ES2273849T3 - Composiciones farmaceuticas que comprenden compuestos ciclicos peptidometicos con giro beta. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica agonista o antagonista de receptores de neurotrofinas que comprende una cantidad agonista de receptores de neurotrofinas aceptable de un compuesto cíclico peptidomimético con giro Beta que mimetiza a una neurotrofina y que tiene la fórmula (I): (Ver fórmula) o un dímero del mismo, donde R1, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan entre sustituyentes de cadena lateral hidrógeno, alquilo o arilo que se encuentran en un aminoácido natural o no natural; o R1 y R2 o R3 y R4 junto con el átomo de carbono al que están unidos pueden formar un grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo, Y es hidrógeno o uno o dos sustituyentes seleccionados entre nitro, amino, halo, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, fenilo o naftilo, estando dicho grupo alquilo, fenilo o naftilo sin sustituir o sustituido con nitro o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, o Y es un grupo modificado que contiene biotina, X es O, N, S, P, Se, C, NH o alquileno de 1 a 6 átomos de carbono, n es 0, 1, 2, 3, 4 ó 5,y ENLAZADOR es un grupo de unión eficaz para formar un dímero del compuesto por reacción con un compuesto homo difuncional, llevando dicho enlazador un grupo seleccionado entre NH2, OH, SH, COOH, CH3CO y CHO, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Description
Composiciones farmacéuticas que comprenden
compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro \beta.
Esta invención se refiere a composiciones
farmacéuticas agonistas y antagonistas de receptores de
neurotrofinas, que comprenden un compuesto cíclico peptidomimético
con giro \beta que mimetiza a una neurotrofina y que tiene la
fórmula (I) presentada a continuación, y a usos de dichas
composiciones.
La tirosina quinasa A (TrkA) es un receptor de
tipo tirosina quinasa transmembrana con alta selectividad por la
neurotrofina conocida como factor de crecimiento nervioso (NGF). Las
neurotrofinas relacionadas incluyen el factor neurotrófico derivado
de cerebro (BDNF) que se une a receptores de tipo tirosina quinasa B
(TrkB) y la Neurotrofina-3 (NT-3)
que prefiere unirse a receptores de tipo tirosina quinasa C
(TrkC).
El acoplamiento de TrkA con NGF inicia la
dimerización del receptor, la fosforilación catalítica de restos de
tirosina citoplásmicos del receptor y una cascada de sucesos de
señalización celular. Estas señales conducen a la prevención de la
muerte celular apoptótica, a la promoción de la diferenciación
celular y el alargamiento de axones y a la regulación positiva de
la acetilcolina transferasa (ChAT). Esto mismo se aplica a otras
neurotrofinas, con la excepción de que las diferentes poblaciones
celulares responden selectivamente basándose en sus patrones de
expresión de receptores. El NGF se usará como prueba para determinar
la actividad biológica, pero las nociones se aplicarán a todas las
neurotrofinas (NTF).
Varios tipos de células neuronales que están
implicados en importantes estados de enfermedad expresan TrkA y,
por lo tanto, responden a NGF, incluyendo neuronas sensoriales,
simpáticas y colinérgicas. Se ha sugerido que la terapia con NGF
puede retrasar el inicio de la enfermedad de Alzheimer, prevenir la
pérdida funcional asociada con un ictus cerebral y mejorar las
neuropatías diabéticas periféricas. Otras aplicaciones propuestas
para el NGF incluyen el tratamiento de lesiones neuronales y la
dirección a tumores derivados del neuroectodermo. Como revisión de
enfermedades diana véase (Saragovi y Burgess, 1999).
A pesar del potencial terapéutico del NGF, los
ensayos clínicos que se centran en esta proteína han sido
decepcionantes (Saragovi y Burgess, 1999). Hay varias razones para
esto: los inconvenientes intrínsecos asociados con el uso de
polipéptidos aplicados como fármacos, inestabilidad in vivo y
efectos pleiotrópicos debidos a la activación de señales que no se
dirigieron intencionadamente. Además, la producción de la proteína
NGF para aplicaciones medicinales es relativamente cara.
Los agonistas de los receptores TrkA, TrkB, TrkC
y p75 tendrían utilidad en el tratamiento y prevención de
trastornos mediados por receptores de tipo tirosina quinasa, por
ejemplo, neurodegeneración crónica o aguda, dolor, cáncer, ataques
cerebrales, neuromas, enfermedades del nervio ocular, tales como
glaucoma, y enfermedad de Alzheimer.
Las estrategias que dan como resultado agonistas
de receptores de tipo tirosina quinasa no están bien establecidas.
Previamente, se han intentado estrategias de mimetismo de ligandos y
mimetismo de anticuerpos para generar análogos peptídicos de dos
agonistas dirigidos al dominio extracelular de TrkA: el ligando
natural NGF (LeSauteur et al, 1995) y el anticuerpo
monoclonal (mAb) 5C3 (LeSauteur et al., 1996). La unión de
TrkA está mediada por regiones con giro \beta discretas de estos
ligandos. Sólo ciertos análogos con giro \beta cíclicos eran
activos (Beglova et al., 1998) y otros confórmeros o péptidos
lineales eran inactivos.
Esta invención pretende proporcionar una
composición farmacéutica agonista o antagonista de receptores de
neurotrofinas.
La invención también pretende proporcionar su
uso en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir
trastornos de tejidos en los que participan receptores de
neurotrofinas.
Además, esta invención pretende proporcionar el
uso de compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro \beta para
uso en la evaluación de requisitos estructurales de agonistas y
antagonistas de receptores de neurotrofinas.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona una composición farmacéutica agonista o antagonista de
receptores de neurotrofinas que comprende una cantidad agonista o
antagonista de receptores de neurotrofinas aceptable de un
compuesto cíclico peptidomimético con giro \beta que mimetiza a
las neurotrofinas y que tiene la fórmula (I), como se define más
adelante, en asociación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporciona el uso de un compuesto cíclico peptidomimético con giro
\beta que mimetiza a una neurotrofina y que tiene la fórmula (I)
como se define más adelante, en la fabricación de un medicamento
para tratar o prevenir un trastorno mediado por receptores de
neurotrofina.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporciona el uso de compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro
\beta de fórmula (I) para evaluar los requisitos estructurales de
compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro \beta que mimetizan
a las neurotrofinas. Los compuestos de fórmula (I) son
o un dímero de los mismos, donde
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se seleccionan
entre sustituyentes de cadena lateral hidrógeno, alquilo o arilo
que se encuentran en un aminoácido natural o no natural;
o
R^{1} y R^{2} o R^{3} y R^{4} junto con
el átomo de carbono al que están unidos pueden formar un grupo
ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo,
Y es hidrógeno o uno o dos sustituyentes
seleccionados entre nitro, amino, halo, alquilo de 1 a 6 átomos de
carbono, fenilo o naftilo, estando dicho grupo alquilo, fenilo o
naftilo sin sustituir o sustituido con nitro o alquilo de 1 a 6
átomos de carbono, o Y es un grupo modificado que contiene
biotina,
X es O, N, S, P, Se, C, NH, SO, SO_{2} o
alquileno de 1 a 6 átomos de carbono,
n es 0, 1, 2, 3, 4 ó 5, y
ENLAZADOR es un grupo de unión eficaz para
formar un dímero del compuesto por reacción con un compuesto homo
difuncional, llevando dicho enlazador un grupo seleccionado entre
NH_{2}, OH, SH, COOH, CH_{3}CO y CHO, Zhicheng Wang et
al. (1999) y Yangbo Feng et al. (1999) en asociación con
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de fórmula (I) incluyen el
material denominado D3 y sus derivados.
Algunos de estos derivados pueden ser
modificaciones sencillas y evidentes tales como formas biotiniladas
y moléculas en las que dos de estas unidades están unidas por
dímeros. Otros derivados obvios de D3 incluyen los siguientes. Las
cadenas laterales R^{1}-R^{6} podrían incluir
cualquier sustituyente alquilo o arilo encontrado en aminoácidos
naturales y no naturales.
Las cadenas laterales típicas de los aminoácidos
de las proteínas (por ejemplo, Arg, Trp, His) tienen un interés
particular y en la presente invención se han preparado muchos
compuestos de esta serie, pero la diversidad de estructuras que
generan fácilmente derivados de D3 incluyen muchos tipos de grupos
funcionales. Los aminoácidos constituyentes pueden ser derivados
N-alquilo, N-arilo o
\alpha,\alpha-dialquilo y derivados cíclicos,
tales como los que podrían formarse a partir de aminoácidos de
ciclopropano.
