF1 PO;
SEC ID nº 35 y SEC ID nº 36, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMTPOX;
SEC ID nº 37 y SEC ID nº 38, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMTH01;
SEC ID nº 39 y SEC ID nº 40, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMvWFA31;
SEC ID nº 41 y SEC ID nº 42, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMF13A01;
SEC ID nº 43 y SEC ID nº 44, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMFESFPS;
SEC ID nº 45 y SEC ID nº 46, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMBFXIII;
SEC ID nº 47 y SEC ID nº 48, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMLIPOL;
SEC ID nº 50 y SEC ID nº 51, cuando uno de los loci en el conjunto es D19S253;
SEC ID nº 56 y SEC ID nº 57, cuando uno de los loci en el conjunto es D4S2368.
En el procedimiento de la presente invención, los alelos amplificados preferentemente se evalúan mediante la comparación de los alelos amplificados con un estándar de tamaño, en la que el estándar de tamaño se selecciona de entre el grupo de estándares de tamaño que consisten de un marcador de ADN y una escalera alélica específica de locus. La evaluación de los alelos preferentemente se lleva a cabo utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida para separar los alelos, formando de esta manera un gel de poliacrilamida de los alelos separados. Los alelos separados en el gel de poliacrilamida preferentemente se determinan visualizando los alelos con una técnica apropiada, tal como tinción con plata, pero más preferentemente con análisis de fluorescencia.
El análisis de fluorescencia preferentemente se realiza marcando un cebador de cada par de cebadores utilizado en la reacción de amplificación multiplex con un marcaje fluorescente previamente a la utilización en la reacción. El marcaje fluorescente utilizado para marcar cada cebador preferentemente es un marcaje de fluoresceína o u marcaje de tetrametil-rodamina. Más preferentemente, se utilizan por los menos dos marcajes diferentes para marcar los diferentes cebadores que se utilizan en la reacción de amplificación multiplex.
La muestra o muestras de ADN que deben analizarse utilizando el procedimiento de la presente invención preferentemente se aíslan a partir de tejido humano, preferentemente tejido seleccionado de entre el grupo que consiste de sangre, semen, células vaginales, pelo, saliva, orina, hueso, muestras bucales, líquido amniótico que contiene células placentarias o células fetales, y mezclas de cualquiera de los tejidos indicados anteriormente.
En una realización alternativa, la invención es un kit para analizar simultáneamente secuencias TR en tres loci, comprendiendo el kit un recipiente que presenta parejas de cebadores oligonucleótidos para coamplificar un conjunto de tres loci de repetición corta en tándem, en el que el conjunto de loci se selecciona de entre los conjuntos de loci consistentes de:
D3S1539, D19S253, D13S317;
D10S1239, D9S930, D20S481;
D10S1239, D4S238, D20S481;
D10S1239, D9S930, D4S2368;
D16S539, D7S820, D13S317;
D10S1239, D9S930, D13S317;
D3S1539, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818;
D20S481, D7S820, D13S317, D5S818;
D9S930, D7S820, D13S317, D5S818;
D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S118, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S562, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S548, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S490, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1299, D7S820, D13S317, D5S818;
D22S683, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S753, D7S820, D13S317, D5S818;
D3S1539, D19S253, D13S317, D20S481;
D3S1539, D19S253, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S930, D4S2368, D20S481;
D16S539, D7S820, D13S317, HUMvWFA31;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX;
D16S539, 7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13AO1, HUMFESFPS, HUMBFXIII;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01, HUMvWFA31; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII, HUMLIPOL.
Por lo menos uno de los cebadores en cada pareja de cebadores incluida en el kit preferentemente presenta una secuencia seleccionada de entre los grupos de secuencias indicados bajo la descripción del procedimiento de la presente invención, anteriormente.
En todavía una tercera realización, la invención son secuencias de cebador y parejas de cebadores para amplificar loci STR específicos de ADN humano. La utilización de los cebadores y parejas de cebadores de la presente invención para el análisis multiplex de ADN humano se demuestra posteriormente en la presente memoria. Los cebadores de la presente invención resultan adecuados para la utilización en el procedimiento de la presente invención, en la que pueden utilizarse en forma marcada o no marcada dependiendo, tal como se ha indicado anteriormente, de cómo deben determinarse los alelos amplificados en la etapa de evaluación del procedimiento.
La presente invención en todas sus diversas realizaciones descritas brevemente anteriormente, proporciona un procedimiento de alto rendimiento y materiales para la detección y el análisis de marcadores genéticos polimórficos utilizando combinaciones específicas de loci y condiciones especificadas. Mediante la selección de la técnica de detección apropiado para la etapa de evaluación, los materiales y el procedimiento de la presente invención puede utilizarse en laboratorios que presentan únicamente una fuente de electricidad y u aparato estándar para la electroforesis en gel de poliacrilamida o aquellos que disponen de lo último en equipos para el barrido de gel fluorescente, por ejemplo los escáneres de fluorescencia FluorImager^{TM} 575 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) o FMBIO^{TM} de Hitachi (San Bruno, CA), o los secuenciadores de ADN ABI 373 y ABI Prism^{TM} 377 (Applied Biosystems Division, Perkin Elmer, Foster City, CA). De esta manera, el procedimiento de la presente invención es adaptable para una diversidad de usos y laboratorios.
El enfoque tal como se especifica en la presente invención produce ahorros de tiempo, trabajo y materiales en el análisis de los loci contenidos dentro de multiplexes. El procedimiento de la presente invención permite la amplificación conjunta de tres o más, incluso ocho o más loci en una sola probeta utilizando una sola reacción de amplificación, en lugar de amplificar cada locus independientemente en probetas separadas.
La presente invención presenta utilidad específica en el campo del análisis forense, la determinación de paternidad, el seguimiento del trasplante de médula ósea, el mapaje de ligamiento, y la detección de enfermedades genéticas y cánceres. Al permitir la amplificación y el análisis simultáneos de tres o más loci, los materiales y procedimientos de la presente invención incrementan significativamente la certeza con la que puede encontrarse la correspondencia del ADN aislado de sangre o de otros tejidos de dos individuos diferentes. La necesidad de distinguir con exactitud entre cantidades reducidas de tejido de diferentes individuos es particularmente aguda en las aplicaciones forenses, en la que muchas condenas (y absoluciones) dependen de los análisis de tipado de ADN, incluyendo el análisis de loci
STR.
Los científicos, particularmente los científicos forenses, desde hace mucho tiempo que aprecian la necesidad de analizar múltiples loci polimórficos de ADN con el fin de garantizar que una correspondencia entre dos muestras de tejido es estadísticamente significativa (Presley, L.A. et al., "The implementation of the polymerase chain reaction (PCR) HLA DQ alpha typing by the FBI laboratory", en: "The Third International Symposium on Human Identification 1992", páginas 245-269, 1993; Bever, R.A. et al., "Characterization of five VNTR loci by Hae III RFLP analysis: application to paterny testing", 1992, en: "The Second International Symposium on Human Identification 1991", página 103-128). Sin embargo, hasta la presente invención, los medios de análisis simultáneo de tres o más loci STR en una sola reacción eran escasos. Para apreciar la importancia de estas capacidades multiplex, ayuda comprender las matemáticas en las que se basa el análisis de tipado de ADN.
A título ilustrativo, supóngase que todo locus STR presenta una frecuencia genotípica (es decir, de un patrón de dos alelos) de uno de cada diez. En otras palabras, supóngase que la probabilidad de que dos individuos seleccionados aleatoriamente presente un tipo correspondiente para un solo STR es de 1/10. Sin embargo, si se analizan dos loci STR diferentes, la probabilidad de una correspondencia al azar entre ambos sistemas es de 1/100. Si se analizan tres loci STR, las probabilidades de correspondencia al azar con cada uno de los tres sistemas es de 1/1.000, y de esta manera sucesivamente. En consecuencia, resulta fácil de apreciar cómo el incremento del número de loci STR analizados por encima de tres loci reduce significativamente la probabilidad de detectar correspondencias aleatorias dentro de la población general, incrementando de esta manera la probabilidad de que identificación (o de descarte) exacta de un sospechoso de un crimen mediante la comparación de su tipo con evidencia obtenida en la escena del crimen. Puede utilizarse un razonamiento similar para concluir que el procedimiento de la presente invención también incrementaría la probabilidad de identificar con exactitud un padre sospechado en un caso de paternidad, o de encontrar correctamente tejido de médula ósea correspondiente, de desarrollar resultados significativos a partir de estudios de mapaje de ligamiento, y de detectar enfermedades genéticas y cánceres.
Resultarán evidentes objetivos, características y ventajas adicionales de la invención a partir de la descripción detallada siguiente de la invención y de los dibujos ilustrativos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de la amplificación simultánea de los loci D3S1539, D7S820, D13S317 y D5S818 según detecta el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 1.
La figura 2 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 2.
La figura 3 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 3.
La figura 4 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D20S481, D7S820, D13S317 Y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 4.
La figura 5 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D20S481, D7S820, D13S317 Y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 5.
La figura 6 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D9S930, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 6.
La figura 7 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 7.
La figura 8 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 8.
La figura 9 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D14S118, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 9.
La figura 10 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D14S562, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 10.
La figura 11 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D14S548, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 11.
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La figura 12 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S490, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 12.
La figura 13 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S753, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 13.
La figura 14 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D17S1299, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 14.
La figura 15 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 15.
La figura 16 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D22S683, D7S820, D13S317 y D5S818 según se detectan con un escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) en el Ejemplo 16.
La figura 17 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSFLPO ("CSF1PO") Y HUMTPOX ("TPOX") según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 17.
La figura 18 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX") y HUMTH01 ("TH01") según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 18.
La figura 19 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO") y HUMTH01 ("TH01") y HUMvWFA31 ("vWA") según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 19.
La figura 20 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01") y HUMFESFPS ("FESFPS") según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 20.
La figura 21 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01"), HUMFESFPS ("FESFPS") y HUMBFXIII ("F13B") según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 21.
