ES2273836T3

ES2273836T3 - Cepas mutantes capaces de producir proteinas quimicamente deiversificadas por incorporacion de aminoacidos no convecionales.

Info

Publication number: ES2273836T3
Application number: ES01929739T
Authority: ES
Inventors: Philippe Marliere; Volker Doring; Henning Mootz
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: CY1105936T1; AU2001256433C1; US20040014942A1; EP1280890A1; WO2001083718A1; DE60125754D1; FR2808284A1; DK1280890T3; JP2004518404A; FR2808284B1; MXPA02010462A; AU5643301A; ATE350469T1; PT1280890E; EP1280890B1; CA2407595A1; NZ522805A; AU2001256433B2; DE60125754T2

Abstract

Una célula obtenida por un método que permite a las células adquirir la capacidad de producir una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional, cuyo método comprende las etapas siguientes: a) la transformación de dichas células mediante al menos la introducción de una mutación sin sentido al nivel de un codón de un gen, señalado como diana, que codifica una proteína necesaria para el crecimiento de dichas células, no siendo funcional dicha proteína sintetizada a partir del gen así mutado; b) llegado el caso, el cultivo de las células obtenidas en la etapa a) en un medio de cultivo que contiene una sustancia alimenticia que compensa la pérdida de funcionalidad de dicha proteína mutada de este modo; y c) el cultivo de las células obtenidas en la etapa a) ó b) en un medio de cultivo que contiene el aminoácido codificado por dicho codón señalado como diana, caracterizada porque se escoge entre las células siguientes depositadas en la CNCM (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos, Paría, Francia) a) cepa E. coli depositada en la CNCM con el Nº 1-2468, el 28 de Abril de 2000, b) cepa E. coli depositada en la CNCM con el Nº 1-2469, el 28 de Abril de 2000. y c) cepa E. coli depositada en la CNCM con el Nº I-2470, el 28 de Abril de 2000.

Description

Cepas mutantes capaces de producir proteínas químicamente diversificadas por incorporación de aminoácidos no convencionales.

La presente invención tiene por objeto células procariotas mutantes, en especial E. coli, capaces de producir proteínas cuyas secuencias de aminoácidos comprenden, al menos, un aminoácido no convencional, procedimientos de producción y purificación de dichas proteínas así como las proteínas obtenidas mediante los procedimientos según la invención. La invención comprende, igualmente, las aplicaciones de dichas células y proteínas en diferentes campos tales como el campo terapéutico, cosmético, de diagnóstico o de la biosíntesis o la biodegradación de compuestos orgánicos.

Un número creciente de proteínas producidas masivamente por organismos recombinantes son empleadas como catalizadores en la industria química o como agentes terapéuticos. La búsqueda de nuevas proteínas con funciones diversificadas es objeto de una intensa actividad, o bien teniendo seleccionando las proteínas de organismos extremófilos, o bien creando variantes proteicas por mutagénesis y selección. No obstante la variabilidad química de las proteínas que pueden ser producidas en organismos vivos queda limitada por la invariabilidad del código genético, es decir, restringida a las combinaciones de un conjunto canónico de 20 aminoácidos. Si la descendencia de las especies naturales pudiera ser remodelada progresivamente en el laboratorio, de modo que se pudieran adoptar diferentes códigos genéticos, la evolución de las proteínas podría ser redirigida y, por tanto, establecidas fuentes artificiales de biodiversidad.

La desviación experimental del código genético es la única vía que permitiría sobrepasar esta limitación. Otro código genético podría especificar un conjunto más o menos grande de aminoácidos, un conjunto sustituido por monómeros no canónicos o un conjunto de aminoácidos canónicos entre los que están redistribuidos los codones. La especificación de aminoácidos suplementarios en líneas vivientes se prestaría a múltiples aplicaciones la más genérica de las cuales sería el establecimiento de una biodiversidad artificial.

La incorporación, permanente o transitoria, de un solo aminoácido suplementario, portador de un grupo funcional químico que pudiera reaccionar sin modificar los aminoácidos convencionales, sería suficiente para instaurar nuevos métodos de funcionalización de proteínas. Éste es, justamente, el objeto de la presente invención.

Döring Volker et al., ``Reassigning Cysteine in the Genetic Code of Escherichia coli, Genetics (Octubre 1998), volumen 150, pp 543-551, describen células de E. coli obtenidas mediante un método que permite a las células adquirir la capacidad de producir una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende, al menos, un aminoácido diferentes (metionina o isoleucina) del normalmente presente según la información genética transportada por el gen correspondiente a dicha proteína o un aminoácido no convencional (O-metiltreonina o norleucina) en lugar de una cisteína.

La invención tiene por objeto una célula obtenida por un método que permite a las células adquirir la capacidad de producir una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende, al menos, un aminoácido no convencional en lugar de una valina, presente normalmente, que comprende las etapas siguientes:

a): la transformación de dichas células mediante una introducción al menos de una mutación sin sentido al nivel de un codón de un gen, señalado como diana, que codifica una proteína necesaria para el crecimiento de dichas células, sintetizada dicha proteína a partir del gen mutado de este modo que no es funcional;

b): llegado el caso, el cultivo de las células obtenidas en la etapa a) en un medio de cultivo que contiene la sustancia alimenticia exigida por la pérdida de funcionalidad de dicha proteína mutada de este modo; y

c): el cultivo de las células obtenidas en la etapa a) ó b) en un medio de cultivo que contiene el aminoácido codificado por dicho codón señalado como diana,

caracterizada porque se escoge entre las células siguientes depositadas en la CNCM (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos, París, Francia).

a): cepa E. coli depositada en la CNCM bajo el Nº I-2468 el 28 de Abril de 2000,

b): cepa E. coli depositada en la CNCM bajo el Nº I-2469 el 28 de Abril de 2000, y

c): cepa E. coli depositada en la CNCM bajo el Nº I-2470 el 28 de Abril de 2000.

Se entenderá designar en la presente memoria descriptiva mediante el término de proteína, igualmente a los péptidos o los polipéptidos, así como a las glicoproteínas correspondientes cuando dichas proteínas están glicosiladas.

Se entenderá, igualmente, designar en la presente memoria descriptiva por aminoácido no convencional todo aminoácido distinto de los aminoácidos incorporados por los ribosomas en el curso de la biosíntesis de las proteínas sintetizadas por los organismos unicelulares o pluricelulares, procariotas o eucariotas, así como cualquier aminoácido incorporado en lugar del aminoácido antes de ser incorporado normalmente en este lugar con respecto a la secuencia nucleica traducida.

Se entenderá, igualmente, designar en la presente memoria descriptiva por mutación sin sentido, una mutación que transforma un codón que representa un aminoácido en un codón que codifica otro aminoácido, no pudiendo este último, si ese es el caso, reemplazar al aminoácido de origen para dar una proteína funcional en la proteína en el lugar del resto de aminoácido de origen.

Se entenderá, igualmente, designar en la presente memoria descriptiva por proteína necesaria para el crecimiento de células, una proteína que cuando es sintetizada por las células de modo funcional permite a dichas células crecer en condiciones de cultivo dadas, y que cuando es sintetizada por las células de modo no funcional necesita la introducción de un nutriente suplementario en dicho medio de cultivo dado, para permitir crecer a dichas células. Tales proteínas no funcionales pueden ser sintetizadas, por ejemplo, por células a continuación de las mutaciones condicionales tales como una mutación de tipo fotosensible.

Con el fin de ilustrar mediante un ejemplo, pero sin limitarse a ello, se puede citar especialmente la proteína timidilato sintasa de E. coli que presenta un sitio catalítico ocupado por cisteína al nivel de la posición 146 de su secuencia de aminoácidos y cuyas mutaciones correspondientes del gen (thyA) causan una exigencia nutricional para la timina o la timidina, no pudiendo ningún otro aminoácido reemplazar a la cisteína en este sitio.

Se entenderá designar en la presente memoria descriptiva por codón diana, el codón de tres bases nucleotídicas transformado por la mutación sin sentido, siendo dicho codón diana la secuencia de 3 bases antes de la transformación por dicha mutación sin sentido.

Según una puesta en práctica de la invención, el medio de cultivo de la etapa c) no contiene el nutrimento exigido por la pérdida de funcionalidad de dicha proteína mutada.

