ES2273737T3 - Procedimiento para la recuperacion de compuestos de estatina de un caldo de fermentacion. - Google Patents

Procedimiento para la recuperacion de compuestos de estatina de un caldo de fermentacion. Download PDF

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Abstract

Procedimiento destinado al aislamiento de una sal sódica de pravastatina a partir de un caldo de fermentación que comprende las etapas siguientes: a) formar una disolución enriquecida de pravastatina; b) obtener una sal de pravastatina a partir de la disolución enriquecida; c) purificar la sal de pravastatina; d) trans-salificar la sal de pravastatina a una sal sódica de pravastatina mediante: i) la liberación de la pravastatina de su sal, ii) la puesta en contacto de la pravastatina con una disolución acuosa de hidróxido sódico formando así una disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina, y iii) el secuestro de los iones de sodio en exceso poniendo en contacto la disolución acuosa de las sal sódica de pravastatina con una resina de intercambio iónico insoluble en agua, y e) aislar la sal sódica de pravastatina de la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina.

Description

Procedimiento para la recuperación de compuestos de estatina de un caldo de fermentación.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para el aislamiento de los productos químicos deseados de las reacciones que se producen en caldos de fermentación acuosos. La invención se refiere además al aislamiento de pravastatina de un caldo de fermentación y en particular al aislamiento de pravastatina producida por la fermentación de compactina.
Antecedentes de la invención
Las complicaciones de las enfermedades cardiovasculares, tales como el infarto de miocardio, la embolia y las enfermedades vasculares periféricas constituyen la mitad de las muertes en los Estados Unidos. El nivel elevado de lipoproteína de baja densidad (LDL) en la sangre ha sido asociado a la formación de lesiones coronarias que obstruyen el flujo de la sangre y pueden romper e inducir trombosis. Goodman and Gilman, The pharmacological basis of therapeutics 879 (9ª ed. 1996). Se ha demostrado que la reducción de los niveles plasmáticos de LDL reduce el riesgo de eventos clínicos en los pacientes con enfermedad cardiovascular y en los pacientes libres de enfermedad cardiovascular pero que padecen hipercolesterinemia. Scandinavian Simvastatin Survival Study Group, 1994; Lipid Research Clinics Program, 1984a, 1984b.
Los fármacos a base de estatinas son en la actualidad los fármacos más efectivos disponibles para reducir el nivel de LDL en la sangre de los pacientes de riesgo para las enfermedades cardiovasculares. Esta clase de fármacos incluye, entre otros, compactina, lovastatina, simvastatina, pravastatina y fluvastatina. El mecanismo de acción de los fármacos de estatinas se ha elucidado con cierto detalle. Éstas interrumpen la síntesis de colesterol y otros esteroles en el hígado mediante la inhibición competitiva del enzima 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reductasa ("HMG-CoA reductasa"). La HMG-CoA reductasa cataliza la conversión de HMG-CoA a mevalonato, que es la etapa determinante de la velocidad en la biosíntesis de colesterol.
En consecuencia, su inhibición conduce a la reducción de la velocidad de síntesis de colesterol en el hígado.
Pravastatina es el nombre médico común del compuesto químico del ácido {1S[1\alpha(\beta*,\delta*)2\alpha,6\alpha8\beta(R*),8a\alpha]}-1,2,6,7,8,8a-hexahidro-\beta,\delta,6-trihidroxi-2-metil-8-(2-metil-1-oxobutoxi)-1-naftalen heptanoico. (CAS nº de registro 81093-370). La estructura molecular de la pravastatina en forma de ácido libre está representada por la Fórmula (Ia) en la que R = OH. La forma de lactona está representada por la Fórmula (Ib), con los átomos marcados para indicar la numeración de los átomos.
100
La pravastatina, la compactina (Fórmula Ib, R = H), la lovastatina (Fórmula Ib, R = CH_{3}), la simvastatina y la fluvastatina presentan cada una cadena de alquilo que termina en un grupo de ácido carboxílico cerrado en una lactona y lleva dos grupos hidroxilo en las posiciones \beta y \delta con respecto al grupo de ácido carboxílico. Esta cadena de alquilo es la parte de la molécula que se une a la HMG-CoA reductasa. El grupo de ácido carboxílico y el grupo hidroxilo en la posición \delta son propensos a la lactonización tal como se muestra en la fórmula (Ib). Los compuestos lactonizables tales como las estatinas pueden existir en forma de ácido libre o en forma de lactona o como una mezcla en equilibrio de las dos formas. La lactonización dificulta la preparación de los fármacos de estatinas debido a que las formas de ácido libre y lactona del compuesto tiene polaridades diferentes. Es probable que un procedimiento para la purificación de una de las formas descarte la otra forma con las impurezas resultando en un rendimiento inferior. En consecuencia, generalmente se debe tener gran cuidado cuando se manejan compuestos lactonizables para aislarlos con un rendimiento elevado.
La pravastatina muestra una ventaja terapéutica importante sobre las demás estatinas. La pravastatina inhibe selectivamente la síntesis del colesterol en el hígado y en el intestino delgado pero no afecta sustancialmente la síntesis de colesterol en las células periféricas [Koga, T. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1045:115-120 (1990)]. Tal selectividad parece ser debida, en parte, a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición C-6 del núcleo de hexahidronaftaleno. La posición C-6 está ocupada por un átomo de hidrógeno en la compactina y por un grupo metilo en la lovastatina. La pravastatina es menos capaz de atravesar las membranas hidrófobas de las células periféricas que los demás congéneres hidrófobos [Serajuddin et al., J. Pharm. Sci.,80:830-834 (1991)] y se considera que la movilidad limitada de la pravastatina determina su acción más localizada en el hígado e intestino.
Según la patente US nº 4.346.227, la pravastatina fue inicialmente aislada por M. Tanaka et al., como un metabolito de la compactina durante un estudio del metabolismo de la compactina. Según la patente '227, la pravastatina se puede obtener mediante la fermentación de la compactina utilizando una multiplicidad de microorganismos: esporas de Absidia coerulea IFO 4423, Cunninghamella echinulata IFO 4445, Streptomyces rosochromogenus NRRL 1233, Syncephalastrum racemosum IFO 4814 y Syncephalastum racemosum IFO 4828. Después de la fermentación, la prevastatina se separaba del caldo de fermentación mediante la acidificación del medio a pH 3 y se extraían la prevastatina y otros compuestos orgánicos no hidrófilos con acetato de etilo, seguido de lavado con sal muera. La prevastatina en forma de ácido libre se lactonizaba mediante la adición de una cantidad catalítica de ácido trifluoroacético, a continuación se neutralizaba con bicarbonato sódico diluido, se secaba sobre sulfato sódico y se secaba por evaporación. El residuo se purificaba mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase invertida ("HPLC"). Los expertos en la materia conocen que la HPLC de fase invertida no es un procedimiento económico para la purificación de un compuesto químico a gran escala.
La patente US nº 5.942.423 se refiere a la hidroxilación microbiana de la compactina a pravastatina utilizando una cepa de Actinomadura. El único procedimiento de aislamiento que se presenta es el aislamiento de cantidades diminutas correspondientes al análisis mediante HPLC del caldo de fermentación a escala analítica. De acuerdo con una discusión más general sobre el aislamiento de pravastatina del caldo, el procedimiento de aislamiento preferido es mediante HPLC.
La solicitud PCT nº PCT/US00/19384 (WO01/03647) comúnmente asignada se refiere a la hidroxilación microbiana de la compactina a pravastatina utilizando una cepa de Micromonospora maculata que generalmente es resistente a los efectos fungicidas de la compactina.