El sustituyente o los sustituyentes Y es
hidrógeno o uno o dos sustituyentes elegidos entre nitro, amino,
halo, alquilo C_{1-6}, preferiblemente de 1 a 4
átomos de carbono, fenilo o naftilo. Los sustituyentes alquilo,
fenilo y naftilo Y pueden estar sin sustituir o sustituidos con
nitro o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono.
Y también puede modificarse con un grupo
funcional que contiene biotina. El grupo X es O, N, S, P, Se, C, NH
o alquileno C_{1-6}. El punto de conexión podría
ser orto o meta con respecto al carbonilo del
benzoílo. Los valores de "n" son 0, 1, 2, 3, 4 y 5. La cadena
lateral de unión que incorpora X puede ser alifática como se indica
en la estructura (I), aromática o heteroaromática.
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y
R^{6} se seleccionan entre sustituyentes de cadena lateral
hidrógeno, alquilo o arilo encontrados en un aminoácido natural o no
natural; o
R^{1} y R^{2} o R^{3} y R^{4} junto con
el átomo de carbono al que están unidos pueden formar un grupo
ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo.
Hay mucha libertad de variación en R^{5} y
R^{6} pero, con mucho, el sustituyente más común en estas
posiciones es hidrógeno. Los sustituyentes también podrían
diseñarse para corresponder a una de las cadenas laterales de los
veinte aminoácidos de las proteínas, principalmente metilo.
Más especialmente, los compuestos (I) son
compuestos preparados a partir de los veinte aminoácidos de las
proteínas o análogos sencillos de éstos, incluyendo sus
enantiómeros, N-alquil-aminoácidos,
N-aril-aminoácidos,
\alpha,\alpha-dialquil-aminoácidos
y aminoácidos cíclicos. Se considera que se obtienen particularmente
actividades biológicas cuando R^{1} y R^{3} son cadenas
laterales de lisina, ácido glutámico, tirosina, isoleucina,
asparagina y treonina, y R^{2}, R^{4}, R^{5}, y R^{6} son
hidrógeno. Una o más de las cadenas laterales se seleccionan
especialmente para que correspondan a cadenas laterales dentro de
regiones de giro de las proteínas neurotrofinas a las que mimetiza
el compuesto cíclico, por ejemplo, NGF, NT-3, NT
4/5 y/o BDNF.
En general, los compuestos macrocíclicos tienen
anillos de 13 a 16 miembros donde el sustituyente X es O, N, S, SO
o SO_{2}. Los fragmentos moleculares Z e Y típicamente son anillos
aromáticos basados en un sistema de anillo sencillo,
particularmente bencenos sustituidos. En esta posición, son
permisibles bencenos sustituidos con nitro, amino, cloro, bromo y
flúor.
En general, se han preparado varios cientos de
compuestos que se ajustan a la estructura indicada anteriormente.
Más adelante se indican algunos ejemplos específicos de compuestos
(I) y que se han ensayado en ensayos de actividades relacionadas
con neurotrofinas.
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Son ejemplos de realizaciones que mimetizan la
actividad neurotrófica los agentes denominados D3, P27,
D53b-d, 25, P56, P57, P58, P39, D21, D46, D40 y
P23. Son ejemplos de realizaciones que antagonizan la actividad
neurotrófica P42 y P43. Estos agentes se muestran a
continuación:
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En la presente invención se han desarrollado
composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas pequeñas,
proteolíticamente estables, con actividad neurotrófica, selectivas
para células que expresan receptores de neurotrofinas (receptores
de tipo tirosina quinasa Trk y receptores p75).
Basándose en los farmacóforos del mAb 5C3 y de
análogos peptídicos de NGF descritos previamente, se ha sintetizado
una biblioteca centrada de compuestos peptidomiméticos con giro
\beta.
La biblioteca de compuestos se compone de
compuestos cíclicos peptidomiméticos con giro \beta. Estos
compuestos, en particular, mimetizan a las neurotrofinas, y por lo
tanto son agonistas o antagonistas de los receptores de
neurotrofinas, o pueden emplearse en la selección y/o evaluación de
los requisitos estructurales necesarios de estos agonistas y
antagonistas.
En general, los compuestos cíclicos tienen un
anillo macrocíclico de 13 a 17, más especialmente 14, 15 ó 16
átomos de anillo; y el anillo está formado predominantemente por una
cadena principal de carbono y nitrógeno que tiene cadenas laterales
de aminoácidos que pueden ser naturales o sintéticas.
El anillo puede caracterizarse por una o más
cadenas laterales en el enlace peptídico, especialmente en las
posiciones i, i+1, i+2 e i+3. El compuesto cíclico típicamente tiene
1, 2 ó 3 cadenas laterales.
Dichas una o más cadenas laterales corresponden
más especialmente a cadenas laterales dentro de giros \beta de
una proteína neurotrofina a la que mimetiza el compuesto cíclico, y
en particular los giros \beta corresponden a los giros \beta de
una neurotrofina tal como NGF, NT-3, NT 4/5 y
BDNF.
Los compuestos cíclicos peptidomiméticos con
giro \beta de la invención, en realizaciones particulares, pueden
representarse por la fórmula (I), como se ha definido anteriormente
en este documento.
En la fórmula (I), el anillo macrocíclico que
contiene de R_{1} a R_{6} convenientemente tiene de 13 a 17 y
preferiblemente, 14, 15 ó 16 átomos de anillo.
En realizaciones preferidas, X es O, S o NH y
R1, R3, R5 y R6 son átomos de hidrógeno. Cuando Y es un
sustituyente, pueden funcionar como un marcador o precursor de un
marcador, pudiendo emplearse dicho marcador en la evaluación de la
unión directa, la distribución in vivo y la capacidad
agonista o antagonista del compuesto cíclico.
El grupo ENLAZADOR funciona como un grupo de
unión eficaz para formar dímeros del compuesto (I) por reacción con
un compuesto homobifuncional tal como polietilenglicol, llevando el
ENLAZADOR un grupo elegido entre NH_{2}, OH, SH, COOH, CH_{3}CO
y CHO.
A continuación se indican compuestos
representativos de fórmula (I) que se han producido como parte de la
biblioteca mencionada anteriormente.
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Los compuestos cíclicos de la invención pueden
prepararse de acuerdo con el procedimiento descrito por Feng et
al en J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 10768-1076.
El tipo general de reacción se ilustra a continuación
Esta reacción es una macrociclación de S_{N}Ar
en fase sólida en la que los aminoácidos secuencialmente forman
enlaces peptídicos del anillo macrocíclico. Si es necesario, pueden
protegerse las cadenas laterales del enlace peptídico, por ejemplo,
como ésteres t-butílicos o
BOC-amidas.
El sustituyente Y en la fórmula (I) puede ser,
por ejemplo, NO_{2}, el cual puede reducirse fácilmente a amino
que puede emplearse para crear un marcador de biotina; otros
marcadores que podrían unirse al sustituyente Y incluyen elementos
radiactivos tales como yodo y tecnecio.
La invención se ilustra en lo sucesivo haciendo
referencia al compuesto EKHse-G-OH
denominado en lo sucesivo por conveniencia D3 y su derivado de
biotina denominado en lo sucesivo D3-biotina, y al
compuesto EKCys denominado en lo sucesivo por conveniencia C59 y
que es un análogo de D3, indicándose las estructuras a
continuación
Las propiedades agonistas o antagonistas de los
receptores de neurotrofinas se utilizan de la forma más eficaz en
el tratamiento de trastornos mediados por receptores de
neurotrofinas cuando el compuesto cíclico se formula en nuevas
composiciones farmacéuticas con un vehículo farmacéuticamente
aceptable de acuerdo con técnicas convencionales de preparación de
composiciones farmacéuticas.