La figura 22 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01"), HUMFESFPS ("FESFPS"), HUMBFXIII ("F13B") y HUMLIPOL ("LPL") según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 22.
La figura 23 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX"), HUMTH01 ("TH01") y HUMvWFA31 ("vWA") según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 23.
La figura 24 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481 según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 24.
La figura 25 es una imagen impresa con impresora láser que muestra la detección por fluorescencia de los productos de amplificación simultánea de los loci D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481 según se detectan con un escáner de fluorescencia FMBIO^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA) en el Ejemplo 25.
La figura 26 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los tres loci, D16S539, D7S820 y D13S317, en el Ejemplo 26.
La figura 27 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los cuatro loci, D16S539, D7S820, D13S317 y HUMvWFA31 ("vWA"), en el Ejemplo 27.
La figura 28 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los tres loci, D10S1239, D9S930 y D13S317, en el Ejemplo 28.
La figura 29 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los tres loci, D10S1239, D9S930 y D4S2368, en el Ejemplo 29.
La figura 30 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los cuatro loci, D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481, en el Ejemplo 30.
La figura 31 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los tres loci, D3S1539, D19S253 y D13S317, en el Ejemplo 31.
La figura 32 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los cuatro loci, D3S1539, D19S253, D4S2368 y D20S481, en el Ejemplo 32.
La figura 33 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los cuatro loci, D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481, en el Ejemplo 33.
La figura 34 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los tres loci, D10S1239, D9S930 y D20S481, en el Ejemplo 34.
La figura 35 es una fotografía que ilustra la detección con tinción de plata de los productos de la amplificación simultánea de los tres loci, D10S1239, D4S2368 y D20S481, en el Ejemplo 35.
Descripción detallada de la invención A. Definiciones
Las definiciones siguientes pretenden ayudar a proporcionar una comprensión clara y consistente del alcance y detalle de los términos:
Escalera alélica: un marcador de tamaño estándar consistente de alelos amplificados del locus.
Alelo: variación genética asociada a un segmento de ADN, es decir, una de las dos o más formas alternativas de una secuencia de ADN que ocupa el mismo locus.
Nomenclatura bioquímica: en la presente memoria se utiliza nomenclatura bioquímica estándar, en la que las bases nucleótidas se denominan adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C). Los nucleótidos correspondientes son, por ejemplo, desoxiguanosín-5'-trifosfato (dGTP).
Polimorfismo de ADN: la condición en la que coexisten en la misma población reproductora dos o más secuencias diferentes de nucleótidos en una secuencia de ADN.
Locus (o locus genético): una posición específica en un cromosoma. Los alelos de un locus se encuentran situados en sitios idénticos en cromosomas homólogos.
Cebador específico de locus: un cebador que se hibrida específicamente con una parte del locus indicado o su cadena complementaria, por lo menos en un alelo del locus, y que no se hibrida eficientemente con otras secuencias de ADN bajo las condiciones utilizadas en el procedimiento de amplificación.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): técnica en la que se utilizan ciclos de desnaturalización, hibridación con cebador, y extensión con ADN polimerasa para amplificar el número de copias de una secuencia de ADN diana aproximadamente 106 veces o más. El procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa para amplificar ácidos nucleicos queda cubierto por las patentes US nº 4.683.195 y nº 4.683.202.
Loci polimórficos de repetición corta en tándem: loci STR en los que el número de elementos de secuencia repetida (y la longitud neta de secuencia) en una región particular del ADN genómico varía de alelo a alelo y de individuo a individuo.
Contenido de información de polimorfismo (PIC): una medida de la cantidad de polimorfismo presente en un locus (Botstein et al., 1980). Los valores de PIC se encuentran comprendidos entre 0 y 1,0, indicando valores más altos mayores grados de polimorfismo. Esta medida generalmente muestra valores más reducidos que la otra medida utilizada comúnmente, la heterocigosidad. Para los marcadores altamente informativos (heterocigosidades superiores a aproximadamente el 70%), la diferencia entre la heterocigosidad y el PIC es reducida.
Reacción primaria: reacción inicial utilizando el ADN genómico humano purificado como molde para la PCR.
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Cebadores: dos oligonucleótidos de cadena única o fragmentos de ADN que se hibridan con las cadenas opuestas de un locus, de manera que los extremos 3' de los cebadores se encuentran lo más próximos posible.
Pareja de cebadores: dos cebadores, incluyendo el cebador 1, que se hibrida con una cadena única en un extremo de la secuencia de ADN que se amplifica, y el cebador 2, que se hibrida con el otro extremo en la cadena complementaria de la secuencia de ADN que se amplifica.
Sitio de cebador: área del ADN diana con el que se hibrida un cebador.
Reacción secundaria: reamplificación con la misma pareja de cebadores u otra diferente, utilizando una dilución de la reacción primaria como molde para la PCR.
Loci de repetición corta en tándem (loci STR): regiones del genoma humano que contienen elementos de secuencia repetidos cortos, de 3 a 7 pares de bases de longitud.
B. Selección de componentes de reacción multiplex
El procedimiento de la presente invención contempla seleccionar un conjunto apropiado de loci, cebadores y protocolos de amplificación para generar alelos amplificados a partir de múltiples loci coamplificados que no se solapan en tamaño o que se encuentran marcados de alguna manera para que los alelos amplificados que no se solapan en tamaño puedan distinguirse entre sí. Además, el presente procedimiento contempla la selección de loci de repeticiones cortas en tándem que sean compatibles para la utilización con un solo protocolo de amplificación. Las combinaciones específicas de loci descritas en la presente memoria son únicas en la presente solicitud. Pueden rechazarse combinaciones de loci por cualquiera de las dos razones anteriores, o debido a que, en combinación, uno o más de los loci no produce un rendimiento de producto adecuado, o se producen en esta reacción fragmentos que no representan alelos auténticos.
Las combinaciones exitosas, además de aquéllas dadas a conocer en la presente memoria, pueden generarse mediante ensayo y error de combinaciones de locus, mediante la selección de secuencias de pareja de cebadores, y mediante el ajuste de las concentraciones de cebadores para identificar un equilibrio en el que puedan amplificarse todos los loci incluidos. Tras dar a conocer el procedimiento y los materiales de la presente invención, es probable que el experto en la materia sugiera procedimientos de selección de loci, parejas de cebadores y técnicas de amplificación para la utilización en el procedimiento y kit de la presente invención. Todos estos procedimientos se pretende que se encuentren comprendidos dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Resulta de particular importancia en la práctica del procedimiento de la presente invención el intervalo de tamaños de los alelos amplificados producidos a partir de los loci individuales que se amplifican conjuntamente en la etapa de reacción de amplificación multiplex. Para facilitar el análisis con las tecnologías actuales, los sistemas que pueden detectarse mediante la amplificación de fragmentos menores de 500 bases resultan más preferentes. Las combinaciones más preferentes de loci, cebadores, y técnicas de amplificación se describen en la sección Descripción resumida de la invención, anteriormente.
La selección inapropiada de cebadores puede producir varios efectos no deseables, tales como la falta de amplificación, la amplificación en múltiples sitios, la formación de dímeros de cebadores, la interacción no deseable de secuencias de cebador de diferentes loci, la producción de alelos de un locus que se solapan con los alelos de otro, o la necesidad de condiciones o protocolos de amplificación para los diferentes loci que resultan incompatibles en un multiplex. La síntesis de los cebadores utilizados en el presente procedimiento pueden llevarse a cabo utilizando cualquier procedimiento estándar para la síntesis de oligonucleótidos conocido por los expertos en la materia.
C. Utilización de multiplexes de tres loci para el desarrollo de multiplexes utilizando más de tres loci
Puede utilizarse cualquiera de entre varias técnicas diferentes para seleccionar el conjunto de loci STR que debe analizarse utilizando un procedimiento de la presente invención. Se describe posteriormente una técnica preferente para desarrollar conjuntos útiles de loci para la utilización en el presente procedimiento de análisis. Tras desarrollar un multiplex que contiene tres loci, puede utilizarse como base para crear multiplexes que contienen más de tres loci. Se crean nuevas combinaciones que incluyen los tres primeros loci. Por ejemplo, se utilizó el multiplex nuclear que contiene los loci D7S820, D13S317 y D5S818 para generar multiplexes derivados de D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818; HUMCSF1PO, HUMTPOX, D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818; HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTHO1, D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818; y HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTHO1, HUMvWFA31, D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818.
Se contempla que puedan utilizarse los conjuntos nucleares de loci para generar otros conjuntos derivados apropiados de loci STR para análisis múltiplex utilizando el procedimiento de la presente invención. Con independencia del procedimiento utilizado para seleccionar los loci analizados utilizando el procedimiento de la presente invención, todos los loci seleccionados para el análisis multiplex deben compartir las características siguientes: (1) deben producir un deslizamiento mínimo (por ejemplo por la lectura incorrecta de la secuencia repetida durante una etapa de amplificación), (2) pocos o ningún artefacto debido a la adición o a la deleción de una base a los alelos amplificados durante la etapa de amplificación multiplex, (3) pocos o ningún artefacto debido a la terminación prematura de las reacciones de amplificación por una polimerasa, y (4) ausencia de bandas "arrastradas" de menor peso molecular de deleciones consecutivas de bases únicas por debajo de un alelo amplificado auténtico dado (ver, por ejemplo, Schumm et al., "Development of Nonisotopic Multiplex Amplification Sets for Analysis of Polimorphic STR Loci", Fourth International Symposium on Human Identification, páginas 177-187, 1993 (pub. por Promega Corp., 1993).
D. Preparación de muestras de ADN
Las muestras de ADN genómico humano pueden prepararse para la utilización en el procedimiento de la presente invención utilizando cualquier procedimiento de preparación de ADN que sea compatible con la amplificación de un solo locus. Muchos de estos procedimientos resultan adecuados para la utilización en la preparación de muestras de ADN genómico para la utilización en el procedimiento de la presente invención, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, los procedimientos de preparación de muestras de ADN descritos por Patel, P.I. et al., "Organization of the HPRT gene and related sequences in the human genome", Somat. Cell Mol. Genet. 10:483-493, 1984; y Gill, P. et al., "Forensic application of DNA ``fingerprints''", Nature 318:577-579, 1985.