La patente US nº 5.202.029 se refiere a un procedimiento para la purificación de inhibidores de HMG-CoA reductasa utilizando HPLC. A continuación de la separación de las impurezas en la columna de HPLC, el inhibidor del inhibidor de la HMG-CoA reductasa se eluye de la columna de HPLC como un soluto disuelto en eluyente. El eluyente se evapora parcialmente y a continuación se añade agua para inducir la cristalización del inhibidor de la HMG-CoA reductasa.
La patente US nº 5.616.595 se refiere a un procedimiento continuo para la recuperación mediante la centrifugación tangencial de los compuestos insolubles en agua de los caldos de fermentación. El caldo de fermentación se recicla a través de un filtro. La concentración del caldo aumenta con cada ciclo debido a la pérdida de agua a través del filtro. Una vez que se alcanza la concentración deseada, el caldo concentrado se suspende en un disolvente en el que el compuesto deseado es soluble. A continuación se cicla la suspensión a través del filtro. La disolución del compuesto deseado se recoge como filtrado y el compuesto deseado se aísla del filtrado y opcionalmente se somete a más purificación. Se dice que el procedimiento es aplicable a múltiples compuestos que incluyen lovastatina, pravastatina y simvastatina.
En la patente US nº 5.712.130 se describe un procedimiento para el aislamiento de lovastatina en forma de lactona. En dicho procedimiento, se extrae lovastatina del caldo de fermentación mediante acetato de butilo. A continuación se centrifuga la disolución resultante y se descarta una fase acuosa que se separa. La fase orgánica se destila al vacío a una temperatura superior a 40ºC, que, además de concentrar la disolución, promociona la lactonización al eliminar agua. Los cristales de la lactona de lovastatina cristalizan al enfriar y se recristalizan hasta una pureza del 90% o superior. Los expertos en la materia apreciarán que este procedimiento es poco adecuado para el aislamiento del ácido carboxílico libre o una sal de carboxilato de la estatina.
En la actualidad, el procedimiento más económico posible para preparar pravastatina es mediante la hidroxilación enzimática de compactina en la posición C-6. Sin embargo, los procedimientos conocidos para aislar una estatina de un caldo de fermentación son poco adecuados para aislar pravastatina como la sal sódica, no alcanzan los niveles de pureza farmacéuticamente aceptable, o necesitan separación cromatográfica para alcanzar una pureza elevada. La presente invención satisface la necesidad existente en la materia de un procedimiento eficaz para el aislamiento de pravastatina de un caldo de fermentación con gran pureza, rendimiento elevado, a escala preparativa y sin necesidad de purificación cromatográfica.
Sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento eficaz destinado al aislamiento de un compuesto de estatina de un caldo acuoso de fermentación. En particular, la presente invención proporciona un procedimiento industrial a escala preparativa para purificar pravastatina sin la necesidad de separación cromatográfica.
Otro objetivo de la invención consiste en obtener pravastatina en una forma muy pura y con gran rendimiento de manera que las estéreo selectividad y regioselectividad ntoables de las transformaciones microbianas puedan lograr, también, un elevado rendimiento y una mayor economía. La pravastatina se separa del caldo con un consumo mínimo de disolventes, se purifica con gran rendimiento y se transforma en su sal sódica farmacéuticamente aceptable.
El procedimiento implica la extracción en un disolvente orgánico de la pravastatina de un caldo de fermentación acuoso, la retroextracción de pravastatina en una disolución acuosa alcalina y, opcionalmente, una reextracción en un disolvente orgánico o la concentración de la disolución acuosa, produciendo una disolución acuosa o una disolución orgánica enriquecida en pravastatina en relación a la concentración inicial de pravastatina en el caldo de fermentación. La pravastatina se obtiene a partir de la disolución enriquecida mediante precipitación de su sal metálica o amónica y la purificación mediante recristalización de la sal de pravastatina. La sal recristalizada se trans-salifica para formar la sal sódica de pravastatina y todo exceso de iones de sodio se secuestra mediante una resina de intercambio iónico. A continuación, se puede aislar la sal sódica de pravastatina de la disolución mediante recristalización, liofilización u otros procedimientos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención consiste en un procedimiento destinado al aislamiento de pravastatina a partir de un caldo de fermentación acuoso. La presente invención se ilustra mediante el aislamiento de pravastatina sódica a partir de un caldo de fermentación.
Hidroxilación enzimática de compactina
Se sintetiza pravastatina sódica mediante hidroxilación enzimática de compactina tal como se describe en las patentes US nº 5.942.423 y 4.346.227. El caldo de hidroxilación a partir del cual se ha de aislar pravastatina puede ser cualquiera de los caldos acuosos conocidos para la fermentación de compactina a escala industrial. Si el caldo es neutro o básico cuando se completa la fermentación, se le añade un ácido con el fin de llevar el caldo a un pH comprendido entre 1 y 6, preferentemente comprendido entre 1 y 5,5 y más preferentemente comprendido entre 2 y 4. Los ácidos que se pueden utilizar incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido trifluoroacético o cualquier ácido protónico, preferentemente uno con un pH inferior a 1 en una disolución 1 M en agua. La acidificación del caldo de fermentación convierte toda sal carboxílica de pravastatina presente en el caldo en un ácido libre y/o lactona.
Aislamiento de pravastatina sódica
El procedimiento de la presente invención comprende las etapas que consisten en formar una disolución concentrada de pravastatina, obtener una sal de pravastatina de la disolución concentrada, purificar la sal de pravastatina, trans-salificar la sal de pravastatina a la sal sódica y aislar la sal sódica de pravastatina.
En la primera etapa, se obtiene pravastatina a partir de un caldo acuoso de fermentación, en disolución a una concentración relativamente elevada mediante una secuencia de operaciones de extracción, retroextracción. La fermentación se realiza típicamente a una dilución muy elevada. Mediante la dilución el caldo alcanza el máximo potencial enzimático. Una desventaja de la elevada dilución consiste en que hasta alcanzar el producto deseado en una forma más enriquecida se deberá manipular un gran volumen de medio de fermentación. El gran volumen impone asimismo restricciones en el procedimiento de aislamiento. Los procedimientos cromatográficos no son, en general, prácticos para la separación de volúmenes tan grandes, particularmente cuando el disolvente es agua. Si el aislamiento se realiza mediante extracción, el disolvente orgánico de extracción debe tener la suficiente polaridad para competir con el agua con el fin de obtener una partición favorable del producto, pero sin ser tan polar que sea esencialmente soluble en agua. Si la extracción es ineficaz, se necesitan grandes volúmenes de disolvente para aislar el producto deseado con rendimiento elevado, con el correspondiente riesgo para la salud y seguridad del personal en y en la proximidad de las instalaciones de fermentación.