Las nuevas composiciones contienen al menos una
cantidad agonista o antagonista de un receptor terapéutico de
neurotrofina del compuesto cíclico activo. Generalmente, la
composición contiene hasta 0,1-100 mg/kg de peso
corporal del paciente del compuesto cíclico. Las composiciones
concentradas adecuadas para la dilución antes del uso pueden
contener 90% en peso o más. Las composiciones incluyen composiciones
adecuadas para administración oral, rectal, tópica, parenteral
(incluyendo subcutánea, intramuscular e intravenosa), pulmonar
(inhalación nasal o bucal), administración nasal o insuflación. Las
composiciones pueden pre-envasarse mezclando
íntimamente el compuesto cíclico con los componentes adecuados para
el medio deseado.
Cuando se va a emplear la administración oral,
puede ser con una composición líquida. En el caso de las
preparaciones líquidas, el agente terapéutico se formula con
vehículos líquidos tales como agua, glicoles, aceites, alcoholes y
similares, y en el caso de preparaciones sólidas tales como cápsulas
y comprimidos, con vehículos sólidos tales como almidones,
azúcares, caolín, etilcelulosa, carbonato cálcico y sódico, fosfato
cálcico, caolín, talco o lactosa, generalmente con lubricantes
tales como estearato cálcico, junto con aglutinantes, agentes
disgregantes y similares. Debido a su facilidad de administración,
los comprimidos y las cápsulas representan la forma de dosificación
oral más ventajosa. Es especialmente ventajoso formular las
composiciones en forma de dosificación unitaria (como se define más
adelante) para facilitar la administración y para permitir la
uniformidad de la dosificación. La composición en forma de
dosificación unitaria constituye un aspecto de la presente
invención.
El compuesto cíclico también puede formularse en
composiciones terapéuticas para inyección intravenosa o
intraperitoneal y puede presentarse en una forma de dosificación
unitaria en ampollas o en recipientes multidosis, si es necesario
con un conservante añadido. Las composiciones también pueden tomar
formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en
vehículos oleosos o acuosos tales como cloruro sódico o dextrosa en
agua, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes
de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Pueden añadirse
agentes tamponantes así como aditivos tales como solución salina o
glucosa para hacer que las soluciones sean isotónicas. El compuesto
cíclico también puede solubilizarse en alcohol/propilenglicol o
polietilenglicol para una administración intravenosa por goteo.
Como alternativa, los ingredientes activos pueden estar en forma de
polvo para reconstituirse con un vehículo adecuado antes de la
administración.
La expresión "forma de dosificación
unitaria" en este documento se refiere a unidades físicamente
discretas, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de
ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado en asociación con el vehículo farmacéutico. Son ejemplos de
estas formas de dosificación unitarias comprimidos, cápsulas,
píldoras, paquetes de polvo, obleas, unidades medidas en ampollas o
en recipientes multidosis y similares. Una dosificación unitaria de
la presente invención generalmente contendrá de 100 a 200 mg de uno
de los compuestos cíclicos.
Para administración por inhalación, los
compuestos cíclicos de la presente invención convenientemente se
suministran en forma de una presentación de pulverización de
aerosol desde envases presurizados o nebulizadores. Los compuestos
cíclicos también pueden administrarse como polvos que pueden
formularse y la composición de polvo puede inhalarse con la ayuda
de un dispositivo inhalador de polvo de insuflación. El sistema de
administración preferido para inhalación es un aerosol de
inhalación de dosis medidas (MDI) que puede formularse como una
suspensión o solución del compuesto cíclico en propulsores
adecuados, tales como fluorocarburos o hidrocarburos.
Otro método de administración es insuflación,
particularmente si la infección se ha extendido a los oídos y a
otras cavidades corporales.
Si la aplicación va a ser tópica, el compuesto
cíclico puede formularse en cremas y pomadas convencionales tales
como vaselina blanca, lanolina anhidra, alcohol cetílico, crema
fría, monoestearato de glicerilo, agua de rosas y similares.
La Fig. 1 demuestra que D3 induce la
diferenciación parcial de cultivos de DRG embrionarios; cuando se
aplica solo; y muestra una potenciación sinérgica del efecto de
concentraciones subóptimas de NGF.
La Fig. 2 demuestra que D3 potencia los
homodímeros TrkA\cdotTrkA de la superficie celular;
la Fig. 3 ilustra NGF con regiones de giro
destacadas que se consideran críticas para la unión al receptor
TrkA (en el dímero están presentes dos átomos de cinc, pero se
omiten para proporcionar claridad); y
la Fig. 4 ilustra la estructura del heterodímero
NG-3/BDNF con las regiones de giro correspondientes
de NT-3 destacadas.
En la Fig. 1 se trataron cultivos de DRG
neuronales primarios como se indica durante 8 días y se estudió la
diferenciación celular morfométricamente. 60 aumentos. Gráficos
representativos de 3 experimentos independientes.
En la Fig. 2, se expusieron células
4-3.6 a ligandos de TrkA según la Tabla 5 (calles
1-4) o sin ligando (calles 5 y 6), y formaron
entrecruzamientos químicos (calles 1-5) o no
formaron entrecruzamientos (calle 6). Los lisados celulares se
sometieron a transferencia de western con antisuero
anti-TrkA 203. La intensidad de la banda M_{r}
300 kDa se analizó densitométricamente a partir de 4 experimentos
estandarizados a NGF 1 nM.
El compuesto D3 es un agonista pequeño,
selectivo y proteolíticamente estable del receptor TrkA. Además, se
ha evaluado el sitio de acoplamiento de D3 sobre TrkA y demuestra
que un pequeño ligando peptidomimético puede agonizar un receptor
de tipo tirosina quinasa de neurotrofina que normalmente se une a un
ligando proteico relativamente grande. Los compuestos de la
invención de esta manera ofrecen una estrategia terapéutica
alternativa con agentes farmacológicos que se dirigen
selectivamente a poblaciones neuronales que expresan receptores de
neurotrofinas específicos en la superficie celular.
El compuesto D3 se preparó de acuerdo con
métodos indicados previamente para compuestos relacionados (Feng
et al., 1998). Se acoplaron FMOC-Gly,
FMOC-Hse(Trt),
FMOC-Lys(BOC),
FMOC-GJu(OtBu), y después cloruro de
2-fluoro-5-nitrobenzoílo
(activación con
di-iso-propilcarbodiimida,
piperidina al 20% en DMF para retirar los grupos FMOC) a resina
TentaGel S PHB a 0,18 mmol/g de carga. El péptido en el soporte se
trató seis veces con TFA al 1%/HSiiPr_{3} al 4% en
CH_{2}Cl_{2} durante 5 min para retirar sólo la protección de
Trt. Se realizó una ciclación por tratamiento con 5,0 equivalentes
de K_{2}CO_{3} en DMF durante 40 h. Después de la escisión con
90% de TFA/5% de H_{2}O/5% de HSiiPr_{3}, el producto final se
purificó por HPLC de fase inversa. D3 y sus derivados fueron
solubles en agua a 5 mg/ml (la máxima concentración ensayada).
Se preparó D3-biotina de la
misma manera que D3, con la excepción de que después de la
ciclación, el grupo nitro se redujo por tratamiento con 10
equivalentes de SnCl_{2}\cdot2H_{2}O en DMF durante 20 h.
Después de la reducción, se acopló FMOC-Gly, y
después biotina-N-hidroxisuccinimida
a la arilamina recién formada. El producto después se escindió de
la resina. El producto final se purificó por HPLC de fase
inversa.
Líneas celulares: los neuroblastomas de
rata B104 expresan receptores p75 pero no expresan ninguna de las
Trk (TrkA- p75+). Las células 4-3.6 son células B104
transfectadas de forma estable con ADNc de TrkA humano, y expresan
niveles iguales de p75 y TrkA (TrkA+ p75+). Para seleccionar agentes
que activen o antagonicen los receptores TrkC, se transfectaron de
forma estable fibroblastos NIH3T3 con ADNc de TrkC humano. Estas
células responden al ligando NT-3. Para la selección
de los agentes que activan o antagonizan los receptores TrkA, se
transfectaron de forma estable fibroblastos NIH3T3 con ADNc de TrkA
humano. Estas células responden al ligando NGF. Como controles se
usaron fibroblastos NIH3T3 de tipo silvestre porque no responden a
ningún ligando de neuro-
trofina.
trofina.
