ES2273709T3 - Gen nurr1 mutado. - Google Patents
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Abstract
Un gen Nurr1 aislado, que incluye una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en Met97Val (M97V), His103Arg (H103R), Tyr121del (Y121del) y Tyr122 (Y122del).
Description
Gen Nurr1 mutado.
La presente invención se refiere a nuevas
mutaciones identificadas por primera vez en el gen Nurr1.
Los estados clínicos asociados con defectos de
genes específicos se pueden heredar, o pueden haber sido provocados
alternativamente mediante una mutación desarrollada posteriormente
en el individuo que la padece. Se supone que muchas enfermedades
neurológicas y psiquiátricas tienen componentes hereditarios, y de
hecho la esquizofrenia, el trastorno afectivo bipolar y la
enfermedad de Parkinson tienen en común que los parientes afectados
constituyen el factor de riesgo epidemiológico más importante. Sin
embargo, el modo de herencia de la susceptibilidad es complejo, y
todavía no se ha elucidado. Una observación adicional habitual en
estas tres enfermedades diferentes es la implicación etiológica y/o
terapéutica de la neurotransmisión dopaminérgica. De este modo, las
células del sistema neuronal dopaminérgico (DA) mesencefálico
mesoestriado se degeneran en la enfermedad de Parkinson
(Hornykiewicz, O. Biochemical aspects of Parkinson's disease.
Neurology 51, S2-S9 (1998)), mientras
que el eje DA mesolímbico es la diana de varios fármacos
antipsicóticos (Gerner, R.H., Post, R.M. y Bunney, W.E.J. A
dopaminergic mechanism in mania, Am J. Psychiatry 133,
1177-1180 (1976); y Creese, I., Burt, D.R. y Snyder,
S.H. Dopamine receptor binding predicts clinical and
pharmacological potencies of antischizophrenic drugs.
Science 192, 481-483 (1976)).
Recientemente, un número de estudios han señalado la importancia de
retinoides y genes relacionados con retinoides para células DA. Las
neuronas DA mesencefálicas expresan receptores para la
transcripción mediada por ácido retinoico, y los ratones que carecen
del receptor Nurr1 relacionado con retinoide no pueden desarrollar
neuronas DA mesencefálicas (Zetterström, R.H. et al. Dopamine
neuron aenesis in Nurr1-deficient mice.
Science 276, 248-250 (1997)).
El gen temprano inmediato Nurr1 (también
denominado NOT en seres humanos, clasificado como NR4A2 según la
nomenclatura más reciente [Nuclear Receptors Nomenclature Committee,
1999]) codifica un receptor de orfano nuclear de la familia
NGFI-B de factores de transcripción (Gerner et
al., más arriba; Hazel, T.G., Nathans, D. y Lau, L.F. A
gene inducible by serum growth factors encodes a member of the
steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85, 8444-8448 (1988); y
Mages, H.W., Rilke, O., Bravo, R., Senger, G, G. y Kroczek, R.A.
NOT, a human immediate-early response gene closely
related to the steroid/thyroid hormone receptor NAK1/TR3. Mol.
Endocrinol. 8, 1583-1591 (1994)). La
variante de corte y empalme principal es una proteína de 598
aminoácidos con dominios de unión a ligando, unión a ADN y
N-terminales. Recientemente, se han aislado otras
variantes de ARNm alternativamente cortadas y empalmadas, que
codifican los dominios completos N-terminales y de
unión a ADN, pero dominios más cortos C-terminales
(Ichinose, H. Et al. Molecular cloning of the human Nurr1
gene: characterization of the human gene and cDNAs. Gene
230, 233-239 (1999); Torii, T., Kawarai, T.,
Nakamura, S. y Kawakami, H. Organization of the human orphan nuclear
receptor Nurr1 gene. Gene 230,
225-232 (1999); y Ohkura, N., Hosono, T., Maruyama,
K., Tsukada, T. y Yamaguchi, K. An isoform of Nurr1 functions as a
negative inhibitor of the NGFI-B family signaling.
Biochim. Biophys. Acta 1444, 69-79
(1999)). Aunque no se ha identificado hasta la fecha ningún ligando
activante para Nurr1, se ha demostrado que Nurr1 puede ser
constitutivamente activo como un factor de transcripción así como se
puede dimerizar con RXR, un receptor implicado en la mediación de
la transcripción inducida por el ácido retinoico (Perlmann, T. y
Jansson, L. A novel pathway for vitamin A signaling mediated by RXR
heterodimerization with NGFI-B and Nurr1. Genes
Dev. 9, 769-782 (1995)). Estos estudios,
junto con otras observaciones, han hecho de Nurr1 un gen candidato
sugerente para enfermedades con una implicación del sistema neuronal
dopaminérgico, tales como esquizofrenia, enfermedad maníaca
depresiva y enfermedad de Parkinson. Sin embargo, hasta la fecha, no
se ha proporcionado ningún signo que permita cualquiera de tales
implicaciones, y de este modo aún no se han desarrollado curas
eficaces basadas en tal conocimiento genético. Puesto que
aproximadamente el 1% del PIB de un país industrial se gasta cada
año en pacientes que sufren enfermedades tales como esquizofrenia y
trastorno afectivo bipolar, una comprensión clara de los
antecedentes genéticos podría a lo mejor conducir a esquemas de
tratamiento y a diagnósticos eficaces. En consecuencia, dentro de
este campo, existe una gran necesidad, basada en factores humanos y
económicos, de obtener una comprensión más concienzuda.
Previamente, se han descrito ciertos genes
asociados con enfermedades mentales específicas. Por ejemplo, el
documento US 5.783.680 describe genes de monoxidasa y proteínas
asociados con el comportamiento anormal. Más específicamente, las
enfermedades definidas allí son trastornos del comportamiento, tal
como agresión impulsiva, e incluyen retraso mental limítrofe y
explosiones agresivas, a menudo en respuesta a ira, miedo o
frustración. Se observó que tal comportamiento agresivo varía
notablemente en gravedad. Otros tipos de comportamiento impulsivo
que se produjeron en casos individuales incluyeron incendio
provocado, intento de violación, y exhibicionismo. De este modo,
como es obvio para la persona experta en este campo, hay claras
diferencias entre los estados a los que se refiere el documento US
5.783.680, y la enfermedad psiquiátrica, tal como esquizofrenia.
Esto es evidente a partir del hecho de que ninguno de los síntomas
citados en dicho documento US 5.783.680 se encuentran en los
criterios de diagnóstico de DSM-IV para la
esquizofrenia o depresión maníaca, ni tienen las características
mínimas requeridas para la esquizofrenia o depresión maníaca
presente en la familia mencionadas en el documento US 5.783.680.
(Para los criterios de DSM-IV, véase Diagnostic and
Statistical Manual of Mental Disorders, Cuarta Edición. Copyright
1994 American Psychiatric Association). De este modo, el documento
US 5.783.680 no se refiere a mutaciones que pueden causar
perturbaciones psiquiátricas.
Finalmente, Zetterström et al (Science,
vol. 276, 11 de abril de 1997: "Dopamine Neuron Agenesis in
Nurr1-Deficient Mice") ha demostrado que los
ratones que carecen de Nurr1 no generan neuronas dopaminérgicas
mesencefálicas, y sugiere que los ligandos de Nurr1 son útiles para
el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
Por primera vez, la presente invención
proporciona tres mutaciones del gen Nurr1 humano como se define en
la reivindicación 1 aneja, y muestra además la relación de las
mismas con un subgrupo no dado a conocer previamente de aprox. 1%
de los estados de esquizofrenia y trastorno afectivo bipolar. Según
la invención, las nuevas mutaciones se representan aquí como M1, M2
y M3.