Según la invención, la etapa c) de cultivo de dichas células puede comprender una serie de cultivos de dichas células en un medio de cultivo que contiene el aminoácido codificado por dicho codón diana (antes de su transformación por dicha mutación sin sentido), llevándose a cabo cada uno de dichos cultivos de la serie hasta obtener la fase estacionaria de crecimiento y seguida de un lavado de las células obtenidas, siendo suficiente el número de cultivos de la serie para permitir la selección de mutaciones aumentando la supresión de dicha mutación sin sentido de dicho gen mutado y la propagación del alelo correspondiente a dicho gen mutado.

Según otra puesta en práctica de la invención, la mutación sin sentido se escoge entre las mutaciones sin sentido que no revierten espontáneamente más que en una frecuencia muy pequeña, del orden de un organismo entre 10^{15} por lo menos.

De preferencia, la mutación sin sentido será escogida entre las mutaciones sin sentido que transforman un codón diana de un gen que codifica una proteína necesaria para el crecimiento de dicha célula en un codón que comparativamente con el codón diana presenta un cambio de dos bases por lo menos, y de modo más preferido, tres bases.

Igualmente, se prefiere utilizar los métodos según la invención, caracterizados porque el codón diana codifica un aminoácido de pequeño volumen estérico y/o anfífilo y/o de volumen estérico inferior o sensiblemente igual al volumen estérico del aminoácido codificado por la mutación sin sentido.

Entre los codones dianas, se prefiere, en especial, los codones dianas que codifican la cisteína y las mutaciones sin sentido escogidas entre las mutaciones sin sentido que transforman un codón diana en un codón que codifica la valina o la isoleucina.

Según otra puesta en práctica de la invención, la etapa a) de transformación de dichas células se lleva a cabo mediante un vector que comprende una secuencia de dicho gen que codifica una proteína necesaria para el crecimiento de dichas células que llevan dicha mutación sin sentido, en especial por medio de un vector plasmídico.

Tales vectores serán preparados según los métodos habitualmente utilizados por los expertos en la técnica, y los clones resultantes pueden ser introducidos en dichas células por los métodos habituales de recombinación genética tales como, por ejemplo, la lipofección, la electroporación o el choque térmico.

En otro aspecto, el método de selección de células capaz de producir una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende, por lo menos, un aminoácido no convencional, se caracteriza porque comprende las etapas a), llegado el caso, b), y c) de un método según la invención, y la selección de las células capaces de crecer en la etapa c).

De modo preferido, el método de selección de células según la invención, comprenderá, además, una etapa d) de cultivo de las células obtenidas en la etapa c) en un medio de cultivo que contiene dicho aminoácido codificado por dicho codón diana, pudiendo estar dicho aminoácido en una concentración superior a la concentración de dicho aminoácido utilizado en la etapa c), y la elección de las células sensibles a la concentración de dicho aminoácido utilizado en la etapa d).

Se entiende designar por célula sensible a un compuesto químico o bioquímico o a una concentración dada de dicho compuesto, una célula cuyo crecimiento es parcial o totalmente inhibido cuando es cultivada en un medio de cultivo que contiene dicho compuesto químico o bioquímico o dicha concentración de dicho compuesto.

La invención comprende, igualmente, un método de selección de células según la invención, caracterizado porque la aminoacil-tRNA sintetasa que reconoce el aminoácido codificado por dicha mutación sin sentido de dichas células seleccionadas, es capaz de cargar sobre uno de sus tRNA asociados, un aminoácido no convencional o un aminoácido diferente de dicho aminoácido codificado por dicha mutación sin sentido.

Se entiende designar en la presente memoria descriptiva por tRNA asociado, un tRNA que es reconocido por la aminoacil-tRNA sintetasa que reconoce un aminoácido y que puede transferir dicho aminoácido.

La invención comprende, además, un método de selección de células mutantes según la invención, caracterizado porque la secuencia nucleica del gen que codifica dicha aminoacil-tRNA sintetasa lleva, por lo menos una mutación comparada con la secuencia del gen salvaje correspondiente, no habiendo sido introducida dicha mutación por una técnica de recombinación genética.

La invención se refiere igualmente a las células procariotas o eucariotas aisladas, capaces de producir una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional, caracterizadas porque comprenden una aminoacil-tRNA sintetasa que reconoce un aminoácido dado capaz de cargar sobre uno de sus tRNA asociados un aminoácido no convencional o un aminoácido distinto de dicho aminoácido dado, y porque la secuencia nucleica del gen que codifica dicha aminoacil-tRNA sintetasa lleva al menos una mutación, comparada con la secuencia del gen salvaje correspondiente, no habiendo sido introducida dicha mutación mediante una técnica de recombinación genética.

Por tanto, la invención se refiere a un método de selección de células basado sobre la constitución por la célula de una vía metabólica necesaria para su crecimiento, permitiendo obtener células capaces de producir un acil-tRNA no canónico capaz de cargar un aminoácido no convencional.

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2467 e identificada con la referencia \beta5419, cepa inicial para efectuar las selecciones, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), que posee las características siguientes:

- deleción en el lugar thyA y reemplazo por un gen de resistencia a la eritromicina,

- deleción en el lugar nrdD y reemplazo por un gen de resistencia a la kanamicina,

- lleva un plásmido pTZ18 (col E1 replicón, bla^{+}) con el alelo Cys146GUA de la timidilato sintasa.

Las células según la invención se escogen entre las células siguientes depositadas en la CNCM (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos, París, Francia):

a): cepa E. coli depositada en el CNCM bajo el Nº I-2468 el 28 de Abril de 2000,

b): cepa E.coli depositada en la CNCM bajo el Nº I-2469 el 28 de Abril de 2000, y

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2468 e identificada con la referencia \beta5456, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), que posee las características siguientes:

- lleva un plásmido pTZ18 (col E1 replicón, bla^{+}) con el alelo Cys146GUA de la timidilato sintasa,

- lleva el alelo T222P del gen valS, cuya expresión produce una forma mutada de la valil-tRNA sintasa que carga otros aminoácidos, naturales o artificiales, sobre los tRNA/Val.

La cepa E coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2470 e identificada con la referencia \beta5520, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), y posee las características siguientes:

- integración de un gen de resistencia a la tetraciclina en el lugar cycA30::Tn10,

- lleva el alelo K277Q del gen valS, cuya expresión produce una forma mutada de la valil-tRNA sintasa que carga otros aminoácidos, naturales o artificiales, sobre los tRNA/Val.

La cepa E. coli K12, depositada bajo el Nº I-2469 e identificada con la referencia \beta5498, es un descendiente de la cepa CU505 y posee las características siguientes:

- lleva el alelo T222P del gen valS,

- cepa de genotipo leu-455 galT12 LAM-IN (rrnD-rrnE)1 DE (ilvE-ilvC) nrdD::kan valS:T222P,

- cepa deficiente en la biosíntesis de la valina y proficiente en la mesincorporación del ácido L-alfa-aminobutírico en las proteínas, por sustitución de la valina.

La invención comprende, además, la utilización de una célula según la invención para la producción de proteína, en especial recombinante, cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional.

Bajo otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): llegado el caso, la selección de una célula por un método según la invención;

b): el cultivo de dicha célula seleccionada en la etapa a) o de una célula según la invención, en un medio de cultivo y en condiciones de cultivo que permiten el crecimiento de dicha célula; y

c): el aislamiento de dicha proteína que comprende al menos un aminoácido no convencional a partir del sobrenadante del cultivo y/o del sedimento celular del fondo obtenido en la etapa b).

En un modo de realización preferido, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): el cultivo de una célula escogida entre las células siguientes depositadas en la CNCM (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos, París, Francia):

-: cepa E. coli depositada en la CNCM bajo el Nº I-2468 el 28 de Abril de 2000;

-: cepa E. coli depositada en la CNCM bajo el Nº I-2469 el 28 de Abril de 2000; y

-: cepa E. coli depositada en la CNCM bajo el Nº I-2470 el 28 de Abril de 2000;

: en un medio de cultivo y en condiciones de cultivo que permiten el crecimiento de dicha célula; y

b): el aislamiento de dicha proteína que comprende al menos un aminoácido no convencional a partir del sobrenadante del cultivo y/o del sedimento celular del fondo obtenido en la etapa b).