Se generó el dominio IgG-C2 de
TrkA humana usando sitios de restricción únicos en los cebadores
para permitir el intercambio con el correspondiente dominio de TrkB
de rata. Los receptores quiméricos se construyeron por subclonación
del dominio IgG-C2 de TrkA humana en los sitios de
restricción correspondientes del ADNc de TrkB de rata indicados en
un trabajo previo (Perez et al., 1995). Las construcciones
quiméricas se confirmaron por secuenciación y se clonaron en el
vector de expresión pCDNA3 que contiene un gen de selección que
proporciona resistencia a neomicina (G41S, GIBCO). Se transfectaron
células HEK293 usando el método de lipofectamina plus (GIBCO), se
seleccionaron con neomicina (0,5 mg/ml) y se obtuvieron al menos 3
subclones independientes por técnicas de dilución limitante
(quimera 293-TrkB/A-IgC2). El
análisis de transferencia de Western con el anticuerpo policlonal
203 dirigido al dominio intracelular de Trk y el análisis FACScan de
la superficie celular con anticuerpo policlonal dirigido al dominio
extracelular de TrkA indicaron que todos los subclones estables
expresan niveles comparables de receptores quiméricos.
Se establecieron cultivos primarios de DRG de
rata fetal a partir de embriones de 17 días de ratas Sprague
Dawley. Todos los ganglios se diseccionaron y disociaron primero
enzimáticamente con tripsina y después mecánicamente. Las células
disociadas se pusieron (10^{5} células/pocillo) en placas de 96
pocillos pre-recubiertas con colágeno y se
cultivaron durante un total de 8 días en Medio Basal Neuro que
contenía suplemento de N2 (GIBCO, Toronto), antibióticos y
L-glutamina. Estos cultivos de DRG expresan TrkA en
\sim85% y son muy dependientes de las señales de TrkA para la
supervivencia.
Se establecieron cultivos celulares a partir del
área septal de embriones de rata de 17 días. En resumen, el tejido
se incubó en PBS que contenía tripsina y DNasa. Después, se
disociaron mecánicamente piezas de tejido. Después de la
centrifugación, el sedimento se suspendió en medio
L-15 de Leibovitz. Las células se cultivaron en
placas NUNC de 96 multipocillos (10^{5} células/pocillo)
recubiertas con poli-D-lisina (5
\mug/ml). Se trataron cultivos puros de neuronas septales un día
después de su puesta en las placas. Los fármacos, preparados en
medio, se añadieron directamente a las células sin cambiar el medio
inicial. La incubación se continuó durante 8 días, después de lo
cual se evaluó la actividad de ChAT.
Estudios de unión directa: se realizaron
como se ha descrito (Saragovi et al., 1998) usando 6
ng/pocillo de proteína del dominio extracelular de TrkA de
baculovirus recombinante (TrkA-ECD) o albúmina de
suero bovino de control (BSA, Fracción V, Boehringer Mannheim)
inmovilizada en placas de microensayo de 96 pocillos. Los pocillos
se bloquearon con tampón de unión (BB: PBS con BSA al 1%) durante 1
hora. Después, se añadieron 50 ng/pocillo de D3 biotinilado como
reactivo primario en BB durante 40 minutos en ausencia o en
presencia de un exceso de D3 no biotinilado como competidor. Los
pocillos se lavaron 5 veces con BB y se añadió avidina acoplada a
peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma) como reactivo secundario
durante 30 minutos. Las placas se lavaron en BB y la actividad
peroxidasa se determinó colorimétricamente usando
2,2-azinobis (ácido
3-etilbenzotiazolinasulfónico) (ABTS, Sigma). La
densidad óptica (DO) se midió a 414 nm en un Lector de Microplacas
(Bio-Rad). Los ensayos se repitieron al menos tres
veces, n = 4.
Ensayos de unión FACScan: se
inmunotiñeron células 4-3.6 (2 x 10^{5}) en tampón
de unión FACScan (PBS, BSA al 0,5% y NaN3 al 0,1%) como se ha
descrito (Saragovi et al., 1998). Se añadieron a las células
durante 1 hora a 4ºC mAb anti-TrkA 5C3 saturante o
mAb anti-p75 MC192 o IgG de control que no mostraba
unión, en presencia o ausencia de D3 como competidor. Se retiró el
exceso de anticuerpo primario por lavado y las células se
inmunotiñeron con anticuerpo secundario de cabra
anti-IgG de ratón marcado con fluoresceína. Las
células se adquirieron en un FACScan y se analizó la fluorescencia
de canal medio de los histogramas con forma de campana usando el
programa
LYSIS II.
LYSIS II.
Competición de Unión: los estudios fueron
como se ha descrito para los ensayos de unión directa a
TrkA-ECD, con la excepción de que como reactivo
primario se añadieron 50 ng del mAb anti-TrkA
5C3/pocillo en BB, en presencia o ausencia de D3 o controles como
competidores como se ha descrito (Saragovi et al., 1998). Los
pocillos se lavaron 5 veces con BB y se añadió anticuerpo de cabra
anti-ratón acoplado con HRP como reactivo
secundario durante 30 min. Las placas se lavaron en BB y se
determinó la actividad peroxidasa. Los ensayos se repitieron al
menos tres veces, n = 4.
Cultivos de DRG primarios: Después de un
total de 8 días de cultivo con los ligandos de ensayo o de control
indicados, se estudió la supervivencia celular usando el ensayo
colorimétrico de bromuro de
3(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) y por observación microscópica.
Líneas celulares: se sembraron 5.000
células/pocillo en medio sin proteína (PFHM-Il,
GIBCO, Toronto) que contenía albúmina de suero bovino al 0,2% (BSA)
(Fracción cristalina V, Sigma, St. Louis, MO) en placas de 96
pocillos (Falcon, Mississauga, Ontario). Los cultivos se dejaron
sin tratar o se trataron con los ligandos de ensayo o de control
indicados. La viabilidad celular se cuantificó usando el ensayo MTT
después de 56-72 horas de cultivo. El porcentaje de
protección se estandarizó a partir de las lecturas de densidad
óptica (DO) con respecto a la concentración óptima de NGF (1 nM) =
100%. Se restó la DO de las células sin tratar. La mayor densidad
óptica de los cultivos primarios no tratados probablemente se debe a
la heterogeneidad celular y a la producción endógena de cantidades
limitantes de factores de crecimiento.
En el día 8 de cultivo, el medio se aspiró y se
añadió tampón de lisis enfriado con hielo (fosfato sódico 10 mM, pH
7,4/TritonX-100 al 0,1% - Marca comercial). Los
ensayos de actividad ChAT se realizaron directamente en los
pocillos usando el método de Fonnum (Fonnum, 1975).
Se trataron células 4-3.6 vivas
suspendidas en PBS con el ligando o los ligandos indicados durante
40 min a 4ºC para permitir la unión. Las células después se lavaron
en PBS, se entrecruzaron con el agente de entrecruzamiento
impermeable a la membrana suberato de disuccinimidilo (DSS, Pierce;
DSS 1 mM, 15 minutos a 15ºC). El DSS que no había reaccionado se
inactivó con acetato amónico 5 mM. Después, las células se lisaron
directamente en tampón de muestra SDS (lisado de células enteras) o
se lisaron en un detergente no iónico NP-40 y se
inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-TrK o
anti-p75 como se ha descrito (LeSauteur et
al., 1996). Se obtuvieron resultados similares con los dos
métodos. Para el análisis de transferencia de western, se
resolvieron cantidades iguales de proteína o equivalentes celulares
para cada muestra en un gradiente de SDS-PAGE de
5-10%, se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa (Xymotech Biosystems, Montreal, Qc) y se sometieron a
transferencia con el anticuerpo policlonal anti-Trk
203 que reconoce el dominio intracelular de Trk. Las manchas de
transferencia se visualizaron usando el sistema de
quimioluminiscencia mejorada (ECL) (New England Nuclear, Boston,
MA).
Se desarrolló una síntesis en fase sólida para
producir un anillo macrocíclico con los restos i+1 e i+2 de un giro
\beta en la conformación apropiada. Se prepararon aproximadamente
60 compuestos de este tipo (Feng et al., 1998) con cadenas
laterales de aminoácidos incorporadas para que correspondieran a los
giros \beta de NGF y mAb 5C3 implicados en la conexión con TrkA
(LeSauteur et al., 1996; LeSauteur et al., 1995). La
unión a TrkA está mediada por regiones de giro \beta discretas en
estos ligandos. Los análogos peptídicos cíclicos con giro \beta
de NGF y del mAb 5C3 sólo eran activos en la conformación apropiada
(Beglova et al., 1998).
