ES2274480T3 - Peptidos ligando el receptor de apo-2l y sus usos. - Google Patents

Abstract

Péptido unidor del receptor del Apo-2L aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 104 (TABLA VIII).

Description

Péptidos ligando el receptor de Apo-2L y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos que se unen a receptores del Apo-2L. Tales péptidos pueden usarse, por ejemplo, en procedimientos en los que se desea la modulación de las actividades biológicas del Apo-2L y/o de los receptores del Apo-2L.

Antecedentes de la invención

Diversas moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral-alfa ("TNF-alfa"), el factor de necrosis tumoral-beta ("TNF-beta" o "linfotoxina-alfa"), la linfotoxina-beta ("LT-beta"), el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando de Apo-1 (también denominado como ligando Fas o ligando CD95), el ligando de Apo-2 (también denominado como Apo2L o TRAIL), el ligando de Apo-3 (también denominado TWEAK), el APRIL, el ligando OPG (también denominado como ligando RANK, ODF o TRANCE), y el TALL-1 (también denominado BlyS, BAFF o THANK), se han identificado como miembros de la familia de citocinas del factor de necrosis tumoral ("TNF") (Consultar, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publicada el 16 de enero de 1997; WO 97/25428 publicada el 17 de julio de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188: 1185-1190 (1998); WO98/28426 publicada el 2 de julio de 1998; WO98/46751 publicada el 22 de octubre de 1998; WO98/18921 publicada el 7 de mayo de 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)). De entre estas moléculas, se ha publicado que TNF-alfa, TNF-beta, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1, el ligando Apo-2 (Apo2L/TRAIL) y el ligando Apo-3 (TWEAK) están implicadas en la muerte de la célula apoptótica.

Apo2L/TRAIL se identificó hace varios años como un miembro de la familia de citocinas del TNF. (Consultar, por ejemplo, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)). El polipéptido Apo2L/TRAIL humano de longitud completa es una proteína transmembrana de 281 aminoácidos de longitud. Algunas células pueden producir una forma soluble nativa del polipéptido, a través del corte enzimático de la región extracelular (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Los estudios cristalográficos de las formas solubles del Apo2L/TRAIL revelan una estructura homotrimérica similar a las estructuras del TNF y de otras proteínas relacionadas (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Sin embargo, se halló que el Apo2L/TRAIL, a diferencia de otros miembros de la familia del TNF, tiene una característica estructural única, ya que tres residuos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad en el homotrímero) coordinan conjuntamente un átomo de zinc, y la unión al zinc es importante para la estabilidad del trímero y su actividad biológica. (Hymowitz et al., ver más arriba; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637
(2000)).

Se ha publicado en la literatura que Apo2L/TRAIL puede desempeñar un papel en la modulación del sistema inmune, incluyendo las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, y en el tratamiento del VIH (consultar, por ejemplo, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000); Jeremias et al., Eur. J. Immunol., 28:143-152 (1998); Katsikis et al., J. Exp. Med., 186:1365-1372 (1997); Miura et al., J. Exp. Med., 193:651-660 (2001)).

Se ha publicado también que las formas solubles del Apo2L/TRAIL inducen la apoptosis en una variedad de células cancerosas in vitro, incluyendo de tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga urinaria, riñón, ovario y cerebro, así como de melanomas, leucemias y mieloma múltiple (consultar, por ejemplo, Wiley et al., ver más arriba; Pitti et al., ver más arriba; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13: 1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Los estudios in vivo en modelos de tumor múrido sugieren adicionalmente que el Apo2L/TRAIL, solo o en combinación con la quimioterapia o la terapia con radiación, puede ejercer efectos anti-tumorales sustanciales (consultar, por ejemplo, Ashkenazi et al., ver más arriba; Walzcak et al., ver más arriba; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., ver más arriba; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)). A diferencia de muchos tipos de células cancerosas, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen ser resistentes a la inducción de apoptosis por ciertas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., ver más arriba; Walzcak et al., ver más arriba). Jo et al., han descrito que una forma soluble de Apo2L/TRAIL, marcada con polihistidina, indujo in vitro la apoptosis en hepatocitos humanos aislados, pero no en hepatocitos no humanos (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); consultar también, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Se cree que ciertas preparaciones de Apo2L/TRAIL recombinante pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas sobre células normales respecto las enfermas, dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula etiqueta, contenido de zinc, y % de contenido de trímero. (Consultar, Lawrence et al., Nature Med., Carta al Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Carta al Editor, 7:385-386 (2001)).

Se cree que la inducción de varias respuestas celulares, mediadas por tales citocinas de la familia del TNF, se inicia a partir de su unión a receptores celulares específicos. Previamente, se identificaron dos receptores distintos del TNF, de aproximadamente 55-kDa (TNFR1) y 75-kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417.563, publicada el 20 de marzo de 1991; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)). Se halló que esos TNFR compartían la estructura típica de los receptores de superficie celular, incluyendo las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las porciones extracelulares de ambos receptores también se hallaron forma natural como proteínas unidoras de TNF solubles (Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990); Hale et al., J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, p. 113 (P424)).

La porción extracelular de los TNFR del tipo 1 y tipo 2 (TNFR1 y TNFR2) contiene un patrón de secuencia de aminoácidos repetitivos de cuatro dominios ricos en cisteínas (CRD) denominados del 1 al 4, que empiezan a partir del extremo NH2-terminal. (Schall et al., ver más arriba; Loetscher et al., ver más arriba; Smith et al., ver más arriba; Nophar et al., ver más arriba; Kohno et al., ver más arriba; Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)). Existe un patrón repetitivo de CDR similar en otras varias proteínas de la superficie celular, incluyendo el receptor del factor de crecimiento del nervio p75 (NGFR) (Johnson et al., Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)), el antígeno CD40 de la célula B (Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989)), el antígeno OX40 de la célula T (Mallet et al., EMBO J., 9:1063 (1990)) y el antígeno Fas (Yonehara et al., ver más arriba e Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)). Los CDR también se hallan en las proteínas solubles T2 similares al TNFR (sTNFR) de los virus de la viruela de Shope y mixoma (Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton et al., Virology, 184:370 (1991)). El alineamiento óptimo de estas secuencias indica que las posiciones de los residuos cisteína están bien conservadas. Estos receptores a menudo se denominan de forma conjunta como miembros de la superfamilia del receptor de TNF/NGF.

Los ligandos de la familia del TNF identificados hasta la fecha, con excepción de la linfotoxina-beta, son típicamente proteínas transmembrana del tipo II, cuyo extremo C-terminal es extracelular. Por contra, la mayoría de los receptores en la familia del receptor del TNF (TNFR) identificados hasta la fecha son típicamente proteínas transmembrana del tipo I. Sin embargo, en ambas familias del ligando y del receptor del TNF, la homología identificada entre los miembros de la familia se ha hallado principalmente en el dominio extracelular ("ECD"). Varias de las citocinas de la familia del TNF, incluyendo el TNF-alfa, el ligando Apo-1 y el ligando CD40, son cortadas proteolíticamente a nivel de la superficie celular; la proteína resultante en cada caso típicamente forma una molécula homotrimérica que funciona como una citocina soluble. Las proteínas de la familia del receptor del TNF también son cortadas proteolíticamente de forma habitual para liberar ECD solubles del receptor que pueden funcionar como inhibidores de las citocinas cognadas.

Pan et al., han descrito otro miembro de la familia del receptor del TNF denominado como "DR4" (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); ver también la WO98/32856 publicada el 30 de julio de 1998). Se informó que el DR4 contenía un dominio de muerte citoplasmático capaz de involucrar el aparato de suicidio de la célula. Pan et al., describen que se cree que el DR4 es un receptor para el ligando conocido como Apo2L/TRAIL.

En Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) y Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), se describe otra molécula que se cree que es un receptor para el Apo2L/TRAIL (ver también la WO98/51793 publicada el 19 de noviembre de 1998; la WO98/41629 publicada el 24 de septiembre de 1998). Esa molécula se denomina como DR5 (también se ha denominado alternativamente como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 o KILLER (Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO98/35986, publicada el 20 de agosto 1998; EP 870.827, publicada el 14 de octubre de 1998; WO98/46643, publicada el 22 de octubre de 1998; WO99/02653 publicada el 21 de enero de 1999; WO99/09165, publicada el 25 de febrero de 1999; WO99/11791, publicada el 11 de marzo de 1999). Se ha informado que el DR5, al igual que el DR4, contiene un dominio de muerte citoplasmático y que es capaz de señalar la apoptosis. La estructura del cristal del complejo formado entre Apo-2L/TRAIL y DR5 se describe en Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

Un grupo adicional de receptores recientemente identificados se denomina como "receptores de señuelo", los cuales se cree que funcionan como inhibidores, en vez de como transductores de señal. Este grupo incluye el DCR1 (también denominado como TRID, LIT o TRAIL-R3) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); y Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)) y el DCR2 (también denominado TRUNDD o TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)), ambos son moléculas de la superficie celular, así como el OPG (Simonet et al., ver más arriba; Emery et al., ver más abajo) y el DCR3 (Pitti et al., Nature, 396:699-703 (1998)), ambas de las cuales son proteínas solubles, secretadas. Se ha descrito que Apo2L/TRAIL se une a aquellos receptores denominados como DcR1, DcR2 y OPG.

Se cree que Apo2L/TRAIL actúa a través de los "receptores de muerte" de la superficie celular DR4 y DR5 para activar las caspasas, o enzimas que llevan a cabo el programa de muerte celular. A partir de la unión del ligando, ambos, el DR4 y el DR5 pueden activar la apoptosis independientemente mediante el reclutamiento y activación del iniciador de la apoptosis, la caspasa-8, a través de la molécula adaptadora contenedora del dominio de muerte denominada como FADD/Mort1 (Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)). En contraste con el DR4 y DR5, los receptores DcR1 y DcR2 no dan la señal de la apoptosis.

Para una revisión de la familia de citocinas del TNF y sus receptores, consultar Ashkenazi y Dixit, Science, 281:
1305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Gruss y Dower, ver más arriba; Nagata, Cell, 88:355-365 (1997); Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001).

Además, los anticuerpos monoclonales contra los receptores humanos DR4 (TRAIL-R1) y DR5 (TRAIL-R2) que inhiben la unión del TRAIL a dichos receptores son conocidos en el estado de la técnica (Chuntharapai et al., Journal of Immunology, 166 (8): 4891-4898 (2001); Griffith et al., Journal of Immunology, 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Medecine, 7(8):954-960).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona péptidos que se unen a receptores del ligando Apo-2 (también conocido como Apo-2L o TRAIL). Opcionalmente, el péptido es un monómero, un dímero, un trímero, un tetrámero, o formas oligoméricas superiores. Opcionalmente, el péptido es una molécula quimérica que comprende el péptido unidor del receptor del Apo-2L fusionado a una secuencia peptídica heteróloga que facilita la formación de complejos oligoméricos (por ejemplo, un dominio de cremallera de leucina). En una realización, el péptido inhibe la interacción del Apo-2L con, al menos, uno de sus receptores, tal como el receptor DR5. Opcionalmente, el compuesto es un agonista de al menos una actividad biológica asociada al Apo-2L, por ejemplo, la inducción de la apoptosis a través del receptor DR5.

En ciertas realizaciones, los péptidos son un péptido unidor del receptor del Apo-2L que tiene de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 residuos aminoácidos, y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 104 (Tabla VIII). Las realizaciones relacionadas de la invención incluyen una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido unidor del receptor del Apo-2L que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 104 (Tabla VIII). Otras realizaciones de la invención incluyen vectores que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido unidor del receptor del Apo-2L, así como células huéspedes que comprenden estos vectores (por ejemplo, E. coli).

Las realizaciones adicionales de la invención incluyen procedimientos para construir el péptido unidor del receptor de Apo-2L, que comprenden los pasos de: proporcionar una célula huésped con un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido unidor del receptor de Apo-2L que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 104 (Tabla VIII); (b) proporcionar un medio de cultivo; (c) cultivar la célula huésped en el medio de cultivo en condiciones suficientes para expresar el péptido unidor del receptor de Apo-2L; (d) recuperar el péptido unidor del receptor de Apo-2L a partir de la célula huésped o del medio de cultivo; y (e) purificar el péptido unidor del receptor de Apo-2L.