La Figura 1 es un compendio de la estructura
genómica del gen Nurr1 humano, de la distribución de los fragmentos
0-7 de PCR, y de la localización de las mutaciones
M1-M3 según la invención, en el exón 3.
La Figura 2 muestra autorradiografías de las
tres mutaciones heterocigóticas M1-M3 según la
invención.
La Figura 3 muestra, en la tabla 1, los
cebadores usados para amplificar los fragmentos 0 a 7 de PCR.
La Figura 4 proporciona, mediante la tabla 2,
descripciones clínicas de los tres portadores heterocigóticos de las
mutaciones M1 a M3 según la invención.
En la presente Solicitud, el término Nurr1
engloba tanto genes Nurr1 de mamíferos, presentes por ejemplo en
seres humanos o en roedores, como genes Nurr1 de especies no
mamíferas, tales como el pez cebra o la lamprea. Además, todos los
genes, fragmentos génicos o especies de ADNc idénticos a Nurr1 y su
ADNc, pero publicados con otros nombres (por ejemplo, NOT (en seres
humanos), RNR1 (en ratas) y HZF-3 (en ratas)),
también están englobados mediante el término Nurr1 como se usa
aquí. De este modo, se entiende que cualquier modo de escritura,
tal como Nurr1, Nurr1, NURR1 y NURR1, como se usan
aquí, engloban todos estos aspectos.
En la presente Solicitud, la expresión "ácido
nucleico" se refiere a un polímero desoxirribonucleotídico o
ribonucleotídico ya sea en forma mono- o bicatenaria, y engloba
análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de
manera similar a los nucleótidos de origen natural. Cuando se hace
referencia al gen, se entiende que se engloba tanto el ADN como el
ADNc.
El término "variante", como se usa aquí,
significa cualquier equivalente funcional del gen Nurr1, incluyendo
genes de origen natural presentes en otras especies, y mutantes, ya
sea de origen natural o manipulados mediante ingeniería.
En la presente memoria descriptiva, la expresión
"condiciones muy restrictivas" significa hibridación a ADN
unido a filtro en 0,5 M de NaHPO_{4}, 7% de dodecilsulfato de
sodio (SDS), 1 mM de EDTA a 65ºC, y lavando en 0,1 x SSC/0,1% de
SDS a 68ºC (Ausubel F. M. et al., eds., 1989, Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing
Associates, Inc., y John Wiley & sons, Inc., Nueva York, en la
p. 2.10.3). En algunos casos en los que las moléculas de ácido
nucleico son desoxioligonucleótidos ("oligos"), las condiciones
muy restrictivas se pueden referir, por ejemplo, al lavado en 6 x
SSC/0,05% de pirofosfato de sodio a 37ºC (para oligos de 14 bases),
a 48ºC (para oligos de 17 bases), a 55ºC (para oligos de 20 bases),
y a 60ºC (para oligos de 23 bases). Las condiciones de baja
restricción son bien conocidas por los expertos en la técnica, y
variarán de forma predecible dependiendo de los organismos
específicos a partir de los que derivan la librería y las
secuencias marcadas. Para una guía que se refiera a tales
condiciones, véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor
Press, N.Y.; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in
Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley,
Interscience, N. Y.
De este modo, en un primer aspecto, la presente
invención se refiere a un gen Nurr1 aislado, que incluye una o más
mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en Met97Val M97V),
His103Arg (H103R), Tyr121del (Y121del) y Tyr122 (Y122del). En este
contexto, se hace referencia a la Figura 1 que muestra un esquema de
la estructura genómica de Nurr1 y de las mutaciones según la
invención. El gen Nurr1 humano comprende 8 kb como 8 exones y 7
intrones localizados en el cromosoma 2q22-23, véase
Ichinose et al., Gene 230 (1999)
133-239, gen el cual se ha depositado en
DDBJ/EMBL/GenBank con el número de acceso AB017586. (Para toda la
secuencia de Nurr1 de ratón, véase Castillo et al.,
Genomics 41, 250-257 (1997), Fig. 1,
número de acceso U86783). En una realización, un fragmento según la
invención comprende todos los exones del gen Nurr1, es decir,
todas sus secuencias de ADNc. Más específicamente, puesto que las
nuevas mutaciones definidas aquí están presentes en el exón 3, en
una realización, un fragmento según la invención comprende al menos
el exón 3 de Nurr1. Realizaciones específicas del primer aspecto
son fragmentos que comprenden la mutación Met97Val, en la que una G
en la primera posición del codón nº 97 ha sustituido una A en dicha
posición, la mutación His103Arg, en la que una G en la primera
posición del codón nº 103 ha sustituido una A en dicha posición, o
la mutación Tyr121del o Tyr122del, en las que se ha suprimido una
tirosina en la posición 121 ó 122. Como se apreciará fácilmente por
la persona experta en este campo, y como se discute adicionalmente
en relación con la figura 2, las últimas supresiones mencionadas
son imposibles de diferenciar entre sí, y por lo tanto se
representarán Tyr122 aquí. Los fragmentos presentes pueden incluir
cualquier longitud del gen Nurr1, dependiendo del uso al que se
destina. Además, en el presente contexto, se señalará que la
presente invención se refiere a los genes Nurr1 mutados de origen
humano y de ratón, independientemente de si se escribe en
mayúsculas o no. Más abajo se expondrán con más detalle diversos
usos ventajosos de los presentes genes y fragmentos.
En consecuencia, mediante la descripción de las
nuevas mutaciones definidas anteriormente, la presente invención
muestra por primera vez una conexión entre el gen Nurr1 y los
trastornos neuropsiquiátricos, conexión la cual se ha buscado
previamente sin ningún éxito, por ejemplo véase Ichinose et
al., más arriba. Previamente, cuando se trató tal
relación posible, se sugirió una conexión general con estados
neuropsiquiátricos, pero nunca se justificó. Sin embargo, nunca se
ha propuesto o previsto que tal relación existiría solamente para
una selección específica de dichos estados. En consecuencia, los
indicios presentados aquí de que las mutaciones en el gen Nurr1
están conectadas con esquizofrenia y enfermedad depresiva maníaca,
pero no con la enfermedad de Parkinson, es muy sorprendente y
permitirá un paso adelante esencial en estudios dirigidos a
desarrollar nuevos fármacos así como nuevas herramientas de
diagnóstico dentro de este campo. Además, la invención tiene
importancia para el campo diagnóstico de la esquizofrenia y del
trastorno afectivo bipolar, debido a que el hallazgo de las
mutaciones de Nurr1 en un subgrupo de pacientes ayudará a
caracterizar mejor el grupo definido por la enfermedad y no
homogéneo de pacientes que padecen estas patologías. De este modo,
los pacientes que sufren esquizofrenia o trastorno afectivo bipolar
debido al Nurr1 mutado se pueden identificar y tratar ahora
diferentemente y de forma más específica según su defecto genético
específico, lo que se ha revelado por primera vez en la presente
invención.