Como control negativo se usó C59 que se
consideraba inactivo. Se sintetizó una forma biotinilada de D3,
D3-biotina, para realizar estudios de unión directa
a TrkA. Todos los ligandos eran muy solubles en tampones
fisiológicos y no requerían disolventes orgánicos.
Se usó análisis FACScan que se basaba en el
agente fluorescente secundario avidina-FITC para
detectar la unión de D3-biotina a la superficie
celular (Tabla 1). Las células 4-3.6 (p75+TrkA+)
tenían una fluorescencia aproximadamente 4 veces mayor para
D3-biotina que para un
péptido-biotina de control de fondo. Además, un
exceso molar de 10 veces de D3 anulaba la unión de
D3-biotina. Por el contrario, no se midió ninguna
unión específica para células B140 (p75+TrkA-). Como las células
4-3.6 son células B104 transfectadas de forma
estable con ADNc de TrkA y estas líneas celulares por lo
demás son idénticas, los datos indican que
D3-biotina y D3 se unen a TrkA de la superficie
celular.
Se obtuvieron datos de unión similares para
D3-biotina por ELISA usando el dominio extracelular
de TrkA soluble pura (TrkA-ECD) producida en
baculovirus (véase la Tabla 3). Estos datos indican además que D3 se
une al dominio extracelular de TrkA y que no se requieren lípidos
de membrana.
Previamente, se demostró que el mAb 5C3 actuaba
como agonista completo de TrkA. El mAb 5C3 se une con una K_{d} 2
nM (LeSauteur et al., 1996) en un epítopo dentro del dominio
IgC2 de TrkA cerca del sitio de unión de NGF. Se postula que este
sitio define un "punto caliente" del receptor. Se ensayaron D3
y el mAb 5C3 para determinar si se unían a sitios receptores
solapantes.
Dos ensayos relacionados ensayaron la capacidad
de D3 de competir por la unión del agonista completo de TrkA mAb
5C3. En el primer ensayo, un ensayo basado en FACScan que usaba
células intactas, D3 indujo una reducción competitiva dependiente
de la dosis de las interacciones mAb 5C3\cdotTrkA (Tabla 2, filas
2-5). En general, D3 presentó una CI_{50} de 4
\muM. A partir de las condiciones experimentales se estima una
K_{d} \sim2 \muM para las interacciones D3\cdotTrkA. El
bloqueo de las interacciones 5C3\cdotTrkA por D3 es selectivo
porque la unión del mAb MC192 dirigida a la subunidad del receptor
de NGF p75 no se bloqueaba (Tabla 2, filas 7 frente a 8). Además,
el peptidomimético C59 de control inactivo no inhibía la unión del
mAb 5C3 (Tabla 2, fila 6) o mAb MC192.
El segundo ensayo usó el dominio extracelular de
TrkA recombinante purificada (TrkA-ECD) inmovilizada
en placas ELISA para ensayar el bloqueo competitivo de
5C3\cdotTrkA-ECD por D3. D3 presentó una
inhibición dependiente de la dosis de interacciones
5C3\cdotTrkA-ECD, pero el peptidomimético C59
inactivo de control no tuvo ningún efecto (Tabla 3). Como se midió
una K_{d} \sim2 nM para las interacciones 5C3\cdotTrkA, a
partir de la CI_{50} experimental se calculó una K_{d} \sim2
\muM para las interacciones D3\cdotTrkA-ECD.
Este cálculo es coherente con los datos mostrados en la Tabla 2. De
manera interesante, los ensayos ELISA y los ensayos de unión RIA
similares revelaron que D3 no bloqueaba sustancialmente las
interacciones NGF\cdotTrkA-ECD.
Como D3 se une en o cerca de un sitio agonista
de TrkA, se probaron los efectos tróficos en ensayos de
supervivencia celular usando el método MTT cuantitativo. Se
ensayaron varias dosis de D3. Sin embargo, por claridad sólo se
muestran las concentraciones próximas a la óptima, que se aproximan
a la K_{d} estimada.
Los cultivos neuronales primarios disociados de
ganglios de la raíz dorsal (DRG) fetal dependen de agonistas de
TrkA para la supervivencia. El NGF exógeno mostró un efecto trófico
dependiente de la dosis (Tabla 4, filas 2-4). D3
solo tuvo un efecto protector significativo sobre cultivos de DRG
(Tabla 5, fila 5), pero el C59 de control no tuvo este efecto
(Tabla 4, fila 6). Los cultivos primarios son heterogéneos y
endógenamente se obtienen bajos niveles de neurotrofinas, lo cual
explica una densidad óptica relativamente elevada para los cultivos
no tratados (Tabla 4, fila 1).
Como D3 no bloquea la unión de NGF, se evaluó la
posible sinergia entre NGF y D3. D3 combinado con diferentes
concentraciones de NGF exógeno demostró un efecto aditivo o
potenciador sobre la supervivencia de DRG (Tabla 4, filas
7-9).
Se obtuvieron resultados similares con otras
líneas de células neuronales, donde D3 potenciaba el efecto de las
bajas concentraciones de NGF (Tabla 5). La protección óptima de las
células 4-3.6 (p75+TrkA+) y las quimeras
HEK293-TrkB/A-IgC2 correspondía al
tratamiento con NGF 1 nM (Tabla 5, fila 2) mientras que NGF 10 pM
proporcionó una protección significativamente menor (Tabla 5, fila
3). D3 solo produjo una protección baja pero significativa (Tabla
5, fila 4), y la protección aumentó con una combinación de NGF 10 pM
+ D3 10 \muM (Tabla 5, fila 6). El compuesto C59 de control
negativo no tuvo ningún efecto solo o en la potenciación de NGF 10
pM (Tabla 5, filas 5 y 7).
En otros controles, ni D3 ni NGF protegieron a
las células B104, a las células HEK293 de tipo silvestre o a las
células HEK293 que expresaban TrkB de la apoptosis. Por lo tanto, la
actividad trófica de NGF y D3 requiere la expresión de TrkA o al
menos el dominio IgG-C2 de TrkA. Además, D3 no
aumentaba el efecto trófico de EGF, lo que sugería que podía ser
selectivo con respecto a NGF. Por último, D3 aumentaba la protección
por NGF de células NIH3T3 transfectadas de forma estable con ADNc
de TrkA, pero no aumentaba la protección por NT-3
de células NIH3T3 transfectadas de forma estable con ADNc de TrkC.
Estos datos indican que D3 acentúa selectivamente el efecto trófico
de NGF y que no se requiere la expresión del receptor de NGF de baja
afinidad p75.
Se evaluó la estabilidad proteolítica de D3
frente a tripsina y papaína. En primer lugar, D3 se expuso a
tratamiento enzimático como se ha descrito previamente (Saragovi
et al., 1992), seguido de la medición de su actividad
biológica en células 4-3.6. El compuesto D3
permaneció totalmente activo en ensayos tróficos incluso después de
1 hora de exposición a tripsina o pepsina, mientras que NGF perdió
toda su actividad en minutos en las mismas condiciones.
El efecto de D3 sobre la diferenciación celular
mediada por TrkA se evaluó usando dos ensayos independientes: el
análisis morfométrico de neuronas disociadas de DRG y la inducción
de la actividad ChAT den cultivos de neuronas septales. En el
primero de estos ensayos, los datos indican que los cultivos
neuronales de DRG experimentan crecimiento de neuritas en respuesta
a D3, y que D3 potencia el efecto de NGF (Figura 1). En el segundo
ensayo, se descubrió que la actividad ChAT aumentaba en respuesta a
NGF (Tabla 6, filas 1 y 2) y a D3 solo (Tabla 6, filas
3-5), mientras que el control de C59 no tenía ningún
efecto (Tabla 6, fila 6). Los aumentos en la actividad ChAT en
respuesta a D3 2 \muM solo fueron comparables a NGF 10 pM exógeno.
Además, las combinaciones de D3 2 \muM + NGF 10 pM aumentaron
notablemente la actividad ChAT, y fueron más eficaces que NGF 400 pM
(Tabla 6, filas 8-10).
Basándose en los datos anteriores, era de
esperar que D3 indujera o estabilizara las interacciones
TrkA\cdotTrkA. Esta hipótesis se estudió bioquímicamente en
células 4-3.6 expuestas a ligandos, seguido de
entrecruzamiento químico en la superficie celular (Figura 2).