Se ha descubierto que los formatos de alquilo C_{2}-C_{4} y los alquilésteres C_{1}-C_{4} de los ácidos carboxílicos C_{2}-C_{4} son capaces de extraer pravastatina del caldo de fermentación acuoso con elevada eficacia. El coeficiente de partición de la lactona de pravastatina es típicamente de 1000:1 o superior y el coeficiente de partición del ácido libre es típicamente de 10:1 o superior. El grupo alquilo puede ser lineal, ramificado o cíclico. Los ésteres preferidos incluyen el formato de etilo, formato de n-propilo, formato de i-propilo, formato de n-butilo, formato de s-butilo, formato de i-butilo, formato de t-butilo, metilacetato, acetato de etilo, acetato de n-propilo, acetato de i-propilo, acetato de n-butilo, acetato de s-butilo, acetato de i-butilo, acetato de t-butilo, metilpropionato, propionato de etilo, propionato de n-propilo, propionato de i-propilo, propionato de butilo, butirato de metilo, butirato de etilo, butirato de n-propilo, butirato de i-propilo, butirato de butilo, metilisobutirato de butilo, isobutirato de etilo, isobutirato de propilo e isobutiratos de butilo. De entre los disolventes orgánicos preferidos se ha descubierto que el acetato de etilo, el acetato de i-butilo, el acetato de propilo y el formato de etilo son particularmente adecuados. El disolvente de extracción más preferido es el acetato de i-butilo. Se pueden sustituir otros disolventes orgánicos por tales ésteres. Se pueden utilizar halocarbonos halogenados, compuestos aromáticos, cetonas y otros, tales como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, 1,2-dicloroetano, benceno, metil butil cetona, dietiléter, metil t-butil éter.
En la etapa de enriquecimiento de la presente invención, se forma un extracto orgánico poniendo en contacto un disolvente orgánico de extracción, preferentemente seleccionado de entre los citados anteriormente, con el caldo de fermentación. El pH del caldo de fermentación debe estar entre aproximadamente pH 1 y aproximadamente pH 6. Preferentemente, el pH debe estar entre aproximadamente pH 2 y aproximadamente pH 4.
Se puede utilizar cualquier equipo adaptado para el mezclado de grandes volúmenes de líquidos en un procedimiento en lote o en continuo. Ya que la fermentación se realiza típicamente como un procedimiento en lote, la elección natural es un procedimiento en lote. En consecuencia, se pueden utilizar mezcladores de grandes volúmenes y tanques de sedimentación o equipos adaptados para el mezclado y la separación de fases. En la forma de realización preferida de la presente invención se pone en contacto con el caldo de fermentación una parte menor, preferentemente inferior a 50% (volumen/volumen), del disolvente de extracción, preferentemente con ligera agitación mecánica. Después de la puesta en contacto y la separación de fases, el disolvente de extracción que contiene la pravastatina se separa del caldo de fermentación desprovisto de pravastatina. El caldo se puede entonces poner en contacto con disolvente orgánico de extracción una o más veces y se pueden combinar todos los extractos orgánicos resultantes. El volumen del extracto orgánico de pravastatina resultante puede ser superior o inferior al volumen del caldo de fermentación.
La segunda operación destinada a producir una disolución enriquecida de prevastatina es la retroextracción de la prevastatina en una disolución acuosa básica. La retroextracción elimina alguna o todas las impurezas orgánicas no polares y, si existe la lactona de prevastatina, promociona la apertura del anillo de lactona. Aunque no se pretende limitarse a una teoría química en particular o mecanismo, según la teoría química bien establecida la pravastatina se encuentra en forma de anión carboxilato en el extracto acuoso básico. La retroextracción se puede utilizar con el fin de concentrar la pravastatina utilizando un volumen de base acuosa inferior al volumen de extracto orgánico. La base es preferentemente NaOH, NH_{4}OH, o KOH, más preferentemente NH_{4}OH ó NaOH y la disolución acuosa básica preferentemente tiene un pH comprendido entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 13,7, más preferentemente de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 13, el más preferido entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 11. El disolvente de extracción se pone en contacto con la disolución acuosa básica hasta que la cantidad de pravastatina en la fase orgánica ha quedado esencialmente agotada tal como se determina mediante cromatografía en capa fina o mediante otro procedimiento que incluye el juicio subjetivo de que ha tenido lugar suficiente contacto para una extracción completa. Se pueden realizar múltiples retroextracciones para una recuperación óptima. Sin embargo, una sola retroextracción es muy eficaz cuando la fase orgánica es acetato de butilo. Preferentemente, la retroextracción se conduce con un volumen final de disolución acuosa básica inferior a un tercio del volumen de extracto orgánico, más preferentemente inferior a un cuarto y todavía más preferentemente, aproximadamente un quinto del volumen del extracto orgánico. El intervalo de concentración preferido de la disolución acuosa enriquecida de la que más adelante se obtiene pravastatina en el procedimiento está comprendido entre aproximadamente 2 g/l a aproximadamente 50 g/l más preferentemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15 g/l.
El extracto acuoso se puede concentrar todavía más mediante destilación, preferentemente destilación al vacío, para incrementar la concentración de la disolución. Antes de concentrar más el extracto acuoso mediante destilación el pH debe ajustarse a entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 13,7, preferentemente a entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 11 y más preferentemente a entre aproximadamente pH 8 y aproximadamente pH 10. La destilación al vacío se puede realizar mediante calentamiento del extracto acuoso desde aproximadamente 30ºC y aproximadamente 80ºC bajo una presión absoluta comprendida entre 5 y 120 mm Hg. La elección de otras condiciones de destilación al vacío está comprendida entre las capacidades de los expertos en la materia, en lo que al procedimiento se refiere.
Como alternativa a la obtención de pravastatina a partir de una disolución acuosa enriquecida más adelante en el procedimiento, la pravastatina se puede obtener a partir de una disolución orgánica enriquecida. La disolución orgánica enriquecida en pravastatina se forma mediante la reextracción de pravastatina en un disolvente orgánico después de haber reacidificado el extracto acuoso con un ácido, preferentemente ácido trifluoro acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético o ácido fosfórico, más preferentemente ácido sulfúrico o ácido fosfórico, a un pH comprendido entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 6,5, más preferentemente comprendido entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0. Dependiendo de las condiciones, el anión de carboxilato de pravastatina, o se puede protonar al ácido libre de pravastatina, que es menos polar que el carboxilato o se puede lactonizar a una forma todavía menos polar.
La pravastatina se reextrae en un disolvente de reextracción seleccionado de entre los disolventes orgánicos descritos anteriormente como adecuados para la extracción de pravastatina del caldo de fermentación. El disolvente orgánico puede ser, pero no necesariamente, el mismo disolvente que se utilizó para extraer pravastatina del caldo de fermentación. En esta reextracción, se alcanza un enriquecimiento todavía superior mediante reextracción en una cantidad de disolvente orgánico preferentemente inferior a aproximadamente 50% (volumen/volumen) del extracto acuoso, más preferentemente comprendida entre aproximadamente 33% (v/v) y aproximadamente 20% (v/v) y todavía más preferentemente aproximadamente 25% (v/v) del volumen del extracto acuoso. En consecuencia, tal como se ejemplifica en el Ejemplo 1, la pravastatina se puede concentrar a partir de 100 l de caldo de fermentación hasta 8 litros de disolución orgánica enriquecida con un rendimiento de 89% a partir del extracto orgánico inicial. Los expertos en la materia apreciarán que se puede obtener un rendimiento más elevado en la purificación de pravastatina mediante la realización de múltiples extracciones mientras que en la forma de realización preferida de la presente invención se ha descrito una sola extracción. Esta forma de realización preferida alcanza un equilibrio entre la economía de disolventes y elevado rendimiento en producto. Los desvíos de dicha forma de realización que incrementan todavía más el rendimiento mediante repetidas extracciones mientras que anteriormente solamente se describió una, no se apartan necesariamente del espíritu de la invención. Antes de proceder a obtener pravastatina a partir de la disolución orgánica enriquecida mediante "salado", se seca preferentemente la disolución orgánica enriquecida, lo que se puede realizar utilizando un agente de secado convencional tal como MgSO_{4}, Na_{2}SO_{4}, CaSO_{4}, sílice, perlita y semejantes, y opcionalmente se decolora con carbón activo. A continuación se separa convencionalmente una disolución orgánica enriquecida seca y/o decolorada mediante, por ejemplo, filtración y decantación.