Las concentraciones de ADN pueden medirse previamente a la utilización en el procedimiento de la presente invención, utilizando cualquier procedimiento estándar de detección de ADN. Sin embargo, la concentración de ADN preferentemente se mide fluorométricamente utilizando una técnica de medición tal como la descrita por Brunk, C.F. et al., "Assay for nanogram quantities of DNA in cellular homogenates", Anal. Biochem. 92:497-500, 1979. La concentración de ADN más preferentemente se mide mediante la comparación de la cantidad de hibridación de estándares de ADN con una sonda específica del ser humano, tal como la descrita por Waye et al. (1979), Waye, J.S. et al., "Sensitive and specific quantification of human genomic deoxyribonucleic acid (DNA) in forensic science specimens: casework examples", J. Forensic Sci. 36:1198-1203, 1979. La utilización de un exceso de ADN molde en las reacciones de amplificación puede producir artefactos que aparezcan como bandas adicionales que no representan alelos verdaderos.
E. Amplificación del ADN
Tras el aislamiento de una muestra de ADN genómico humano, y la determinación de su concentración tal como se ha descrito anteriormente, los loci diana pueden coamplificarse en la etapa de amplificación multiplex del presente procedimiento. Puede utilizarse cualquiera de entre varios procedimientos de amplificación diferentes para amplificar los loci, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R.K. et al., "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia", Science 230:1350-1354, 1985), la amplificación basada en la transcripción (Kwoh, D.Y. y Kwoh, T.J., "Target amplification systems in nucleic acid-based diagnostic approaches", American Biotechnology Laboratory, octubre de 1990, y la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (Walker, G.T. et al., "Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme-DNA Polymerase system", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:392-396, 1992). Preferentemente, la muestra de ADN se somete a amplificación por PCR utilizando parejas de cebadores y condiciones de termociclado específicas para cada locus en el conjunto. Se hace referencia al listado de secuencias al final de la presente especificación para detalles de las secuencias de cebadores utilizadas en los Ejemplos posteriormente, algunas de las cuales son realizaciones alternativas de la presente invención.
En los ejemplos posteriormente se proporcionan detalles del protocolo de amplificación más preferente para cada una de las combinaciones de loci más preferentes para la utilización en el procedimiento de la presente invención. También se hace referencia a los ejemplos para detalles adicionales del procedimiento específico relativo a cada multiplex. Las secuencias de los cebadores específicos de locus utilizados en los ejemplos incluyen varios nucleótidos que, bajo las condiciones utilizadas en la hibridación, resultan suficientes para la hibridación con un alelo del locus que se amplifica, y para que se encuentren esencialmente libres de la amplificación de alelos de otros loci. Se hace referencia a la patente US nº 5.192.659 de Simons para una descripción más detallada de cebadores específicos de locus.
F. Separación y detección de fragmentos de ADN
Tras producir un conjunto de alelos amplificados en la etapa de amplificación multiplex del presente procedimiento, se evalúan los alelos amplificados. La etapa de evaluación del presente procedimiento puede conseguirse mediante cualquiera de entre varios medios diferentes, el más preferente de los cuales se describe posteriormente.
La electroforesis preferentemente se utiliza para separar los productos de la reacción de amplificación multiplex, más preferentemente la electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (ver, por ejemplo, Sambrook, J. et al. (1989) en: Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 13.45-13.57). Los procedimientos de preparación de gel y de electroforesis más preferentes y las condiciones para la utilización en la etapa de evaluación del procedimiento de la presente invención se describen en el Ejemplo 1. La separación de fragmentos de ADN en un gel desnaturalizante de poliacrilamida se produce a partir del tamaño de cada fragmento.
Tras separar los alelos amplificados en un gel de poliacrilamida, los alelos y cualquier otro ADN en el gel (por ejemplo marcadores de ADN o una escalera alélica) seguidamente pueden visualizarse y analizarse. La visualización del ADN en el gel puede conseguirse utilizando cualquiera de entre varias técnicas de la técnica anterior, incluyendo la tinción con plata o informadores tales como los isótopos radioactivos, los compuestos fluorescentes, los compuestos quimioluminiscentes y enzimas en combinación con sustratos detectables. La tinción con plata es un procedimiento preferente de visualizar los alelos en el gel (ver, por ejemplo, Bassam, B.J. et al., "Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels", Anal. Biochem. 196:80-83, 1991. Un procedimiento más preferente es la utilización de cebadores marcados radioactivamente (ver, por ejemplo, Hammond et al., 1994) o marcados fluorescentemente (ver, por ejemplo, Schumm et al., 1994) para cada locus en la reacción multiplex, seguido de la detección de los productos marcados utilizando un autorradiograma o detector fluorométrico, respectivamente.
Los alelos presentes en la muestra de ADN preferentemente se determinan por comparación con un estándar de tamaño, tal como un marcador de ADN o una escalera alélica específica de locus para determinar los alelos presentes en cada locus dentro de la muestra. El marcador de tamaño más preferente para la evaluación de una amplificación multiplex que contiene dos o más loci STR polimórficos consiste de una combinación de escaleras alélicas para cada uno de los loci que se evalúan (ver, por ejemplo, la descripción de escaleras alélicas y el procedimiento de construcción de escaleras en Schumm et al., supra, en la página 178).
El marcador preferente de tamaño para la evaluación de una amplificación multiplex que contiene dos o más loci STR polimórficos que se generan utilizando cebadores marcados fluorescentemente para cada locus consiste de una combinación de escaleras alélicas marcadas fluorescentemente para los loci que se evalúan.
Tras la construcción de escaleras alélicas para los loci individuales, pueden mezclarse y cargarse para la electroforesis en gel al mismo tiempo que se cargan las muestras amplificadas. Cada escalera alélica comigra con los alelos en la muestra del locus correspondiente.
Puede generarse un registro permanente de datos utilizando película Automatic Processor Compatible (APC) (manual de STR systems nº TMD004, disponible de Promega Corporation, Madison, WI) o con la utilización de un instrumento de detección de fluorescencia (manual de STR systems nº TMD006, también disponible de Promega Corporation, Madison, WI).
G. Técnica de detección preferente: detección de fluorescencia
En una de las realizaciones más preferentes del procedimiento de la presente invención, se utilizó la detección por fluorescencia para evaluar los alelos amplificados en la mezcla producida mediante la reacción de amplificación multiplex. A continuación se proporciona una descripción resumida breve de cómo se pone en práctica preferentemente el procedimiento de detección.
Con la aparición de los sistemas automáticos de obtención de imágenes por fluorescencia, puede conseguirse una detección más rápida y el análisis de productos de amplificación multiplex. Para los análisis fluorescentes, puede incluirse un cebador fluoresceinado en la amplificación de cada locus. En los ejemplos posteriormente se incluyen las descripciones de la utilización de dos especies preferentes de cebadores marcados fluorescentemente, de cebadores marcados con fluoresceína (FL-) y de cebadores marcados con tetrametil rodamina (TMR-). La separación de los fragmentos amplificados producidos utilizado estos cebadores marcados se consigue exactamente de la misma manera que con el procedimiento de detección con pigmento de plata. El gel resultante puede analizarse utilizando un analizador FluorImager^{TM} (disponible comercialmente de Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) o FMBIOTM (disponible comercialmente de Hitachi Corporation, San Bruno, CA), que escanea el gel y digitaliza los datos en un tiempo muy corto, por ejemplo tres a veinte minutos.
En resumen, el procedimiento de la presente invención se pone en práctica más preferentemente utilizando la detección fluorescente en la etapa de evaluación. En este procedimiento preferente de detección, uno de cada pareja de cebadores utilizada en la reacción de amplificación multiplex presenta unido al mismo un marcaje fluorescente, y como resultado, los alelos amplificados producidos en la reacción de amplificación se encuentran marcados fluorescentemente. En esta realización más preferente de la invención, los alelos amplificados se seguidamente se separan en un gel de poliacrilamida y los alelos separados se visualizan y se analizan utilizando un analizador de imágenes fluorescentes.
Resulta preferente la detección fluorescente sobre otros procedimientos radioactivos de marcaje y de detección debido a que no requiere la utilización de materiales radioactivos, y todos los problemas de regulación y seguridad que acompañan a la utilización de estos materiales.
La detección fluorescente también resulta preferente sobre otros procedimientos no radioactivos de detección, tales como la tinción con plata, debido a que los procedimientos fluorescentes de detección generalmente revelan menos artefactos del gel que la tinción. El menor número de artefactos del gel probablemente se deben, en gran medida, al hecho de que sólo los fragmentos amplificados de ADN en los que se ha unido marcaje son detectados en la detección fluorescente, mientras que todos los fragmentos amplificados de ADN producidos en la reacción de amplificación multiplex resultan teñidos y se detectan utilizando el procedimiento de detección de tinción con plata. Los geles de poliacrilamida tenidos con tinción de plata también presentan una señal de fondo general considerablemente mayor debido a la unión no específica de la tinción de plata al gel mismo, reduciendo la sensibilidad con la que pueden detectarse las bandas individuales de ADN dentro del gel. A continuación se comparan la tinción con plata y los procedimientos fluorescentes de detección en dos conjuntos de ejemplos.
H. Kit
La presente invención también se refiere a kits que utilizan el procedimiento descrito anteriormente. Un kit básico comprende un recipiente con uno o más cebadores específicos de locus para cada locus. Opcionalmente pueden incluirse instrucciones de utilización.