Tal como se muestra, por ejemplo, en la Tabla VIII, los péptidos unidores del receptor del Apo-2L de la presente invención preferiblemente exhiben ciertos rasgos o características. Por ejemplo, en ciertas realizaciones de la invención, los péptidos unidores del receptor del Apo-2L tienen un residuo cisteína en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7, numeradas a partir de su extremo N-terminal. En las realizaciones preferidas, el péptido unidor del receptor del Apo-2L incluye el motivo siguiente: cisteína-X1-X2-X3-cisteína, en el cual X1 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en metionina y leucina, X2 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en treonina y alanina, y X3 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en serina, metionina, leucina y ácido glutámico.

Los péptidos unidores del receptor del Apo-2L de la invención pueden modificarse usando uno de la amplia variedad de procedimientos conocidos en el estado de la técnica. En las realizaciones preferidas de la invención, un péptido unidor del receptor del Apo-2L de la invención se une a una molécula o secuencia polipeptídica heterólogas. Opcionalmente, la secuencia polipeptídica heteróloga es un dominio de cremallera de leucina. Opcionalmente, la secuencia heteróloga comprende la secuencia de aminoácidos glicina-glicina-metionina. Opcionalmente, el péptido unidor del receptor del Apo-2L puede conjugarse o unirse a una o más moléculas de engarce o grupos poliol.

En ciertas realizaciones de la invención, el péptido unidor del receptor del Apo-2L inhibe la interacción entre el Apo-2L y el DR4. En algunas realizaciones de la invención, el péptido unidor del receptor del Apo-2L inhibe la interacción entre el Apo-2L y el DR5. Opcionalmente, el péptido unidor del receptor del Apo-2L induce la apoptosis en una o más células de mamífero.

También se proporciona en la presente invención una composición que comprende al menos uno de los péptidos descritos más arriba en un portador. Preferiblemente, esta composición es estéril. Además, la invención proporciona procedimientos para preparar las composiciones descritas más arriba. En realizaciones particularmente deseables, las composiciones resultantes son formulaciones farmacéuticamente aceptables.

También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican los péptidos descritos en la presente invención, y pueden usarse, por ejemplo, para la terapia génica in vivo o ex vivo.

En aún otras realizaciones, se proporcionan procedimientos para determinar la cantidad del péptido unido a un determinado receptor del Apo-2L, o en un fluido biológico, de forma que la dosificación del péptido pueda ajustarse de forma apropiada. En la presente invención también se incluye un procedimiento para predecir la afinidad relativa por la unión a un ligando de un péptido que compite con un polipéptido por la unión al ligando, en el cual el péptido que se deriva de una biblioteca exhibida sobre fago, en el cual el procedimiento comprende incubar un clon de fagómido correspondiente al péptido con el polipéptido en presencia del ligando, diluir en serie el fago, y medir el grado con el que se inhibe la unión del clon de fagómido al ligando por el péptido, en donde el clon de fagómido que es inhibido sólo a bajas concentraciones de fago tiene una afinidad mayor por el ligando que un clon de fagómido que es inhibido tanto a bajas como a elevadas concentraciones de fago.

Otras realizaciones de la invención son procedimientos para modular la actividad biológica del Apo-2L y/o del receptor del Apo-2L en células de mamífero. Una realización preferida de la invención es un procedimiento para inducir la apoptosis in vitro en células de mamífero, que comprende exponer las células de mamífero a una cantidad efectiva de un péptido unidor del receptor del Apo-2L descrito en la presente invención. Otra realización de la invención es un procedimiento para inhibir una actividad biológica asociada al Apo-2L, tal como la apoptosis en células de mamífero, que comprende exponer las células de mamífero a una cantidad efectiva de un péptido unidor del receptor del Apo-2L descrito en la presente invención. Las células de mamífero pueden ser, por ejemplo, células cancerosas. En aún otros aspectos, la invención proporciona procedimientos para tratar un trastorno, tal como el cáncer o un trastorno inmunitario, en un mamífero, que comprende administrar al mamífero, opcionalmente mediante inyección o infusión, una cantidad efectiva de un péptido unidor del receptor del Apo-2L proporcionado por la presente invención. Opcionalmente, el trastorno es el cáncer, y más particularmente es un cáncer de mama, pulmón o colon (colorectal). Los péptidos descritos en la presente invención pueden administrarse solos o junto con otros agentes.

En realizaciones adicionales, la invención proporciona equipos que comprenden un contenedor que comprende un péptido unidor del receptor del Apo-2L descrito en la presente invención, e instrucciones para usar el péptido unidor del receptor del Apo-2L; tales como para usar el péptido para tratar un trastorno contra el cual el péptido es efectivo. Opcionalmente, el trastorno es el cáncer, y más particularmente es un cáncer de mama, pulmón o colon (colorectal).

Aún otra realización de la invención es un artículo manufacturado que comprende un contenedor que incluye un péptido unidor del receptor del Apo-2L descrito en la presente invención, e instrucciones impresas para usar el péptido unidor del receptor del Apo-2L. Opcionalmente, el contenedor es una botella, un vial, una jeringa, o un tubo de ensayo. Opcionalmente, el artículo manufacturado comprende un segundo contenedor que incluye agua para inyecciones, una solución salina, una solución de Ringer, o una solución de dextrosa.

En particular, se proporcionan las siguientes realizaciones detalladas en formato de reivindicación:

1. Péptido unidor del receptor del Apo-2L aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 104 (Tabla VIII).

2. Molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de la reivindicación 1.

3. Vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2.

4. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. Célula huésped de la reivindicación 4 en donde dicha célula huésped es E. coli, una célula ovárica de hámster chino (CHO), o una célula de levadura.

6. Procedimiento para construir el péptido unidor del receptor de Apo-2L, que comprende los pasos de: proporcionar una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4; (b) proporcionar el medio de cultivo; (c) cultivar la célula huésped en el medio de cultivo en condiciones suficientes para expresar el péptido unidor del receptor de Apo-2L; (d) recuperar el péptido unidor del receptor de Apo-2L a partir de la célula huésped o del medio de cultivo; y (e) purificar el péptido unidor del receptor de Apo-2L.

7. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido inhibe la interacción entre un polipéptido del receptor DR4 humano y un polipéptido del ligando Apo-2 que comprende los aminoácido 114 a 281 de la Figura 1.

8. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido inhibe la interacción entre un polipéptido del receptor DR5 humano y un polipéptido del ligando Apo-2 que comprende los aminoácido 114 a 281 de la Figura 1.

9. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido induce la apoptosis en una o más células de mamífero.

10. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido tiene un residuo cisteína en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7, numeradas a partir de su extremo N-terminal.

11. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido incluye el motivo siguiente: cisteína-X1-X2-X3-cisteína, en el cual X1 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en metionina y leucina, X2 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en treonina y alanina, y X3 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en serina, metionina, leucina y ácido glutámico.

12. Péptido de la reivindicación 1 que une un receptor DR5 pero no une un receptor DR4.

13. Péptido de la reivindicación 1 que une un receptor DR5 y además se une a un receptor DR4, un receptor DcR1, y/o un receptor DcR2.

14. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-13, en las cuales el péptido unidor del receptor del Apo-2L está unido a una secuencia polipeptídica heterólogas.

15. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-14, en las cuales la secuencia polipeptídica heterólogas es un dominio de cremallera de leucina que comprende la secuencia de aminoácidos glicina-glicina-metionina.

16. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-15, en las cuales el péptido unidor del receptor del Apo-2L está conjugado o unido a uno o más grupos poliol.

17. Composición que comprende el péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16 en un portador.

18. Composición de la reivindicación 17 que es estéril.

19. Composición de la reivindicación 17, en la cual el péptido induce la apoptosis en una o más células de mamífero.

20. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de las reivindicaciones 1 ó 7-16 para su uso en terapia.

21. Procedimiento para inducir la apoptosis in vitro en células de mamífero, que comprende exponer las células de mamífero a una cantidad efectiva de un péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16.

22. Procedimiento de la reivindicación 21 en el cual las células de mamífero son células cancerosas.

23. Uso de un péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16 para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un mamífero.

24. Uso de la reivindicación 23, en la cual dicho cáncer es un cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon o cáncer colorectal.

25. Uso de un péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inmunitaria en un mamífero.

26. Uso de la reivindicación 25, en la cual dicha enfermedad inmunitaria es la artritis o la esclerosis múltiple.

27. Equipo que comprende un contenedor que contiene al menos un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16 e instrucciones que guían al usuario para utilizar el péptido.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del ligando Apo-2 humano (SEQ ID NO:2) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:1). La "N" en la posición del nucleótido 447 (en la SEQ ID NO: 2) se usa para indicar que la base del nucleótido puede ser una "T" o una "G".

Las Figuras 2A y 2B muestran la secuencia de nucleótidos del ADNc del DR4 humano de longitud completa (SEQ ID NO: 3) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 4). Las respectivas secuencias de nucleótidos y aminoácidos del DR4 humano se mencionan también en Pan et al., Science, 276:111 (1997).

La Figura 3A muestra la secuencia de 411 aminoácidos del DR5 humano (SEQ ID NO: 5) tal como se publicó en WO 98/51793 el 19 de noviembre de 1998. En el estado de la técnica se conoce una variante de ayuste durante la transcripción del DR5 humano. Esta variante de ayuste del DR5 codifica la secuencia de 440 aminoácidos del DR5 humano mostrada en las Figuras 3B y 3C (SEQ ID NO: 6) tal como se publicó en WO 98/35986 el 20 de agosto de 1998.

Las Figuras 4A-4D proporcionan ilustraciones de los protocolos usados para modificar los péptidos unidores del receptor del Apo-2L.

La Figura 5 es una representación esquemática del péptido G4 (LB881) unido a un polipéptido de cremallera de leucinas heterólogo. La secuencia de aminoácidos completa de este polipéptido es GEVCLTSCSR LRGGSGGMKL KQIEDKLEEI LSKLYHIENE LARIKKLVGER (SEQ ID NO: 113).

La Figura 5B es una representación gráfica que muestra la actividad inductora de la apoptosis de un péptido unidor del LB881 Apo2L oligomerizado (SEQ ID NO: 113). La actividad inductora de la apoptosis de esta molécula se verificó usando células de carcinoma pulmonar SK-MES-1 y un ensayo de azul de alamar (tal y como se describe en el Ejemplo 4 siguiente).

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

"Miembro de la familia del TNF" se usa en un sentido amplio para referirse a varios polipéptidos que comparten algún parecido con el factor de la necrosis tumoral (TNF) en cuanto a la estructura o función. Ciertas características estructurales y funcionales asociadas con la familia de polipéptidos del TNF son conocidas en el estado de la técnica, y se describen, por ejemplo, en la sección anterior "Antecedentes de la Invención". Tales polipéptidos incluyen, pero no se limitan a los polipéptidos mencionados en la técnica como TNF-alfa, TNF-beta, ligando CD40, ligando CD30, ligando CD27, ligando OX-40, ligando 4-1BB, ligando de Apo-1 (denominado también como ligando Fas o ligando CD95), Apo-2L/TRAIL (también denominado como TRAIL), ligando de Apo-3 (denominado también como TWEAK), APRIL, ligando OPG (denominado también como ligando RANK, ODF, o TRANCE), y TALL-1 (denominado también como BlyS, BAFF or THANK) (Consultar, por ejemplo, Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), publicaciones del PCT con nº WO 97/01633; y WO 97/25428; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); publicaciones del PCT con nº WO98/28426; WO98/46751; y WO98/18921; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

"Péptido unidor del receptor del Apo-2L" se usa en un sentido amplio para referirse a péptidos que se unen a uno o más de los receptores del Apo-2L. El término "péptido unidor del receptor del Apo-2L" excluye los anticuerpos dirigidos contra los receptores DR4 y/o DR5. Preferiblemente, el péptido tiene de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 residuos aminoácidos, o de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 residuos, y más preferiblemente de aproximadamente 12 hasta aproximadamente 25 residuos aminoácidos. Opcionalmente, el péptido unidor del receptor del Apo-2L consiste de no más de 25 residuos aminoácidos (por ejemplo, 25 o menos residuos aminoácidos). Preferiblemente, el péptido tiene un residuo cisteína en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7, numeradas a partir de su extremo N-terminal. Aún más preferiblemente, el péptido tiene adicionalmente un residuo valina, ácido glutámico o glicina N-terminal respecto el residuo cisteína N-terminal. Incluso más preferiblemente, el péptido es tal que el residuo N-terminal respecto el residuo cisteína N-terminal es una valina. Aún más preferiblemente, el péptido tiene un motivo que comprende el siguiente: cisteína-X_{1}-X_{2}-X_{3}-cisteína. Preferiblemente, X_{1} es un residuo metionina o leucina. Preferiblemente X_{2} es un residuo treonina o alanina. Preferiblemente, X_{3} es un residuo serina, metionina, leucina o ácido glutámico. Este péptido, incluso más preferiblemente, tiene un residuo leucina en la posición 2 numerada a partir de su extremo C-terminal. Opcionalmente, el péptido unidor del receptor del Apo-2L está fusionado o unido a una secuencia o molécula heterólogas. Preferiblemente, la secuencia permite o asiste al péptido formar complejo de orden superior u oligoméricos (por ejemplo, un dominio de cremallera de leucina). Opcionalmente, el péptido unidor del receptor del Apo-2L se une a un primer receptor del Apo-2L (por ejemplo, el DR5), pero no a un segundo receptor del Apo-2L (por ejemplo, el DR4, el DcR1, el DcR2). Alternativamente, el péptido unidor del receptor del Apo-2L se une a un primer receptor del Apo-2L (por ejemplo, el DR5), y además se une a uno o más de otros receptores del Apo-2L (por ejemplo, el DR4, el DcR1, el DcR2). Opcionalmente, el péptido es una antagonista que inhibe la interacción del Apo-2L con el DR5. Alternativamente, el péptido es un agonista de la actividad señalizadora del DR5. Opcionalmente, el péptido es una antagonista que inhibe la interacción del Apo-2L con el DR4. Alternativamente, el péptido es un agonista de la actividad señalizadora del DR4.