En la etapa siguiente del procedimiento, se obtiene una sal de pravastatina a partir de una disolución acuosa u orgánica, según sea el caso. La sal se obtiene mediante precipitación a partir de la disolución enriquecida. La precipitación se induce mediante la adición de una sal metálica, amoníaco, una amina, una sal amónica o una sal de amina a la disolución.
Las sales metálicas que se pueden utilizar incluyen hidróxidos, alcóxidos, haluros, carbonatos, boratos, fosfatos, tiocianatos, acetatos, nitratos, sulfatos, tiosulfatos y cualquier otra sal de elevada solubilidad en agua. Las sales metálicas comprenden litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, cobre, hierro, níquel, manganeso, estaño, zinc y aluminio. Las sales preferidas son sales de los siguientes cationes metálicos: Li^{+}, Na^{+}, Ca^{2+}, Mg^{2+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+}, Mn^{2+}, Sn^{2+}, Zn^{2+} y Al^{3+}. Los cationes metálicos preferidos de las sales utilizadas para inducir la precipitación de una sal metálica de pravastatina son Na^{+} y K^{+}.
La pravastatina se puede precipitar también como una sal amónica o una sal de amina añadiendo amoníaco o una amina. La amina puede ser amina primaria, secundaria o terciaria. Se puede utilizar una alquil- o arilamina cualquiera, que no se encuentre imposibilitada para que se produzca la interacción iónica entre el nitrógeno de la amina y el grupo carboxilo de la pravastatina. Las aminas comprenden, pero sin que ello sea limitante, metil, dimetil, trimetil, etil, dietil, trietil y otras aminas C_{1}-C_{6} primarias, secundarias y terciarias; y además incluyen morfolina, N-metilmorfolina, isopropil ciclohexil amina, piperidina y semejantes. Independientemente de la ausencia, presencia o multiplicidad de sustituciones en el nitrógeno, una sal formada mediante la reacción de amoníaco o una amina se refiere a continuación como una sal de amonio. Se pretende que el significado de esto comprenda las sales de aminas así como también las sales de amonio.
La precipitación de la sal de amonio de la pravastatina también se puede inducir mediante la adición de una sal de amonio sola o en combinación con amoníaco, una amina o una sal metálica. Las sales de amonio preferidas son las siguientes sales de amoníaco: NH_{4}Cl, NH_{4}Br, NH_{4}I, (NH_{4})_{2}SO_{4}, NH_{4}NO_{3}, (NH_{4})_{3}PO_{4}, (NH_{4})_{2}S_{2}O_{4}, NH_{4}OAc y NH_{4}SCN, siendo la más preferida NH_{4}Cl.
Las sales metálicas, sales de amonio y líquidos de elevado punto de ebullición y las aminas sólidas se pueden añadir mediante los procedimientos convencionales, preferentemente en una zona bien ventilada, tanto como sólidos, líquidos puros o disoluciones en agua o disolventes orgánicos. La adición de amoníaco gaseoso necesita equipos especiales para el manejo de gases cáusticos. Tales equipos, que incluyen recipientes a presión, reguladores, válvulas y conductos se encuentran ampliamente disponibles. El amoníaco se puede introducir en el espacio sobre la disolución enriquecida y a presión ambiental o, si se dispone de un recipiente presurizado, a presión elevada. Por el contrario, el amoníaco se puede hacer burbujear a través de la disolución, que se agita preferentemente para reducir la oclusión del tubo de admisión por la sal amónica de pravastatina precipitada.
En una forma de realización preferida de la presente invención, la pravastatina se obtiene a partir de la disolución enriquecida como la sal amónica mediante la adición de amoníaco o una amina. En una forma de realización más preferida, la pravastatina se obtiene a partir de la disolución enriquecida en forma de sal amónica de pravastatina mediante la adición de amoníaco gas a la disolución enriquecida. El amoníaco genera una sal amónica muy polar de pravastatina que precipita fácilmente del disolvente con un elevado rendimiento. En la forma de realización más preferida, la pravastatina se obtiene como la sal amónica de pravastatina mediante la adición de amoníaco gaseoso y una sal amónica. La sal de amonio más preferida es NH_{4}Cl, que tiene la ventaja de formar una disolución acuosa concentrada de cloruro amónico en caso de un secado incompleto de la disolución orgánica enriquecida.
La temperatura a la que se deben añadir la sal metálica, amoníaco, amina y/o sal amónica se puede determinar mediante los procedimientos experimentales habituales, realizando la reacción a escala reducida y siguiendo el carácter exotérmico de la reacción. Preferentemente, la temperatura de la disolución no se permite que exceda los 40ºC. Aunque se pueden experimentar temperaturas de hasta 80ºC sin una descomposición significativa de la pravastatina, muchos disolventes orgánicos de la presente invención hervirán a una temperatura inferior. Cuando se utiliza amoníaco la temperatura preferida está comprendida entre aproximadamente -10ºC y aproximadamente 40ºC.
Una vez parece que ha cesado la precipitación o una vez que mediante otros medios se determina que el consumo de pravastatina está esencialmente completo, debe cesar la adición.
Cuando se utiliza amoníaco o una amina volátil, se debe ventilar el recipiente para dispersar el exceso de vapores. A continuación se aíslan los cristales mediante filtración, decantación del disolvente, evaporación del disolvente u otro procedimiento, preferentemente mediante filtración.
Después de, opcionalmente, limpiar los cristales precipitados, la sal de pravastatina se purifica mediante una o más recristalizaciones. Para purificar la sal de pravastatina, primero se disuelve la sal en agua. Preferentemente se utiliza la mínima cantidad de agua posible. La disolución generalmente necesitará más agua, si se ha obtenido una sal de amina, en lugar de una sal metálica o una sal de amonio. Una vez se ha disuelto por completo la sal de pravastatina, se disminuye la polaridad de la disolución mediante la adición de un antidisolvente. El antidisolvente es un disolvente orgánico soluble en agua o una mezcla de disolventes en la que la sal de pravastatina tiene poca solubilidad. Los disolventes orgánicos adecuados solubles en agua comprenden acetona, acetonitrilo, acetatos de alquilo, i-butanol y etanol.
Se puede permitir que la sal de pravastatina recristalice espontáneamente o se puede inducir a recristalizar mediante etapas adicionales tales como la adición de un ión común, enfriado o adición de un cristal semilla. Para inducir todavía más la recristalización mediante la adición de un ión común, se añade a la mezcla una sal que tenga el mismo metal o ión amónico que la sal de pravastatina. Las sales adecuadas para inducir la recristalización de las sales de pravastatina son las mismas sales metálicas y de amonio que se pueden utilizar para precipitar la sal a partir de la disolución enriquecida. Según el procedimiento preferido en el que se obtiene pravastatina como sal amónica, para inducir la recristalización de la sal de pravastatina se añade a la disolución la sal de cloruro de amonio o de amina previamente utilizada para obtener la sal de pravastatina. En la forma de realización más preferida, en la que se obtiene la sal amónica de pravastatina, la sal que se añade es preferentemente NH_{4}Cl.