Entre otros componentes opcionales del kit pueden incluirse una escalera alélica referida a cada uno de los loci especificados, una cantidad suficiente de enzima para la amplificación, un tampón de amplificación para facilitar la amplificación, una solución de carga para la preparación del material amplificado para la electroforesis en gel, ADN genómico humano como molde de control, un marcador de tamaños para garantizar que los materiales migran en el gel como está previsto, y un protocolo y un manual para forma al usuario y limitar los errores de utilización. Las cantidades de los diversos reactivos en los kits también pueden variarse dependiendo de varios factores, tales como la sensibilidad óptima del procedimiento. Se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invención proporcionar kits de ensayo para la utilización en aplicaciones manuales o kits de ensayo para la utilización con detectores o analizadores automáticos.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se presentan a fin de ilustrar las ventajas de la presente invención y para asistir al experto ordinario en la materia en la realización y utilización del a misma. Los ejemplos no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la exposición o la protección proporcionada por la patente.
Se llevaron a cabo el aislamiento y la cuantificación del ADN genómico esencialmente tal como describen Puers, C. et al., "Identification of repeat sequence heterogeneity at the polymorphic short tandem repeat locus HUMTO1 [AATG]n and reassignment of alleles in population analysis y using a locus-specific allelic ladder", Am. J. Hum. Genet. 53:953-958, 1993. Estos procedimientos son generalmente conocidos por los expertos en la materia y resultan preferentes, aunque no necesarios, para la aplicación de la invención.
Se separaron los productos de amplificación mediante electroforesis a través de un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 4% de 0,4 mm de grosor (proporción 19:1 de acrilamida a bis-acrilamida) que contenía urea 7 M (Sambrook et al., 1989) y que se entrecruzó químicamente a una placa de vidrio (Kobayashi, Y., "A method to cast thin sequencing gels", BRL Focus 10:73-74, 1988) en casos que implicaban el análisis con tinción de plata. No se utilizó este entrecruzamiento en los casos que implicaban el análisis por fluorescencia. Las muestras de ADN se mezclaron con 2,5 \mul de una solución de carga (NaOH 10 mM, formamida al 9%, azul de bromofenol al 0,05%, xileno cianol al 0,05%), se desnaturalizaron a 95ºC durante 2 minutos y se enfriaron en hielo previamente a la carga.
Tras la separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, los productos de reacción amplificados y los controles marcadores de tamaño de ADN se detectaron utilizando la tinción con plata, la detección fluorescente, la detección radioactiva, o una combinación de los procedimientos de detección anteriores. En algunos Ejemplos, los productos de reacción y los marcadores de tamaño en el gel se detectaron mediante tinción con plata utilizando un procedimiento estándar de tinción y de detección descrito en la técnica anterior (ver, por ejemplo, Bassam et al., Permanent images of the stained gels were obtained by exposure to Automatic Processor Compatible Film (APC Film, Promega Corporation, nº de cat. DQ4411). En otros Ejemplos, la detección se llevó a cabo mediante escaneo fluorescente, utilizando un procedimiento descrito en la técnica anteriores (Schumm et al., 1994).
Cada ejemplo posteriormente es un ejemplo de la utilización del procedimiento de la presente invención, y en algunos casos, un ejemplo de la utilización de uno o más de los cebadores de la presente invención para determinar simultáneamente los alelos presentes en por lo menos tres loci de repetición corta en tándem de una o más muestras de ADN. Las Tablas 1 y 2 resumen qué conjunto de loci se coamplificó en la reacción de amplificación multiplex descrita en cada Ejemplo posteriormente. Las dos tablas también indican qué pareja de cebadores se utilizó para detectar los alelos amplificados de las reacciones multiplex descritas en los mismos, mientras que la Tabla 2 indica los Ejemplos en los que se utilizó tinción con plata para detectar los alelos amplificados.
Un cebador de cada pareja de cebadores indicada en la Tabla 1 se marcó fluorescentemente previamente a su utilización en la reacción de amplificación multiplex. En algunos casos, se utilizó un marcaje diferente para marcar cebadores de diferentes loci, de manera que los alelos producidos utilizando los diferentes cebadores pudiesen distinguirse entre sí cuando se escaneasen con el escáner de fluorescencia utilizando en los Ejemplos posteriormente. Se utilizaron dos marcajes fluorescentes diferentes en los Ejemplos posteriormente, indicados en la Tabla 1, posteriormente, como "FL", indicando marcaje de fluoresceína, y "TMR" para indicar marcaje de tetrametil-rodamina. La Tabla 1 también indica qué cebador de cada pareja de cebadores utilizada en la reacción de amplificación multiplex se marcó de qué manera en cada ejemplo (por ejemplo, "FL-2" significa que el cebador con la SEC ID nº 2 se marcó en su extremo 5’ con fluoresceína previamente a su utilización en la reacción de amplificación multiplex).
Se utilizan las mismas abreviaturas FL y TMR en los Ejemplos posteriormente. Sin embargo, en ellos la abreviatura de marcaje se sitúa inmediatamente antes del SEC ID nº del cebador marcado que se ha utilizado en la reacción de amplificación descrita en los mismos (por ejemplo, "FL-SEC ID nº 2" en lugar de "FL-2").
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En cuatro pares de Ejemplos posteriores (Ejemplos 2 y 3, 4 y 5, 7 y 8, y 19 y 23), se analizó el mismo conjunto de loci utilizando el mismo conjunto de cebadores y l mismos marcajes fluorescentes unidos covalentemente a uno de cada pareja de cebadores para cada locus STR analizado. Sin embargo, se marcó un conjunto diferente de cebadores en cada uno de los Ejemplos. Estos pares de Ejemplos se incluyen en la presente memoria para demostrar que la misma señal de ruido reducida y resultados idénticos de determinación alélica pueden obtenerse a partir del mismo conjunto de cebadores utilizando el marcaje fluorescente como procedimiento de detección, con independencia de qué cebador de cada pareja de cebadores se marca antes de su utilización en una reacción de amplificación multiplex del procedimiento de la presente invención.
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TABLA 1
1
2
3 
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Obsérvese que en unos cuantos casos aparece el mismo conjunto de loci y el mismo conjunto de cebadores en la Tabla 1 y en la Tabla 2. En estos casos, se analizó el mismo conjunto de alelos utilizando la detección fluorescente y la tinción con plata, respectivamente. Se proporcionan dos de estos casos de conjuntos duplicados en la presente memoria, Ejemplos 24 y 23, y Ejemplos 25 y 30. Estos ejemplos ilustran claramente que pueden obtenerse los mismos resultados con ambos procedimientos.
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TABLA 2 
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4
5
Ejemplo 1 Detección fluorescente de amplificación multiplex de los loci D3S1539, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales DS31539, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde, y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo: 0,25 \muM de cada uno de los cebadores D3S1539 nº 1 [SEC ID nº 7] y nº 2 [SEC ID nº 8], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 21], 0,219 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W y los productos se visualizaron mediante detección de las señales fluorescentes utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 1, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D3S1539, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 2 Detección fluorescente de amplificación multiplex de los loci D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el siguiente protocolo de amplificación: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 3 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,25 \muM de cada uno de los cebadores D17S1298 nº 1 [SEC ID nº 9] y nº 2 [FL-SEC ID nº 10], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,219 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales fluorescentes utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 2, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 3 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818
Se amplificaron los loci D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818 tal como se describe en el Ejemplo 2, excepto en que la SEC ID nº 9 se sustituyó por FL-SEC ID nº 9 y FL-SEC ID nº 10 se sustituyó por SEC ID nº 10.
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Synnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 3, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D17S1298, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 4 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D20S481, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó simultáneamente un molde de ADN en los loci individuales D20S481, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde, y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,25 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 11] y nº 2 [FL-SEC ID nº 12], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,219 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W y los productos se visualizar mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FluorimagerTM (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 4, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D20S481, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 5 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D20S481, D7S820, D13S317 y D5S818
Se amplificaron los loci D20S481, D7S820, D13S317 y D5S818 tal como se describe en el Ejemplo 4, excepto en que se sustituyó la SEC ID nº 11 por FL-SEC ID nº 11 y FL-SEC ID nº 12 se sustituyó por la SEC ID nº 12.
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
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Se hace referencia a la figura 5, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D20S481, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 6 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D9S930, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D9S930, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,70 \muM de cada uno de los cebadores D9S930 nº 1 [SEC ID nº 13] y nº 2 [FL-SEC ID nº 14], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 6, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D9S930, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 7 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó simultáneamente un molde de ADN en los loci individuales D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el siguiente protocolo de amplificación: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D10S1239 nº 1 [SEC ID nº 15] y nº 2 [FL-SEC ID nº 16], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 7, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 8 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818
Se amplificaron los loci D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818 tal como se describe en el Ejemplo 7, excepto en que se sustituyó la SEC ID nº 15 por la secuencia FL-SEC ID nº 15 y la secuencia FL-SEC ID nº 16 se sustituyó por la SEC ID nº 16.
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 8, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 9 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D14S18, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó simultáneamente un molde de ADN en los loci individuales D14S18, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 X STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron en combinación ocho cebadores de amplificación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D14S118 nº 1 [SEC ID nº 17] y nº 2 [FL-SEC ID nº 18], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 9, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D14S118, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 10 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D14S562, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D14S562, D72820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D14S562 nº 1 [FL-SEC ID nº 19] y nº 2 [SEC ID nº 20], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 10, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D14S562, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 11 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D14S548, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D14S548, D72820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D14S548 nº 1 [SEC ID nº 21] y nº 2 [FL-SEC ID nº 22], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 11, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D14S548, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 12 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S490, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S490, D72820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D16S490 nº 1 [SEC ID nº 23] y nº 2 [SEC ID nº 24], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 11, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S490, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 13 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S753, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S753, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D16S753 nº 1 [SEC ID nº 25] y nº 2 [SEC ID nº 26], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 13, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S753, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 14 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D17S1299, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D17S1299, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D17S1299 nº 1 [SEC ID nº 27] y nº 2 [SEC ID nº 28], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 45 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 14, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D17S1299, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 15 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [SEC ID nº 30], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 15, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 16 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D22S683, D7S820, D13S317 y D5S818
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D22S683, D7S820, D13S317 y D5S818 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D22S683 nº 1 [SEC ID nº 31] y nº 2 [SEC ID nº 32], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,375 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 55 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 16, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D22S683, D7S820, D13S317 y D5S818.