Entre las proteínas que pueden ser producidas por un procedimiento según la invención, se pueden citar, pero sin limitarse a ellas, las proteínas que por la incorporación de al menos un aminoácido no convencional, permiten obtener una actividad buscada, que una proteína cuya secuencia está constituida únicamente por aminoácidos convencionales no permite obtener. Se entiende por actividad, designar de modo general toda actividad tal como una actividad fisiológica o biológica relativa a los organismos mono- o pluricelulares, incluso parcial, tal como, por ejemplo, una actividad estructural o bioquímica, por ejemplo, enzimática, antigénica, de tipo anticuerpos o de modulación, regulación o inhibición de actividad biológica, o incluso tal que permite su empleo en un procedimiento de biosíntesis o de biodegradación de compuestos químicos o bioquímicos.

Igualmente se pueden citar entre las proteínas que pueden ser producidas mediante un procedimiento según la invención, las proteínas en las que la incorporación de al menos un aminoácido no convencional se efectúa de tal modo que no resulta modificación profunda de la actividad biológica de la correspondiente proteína sin modificar. Además de la actividad biológica conservada de la proteína sin modificar correspondiente, estas proteínas según la invención presentarán un aminoácido no convencional cuyas propiedades específicas podrán ser aprovechadas
ventajosamente.

Entre las propiedades específicas comunicadas por la presencia de un aminoácido no convencional, se pueden citar, en particular, las propiedades asociadas con la presencia de un grupo funcional sobre dicho aminoácido no convencional, capaz de reaccionar fácilmente y de modo específico con un compuesto químico o bioquímico, en condiciones que permiten no alterar la actividad de la proteína o que eviten la modificación de los aminoácidos convencionales.

La presencia de este grupo funcional específico podrá ser utilizada ventajosamente, por ejemplo, para:

(i) purificar cualquier proteína, en especial recombinante, que incorpore dicho aminoácido no convencional;

(ii) unir una proteína tal a un soporte sólido;

(iii) unir a una proteína tal moléculas capaces de ser detectadas, tales como sondas espectroscópicas de naturaleza variada;

(iv) unir a una proteína tal polímeros lipófilos o hidrófilos que permitan solubilizarlas en disolventes o de hacer pantalla para el reconocimiento por anticuerpos;

(v) asociar una proteína tal a un polinucleótido;

(vi) asociar una proteína tal a un compuesto químico o bioquímico cuya presencia permita aumentar, disminuir, modular, regular o seleccionar la actividad biológica de tal proteína, o modificar su biodisponibilidad como compuesto de uso terapéutico; o también

(vii) fijar de modo permanente a una proteína tal una coenzima que de otro modo difundiría en solución.

Según la presente invención, la incorporación de al menos un aminoácido no convencional podrá inducir sobre aminoácidos el ser el origen de una especificidad o de la actividad, o el origen de la conformación estructural, la carga, la hidrofobicidad o la capacidad de polimerización de la proteína sin modificar correspondiente. De este modo podrán crearse proteínas de actividad equivalente, aumentada o disminuida, o de especificidad equivalente, más pequeña o más grande que la proteína con aminoácidos convencionales sin modificar, correspondiente.

Por proteína sin modificar, se entiende designar la proteína salvaje o recombinante, constituida por aminoácidos convencionales y de la cual proviene la proteína que comprende el aminoácido no convencional.

De preferencia, el procedimiento de producción según la invención, se caracteriza porque dicho medio de cultivo de la etapa b) que permite el crecimiento de dicha célula, contiene dicho aminoácido no convencional o uno de sus precursores.

Según un modo particular, el procedimiento de producción según la invención se caracteriza porque dicho aminoácido no convencional es sintetizado por dicha célula, pudiendo aumentarse la síntesis de dicho aminoácido no convencional mediante modificación genética de dicha célula.

La invención se refiere, además, a un procedimiento de producción de una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional según la invención, caracterizado porque dicha célula es auxótrofa para el aminoácido codificado por dicho codón diana.

Están comprendidos igualmente en la presente invención, los procedimientos según la invención, caracterizados porque dicha célula comprende un gen de interés, homólogo o heterólogo, cuya secuencia codificadora lleva al menos un codón señalado como diana

De modo general, el gen de interés codifica un RNA mensajero que seguidamente será traducido en la proteína de interés.

El gen de interés puede ser aislado mediante cualquier técnica convencional tal como clonación, PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) o incluso sintetizado químicamente. Puede ser de tipo genómico (provisto de uno o más intrones) o DNA complementario (DNAc). La proteína de interés puede estar constituida por una proteína madura, un precursor y, en especial, un precursor destinado a ser secretado y que comprende un péptido señal, una proteína truncada, una proteína quimérica que proviene de la fusión de secuencias de orígenes diversos o, incluso, una proteína mutada que presenta propiedades biológicas mejoradas y/o modificadas.

De modo general, el gen de interés, homólogo o heterólogo, podrá escogerse entre los genes que codifican cualquier proteína utilizable como compuesto terapéutico o cosmético, o como reactivo de diagnóstico, o también como compuesto que puede ser utilizado en un procedimiento de biosíntesis o de biodegradación.

A modo de ejemplos, de pueden citar los genes de interés que codifican las proteínas de interés que siguen:

-: citoquinas o linfoquinas (interferones \alpha, \beta y \gamma, interleuquinas y en especial la IL-2, la IL-6, la IL-10 ó la IL-12, factores necrosantes de los tumores (TNF), factores estimulantes de colonias (GM-CSF, C-CSF, M-CSF, ...);

-: receptores celulares o nucleares, en especial los reconocidos por organismos patógenos (virus, bacterias, o parásitos) o sus ligandos;

-: proteínas implicadas en una enfermedad genética (factor VII, factor VIII, factor IX, distrofina o minidistrofina, insulina, proteína CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormonas del crecimiento (hGH);

-: enzimas (ureasa, renina, trombina,....) o todas las enzimas implicadas en el metabolismo o la biosíntesis de las proteínas, de los lípidos, de los ácidos nucleicos, de los azúcares, de los aminoácidos, de los ácidos grasos o de los nucleótidos;

-: inhibidores de enzimas (\alpha1-antitripsina, antitrombina III, inhibidores de proteasas virales, ...);

-: compuestos con efecto antitumoral, capaces de inhibir, al menos parcialmente, la iniciación o la progresión de tumores o cánceres (anticuerpos, inhibidores que actúan al nivel de loa división celular o de las señales de transducción, productos de expresión de los genes supresores de tumores, por ejemplo p53 ó Rb, proteínas que estimulan el sistema inmunitario,....);

-: proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad de las clases I ó II o proteínas reguladoras que actúan sobre la expresión de los correspondientes genes;

-: proteínas capaces de inhibir una infección viral, bacteriana o parasitaria o su desarrollo (proteínas antigénicas que poseen propiedades inmunógenas, epítopos antigénicos, anticuerpos,...);

-: toxinas tales como la ricina, la toxina colérica, diftérica,...o inmunotoxinas);

-: marcadores (\beta-galactosidasa, peroxidasa,...); y

-: luciferasa, GFP (Green Fluorescent Protein), etc.

La invención comprende, además, un procedimiento de producción de una proteína según la invención, caracterizado porque el medio de cultivo de la etapa b) comprende, además, los compuestos necesarios para la inducción de la síntesis de la proteína codificada por dicho gen de interés. Estos compuestos son conocidos por los expertos en la técnica y dependen, en particular, de la célula y del gen homólogo o heterólogo seleccionados.

La invención se refiere, igualmente, a un procedimiento según la invención, caracterizado porque la actividad biológica de la proteína codificada por dicho gen de interés, está conservada, al menos parcialmente, después de la incorporación de dicho aminoácido no convencional al nivel del codón señalado como diana, de dicho gen de interés.

La invención se refiere, además, a un procedimiento según la invención, caracterizado porque el aminoácido no convencional se escoge entre los aminoácidos no convencionales de fórmula I y de configuración L.

1

en la que:

R_{1} y R_{2} representan radicales que contienen un grupo funcional capaz de reaccionar de modo selectivo, escogido, de preferencia, entre los grupos aldehído, cetona, etenilo, etinilo o nitrilo.