Se observó el doblete esperado coherente con los
monómeros de TrkA indicados previamente de p110 y p140 en todas las
muestras (Figura 2, flecha gruesa). Se vieron bandas de \sim300
kDa, coherentes con el peso molecular de homodímeros de
TrkA\cdotTrkA (Figura 2, flecha fina) en muestras de células
tratadas con ligandos de TrkA NGF 1 nM, NGF 10 pM o NGF 10 pM + D3
10 \muM, y también se detectaron (aunque mucho más débilmente) en
células tratadas con D3 10 \muM solo. La intensidad de la banda
de M_{r} 300 kDa, que se suponía que eran dímeros de TrkA, se
analizó densitométricamente a partir de 4 experimentos
independientes estandarizados a NGF 1 nM (100%). Hubo un aumento
coherente en los dímeros después del tratamiento con D3 solo (21
\pm 4%) o NGF 10 pM solo (52 \pm 6%), que fue mayor después del
tratamiento con NGF 10 pM + D3 10 \muM (77 \pm 7%). Las células
de control formaron entrecruzamientos en ausencia de ligando o las
células expuestas a ligando pero sin entrecruzamiento no tenían
supuestos dímeros.
Los homodímeros de TrkA son estables a la
desnaturalización con SDS debido al entrecruzamiento covalente.
Dado que la eficacia del entrecruzamiento químico es
\sim1-4% de las reservas totales de TrkA, se
excluyó la caracterización bioquímica adicional de los complejos
aparte del hecho de que contienen TrkA. Los complejos pueden
contener NGF entrecruzado. Sin embargo, es poco probable que las
bandan comprendan p75 porque las inmunoprecipitaciones con
anticuerpos anti-p75 no revelaron ningún material en
el M_{r} de homodímeros de TrkA. Además, no se vio
sistemáticamente material de M_{r} 215 kDa que comprendiera
heterodímeros de p75-TrkA.
Son ejemplos de algunas realizaciones preferidas
que mimetizan la actividad neurotrófica de tipo NGF (Tabla 7) los
agentes denominados D3, D53b-d, D21, P23 y P58.
Estos agentes, ensayados a 10 \muM, producen supervivencia
significativa en células que expresan TrkA, pero no en células que
no expresan receptores de neurotrofina. Además, estos agentes
muestran un efecto sinérgico con concentraciones subóptimas de NGF
(10 pM). NGF a 10 pM produce una supervivencia de 32 \pm 6% en
comparación con NGF 1 nM que, en las células TrkA se estandariza a
una supervivencia de 100%. NGF a 10 pM más las realizaciones
indicadas aumenta significativamente la supervivencia celular.
Son ejemplos de algunas realizaciones preferidas
que mimetizan la actividad neurotrófica de tipo NT-3
(Tabla 8) los agentes denominados P27 y P23. Estos agentes,
ensayados a 10 \muM, producen una supervivencia significativa de
células que expresan TrkC, pero no de células que no expresan
receptores de neurotrofinas. Además, estos agentes muestran un
efecto sinérgico con concentraciones subóptimas de
NT-3 (10 pM). NT-3 a 10 pM produce
una supervivencia de 29 \pm 1% en comparación con
NT-3 1 nM que, en las células TrkC se estandariza a
una supervivencia de 100%. NT-3 a 10 pM más las
realizaciones indicadas aumenta significativamente la supervivencia
celular. Debe tenerse en cuenta que P23 aumenta la supervivencia de
células que expresan TrkA y TrkC, por lo tanto se comporta como
NT-3 que es un ligando de los dos receptores.
Son ejemplos de algunas realizaciones preferidas
que antagonizan la actividad neurotrófica de NGF (Tabla 9) los
agentes denominados P42 y P43. Aunque estas realizaciones solas no
afectan a la supervivencia celular (Tabla 9, filas 4 y 5), reducen
la supervivencia producida por NGF (Tabla 9, filas
6-9). NGF a 1 nM (Tabla 9, fila 2) produce una
supervivencia de 100% y este efecto se reduce por P42 y P43
respectivamente a una supervivencia de 68% y 55%. Por lo tanto,
estas realizaciones son antagonistas para la actividad neurotrófica
de NGF.
Una pequeña molécula peptidomimética con giro
\beta proteolíticamente estable agonista del receptor de
neurotrofina TrkA. Se demostró que D3 se une a TrkA, compite por la
unión del agonista de TrkA mAb 5C3, potencia selectivamente la
protección trófica de líneas celulares que expresan TrkA y cultivos
primarios neuronales e induce la diferenciación de cultivos
neuronales primarios. Estos resultados indican que un pequeño
peptidomimético con giro \beta puede activar un receptor de
neurotrofina de tipo tirosina quinasa que normalmente se une a un
ligando proteico relativamente grande.
Se han obtenido avances recientes en el
mimetismo de ligandos como resultado de la selección de grandes
bibliotecas de fagos o péptidos, productos naturales o bibliotecas
químicas. Sin embargo, la mayoría de los ligandos descritos son
antagonistas o requieren de otra manera la dimerización de péptidos
relativamente grandes, tienen un eje doble de simetría que hace que
se parezcan a un dímero o son poco solubles en tampones
fisiológicos. Por el contrario, D3 es un peptidomimético pequeño,
no simétrico, proteolíticamente estable y muy soluble en agua que
se une al dominio extracelular de TrkA.
Los estudios de unión y competición de ligandos
demuestran la interacción selectiva de D3 con el dominio
extracelular de TrkA, en lugar de con el dominio catalítico. Por lo
tanto, la solubilidad en agua y la dirección extracelular de D3
significan que no se requieren disolventes orgánicos tóxicos para
atravesar la membrana celular.
Dadas las bajas concentraciones usadas en
sinergia con D3, es poco probable que el efecto de NGF esté mediado
por acoplamiento con el receptor de baja afinidad p75. Se postula
que NGF actúa aumentando las interacciones TrkA\cdotTrkA mientras
que D3 estabiliza los homodímeros o reduce el porcentaje de
separación de homodímeros de receptores induciendo cambios
conformacionales.
En la presente invención, los datos biológicos
mostrados son con bajas concentraciones \muM de D3, que son
óptimas. Como es de esperar por la afinidad estimada para las
interacciones TrkA\cdotD3, las concentraciones de D3 menores
producen menos eficacia. Debe destacarse que aunque la afinidad de
NGF\cdotTrkA es \sim10^{-11} M, la actividad óptima requiere
concentraciones de NGF 2 nM. Por lo tanto, D3 es óptimo a
concentraciones que se aproximan a su K_{d} mientras que NGF es
óptimo a concentraciones \sim100 veces mayores que su K_{d}. Se
interpreta que esta diferencia significa que D3 es más estable en
solución, y esta noción se confirma por la resistencia de D3 a la
proteolisis.
D3 bloquea competitivamente la unión del mAb 5C3
pero no bloquea a NGF. Además, la actividad agonista óptima del mAb
5C3 se inhibía por D3 de una manera dependiente de la dosis,
mientras que aumentaba el efecto antagonista de NGF. Es poco
probable que D3 no bloquee NGF debido a las diferencias de afinidad,
porque las interacciones NGF\cdotTrkA-ECD y
5C3\cdotTrkA-ECD están en el intervalo nM.
Dos factores pueden ser responsables de este
resultado. En primer lugar, tanto el mAb 5C3 como D3 se acoplan
sobre un epítopo único y continuo dentro del dominio
IgG-C2 de TrkA, mientras que NGF se une a un epítopo
discontinuo dentro de los dominios IgG-C1 e
IgG-C2 de TrkA (Perez et al., 1995) y otros
dominios. Esto facilitaría el bloqueo del mAb 5C3 por D3 mientras
que NGF puede unirse a través de su segundo sitio de acoplamiento.
En segundo lugar, el mAb 5C3 y NGF se unen a TrkA en sitios
parcialmente solapantes pero no idénticos (LeSauteur et al.,
1996). Por lo tanto, los datos sugieren que D3 se une a TrkA en un
epítopo solapante al "punto caliente" del agonista mAb 5C3 del
dominio IgG-C2 de TrkA, cerca del sitio de
acoplamiento de NGF. Estas observaciones pueden explicar la
sinergia de D3 con NGF y el bloqueo del mAb 5C3. El sitio de
acoplamiento se denomina "punto caliente" porque define un
sitio funcional donde los ligandos que se unen al sitio pueden
activar una función. Esta función puede ser agonista (parcial) o
antagonista (parcial).