Opcionalmente, los péptidos unidores del receptor del Apo-2L de la invención se unen a un receptor del Apo-2L (por ejemplo, el DR5 o el DR4) en un rango de concentración desde aproximadamente 1 nM hasta aproximadamente 1 mM (y opcionalmente desde aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 1 mM) según se mide en un ensayo de unión del péptido (tal como se describe en los Ejemplos siguientes). Opcionalmente, los péptidos unidores del receptor del Apo-2L de la invención presentan un valor de Ic 50 desde aproximadamente 3 nM hasta aproximadamente 150 nM (y preferiblemente desde aproximadamente 6 nM hasta aproximadamente 50 nM) según se mide en un ensayo de unión del péptido (tal como se describe en los Ejemplos siguientes).

Los términos "Apo2L/TRAIL", "Apo-2L", y "TRAIL" se usan en la presente invención para referirse a una secuencia polipeptídica que incluye los residuos aminoácidos 114-281, ambos inclusive, 95-281, ambos inclusive, residuos 92-281, ambos inclusive, residuos 91-281, ambos inclusive, residuos 41-281, ambos inclusive, residuos 15-281, ambos inclusive, o residuos 1-281, ambos inclusive, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), así como de los fragmentos biológicamente activos y variantes por supresión, inserción o sustitución de las secuencias anteriores. En una realización, la secuencia polipeptídica comprende los residuos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID NO:1), y opcionalmente consiste en los residuos 114-281 de la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Opcionalmente, la secuencia polipeptídica comprende los residuos 92-281 o los residuos 91-281 de la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Los polipéptidos del Apo-2L pueden estar codificados por la secuencia de nucleótidos nativa mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2). Opcionalmente, el codón que codifica el residuo Pro119 (Figura 1; SEQ ID NO:2) puede ser "CCT" o "CCG". En otras realizaciones, los fragmentos o variantes son biológicamente activas y tienen al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente aproximadamente al menos el 90% de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente, al menos el 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con una cualquiera d las secuencias Apo2L/TRAIL antes citadas. Opcionalmente, el polipéptido Apo2L/TRAIL está codificado por una secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia polinucleotídica codificante proporcionada en la Figura 1 (SEQ ID NO:2). La definición abarca las variantes por sustitución del Apo2L/TRAIL en las cuales al menos uno de sus aminoácidos nativos está sustituido por un residuo alanina. Las variantes concretas por sustitución del Apo2L/TRAIL incluyen aquéllas en las que al menos un aminoácido es sustituido por un residuo alanina. Estas variantes por sustitución incluyen las identificadas, por ejemplo, como "D203A"; "D218A" y "D269A". Esta nomenclatura se usa para identificar las variantes del Apo2L/TRAIL en las cuales los residuos ácido aspártico en las posiciones 203, 218 y/o 269 (usando la numeración mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1)) se sustituyen por residuos alanina. Opcionalmente, las variantes del Apo2L/TRAIL pueden comprender una o más de las sustituciones por alanina que se citan en la Tabla 1 de la solicitud del PCT publicada WO 01/00832. Las variantes por sustitución incluyen una o más de las sustituciones de residuos identificadas en la Tabla I de la WO 01/00832, publicada el 4 de enero de 2001. La definición también abarca una secuencia nativa del Apo2L/TRAIL aislada a partir de una fuente del Apo2L/TRAIL o preparada mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. El Apo2L/TRAIL de la invención incluye los polipéptidos mencionados como Apo2L/TRAIL o TRAIL y descubiertos en las publicaciones del PCT con nº WO97/01633 y WO97/25428. Los términos "Apo2L/TRAIL" o "Apo2L" se usan para referirse de forma general a las formas del Apo2L/TRAIL, lo que incluye las formas monoméricas, diméricas o triméricas del polipéptido. Toda la numeración de los residuos aminoácidos a los que se hace referencia en la secuencia del Apo2L usa la numeración según la Figura 1 (SEQ ID NO:1), a menos que específicamente se indique lo contrario. Por ejemplo, "D203" o "Asp203"
se refiere al residuo ácido aspártico en la posición 203 en la secuencia proporcionada en la Figura 1 (SEQ ID No:1).

El término "dominio extracelular del Apo2L/TRAIL" o "ECD del Apo2L/TRAIL" se refiere a una forma del Apo2L/TRAIL que carece esencialmente de los dominios transmembrana y citoplásmico. Ordinariamente, el ECD tendrá menos del 1% de tales dominios transmembrana y citoplásmicos, y, preferiblemente tendrá menos del 0,5% de tales dominios. Se sobreentenderá que cualquier dominio o dominios transmembrana, identificados para los polipéptidos de la presente invención, se identifican siguiendo los criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero los más probable es que en no más de 5 aminoácidos en cada extremo del dominio tal como se identificó inicialmente. En las realizaciones preferidas, el ECD consistirá en una secuencia soluble del dominio extracelular del polipéptido, la cual carece de los dominios transmembrana y citoplásmico o intracelular (y no está unida a la membrana). Se describen secuencias concretas del dominio extracelular del Apo-2L/TRAIL en las publicaciones del PCT con nº WO97/01633 y WO97/25428.

El término "monómero del Apo2L/TRAIL" o "monómero del Apo2L" se refiere a una cadena covalente de una secuencia del dominio extracelular del Apo2L.

El término "dímero del Apo2L/TRAIL" o "dímero del Apo2L" se refiere a dos monómeros del Apo2L unidos en un enlace covalente mediante un enlace disulfuro. El término, tal y como se utiliza en la presente invención, incluye los dímeros del Apo2L que permanecen libres y los dímeros del Apo2L que están dentro de formas triméricas del Apo2L (es decir, asociados con otro, un tercer monómero del Apo2L).

El término "trímero del Apo2L/TRAIL" o "trímero del Apo2L" se refiere a tres monómeros del Apo2L que están asociados de forma no covalente.

El término "agregado del Apo2L/TRAIL" se usa para referirse a formas oligoméricas superiores autoasociadas del Apo2L/TRAIL, tales como los trímeros del Apo2L/TRAIL, los cuales forman, por ejemplo, formas hexaméricas y nanoméricas del Apo2L/TRAIL. La determinación de la presencia y cantidad de monómero, dímero o trímero (u otros agregados) del Apo2L/TRAIL puede hacerse usando procedimientos y ensayos conocidos en el estado de la técnica (y usando materiales disponibles comercialmente), tales como la HPLC por exclusión de tamaño nativo ("SEC"), la exclusión por tamaño de desnaturalización usando dodecilsulfato de sodio ("SDS-SEC"), la HPLC en fase inversa, y la electroforesis capilar.

"Receptor del ligando de Apo-2" incluye los receptores conocidos como "DR4" y "DR5", cuyas secuencias polinucleotídicas y peptídicas se muestran respectivamente en las Figura 2 y 3. Pan et al. han descrito el miembro de la familia del receptor del TNF conocido como "DR4" (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); consultar también la WO98/32856 publicada el 30 de julio de 1998). Se informó que el receptor DR4 contenía un dominio de muerte citoplasmático capaz de involucrar el aparato de suicidio de la célula. Pan et al., describen que se cree que el DR4 es un receptor para el ligando conocido como Apo2L/TRAIL. Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) y Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) describen otro receptor para el Apo2L/TRAIL (ver también la WO98/51793 publicada el 19 de noviembre de 1998; la WO98/41629 publicada el 24 de septiembre de 1998). Este receptor es conocido como el DR5 (el receptor se ha denominado también alternativamente como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 o KILLER (Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO98/35986, publicada el 20 de agosto 1998; EP 870.827, publicada el 14 de octubre de 1998; WO98/46643, publicada el 22 de octubre de 1998; WO99/02653 publicada el 21 de enero de 1999; WO99/09165, publicada el 25 de febrero de 1999; WO99/11791, publicada el 11 de marzo de 1999). Se ha informado que el DR5, al igual que el DR4, contiene un dominio de muerte citoplasmático y que es capaz de señalar la apoptosis. Como se ha descrito más arriba, otros receptores para del Apo-2L incluyen el DcR1, DcR2, y OPG (consultar, Sheridan et al., ver más arriba; Marsters et al., ver más arriba; y Simonet et al., ver más arriba). El término "receptor del Apo-2L" cuando se usa en la presente invención abarca el receptor de secuencia nativa y las variantes del receptor. Estos términos abarcan el receptor del Apo-2L expresado en una variedad de mamíferos, incluyendo los humanos. El receptor del Apo-2L puede expresarse endógenamente, tal como ocurre de forma natural en una variedad de líneas de tejidos humanos, o puede expresarse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. Una "secuencia nativa del receptor del Apo-2L" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un receptor Apo-2L derivado de la naturaleza. Por tanto, un receptor del Apo-2L de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de un receptor del Apo-2L que ocurra de forma natural procedente de cualquier mamífero. Tal receptor del Apo-2L de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "receptor del Apo-2L de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas del receptor que ocurren de forma natural (por ejemplo, una forma soluble que contiene, por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas variantes que ocurren de forma natural (por ejemplo, formas ayustadas de forma alternativa), y variantes alélicas que ocurren de forma natural. Las variantes del receptor pueden incluir fragmentos o mutantes por supresión de la secuencia nativa del receptor del Apo-2L.

El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula descrita en las reivindicaciones que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o completamente una o más de las actividades biológicas del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vitro, in situ, o in vivo. Los ejemplos de tales actividades biológicas del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5 incluyen la unión del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, la inducción de la apoptosis, así como aquéllas mencionadas adicionalmente en la literatura. Un antagonista puede funcionar de manera directa o indirecta. Por ejemplo, el antagonista puede funcionar para bloquear, inhibir o neutralizar, parcial o totalmente, una o más de las actividades biológicas del Apo2L/TRAIL, in vitro, in situ, o in vivo, a resultas de su unión directa al DR4 o DR5. El antagonista también podría funcionar indirectamente para bloquear, inhibir o neutralizar, parcial o totalmente, una o más de las actividades biológicas del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vitro, in situ, o in vivo, a resultas, por ejemplo, de bloquear o inhibir otra molécula efectora. La molécula antagonista puede comprender una actividad antagonista "dual", en donde la molécula es capaz de bloquear, inhibir o neutralizar, parcial o totalmente, una actividad biológica del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5.