Entre estos grupos, se prefiere particularmente el grupo oxo (aldehído o cetona) de reactividad selectiva, que facilita la funcionalización química de las proteínas. Otros grupos sencillos tales como el grupo etinilo se prestarían igualmente a reacciones selectivas. Un vasto cuerpo de experiencias conduce, con ayuda de sistemas de traducción acelular (ex vivo) y de acil-tRNAa sintetizados in vitro, ha demostrado que una gran variedad de grupos acilo podían ser transferidos sobre el ribosoma en respuesta a un codón leído por el tRNA. En breve, las modificaciones laterales de los aminoácidos parecen todas compatibles con la traducción (no se ha descubierto hasta la fecha aminoácido cuya cadena lateral fuera lo bastante importante para bloquear la traducción); sustituciones del grupo funcional amino en alquilamino, hidroxi e hidrazino son compatibles con la química de transpeptidación catalizada por el ribosoma (Bain et al., 1991) (es sabido que el ribosoma puede formar poliésteres además de las poliamidas convencionales); la sustitución del hidrógeno alfa del grupo H_{2}NCH(R)-COOH por un grupo alquilo (metilo) o la inversión de configuración del carbono alfa (D-aminoácidos) no son, por el contrario, aceptadas por el ribosoma.

La invención tiene por objeto, igualmente, un procedimiento según la invención, para la funcionalización de proteínas.

La invención se refiere, igualmente, a un procedimiento de purificación de proteínas, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): la incorporación en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína, de un aminoácido no convencional que contiene un grupo funcional capaz de reaccionar de modo selectivo mediante un procedimiento según la invención;

b): la puesta en contacto de la solución que contiene la proteína obtenida en la etapa a) con un soporte que comprende un compuesto capaz de reaccionar específicamente con dicho grupo funcional y fijar específicamente dicha proteína, y

c): el aislamiento de dicha proteína fijada sobre el soporte.

Los procedimientos de purificación de una proteínas, naturales o recombinantes, utilizados habitualmente por los expertos en la técnica, recurren, en general, a métodos utilizados individualmente o en combinación, tales como el fraccionamiento, los métodos cromatográficos, las técnicas de inmuno-afinidad por medio de anticuerpos mono- o policlonales específicos, etc. Estos métodos son frecuentemente largos y fatigosos y no permiten siempre obtener la actividad específica, o el grado y el rendimiento de purificación deseados. La presencia de un grupo funcional específicos sobre la proteína a purificar, capaz de reaccionar selectivamente con el soporte de purificación sin alterar la actividad de la proteína, facilita en gran medida la purificación de la proteína necesaria para su utilización.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de fijación de una proteína sobre un compuesto químico o bioquímico, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): la incorporación en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína mediante un procedimiento según la invención, de un aminoácido no convencional que contiene un grupo funcional capaz de reaccionar de modo selectivo;

b): la puesta en contacto de la proteína obtenida en la etapa a) con dicho compuesto químico o bioquímico que comprende un grupo capaz de reaccionar específicamente con dicho grupo funcional en un medio que permite la reacción.

De preferencia, la fijación de una proteína sobre un compuesto químico o bioquímico, es una fijación realizada por enlace covalente.

Los compuestos químicos o bioquímicos que pueden ser utilizados en dicho procedimiento de fijación según la invención, pueden ser escogidos entre todos los compuestos capaces de reaccionar con el grupo funcional del aminoácido no convencional incorporado.

Se entiende designar en la presente descripción por complejo proteico, el producto obtenido en la etapa b) del procedimiento descrito anteriormente en esta memoria, que comprende una proteína según la invención fijada sobre un compuesto químico o bioquímico.

La invención comprende, asimismo, un procedimiento según la invención, caracterizado porque dicho compuesto químico o bioquímico, está el mismo fijado sobre un soporte sólido o es un compuesto constitutivo de un soporte sólido.

La invención se refiere, además, a un procedimiento según la invención para la preparación de un complejo proteico.

De preferencia, la invención comprende los procedimientos de la invención, caracterizados porque dicha proteína fijada o dicho compuesto químico o bioquímico, se escoge entre los compuestos terapéuticos, cosméticos o diagnósticos.

Dicha proteína fijada será escogida, en particular, entre las proteínas cuya secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido no convencional según un procedimiento de la invención, y cuya proteína sin modificar correspondiente, salvaje o recombinante, se escoge entre las proteínas utilizables como compuestos terapéuticos, cosméticos o como reactivos de diagnóstico.

De preferencia, los procedimientos según la invención están caracterizados porque el compuesto químico o bioquímico se escoge entre los compuestos capaces de modificar la actividad biológica de la proteína fijada.

Se entiende designar por compuestos capaces de modificar la actividad biológica de otro compuesto, un compuesto capaz de aumentar, disminuir o regular la actividad biológica de dicho otro compuesto.

La invención comprende, igualmente, a un procedimiento según la invención, caracterizado porque el compuesto químico o bioquímico se escoge entre los compuestos cuya actividad biológica puede ser modificada por la proteína fijada.

La invención comprende, igualmente, un procedimiento según la invención, caracterizado porque el compuesto químico o bioquímico se escoge entre los compuestos que comprenden una proteína, un polinucleótido, un ácido graso, un azúcar o un polímero natural o sintético.

Según otro aspecto, la invención tiene por objeto las proteínas, en particular recombinantes, y los complejos proteicos obtenidos mediante un procedimiento según la invención.

Según la presente invención, las proteínas obtenidas mediante un procedimiento de producción de proteína de la invención, serán de naturaleza recombinante y sus secuencias de aminoácidos comprenderán, al menos, un aminoácido no convencional.

Según la presente invención, los complejos proteicos obtenidos mediante un procedimiento de preparación de complejos proteicos de la invención, están caracterizados, en particular, porque comprenden una proteína recombinante cuya secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido no convencional que contiene un grupo funcional, y un compuesto químico o bioquímico que comprende un grupo capaz de reaccionar con dicho grupo funcional.

La invención comprende, igualmente, un método de selección de compuestos capaces de unirse a una proteína según la invención o capaces de unirse al compuesto químico o bioquímico del complejo proteico según la invención. Entre estos métodos se puede citar como ejemplo, un método caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): La puesta en contacto de dicho compuesto susceptible de ser seleccionado, con la proteína o el complejo proteico según la invención, pudiendo dicha proteína o complejo ser fijado, en especial, sobre un soporte sólido;

b): la determinación de la capacidad de dicho compuesto para unirse con la proteína o el complejo proteico según la invención.

Los complejos susceptibles de ser seleccionados, pueden ser compuestos orgánicos tales como proteínas o hidratos de carbono o cualesquiera otros compuestos orgánicos o inorgánicos ya conocidos, o compuestos orgánicos nuevos preparados a partir de técnicas de modelización molecular y obtenidos mediante síntesis química o bioquímica, conocidas por los expertos en la técnica.

Las células según la invención, pueden igual y ventajosamente, servir de modelo y ser utilizadas en procedimientos operatorios llevados a cabo para estudiar, identificar y/o seleccionar proteínas según la invención o compuestos capaces de poseer una actividad buscada.

La invención se refiere, igualmente, a la utilización de una proteína o de un complejo proteico según la invención, como reactivo de diagnóstico así como los procedimientos de diagnóstico, en particular para la detección, identificación, localización y/o la valoración específica de polipéptido o polinucleótido, empleando una proteína o un complejo proteico según la invención.

En efecto, están comprendidas en las proteínas según la invención, proteínas que tienen incorporado por lo menos un aminoácido no convencional y que han conservado parcial o totalmente la actividad inicial de las proteínas salvajes o recombinantes sin modificar correspondientes tales como de anticuerpos, antígenos, enzimas o sus fragmentos biológicamente activos conocidos para ser utilizados en procedimientos de diagnóstico.

Del mismo modo, están comprendidos en los complejos proteicos según la invención, los complejos proteicos formados a partir de una proteína según la invención y un compuesto químico o bioquímico, tales como complejos que comprenden un anticuerpo, un antígeno o una sonda oligonucleotídica copulada a una enzima, a un sustrato o a una molécula capaz de ser detectada.

Entre los procedimientos de diagnóstico según la invención, se pueden citar, por ejemplo, los procedimientos que comprenden las etapas siguientes:

a): la puesta en contacto de la muestra biológica susceptible de contener el compuesto buscado, con una proteína o un complejo proteico según la invención, pudiendo dicha proteína o complejo proteico, ser fijado particularmente sobre un soporte sólido; y

b): la puesta de manifiesto, la identificación, la localización y/o la valoración del complejo formado entre el compuesto buscado y una proteína o un complejo proteico según la invención.

Los expertos en la técnica sabrán adaptar con las proteínas o los complejos proteicos según la invención, los procedimientos de diagnóstico estándar conocidos.

Las técnicas y los reactivos específicos que permiten la puesta de manifiesto, la identificación, la localización y/o la valoración del complejo formado que se podrá utilizar en los procedimientos de la invención, igualmente son bien conocidos por lo expertos en la técnica, y son, por ejemplo, las técnicas ELISA, RIA, inmunofluorescencia, PCR, u otras técnicas de amplificación de un ácido nucleico señalado como diana, conocidas por los expertos en la materia.