De este modo, incluso aunque Zetterström et
al (Science, 1997, más arriba) sugirió que los ligandos de Nurr1
putativos podrían ser útiles para el tratamiento de la enfermedad
de Parkinson y de otros trastornos del circuito dopamínico
mesencefálico, no pudo demostrar ninguna conexión entre Nurr1 y las
patologías expuestas aquí anteriormente de esquizofrenia y
depresión maníaca. La presente invención describe por primera vez
tres mutaciones específicas que, como se muestra más abajo en la
sección experimental, están claramente relacionadas con un subgrupo
de pacientes que sufren dichas patologías. Aunque las tres
mutaciones descritas no pueden explicar la patología en todos los
pacientes esquizofrénicos o maniacodeprimidos, su ausencia del
material de control investigado fortalece su papel en los pacientes
en los que se han identificado. Puesto que se ha demostrado un
efecto de cada una de las mutaciones sobre la actividad de Nurr1, y
las tres mutaciones muestran efectos muy similares, se proporcionan
signos muy fiables de que las presentes mutaciones contribuyen al
fenotipo observado en aquellos pacientes en los que se encontraron
las mutaciones.
Para recalcar adicionalmente la utilidad
práctica de la presente invención, se señala que una persona experta
en la técnica está muy al tanto de la etiología multifactorial de
enfermedades complejas, tales como esquizofrenia y depresión
maníaca. Por lo tanto, es improbable que se encuentren mutaciones en
un solo gen en una gran porción de pacientes. Dado un predominio
mundial de ambas enfermedades de alrededor de 1% cada una, la
explicación del 1% de estas enfermedades puede ayudar a un número
enorme de personas.
Actualmente, después de la descripción expuesta
anteriormente de mutaciones en MAOA en pacientes con agresión
impulsiva (documento US 5.783.680), se llevó a cabo otro estudio (Am
J Med Genet 1999 Feb 5;88(1):25-8) en busca
de mutaciones de MAOA en pacientes con diagnósticos similares (y
también en individuos sanos y pacientes con Parkinson que sirvieron
como material de control), sin encontrar ninguna de las mutaciones.
De este modo, de forma similar a las nuevas mutaciones según la
presente invención, las mutaciones de MAOA son causas muy raras de
ciertas patologías, las cuales, en su caso, son de
comportamiento.
La presente invención describe además un ácido
nucleico capaz de hibridarse específicamente a un gen o a un
fragmento como se define anteriormente. La preparación de ADN se
logra fácilmente mediante la persona experta en este campo,
mediante cualquier método adecuado, tal como clonación y restricción
de secuencias apropiadas mediante cualquier método in vitro
o in vivo, tal como la reacción en cadena de polimerasa
(PCR), la reacción en cadena de ligasa (LCR), el sistema de
amplificación a base de transcripción (TAS), el sistema de
replicación de secuencias autosostenido (SSR), o la clonación y
amplificación a base de células, en el que la célula puede ser
cualquier célula adecuada, tal como una bacteria, una estirpe
celular cultivada, etc. La persona experta en este campo conoce
bien una gran variedad de métodos de clonación y amplificación, por
ejemplo véase Sambrook et al., (1989); Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2ª Ed., vol. 1-3). Además,
se pueden preparar mediante síntesis química directa por métodos
tales como el método del fosfotriéster (Narang et al.,
Meth. Enzymol. 68, 90-99 (1979); el
método del fosfodiéster (Brown et al., Meth. Enzymol.
68, 109-151 (1979); el método de
fosforamidito de dietilo (Beaucage et al., Tetra.
Lett., 22, 1859-1862 (1981); y el método
de soporte sólido (patente US nº 4.458.066).
Los presentes fragmentos se pueden usar, por
ejemplo, como cebadores, por ejemplo para PCR, los cuales pueden
estar presentes, por ejemplo, en un kit, como sondas, etc. Además,
como se explica más abajo, se pueden usar para generar polipéptidos
inmunogénicos o proteínas de fusión para uso en la generación de
anticuerpos específicos que reconocen el epítopo del mutante. Para
uso como cebadores, los fragmentos tienen preferiblemente una
longitud de al menos alrededor de 10, tal como al menos alrededor
de 15-20, bases, lo que sin embargo depende del
método usado.
La presente invención describe además un vector
que comprende un ácido nucleico según la invención, así como
células que tienen tal ácido nucleico, útiles para la producción de
la presente proteína o péptido. Tales células pueden ser procariotas
o eucariotas, y se describen con más detalle a continuación, en
relación con sistemas de modelos de cultivos celulares.
Otro aspecto de la invención es una proteína o
un péptido codificado por un gen o por un fragmento génico según la
invención. En consecuencia, en realizaciones específicas, la
proteína o polipéptido presente puede incluir un resto de Val en la
posición que corresponde al aminoácido nº 97 de la proteína de Nurr1
de tipo natural; un resto Arg en la posición que corresponde al
aminoácido nº 103 de la proteína de Nurr1 de tipo natural; y/o una
secuencia que no incluye ningún resto Tyr en la posición
correspondiente al aminoácido nº 122 de la proteína de Nurr1 de tipo
natural.
Además, la presente proteína o polipéptido
también se puede usar para diseñar específicamente una sustancia
que se una a allí, y que sea capaz de una inhibición o de otra
alteración de su función.
La presente invención también se refiere a
métodos de tratamiento, así como al uso de las presentes proteínas
o péptidos en la fabricación de un medicamento. Además, las
presentes proteínas o péptidos también son útiles en el diagnóstico
de esquizofrenia y/o de la enfermedad maníaca depresiva, o puesto
que su expresión en un paciente será una indicación de la
existencia de una de las mutaciones según la invención.
Un aspecto adicional de la invención es un
anticuerpo que se une específicamente a una proteína o péptido
según la invención, y comprende preferiblemente al menos alrededor
de 10, más preferiblemente al menos 20, 40 ó 50 o más, aminoácidos.
Tal anticuerpo se puede usar como un medicamento a fin de inhibir o
suprimir el efecto biológico del producto de un gen mutado. Como
alternativa, el presente anticuerpo se puede usar en el diagnóstico
de la esquizofrenia y/o del trastorno maniacodepresivo. El presente
anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal; preferiblemente, es
un anticuerpo monoclonal. Puede ser humanizado o de humano. La
invención también se refiere a una célula, tal como una célula
recombinante, por ejemplo hibridomas o triomas, que expresa tal
anticuerpo como se define anteriormente. Los métodos para producir
anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la
técnica. De forma breve, se mezcla un inmunógeno (antígeno),
preferiblemente un polipéptido purificado, un polipéptido acoplado
a un portador apropiado (por ejemplo, GST, hemocianina de
lapa californiana, etc.), o un polipéptido incorporado en un vector
de inmunización, tal como un virus de la vacuna recombinante
(véase, patente U.S. nº 4.722.848), con un adyuvante, y los
animales se inmunizan con la mezcla. La respuesta inmunitaria del
animal frente a la preparación inmunógena se monitoriza tomando
muestras de sangre de ensayo, y determinando el título de
reactividad frente al polipéptido de interés. Cuando se obtienen
títulos apropiadamente elevados de anticuerpo frente al inmunógeno,
se recoge sangre del animal, y se preparan antisueros. El
fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecerlos en
anticuerpos reactivos con el polipéptido se realiza cuando se desee
(véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in
Immunology Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989)
Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press,
NY).