El término "agonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula descrita en las reivindicaciones que potencia, estimula o activa, parcial o completamente, una o más de las actividades biológicas del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vitro, in situ, o in vivo. Los ejemplos de tales actividades biológicas del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5 incluyen la unión del Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, la apoptosis, así como aquéllas mencionadas adicionalmente en la literatura. Un agonista podría funcionar de manera directa o indirecta. Por ejemplo, el agonista puede funcionar para potenciar, estimular o activar, parcial o totalmente, una o más de las actividades biológicas del DR4 o DR5, in vitro, in situ, o in vivo, a resultas de su unión directa al DR4 o DR5, lo que causa la activación del receptor o la transducción de la señal. El agonista puede funcionar también indirectamente para potenciar, estimular o activar, parcial o totalmente, una o más de las actividades biológicas del Dr4 o DR5, in vitro, in situ, o in vivo, a resultas de, por ejemplo, de la estimulación de otra molécula efectora que causa a continuación la activación del DR4 o DR5 o la transducción de la señal. Se contempla que un agonista puede actuar como una molécula potenciadora que funciona indirectamente para potenciar o incrementar la activación o actividad del DR4 o DR5. Por ejemplo, el agonista puede potenciar la actividad del Apo-2L endógeno en un mamífero. Esto puede conseguirse, por ejemplo, pre-complejando el DR4 o DR5, o estabilizando los complejos de los respectivos ligandos con el receptor DR4 o DR5 (tal como estabilizando el complejo nativo formado entre Apo-2L y DR4 o DR5).

El término "etiquetado" cuando se usa en la presente invención se refiere a una molécula quimérica que comprende un péptido unidor del receptor del Apo-2L o, alternativamente, el Apo2L/TRAIL, o una porción del mismo, fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos como para proporcionar un epítopo contra el cual puede prepararse un anticuerpo, o para proporcionar alguna otra función, tal como la capacidad de oligomerizar (por ejemplo, como ocurre con los péptidos que tienen dominios de cremallera de leucinas), aunque es lo bastante corto como para que generalmente no interfiera con la actividad del péptido unidor del receptor del Apo-2L. El polipéptido etiqueta preferiblemente es también bastante único, de forma que un anticuerpo específico para la marca no reaccione sustancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta apropiados tienen generalmente al menos seis residuos aminoácidos, y usualmente entre 8 y 50 residuos aminoácidos (preferiblemente, entre desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 residuos).

El término "ion metálico divalente" se refiere a un ion metálico que tiene dos cargas positivas. Los ejemplos de iones metálicos divalentes incluyen pero no se limitan al zinc, cobalto, níquel, cadmio, magnesio y manganeso. Las formas concretas de tales metales que pueden emplearse incluyen las formas de sal (por ejemplo, formas de sal farmacéuticamente aceptables), tales como las formas cloruro, acetato, carbonato, citrato y sulfato de los iones metálicos divalentes mencionados más arriba. Opcionalmente, un ion metálico divalente para usar en la presente invención es el zinc, y preferiblemente, la forma de sal, sulfato de zinc o cloruro de zinc.

"Aislado", cuando se usa para describir los diversos péptidos o proteínas descritos en la presente invención, significa un péptido o proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del péptido o de la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, el péptido o la proteína se purificarán (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria, o (2) hasta su homogeneidad según SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata, o (3) hasta su homogeneidad según las técnicas de espectroscopia de masas o mapeado del péptido. La material aislado incluye el péptido o la proteína in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente de su entorno natural no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el péptido o la proteína aislados se prepararán mediante al menos un paso de purificación.

"Porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos", en relación a las secuencias identificadas en la presente invención, se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máxima porcentaje de identidad de la secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. El alineamiento, para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos, puede conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los conocimientos del campo, se pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo la asignación de los algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se están comparando. Para los propósitos en la presente invención, los valores del porcentaje de identidad de los aminoácidos puede obtenerse usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2, el cual fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente del cual se ha registrado con la documentación para el usuario en la U.S. Copyright Office, Washington, DC, 20559, registrado con el nº US Copyright Registration TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es determinada fácilmente por alguien con la formación ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para un emparejamiento correcto, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para emparejarse de nuevo, cuando las hebras complementarias están presentes en un entorno, por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de identidad deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. A resultas de esto, se deduce que las temperaturas relativas más elevadas tenderán a hacer que las condiciones de reacción sean más rigurosas, mientras que las temperatura más bajas lo hacen menos. Para detalles y explicaciones adicionales sobre la rigurosidad de las reacciones de hibridación, consultar Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones de elevada rigurosidad", tal como se definen en la presente invención, se identifican por ser aquéllas que: (1) emplean una baja fuerza iónica y una temperatura elevada para el lavado; cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/0,1% de sulfato dodecilo de sodio a 50ºC; (2) emplean un agente desnaturalizante durante la hibridación; 50% (v/v) de formamida con un 0,1% de albúmina de suero bovina/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean 50% de formamida, 5\times SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico 0,1%, 5\times solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2\times SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguido por un lavado de elevada rigurosidad consistente en 0,1\times SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como describen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5\times SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5\times solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguida por el lavado de los filtros en 1\times SSC a aproximadamente 37-50ºC. El especialista capacitado reconocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etcétera, según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión en un determinado organismo huésped de una secuencia codificante operativamente ligada. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretorio está unido operativamente a un ADN para un polipéptido, si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador están operativamente unidos a una secuencia codificante si éstos afectan la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está ubicado de forma que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

El término "citocina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Las linfocinas, las monocinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales son ejemplos de tales citocinas. Entre las citocinas se incluyen las hormonas del crecimiento, tales como la hormona del crecimiento humana, la N-metionil hormona del crecimiento humana, y la hormona del crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas glicoproteicas tales como la hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placentario; el factor-\alpha y -\beta de la necrosis tumoral; la sustancia inhibidora de mullerian; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento del nervio; el factor de crecimiento de las plaquetas; los factores de crecimiento transformadores (TGF) tales como el TGF-\alpha y TGF-\beta; el factor-I y -II de crecimiento similar a la insulina; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductivos; los interferones tales como el interferón-\alpha, -\beta, y -gamma; los factores estimuladores de colonias (CSF), tales como el CSF de macrófagos (M-CSF); el CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), y el CSF de granulocitos (G-CSF); las interleucinas (IL), tales como las IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; y otros factores polipeptídicos tales como el LIF y el ligando kit (KL). Tal como se usa en la presente, el término citocina incluye las proteínas procedentes de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes, y los equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

El término "agente citotóxico", tal como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa la destrucción de las células. Se pretende que el término incluya los isotopos radiactivos (por ejemplo, ^{131}I, ^{125}I, ^{90}Y y ^{186}Re), los agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen los agentes alquilantes tales como la tiotepa y la ciclofosfamida (CYTOXAN^{TM}); los alquilsulfonatos tales como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas tales como la benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; las etileniminas y metilamelaminas, incluyendo la altretamina, trietilenemelamina, trietienefosforamida, trietilenetiofosforamida y trimetilolomelamina; las acetogeninas (especialmente la bullatacina y la bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan); la briostatina; la calistatina; el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la criptoficina 8); la dolastatina; la duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); la eleuterobina; la pancratistatina; una sarcodictiina; la espongistatina; las mostazas nitrogenadas tales como el clorambucilo, la clornafacina, la colofosfamida, la estramustina, la ifosfamida, la mecloretamina, el hidrocloruro del óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina, la trofosfamida, la mostaza de uracilo; las nitrosureas tales como la carmustina, la clorozotocina, la fotemustina, la lomustina, la nimustina, la ranimustina; los antibióticos tales como los antibióticos de enediyne (por ejemplo, la calicheamicina, especialmente la calicheamicina gammaII y la calicheamicina phiII, consultar, por ejemplo, Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); la dinemicina, inlcuyendo la dinemicina A; los bisfosfonatos, tales como el clodronato; una esperamicina; así como el cromóforo de la neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteínas), aclacinomisinas, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamicina^{TM}) (incluyendo la morfolino-doxorubicina, la cianomorfolino-doxorubicina, la 2-pirrolino-doxorubicina y la desoxidoxorubicina), la epirubicina, la esorubicina, la idarubicina, la marcelomicina, las mitomicinas tales como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina, las olivomicinas, la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorubicina, la estreptonigrina, la estreptozocina, la tubercidina, el ubenimex, la zinostatina, la zorubicina; los anti-metabolitos tales como el metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); los análogos del ácido fólico tales como la denopterina, el metotrexato, la pteropterina, el trimetrexato; los análogos de purina tales como la fludarabina, la 6-mercaptopurina, la tiamiprina, la tioguanina; los análogos de pirimidina tales como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina, el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina, la doxifluridina, la enocitabina, la floxuridina; los andrógenos tales como la calusterona, el propiontao de dromostanolona, el epitiostanol, la mepitiostana, la testolactona; los anti-adrenales tales como la aminoglutetimida, el mitotano, el trilostano; los rellenadores de ácido fólico tales como el ácido frolínico; la aceglatona; el glicósido de aldofosfamida; el ácido aminolevulínico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucilo; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina; la diaziquona; la elfornitina; el acetato de elliptinio; una epotilona; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinano; la lonidamina; los maytansinoides tales como la maytansina y las ansamitocinas; la mitoguazona; la mitoxantrona; el mopidamol; la nitracrina; la pentostatina; el fenameto; la pirarubicina; la losoxantrona; el ácido podofilínico; la 2-etilhidrazida; la procarbazina; el PSK®; la razoxana; la rizoxina; el sizofirano; el espirogermanio; el ácido tenuazónico; la triaziquona; la 2,2',2''-triclorotrietilamina; la tricotecenas (especialmente la toxina T-2, la verracurina A, la roridina A y la anguidina); el uretano; la vindesina; la dacarbazina; la manomustina; el mitobronitol; el mitolactol; el pipobromano; la gacitosina; el arabinósido ("Ara-C"); la ciclofosfamida; la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y el doxetaxelo (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); el clorambucilo; la gemcitabina (Gemzar^{TM}) ; la 6-tioguanina; la mercaptopurina; el metotrexato; los análogos de platino tales como el cisplatino y carboplatino; la vinblastina; el platino; el etoposido (VP-16); la ifosfamida; la mitoxantrona; la vincristina; la vinorelbina (Navelbine)^{TM}; la novantrona; el tenipósido; el edatrexato; la daunomicina; la aminopterina; la xeloda; el ibandronato; el CPT-11; el inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; la difluorometilornitina (DMFO); los retinoides tales como el ácido retinoico; la capecitabina; y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de la hormona sobre los tumores, tales como los antiestrógenos y modulares selectivos del receptor del estrógeno (SERM), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (incluyendo el Nolvadex^{TM}), el raloxifeno, el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona, y el toremifeno (Fareston^{TM}); los inhibidores de la aromatasa que inhibien el enzima aromatasa, el cual regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, los 4(5)-imidazoles, la aminoglutetimida, el acetato de megestrol (Megace^{TM}), el exemestano, el formestano, la fadrozola, la vorozola (Rivisor^{TM}), la letrozola (Femara^{TM}), y la anastrozola (Arimidex^{TM}); y los antiandrógenos tales como la flutamida, la nilutamida, la bicalutamida, el leuprólido, y la goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptes de los anteriores.

Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en la presente invención, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente de una célula cancerosa que sobreexpresa cualquiera de los genes identificados en la presente invención, tanto in vitro como in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan tales genes en la fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores incluyen los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en una etapa distinta de la fase S), tales como los agentes que inducen la detención en G1 y la detención en la fase M. Los bloqueantes clásicos de la fase M incluyen el vincas (vincristina y vinblastina), el taxol, y los inhibidores de la topo II tales como la doxorubicina, la epirubicina, la daunorubicina, el etoposido y la bleomicina. Aquellos agentes que detienen en G1 también desbordan hacia la detención en la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes del ADN tales como el tamoxifén, la prednisona, la dacarbazina, la mecloretamina, el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y el ara-C. Puede hallarse información adicional en The Molecular Basis of Cancer, editores Mendelsohn e Israel, capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente en la p. 13.