La invención se refiere, igualmente a un kit o estuche de diagnóstico, en especial para la identificación, localización y/o valoración específica de una proteína o un polinucleótido, caracterizado porque contiene una proteína o un complejo proteico según la invención.

La invención se refiere, además, a la utilización de una proteína, de un complejo proteico o de una célula según la invención, para la preparación de una composición farmacéutica o cosmética.

Finalmente, la invención tiene por objeto una composición farmacéutica o cosmética que comprende una proteína, un complejo proteico o una célula, según la invención.

Otras características y ventajas de la invención aparecen en la continuación de la descripción, con los ejemplos que figuran seguidamente.

Ejemplos

Características de cepas que se mencionan a continuación en los ejemplos.

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2025 e identificada con la referencia \beta5366, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), que posee las características siguientes;

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2026 e identificada con la referencia \beta8144, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), que posee las características siguientes:

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2027 e identificada con la referencia \beta8146, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), que posee las características siguientes:

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2339 e identificada con la referencia \beta5479, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), que posee las características siguientes:

- lleva el alelo R223H del gen valS,

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2340 e identificada con la referencia \beta5485, es un descendiente de la cepa MG1655 (wt E. coli K12), que posee las características siguientes:

- lleva el alelo cromosómico Val 276 Ala del gen valS,

La cepa E. coli K12, depositada en la CNCM bajo el Nº I-2341 e identificada con la referencia \beta5486, es un descendiente de la cepa MG 1655 (wt E. coli K12) que posee las características siguientes:

- lleva el alelo cromosómico Asp 230 Asn del gen valS,

Ejemplo 1 Construcción de una cepa de E. coli que lleva una mutación sin sentido Cys->Val en el sitio activo de la timidilato sintasa y que crea una exigencia nutricional para la timina, la timidina o la cisteína

Los alelos artificiales del gen thyA se construyen por mutagénesis dirigida del plásmido pTS0 (Lemeignan et al., 1993), que deriva del plásmido pTZ18R (BioRad) por inserción del gen thyA salvaje de E. coli. La mutagénesis dirigida por medio de un oligonucleótido se realiza según el método descrito por Kunkel et al., (1987) sobre el fagémido pTS0. La preparación de la matriz de hebra sencilla de pTS0, amplificada en la cepa RZ1032 (Kunkel et al., 1987) (Hfr KL 16 P045 [lysA(61-62)] dut1 ung1 thl1 relA1 supE44 zbd-279::Tn10) se realiza según el protocolo descrito por Sambrook et al., (1989). Un oligonucleótido fosforilado en 5' (adquirido a la sociedad Genome Express) se utiliza como cebador mutágeno:

Oligodesoxinucleótido 1 (SEQ ID NO:1):

: 5'pTGGATAAAATGGCGCTGGCACCGGTACATGCATTCTTCCAGTTCTATGT.

La hibridación de este oligonucleótido con la matriz de una sola hebra en cada una de las dos construcciones, se lleva a cabo con 10 ng de oligonucleótido y 0,2 \mul de matriz, en un volumen de 10 \mul de una solución tampón conteniendo 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM de EDTA y 50 mM de cloruro de sodio. Kis tubos se incuban 5 minutos a 70ºC y luego se enfrían progresivamente hasta 30ºC. A esta mezcla se añade entonces 0,5 mM de cada uno de los dNTP, 1 mM de ATP, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de cloruro de magnesio, 2 mM de ditiotreitol y 1 unidad de cada una de las dos enzimas del fago T4 DNA ligasa y DNA polimerasa. Esta mezcla reaccionante, de un volumen final de 20 \mul, se incuba 60 minutos a 37ºC, 5 \mul de los cuales se utilizan seguidamente para transformar células competentes de la cepa GT869 (Parsot, C. 1986) (thrB1004 pro thi strA hsdS lacZ \DeltaM15 [F' lacZ \DeltaM15 laclq traD36 proA+ proB+]) de E- coli K12 siguiendo el método descrito por Sambrook et al., (1989). Las células transformadas son extendidas en placas de Petri que contienen medio LB adicionado con 100 mg/l de carbenicilina. Doce clones resistentes al antibiótico son reaislados sobre el mismo medio. El DNA de cadena simple correspondiente a los fagémidos de estos clones, se prepara y secuencia según el método didesoxi (Sanger et al., 1977). El kit de secuenciación M13 (Boehringer Mannheim, Alemania) y la desoxiadenosina 5'-(\alpha-tio)trifosfato) 1300 Ci(mmol, Amersham), se combinan según las indicaciones de los proveedores. Se utilizan cuatro cebadores para determinar la secuencia de los alelos de thyA:

Oligodesoxinucleótido 3 (SEQ ID NO:3): 5'GGTGTGATCATGATGGTC

Oligodesoxinucleótido 4 (SEQ ID NO:4): 5'CCTGCAAGATGGATTCCC

Oligodesoxinucleótido 5 (SEQ ID NO:5):5'CGCGCCGCATTATTGTTTC

Oligodesoxinucleótido 6 (SEQ ID NO:6):5'GTCTGGACCGGTGGCGACA

El plásmido pTS1 obtenido de este modo propaga el alelo thyA:Val146, en el que la posición 146 ocupada en el gen thyA salvaje por el codón UGC de la cisteína está ocupada por el codón GUA de la valina. El plásmido pTS1 es introducido por transformación, realizada según el método de Sambrook et al., (1989), en la cepa \DeltathyA de E. coli K12, \beta1308 (Lemeignan et al., 1993) de la cual ha sido suprimido el gen cromosómico de la timidilato sintasa, thyA). La cepa transformada que lleva el alelo plasmídico thyA:Val 146, \beta5366, se muestra incapaz de crecer sin haber añadido al medio de cultivo timina o timidina, al igual que la cepa \beta1308 de la que deriva. Por el contrario, la cepa \beta5366 pone de manifiesto un crecimiento marginal a 30ºC, sobre gradiente de difusión de cisteína, realizado en placas de Petri que contienen 25 ml de medio mineral MS glucosado a partir de un pocillo central que lleva 0,1 ml de una solución de L-cisteína 400 mM. En las mismas condiciones, la cepa \beta1308 no da lugar a crecimiento alguno detectable. Así pues, la mutación sin sentido que convierte la cisteína catalítica en la posición 146 de la timidilato sintasa, en valina, puede ser suprimida parcialmente mediante aporte masivo de cisteína exógena. La adición de 0,1 mM de valina al medio de las placas de Petri, impide el crecimiento de la cepa \beta5366 sobre gradiente de cisteína. Por tanto, todo ocurre como si la cisteína pudiera infiltrarse en el sitio activo de la valil-tRNA sintetasa para formar Cys-tRNA^{val} erróneos, aptos para corregir la sustitución de la cisteína por la valina en el sitio activo de la timidilato sintasa. El exceso de valina prevendría la formación de estos Cys-tRNA^{val} erróneos.

Ejemplo 2 Construcción de una cepa de E. coli que lleva una mutación sin sentido Cys->Ile en el sitio activo de la timidilato sintasa y que crea una exigencia nutricional para la timina, la timidina o la cisteína

La construcción correspondiente se realiza, igualmente, para reemplazar a la cisteína en la posición 146 de la timidilato sintasa, por mutagénesis dirigida por medio del oligonucleótido 2, siguiendo el mismo protocolo que en el Ejemplo 1.

Oligodesoxinucleótido 2 (SEQ ID NO:2):

: 5'pTGGATAAAATGGCGCTGGCACCGATACATGCATTCTTCCAGTTCTATGT

El plásmido pTS2 obtenido de este modo propaga el alelo thyA:Ile146, en el que la posición 146 ocupada en el gen thyA salvaje por el codón UGC de la cisteína, está ocupada por el codón AUA de la isoleucina. La cepa que propaga el alelo plasmídico thyA:Ile 146, \beta5274, revela exigir el aporte nutricional de timina, timidina o cisteína en exceso, lo mismo que la cepa \beta5366. La supresión fenotípica de la cepa \beta5274 por la cisteína, es abolida por 0,1 mM de isoleucina, al igual que la de la cepa \beta5366 por la valina. Por tanto, todo ocurre como si la isoleucil-tRNA sintetasa fuera capaz de formar Cys-tRNA^{ile} erróneos en presencia de un exceso de cisteína, y que esta formación errónea hubiera sido prevenida por la presencia de un exceso de isoleucina.