Ejemplo 17 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO y HUMTPOX
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO y HUMTPOX en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,06 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,65 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [SEC ID nº 30], 0,325 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,22 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,55 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores HUMCSF1PO nº 1 [TMR-SEC ID nº 33] y nº 2 [SEC ID nº 34], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores HUMTPOX nº 1 [SEC ID nº 35] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 36].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 7, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus en escaneos separados a 505 nm y a 625 nm del mismo gel, mostrando material marcado con fluoresceína y con tetrametil-rodamina, respectivamente. Los carriles 1 a 4 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1 PO") y HUMTPOX ("TPOX").
Ejemplo 18 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX y HUMTH01
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX y HUMTH01 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,07 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron catorce cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [FL-SEC ID nº 30], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,60 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores HUMCSF1PO nº 1 [TMR-SEC ID nº 33] y nº 2 [SEC ID nº 34], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores HUMTPOX nº 1 [SEC ID nº 35] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 36] y 0,40 \muM de cada uno de los cebadores HUMTH01 nº 1 [SEC ID nº 37] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 38].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 18, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus en escaneos separados a 505 nm y a 625 nm del mismo que muestran el material marcado con fluoresceína y con tetrametil-rodamina, respectivamente. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX") y HUMTH01 ("TH01").
Ejemplo 19 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01 y HUMvWFA31
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01 y HUMvWFA31 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,08 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron dieciséis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [FL-SEC ID nº 30], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,60 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores HUMCSF1PO nº 1 [TMR-SEC ID nº 33] y nº 2 [SEC ID nº 34], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores HUMTPOX nº 1 [SEC ID nº 35] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 36], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores HUMTH01 nº 1 [SEC ID nº 37] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 38] y 40 \muM de cada uno de los cebadores HUMvWFA31 nº 1 [SEC ID nº 39] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 40].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 19, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus en escaneos separados a 505 nm y a 625 nm del mismo que muestran el material marcado con fluoresceína y con tetrametil-rodamina, respectivamente. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX"), HUMTH01 ("TH01") y HUMvWFA31 ("vWA").
Ejemplo 20 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 y HUMFESFPS
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 y HUMFESFPS en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,06 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron doce cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [FL-SEC ID nº 30], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,60 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6], 0,10 \muM de cada uno de los cebadores HUMF13A01 nº 1 [TMR-SEC ID nº 41] y nº 2 [SEC ID nº 42] y 1,0 \muM de cada uno de los cebadores HUMFESFPS nº 1 [TMR-SEC ID nº 43] y nº 2 [SEC ID nº 44].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 20, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus en escaneos separados a 505 nm y a 625 nm del mismo que muestran el material marcado con fluoresceína y con tetrametil-rodamina, respectivamente. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01") y HUMFESFPS ("FESFPS").
Ejemplo 21 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS y HUMBEXIII
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS y HUMBEXIII en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,07 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron catorce cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [FL-SEC ID nº 30], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,60 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6], 0,10 \muM de cada uno de los cebadores HUMF13A01 nº 1 [TMR-SEC ID nº 41] y nº 2 [SEC ID nº 42], 1,0 \muM de cada uno de los cebadores HUMFESFPS nº 1 [TMR-SEC ID nº 43] y nº 2 [SEC ID nº 44] y 0,50 \muM de cada uno de los cebadores HUMBFXIII nº 1 [TMR-SEC ID nº 45] y nº 2 [SEC ID nº 46].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 21, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus en escaneos separados a 505 nm y a 625 nm del mismo que muestran el material marcado con fluoresceína y con tetrametil-rodamina, respectivamente. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01"), HUMFESFPS ("FESFPS") y HUMBFXIII ("F13B").
Ejemplo 22 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII y HUMLIPOL
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII y HUMLIPOL en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,08 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron dieciséis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [FL-SEC ID nº 30], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [FL-SEC ID nº 2], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4], 0,60 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [FL-SEC ID nº 6], 0,10 \muM de cada uno de los cebadores HUMF13A01 nº 1 [TMR-SEC ID nº 41] y nº 2 [SEC ID nº 42], 1,0 \muM de cada uno de los cebadores HUMFESFPS nº 1 [TMR-SEC ID nº 43] y nº 2 [SEC ID nº 44], 0,50 \muM de cada uno de los cebadores HUMBFXIII nº 1 [TMR-SEC ID nº 45] y nº 2 [SEC ID nº 46] y 20 \muM de cada uno de los cebadores HUMLIPOL nº 1 [TMR-SEC ID nº 47] y nº 2 [SEC ID nº 48].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 22, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus en escaneos separados a 505 nm y a 625 nm del mismo que muestran el material marcado con fluoresceína y con tetrametil-rodamina, respectivamente. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 ("F13A01"), HUMFESFPS ("FESFPS"), HUMBFXIII ("F13B") y HUMLIPOL ("LPL").
Ejemplo 23 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMFCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01 y HUMvWFA31
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMFCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01 y HUMvWFA31 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,08 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron dieciséis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 30], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 2], 0,30 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 4], 0,60 \muM de cada uno de los cebadores D5S818 nº 1 [SEC ID nº 5] y nº 2 [TMR-SEC ID nº 6], 0,50 \muM de cada uno de los cebadores HUMTPOX nº 1 [SEC ID nº 35] y nº 2 [FL-SEC ID nº 36], 0,20 \muM de cada uno de los cebadores HUMTH01 nº 1 [SEC ID nº 37] y nº 2 [FL-SEC ID nº 38], 0,55 \mum de cada uno de los cebadores HUMvWFA31 nº 1 [SEC ID nº 39] y nº 2 [FL-SEC ID nº 40].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 23, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus en escaneos separados a 505 nm y a 625 nm del mismo que muestran el material marcado con fluoresceína y con tetrametil-rodamina, respectivamente. Los carriles 1 a 3 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO ("CSF1PO"), HUMTPOX ("TPOX"), HUMTH01 ("TH01") y HUMvWFA31 ("vWA").
Ejemplo 24 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D3S1539 nº 1 [SEC ID nº 7] y nº 2 [FL-SEC ID nº 49], 0,75 \muM de cada uno de los cebadores D19S253 nº 1 [FL-SEC ID nº 50] y nº 2 [SEC ID nº 51], 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [FL-SEC ID nº 4] y 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 52] y nº 2 [FL-SEC ID nº 53].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia FMBIOFluorimager^{TM} (Hitachi Software Engineering, San Bruno, CA).
Se hace referencia a la figura 24, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481.
Ejemplo 25 Detección fluorescente de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,30 \muM de cada uno de los cebadores D10S1239 nº 1 [FL-SEC ID nº 15] y nº 2 [SEC ID nº 54], 0,40 \muM de cada uno de los cebadores D9S930 nº 1 [SEC ID nº 55] y nº 2 [FL-SEC ID nº 14], 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D4S2368 nº 1 [SEC ID nº 56] y nº 2 [FL-SEC ID nº 57] y 0,50 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 52] y nº 2 [FL-SEC ID nº 53].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante la detección de las señales de fluorescencia utilizando el escáner de fluorescencia Fluorimager^{TM} (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Se hace referencia a la figura 25, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481.
Ejemplo 26 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820 y D13S317
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820 y D13S317 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,03 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron seis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [SEC ID nº 58], 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [SEC ID nº 2] y 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [SEC ID nº 4].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 26, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 4 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820 y D13S317, y el carril 5 muestra una muestra sin molde de ADN sometida al mismo procedimiento, es decir, un control negativo.
Ejemplo 27 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D16S539, D7S820, D13S317 y HUMvWFA31
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D16S539, D7S820, D13S317 y HUMvWFA31 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,3 \muM de cada uno de los cebadores D16S539 nº 1 [SEC ID nº 29] y nº 2 [SEC ID nº 30], 0,3 \muM de cada uno de los cebadores D7S820 nº 1 [SEC ID nº 1] y nº 2 [SEC ID nº 2], 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [SEC ID nº 4] y 0,5 \muM de cada uno de los cebadores HUMvWFA31 nº 1 [SEC ID nº 59] y nº 2 [SEC ID nº 60].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 32 cm durante 50 minutos a 40 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 27, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 3 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D16S539, D7S820, D13S317 y HUMvWFA31 ("vWA").
Ejemplo 28 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D9S930 y D13S317
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D10S1239, D9S930 y D13S317 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando una cantidad en ng indeterminada de molde y 0,03 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos.
Se utilizaron seis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D10S1239 nº 1 [SEC ID nº 15] y nº 2 [SEC ID nº 54], 0,3 \muM de cada uno de los cebadores D9S930 nº 1 [SEC ID nº 55] y nº 2 [SEC ID nº 61] y 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [SEC ID nº 4].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 60 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 28, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 3 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D9S930 y D13S317.
Ejemplo 29 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D9S930 y D4S2368
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D10S1239, D9S930 y D4S2368 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando una cantidad en ng indeterminada de molde y 0,03 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron seis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D10S1239 nº 1 [SEC ID nº 15] y nº 2 [SEC ID nº 54], 0,3 \muM de cada uno de los cebadores D9S930 nº 1 [SEC ID nº 55]
y nº 2 [SEC ID nº 61] y 0,15 \muM de cada uno de los cebadores D4S2368 nº 1 [SEC ID nº 56] y nº 2 [SEC ID nº 57].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 60 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 29, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 6 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D9S930 y D4S2368.
Ejemplo 30 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando una cantidad en ng indeterminada de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D10S1239 nº 1 [SEC ID nº 15] y nº 2 [SEC ID nº 54], 4,0 \muM de cada uno de los cebadores D9S930 nº 1 [SEC ID nº 55] y nº 2 [SEC ID nº 14], 0,2 \muM de cada uno de los cebadores D4S2368 nº 1 [SEC ID nº 56] y nº 2 [SEC ID nº 57] y 0,2 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 52] y nº 2 [SEC ID nº 53].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 67 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 30, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 4 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D9S930, D4S2368 y D20S481.