"Biológicamente activo" o "actividad biológica" para los propósitos en la presente invención significa (a) que tiene la capacidad de inducir o estimular o inhibir la apoptosis en al menos un tipo de célula cancerosa de mamífero o célula infectada viralmente, in vivo o ex vivo, bien solo, como un agente sencillo, o en combinación con otro agente tal como un agente quimioterapéutico (b) capaz de unir y/o estimular un receptor para el Apo2L/TRAIL (tales receptores pueden incluir el receptor DR4, el receptor DR5, el OPG, el receptor DcR1, y el receptor DcR2); o (c) que tiene alguna actividad de un polipéptido Apo2L/TRAIL nativo o que ocurre de forma natural. Los ensayos para determinar la actividad biológica pueden llevarse a cabo usando procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como la fragmentación del ADN (consultar, por ejemplo, Marsters et al., Curr. Biology, 6:1669 (1996)), la inactivación de la caspasa, la unión al DR4, la unión al DR5 (consultar, por ejemplo, WO 98/51793, publicada el 19 de noviembre de 1998), la unión del DcR1 (consultar, por ejemplo, WO 98/58062, publicada el 23 de diciembre de 1998), la unión del DcR2 (consultar, por ejemplo, WO 99/10484, publicada el 4 de marzo de 1999) así como los ensayos descritos en las publicaciones del PCT con nº WO97/01633, WO97/25428, WO 01/00832, y WO 01/22987.

Los términos "apoptosis" y "actividad apoptótica" se usan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que está acompañada típicamente por uno o más cambios característicos, incluyendo la condensación del citoplasma, la pérdida de las microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico, o la pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular (tales como los ensayos de azul de Alamar o los ensayos de MTT), el análisis mediante FACS, la activación de caspasas, la fragmentación del ADN (consultar, por ejemplo, Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271-279 (1991), y ensayos de rotura por la polimerasa de poli(ADP-ribosa), "PARP", conocidos en el estado de la técnica.

Tal como se usa en la presente invención, el término "trastorno" se refiere en general a cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con las composiciones descritas en la presente invención, incluyendo cualquier enfermedad o trastorno que pueda tratarse mediante cantidades efectivas de un péptido unidor del receptor del Apo-2L. Esto incluye los trastornos crónicos y agudos, así como aquellas condiciones patológicas que predisponen el mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos a ser tratados en la presente invención incluyen los cánceres benignos o malignos; los trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos, los trastornos autoinmune, la artritis (incluyendo la artritis reumatoide), la esclerosis múltiple, y el VIH/SIDA.

Los términos "cáncer", "canceroso" o "maligno" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular descontrolado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan al carcinoma, el linfoma, la leucemia, el blastoma, y el sarcoma. Los ejemplos más concretos de tales cánceres incluyen el carcinoma de célula escamosa, el cáncer pulmonar de célula pequeña, el cáncer pulmonar de células no pequeñas, el glioma, el cáncer gastrointestinal, el cáncer renal, el cáncer de ovarios, el cáncer de hígado, la leucemia linfoblástica, la leucemia linfocítica, el cáncer colorectal, el cáncer del endometrio, el cáncer renal, el cáncer de próstata, el cáncer de tiroides, el neuroblastoma, el cáncer de páncreas, el glioblastoma multiforme, el cáncer del cuello del útero, el cáncer de cerebro, el cáncer de estómago, el carcinoma de color, y los cánceres de cabeza y cuello.

El término "enfermedad relacionada con la inmunidad" significa una enfermedad en la que un componente del sistema inmunitario de un mamífero causa, media o contribuye de otro modo a la morbidez en el mamífero. También se incluyen las enfermedades en las que la estimulación o la intervención de la respuesta inmunitaria tienen un efecto de mejoría sobre la progresión de la enfermedad. Se incluyen dentro de este término las enfermedades autoinmunitarias, las enfermedades inflamatorias inmunomediadas, las enfermedades inflamatorias no inmunomediadas, las enfermedades infecciosas, y las enfermedades de inmunodeficiencia. Los ejemplos de enfermedades relacionadas con la inmunidad y enfermedades inflamatorias, algunas de las cuales son inmunitarias o están mediadas por células T, que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen el lupus eritematoso, la artritis reumatoide, la artritis crónica juvenil, las espóndiloartropatías, la esclerosis sistémica (escleroderma), las miopatías inflamatoria idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), el síndrome de Sjögren, la vasculitis sistémica, la sarcoidosis, la anemia autoimmune hemolítica (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal), la trombocitopenia autoinmune (trombocitopenia idiopática púrpura, trombocitopenia inmune-mediada), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), la diabetes mellitus, la enfermedad renal inmunomediada (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como la esclerosis múltiple, la polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica); las enfermedades hepatobiliares, tales como la hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), la hepatitis activa crónica autoinmune, la cirrosis biliar primaria, la hepatitis granulomatosa, y la colangitis esclerosante, enfermedades inflamatorias y fibróticas del pulmón tales como la enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerante: enfermedad de Crohn), la enteratía sensible al gluten, y la enfermedad de Whipple, las enfermedades de la piel autoinmunes o inmunomediadas, incluyendo las enfermedades ampollosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis por contacto, la psoriasis, las enfermedades alérgicas tales como el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad a la comida y la urticaria, las enfermedades inmunológicas del pulmón, tales como las neumonías eosinofilicas, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis por hipersensibilidad; las enfermedades asociadas a trasplantes, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad del injerto contra el huésped. Las enfermedades infecciosas incluyen el SIDA (infección por VIH), la hepatitis A, B, C, D y E, las infecciones bacterianas, las infecciones fúngicas, las infecciones por protozoos y las infecciones parasitarias.

"Enfermedad autoinmune" se usa en la presente invención en un sentido amplio, general, para referirse a los trastornos o condiciones en mamíferos en los que la destrucción del tejido normal o sano surge a partir de respuestas inmunitarias humorales o celulares del mamífero individual contra sus propios constituyentes tisulares. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el lupus eritematoso, la tiroiditis, la artritis reumatoide, la psoriasis, la esclerosis múltiple, la diabetes autoinmune, y la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD).

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" tal y como se usan en la presente invención se refieren a la terapia curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva. El tratamiento o administración consecutivo se refiere al tratamiento con, al menos, una base diaria sin interrumpir el tratamiento en uno o más días. El tratamiento o administración intermitente, o tratamiento o administración de forma intermitente, se refiere al tratamiento que no es consecutivo, sino más bien cíclico por naturaleza.

El término "mamífero" tal y como se usa en la presente invención se refiere a cualquier mamífero clasificado como un mamífero, incluyendo los humanos, las vacas, los caballos, los perros y los gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un humano.

B. Materiales y procedimientos de ejemplo de la invención

La invención descrita en la presente memoria se refiere a péptidos que se unen a los receptores del Apo-2L. Opcionalmente, el péptido es una antagonista que inhibe la interacción del Apo-2L con el DR5. Alternativamente, el compuesto peptídico es un agonista de la actividad señalizadora del DR5. Opcionalmente, el compuesto peptídico es un antagonista que inhibe la interacción del Apo-2L con el DR4. Alternativamente, el compuesto peptídico es un agonista de la actividad señalizadora del DR4. Preferiblemente, el péptido tiene desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 25 residuos aminoácidos, o desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20 residuos, y más preferiblemente, desde 12 hasta 20 residuos aminoácidos. Más preferiblemente, el péptido tiene un residuo cisteína en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7, numeradas a partir de su extremo N-terminal. Aún más preferiblemente, el péptido tiene adicionalmente un residuo valina, ácido glutámico o glicina N-terminal respecto el residuo cisteína N-terminal. Incluso más preferiblemente, el péptido es tal que el residuo N-terminal respecto el residuo cisteína N-terminal es una valina. Aún más preferiblemente, el péptido tiene un motivo que comprende cisteína-X_{1}-X_{2}-X_{3}-cisteína. Preferiblemente, X_{1} es un residuo metionina o leucina. Preferiblemente X_{2} es un residuo treonina o alanina. Preferiblemente, X_{3} es un residuo serina, metionina, leucina o ácido glutámico. Este péptido, incluso más preferiblemente, tiene un residuo leucina en la posición 2 numerada a partir de su extremo C-terminal.

Los péptidos proporcionados por esta invención pueden prepararse usando técnicas conocidas en el estado de la técnicas, tales como mediante síntesis química o empleando la tecnología recombinante. Para la síntesis de péptidos relativamente cortos (por ejemplo, menos de 50 residuos) o que contienen aminoácidos no naturales o inusuales, tales como la D-Tyr, la ornitina, el aminoácido adípico, y similares, se prefiere la síntesis química, especialmente la síntesis en fase sólida. Los procedimientos recombinantes se prefieren para los péptidos más largos. Cuando se seleccionan los procedimientos recombinantes, puede construirse un gen sintético de nuevo o puede mutarse un gen natural mediante, por ejemplo, la mutagénesis en casete. Más abajo se detallan procedimientos recombinantes genera-
les.

Usando, por ejemplo, los receptores DR4 ó DR5 y sus respectivas secuencias de aminoácidos se puede identificar un antagonista o agonista del péptido unidor del receptor del Apo-2L usando los procedimientos descritos en la presente invención. Opcionalmente, el péptido unidor del receptor del Apo-2L puede producirse usando procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como la síntesis peptídica o las técnicas del ADN recombinante. Las técnicas del ADN contemplan, de forma simplificada, tomar el gen, bien natural o sintético, que codifica el péptido; insertarlo en un vector apropiado; insertar el vector en una célula huésped apropiada; cultivar la célula huésped hasta causar la expresión del gen; y recuperar o aislar el péptido producido por el mismo. Preferiblemente, el péptido recuperado se purifica entonces hasta un grado apropiado.

De forma algo más particular, la secuencia de ADN que codifica un péptido unidor del receptor del Apo-2L se clona y manipula de forma que puede expresarse en un huésped conveniente. El ADN que codifica los polipéptidos originales puede obtenerse de una biblioteca genómica, a partir de ADNc derivado del ARNm de células que expresan el péptido, o construyendo sintéticamente la secuencia de ADN (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989).

El ADN original se inserta a continuación en un plásmido o vector apropiado, el cual se usa para transformar una célula huésped. En general, en conexión con esos huéspedes, se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicación y control, las cuales se derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector ordinariamente es portador de un sitio de replicación, así como de secuencias que codifican proteínas o péptidos que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células transformadas.

Por ejemplo, E. coli puede transformarse usando el pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. Mandel et al., J. Mol. Biol., 53: 154 (1970). El plásmido pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina, y proporciona por tanto medios sencillos para la selección. Otros vectores incluyen características diferentes, tales como promotores diferentes, las cuales son a menudo importantes para la expresión. Por ejemplo, los plásmidos pKK223-3, pDR720, y pPL-lambda representan vectores de expresión con los promotores tac, trp, o PL que están actualmente disponibles (Pharmacia Biotechnology).

Pueden construirse otros vectores preferidos, usando técnicas estándares, mediante la combinación de los rasgos relevantes de los vectores descritos más arriba. Los rasgos relevantes incluyen el promotor, el sitio de unión del ribosoma, el gen de la decorsina u ornatina o la fusión de genes (dominio Z de la Proteína A y la decorsina u ornatina y sus engarces), los marcadores de la resistencia a antibióticos, y los orígenes de replicación apropiados.

La célula huésped puede ser procariota o eucariota. Las procariotas son las preferidas para clonar y expresar secuencias de ADN para producir el polipéptido progenitor, los péptidos con segmentos sustituidos, los péptidos con residuos sustituidos, y las variantes del péptido. Por ejemplo, puede usarse la cepa 294 de la E. coli K12 (ATCC Nº 31446), así como la E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nº 31537), y las E. coli c600 y c600hfl, la E. coli W3110 (F-, gamma-, prototrófica/ATCC Nº 27325), los bacilos tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y varias especies de Pseudomonas. La procariota preferida es E. coli W3110 (ATCC 27325). Cuando se expresan en procariotas, los péptidos típicamente contienen una metionina o una formilmetionina N-terminal y no están glicosilados. En el caso de las proteínas de fusión, la metionina o formilmetionina N-terminal reside en el extremo amino de la proteína de fusión o de la secuencia señalizadora de la proteína de fusión. Por supuesto, se pretende que estos ejemplos sean ilustrativos en vez de limitantes.

Además de los procariotas, pueden usarse como células huéspedes los organismos eucariotas, tales como los cultivos de levaduras, o las células derivadas de organismos multicelulares. En principio, es factible trabajar con cualquiera de tales cultivos celulares. Sin embargo, ha sido mayor el interés por las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) ha devenido un procedimiento reproducible. Tissue Culture, Academic Press, editores Kruse y Patterson, (1973). Son ejemplos de tales líneas celulares huéspedes útiles las células VERO y HeLa, las líneas de células ováricas de hámster chino (CHO), las líneas celulares W138, 293, BHK, COS-7 y MDCK.