Ejemplo 3 Selección de mutantes del código genético que mesincorpora la cisteína al lugar de la valina por cultivo seriado en líquido y caracterización genética de los mutantes de la valil-tRNA sintetasa obtenidos de este modo

La cepa \beta5366 que lleva el alelo sin sentido thyA:Val146 sobre el plásmido pTS1 se cultiva en medio mineral MS glucosado (2 g/l, Richaud et al., 1993) suplementado con 0,3 mM de timidina, durante 24 horas, a 30ºC, en aerobiosis. Seguidamente las células son lavadas dos veces con medio mineral MS desoxigenado. Un medio nutritivo desoxigenado que contiene 10 ml de medio mineral MS glucosado, adicionado con 1,5 mM de cisteína, se inocula al 1/100 por medio de las células lavadas. A continuación se cultivan las células en

anaerobiosis durante 24 horas, a 30ºC, y un tubo nuevo que contiene 10 ml de medio mineral MS glucosado con cisteína, desoxigenado, se inocula con una dilución al 1/100 del cultivo en fase estacionaria precedente. Este procedimiento operatorio se repite 26 veces. Al término de esta propagación seriada, son aislados 12 clones del cultivo líquido sobre placas de medio mineral MS glucosa do (2 g/l) timidina (0,3 mM) en aerobiosis y salvaguardados en suspensión en el mismo medio líquido, a –80ºC. Los doce clones se ensayan en placas que contienen medio mineral MS glucosado, adicionado con factores nutricionales. Todos estos clones ponen de manifiesto exigir la timina o la timidina como factor de crecimiento, a menos que la cisteína se encuentre presente en el medio de cultivo en una concentración 1,5 mM, por lo menos.

De tales clones se escogen para una caracterización genética en profundidad, \beta8144 y \beta8146. Experiencias de transducción por el fago P1 del carácter de resistencia a la kanamicina, introducido en el lugar nrdD inmediato al gen valS de la valil-tRNA sintetasa (97 mn del cromosoma del cromosoma de E. coli K12) son llevadas a cabo por medio de las cepas \beta8144 y \beta8146. En los dos casos, aproximadamente la mitad de los transductantes resistentes a la kanamicina manifiestan, igualmente, una dependencia nutricional para la timidina suprimible por la cisteína exógena en la concentración de 1,5 mM por lo menos. Esta proporción está de acuerdo con la distancia genética entre los genes valS y nrdD (0,4 mn) y hace suponer que el fenotipo de supresión de la mutación sin sentido Cys->Val al sitio activo de la timidilato sintasa por pequeñas concentraciones de cisteína ha sido ocasionado por la alteración genética del lugar valS.

La fijación de una alteración genética en el gen valS de las cepas adaptadas se confirma por secuenciación de este lugar: un A cambiado en C ocasiona el reemplazo de la lisina en la posición 277 por la glutamina en las cepas adaptadas \beta8144 y \beta8146. La secuenciación se lleva a cabo sobre una matriz obtenida por reacción de polimerización en cadena (PCR) realizada en las condiciones descritas por Sambrook et al., (1989). La reacción de amplificación se lleva a cabo en 100 \mul de una solución que contiene 10 ng de DNA genómico de las cepas \beta8144 ó \beta8146. 20 pmol de cada cebador, 40 nmol de una mezcla equimolar de los 4 desoxinucleótidos trifosfatos, 10 \mul de un tampón compuesto por Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 500 mM y MgCl_{2} 20 mM, en presencia de 1 a 2 unidades de Vent polimerasa (Biolabs). Para cada reacción, se efectúan 30 ciclos de polimerización, utilizando un amplificador de DNA (Perkin-Elmer Cetus), como sigue: la desnaturalización se lleva a efecto a 94ºC durante 5 minutos para el primer ciclo y 1 minuto para los ciclos siguientes, la hibridación a 58ºC durante 1 minuto y el alargamiento a 72ºC durante 3 minutos para los 29 primeros ciclos y durante 10 minutos para el último ciclo. Los oligonucleótidos 7 y 8 son utilizados para la amplificación del gen.

Oligodesoxinucleótido 7 (SEQ ID NO:7):

: 5'GGGGAATTCGGTGTGTGAAATTGCCGCAGAACG

Oligodesoxinucleótido 8 (SEQ ID NO:8):

: 5'GGCAAGCTTCCAGTATTTCACGGGGAGTTATGC

Los fragmentos de la PCR obtenidos de este modo son purificados utilizando el kit QIAquick (Qiagen) y transmitidos a la sociedad Genaxis para determinar la secuencia.

Ejemplo 4 Supresión fenotípica por precursores metabólicos de la cisteína

La exigencia nutricional de cisteína de las cepas adaptadas \beta8144 y \beta8146, se aprovecha para caracterizar precursores metabólicos que pudieran sustituir a la cisteína en el medio de cultivo sin dar lugar a la degradación por oxidación. La S-carbamil-L-cisteína (3 mM), la S-metil-L-cisteína (3 mM) y el ácido L-tiazolidina-4-carboxilato (2 mM) se revelan capaces de reemplazar a la cisteína como factor de crecimiento de las cepas adaptadas \beta8144 y \beta8146, en el lugar de la timidina o de la timina. Los mismos compuestos se revelan capaces de satisfacer la exigencia de cisteína de un mutante cysN::kan (cepa JT1, procurada por M. Berlyn, Coli Genetic Stock Center, Yale University, EE.UU. (Levh et al., 1988)). Sin embargo, la adición de ninguna de estas sustancias permite el crecimiento de la cepa \beta1308 que lleva una dilución cromosómica del gen thyA de la timidilato sintasa, excluyendo de este modo su contaminación por indicios de timina o de timidina.

Ejemplo 5 Selección de mutantes del código genético que mesincorpora la cisteína en el lugar de la valina por aislamiento sobre medio sólido y caracterización genética de mutantes de la valil-tRNA sintetasa que mesincorpora la cisteína

La cepa \beta5366 que lleva el alelo sin sentido thyA:Val146 sobre el plásmido pTS1 es transducido con un lisado del fago P1 cosechado sobre una cepa auxiliar de E. coli (\beta7170, Bouzon et al., 1997) en cuyo cromosoma había sido introducido un marcador de resistencia a la kanamicina en el lugar nrdD, inmediato al lugar valS del gen de la valil-tRNA sintetasa, produciendo así la cepa \beta5419. Un alelo mutágeno del gen dnaQ es introducido extemporáneamente por transducción de la cepa \beta5419 por medio de un lisado del fago P1 cosechado sobre una cepa auxiliar (MS2131, Shapiro, 1990) que lleva un marcador de resistencia a la tetraciclina dnaQ::miiTn10. Un clon tal resistente a la tetraciclina y que pone de manifiesto un grado de mutación espontánea, amplificado aproximadamente 1000 veces (para adquisición de la resistencia a la estreptomicina), es cultivado a 30ºC en medio mínimo de glucosado en presencia de timidina (0,3 mM). Al cabo de 24 horas, las células son recolectadas y lavadas dos veces con un volumen idéntico del medio de cultivo sin timidina. Un volumen de 0,1 ml de la suspensión que resulta, correspondiente, aproximadamente, a 10^{8} bacterias, es extendido en la superficie de una serie de placas de Petri que contienen una concentración de S-carbamil-L-cisteína que varía entre 0 y 8 mM por incremento de 1 mM adicionante del medio mineral MS glucosado (2 g/l). El mismo procedimiento operatorio se aplica en la cepa no mutatriz \beta5419, al gen dnaQ salvaje. El conjunto de las placas de Petri se incuba 96 horas a 30º. Aparecen colonias en las placas que tienen una concentración de S-carbamil-L-cisteína que sobrepasa 2 mM en el caso en que el alelo mutágeno dnaQ::miniTn10 haya sido introducido en la cepa ensayada.