Ejemplo 31 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D3S1539, D19S253 y D13S317
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D3S1539, D19S253 y D13S317 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5,0 ng de molde y 0,03 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos.
Se utilizaron seis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D3S1539 nº 1 [SEC ID nº 7] y nº 2 [SEC ID nº 49], 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D19S253 nº 1 [SEC ID nº 50] y nº 2 [SEC ID nº 51] y 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [SEC ID nº 4].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 65 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 31, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 4 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D3S1539, D19S253 y D13S317, y el carril 5 muestra una muestra sin molde de ADN sometida a los mismos procedimientos, es decir, un control negativo.
Ejemplo 32 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D3S1539, D19S253, D4S2368 y D20S481
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D3S1539, D19S253, D4S2368 y D20S481 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 5,0 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D3S1539 nº 1 [SEC ID nº 7] y nº 2 [SEC ID nº 49], 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D19S253 nº 1 [SEC ID nº 50] y nº 2 [SEC ID nº 51], 0,1 \muM de cada uno de los cebadores D4S2368 nº 1 [SEC ID nº 56] y nº 2 [SEC ID nº 57] y 0,1 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 52] y nº 2 [SEC ID nº 53].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 65 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 32, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 4 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D3S1539, D19S253, D4S2368 y D20S481, y el carril 5 muestra una muestra sin molde de ADN sometida a los mismos procedimientos, es decir, un control negativo.
Ejemplo 33 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 0,5 a 250 ng de molde y 0,04 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron ocho cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D3S1539 nº 1 [SEC ID nº 7] y nº 2 [SEC ID nº 49], 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D19S253 nº 1 [SEC ID nº 50] y nº 2 [SEC ID nº 51], 0,5 \muM de cada uno de los cebadores D13S317 nº 1 [SEC ID nº 3] y nº 2 [SEC ID nº 4] y 0,2 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 52] y nº 2 [SEC ID nº 53].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 68 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991). Se hace referencia a la figura 33, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D3S1539, D19S253, D13S317 y D20S481, y el carril 6 muestra una muestra sin molde de ADN sometida a los mismos procedimientos, es decir, un control negativo.
Ejemplo 34 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D9S930 y D20S481
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D10S1239, D9S930 y D20S481 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 0,5 a 250 ng de molde y 0,03 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron seis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D10S1239 nº 1 [SEC ID nº 15] y nº 2 [SEC ID nº 54], 4,0 \muM de cada uno de los cebadores D9S930 nº 1 [SEC ID nº 55] y nº 2 [SEC ID nº 14] y 0,2 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 52] y nº 2 [SEC ID nº 53].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 68 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 34, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D9S930 y D20S481, y el carril 6 muestra una muestra sin molde de ADN sometida a los mismos procedimientos, es decir, un control negativo.
Ejemplo 35 Detección con plata de la amplificación multiplex de los loci D10S1239, D4S236 y D20S481
En el presente ejemplo, se amplificó un molde de ADN simultáneamente en los loci individuales D10S1239, D4S236 y D20S481 en un solo recipiente de reacción. La amplificación por PCR se llevó a cabo en 25 \mul de tampón 1 x STR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a 25ºC), Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM y 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) utilizando 0,5 a 250 ng de molde y 0,03 U de ADN polimerasa Taq/\mul. Se utilizó un ciclador térmico 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) con el protocolo de amplificación siguiente: 96ºC durante 2 minutos, después 10 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, y 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 20 ciclos de 90ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto, 70ºC durante 1,5 minutos, seguido de 1 ciclo de 60ºC durante 30 minutos.
Se utilizaron seis cebadores de amplificación en combinación, incluyendo 1,0 \muM de cada uno de los cebadores D10S1239 nº 1 [SEC ID nº 15] y nº 2 [SEC ID nº 54], 0,2 \muM de cada uno de los cebadores D4S2368 nº 1 [SEC ID nº 56] y nº 2 [SEC ID nº 57] y 0,2 \muM de cada uno de los cebadores D20S481 nº 1 [SEC ID nº 52] y nº 2 [SEC ID nº 53].
Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en un gel de 40 cm durante 68 minutos a 60 W, y los productos se visualizaron mediante análisis de la tinción de plata de acuerdo con el protocolo de Bassam et al. (1991).
Se hace referencia a la figura 35, que muestra los fragmentos amplificados de cada locus. Los carriles 1 a 5 contienen muestras de ADN coamplificadas simultáneamente para los loci D10S1239, D4S2368 y D20S481, y el carril 6 muestra una muestra sin molde de ADN sometida a los mismos procedimientos, es decir, un control negativo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Schumm, James W.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Amplificación multiplex de loci de repeticiones cortas en tándem
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 61
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Promega Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2800 Woods Hollow Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Madison
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Wisconsin
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
NACIÓN: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 53711-5399
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS, versión 6.0
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: WordPerfect 5.1 (formato de texto de DOS)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/632.575
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 15/IV/96
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN: 435
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 03/316.544
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 30/IX/94
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico humano
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D7S820
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAACACTTGT CATAGTTTAG AACG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D7S820
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGAGGTATC AAAAACTCAG AGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D13S317
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACAGAAGTCT GGGATGTGGA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D13S317
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCCAAAAAG ACAGACAGAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D5S818
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTGATTTT CCTCTTTGGT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D5S818
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGATTCCAAT CATAGCCACA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D3S1539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTCTTTCCA TTACTCTCTC CATAGC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D3S1539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGCTGTTT TAGCTTCCAG GA 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1298
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGGTCTTT TGGTTGCCAG TATG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 10
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1298
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTCAGTAAA CCTGTGACCT GAGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 11
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATGGTGAGA AATGGGTTAT GAGTGC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTCCGGCTT TGTGTCATAA AACAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGACAACAG AGTGAGATGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTATGGGAA TTACAAGCAG GAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D10S1239
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTTGAAATG GACCCCTAGC TAATGT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D10S1239
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCCTGTCC CCAGCTATCT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S118
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCTTGGGC AACATAGGG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S118
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAACTCCTG AGGTCAAACA ATCC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S562
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTGGAGGGT GGGGTGGCTA A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 20
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14SS62
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAAATTTTG TTGCCTTGCT CTGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 21
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S548
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGGGCAAC AGAGTGAGAC T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S548
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCAGCTTT AACAGTTTGT GCTT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 23
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S490
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGGACAC AGAATGTAAA ATC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 24
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S490
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAACCCAAAT AGATGACAGG CACA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 25
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S753
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCACTCCAGG CTGAATGACA GAAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S753
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGTGCCGC CTATTTTTGT GAAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1299
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCTGATGA GATAGCACTT GAGC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 28
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1299
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACTGTGTGG AGGTGTAGCA GAGA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 29
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGGTCTAA GAGCTTGTAA AAAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 30
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGCATCTG TAAGCATGTA TCTATC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 31
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D22S683
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAAGGTTGC ATTGAGCCAA GAT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 32
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D22S683
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGTGGAAAT GCCTCATGTA GAAA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 33
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMCSF1PO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACCTGAGTC TGCCAAGGAC TAGC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 34
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMCSF1PO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCCACACAC CACTGGCCAT CTTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 35
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTPOX
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGGCACAG AACAGGCACT TAGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 36
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTPOX
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGGAACTG GGAACCACAC AGGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 37
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTH01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTCAAAGGG TATCTGGGCT CTGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 38
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTH01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGGCTGAA AAGCTCCCGA TTAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 39
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAAGCCCTA GTGGATGATA AGAATAATC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 40
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggacagatga taaatacata ggatggatgg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 41
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMF13A01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGTTGCAC TCCAGCCTTT GCAA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 42
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMF13A01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCCTGAATC ATCCCAGAGC CACA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 43
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMFESFPS
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGTTAATT CATGTAGGGA AGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 44
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMFESFPS
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGTCCCAG CTACTTGGCT ACTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 45
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMBFXIII
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAGGTGGTG TACTACCATA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 46
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMBFXIII
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCATGCCA TTGCACTCTA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 47
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMLIPOL
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGACCAAGG ATAGTGGGAT ATAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 48
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMLIPOL
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTAACTGAG CGAGACTGTG TCT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 49
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D3S1539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCCTTTC AGCACCAG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 50
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D19S253
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATAGACAGAC AGACGGACTG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 51
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D19S253
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGAGTGGAG ATTACCCCT 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 52
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGCTCTCT GAAGCAGGTG T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 53
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGATTGCAC TAGAAAGAGA GGAA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 54
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D10S1239
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCCTGTCC CCAGCTATCT GGA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 55
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTTGAATCT TGAGTCTCTC AGAGTCA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 56
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D4S2368
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTACTCATT TTCCCGCAAT GATG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 57
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D4S2368
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGAAAGTA GGGTCTGGGC TCTT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 58
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGCATCTG TAAGCATGTA TCTATCAT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 59
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAAGCCCTA GTGGATGATA AGAATAATCA GT 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 60
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGACAGATGA TAAATACATA GGATGGATGG ATA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 61
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTATGGGAA TTACAAGCAG GAAAC 
\hfill
25 
\newpage
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Promega Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 2800 Woods Hollow Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Madison
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
NACIÓN: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): WI 53711-5399
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: amplificación multiplex de loci de repeticiones cortas en tándem
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 61
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WordPerfect 5.1 y PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97929672.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/06293
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-ABRIL-1997
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/632.575
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-ABRIL-1996
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico humano
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D7S820