Los anticuerpos monoclonales se preparan a
partir de células que segregan el anticuerpo deseado. Estos
anticuerpos se identifican sistemáticamente para determinar la
unión a polipéptidos normales o modificados, o se identifican
sistemáticamente para determinar la actividad agonista o
antagonista. Los anticuerpos específicos monoclonales y
policlonales se unirán habitualmente con una K_{D} de al menos
alrededor de 0,1 mM, más habitualmente al menos alrededor de 50
\muM, y lo más preferible al menos alrededor de 1 \muM o mejor.
En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a
partir de diversos hospedantes mamíferos, tales como ratones,
roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de las
técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se encuentra
en, por ejemplo, Stites et al. (eds) Basic and
Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los
Altos, CA, y referencias citadas allí; Harlow y Lane, más
arriba; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y
Milstein (1975) Nature 256: 495-497.
Las preparaciones farmacéuticas que comprenden
una sustancia identificada mediante uso de los métodos descritos
aquí según la invención, o un anticuerpo como se describe
anteriormente, según la invención, se pueden preparar mediante
cualquier método estándar según los métodos estándares, véase por
ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. Osol, A
(ed.) 1980; y Langer, Science 249,
1527-1533 (1990).
Los péptidos, polipéptidos y proteínas según la
invención se pueden sintetizar usando técnicas químicas estándares
de síntesis de péptidos, bien conocidas por los expertos. Para la
síntesis en fase sólida, véase por ejemplo Barany y Merrifield,
Solid-Phase Peptide Synthesis, en The Peptides:
Analysis, Synthesis, Biology, vol. 2: Special Methods in
Peptide Synthesis.
Los presentes péptidos y polipéptidos también se
pueden producir usando tecnología de ADN recombinante. Generalmente,
esto implica crear una secuencia de ADN que codifica el péptido
deseado, es decir, que incluye una o más de las mutaciones
presentes, por ejemplo como una secuencia recombinantes que codifica
el presente péptido como parte de una proteína de fusión, colocar
el ADN en un casete de expresión bajo el control de un promotor
particular, expresar el péptido en un hospedante, y aislar el
péptido expresado. En el caso de una proteína, se puede requerir su
renaturalización. Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos o
proteínas se pueden expresar en una variedad de células
hospedantes, incluyendo E. coli, otros hospedantes
bacterianos, levadura, y diversas células eucariotas superiores,
tales como las estirpes celulares de COS, CHO o HeLa, y estirpes
celulares de mielomas. El gen se ligará operablemente a secuencias
de control de la expresión apropiadas para cada hospedante. Para
E. coli, esto incluye un promotor tal como los promotores T7,
trp o lambda, un sitio de unión a ribosoma y preferiblemente una
señal de terminación de la transcripción. Para células eucariotas,
las secuencias de control incluirán un promotor y preferiblemente
un potenciador, y pueden incluir secuencias donantes y aceptoras de
corte y empalme. Los sistemas de expresión que se pueden usar para
la preparación de las presentes proteínas y péptidos incluyen, pero
no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo,
E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de
expresión recombinantes de ADN bacteriófago, ADN plasmídico o ADN
cosmídico, que contienen las presentes secuencias nucleotídicas;
levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con
vectores de expresión de levadura recombinantes, que contienen las
presentes secuencias nucleotídicas; sistemas de células de insectos
infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por
ejemplo, baculovirus), que contienen las presentes secuencias;
sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión
de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la
coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV), o transformados
con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo,
plásmido Ti), que contiene las presentes secuencias nucleotídicas;
o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK,
293, 3T3) que contienen los constructos de expresión recombinantes
que contienen promotores derivados del genoma de células de
mamíferos (por ejemplo, promotor de la metalotioneína) o procedentes
de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de
adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la vacuna).
Una vez expresados, se pueden usar
procedimientos estándares para la purificación, tal como la
precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad,
cromatografía en columna, electroforesis en gel, y similares.
Véase, generalmente, R. Scopes, Protein Purification,
Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods
in Enzymology, Vol. 182: Guide to protein purification,
Academic Press, Inc., N.Y. (1990).
La presente invención describe además un cultivo
celular que comprende células transgénicas que contienen una o más
de las presentes mutaciones, para uso como un modelo, por ejemplo
para enseñar nuevas sustancias farmacéuticamente activas. Tales
células pueden llevar una o más de las presentes mutaciones sobre un
vector, o en el genoma. En una realización, son células aisladas
que han sido mutadas espontáneamente en un entorno natural,
mientras que otra realización se refiere a células producidas
mediante técnicas de ADN recombinante. Tal cultivo celular
comprenderá células inmortalizadas, tales como células nerviosas
primarias, células COS o HeLa, etc. Según la invención, se puede
usar uno cualquiera de los métodos diversos usados actualmente para
la introducción en, y para la amplificación de, ácido nucleico
extraño (heterólogo) en células cultivadas con fines de
investigación, así como con el fin de sobreproducir proteínas de
interés para aplicaciones farmacéuticas. Las presentes estirpes
celulares comprenden genes insertados o fragmentos génicos como se
describe anteriormente. Como alternativa, derivan de un material
transgénico (véase, por ejemplo, Babinet et al., patente US
nº 5.073.490). Más abajo se describen con más detalle los animales
transgénicos, pero un repaso general del proceso básico para la
creación de un animal transgénico, particularmente ratones, se
encuentra, por ejemplo, en Palmiter et al., en "Dramatic
Growth of Mice That Develop From Eggs Microinjected with
Metallothionein-Growth Hormone Fusion Genes",
Nature. Vol. 300, 611-615 (Dec.
1982).
Sin embargo, los sistemas de mamíferos son los
más preferidos. En células hospedantes de mamíferos, se pueden
utilizar un gran número de sistemas de expresión a base de virus. En
los casos en los que se use un adenovirus como vector de expresión,
la secuencia nucleotídica de interés se puede ligar a un complejo de
control de la transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo,
el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen
quimérico se puede insertar entonces en el genoma del adenovirus
mediante recombinación in vitro o in vivo. La
inserción de una región no esencial del genoma vírico dará como
resultado un virus recombinante que es viable y que es capaz de
expresar el presente producto génico en hospedantes infectados.
(Véase, por ejemplo, Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81:3655-3659). También pueden
ser necesarias señales de iniciación específicas, para la
traducción eficaz de las presentes secuencias nucleotídicas
insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las
secuencias adyacentes. En los casos en los que se inserta en el
vector de expresión apropiado un gen o ADNc de Nurr1 completo,
incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes,
no son necesarias señales de control de la traducción adicionales.
Sin embargo, en los casos en los que se inserta sólo una porción de
la secuencia codificante, se deben de proporcionar señales de
control de la traducción exógenas, incluyendo, quizás, el codón de
iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe de estar en
fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada,
para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales de
control de la traducción exógenas y los codones de iniciación
pueden tener diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La
eficacia de la expresión se puede potenciar mediante la infusión de
elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores
de la transcripción, etc. (Véase Bittner et al., 1987,
Methods in Enzymol. 153, 516-544).
Además, es necesaria una purificación del presente producto. Por
ejemplo, se puede usar un anticuerpo específico para el péptido o
proteína expresado. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht
et al. permite la purificación rápida de proteínas de fusión
no desnaturalizadas expresadas en extirpes celulares de seres
humanos (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 8972-8976).