La recristalización se puede realizar a una temperatura comprendida entre aproximadamente -10ºC y aproximadamente 60ºC, preferentemente a entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 50ºC, más preferentemente entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 40ºC. Una vez que se ha recristalizado la sal de pravastatina sustancialmente a partir de la disolución, los cristales se aíslan y se limpian, por ejemplo, con una mezcla 1:1 de acetato de i-butílico y acetona y se secan. El secado se puede realizar a temperatura ambiente pero es preferible realizarlo a una temperatura ligeramente elevada, inferior a 45ºC y preferentemente a aproximadamente 40ºC. Opcionalmente, para un buen efecto, se puede repetir la recristalización, tal como se muestra en los Ejemplos 7 y 8. Cada repetición tiene lugar con un rendimiento comprendido aproximadamente entre el 92 y 96%.
Incluso después de la recristalización la pravastatina contiene una impureza orgánica con un tiempo de retención relativo (RRT) de 0,9 en HPLC. La impureza orgánica se estima que comprende un 0,2% de la composición total, con base en el cromatograma HPLC obtenido mediante detección UV. La impureza orgánica se puede eliminar tal como se indica a continuación.
Se disuelve la sal de pravastatina en agua, preferentemente la mínima o aproximadamente 6 ml x g^{-1} y se añade aproximadamente 0,2% (vol./vol.) de isobutanol. Se eleva el pH desde pH 8 hasta aproximadamente pH 14, preferentemente entre aproximadamente pH 10 y aproximadamente pH 13,7 mediante la adición de hidróxido sódico y se mantiene la mezcla a una temperatura comprendida entre aproximadamente 10ºC y aproximadamente 50ºC durante entre 10 y 200 minutos, preferentemente a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 30ºC durante entre 60 y 100 minutos. A continuación, se reacidifica la disolución mediante una ácido mineral u orgánico, preferentemente ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, a un pH comprendido entre aproximadamente pH 4 y aproximadamente pH 9, más preferentemente comprendido entre pH 5 y aproximadamente pH 9, todavía más preferible entre aproximadamente pH 6 y aproximadamente pH 7,6. Una vez ajustado el pH, se añade a la disolución cloruro amónico para precipitar la sal de pravastatina. Si la cantidad de agua utilizada es de aproximadamente 6 ml x g^{-1} , se recomienda la utilización de entre aproximadamente 2,0 y 2,3 g de cloruro amónico por gramo de pravastatina. Preferentemente, el cloruro amónico se añade por partes durante un período de entre cuatro y seis horas.
Una vez añadido el cloruro amónico, la sal amónica de pravastatina se puede recristalizar espontáneamente. De otro modo, se puede inducir la recristalización mediante enfriado, sembrado u otro procedimiento convencional. Mientras que la recristalización preferentemente se induce mediante la adición de un ión común, por ejemplo la adición de un cloruro amónico, la recristalización se puede inducir también mediante la dilución con un antidisolvente, tal como se realiza preferentemente en la etapa de recristalización descrita anteriormente. Sin embargo, en esta operación se debe tener cuidado de no precipitar inadvertidamente sales de pravastatina. Tal como se muestra con más detalle en el Ejemplo 1, la cantidad de impureza orgánica de RRT = 0,9 se redujo por debajo de los límites detectables y la pravastatina amonica se obtuvo con una pureza de aproximadamente 99,3%, acercándose al nivel de pureza farmacéuticamente aceptable. En esta etapa de procedimiento inventivo, se puede obtener una sal amónica de pravastatina con menos de un 0,7% (peso/peso) de impurezas orgánicas.
Una vez eliminadas las impurezas orgánicas mediante recristalización, la sal de pravastatina se trans-salifica a pravastatina sódica. Trans-salificar, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier procedimiento mediante el que el catión de una molécula de sal orgánica se intercambia por otro catión. En la trans-salificación, la pravastatina se libera primero de su sal metálica o de amonio mediante la disolución de la sal en un disolvente acuoso, se añade un ácido prótico tal como ácido clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, trifluoroacético o acético a la disolución acuosa y se extrae la pravastatina de la disolución acuosa con un disolvente orgánico. El ácido se añade a la disolución acuosa en una cantidad suficiente para neutralizarla o acidificarla, preferentemente para acidificarla a un pH comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6, más preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4. Antes o después de añadir el ácido prótico a la disolución acuosa, la disolución acuosa se pone en contacto con un disolvente orgánico inmiscible tal como acetato de i-butilo o cualquier otro disolvente orgánico inmiscible en agua. Una vez que se ha puesto en contacto la disolución acuosa con el disolvente orgánico inmiscible en agua y tratado con el ácido prótico, la fase orgánica resultante que contiene pravastatina se separa de la fase acuosa y, después de limpiar opcionalmente con agua para eliminar los residuos de amonio, se reextrae la pravastatina con hidróxido sódico. Es preferible utilizar una cantidad de NaOH solamente en un exceso modesto sobre la cantidad de pravastatina, preferentemente inferior a 1,1 
\hbox{equivalentes de ésta, más preferentemente inferior
a 1,02 equivalentes de ésta.}
Después de la extracción en el hidróxido sódico acuoso, el exceso de cationes de sodio se secuestra para obtener una equivalencia de aproximadamente 1:1 entre cationes sodio y pravastatina. El secuestro se alcanza utilizando resinas de intercambio iónico insolubles en agua. Las resinas de intercambio iónico adecuadas son las resinas de tipo catiónico y de tipo quelante, las preferidas son las resinas de intercambio de ácidos fuertes y débiles.
Entre las resinas de ácido fuerte para intercambio catiónico que se pueden utilizar se encuentran las que tienen grupos de ácido sulfónico (SO_{3}^{-}H^{+}). Entre éstas se encuentran comprendidos los productos comerciales Amberlite® IR-118, IR-120, 252H; Amberlyst® 15, 36; Amberjet® 1200(H) (Rohm and Haas); la serie de resinas de intercambio iónico Dowex® 50WX, Dowex® HCR-W2, Dowex® 650C, Dowex® Maraton C, Dowex® DR-2030 y Dowex® HCR-S (Dow Chemical Co.); la serie de resinas Diaion® SK 102 a 116 (Mitsubishi Chemical Co.) y Lewatit SP 120 (Bayer). Las resinas de ácido fuerte de intercambio catiónico preferidas son las series Amberlite® 120, Dowex® 50WX y Diaion® SK.
Las resinas de intercambio catiónico de ácido débil comprenden las que tienen grupos de ácidos grupo carboxílico colgando. Las resinas de intercambio catiónico de ácido débil comprenden los productos comerciales Amberlite® CG-50, IRP-64, IRC 50 y C67; la serie Dowex]® CCR, la serie Lewatit® CNP y la serie Diaion® WK, de entre éstas, las más preferidas son Amberlite® IRC50, Lewatit® CNP 80 y Diaion® WK 10. Las menos preferidas son las resinas de intercambio de tipo quelato. Algunas de las variedades comerciales que se encuentran disponibles comprenden Duolite® C-718 y C-467 (Rohm & Haas).
La disolución que contiene sal sódica de pravastatina y un exceso de cationes de sodio se puede poner en contacto con la resina de intercambio iónico mediante los procedimientos conocidos en la materia, que comprenden pasar la disolución a través de una columna o lecho de la resina o mediante la agitación de una cantidad de resina suficiente en un frasco con la disolución. La forma de contacto no es crítica. Una vez secuestrados los iones de sodio en exceso, el pH de la disolución de pravastatina deberá estar comprendido entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 10, preferentemente entre aproximadamente 7,4 y aproximadamente 7,8, aunque el pH variará dependiendo de la dilución. La reducción del pH de la disolución de pravastatina sódica de un pH elevado a uno inferior y la nivelación del pH a un nivel de pH inferior es un indicio de un secuestro esencialmente completo del exceso de iones Na^{+}. Una vez el secuestro está completo, la disolución de pravastatina sódica se separa de la resina de modo convencional. Se puede recoger como el efluente de una columna o lecho o se puede separar mediante filtración, decantación y
semejantes.