Una variación de los procedimientos anteriores contempla el uso de las fusiones de genes, en las cuales el gen que codifica el péptido deseado está asociado, en el vector, con un gen que codifica otra proteína o un fragmento de otra proteína. Esto resulta en que el péptido deseado es producido por la célula huésped como una fusión con otra proteína o péptido. La "otra" proteína o péptido a menudo es una proteína o péptido que puede ser secretada por la célula, haciendo posible aislar y purificar el péptido deseado a partir del medio de cultivo, y eliminando la necesidad de destruir las células huéspedes que surge cuando el péptido deseado permanece dentro de la célula. Alternativamente, la proteína de fusión puede expresarse intracelularmente. Es útil usar proteínas de fusión que se expresan abundantemente.

En una realización preferida, el péptido puede fusionarse con una inmunoglobulina o una región concreta de una inmunoglobulina, tal como la región Fc de una molécula de IgG. Tales fusiones pueden generarse, por ejemplo, para extender la vida media in vivo en el plasma de una composición peptídica deseada. En una realización típica, la fusión con inmunoglobulina incluye el gozne, y las regiones CH2 y CH3, o el gozne, y las regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones con inmunoglobulina consultar, por ejemplo, la patente estadounidenses nº 5.428.130, la cual se incorpora en la presente invención por referencia.

El uso de las fusiones de genes, aunque no es esencial, puede facilitar la expresión de los péptidos heterólogos en E. coli, así como la purificación subsiguiente de los productos de esos genes. Harris, en Genetic Engineering, editor Williamson, R., (Academic Press, London, Vol. 4, 1983), p. 127; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 557-561 (1989) y Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 563-569 (1989). Las fusiones de Proteína A se usan a menudo porque la unión de la Proteína A, o más específicamente, del dominio Z de la Proteína A, a la IgG proporciona un "asa de afinidad" para la purificación de la proteína fusionada. Se ha mostrado también que muchas proteínas heterólogas son degradadas cuando se expresan directamente en E. coli, pero que son estables cuando se expresan como proteínas de fusión. Marston, Biochem J., 240:1 (1986). El uso de las fusiones de genes puede facilitar también la formación de complejos oligoméricos tales como los dímers, trímeros o tetrámeros del péptido unidor del receptor del Apo-2L. Preferiblemente, la secuencia polipeptídica heteróloga comprende un dominio de cremallera de leucina, como se discutió más arriba en el Ejemplo 3.

Las proteínas de fusión pueden cortarse usando compuestos químicos, tales como el bromuro de cianógeno, el cual corta en una metionina, o hidroxilamina, la cual corta entre un residuo Asn y un residuo Gly. Usando la metodología estándar del ADN recombinante, los pares de bases de nucleótidos que codifican estos aminoácidos pueden insertarse justo antes del extremo 5' del gen que codifica el péptido deseado.

Alternativamente, se puede emplear el corte proteolítico e la proteína de fusión. Carter, en Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, editores Ladisch et al., (American Chemical Society Symposium Series, nº 427, 1990), capítulo 13, páginas 181-193.

Las proteasas tales como el Factor Xa, la trombina y la subtilisina, o sus mutantes, y un cierto número de otras, se han usado con éxito para cortar las proteínas de fusión. Típicamente, se inserta un engarce peptídico, que puede cortarse con la proteasa usada, entre la "otra" proteína (por ejemplo, el dominio Z de la Proteína A) y el péptido deseado. Usando la metodología del ADN recombinante, los pares de bases de nucleótidos que codifican el engarce se insertan entre los genes o fragmentos de genes que codifican las otras proteínas. El corte proteolítico de la proteína de fusión parcialmente purificada que contiene el engarce correcto puede llevarse a cabo a continuación, bien sobre la proteína de fusión nativa, o la proteína de fusión reducida o desnaturalizada.

El péptido puede estar o puede no estar plegado correctamente cuando se expresa como una proteína de fusión. También, el engarce peptídico específico que contiene el sitio de corte puede ser o puede no ser accesible a la proteasa. Estos factores determinan si la proteína de fusión debe desnaturalizarse y plegarse de nuevo, y, de ser así, si estos procedimientos se emplean antes o después del corte.

Cuando se necesita la desnaturalización y plegado de nuevo, el péptido se trata típicamente con un caotropo, tal como la guanidina\cdotHCl, y a continuación se trata con un tampón redox que contiene, por ejemplo, ditiotreitol o glutatión reducido y oxidado en las proporciones, pH y temperatura apropiados, de tal forma que el péptido se pliega de nuevo en su estructura nativa.

Cuando los péptidos no se preparan usando la tecnología del ADN recombinante, preferiblemente se preparan usando la síntesis en fase sólida, tal como la descrita de forma general por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963), aunque pueden emplearse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en el estado de la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del péptido mediante el acoplamiento de un \alpha-aminoácido protegido a una resina apropiada. Un material de partida de ese tipo puede prepararse uniendo un aminoácido con el \alpha-amino protegido, mediante un enlace éster, a una resina clorometilada o a una resina con hidroximetilo, o mediante un enlace amida a una resina BHA o a una resina MBHA. La preparación de la resina con hidroximetilo es descrita por Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38:1597-1598 (1966). Las resinas clorometiladas están disponibles comercialmente en BioRad Laboratories, Richmond, CA y en Lab. Systems, Inc. La preparación de una resina de ese tipo se describe en Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, (Freeman & Co., San Francisco 1969), capítulo 1, pp. 1-6. Los soportes de resina BHA y MBHA están disponibles comercialmente y se usan generalmente sólo cuando el polipéptido deseado que se está sintetizando tiene una amida no sustituida en el extremo C-terminal. Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica para la formación de péptidos. Un procedimiento implica convertir el aminoácido en un derivado que hará al grupo carboxilo más susceptible a la reacción con el grupo amino N-terminal libre del fragmento peptídico. Por ejemplo, el aminoácido puede convertirse en una anhídrido mixto mediante la reacción de un aminoácido protegido con etilcloroformato, fenilcloroformato, sec-butilcloroformato, isobutilcloroformato, cloruro de pivaloilo u otros cloruros de ácido similares. Alternativamente, el aminoácido puede convertirse en un éster activo tal como un éster de 2,4,5-triclorofenilo, un éster de pentaclorofenilo, un éster de pentafluorofenilo, un éster de p-nitrofenilo, un éster de N-hidroxisuccinimida, o un éster formado a partir de la 1-hidroxibenzotriazola.

Otro procedimiento de acoplamiento implica el uso de un agente acoplador apropiado tal como la N,N'-diciclohexilcarbodiimida o N,N'-diisopropil-carbodiimida. Otros agentes acoplantes apropiados, evidentes para los especialistas en la técnica, se describen en E. Gross & J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. I: "Major Methods of Peptide. Bond Formation" (Academic Press, Nueva York, 1979).

Debería reconocerse que el grupo \alpha-amino de cada aminoácido empleado en la síntesis del péptido debe protegerse durante la reacción de acoplamiento para prevenir reacciones secundarias que impliquen su función \alpha-amino activa. Debería reconocerse que ciertos aminoácidos contienen grupos funcionales en la cadena lateral (por ejemplo, sulfhidrilos, aminos, carbonilos e hidroxilos), y que tales grupos funcionales deben protegerse también con grupos protectores apropiados para impedir que ocurra una reacción química en ese sitio durante ambos, los pasos de acoplamiento inicial y los pasos subsiguientes. Los grupos protectores apropiados, conocidos en el estado de la técnica, se describen en Gross y Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, volumen 3: "Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis" (Academic Press, Nueva York, 1981).

En la selección de un determinado grupo protector de la cadena lateral, a usarse en la síntesis de los péptidos, se observan las siguientes reglas generales. Un grupo protector del \alpha-amino, (a) deber hacer inerte la función \alpha-amino en las condiciones empleadas en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser fácilmente eliminable después de la reacción de acoplamiento en condiciones que no eliminarán los grupos protectores de la cadena lateral y que no alterarán la estructura del fragmento peptídico, y (c) debe eliminar la posibilidad de racemización a partir de la activación inmediatamente antes del acoplamiento. Un grupo protector de la cadena lateral, (a) deber hacer inerte el grupo funcional de la cadena lateral en las condiciones empleadas en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser estable en las condiciones empleadas para retirar el grupo protector del \alpha-amino, y (c) debe ser fácilmente eliminable, una vez se haya completado el péptido de aminoácidos, en condiciones de reacción que no alterarán la estructura de la cadena peptídica.

Será evidente para los especialistas en la técnica que los grupos protectores que se sabe son útiles para la síntesis del péptido variarán en su reactividad con los agentes empleados para su eliminación. Por ejemplo, ciertos grupos protectores tales como el trifenilmetilo y el 2-(p-bifenilil)isopropiloxicarbonilo son muy lábiles y pueden cortarse en condiciones ácidas suaves. Otros grupos protectores, tales como el t-butiloxicarbonilo (BOC), t-amiloxicarbonilo, adamantil-oxicarbonilo, y p-metoxibenciloxicarbonilo son menos lábilies y requieren ácidos moderadamente fuertes, tales como el ácido trifluoracético, el clorhídrico, o el trifluoruro de boro en ácido acético, para su eliminación. Aún otros grupos protectores, tales como el bencilozicarbonilo (CBZ o Z), el halobenciloxicarbonilo, el p-nitrobenciloxicarbonilo, el cicloalquilcarbonilo, y el isopropiloxicarbonilo, son incluso menos lábiles y requieren ácidos más fuertes, tales como el fluorhídrico, el bromhídrico, o el trifluoroacetato de boro en ácido trifluoroacético, para su eliminación. Entre las clases útiles de grupos protectores de aminoácidos se incluyen:

(1) para un grupo \alpha-amino, (a) grupos protectores del tipo uretano aromáticos, tales como el fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) CBZ, y el CBZ sustituido, tal como, por ejemplo, el p-clorobenciloxicarbonilo, p-6-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, y p-metoxibenciloxicarbonilo, o-clorobenciloxicarbonilo, 2,4-diclorobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobenciloxicarbonilo, y similares; (b) grupos protectores del tipo uretano alifáticos, tales como el BOC, t-amiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, 2-(p-bifenilil)-isopropiloxicarbonilo, aliloxicarbonilo y similares; (c) grupos protectores del tipo uretano cicloalquilos, tales como el ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, y ciclohexiloxicarbonilo; y d) aliloxicarboniloilo. Los grupos preferidos para la protección del \alpha-amino son el BOC o FMOC.

(2) para el grupo amino de la cadena lateral presente en Lys, la protección puede ser mediante cualquiera de los grupos mencionados más arriba en (1), tales como el BOC, el p-clorobenciloxicarbonilo, etcétera.

(3) para el grupo guanidino de Arg, la protección puede ser mediante nitro, tosilo, CBZ, adamantiloxicarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo ó 2,3,6-trimetil-4-metoxifenilsulfonilo, o BOC.

(4) para el grupo hidroxilo de Ser, Thr, o Tyr, la protección puede ser, por ejemplo, mediante un C1-C4 alquilo, tal como el t-butilo; bencilo (BZL); BZL sustituido, tal como el p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo, o-clorobencilo, y 2,6-diclorobencilo.

(5) para el grupo carboxilo de Asp o Glu, la protección puede ser, por ejemplo, mediante esterificación usando grupos tales como el BZL, t-butilo, ciclohexilo, ciclopentilo, y similares.

(6) para el nitrógeno del imidazol de His, se emplea convenientemente el grupo tosilo.

(7) para el hidroxilo fenólico de Tyr, se emplea apropiadamente un grupo protector tal como el tetrahidropiranilo, ter-butilo, tritilo, BZL, clorobencilo, 4-bromobencilo, ó 2,6-diclorobencilo. El grupo protector preferido es el 2,6-diclorobencilo.

(8) para el grupo amino de la cadena lateral de Asn o Gln, preferiblemente se emplea el xantilo (Xan).

(9) para Met, el aminoácido se deja preferiblemente sin protección.

(10) para el grupo tio de Cys, típicamente se emplea el p-metoxibencilo.