Además, la presente invención se refiere a un
animal transgénico, preferiblemente un animal no humano, tal como
un mamífero, por ejemplo un ratón, que comprende un gen o fragmento
génico mutado según la invención, así como a cualquier generación
adicional de dicho animal. para una instrucción comprensiva de cómo
se pueden establecer modelos de animales para enfermedades humanas
con mutaciones genéticas identificadas, se hace referencia a Human
Molecular Genetics, BIOS Scientific Publishers Limited, 1996,
capítulo 19, p. 507-550, titulado "Studying human
gene structure and function and creating animal models of
disease", Strachan, T. y Read, A.P. Se puede usar cualquier
técnica conocida en la técnica para introducir en animales el
presente gen, que comprende una o más de las nuevas mutaciones,
para producir las estirpes fundadoras de los animales transgénicos.
Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, microinyección
polinuclear (Hoppe, P.C. y Wagner, T. E., 1989, patente U.S. nº
4.873.191); la transferencia génica, mediada por retrovirus, en
estirpes de microbios (Van der Putten et al., 1985, Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152); la
selección de genes como dianas en células madre embriónicas
(Thompson et al., 1989, Cell
56:313-321); la electroporación de embriones
(Lo, 1983, Mol Cell. Biol.
3:1803-1814); y la transferencia génica
mediada por esperma (Lavitrano et al., 1989, Cell
57:717-723); etc. Para un repaso de tales
técnicas, véase Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev.
Cytol. 115:171-229. Lo más preferible,
el animal transgénico según la invención es un ratón que comprende
una o más de las presentes mutaciones M1-M3.
Como alternativa, en lugar de introducir un gen
completo o un fragmento génico en el hospedante, se provoca la
mutación o mutaciones deseadas en un animal de laboratorio, tal como
un ratón. Esto se puede lograr mediante un proceso mutagénico,
incluyendo la mutagénesis in vitro, seguido de la
transferencia del material genómico en células madre embriónicas, o
mediante cualquier otro procedimiento mutagénico, incluyendo
tratamientos químicos, biológicos, radioactivos, o con
ultravioletas.
Debido al hecho de que los dominios del gen
Nurr1 que rodean M1, M2 y M3 están muy conservados en un ratón y en
un ser humano, véase por ejemplo Ichinose et al., más
arriba, el modelo de animal transgénico más preferido según la
invención es un ratón, en el que se ha introducido una o más de las
presentes mutaciones M1-M3. De este modo, por
razones de simplicidad en la preparación, el modelo de ratón es un
candidato ideal para estudios de las presentes mutaciones
humanas.
Los métodos para transferir genes en la estirpe
de microbios, la expresión de genes naturales e híbridos, y los
cambios fenotípicos que se han producido en ratones transgénicos, se
describen por Palmiter y Brinster en Ann. Rev. Genet.
20 (1986) 465-499.
En consecuencia, la presente invención también
se refiere al uso de un modelo animal como se define anteriormente
para la identificación de nuevos fármacos. Más específicamente, tal
método de ensayo de la actividad terapéutica de un agente
farmacológico sobre esquizofrenia o enfermedad maníacadepresiva
comprende administrar una cantidad eficaz de dicho agente
farmacológico al modelo de ratón según la invención, y evaluar el
efecto de dicho agente sobre dicho ratón. Cualquier sustancia
identificada mediante uso de un modelo según la invención está
también dentro del alcance de la invención.
Otro aspecto de la invención es un método para
detectar la presencia de una mutación en el exón 3 del gen Nurr1,
mutación la cual se selecciona del grupo que consiste en Met97Val,
His103Arg, Tyr121del y Tyr122del, método el cual comprende obtener
una muestra biológica procedente, por ejemplo, de un sujeto humano o
de un modelo animal, y analizar dicha muestra para determinar dicha
mutación. Más específicamente, la muestra biológica se analiza
aislando ADN de dicha muestra, amplificando dicho ADN, hibridando
dicho ADN a una sonda oligonucleotídica marcada, que se hibrida
específicamente a ADN mutante que contiene una G como la primera
base del codón nº 97, una G como la segunda base del codón nº 103;
o TACTAC alterado en el codón nº 121 ó 122, o a una o más bases
adyacentes a dicha mutación, dependiendo del método usado. Los
métodos para detectar mutaciones en ADN se repasan, por ejemplo, en
U. Landgren, GATA 9, 1992, p. 3-8.
Además, las presentes mutaciones en el gen Nurr1
se pueden detectar mediante los siguientes métodos (a)-(j), que se
describen con detalle en: (1) Mutation Detection, A Practical
Approach, R.G.H. Cotton, E. Edkins y S. Forrest (editores), The
Practical Approach Series, Oxford University press (1998), y (2)
Finding Mutations, The Basics, J.R. Hawkins, Oxford
University Press (1997).
(a) El análisis de polimorfismo de confirmación
de una sola cadena (SSCA, también denominado SSCP), solo o en
combinación con el análisis de heterodúplex (HA), es uno de los
enfoques usados más ampliamente para la detección de las
mutaciones. (b) La electroforesis en gradiente de gel
desnaturalizante (DGGE) es el nombre de una familia completa de
métodos similares que se basan en la reducción de la movilidad
electroforética de una molécula de ADN en un medio denso durante la
desnaturalización. (c) El ensayo de protección de ribonucleasa o el
ensayo de escisión de ARNasa (RPA), el ensayo de escisión química de
desemparejamiento (CMM) y la detección de la mutación usando
endonucleasa VII T4 (EMC), son métodos eficaces para detectar
desemparejamientos de ADN-ADN o de
ADN-ARN provocados por las mutaciones. (d) La
hibridación con sondas oligonucleotídicas específicas de secuencias
(SSOP) aprovecha el hecho de que, en condiciones restrictivas, un
único desemparejamiento de pares de bases puede evitar la
hibridación de sondas oligonucleotídicas complementarias cortas. (e)
Los ensayos de ligación, tales como el ensayo de ligación de
oligonucleótidos (OLA), comprenden otras maneras para detectar
cambios en secuencias de ADN. (f) La secuenciación directa, que
constituye uno de los métodos más sensibles de detección de la
mutación. (g) Un método más bien nuevo, que se origina de la
secuenciación directa, se denomina minisecuenciación o
minisecuenciación en fase sólida. (h) La amplificación selectiva de
alelos específicos (PASA, también denominada ASA o ASP) hace
posible detectar mutaciones durante la amplificación del fragmento
de interés mediante PCR. (i) Con el ensayo de truncamiento de
proteína (PTT), se pueden identificar mutaciones que inducen
codones de parada en la secuencia de ADN después de la traducción de
la secuencia en proteína. (j) El ensayo de polimorfismo de longitud
de fragmento de restricción (RFLP) hace uso de endonucleasas que
reconocen y escinden secuencias nucleotídicas específicas. Las
mutaciones en el ADN pueden cambiar la secuencia, de forma que una
endonucleasa que corta la secuencia de tipo natural no puede
reconocer ni cortar la secuencia mutada, o puede inducir un nuevo
sitio de escisión para una endonucleasa que no corta la secuencia de
tipo natural. En secuencias que no se pueden distinguir mediante
enzimas de origen natural, las mutaciones se pueden analizar
mediante análisis de restricción introducida por cebadores, un
método que altera la secuencia que rodea a la mutación.