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAACACTTGT CATAGTTTAG AACG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D7S820
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGAGGTATC AAAAACTCAG AGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D13S317
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACAGAAGTCT GGGATGTGGA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D13S317
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCCAAAAAG ACAGACAGAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D5S818
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTGATTTT CCTCTTTGGT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D5S818
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGATTCCAAT CATAGCCACA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D3S1539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTCTTTCCA TTACTCTCTC CATAGC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D3S1539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGCTGTTT TAGCTTCCAG GA 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1298
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGGTCTTT TGGTTGCCAG TATG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 10
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1298
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTCAGTAAA CCTGTGACCT GAGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 11
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATGGTGAGA AATGGGTTAT GAGTGC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTCCGGCTT TGTGTCATAA AACAG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGACAACAG AGTGAGATGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTATGGGAA TTACAAGCAG GAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D10S1239
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTTGAAATG GACCCCTAGC TAATGT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D10S1239
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCCTGTCC CCAGCTATCT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S118
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCTTGGGC AACATAGGG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S118
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAACTCCTG AGGTCAAACA ATCC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S562
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTGGAGGGT GGGGTGGCTA A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 20
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S562
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAAATTTTG TTGCCTTGCT CTGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 21
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S548
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGGGCAAC AGAGTGAGAC T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D14S548
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCAGCTTT AACAGTTTGT GCTT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 23
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S490
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGGACAC AGAATGTAAA ATC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 24
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S490
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAACCCAAAT AGATGACAGG CACA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 25
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S753
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCACTCCAGG CTGAATGACA GAAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S753
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGTGCCGC CTATTTTTGT GAAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1299
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCTGATGA GATAGCACTT GAGC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 28
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D17S1299
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACTGTGTGG AGGTGTAGCA GAGA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 29
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGGTCTAA GAGCTTGTAA AAAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 30
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGCATCTG TAAGCATGTA TCTATC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 31
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D22S683
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAAGGTTGC ATTGAGCCAA GAT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 32
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D22S683
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGTGGAAAT GCCTCATGTA GAAA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 33
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMCSF1PO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACCTGAGTC TGCCAAGGAC TAGC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 34
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMCSF1PO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCCACACAC CACTGGCCAT CTTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 35
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTPOX
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGGCACAG AACAGGCACT TAGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 36
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTPOX
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGGAACTG GGAACCACAC AGGT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 37
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTH01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTCAAAGGG TATCTGGGCT CTGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 38
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMTH01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGGCTGAA AAGCTCCCGA TTAT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 39
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAAGCCCTA GTGGATGATA AGAATAATC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 40
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCAGATGA TAAATACATA GGATGGATGG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 41
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMF13A01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGTTGCAC TCCAGCCTTT GCAA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 42
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMF13A01
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCCTGAATC ATCCCAGAGC CACA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 43
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMFESFPS
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGTTAATT CATGTAGGGA AGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 44
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMFESFPS
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGTCCCAG CTACTTGGCT ACTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 45
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMBFXIII
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAGGTGGTG TACTACCATA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 46
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMBFXIII
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCATGCCA TTGCACTCTA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 47
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMLIPOL
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGACCAAGG ATAGTGGGAT ATAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 48
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMLIPOL
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTAACTGAG CGAGACTGTG TCT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 49
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D3S1539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCCTTTC AGCACCAG 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 50
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D19S253
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATAGACAGAC AGACGGACTG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 51
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D19S253
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGAGTGGAG ATTACCCCT 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 52
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCTCTCT GAAGCAGGTG T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 53
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D20S481
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGATTGCAC TAGAAAGAGA GGAA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 54
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D10S1239
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCCTGTCC CCAGCTATCT GGA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 55
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTTGAATCT TGAGTCTCTC AGAGTCA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 56
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D4S2368
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTACTCATT TTCCCGCAAT GATG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 57
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D4S2368
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGAAAGTA GGGTCTGGGC TCTT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 58
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D16S539
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGCATCTG TAAGCATGTA TCTATCAT 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 59
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAAGCCCTA GTGGATGATA AGAATAATCA GT 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 60
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: HUMvWFA31
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGACAGATGA TAAATACATA GGATGGATGG ATA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 61
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: D9S930
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTATGGGAA TTACAAGCAG GAAAC 
\hfill
25

Claims (42)

1. Procedimiento para determinar simultáneamente los alelos presentes en loci de repeticiones cortas en tándem de una o más muestras de ADN, que comprende:
a.
proporcionar por lo menos una muestra de ADN a analizar,
b.
seleccionar un conjunto de loci de repeticiones cortas en tándem de la muestra de ADN a analizar que pueden amplificarse conjuntamente, en el que el conjunto de loci se selecciona de entre el grupo de conjuntos de loci que consiste de:
D3S1539, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818;
D20S481, D7S820, D13S317, D5S818;
D9S930, D7S820, D13S317, D5S818;
D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S118, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S562, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S548, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S490, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1299, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818;
D22S683, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S753, D7S820, D13S317, D5S818;
D3S1539, D19S253, D13S317, D20S481;
D3S1539, D19S253, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S930, D4S2368, D20S481; y
D16S539, D7S820, D13S317, HUMvWFA31;
c.
coamplificar el conjunto de loci en una reacción de amplificación multiplex, en el que el producto de la reacción es una mezcla de alelos amplificados de cada uno de los loci coamplificados en el conjunto; y
d.
evaluar los alelos amplificados para determinar los alelos presentes en cada uno de los loci analizados en el conjunto en la muestra de ADN.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los loci coamplificados en el mismo se seleccionan de entre:
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO y HUMTPOX; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01 y HUMFESFPS.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el conjunto de loci coamplificados en el mismo se seleccionan de entre:
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX y HUMTH01; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS y HUMBFXIII
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el conjunto de loci coamplificados en el mismo se selecciona de entre:
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01 y HUMvWFA31; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII y HUMLIPOL.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en el que la reacción de amplificación multiplex se lleva a cabo utilizando parejas de cebadores que flanquean los loci analizados.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, comprendiendo adicionalmente la etapa de seleccionar parejas de cebadores para la reacción de amplificación multiplex que produce alelos de cada locus que no se solapan con los alelos de otros loci en el conjunto coamplificado en el mismo, cuando los alelos se separan mediante electroforesis en gel.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que por lo menos uno de cada pareja de cebadores utilizados en la reacción de amplificación multiplex presenta una secuencia seleccionada de entre uno de los grupos de secuencias que consisten de:
SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2, cuando uno de los loci en el conjunto es D7S820;
SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4, cuando uno de los loci en el conjunto es D13S317;
SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, cuando uno de los loci en el conjunto es D5S818;
SEC ID nº 7, SEC ID nº 8 y SEC ID nº 49, cuando uno de los loci en el conjunto es D3S1539;
SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10, cuando uno de los loci en el conjunto es D17S1298;
SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53, cuando uno de los loci en el conjunto es D20S481;
SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 55, SEC ID nº 61, cuando uno de los loci en el conjunto es D9S930;
SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 54, cuando uno de los loci en el conjunto es D10S1239;
SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, cuando uno de los loci en el conjunto es D14S118;
SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, cuando uno de los loci en el conjunto es D14S562;
SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, cuando uno de los loci en el conjunto es D14S548;
SEC ID nº 23, SEC ID nº 24, cuando uno de los loci en el conjunto es D16S490;
SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, cuando uno de los loci en el conjunto es D16S753;
SEC ID nº 27, SEC ID nº 28, cuando uno de los loci en el conjunto es D17S1299;
SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 58, cuando uno de los loci en el conjunto es D16S539;
SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, cuando uno de los loci en el conjunto es D22S683;
SEC ID nº 33, SEC ID nº 34, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMCSF1PO;
SEC ID nº 35, SEC ID nº 36, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMTPOX;
SEC ID nº 37, SEC ID nº 38, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMT01;
SEC ID nº 39, SEC ID nº 40, SEC ID nº 59, SEC ID nº 60, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMvWFA31;
SEC ID nº 41, SEC ID nº 42, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMF13A01;
SEC ID nº 43, SEC ID nº 44, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMFESFPS;
SEC ID nº 45, SEC ID nº 46, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMBFXIII;
SEC ID nº 47, SEC ID nº 48, cuando uno de los loci en el conjunto es HUMLIPOL;
SEC ID nº 50, SEC ID nº 51, cuando uno de los loci en el conjunto es D19S253; y
SEC ID nº 56, SEC ID nº 57, cuando uno de los loci en el conjunto es D4S2369.
8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la reacción de amplificación multiplex es una reacción en cadena de la polimerasa.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en el que los alelos amplificados se evalúan comparando los alelos amplificados a un estándar de tamaño, en el que el estándar de tamaño se selecciona de entre el grupo de estándares de tamaño que consiste de un marcador de ADN y una escalera alélica específica de locus.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en el que los alelos amplificados se evalúan utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida para separar los alelos, formando un gel de poliacrilamida de los alelos separados.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los alelos separados en el gel de poliacrilamida se determinan visualizando los alelos mediante análisis de tinción de plata.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los cebadores capaces de unirse a una región flanqueante de cada uno de los loci en el conjunto se utilizan para coamplificar los loci, en el que por lo menos uno de los cebadores utilizados para coamplificar cada locus presenta un marcaje fluorescente unido covalentemente a los mismos, de manera que los alelos amplificados producidos a partir de ellos se encuentran marcados fluorescentemente, y en el que los alelos separados en el gel de poliacrilamida se determinan visualizando los alelos mediante análisis de fluorescencia.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el marcaje fluorescente se selecciona de entre el grupo de marcajes que consiste de fluoresceína y tetrametil-rodamina.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en el que se ha aislado por lo menos una muestra de ADN a analizar de tejido humano, en la que el tejido humano se selecciona de entre el grupo de tejido humano que consiste de sangre, semen, células vaginales, pelo, saliva, orina, líquido amniótico que contiene células placentarias o células fetales, y mezclas de cualquiera de los tejidos indicados anteriormente.