El hecho de que D3 sea bioactivo y se
seleccionara a partir de un grupo relativamente pequeño de
compuestos basados en giro \beta tiene amplias implicaciones para
muchas iniciativas de investigación que implican interacciones
proteína-proteína. Particularmente, estas nociones
pueden aplicarse a todos los miembros de la familia de ligandos de
neurotrofina y sus receptores porque funcionan de una manera
comparable a TrkA.NGF.
La presente invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden un peptidomimético de molécula pequeña
que se une y activa a TrkA. En la presente invención, se descubre
que un híbrido de un péptido y una molécula orgánica pequeña
diseñada para albergar restos aminoacídicos clave en una
conformación de giro dentro de una región flanqueante pequeña
ofrece un medio para transformar un péptido en una molécula orgánica
pequeña activa. Por lo tanto, D3 representa la validación del
concepto de peptidomimético para la familia Trk de receptores de
tipo tirosina quinasa. Este ligando peptidomimético de molécula
pequeña de TrkA que tiene actividad neurotrófica puede usarse para
tratar trastornos neurodegenerativos, dolor, neoplasias y otras
patologías (revisado en Saragovi y Burgess, 1999) en los que
intervienen receptores Trk.
La unión de biotina-D3 a células
B 104 (p75+ TrkA-) o células 4-3.6 (p75+ TrkA+) se
cuantificó por análisis FACScan. Los ligandos son
control-biotina (un péptido biotinilado inactivo)
(fila 2), D3-biotina (fila 3) o
D3-biotina con un exceso molar de 10 veces de D3
(fila 4). Todos los ligandos se siguieron con
avidina-FITC como marcador fluorescente. Los datos
mostrados son fluorescencia de canal medio (MCF) de histogramas con
forma de campana, 5.000 sucesos adquiridos. Se promedian los datos
de MCF \pm sem de 3 experimentos independientes.
Se analizaron células 4-3.6 por
FACScan para comprobar la unión del mAb anti-TrkA
5C3 o el mAb anti-p75 MC192. Las células expuestas
a IgG de ratón primario de control con o sin D3 40 \muM producen
una tinción de fondo idéntica. Para cada condición, se adquirieron
5.000 células. El porcentaje de uniones máximas se calculó a partir
de la MCF de histogramas con forma de campana, usando la fórmula
(ENSAYO_{MCF}-fondo_{MCF})*100/(MÁXIMO_{MCF}-fondo_{MCF}).
Se promedian los valores de MCF \pm sem de 3 experimentos
independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la unión del mAb 5C3 (a 2 nM constante)
a TrkA-ECD purificado inmovilizado en placas ELISA
en ausencia o presencia de competidores. El fondo (<2%) fue la
densidad óptica de los pocillos con todos los reactivos excepto
Trk-ECD inmovilizado. Se promedian los datos de 3
experimentos, cada experimento n = 4.
\newpage
Se trataron cultivos neuronales primarios
dependientes de NGF de DRG de embrión de rata con los ligandos
indicados durante un total de 8 días. La supervivencia celular se
midió por ensayos MTT. Se calculó la protección con respecto a la
concentración óptima de NGF (1 nM, protección 100%) restando la D.O.
de las células no tratadas. Se muestra la D.O. de un experimento,
media \pm sem, n = 4. Se promedió el porcentaje de protección de 3
experimentos.
Se trataron células 4-3.6 o
células HEK 293 que expresaban el receptor quimérico TrkB/TrkA
IgG-C2 con los ligandos indicados durante un total
de 72 horas. La supervivencia se midió por ensayos MTT. El
porcentaje se protección se calculó como en la Tabla 4. Se muestra
la D.O. de un experimento, media \pm sem, n = 4. Se promedió el
porcentaje de protección de 6 (células 4-3.6) o 3
(quimera 293-IgG-C2) experimentos
independientes.
Se trataron cultivos neuronales septales como se
indica durante un total de 8 días. Se midió la actividad ChAT (pmol
Ach/min/pocillo \pm sem) en el día 8. Media \pm sem. Se
promedian los datos de 3 experimentos independientes, cada
experimento n = 4.
Se trataron fibroblastos NIH3T3 transfectados y
que expresaban receptores TrkA o TrkC, o controles de tipo
silvestre no transfectados (NIH wt) con los ligandos indicados
durante un total de 72 horas. Las células que expresan TrkA
responden óptimamente a NGF. Las células que expresan TrkC responden
óptimamente a NT-3. Se realizaron ensayos con
agentes solos o en presencia de concentraciones subóptimas de NGF
(10 pM). La supervivencia se midió por ensayos MTT. El porcentaje
de protección se calculó como en la Tabla 4. Se muestra la D.O. de
un experimento, media \pm sem, n = 4. Cada experimento se repitió
3 veces o más.
Se trataron fibroblastos NIH3T3 transfectados y
que expresaban receptores TrkA o TrkC, o controles de tipo
silvestre no transfectados (NIH wt), con los ligandos indicados
durante un total de 72 horas. Las células que expresan TrkA
responden óptimamente a NGF y en un menor grado a
NT-3. Las células que expresan TrkC responden
óptimamente a NT-3. Los ensayos se realizaron con
agentes solos o en presencia de concentraciones subóptimas de
NT-3 (10 pM). La supervivencia se midió por ensayos
MTT. El porcentaje de protección se calculó como en la Tabla 4. Se
muestra la D.O. de un experimento, media ± sem, n = 4. Cada
experimento se repitió 3 veces o más.
Se trataron fibroblastos NIH3T3 transfectados y
que expresaban TrkA con los ligandos indicados durante un total de
72 horas. Las células que expresan TrkA responden óptimamente a NGF
1 nM y subóptimamente a NGF 10 nM. La supervivencia se midió por
ensayos MTT. El porcentaje de protección se calculó como en la Tabla
4. Se muestra la D.O. de un experimento, media \pm sem, n = 4.
Cada experimento se repitió 3 veces o más. Nd: no realizado.
La naturaleza molecular de las interacciones
NT-3/TrkC es importante por las siguientes razones.
Muchas interacciones proteína-proteína se producen
por medio del contacto en algunas regiones clave, "puntos
calientes", en lugar de interacciones generalizadas a lo largo
de la superficie de la proteína entera. Éstas generalmente implican
10-30 cadenas laterales de contacto en porciones
discontinuas de cada secuencia primaria. Sin embargo, se requiere
una fracción relativamente pequeña de estas cadenas laterales para
una unión fuerte en las superficie de contacto. Las pequeñas
moléculas que interaccionan con los puntos calientes pueden
interferir con las interacciones normales
proteína-proteína haciendo viable el concepto de
mimetismo de hormonas.
Ciertos resultados previos proporcionan pruebas
de que las regiones de giro de la neurotrofina NGF son puntos
calientes para la interacción NGF/TrkA (LeSauteur et al,
1995). NGF es una proteína de 22 kDa que existe y funciona como un
dímero. Está muy conservada entre especies. El NT-3
maduro comparte 50 aminoácidos idénticos con NGF, principalmente
centrados en regiones que promueven la estructura terciaria común
(por ejemplo, los seis restos de Cys del nudo de cisteína están
conservados). La región de la superficie de contacto del dímero
está compuesta de cadenas \beta que mantienen la conformación y
disposición de motivos estructurales; estos restos nucleares
hidrófobos están muy conservados entre todas las neurotrofinas. Por
el contrario, las regiones de giro son muy variables y parecen
determinar la especificidad de unión al receptor.
Las fuertes similitudes estructurales entre NGF
y NT-3 (en el heterodímero BDNF) indican que las
regiones de giro de NT-3 destacadas en la Fig. 4
son importantes en el acoplamiento de NT-3 con TrkC.
Además, miméticos de las regiones de giro de NT-3
también pueden unirse a TrkA y p75 (como lo hace
NT-3).