Además, la invención también se refiere a un kit
para llevar a cabo uno cualquiera de los métodos descritos
anteriormente. En consecuencia, los agentes esenciales para la
detección de la mutación según el método respectivo se pueden
combinar en paquetes individuales como kits fáciles para el usuario,
para una fácil detección de la mutación. Tales kits pueden contener
reactivos y enzimas para la amplificación de los sitios mutados,
oligonucleótidos que se hibridan a secuencias de ADN alrededor y/o
que contienen las mutaciones y enzimas para la escisión específica
de ADN en sitios mutados. Además, los presentes kits también pueden
incluir marcadores adecuados. La presente invención también se
refiere a la producción de cualquiera de tal kit dirigido a detectar
las mutaciones M1-M3 identificadas aquí.
Finalmente, la presente invención también se
refiere a métodos de terapia génica dirigidos a corregir una o más
de las mutaciones según la invención. Las técnicas para terapia
génica son bien conocidas para la persona experta. Por ejemplo, los
documentos WO 93/24640 y WO 95/11984 describen métodos y
composiciones para la terapia génica in vivo usando
tecnología de vector vírico o no vírico. En otro ejemplo, el
documento WO 95/06743 describe un método mediante el cual se
introducen constructos terapéuticos de ácidos nucleicos en células
epiteliales de vías respiratorias aisladas de pacientes, vía la
transformación con un vector vírico que contiene un constructo. Las
células transformadas se administran entonces al paciente. La
tecnología para los diversos vectores víricos o no víricos, que se
pueden aplicar a células in vitro, o que se puede inyectar o
aplicar in vivo a pacientes, es igualmente bien conocida por
la persona experta.
La Figura 1 es un esquema de la estructura
genómica del gen Nurr1 humano, la distribución de los fragmentos
0-7 de PCR, y la localización de las mutaciones
M1-M3 según la invención, en el exón 3. Estas tres
mutaciones están localizadas dentro de 78 pares de bases del
fragmento 1 de PCR, que comprende las primeras 495 bases del exón
3. El fragmento 0 sólo se secuenció una vez, a fin de diseñar un
nuevo cebador dentro del segundo intrón, adyacente de forma próxima
al exón 3. Todos los otros fragmentos (1-7) se
usaron para la secuenciación de la región codificante en los
primeros 20 pacientes de Parkinson, 20 pacientes esquizofrénicos y 4
controles. Después de la identificación de la primera mutación,
sólo se secuenció el fragmento 1 en todos los pacientes
posteriores.
La Figura 2 muestra autorradiografías de las
tres mutaciones heterocigóticas M1-M3 según la
invención. a, M1 (M97V) conduce a una banda doble en el
primer nucleótido del codón para la posición 97 de aminoácidos. La
flecha señala a la banda de tipo natural. b, M2 (H103R)
intercambia el nucleótido central en el codón para el aminoácido
103. La flecha indica el tipo natural. c, M3 (\DeltaY122)
suprime una de las tirosinas en las posiciones 121 ó 122. No es
posible afirmar cuál de las tres bandas consecutivas se ha
suprimido. Sin embargo, el patrón del desplazamiento de tres pares
de bases, empezando en la secuencia TACTAC, debe resultar de una
supresión de tres pares de bases dentro de estos seis pares de
bases, y la secuencia de aminoácidos circundantes no se ve afectada
por este desplazamiento. Debido a que se usó un cebador inverso para
generar esta autorradiografía, el desplazamiento se produce en la
secuencia adyacente por encima de los codones dobles de tirosina. A
la derecha, se muestra con fines comparativos la secuencia de tipo
natural (wt).
La Figura 3 muestra, en la tabla 1, los
cebadores usados para amplificar los fragmentos 0 a 7 de PCR. Debido
a que las secuencias intrónicas no eran conocidas cuando se inició
el presente estudio, los cebadores están localizados en los exones,
y casi todos los fragmentos contienen una secuencia intrónica. Más
específicamente, el fragmento nº 0 comprende una parte del segundo
exón (no codificante), el intrón 1 (completo) y dos bases del exón
3; en el fragmento nº 1, el cebador delantero está localizado en el
segundo intrón, inmediatamente adyacente a la frontera con el
tercer exón, y este fragmento contiene las primeras 513 bases del
exón 3; el fragmento nº 2 es la segunda mitad del exón 3, estando
ambos cebadores localizados dentro de la secuencia codificante; el
fragmento nº 3 es el resto del exón 3, el intrón 3 completo y la
mayor parte del exón 4; el fragmento nº 4 comprende el exón 4, el
intrón 4 y el exón 5; el fragmento nº 5 comprende el exón 5, el
intrón 5 y el exón 6; el fragmento nº 6 comprende el exón 6, el
intrón 6 y el exón 7; y el fragmento nº 7 comprende el exón 7, el
intrón 7 y el exón 8, incluyendo 34 bases de la región 3' no
traducida.
La Figura 4 proporciona, mediante la tabla 2,
descripciones clínicas de los tres portadores heterocigóticos de
las mutaciones M1 a M3 según la invención. En la tabla 2, se usan
las siguientes abreviaturas: MD: depresión principal; SAP:
trastorno de ansiedad de separación; ADHD: trastorno de déficit de
atención/hiperactividad. Más específicamente, el historial clínico
de la portadora heterocigótica de M1 es un comienzo con
alucinaciones auditivas, más tarde presentó delirios egocéntricos,
delirios paranoides, alucinosis auditiva verbal, alucinosis visual
y táctil, inserción de pensamientos y "emisión" de
pensamientos, así como también afectos planos y algunas veces
inapropiados. Respondió bien al tratamiento antipsicótico, pero
experimentó recaídas tras descontinuar la medicación antipsicótica.
Actualmente se encuentra bajo medicación antipsicótica continua, y
ha estado libre de episodios psicóticos durante varios años. Sus
antecedentes familiares fueron los siguientes: la hermana de su
abuela paterna estuvo en tratamiento en un psiquiátrico, siendo
desconocida la causa de la enfermedad. La historia clínica del
portador de M2 incluye una primera admisión hospitalaria tras 5
meses de humor de grandeza e irritable, disminución de la necesidad
del sueño, distracción, y excesiva implicación en actividades
placenteras. El final de este período también incluyó síntomas
psicóticos: alucinaciones auditivas verbales congruentes con el
ánimo, delirios egocéntricos, delirios de grandeza, incoherencia, y
comportamiento desorganizado. El tratamiento se realizó con
medicación antipsicótica, y alta hospitalaria a un ambulatorio. La
rehospitalización tuvo lugar un mes más tarde debido a un ánimo
deprimido, ganancia de peso, pérdida de energía, sentimiento de
inutilidad, dificultades para concentrarse, y pensamiento recurrente
de muerte. No se produjeron síntomas psicóticos durante episodios
maníacos y depresivos posteriores. Ha sido tratada con litio durante
más de cuatro años, sin recaídas. Los antecedentes familiares de la
paciente con M2 fueron los siguientes: la paciente confirmó la
falta de perturbaciones psiquiátricas importantes en los
antecedentes familiares. Sin embargo, se afirma que el abuelo de la
paciente era un estafador empedernido. Los antecedentes del portador
de M3 incluye dos episodios de ánimo deprimido prolongado y
anhedonia (edades 6-7 y 10-11). Se
experimentaron alucinaciones auditivas a partir del segundo
episodio. Las alucinaciones y los delirios se produjeron de forma
regular, y son independientes del estado de ánimo. Historial
intermitente de obsesiones y compulsiones desde la edad de 6 años.
Episodios frecuentes de pensamiento ilógico y neologismos, y
períodos cortos de discurso incoherente. Los antecedentes
familiares del paciente con M3 fueron los siguientes: la madre
presentó unos pocos episodios alucinatorios (olfativo, visual)
ocasionales, pero sin síntomas posteriores.