La pravastatina sódica se puede aislar de la disolución de pravastatina sódica mediante cristalización. Una cristalización eficaz puede requerir la eliminación parcial de agua, que se puede realizar mediante destilación al vació o nanofiltración. Preferentemente, la disolución de sal sódica de pravastatina se concentra de aproximadamente 20 a 50% (peso/volumen) antes de la cristalización. Si es necesario, después de la concentración, la disolución acuosa de pravastatina sódica se puede ajustar a un pH comprendido entre aproximadamente 7 y aproximadamente 10 mediante una resina de intercambio iónico en la forma H^{+}.
La adición de un disolvente orgánico soluble en agua o una mezcla de disolventes orgánicos a la disolución de pravastatina sódica ayuda a la cristalización. En particular, se pueden mencionar mezclas de acetona y acetona/acetonitrilo, etanol/acetonitrilo y etanol/acetato de etilo. Uno de los sistemas de disolvente más preferidos para la cristalización de pravastatina sódica es una mezcla 1/3/12 de agua/acetona/acetonitrilo formada concentrando la disolución de pravastatina sódica hasta aproximadamente un 30% peso/volumen y a continuación añadiendo el volumen adecuado de mezcla 1/4 de acetona/acetonitrilo. La otra mezcla de disolventes de cristalización preferida es agua-acetona (1:15).
La pravastatina sódica también se puede aislar mediante liofilización de la disolución de pravastatina sódica.
Independientemente de que se haya aislado mediante cristalización u otros procedimientos que mejoren la pureza del producto, la pravastatina sódica que se aísla en la práctica de la presente invención está sustancialmente libre de lactona de pravastatina. Tal como se demuestra en los ejemplos siguientes, la pravastatina sódica se puede aislar con un contenido de impurezas totales inferior al 0,5% (peso/peso). Además, la pravastatina sódica se puede aislar con un contenido total de impurezas del 0,2% (peso/peso) o inferior mediante la adhesión a las formas de realización preferidas de la presente invención, dos de las cuales se ejemplifican en los Ejemplos 1 y 15. Las principales impurezas que constituyen parte del contenido total de impurezas comprenden epipravastatina sódica, 3’-OH compactina sódica, 6-hidroxi isocompactina sódica y lactona de pravastatina.
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Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de pravastatina
El caldo de fermentación (100 l) se acidificó a un pH comprendido entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 5,0 mediante la adición de ácido sulfúrico. El caldo de fermentación acidificado se extrae con acetato de i-butilo (3 x 50 l). El rendimiento de la extracción mediante acetato de i-butilo fue del 95% por análisis mediante HPLC calibrado al estándar interno del caldo. Las condiciones de HPLC (fase reversa):columa:C_{18}, tamaño de partícula 5 \mum, longitud 150 mm, diámetro 4,6 mm; fase móvil: 45% metanol/agua, 0,1% Et_{3}N, 0,1% ácido acético glaciar; velocidad de flujo 1,3 ml x min^{-1}; temperatura de la columna 25ºC; volumen de inyección 10 \mul; estándar interno etil parahidroxibenzoato; detección: UV \lambda = 238 nm.
Las fases combinadas de acetato de i-butilo se extrajeron con agua (35 l) a un pH comprendido entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 11,0 mediante la adición de hidróxido amónico concentrado. La fase acuosa de disolución de pravastatina resultante se acidificó a un pH comprendido entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mediante la adición de 5 M ácido sulfúrico y se reextrajo mediante acetato de i-butilo (8 l). La disolución de pravastatina resultante se secó parcialmente sobre Perlita y Na_{2}SO_{4}. La disolución de pravastatina se decantó y a continuación se filtró de los agentes secantes y se decoloró sobre carbón activado (1,7 g). La disolución se filtró a continuación para eliminar el carbón y se transfirió a un frasco equipado con una entrada de gas.
El amoníaco gas se introdujo en el espacio sobre la disolución a entre 15 y 25ºC con agitación rápida. Después de que pareció cesar la precipitación, se apagó el amoníaco y se añadió cloruro amónico a la mezcla para facilitar la filtración. Los cristales precipitados de sal de carboxilato de pravastatina amónica se recogieron mediante filtración y se limpiaron con acetato de i-butilo y a continuación acetona lo que produjo sal amónica de pravastatina de una pureza de aproximadamente 94% tal como se determinó mediante HPLC, detección mediante UV a \lambda = 238 nm.
La sal amónica de pravastatina se purificó adicionalmente mediante cristalización a partir de una disolución saturada de cloruro amónico tal como sigue. La sal de pravastatina que contienen 162 g de sustancia activa se disolvió en agua (960 ml) y se diluyó con acetona (96 ml) y acetato de i-butilo (96 ml) a entre aproximadamente 35 y 40ºC. La disolución se enfrió a entre aproximadamente 30 y 32ºC y se indujo la cristalización de la pravastatina amónica mediante la adición de NH_{4}Cl sólido hasta que más adiciones no parecieron genera cristales adicionales. Después de añadir cloruro amónico, se enfrió la disolución a entre aproximadamente 0 y 26ºC. Los cristales de pravastatina amónica se recogieron mediante filtración y se limpiaron mediante acetato de i-butilo y acetona, tal como anteriormente, y se secaron a aproximadamente 40ºC. Los cristales resultantes de sal de pravastatina amónica (155,5 g) se obtuvieron con una pureza aproximada del 98% según se determinó mediante HPLC utilizando las condiciones anteriormente mencionadas.
La sal amónica de pravastatina se purificó adicionalmente mediante otra cristalización tal como sigue. Se disolvió la sal amónica de pravastatina (155,5 g de sustancia activa) en agua (900 ml). Se añadió isobutanol (2 ml) y a continuación se elevó el pH hasta entre aproximadamente pH 10 y aproximadamente pH 13,7 mediante la adición de disolución concentrada de hidróxido sódico y se agitó la disolución durante 75 minutos a temperatura ambiente. Se neutralizó la disolución a un pH de aproximadamente 7 mediante la adición de ácido sulfúrico y se indujo la cristalización de pravastatina amónica mediante la adición de NH_{4}Cl sólido. Los cristales (150 g) se recogieron mediante filtración y se limpiaron con acetona. La pravastatina amónica se determinó que fue 99,3% pura mediante HPLC, detección mediante la utilización de las condiciones descritas anteriormente.
A continuación se trans-salificó la pravastatina amónica a la sal sódica como sigue. Se disolvieron los cristales de pravastatina amónica en agua (1800 ml). Se añadió acetato de i-butilo (10,5 l). A continuación se acidificó la disolución a un pH comprendido entre aproximadamente pH 2 y aproximadamente pH 4, mediante la adición de ácido sulfúrico, lo que convirtió a la pravastatina de vuelta en el ácido libre. La fase de acetato de i-butilo, que contiene la pravastatina, se limpió con agua (5 x 300 ml). La pravastatina se convirtió a continuación en su sal sódica y se retroextrajo en otra fase acuosa mediante agitación de la disolución en acetato de i-butilo sobre agua (900 a 2700 ml) con adición intermitente de 8 m NaOH hasta que se alcanzó un pH comprendido entre aproximadamente pH 7,4 y aproximadamente pH 13.