Un lisado del fago P1, cosechado a partir de un clon tal, se emplea para transducir la cepa \beta5366 que lleva el alelo plasmídico thyA:Val146. Aproximadamente la mitad de los transductantes resistentes a la kanamicina se muestran capaces de crecer en presencia de 3 mM de S-carbamil-L-cisteína y en ausencia de timina o timidina, entre los cuales, la cepa \beta5455. La otra mitad de los transductantes es incapaz y exige la timina o la timidina para proliferar, tal como la cepa \beta5366. Esta proporción entre los fenotipos está en concordancia con la distancia genética entre los lugares valS y nrdD (0,4 mn) Así, la supresión de la mutación sin sentido de thyA Cys->Val por una pequeña concentración de cisteína exógena, podría resultar de una alteración del gen de la valil-tRNA sintetasa. El lugar valS de una de las cepas obtenidas por transducción de \beta5366 y capaces de crecer en presencia de 3 mM de S-carbamil-L-cisteína y en ausencia de timina o timidina, designada \beta5455, es amplificada por reacción de polimerización en cadena y secuenciada como se describe en el Ejemplo 3. Un A cambiado en C ocasiona el reemplazo de la treonina en la posición 222 por la prolina, confirmando de este modo la fijación de una alteración genética en el gen valS de la cepa \beta5455.

Ejemplo 6 Sensibilidad de los mutantes de la valil-tRNA sintetasa a aminoácidos no canónicos

Las cepas \beta5455, \beta8144 y \beta8146, son ensayadas para determinar su sensibilidad a aminoácidos artificiales que presentan una semejanza estérica con la valina. El ensayo se lleva a cabo en placas de medio mineral MS glucosado, suplementado con timidina. Las células son cultivadas en medio aerobio (mineral MS glucosado, timidina 0,3 mM) durante 24 horas a 30ºC y diluidas a 1/250 en medio mineral MS. 0,5 ml de esta suspensión celular son extendidos en placas de Petri que contienen 25 ml de medio mineral MS glucosado. A continuación se vacía un pocillo en el centro de la placa y se llena con 0,1 ml de una solución de un aminoácido:

(1): 100 mM de L-2-amino-butirato

(2): 100 mM de L-2-amino-valerato

(3): 100 mM de L-2,3-diamino-propionato

(4): 50 mM de L-3-tiol-2-amino-butirato.

Las placas se incuban seguidamente durante 24 horas, a 30ºC, y se registra la aparición eventual en las placas de una zona de inhibición en torno a los pocillos. Se miden los diámetros de las zonas de inhibición de crecimiento, atenuadas sobre las placas de Petri:

L-2-amino-butirato: 5,2 cm (\beta5455), 5,7 cm (\beta8144), 6,7 cm (\beta8146);

L-2-amino-valerato: 2,1 cm (\beta5455), 1,5 cm (\beta8144), 6,7 cm (\beta8146);

L-2,3-diamino-propionato: 2,3 cm (\beta5455), 2,7 cm \beta(8144), 1,9 cm (\beta8146);

L-3-tiol-2-amino-butirato: 2,0 cm (\beta5366), 4,6 cm (\beta5455), 4,0 cm (\beta8144), 4,0 cm (\beta8146).

El L-2-amino-butirato, el L-2-amino-valerato y el L-2,3-diamino-propionato, en las concentraciones indicadas, no tienen efecto sobre la cepa \beta5366 en el alelo valS salvaje, pero inhiben el crecimiento de las cepas que llevan un gen valS mutado. El L-3-tiol-2-amino-butirato inhibe el crecimiento de todas las cepas, pero se puede apreciar una inhibición más importante sobre las cepas mutadas. Por consiguiente, todo transcurre como si los mutantes de la valil-tRNA sintetasa tuvieran una especificidad aumentada, haciéndolos capaces de cargar los tRNA^{Val} con aminoácidos que no pueden ser incorporados por la forma salvaje de la enzima.

Ejemplo 7 Incorporación del aminoácido no canónico \alpha-aminobutirato en las proteínas de una cepa de E. coli mutada en la valil-tRNA sintetasa

Un lisado del fago P1 obtenido a partir de la cepa \beta5455 (véase el Ejemplo 5), ha sido empleado para transducir la cepa CU505 que lleva una deleción \AEilvCABD y una mutación haciéndola auxótrofa para la valina, la isoleucina y la leucina. La cepa CU505 fue obtenida del Coli Genetic Stock Center, Yale University (EE.UU.). Clones transductantes fueron seleccionados sobre placas LB kanamicina y ensayados para determinar su sensibilidad al amino-butirato (3 mM) en medio sólido MS glucosado (2 g/l) conteniendo 0,3 mM de cada uno de los tres aminoácidos valina, isoleucina y leucina. Aproximadamente 50% de los clones transductantes no pudieron crecer en estas condiciones, lo que indica la transducción conjunta del alelo valS:T222P y el marcador de resistencia nrdD::kan (véase el Ejemplo 5). Uno de los clones transductantes, designado \beta5498, fue utilizado para demostrar la incorporación de amino-butirato en reemplazo de la valina, en comparación con CU505. Las dos cepas fueron cultivadas a 30ºC en medio líquido MS glucosado (2 g/l) conteniendo el dipéptido Ile-Leu, en la concentración de 0,3 mM y el dipéptido Ile-Val en la concentración de 0,02 mM, o bien en presencia de 0,2 mM de L-amino-butirato o bien en ausencia del análogo. El inóculo correspondiente a cada cepa provenía de un precultivo en medio líquido MS glucosado (2 g/l) conteniendo el dipéptido Ile-Leu en la concentración de 0,3 mM y el dipéptido Ile-Val en la concentración de 0,04 mM. Los cultivos (50 ml) en fase estacionaria al cabo de 24 horas a 30ºC fueron cosechados por centrifugación. Para cada ensayo, el sedimento del fondo fue suspendido seguidamente en 25 ml de una solución de ácido tricloroacético de 100 g/l (TCA 10%) a 4ºC, centrifugado, resuspendido en 5 ml de TCA 10%, centrifugado de nuevo, el sedimento vuelto a suspender en TCA 5%, la suspensión incubada a 95ºC durante 30 minutos, centrifugada, el sedimento resuspendido en 5 ml de acetona, centrifugado, el sedimento resuspendido en 5 ml de acetona, centrifugado, el sedimento resuspendido en 5 ml de acetona, centrifugado, y dejado secar el sedimento. El residuo obtenido de este modo se disolvió en 1 ml de una solución de NH_{4}HCO_{3} 50 mM para ser liofilizado. El liofilizado se disolvió en 2 ml de ácido clorhídrico 6N que contenía 2 g/l de fenol, la mezcla se encerró herméticamente en una ampolla y se incubó luego a 110ºC durante 20 horas. La concentración de los aminoácidos del hidrolizado fue cuantificada luego mediante derivatización por ninhidrina siguiendo las indicaciones del suministrador del analizador Beckman 6300. El amino-butirato fue detectado en el hidrolizado de las proteínas solamente en el caso en que el amino-butirato hubiera sido añadido al medio de cultivo, y solamente para la cepa \beta5498. La proporción de amino-butirato reemplazaba una cuarta parte de la cantidad de valina, correspondiente a aproximadamente 5 restos de amino-butirato para 100 aminoácidos de las proteínas totales. Los resultados detallados de los análisis para las dos cepas CU505 y \beta5498 en las dos condiciones de cultivo, se proporcionan en la tabla que figura seguidamente.

\newpage

Composición química de las proteínas extraídas de cepas auxótrofas para la valina y cultivadas en limitación de valina, con o sin amino-butirato

2

Resultados expresados en equivalentes de Leu

Ejemplo 8 Selección de nuevos mutantes del código genético a partir de una cepa mutatriz por aislamiento sobre medio sólido

La cepa \beta5419, que expresa el alelo inactivo thyA:Val146 a partir de un plásmido y que lleva el marcador \AEnrdD::kan en el cromosoma, como se da cuenta de su construcción en el Ejemplo 5, fue transducido por medio de un lisado del fago P1 cosechado sobre la cepa TAD, llevando un marcador mutador \AEmutS::spc, que comunica resistencia a la estreptomicina, seleccionando sobre medio sólido LB que contiene espectinomicina (25 mg/ml) para obtener la cepa \beta5555. El fenotipo mutador de esta cepa ha sido demostrado enumerando la frecuencia de los mutantes resistentes a la rifamicina. Siguiendo el procedimiento experimental descrito en el Ejemplo 5, fueron obtenidos clones capaces de crecer a 30ºC en medio mineral glucosado sin timidina, en presencia de 2 a 5 mM de S-carbamoil-L.-cisteína (SCC). Tres de estos clones han servido para preparar lisados del fago P1, que fueron utilizados para transducir la cepa \beta5366, seleccionando para la resistencia a la kanamicina, siguiendo el procedimiento operatorio del Ejemplo 5. Para cada uno de los tres lisados, aproximadamente la mitad de los transductantes era capaz de crecer en medio sólido mineral glucosado conteniendo 3 mM de SCC, lo que indica la proximidad de una mutación que suprime el alelo sin sentido thyA:C146V y del marcador nrdD::kan. El lugar valS de las tres cepas \beta5479, \beta5485 y \beta5486, cada una de ellas correspondiente a un transductante supresible por SCC obtenido a partir de uno de los tres lisados, fue amplificado por PCR y secuenciado como se ha descrito en el Ejemplo 3. Una mutación puntual diferente fue encontrada para cada una de las tres cepas, a saber, Arg 223 cambiada en His en la cepa \beta5479, Val 276 cambiada en Ala en la cepa \beta5485 y Asp cambiada en Asn en la cepa \beta5486. Así pues, cada clon que presenta un fenotipo de supresión del mutante sin sentido Cys 146 Val de thyA, presenta igualmente la sensibilidad al amino-butirato. Cada uno de estos clones revela ser portador de una mutación puntual diferente en el gen valS, dando validez al cribado selectivo como medio de diversificar la actividad de la valil-tRNA sintetasa en el Escherichia coli.