Los ejemplos a continuación se dan meramente
para ilustrar la presente invención, y no pretenden limitar el
alcance de la invención como se define mediante las reivindicaciones
anejas. Todas las referencias dadas a continuación o en cualquier
otra parte en la presente memoria descriptiva se incluyen aquí como
referencia.
Mediante la secuenciación directa de ADN
genómico, se encontró una mutación con pérdida de sentido y una
supresión de tres pares de bases en el tercer exón de Nurr1, en dos
pacientes esquizofrénicos. Se encontró una mutación con pérdida de
sentido en el mismo exón en un paciente con trastorno
maníacodepresivo. Ninguna de estas mutaciones estaba presente en
pacientes con enfermedad de Parkinson, o en el material de ADN de
control de poblaciones normales.
Toda la región codificante del gen Nurr1 se
secuenció primeramente en 20 pacientes con la enfermedad de
Parkinson, 20 pacientes con esquizofrenia y 4 individuos de control
sanos. Los cebadores usados para la amplificación mediante PCR de
los fragmentos de ADN mostrados en la figura 1 se resumen en la
tabla 1. Se identificó una supresión de tres pares de bases
(\DeltaY122, fig. 1 y 2) en un individuo esquizofrénico con
comienzo en la niñez, natural de los Estados Unidos de América.
Esta mutación (M3) estaba localizada en el fragmento 1 que cubre
alrededor de la primera mitad del dominio
N-terminal. Esta mutación no se encontró cuando el
fragmento 1 se secuenció en 100 individuos sanos de los Estados
Unidos de América, ni se encontró ninguna otra mutación en el mismo
fragmento en este material. Puesto que las mutaciones se encuentran
arracimadas frecuentemente en regiones codificantes en genes que
provocan enfermedades, se continuaron los presentes esfuerzos de
secuenciación centrándose en el fragmento 1. Este fragmento se
secuenció en 100 controles suecos, 50 pacientes suecos adicionales
con Parkinson, 17 esquizofrénicos americanos adicionales, 135
esquizofrénicos suecos adicionales y 29 pacientes maníacodeprimidos
de los Estados Unidos de América y de Suecia. Se identificó una
mutación con pérdida de sentido (H103R; M2 en las figuras) en un
paciente esquizofrénico sueco, y se identificó otra mutación con
pérdida de sentido (M97V; M1 en las figuras) en un paciente sueco
con enfermedad maníacadepresiva con síntomas psicóticos. Las tres
mutaciones estaban ausentes de todas las otras muestras de ADN, y
por lo tanto es improbable que sean variantes polimórficas del gen
humano de Nurr1. De forma notable, no se encontraron mutaciones en
las muestras de ADN de pacientes con Parkinson. Los intentos para
obtener muestras de ADN a partir de familiares de los tres
portadores de las mutaciones tuvieron sólo un éxito moderado. Sólo
en el caso del comienzo en la niñez (M3) fue posible obtener el ADN
de los progenitores. La madre era una portadora sana de la mutación,
pero no se pudo obtener ningún antecedente familiar adicional de
este familiar. Los antecedentes familiares y personales patológicos
de los tres pacientes se resumen en relación con la tabla 2, figura
4. De forma interesante, las tres mutaciones se agrupan en
aminoácidos conservados en evolución, en estrecha vecindad entre sí
en la región N-terminal de Nurr1, lo que puede
indicar un efecto común sobre la función de Nurr1. Los resultados
preliminares a partir de experimentos de mutagénesis in vitro
indican que la actividad transcripcional, mediada por el monómero
de Nurr1 que se une al elemento de respuesta de unión a Nurr1, no se
ve muy afectada por cualquiera de las tres mutaciones (datos no
mostrados). Es necesario realizar ensayos más complejos para medir
la heterodimerización de Nurr1 con RXR, la homodimerización de
Nurr1 y la interacción de Nurr1 con otros factores activantes o
silenciadores, para elucidar posibles consecuencias funcionales de
las mutaciones. Debido a que el gen Nurr1 está muy conservado en
evolución, y a que todos los aminoácidos afectados por las
mutaciones son idénticos en los ratones, la generación de ratones
transgénicos que tienen las nuevas mutaciones según la invención
proporciona oportunidades adicionales para comprender cómo se ve
afectada la función de Nurr1. La generación de tales ratones ayudará
a elucidar una vía para el desarrollo de la esquizofrenia y/o del
trastorno afectivo bipolar, y de este modo también ayudará a
encontrar otros factores etiológicos genéticos y medioambientales
para estas enfermedades.
Todos los pacientes esquizofrénicos y con
trastorno afectivo bipolar satisficieron los criterios de
diagnóstico de DSM-III-R
(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Third
Revised Edition. Copyright 1987 American Psychiatric Association) o
DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental
Disorders, Fourth Edition. Copyright 1994 American Psychiatric
Association). Los pacientes con Parkinson se diagnosticaron según
los "criterios clínicos del banco de cerebros" para la
enfermedad de Parkinson idiopática (Daniel, S.E. y Lees, A.J.
Parkinson's Disease Society Brain Bank, London: overview and
research. J. Neural Transm. Suppl. 39,
165-172 (1993)), excepto que tres casos tuvieron más
de un familiar afectado, pero aún así se les incluyó. Las muestras
de ADN procedentes de pacientes con trastorno afectivo bipolar se
adquirieron de Coriell Cell Repository (Camden, USA). Mientras que
todos los pacientes esquizofrénicos y con Parkinson implicados en
este estudio eran individuos que no tenían relación entre sí, los
pacientes con trastorno afectivo bipolar pertenecieron a las
familias de Coriell números 811 (n = 3), 812 (n = 2), 823 (n = 5),
830 (n = 4), 834 (n = 1) 835 (n = 1), 884 (n = 5), 888 (n = 1), 893
(n = 2) y 1075 (n = 2). También se incluyeron en este material tres
pacientes maníacodeprimidos originarios de Suecia, como supuestos
controles o pacientes esquizofrénicos. En el presente estudio
parece que satisficieron los criterios de
DSM-III-R para el trastorno afectivo
bipolar.
El ADN se extrajo de sangre completa según
protocolos estándares. La estructura genómica del gen Nurr1 humano
se dedujo a partir del gen Nurr1 de ratón homólogo, y se diseñaron
cebadores que cubren el segundo exón y toda la región codificante
(tabla 1, fig. 3). La numeración de los nucleótidos y aminoácidos
empleados aquí sigue la publicación inicial de la secuencia de ARNm
de Nurr1 (NOT) humano (Mages et al., más
arriba). La secuencia del segundo intrón se determinó
secuenciando el fragmento 0, y se diseñó un cebador delantero
adicional localizado en el segundo intrón (véase la tabla 1, figura
3, y la figura 1). La reacción en cadena de polimerasa (PCR) se
llevó a cabo usando ADN polimerasa de Taq (SIGMA). Se realizaron 35
ciclos a 94ºC durante 40 segundos, a 56ºC durante 45 segundos y a
72ºC durante 1 minuto. Después de la PCR, las muestras sufrieron
una electroforesis en geles de agarosa al 1% de bajo punto de
fusión, y se visualizaron usando transiluminación mediante UV
después de la tinción con bromuro de etidio. El ADN se extrajo de
las porciones de gel (kit de purificación de ADN de preparaciones
de PCR, SDS), y los fragmentos de ADN se secuenciaron (kit de
secuenciación mediante ciclos terminadores radiomarcados Thermo
Sequenase Amersham). Los productos de la reacción se hicieron pasar
sobre geles de secuenciación de acrilamida al 6% (National
Diagnostics), y se visualizaron mediante autorradiografía.