El aminoácido C-terminal, por ejemplo, Lys, se protege en la posición N-aminoácido mediante un grupo protector convenientemente seleccionado, en el caso de Lys, el BOC. El BOC-Lys-OH puede acoplarse entonces primero a la resina con bencilidrilamina o clorometilada de acuerdo con los procedimientos detallados en Horiki et al., Chemistry Letters, 165-168 (1978)) o usando isopropilcarbodiimida a aproximadamente 25ºC durante 2 horas sin agitación. A continuación del acoplamiento del aminoácido protegido con BOC al soporte de resina, se elimina el grupo protector del \alpha-amino, por ejemplo, usando ácido trifluoroacético (TFA) en cloruro de metilo o TFA solo. La desprotección se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0ºC y la temperatura ambiente. Otros agentes de corte estándares, tales como el HCl en dioxano, y las condiciones para la eliminación de grupos protectores \alpha-amino específicos, están descritas en la literatura.

Después de la eliminación del grupo protector \alpha-amino, los restantes aminoácidos con el \alpha-amino y la cadena lateral protegidos se acoplan paso a paso en el orden deseado. Como una alternativa a añadir cada aminoácido por separado en la síntesis, algunos pueden acoplarse entre ellos antes de la adición al sintetizador en fase sólida. La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado se halla dentro de las capacidades del estado de la técnica. Son particularmente apropiados como un reactivo de acoplamiento el N,N'-diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida.

Cada aminoácido o secuencia de aminoácidos protegido se introduce en exceso en el rector de la fase sólida, y el acoplamiento se lleva a cabo de forma apropiada en un medio de dimetilformamida (DMF) o CH_{2}Cl_{2}, o mezclas de los mismos. Si ocurre un acoplamiento incompleto, se repite el procedimiento de acoplamiento antes de la eliminación del grupo protector del N-amino, previa al acoplamiento del siguiente aminoácido. El éxito de la reacción de acoplamiento en cada etapa de la síntesis puede monitorizarse. Un procedimiento preferido para monitorizar la síntesis es mediante la reacción de ninhidrina, tal como es descrita por Kaiser et al., Anal. Biochem, 34:595 (1970). Las reacciones de acoplamiento pueden realizarse automáticamente usando procedimientos bien conocidos, por ejemplo, un sintetizador de péptidos BIOSEARCH 9500^{TM}.

A partir de la finalización de la secuencia peptídica deseada, el péptido protegido debe separarse del soporte de resina, y todos los grupos protectores deben eliminarse. La reacción de corte y la eliminación de los grupos protectores se consigue de forma conveniente simultáneamente o paso a paso. Cuando el soporte de resina es una resina de poliestireno cloro-metilada, el enlace que ancla el péptido a la resina es un enlace éster formado entre el grupo carboxilo libre del residuo C-terminal y uno de los muchos grupos clorometilo presentes sobre la matriz de la resina. Se apreciará que el enlace de anclaje puede cortarse con reactivos que se sabe que son capaces de cortar un enlace éster y de penetrar en la matriz de la resina.

Un procedimiento especialmente conveniente es mediante el tratamiento con fluorhídrico anhidro líquido. Este reactivo, no sólo cortará el péptido de la resina, sino que también eliminará todos los grupos protectores. Por tanto, el uso de este reactivo rendirá directamente el péptido completamente desprotegido. Cuando se usa la resina clorometilada, el tratamiento con fluorhídrico resulta en la formación de los ácidos del péptido libre. Cuando se usa la resina con bencilhidrilamina, el tratamiento con fluorhídrico resulta en las aminas el péptido libre. La reacción con fluorhídrico en presencia de anisol y dimetilsulfuro a 0ºC durante una hora eliminará simultáneamente los grupos protectores de las cadenas laterales y liberará el péptido de la resina.

Cuando se desea separar el péptido sin eliminar los grupos protectores, la resina-péptido protegido puede someterse a metanolisis para rendir el péptido protegido, en el cual el grupo carboxilo C-terminal está metilado. El metiléster se hidroliza a continuación en condiciones alcalinas suaves para proporcionar el grupo carboxilo C-terminal libre. Los grupos protectores de la cadena peptídica se eliminan a continuación mediante tratamiento con un ácido fuerte, tal como el fluorhídrico líquido. Una técnica particularmente útil para la metanolisis es la de Moore et al., Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., editores M. Goodman y J. Meienhofer, (John Wiley, N.Y., 1977), p. 518-521, en la cual la resina-péptido protegido se trata con metanol y cianuro potásico en presencia de un éter de corona.

Otro procedimiento para cortar el péptido protegido de la resina, cuando se emplea la resina clorometilada, es mediante la amoniolisis o mediante el tratamiento con hidrazina. Si se desea, la amida o hidrazida C-terminal resultante puede hidrolizarse al grupo carboxilo C-terminal libre, y los grupos protectores pueden eliminarse de forma convencional.

Se reconocerá también que el grupo protector presente en el grupo \alpha-amino N-terminal puede eliminarse preferentemente, bien antes o después de que el péptido protegido sea separado del soporte.

La purificación de los polipéptidos de esta invención se consigue típicamente usando procedimientos convencionales tales como la HPLC preparativa (incluyendo la HPLC en fase inversa) u otras técnicas cromatográficas conocidas, tales como la permeación en gel, el intercambio iónico, la cromatografía de partición, la cromatografía de afinidad (incluyendo las columnas de anticuerpo monoclonal) o la distribución contracorriente.

Los péptidos de esta invención pueden estabilizarse mediante la polimerización. Esta puede conseguirse entrecruzando cadenas de monómero con agentes entrecruzadores polifuncionales, bien directa o indirectamente, a través de polímeros multifuncionales. Ordinariamente, se entrecruzan en sus extremos C- o N-terminales dos polipéptidos sustancialmente idénticos usando un agente entrecruzador bifuncional. El agente se usa para entrecruzar los grupo amino y/o carboxilo terminal. Generalmente, ambos grupos carboxilo terminales o ambos grupos amino terminales se entrecruzan entre ellos, aunque mediante la selección del agente entrecruzador apropiado, el alfa-amino de un polipéptido se entrecruza con el grupo carboxilo terminal de otro polipéptido. Preferiblemente, los polipéptidos se sustituyen en sus extremos C-terminales con cisteína. En condiciones bien conocidas en el estado de la técnica, puede formarse un enlace disulfuro entre las cisteínas terminales, entrecruzándose de ese modo las cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, los puentes disulfuro se forman convenientemente mediante la oxidación catalizada por metal de las cisteínas libres, o mediante la sustitución nucleofílica de un residuo cisteína apropiadamente modificado. La selección del agente entrecruzador dependerá de las identidades de las cadenas laterales reactivas de los aminoácidos presentes en los polipéptidos. Por ejemplo, no se preferiría el entrecruzamiento mediante disulfuro si la cisteína estuviera presente en el polipéptido en sitios adicionales distintos del extremo C-terminal. También se hallan dentro del ámbito de la presente invención los péptidos entrecruzados con puentes de metileno.

Los sitios de entrecruzamiento apropiados en los péptidos, aparte de los grupos amino N-terminal y carboxilo C-terminal, incluyen los grupos épsilon-amino hallados en los residuos lisina, así como los grupos amino, imino, carbonilo, sulfhidrilo e hidroxilo ubicados en las cadenas laterales de los residuos internos de los péptidos o de los residuos introducidos en las secuencias flanqueadoras. El entrecruzamiento a través de agentes entrecruzadores añadidos externamente se consigue convenientemente, por ejemplo, usando cualquiera de un cierto número de reactivos familiares a los especialistas en la técnica, por ejemplo, a través del tratamiento del polipéptido con carbodiimida. En la literatura se hallan otros ejemplos de agentes entrecruzadores multifuncionales apropiados (ordinariamente, bifuncionales).

Los péptidos de esta invención pueden estabilizarse conformacionalmente mediante la ciclización. Los péptidos se ciclan ordinariamente uniendo covalentemente los dominios N- y C-terminal de un péptido con el dominio correspondiente de otro péptido de esta invención, para formar de ese modo ciclo-oligómeros que contienen dos o más secuencias peptídicas iteradas, en donde cada péptido interno tiene sustancialmente la misma secuencia. Además, los péptidos ciclados (sean ciclo-oligómeros o ciclo-monómeros) se entrecruzan para formar estructuras de 1-3 ciclos que comprenden en ellas de 2 a 6 péptidos. Los péptidos preferiblemente no están unidos covalentemente a través de grupos \alpha-amino y carboxilo de la cadena principal (cabeza con cola), sino que se entrecruzan a través de las cadenas laterales de los residuos ubicados en los dominios N- y C-terminales. Por tanto, los sitios de entrecruzamiento generalmente se darán entre las cadenas laterales de los residuos.

Se conocen por sí mismos muchos procedimientos apropiados para preparar los péptidos mono- o policiclados contemplados en la presente invención. La ciclación Lys/Asp se ha conseguido usando NocBoc-aminoácidos sobre el soporte de la fase sólida, con protección de la cadena lateral con Fmoc/9-fluorenilmetilo (OFm) para Lys/Asp; el proceso se completa mediante el tratamiento con piperidina seguido por ciclación.

Las cadenas laterales de Glu y Lys se han ciclado también en la preparación de péptidos cíclicos o bicíclicos; el péptido se sintetiza mediante la química de la fase sólida sobre una resina con p-metilbencilhidrilamina. Se para el péptido de la resina y se desprotege. El péptido ciclado se forma usando difenilfosforilazida en metilformamida diluida. Para un procedimiento alternativo, consultar Schiller et al., Peptide Protein Res., 25:171-177 (1985). Consultar también la patente estadounidense nº 4.547.489.

Los péptidos entrecruzados o ciclados mediante disulfuro se generan mediante procedimientos convencionales. El procedimiento de Pelton et al., (J. Med. Chem., 29:2370-2375 (1986)) es apropiado, excepto que se produce una mayor proporción de ciclo-oligómeros llevando a cabo la reacción en soluciones más concentradas que la mezcla de reacción diluida descrita por Pelton et al., para la producción de ciclo-monómeros. La misma reacción química es útil para la síntesis de dímeros o ciclo-oligómeros o ciclomonómeros. Son útiles también los puentes de tiometileno. Lebl y Hruby, Tetrahedron Letters, 25:2067-2068 (1984). Consultar también Cody et al., J. Med. Chem., 28:583 (1985).

Los péptidos cíclicos o poliméricos deseados se purifican mediante filtración en gel seguida por cromatografía líquida con presión elevada en fase inversa, u otros procedimientos convencionales. Los péptidos se esterilizan mediante filtración, y se formulan en vehículos convenciones farmacológicamente aceptables.

Los materiales de partida requeridos para los procesos descritos en la presente invención son conocidos en la literatura, o pueden prepararse usando procedimientos conocidos y materiales de partida conocidos.

Si en los péptidos que se están creando, los átomos de carbono unidos a cuatro sustituyentes no idénticos son asimétricos, entonces los compuestos pueden existir como diastereómeros, enantiómeros o mezclas de los mismos. Las síntesis descritas más arriba pueden emplear racematos, enantiómeros, o diastereómeros como materiales de partida o intermediarios. Los productos diastereoméricos que resultan de tales síntesis pueden separarse mediante cristalización o procedimientos cromatográficos. De igual forma, las mezclas de productos enantioméricos pueden separarse usando las mismas técnicas u otros procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Cada uno de los átomos de carbono asimétricos, cuando está presente, puede estar en una o dos configuraciones (R o S), y ambas de hallan dentro del ámbito de la presente invención.

Los compuestos peptídicos descritos en esta invención pueden aislarse como el ácido o la base libres, o convertirse a sales de varios ácidos y bases inorgánicos y orgánicos. Tales sales se hallan dentro del ámbito de esta invención. Los ejemplos de tales sales incluyen las de amonio, sales metálicas como las de sodio, potasio, calcio y magnesio; sales con bases orgánicas como la diciclohexilamina, la N-metil-D-glucamina y similares; y sales con aminoácidos como la arginina o lisina. Las sales con ácidos inorgánicos u orgánicos pueden prepararse de igual modo, por ejemplo, usando clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, trifluoroacético, metanosulfónico, málico, maleico, fumárico y similares. Las sales no tóxicas y fisiológicamente compatibles son particularmente útiles, aunque otras sales menos deseables pueden tener uso en los procedimientos de aislamiento y purificación.