15. Procedimiento para determinar simultáneamente los alelos presentes en tres loci de repeticiones cortas en tándem de una o más muestras de ADN, que comprende:
a.
proporcionar por lo menos una muestra de ADN a analizar,
b.
seleccionar un conjunto de tres loci de la muestra de ADN a analizar que pueden amplificarse conjuntamente, en el que el conjunto de tres loci comprende un conjunto de tres loci seleccionados de entre el grupo de conjuntos de loci que consiste de:
D3S1539, D19S253, D13S317;
D10S1239, D9S930, D20S481;
D10S1239, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S930, D4S2368,
D16S530, D7S820, D13S317; y
D10S1239, D9S930, D13S317.
c.
coamplificar el conjunto de tres loci en una reacción de amplificación multiplex, en el que el producto de la reacción es una mezcla que comprende alelos amplificados de cada uno de los loci coamplificados en el conjunto de tres loci; y
d.
evaluar los alelos amplificados en la mezcla para determinar por lo menos los alelos presentes en cada uno de los tres loci analizados en el conjunto de tres loci en la muestra de ADN.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el conjunto de tres loci se selecciona de entre el grupo de conjuntos de loci que consiste de:
D13S1539, D19S253, D13S317;
D10S1239, D9S930, D20S481;
D10S1239, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S930; D4S2368;
D16S539, D7S820, D13S317; y
D10S1239, D9S930, D13S317.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que la reacción de amplificación multiplex se lleva a cabo utilizando tres parejas de cebadores, en el que cada pareja de cebadores flanquea uno de los tres loci de repeticiones cortas en tándem en el conjunto de loci coamplificados en la reacción.
18. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que cada una de las tres parejas de cebadores utilizadas en la reacción de amplificación multiplex se diseña para que se hibride con un alelo de un locus en el conjunto de loci coamplificados en la reacción, en la que:
cuando D7S820 es uno de los loci en el conjunto de loci coamplificados, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2;
cuando D13S3178 es uno de los loci en el conjunto de loci coamplificados, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4;
cuando D20S481 es uno de los loci en el conjunto de loci coamplificado, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53;
cuando DS930 es uno de los loci en el conjunto de loci coamplificado, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 55 y SEC ID nº 61;
cuando D10S1239 es uno de los loci en el conjunto de loci coamplificado, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 15; SEC ID nº 16 y SEC ID nº 44;
cuando D16S539 es uno de los loci en el conjunto de loci coamplificado, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 29 y SEC ID nº 30; y
cuando D4S2368 es uno de los loci en el conjunto de loci coamplificado, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 56 y SEC ID nº 57.
19. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que la reacción de amplificación multiplex es una reacción en cadena de polimerasa.
20. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que los alelos amplificados se evalúan mediante la comparación de los alelos amplificados con un estándar de tamaño, en el que el tamaño estándar se selecciona de entre el grupo de estándares de tamaño que consiste de un marcador de ADN y una escalera alélica específica de locus.
21. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que los alelos amplificados se evalúan utilizando electroforesis de gel de poliacrilamida para separar los alelos, formando un gel de poliacrilamida de los alelos separados.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que los alelos separados en el gel de poliacrilamida se determinan visualizando los alelos mediante análisis de tinción de plata.
23. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que los alelos separados en el gel de poliacrilamida se determinan visualizando los alelos mediante análisis de fluorescencia.
24. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que se ha aislado por lo menos una muestra de ADN a analizar de tejido humano, en la que el tejido humano se selecciona de entre el grupo de tejidos humanos que consiste de sangre, semen, tejido vaginal, pelo, saliva, orina, hueso, muestra bucal, líquido amniótico que contiene células placentarias o células fetales, y mezclas de cualquiera de los tejidos indicados anteriormente.
25. Kit para analizar simultáneamente secuencias de repetición corta en tándem, que comprende un recipiente que presenta cebadores oligonucleótidos para coamplificar un conjunto de loci de repetición corta en tándem, en el que el conjunto de loci se selecciona de entre los conjuntos de loci que consisten de:
D3S1539, D19S253, D13S317;
D10S1239, D9S930, D20S481;
D10S1239, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S930, D4S2368;
D16S539, D7S820, D13S317;
D10S1239, D9S930, D13S317;
D3S1539, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1298, D7S820, D13S317, D5S818;
D20S481, D7S820, D13S317, D5S818;
D9S930, D7S820, D13S317, D5S818;
D10S1239, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S118, D7S820, D13S317, D4S818;
D14S562, D7S820, D13S317, D5S818;
D14S548, D7S820, D13S137, D5S818;
D16S490, D7S820, D13S317, D5S818;
D17S1299, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818;
D22S683, D7S820, D13S317, D5S818;
D16S753, D7S820, D13S317, D5S818;
D3S1539, D9S5253, D13S317, D20S481;
D3S1539, D19S5253, D4S2368, D20S481;
D10S1239, D9S930, D4S2368, D20S481;
D16S539, D7S820, D13S317, HUMVWFA31;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII;
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMTH01, HUMvWFA31; y
D16S539, D7S820, D13S317, D5S818, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMBFXIII, HUMLIPOL; en los que cada uno de los cebadores oligonucleótidos se diseña para que se hibride con un alelo de uno de los tres loci en el conjunto de loci seleccionado, en el que:
cuando D7S820 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2;
cuando D13S317 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4;
cuando D5S818 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6;
cuando D17S1298 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10;
cuando D20S481 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 52, SEC ID nº 53;
cuando D9S930 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 55, SEC ID nº 61;
cuando D10S1239 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 54;
cuando D14S118 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 17, SEC ID nº 18;
cuando D14S562 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 19, SEC ID nº 20;
cuando D14S548 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 21, SEC ID nº 22;
cuando D16S490 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 23, SEC ID nº 24;
cuando D16S753 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 25, SEC ID nº 26;
cuando D17S1299 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 27, SEC ID nº 28;
cuando D16S539 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 29, SEC ID nº 30, SEC ID nº 58;
cuando D22S683 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 31, SEC ID nº 32;
cuando HUMCSF1PO es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 33, SEC ID nº 34;
cuando HUMTPOX es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 35 y SEC ID nº 36;
cuando HUMTH01 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 37, SEC ID nº 38;
cuando HUMvWFA31 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 39, SEC ID nº 40, SEC ID nº 60;
cuando HUMF13A01 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 41 y SEC ID nº 42;
cuando HUMFESFPS es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 43, SEC ID nº 44;
cuando HUMBFXIII es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 45, SEC ID nº 46;
cuando HUMLIPOL es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 47, SEC ID nº 48;
cuando D19S253 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 50 y SEC ID nº 51;
cuando D4S2368 es uno de los loci en el conjunto, por lo menos uno de los cebadores presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 56, SEC ID nº 57.
26. Kit según la reivindicación 25, que comprende además un recipiente que presenta reactivos para por lo menos una reacción de amplificación multiplex.
27. Kit según la reivindicación 25, que comprende además un recipiente que presenta una escalera alélica.
\newpage
28. Kit según la reivindicación 27, en el que cada escalón de la escalera alélica y por lo menos un cebador oligonucleótido para cada uno de los loci en el conjunto presentan, cada uno, un marcaje unido covalentemente a los mismos.
29. Kit según la reivindicación 28, en el que el marcaje es un marcaje fluorescente.
30. Kit según la reivindicación 29, en el que por lo menos uno de los cebadores oligonucleótidos presenta un marcaje fluorescente unido covalentemente al mismo diferente del que presentan otras parejas de cebadores en el recipiente.
31. Procedimiento para determinar simultáneamente los alelos presentes en loci de repeticiones cortas en tándem de una o más muestras de ADN, que comprende:
a.
proporcionar por lo menos una muestra de ADN a analizar,
b.
seleccionar un conjunto de loci de repeticiones cortas en tándem de la muestra de ADN a analizar que puede amplificarse conjuntamente, en el que tres de los loci en el conjunto son D7S820, D13S317 y D5S818;
c.
coamplificar el conjunto de loci en una reacción de amplificación multiplex,
en el que el producto de la reacción comprende una mezcla de alelos amplificados de cada uno de los loci coamplificados en el conjunto; y
d.
evaluar los alelos amplificados en la mezcla para determinar los alelos presentes en cada uno de los loci analizados en el conjunto en la muestra de ADN.
32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la reacción de amplificación multiplex se lleva a cabo utilizando parejas de cebadores que flanquean los loci analizados.
33. Procedimiento según la reivindicación 31 ó 32, que comprende adicionalmente la etapa de seleccionar parejas de cebadores para la reacción de amplificación multiplex que produce alelos de cada locus que no se solapan con los alelos de los otros loci en el conjunto coamplificado en la misma, cuando los alelos se separan mediante electroforesis en gel.
34. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que la reacción de amplificación multiplex es una reacción en cadena de polimerasa.
35. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que los alelos amplificados se evalúan mediante la comparación de los alelos amplificados con un estándar de tamaño, en la que el estándar de tamaño se selecciona de entre el grupo que estándares de tamaño que consiste de un marcador de ADN y una escalera alélica específica de locus.
36. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que los alelos amplificados se evalúan utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida para separar los alelos, formando un gel de poliacrilamida de alelos separados.
37. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que los alelos separados en el gel de poliacrilamida se determinan visualizando los alelos mediante análisis de tinción de plata.
38. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que los cebadores capaces de unirse a una región flanqueante de cada uno de los loci en el conjunto se utilizan para coamplificar los loci, en el que por lo menos uno de los cebadores utilizados para coamplificar cada locus presenta un marcaje fluorescente unidos covalentemente a los mismos de manera que los alelos amplificados producidos a partir de ellos se encuentran marcados fluorescentemente, y en el que los alelos separados en el gel de poliacrilamida se determinan visualizando los alelos mediante análisis de fluorescencia.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el marcaje fluorescente se selecciona de entre el grupo de marcajes que consiste de fluoresceína y tetrametil-rodamina.
40. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que uno de cada pareja de cebadores utilizada en la reacción de amplificación multiplex presenta un marcaje fluorescente unido covalentemente al mismo.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, en el que los cebadores marcajes utilizados en la reacción de amplificación multiplex presentan el mismo marcaje fluorescente unido covalentemente a los mismos.
42. Kit según la reivindicación 29, en el que los cebadores oligonucleótidos marcajes presentan el mismo marcaje fluorescente unido covalentemente a los mismos.
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