La presente invención muestra que dos de 187
pacientes con esquizofrenia, y uno de 29 pacientes con trastorno
afectivo bipolar, tuvieron mutaciones únicas agrupadas en el área
del dominio de N-terminal del gen Nurr1. Incluso
aunque la frecuencia de Nurr1 mutado determinada según la invención
puede parecer baja (alrededor de uno por ciento para la
esquizofrenia, y tres por ciento para el trastorno bipolar), está
perfectamente en línea con el origen multifactorial de estas
enfermedades, explicando un número de diferentes defectos génicos
que quedan por identificar una fracción del número total de
pacientes de cada uno.
Debido a que la rareza de las variantes
moleculares de NURR1 no excluye su papel en la patogénesis de
enfermedad psiquiátrica en aquellos individuos en los que se
identificaron, se realizaron ensayos funcionales a fin de elucidar
si cualquiera de las tres mutaciones agrupadas puede afectar a la
función de NURR1. La siguiente descripción de resultados a
partir de tales estudios funcionales se adapta a partir del
manuscrito titulado "NURR1 Mutations in Cases of
Schizophrenia and Manic Depressive Disorder" de los autores
Silvia Buervenich, Andrea Carmine, Mariette Arvidsson, Fengqing
Xiang, Zhiping Zhang, Olof Sydow, Erik G. Jonsson, Goran C. Sedvall,
Sherry Leonard, Randal G. Ross, Robert Freedman, Kodavali V.
Chowdari, Vishwajit L. Nimgaonkar, Thomas Perlmann, Maria Anvret, y
Lars Olson. El trabajo citado está actualmente en fase de
publicación en la revista American Journal of Medical Genetics;
Sección de Neuropsiquiatría.
Se clonó la secuencia de ADNc de NURR1
humano en el vector de expresión pCMX [Umesono et al., 1991],
y se generaron vectores de expresión para los mutantes mediante
mutagénesis dirigida al sitio (GeneEditor In Vitro
Site-Directed Mutagenesis System, Promega). Se
generó un fragmento de ADN de NurRE bicatenario [Philips et
al., 1997] hibridando los cebadores 5'-AGC TTG
TGA TAT TTA CCT CCA AAT GCC AG-3' y
5'-AGC TCT GGC ATT TGG AGG TAA ATA TCA
CA-3'. Se generó un plásmido informador de
luciferasa, que contiene tres sitios de NurRE en tándem, ligando
los fragmentos hibridados en dirección 5' del promotor de timidina
quinasa del virus del herpes simple fusionado al gen de luciferasa.
Se hicieron crecer células (HEK)-293 de riñón
embriónico humano en medio de Eagle modificado de Dulbecco,
suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS). Las
transfecciones se realizaron en placas de 24 pocillos mediante el
método de fosfato de calcio. De forma resumida, las células se
sembraron un día antes de la transfección. Las células en cada
pocillo se trataron con 100 ng de los vectores de expresión
indicados, 100 ng del plásmido informador y 200 ng del plásmido
CMX-\betagal de referencia que contiene el gen de
\beta-galactosidasa y CMX-PL1 como
ADN portador, hasta 500 ng de ADN total. Las células se expusieron
a precipitado de fosfato de calcio durante 12-16
horas, y se lavaron con PBS, y después se añadió medio reciente.
Las células se cosecharon y se lisaron después de 36 h de
incubación. Los extractos se ensayaron para determinar la actividad
de luciferasa y de \beta-galactosidasa en un
lector de luminómetro/fotómetro de microplacas
(Lucy-1, Anthos). Todas las actividades de
luciferasa se normalizaron a la actividad de
\beta-galactosidasa.
Se midió la actividad transcripcional de NURR1
usando células de (HEK)-293 de riñón embriónico
humano, monitorizando la unión del homodímero de NURR1 a NurRE
[Philips et al., 1997]. Cada experimento se llevó a cabo
usando dos clones independientes para los vectores de tipo natural
y mutado, respectivamente, y la actividad se midió en al menos
cuatro pocillos separados para cada clon. Se encontró una reducción
significativa (30-40%) de la actividad
transcripcional de los homodímeros de NURR1 mutados. Esta reducción
fue sorprendentemente similar en los tres clones mutados, y es
consistente con el presente hallazgo de que las tres mutaciones
están agrupadas en una región de NURR1 que es críticamente
importante para la activación transcripcional. La actividad media y
s.e.m. de NURR1 mutado en porcentaje de actividad de tipo natural en
todos los experimentos llevados a cabo fueron \DeltaY122: 0,645
\pm 0,024, n=87; H103R: 0,608 \pm 0,036, n=87; y M97V: 0,661
\pm 0,046, n=54.
Los hechos de que (1) las tres mutaciones
estaban agrupadas dentro de los 78 pares de bases del dominio
N-terminal, (2) todas condujeron, en un bioensayo
in vitro, a una actividad transcripcional de NURR1 alterada,
y (3), excepto para las tres mutaciones, esta región del gen
NURR1 estaba totalmente conservada a nivel del ADN en todo el
material de los 620 individuos (1240 alelos), sugieren que el gen
NURR1 constituye un gen interesante para la identificación
sistemática de mutaciones en enfermedades con implicación del
sistema dopamínico.
Figura
3
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Figura
4
Claims (15)
1. Un gen Nurr1 aislado, que incluye una o más
mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en Met97Val (M97V),
His103Arg (H103R), Tyr121del (Y121del) y Tyr122 (Y122del).
2. Un gen según la reivindicación 1, que
comprende los exones del gen Nurr1.
3. Un gen según la reivindicación 1 ó 2, que
comprende el exón 3 del gen Nurr1.
4. Un gen según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, que comprende la mutación
Met97Val.
5. Un gen según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, que comprende la mutación
His103Arg.
6. Un gen según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, que comprende la mutación
Tyr121del o Tyr122del.
7. Una proteína o un péptido codificado por un
gen según una cualquiera de las reivindicaciones
1-6.
8. Una proteína o un péptido según la
reivindicación 7, que incluye un resto de Val en la posición
correspondiente al aminoácido nº 97 de la proteína de Nurr1 de tipo
natural.
9. Una proteína o un péptido según la
reivindicación 7, que incluye un resto de Arg en la posición
correspondiente al aminoácido nº 103 de la proteína de Nurr1 de
tipo natural.
10. Una proteína o un péptido según la
reivindicación 7, que no incluye ningún resto de Tyr en la posición
correspondiente al aminoácido nº 121 ó 122 de la proteína de Nurr1
de tipo natural.
11. Un anticuerpo contra una proteína o péptido
según una cualquiera de las reivindicaciones 7-10,
en el que dicho anticuerpo se une específicamente a dicha proteína
o péptido.
12. Un animal transgénico no humano, tal como un
ratón o una rata, que comprende un gen según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6.
13. Un anticuerpo según la reivindicación 11,
para uso como un medicamento.
14. Uso de un anticuerpo según la reivindicación
13, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o
prevención de estados psicóticos, tales como esquizofrenia y/o
trastorno maníacodepresivo.
15. Una preparación farmacéutica que comprende
un anticuerpo según la reivindicación 11, junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
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