Las cepas mutantes E. coli de referencias \beta5456, \beta5520 y \beta5498, han sido obtenidas a partir de la cepa mutante \beta5419, tal como se ha mencionado anteriormente en esta memoria en el Ejemplo 5, y según los procedimientos de selección tales como los aquí descritos anteriormente en los Ejemplos 5 y 8.

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<110> INSTITUT PASTEUR

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<120> CEPAS MUTANTES CAPACES DE PRODUCIR PROTEÍNAS QUÍMICAMENTE DIVERSIFICADAS POR INCORPORACIÓN DE AMINOÁCIDOS NO CONVENCIONALES

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<130> BIF 023252 PCT

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<140> PCT/FRO1/01306

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<141> 2001-04-27

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<150> FR 00 05547

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<170> PatentIn Versión 3.2

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<223> Oligonucleótido fosforilado en posición 5' derivado de la secuencia del gen que codifica la timidilato-sintasa

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<223> Oligonucleótido fosforilado derivado de la secuencia del gen que codifica la timidilato-sintasa

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<223> Oligonucleótido fosforilado en posición 5' derivado de la secuencia del gen que codifica la valil-tRNA sintetasa

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido fosforilado en posición 5' derivado de la secuencia del gen que codifica la timidilato-sintasa

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido fosforilado en posición 5' derivado de la secuencia del gen que codifica la valil-tRNA sintetasa

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Claims

1. Una célula obtenida por un método que permite a las células adquirir la capacidad de producir una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional, cuyo método comprende las etapas siguientes:

a): la transformación de dichas células mediante al menos la introducción de una mutación sin sentido al nivel de un codón de un gen, señalado como diana, que codifica una proteína necesaria para el crecimiento de dichas células, no siendo funcional dicha proteína sintetizada a partir del gen así mutado;

b): llegado el caso, el cultivo de las células obtenidas en la etapa a) en un medio de cultivo que contiene una sustancia alimenticia que compensa la pérdida de funcionalidad de dicha proteína mutada de este modo; y

caracterizada porque se escoge entre las células siguientes depositadas en la CNCM (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos, Paría, Francia)

a): cepa E. coli depositada en la CNCM con el Nº 1-2468, el 28 de Abril de 2000,

b): cepa E. coli depositada en la CNCM con el Nº 1-2469, el 28 de Abril de 2000. y

c): cepa E. coli depositada en la CNCM con el Nº I-2470, el 28 de Abril de 2000.

2. La utilización de una célula según la reivindicación 1, para la producción de una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional.

3. Un procedimiento de producción de de una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): el cultivo de una célula según la reivindicación 1, en un medio de cultivo y en condiciones de cultivo que permiten el crecimiento de dicha célula; y

b): el aislamiento de dicha proteína que comprende al menos un aminoácido no convencional, a partir del sobrenadante de cultivo y/o del sedimento celular obtenido en la etapa a).

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho medio de cultivo de la etapa a) que permite el crecimiento de dicha célula, contiene dicho aminoácido no convencional o uno de sus precursores.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho aminoácido no convencional es sintetizado por dicha célula.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la síntesis de dicho aminoácido no convencional es aumentada por modificación genética de dicha célula.

7. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque dicha célula es auxótrofa para el aminoácido codificado por dicho codón señalado como diana.

8. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque dicha célula comprende un gen de interés, homólogo o heterólogo, cuya secuencia codificante lleva al menos un codón señalado como diana.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa a) comprende los compuestos necesarios para la inducción de la síntesis de la proteína codificada por dicho gen de interés.

10. Un procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque la actividad biológica de la proteína codificada por dicho gen de interés está conservada, al menos parcialmente, después de la incorporación de dicho aminoácido no convencional al nivel del codón señalado como diana de dicho gen de interés.

11. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 10, caracterizado porque el aminoácido no convencional se escoge entre los aminoácidos no convencionales de fórmula I, de configuración L

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en la que R_{1} ó R_{2} representan radicales que contienen un grupo funcional capaz de reaccionar de modo selectivo.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el grupo funcional se escoge entre los grupos aldehído, cetona, etenilo, etinilo o nitrilo.

13. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 12, para la funcionalización de proteínas.

14. Un procedimiento de purificación de una proteína, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): la incorporación en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína de un aminoácido no convencional que contiene un grupo funcional capaz de reaccionar de modo selectivo por un procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 13;

b): la puesta en contacto de la solución que contiene la proteína obtenida en la etapa a) con un soporte que comprende un compuesto capaz de reaccionar específicamente con dicho grupo funcional y fijar específicamente dicha proteína; y

c): el aislamiento de dicha proteína fijada sobre el soporte.

15. Un procedimiento de fijación de una proteína sobre un compuesto químico o bioquímico, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a): la incorporación en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 13, de un aminoácido no convencional que contiene un grupo funcional capaz de reaccionar de modo selectivo;

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho compuesto químico o bioquímico está, el mismo, fijado sobre un soporte sólido o es un compuesto constitutivo de un soporte sólido.

17. Un procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, para la preparación de un complejo proteico.

18. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque la proteína fijada o el compuesto químico o bioquímico, se escoge entre los compuestos terapéuticos, cosméticos o diagnósticos.

19. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 16, caracterizado porque el compuesto químico o bioquímico se escoge entre los compuestos capaces de modificar la actividad biológica de la proteína fijada.

20. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque el compuesto químico o bioquímico se escoge entre los compuestos cuya actividad biológica puede ser modificada por la proteína fijada.

21. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque el compuesto químico o bioquímico se escoge entre los compuestos que comprenden una proteína, un polinucleótido, un ácido graso, un azúcar o un polímero natural o sintético.

22. Una proteína obtenida por un procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 15, caracterizada porque se trata de una proteína recombinante cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos un aminoácido no convencional escogido entre los aminoácido no convencionales de fórmula I y configuración L

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en la que:

R_{1} o R_{2} representan radicales que contienen un grupo funcional capaz de reaccionar de modo selectivo.

23. Una proteína según la reivindicación 22, caracterizada porque el grupo funcional se escoge entre los grupos aldehído, cetona, etenilo, etinilo o nitrilo.

24. Un complejo proteico obtenido por un procedimiento según una de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque comprende una proteína recombinante cuya secuencia de aminoácidos comprende un aminoácido no convencional que contiene un grupo funcional, y un compuesto químico o bioquímico que comprende un grupo capaz de reaccionar con dicho grupo funcional.

25. La utilización de una proteína según la reivindicación 22 ó 23, o de un complejo proteico según la reivindicación 24, como reactivo de diagnóstico.

26. Un procedimiento de diagnóstico, caracterizado porque emplea una proteína según la reivindicación 22 ó 23, o un complejo proteíco según la reivindicación 24.

27. Un estuche de diagnóstico, caracterizado porque contiene una proteína según la reivindicación 22 ó 23, o un complejo proteico según la reivindicación 24.

28. La urtilización de una proteína según la reivindicación 22 ó 23, de un complejo proteico según la reivindicación 24 ó de una célula según la reivindicación 1, para la preparación de una composición farmacéutica o cosmética.

29. Una composición farmacéutica o cosmética que comprende una proteína según la reivindicación 22 ó 23, un complejo proteico según la reivindicación 24, ó una célula según la reivindicación 1.