A continuación se proporcionan los datos de
estudios de proteínas quiméricas. Una quimera de
NT-3 que expresa los restos 1-66 y
115-122 de NGF (numeración de acuerdo con NGF) gana
la función de tipo NGF, con una retención completa de la actividad
de NT-3. Estos descubrimientos implican que las
secuencias que confieren propiedades de tipo NT-3
están contenidas dentro de la región que corresponde a los restos
67-114 de NGF. Otra quimera de NT-3
estudiada contenía las secuencias de NGF en el extremo N y en la
región 3 del bucle \beta (aproximadamente restos
91-98). Este recombinante tenía una función NGF
mejorada y una actividad de NT-3 disminuida con
respecto al NT-3 de tipo silvestre. Estos datos
implican que se puede atribuir una contribución importante a la
unión y actividad de NT-3 al bucle \beta 3. Esto
es coherente con los estudios de la primera quimera porque el bucle
\beta 3 está dentro de la región que corresponde a los restos
67-114 que se descubrió que contenían regiones
clave para la unión. Otro estudio de proteínas quiméricas
NT-3/NGF descubrió que el bucle \beta 3 era una
región crítica para determinar especificidad, y que los restos
proximales Arg y Tyr pueden mejorar la unión.
Ciertos experimentos de mutagénesis revelan
restos dispersos de NT-3 que contribuyen a la unión.
De esta manera, se observa alguna pérdida de afinidad y pérdida de
actividad de NT-3/TrkC tras la sustitución de seis
restos de NT-3 por los restos correspondientes en
NGF (S73D, F86Y, K88R, F101W, A107S y V111A). Estos aminoácidos son
discontinuos en la secuencia primaria, pero están próximos al bucle
\beta 3 en la neurotrofina dimérica plegada. Próximo al bucle
\beta 3 de NT-3 hay una arginina que está
conservada entre NGF y NT-3, pero parece jugar un
papel diferente en cada neurotrofina. Se observó una pérdida
significativa de bioactividad de NT-3 en un mutante
NT-3 R103A; sin embargo, no se observó ninguna
pérdida de actividad de NGF en un mutante NGF R103A. Esto indica
diferencias en la forma en la que estas neurotrofinas se unen a sus
receptores. Además, adyacente a R103 hay una fenilalanina (F104) en
NGF y un triptófano (W104) en NT-3. Estos restos
hidrófobos están expuestos al disolvente y su sustitución también
reduce la bioactividad, lo que sugiere un papel en la unión o en la
estabilización de una conformación
activa.
activa.
Parece ser que el extremo N de las neurotrofinas
puede jugar un papel importante en la unión a sus receptores. Esta
región es una diana más difícil de mimetizar porque el extremo N de
NT-3 (y de NGF) está "desestructurado" en
solución y en estado sólido. La creación de modelos indica que el
extremo N se compone de dos subdominios que comprenden los restos
1-8 y los restos 9-11. Los restos
1-8 son flexibles, pero los restos
9-11 son rígidos y mantienen una interacción
electrostática entre E(11) y E(118). Por consiguiente,
un plegamiento largo localiza los restos 1-8 cerca
del bucle 2/bucle 3.
Las interacciones NGF/p75 y
NT-3/p75 están mediadas al menos parcialmente por el
bucle \beta 1 de la neurotrofina que se caracteriza por
aminoácidos cargados positivamente. También pueden implicar
aminoácidos R114 y K115. En general, estos restos son discontinuos
con la secuencia primaria del bucle 1, pero en la estructura
tridimensional quedan próximos al mismo.
Basándose en los datos anteriores, es apropiado
incorporar específicamente uno o más de los restos encontrados en
las neurotrofinas en posiciones 1-11;
29-34; 42-48; y
91-98. Éstas serán las dianas primarias para el
descubrimiento principal.
\newpage
La Tabla 10 proporciona alineaciones de
secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
- BDNF, Factor Neurotrófico Derivado de Cerebro
- FMOC, fluoreniloxicarbonilo
- BOC, terc-butoxicarbonilo
- MCF, fluorescencia de canal medio
- ChAT, Acetil Colina Transferasa
- MTT, Bromuro de 3(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolio
- DMF, dimetilformamida
- NGF, factor de crecimiento nervioso
- DRG: ganglios de la raíz dorsal
- NT-3, neurotrofina-3
- ELISA: ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima
- {}\hskip1.2cm RIA: radioinmunoensayo
- FACScan, Explorador de Células Activadas por Fluorescencia
- {}\hskip1.2cm TFA, ácido trifluoroacético
- FITC, isotiocianato de fluoresceína
- Trt, tritilo.
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Claims (17)
1. Una composición farmacéutica agonista
o antagonista de receptores de neurotrofinas que comprende una
cantidad agonista de receptores de neurotrofinas aceptable de un
compuesto cíclico peptidomimético con giro \beta que mimetiza a
una neurotrofina y que tiene la fórmula (I):
o un dímero del
mismo,
donde R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4},
R^{5} y R^{6} se seleccionan entre sustituyentes de cadena
lateral hidrógeno, alquilo o arilo que se encuentran en un
aminoácido natural o no natural; o
R^{1} y R^{2} o R^{3} y R^{4} junto con
el átomo de carbono al que están unidos pueden formar un grupo
ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo,
Y es hidrógeno o uno o dos sustituyentes
seleccionados entre nitro, amino, halo, alquilo de 1 a 6 átomos de
carbono, fenilo o naftilo, estando dicho grupo alquilo, fenilo o
naftilo sin sustituir o sustituido con nitro o alquilo de 1 a 6
átomos de carbono, o Y es un grupo modificado que contiene
biotina,
X es O, N, S, P, Se, C, NH o alquileno de 1 a 6
átomos de carbono,
n es 0, 1, 2, 3, 4 ó 5, y
ENLAZADOR es un grupo de unión eficaz para
formar un dímero del compuesto por reacción con un compuesto homo
difuncional, llevando dicho enlazador un grupo seleccionado entre
NH_{2}, OH, SH, COOH, CH_{3}CO y CHO, en asociación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde dicho compuesto tiene un anillo macrocíclico
de 13 a 17 átomos de anillo.
3. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, donde dicho compuesto tiene una o más cadenas
laterales en dicho anillo macrocíclico, extendiéndose dichas una o
más cadenas laterales desde los átomos de anillo de la cadena
principal.
4. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 3, donde dichas una o más cadenas laterales
corresponden a restos encontrados dentro de los giros \beta de
una neurotrofina.
5. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 4, donde dicha neurotrofina es el factor de
crecimiento nervioso (NGF), neurotrofina-3
(NT-3), neurotrofina-4/5 (NT4/5) o
factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF).
6. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 4, donde dicha neurotrofina se une a un receptor.
7. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 6, donde dicho receptor de neurotrofina es TrkA,
TrkB, TrkC o p75.
8. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde R^{1} y R^{3} se seleccionan entre
cadenas laterales de lisina, ácido glutámico, tirosina,
iso-leucina, asparagina y treonina, y R^{2},
R^{4}, R^{5} y R^{5} son hidrógeno.
9. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde X es O, S o NH y R^{1}, R^{3}, R^{5}
y R^{6} son hidrógeno.
10. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, donde dicho compuesto se selecciona entre
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
11. Uso de un compuesto cíclico
peptidomimético con giro \beta de fórmula (I) como se ha definido
en cualquiera de las reivindicaciones 1, 8, 9 y 10, en la evaluación
de los requisitos estructurales de compuestos cíclicos
peptidomiméticos con giro \beta que mimetizan una neurotrofina
in vitro.
12. Uso de un compuesto cíclico
peptidomimético con giro \beta que mimetiza a una neurotrofina y
que tiene la fórmula (I) como se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1, 8, 9 y 10, en la fabricación de un medicamento
para tratar o prevenir un trastorno mediado por receptores de
neurotrofinas.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación
11 ó 12, en el que el anillo macrocíclico que contiene X tiene de
13 a 17 átomos de anillo.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación
11 ó 12, donde dicho compuesto es de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
15. Uso de acuerdo con la reivindicación
11 ó 12, donde dicho compuesto es de fórmula:
16. Un método para seleccionar y/o evaluar
los requisitos estructurales necesarios de agonistas y antagonistas
para receptores de neurotrofinas que aprovecha un compuesto cíclico
de fórmula (I) como se ha definido en las reivindicaciones 1 u 8,
en competición con un compuesto de ensayo en investigación.
17. Uso de un compuesto de fórmula (I)
como se ha definido en las reivindicaciones 1 u 8, para identificar
dominios de receptores funcionalmente importantes, en ensayos de
unión.
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