La disolución de sal sódica de pravastatina se trató entonces con una resina de intercambio iónico para secuestrar el exceso de cationes de sodio. Después de la separación, la fase acuosa se agitó durante 30 minutos sobre resina de intercambio Amberlita® IRC 50 en la forma H^{+} a temperatura ambiente. La agitación continuó hasta que se alcanzó un pH comprendido entre aproximadamente pH 7,4 y aproximadamente pH 7,8.
A continuación se filtró la disolución para eliminar la resina y se concentró parcialmente al vacío hasta un peso de 508 g. A continuación se diluyó la disolución con acetonitrilo (480 ml), dando una mezcla disolvente de 1,4:1 acetonitrilo:agua. La disolución se agitó sobre carbón activo (5 g) para decolorar. Después de filtrar el carbón activo, se obtuvo pravastatina sódica como cristales mediante cristalización con un rendimiento del 90% después de la adición de acetona y acetonitrilo para formar una mezcla 1/3/12 de agua/acetona/acetonitrilo (5,9 l) con enfriamiento hasta una temperatura comprendida entre aproximadamente -10 y aproximadamente 0ºC. La pravastatina sódica se obtuvo con un rendimiento global de 65% con una pureza del 99,3% relativa a la sustancia activa fermentada inicial según se determinó mediante HPLC utilizando las condiciones anteriormente descritas.
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Ejemplo 2
A continuación del proceso del Ejemplo 1, pero omitiendo la recristalización de la mezcla de agua/acetona/aceto-
nitrilo, se obtuvo la pravastatina sódica mediante liofilización de la disolución concentrada de pravastatina sódica en agua con una pureza de aproximadamente el 99% y un rendimiento de aproximadamente el 72%. La comparación de la pureza final del presente ejemplo con la del Ejemplo 1 demuestra que la recristalización de la pravastatina sódica, más bien que la liofilización, da un producto algo más puro.
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Ejemplos 3 a 6
A continuación del Ejemplo 1, se aisló la pravastatina sódica a partir del caldo de fermentación con los rendimientos y purezas mostrados en la Tabla 1, cuando se añadió el correspondiente disolvente en el procedimiento de trans-salificación.
TABLA 1 
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Ejemplo nº Disolvente orgánico Rendimiento (%) Pureza (%)
3 CH_{2}Cl_{2} 63 96,6
4 Acetato de etilo 58 99,5
5 Formato de etilo 51 99,6
6 Butil metil cetona 61 99,5 
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Ejemplo 7
A continuación de proceso del Ejemplo 1, pero purificando todavía más la sal amónica de pravastatina mediante una repetición de la cristalización de la sal amónica de pravastatina, se obtuvo pravastatina sódica con una pureza de aproximadamente el 99,6% y un rendimiento del 58,4%.
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Ejemplo 8
A continuación del proceso del Ejemplo 1, pero purificando todavía más la sal amónica de pravastatina mediante la repetición dos veces de la cristalización de la sal amónica de pravastatina, se obtuvo pravastatina sódica con una pureza de aproximadamente 99,8% y un rendimiento del 53%.
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Ejemplo 9
A continuación del proceso del Ejemplo 1, el caldo de fermentación (100 l) se acidificó a un pH comprendido entre aproximadamente el 2,5 y aproximadamente el 5,0 mediante la adición de ácido sulfúrico. El caldo de fermentación acidificado se extrajo con acetato de i-butilo (3 x 50 l). Las fases de acetato de i-butilo combinadas se extrajeron con agua (35 l) que había sido acidificada a un pH comprendido entre aproximadamente pH 7,5 y aproximadamente pH 11,0 mediante la adición de hidróxido amónico concentrado.
En lugar de acidificar el extracto acuoso y extraer con acetato de i-butilo para obtener una solución orgánica más enriquecida tal como se realizó en el Ejemplo 1, el extracto acuoso se concentró a 140 g/l al vacío. La disolución concentrada resultante tuvo un pH comprendido entre aproximadamente pH 4,0 y aproximadamente pH 8. El exceso de amoníaco se extrajo mediante evaporación.
A continuación se añadieron cristales de cloruro amónico (405 g) lentamente, en partes, a la disolución concentrada durante un período de cuatro horas y se permitió que la sal amónica de pravastatina cristalizase a temperatura ambiente. A continuación se aislaron los cristales mediante filtración y se limpiaron con disolución saturada de cloruro amónico. A continuación se añadieron los cristales a agua (1 l) a 40ºC. Una vez disueltos, se redujo la temperatura a 30ºC y se añadió cloruro amónico (330 g) en porciones a la disolución durante un periodo de dos horas. A continuación se agitó la disolución durante 15 horas a temperatura ambiente y se recuperaron los cristales de la sal amónica de pravastatina mediante filtración, se limpiaron con acetato de i-butilo, a continuación con acetona y se secaron. Los cristales resultantes se purificaron todavía más mediante recristalización, se transpusieron a la sal sódica y se aislaron tal como se describe en el Ejemplo 1. Se obtuvo pravastatina sódica de una pureza del 99,6% con un rendimiento del 64,7%.
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Ejemplo 10
A continuación del Ejemplo 1, pero la sal sódica de pravastatina se cristalizó de una mezcla 1:15 de agua/acetona con un rendimiento global, relativo al de la sustancia activa fermentada inicial, del 64% y una pureza del 99,6% tal como se determinó mediante HPLC.
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Ejemplo 11
A continuación del procedimiento del Ejemplo 9, los dos párrafos iniciales, se obtuvo un extracto acuoso concentrado (140 g x l^{-1}). El extracto acuoso concentrado se dividió en tres partes iguales. A continuación, se acidificó la disolución concentrada resultante a un pH comprendido entre aproximadamente pH 4,0 y aproximadamente pH 8,0 mediante la adición de HCl 1 M. Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 9, tercer párrafo, pero sustituyendo las sales en la Tabla 2 por cloruro amónico, se precipitó una sal de pravastatina en cada una de las porciones y se traspuso a la sal sódica.
TABLA 2
Sales Pureza (%) Rendimiento (%)
KCl 99,3 42
NaCl 99,4 38
LiCl 99,1 34

Claims (42)

1. Procedimiento destinado al aislamiento de una sal sódica de pravastatina a partir de un caldo de fermentación que comprende las etapas siguientes:
a)
formar una disolución enriquecida de pravastatina;
b)
obtener una sal de pravastatina a partir de la disolución enriquecida;
c)
purificar la sal de pravastatina;
d)
trans-salificar la sal de pravastatina a una sal sódica de pravastatina mediante:
i)
la liberación de la pravastatina de su sal,
ii)
la puesta en contacto de la pravastatina con una disolución acuosa de hidróxido sódico formando así una disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina, y
iii)
el secuestro de los iones de sodio en exceso poniendo en contacto la disolución acuosa de las sal sódica de pravastatina con una resina de intercambio iónico insoluble en agua, y
e)
aislar la sal sódica de pravastatina de la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la disolución enriquecida es una disolución acuosa enriquecida que se forma mediante las etapas siguientes:
a)
poner en contacto un caldo de fermentación ácido con un disolvente orgánico de extracción y formar así un extracto orgánico de pravastatina;
b)
retroextraer el extracto orgánico poniéndolo en contacto con una disolución acuosa básica que forma así un extracto acuoso; y
c)
concentrar el extracto acuoso formando así una disolución acuosa enriquecida de pravastatina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la disolución enriquecida es una disolución orgánica enriquecida que se forma mediante las etapas siguientes:
a)
poner en contacto un caldo de fermentación ácido con un disolvente orgánico de extracción y formar de esta manera un extracto orgánico de pravastatina;
b)
retroextraer el extracto orgánico por la puesta en contacto con una disolución acuosa básica que forma de esta manera un extracto acuoso de pravastatina; y
c)
reextraer la pravastatina del extracto acuoso mediante la puesta en contacto con un disolvente orgánico de reextracción formando de esta manera una disolución orgánica enriquecida de pravastatina.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que la concentración del extracto acuoso se realiza mediante destilación al vacío.
5. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que la puesta en contacto del caldo de fermentación ácido con el disolvente orgánico de extracción se realiza a un pH comprendido entre aproximadamente pH 1 y aproximadamente pH 6.
6. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que la retroextracción con una disolución acuosa básica se realiza a un pH comprendido entre aproximadamente pH 7,0 y aproximadamente pH 13,7.
7. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que el disolvente orgánico de extracción se selecciona de entre el grupo constituido por formatos de alquil C_{2}-C_{4}, ésteres de alquilo C_{1}-C_{4} de ácidos carboxílicos alquílicos C_{2}-C_{4}, diclorometano, dicloroetano, cloroformo, tetracloruro de carbono y butil metil cetona.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el disolvente orgánico de extracción es un acetato.
9. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la reextracción de pravastatina con un disolvente orgánico se realiza a un pH comprendido entre aproximadamente pH 1 y aproximadamente pH 6.
10. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el disolvente orgánico de extracción y el disolvente orgánico de reextracción se seleccionan cada uno de ellos independientemente de entre el grupo constituido por formatos de alquilo C_{2}-C_{4}, ésteres de alquilo C_{1}-C_{4} de ácidos carboxílicos alquílicos C_{2}-C_{4}, diclorometano, dicloroetano, cloroformo, tetracloruro de carbono, butil metil cetona.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el disolvente orgánico de extracción y el disolvente orgánico de reextracción son acetatos.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el disolvente orgánico de extracción y el disolvente orgánico de reextracción son acetato de i-butilo.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la obtención de la sal de pravastatina se realiza a una temperatura de entre aproximadamente -10ºC y aproximadamente +60ºC.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la obtención de la sal de pravastatina comprende precipitar la sal de pravastatina mediante la adición de una sal metálica, amoníaco, una amina, o una sal de amonio a la disolución enriquecida.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la sal de pravastatina se precipita mediante la adición de una sal de amonio.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la sal de amonio se selecciona de entre el grupo constituido por NH_{4}Cl, NH_{4}Br, NH_{4}I, (NH_{4})_{2}SO_{4}, NH_{4}NO_{3}, (NH_{4})_{3}PO_{4}, (NH_{4})_{2}S_{2}O_{4}, NH_{4}OAc y NH_{4}SCN.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la sal de amonio es NH_{4}Cl.
18. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la sal de pravastatina se precipita mediante la adición de amoníaco gaseoso.
19. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la sal de pravastatina se precipita mediante la adición de amoníaco gaseoso y sal de amonio.
20. Procedimiento según la reivindicación 14, en el la sal de pravastatina se precipita mediante la adición de una sal metálica.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la sal metálica se selecciona de entre el grupo constituido por sales de litio, sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio, sales de magnesio, sales de cobre, sales de hierro, sales de níquel, sales de manganeso, sales de estaño, sales de cinc y sales de aluminio.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la sal metálica se selecciona de entre las sales que contienen los iones metálicos Li^{+}, Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+}, Mg^{2+},Cu^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+}, Ni^{2+}, Mn^{2+}, Sn^{2+}, Zn^{2+}, Al^{3+}.
23. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la sal de pravastatina se precipita mediante la adición de una sal de amina.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la sal de amina tiene un componente de amina seleccionado de entre el grupo constituido por alquilaminas C_{1}-C_{3} primarias, secundarias y terciarias.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de purificar la sal del compuesto comprende la etapa de recristalizar la sal de pravastatina.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que la recristalización de la sal de pravastatina comprende las etapas siguientes:
a)
disolver la sal de pravastatina en agua formando de esta manera una disolución acuosa de la sal de pravastatina;
b)
diluir la disolución acuosa de la sal de pravastatina con un antidisolvente; y
c)
añadir una sal que contiene el mismo ión de metal, amonio o aminio que la sal de pravastatina.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que el antidisolvente se selecciona de entre el grupo constituido por acetato de etilo, acetato de i-butilo, i-butanol, acetona, acetonitrilo y etanol.
28. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que la sal que tiene el mismo ión de metal, amonio o aminio que la sal de pravastatina es una sal de amonio.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la sal de amonio se selecciona de entre el grupo constituido por NH_{4}Cl, NH_{4}Br, NH_{4}I, (NH_{4})_{2}SO_{4}, NH_{4}NO_{3}, (NH_{4})_{3}PO_{4}, (NH_{4})_{2}S_{2}O_{4}, NH_{4}OAc y NH_{4}SCN.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en la que la sal de amonio es NH_{4}Cl.
31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la liberación de la pravastatina de la sal de pravastatina comprende las etapas siguientes:
a)
disolver la sal de pravastatina en un disolvente acuoso,
b)
añadir un ácido prótico al disolvente acuoso, y
c)
extraer la pravastatina del disolvente acuoso en un disolvente orgánico para formar un disolución orgánica de pravastatina
en el que además, la pravastatina se pone en contacto con la disolución acuosa de hidróxido sódico mediante la retroextracción de la disolución orgánica de pravastatina con la disolución acuosa de hidróxido sódico.
32. Procedimiento según la reivindicación 31, en la que la extracción de prevastatina se realiza a un pH comprendido entre aproximadamente pH 1 y aproximadamente pH 6.
33. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que el disolvente orgánico se selecciona de entre el grupo constituido por formatos de alquilo C_{2}-C_{4}, alcanoatos C_{2}-C_{4} de alquilo C_{1}-C_{4}, diclorometano, dicloroetano, cloroformo, tetracloruro de carbono y butil metil cetona.
34. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que el disolvente orgánico es acetato de i-butilo.
35. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la retroextracción de la disolución orgánica del compuesto en una disolución acuosa de hidróxido sódico se realiza a un pH comprendido entre aproximadamente pH 6,5 y aproximadamente pH 13,7.
36. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aislamiento de la sal sódica de pravastatina comprende las etapas siguientes:
a)
concentrar la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina y
b)
diluir la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina con un disolvente orgánico o una mezcla de disolvente orgánico.
37. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que la concentración de la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina se realiza mediante destilación al vacío.
38. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que la concentración de la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina se realiza mediante nanofiltración.
39. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina se diluye con acetona.
40. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina se diluye con una mezcla de disolvente orgánico seleccionada de entre el grupo constituido por mezclas de acetona/acetonitrilo, mezclas de etanol/acetonitrilo y mezclas de etanol/acetato de etilo.
41. Procedimiento según la reivindicación 36, en el que el aislamiento de la sal sódica de pravastatina se realiza a una temperatura comprendida entre aproximadamente -10º C y aproximadamente +60º C.
42. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 41, en el que el aislamiento de la sal sódica de pravastatina comprende la etapa de liofilizar la disolución acuosa de la sal sódica de pravastatina o la etapa de cristalizar la sal sódica de pravastatina de la disolución de la sal sódica de pravastatina.
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