Un cierto número de procedimientos son útiles para la preparación de las sales descritas más arriba y son conocidos por los especialistas en la técnica. Los ejemplos incluyen la reacción de la forma de ácido libre o de base libre del péptido con uno o más equivalentes molares del ácido o base deseado, en un solvente o mezcla de solventes en las que la sal es insoluble; o en un solvente como el agua, tras lo cual el solvente se elimina mediante evaporación, destilación o liofilización. Alternativamente, la forma de ácido o base libre del producto puede hacerse pasar a través de una resina de intercambio iónico para formar la sal deseada, o una forma de sal del producto puede convertirse en otra usando el mismo proceso general.

Ciertos esquemas específicos que pueden ser apropiados para la síntesis química de los péptido en la presente invención se muestran en WO 96/15148, publicada el 23 de mayo de 1996, los descubrimientos de la cual se incorporan en la presente invención por referencia.

Los péptidos de esta invención pueden administrarse al mamífero mediante cualquier técnica apropiada, incluyendo las rutas de administración oral, parenteral (por ejemplo, inyección o infusión o implante intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea), nasal, pulmonar, vaginal, rectal, sublingual, o tópica, y puede formularse en formas de dosificación apropiadas para cada ruta de administración. La ruta de administración específica dependerá, por ejemplo, de la historia médica del paciente, incluyendo cualesquier efectos secundarios percibidos o anticipados al usar el compuesto, del tipo de péptido que se esté administrando, y del trastorno concreto a corregirse. Opcionalmente, la administración es mediante infusión continua (usando, por ejemplo, dispositivos de liberación lenta, o minibombas tales como las bombas osmóticas o los parches cutáneos), o mediante inyección (usando, por ejemplo, medios intravenosos o subcutáneos).

C. Preparación de las formulaciones típicas de la invención

En la preparación de una formulación típica de la presente invención, se destaca que la calidad o "grado" recomendado de los componentes empleados dependerá del uso final de la formulación. Para los usos terapéuticos, se prefiere que el componente o componentes sean de un grado (tal como "GRAS") permitido como aditivo para los productos farmacéuticos.

En ciertas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden el péptido unidor del receptor del Apo-2L, y uno o más excipientes, los cuales proporcionan la fuerza iónica suficiente para potenciar la solubilidad y/o estabilidad del péptido unidor del receptor del Apo-2L, en donde la composición tiene un pH desde 6 (o aproximadamente 6) hasta 9 (o aproximadamente 9). El péptido unidor del receptor de unión del Apo-2L puede prepararse mediante cualquier procedimiento apropiado para conseguir la pureza deseada de la proteína, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos anteriores. En ciertas realizaciones, el péptido unidor del receptor del Apo-2L se expresa de forma recombinante en células huéspedes E. coli o se prepara mediante síntesis química. La concentración del péptido unidor del receptor del Apo-2L en la formulación puede variar dependiendo, por ejemplo, del uso al que está destinada la formulación. Los especialistas en el campo pueden determinar, sin experimentación innecesaria, la concentración deseada del péptido unidor del receptor del Apo-2L.

El excipiente o excipientes en las formulaciones, los cuales proporcionan la fuerza iónica suficiente para potenciar la solubilidad y/o estabilidad del péptido unidor del receptor del Apo-2L, son opcionalmente un ácido orgánico o inorgánico poliiónico, aspartato, sulfato sódico, succinato sódico, acetato sódico, cloruro sódico, Captisola^{TM}, Tris, sal de arginina u otros aminoácidos, azúcares y polioles tales como la trehalosa y la sacarosa. Preferiblemente, el excipiente o excipientes en las formulaciones que proporcionarán una fuerza iónica suficiente es una sal. Las sales que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a las sales de sodio y las sales de arginina. El tipo de sal empleado y la concentración de la sal son preferiblemente tales que la formulación tiene una fuerza iónica relativamente elevada, lo que permite que el péptido unidor del receptor del Apo-2L sea estable en la formulación. Opcionalmente, la sal está presente en la formulación a una concentración desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 0,5 M.

La composición preferiblemente tiene un pH de 6 (o aproximadamente 6) hasta 9 (o aproximadamente 9), más preferiblemente desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5, y aún más preferiblemente desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 7,5. En un aspecto preferido de esta realización, la composición comprenderá además un tampón para mantener el pH de la composición al menos desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8. Los ejemplos de tampones que pueden emplearse incluyen pero no se limitan a Tris, HEPES e histidina. Cuando se emplea Tris, el pH puede opcionalmente ajustarse a desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8,5. Cuando se emplea HEPES o histidina, el pH puede opcionalmente ajustarse a desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 7. Opcionalmente, el tampón se emplea a una concentración desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 50 mM en la formulación, y preferiblemente a una concentración desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 20 mM.

Puede ser deseable incluir uno o más tensioactivos en la composición, particularmente en las formulaciones líquidas (o las formulaciones liofilizadas reconstituidas). Tales tensioactivos pueden comprender, por ejemplo, un tensioactivo no iónico como el TWEEN^{TM} o el PLURONICS^{TM} (por ejemplo, el polisorbato o poloxámero). Preferiblemente, el tensioactivo incluye polisorbato 20 ("Tween 20"). El tensioactivo se empleará opcionalmente a una concentración desde aproximadamente el 0,005% hasta aproximadamente el 0,2%.

Las formulaciones de la presente invención pueden incluir, además del péptido unidor del receptor del Apo-2L y aquellos componentes descritos más arriba, otros varios excipientes o componentes adicionales. Opcionalmente, la formulación puede contener, para la administración parenteral, un portador farmacéutica o parenteralmente aceptable, es decir, uno que no es tóxico para los destinatarios en las dosis y concentraciones empleadas, y que es compatible con otros ingredientes en la formulación. Opcionalmente, el portador es un portador parenteral, tal como una solución que es isotónica con la sangre del destinatario. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen el agua, la solución salina o una solución salina tamponada, tal como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), la solución de Ringer^{TM}, y la solución de dextrosa. Varios portadores, excipientes o estabilizantes opcionales, farmacéuticamente aceptables, se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol A. ed. (1980).

Las formulaciones en la presente invención también pueden contener uno o más conservantes. Los ejemplos incluyen el cloruro de octadecildimetilbencilamonio, el cloruro de hexametonio, el cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los cuales los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y el cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos, alquilparabenes, tales como el metil o propilparabén, y el m-cresol. Los antioxidantes incluyen el ácido ascórbico y la metionina; los conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencetonio; el alcohol butílico; los alquilparabenos tales como el metil o propilparaben; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol; y el m-cresol); los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); las proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; los azúcares tales como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; o el polietilenglicol (PEG).

Los ejemplos adicionales de tales portadores incluyen la lecitina, las proteínas del suero, tales como la albúmina del suero humana, las sustancias tamponantes, tales como la glicina, el ácido sórbico, el sorbato potásico, las mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, el agua, las sales, o electrolitos tales como el sulfato de protamina, el cloruro sódico, la polivinilpirrolidona, y las sustancias basadas en la celulosa. Los portadores para las formas basadas en geles incluyen los polisacáridos tales como la carboximetilcelulosa sódica o la metilcelulosa, la polivinilpirrolidona, los poliacrilatos, los polímeros del bloque polioxietileno-polioxipropileno, el polietilenglicol, y los alcoholes de ceras de la madera. Las formas de depósito convencionales incluyen, por ejemplo, la microcápsulas, las nanocápsulas, los liposomas, los esparadrapos, las formas para inhalación, los atomizadores nasales, y las preparaciones de liberación sostenida.

Las composiciones de la invención pueden comprender formulaciones líquidas (soluciones líquidas o suspensiones líquidas), y formulaciones liofilizadas, así como formulaciones en suspensión, en las cuales el péptido unidor del receptor del Apo-2L está en forma de cristales o de precipitado amorfo.

La formulación final, si es un líquido, se almacena preferiblemente congelada a -20ºC. Alternativamente, la formulación puede liofilizarse y proporcionarse como un polvo para su reconstitución con agua para inyecciones, que puede almacenarse opcionalmente a 2-30ºC.

La formulación a usarse para administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estéril (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tienen un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica).

La composición ordinariamente se almacenará en contenedores monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para su reconstitución. Los contenedores pueden ser cualesquier contenedores disponibles en la técnica y pueden llenarse usando procedimientos convencionales. Opcionalmente, la formulación puede incluirse en un dispositivo lápiz inyector (o en un cartucho que encaja dentro de un lápiz inyector), tal como los disponibles en la técnica (consultar, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.370.629), que son apropiados para el suministro terapéutico de la formulación. Como un ejemplo de formulación liofilizada, se rellenan viales de 10 ml con 5,5 ml de una solución esterilizada mediante filtración de péptido unidor del receptor del Apo-2L al 2% (p/v), y la mezcla resultante se liofiliza. Una solución para inyección puede prepararse reconstituyendo la formulación liofilizada del péptido unidor del receptor del Apo-2L usando, por ejemplo, agua para inyecciones.

D. Procedimientos de uso y otra aplicación

Los péptidos unidores del receptor del Apo-2L descritos en la presente invención pueden emplearse para la fabricación de un medicamento/composición que tiene uso en una variedad de aplicaciones terapéuticas y no terapéuticas. Entre estas aplicaciones se encuentran los procedimientos para tratar trastornos, tales como el cáncer, las condiciones relacionadas con la inmunidad, o las condiciones víricas. Tales aplicaciones terapéuticas y no terapéuticas se describen adicionalmente en, por ejemplo, WO97/25428, WO97/01633, y WO 01/22987.

La invención contempla el uso de la terapia génica para tratar un mamífero usando ácido nucleico que codifica el péptido unidor del receptor del Apo-2L. Los ácidos nucleicos que codifican el péptido unidor del receptor del Apo-2L pueden usarse para este propósito. Una vez se conoce la secuencia de aminoácidos, se pueden generar varias moléculas de ácido nucleico usando la degeneración del código genético, y seleccionar cuál se usará para la terapia génica.

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Hay dos estrategias principales para introducir el ácido nucleico (contenido opcionalmente en un vector) dentro de las células de los pacientes con propósito de terapia génica: in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en el sitio en el que se requiere el compuesto del péptido unidor del receptor del Apo-2L. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en las células aisladas y las células modificadas se administran al paciente, bien directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas, las cuales se implantan dentro del paciente. Consultar, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 4.892.538 y 5.283.187.

Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos dentro de células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro, o in vivo a las células del huésped previsto. Las técnicas apropiadas para la transferencia del ácido nucleico dentro de células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, la DEAE-dextrano, el procedimiento de la precipitación con fosfato cálcico, etcétera. Un vector usado comúnmente para el suministro ex vivo del gen es un retrovirus.

Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores víricos (tales como el adenovirus, el virus del Herpes simplex I, o los virus adeno-asociados) y los sistemas basados en lípidos (los lípidos útiles para la transferencia del gen mediada por lípidos son, por ejemplo, el DOTMA, la DOPE y la DC-Chol). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente del ácido nucleico con un agente que apunte hacia las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor sobre la célula diana, etcétera. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis pueden usarse para apuntar y/o facilitar la captación, por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas que sean trópicos para un tipo celular determinado, anticuerpos contra proteínas que experimentan internalización al ciclarse, y proteínas que apuntan a la localización intracelular y potencian la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por un receptor es descrita, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de construcción de genes y terapia génica actualmente conocidos, consultar Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992). Consultar también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.

En los procedimientos de la invención para tratar un trastorno, una formulación del péptido unidor del receptor del Apo-2L puede administrarse directamente al mamífero mediante cualquier técnica apropiada, incluyendo la infusión o inyección. La ruta de administración específica dependerá, por ejemplo, de la historia médica del paciente, incluyendo cualesquier efectos secundarios percibidos o anticipados al usar péptido unidor del receptor del Apo-2L, y del trastorno concreto a corregirse. Los ejemplos de administración parenteral incluyen la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial e intraperitoneal de la composición. Las formulaciones se administran preferiblemente como inyecciones o infusiones intravenosas (i.v.), subcutáneas (s.c.), intramusculares (i.m.) repetidas, como infusiones intracraneales o como formulaciones en aerosol apropiadas para un suministro intranasal o intrapulmonar (para suministro intrapulmonar consultar, por ejemplo, la EP 257.956).

Se destaca que la presión osmótica de las inyecciones puede se importante en la inyección subcutánea e intramuscular. Las soluciones inyectables, cuando son hipotónicas o hipertónicas, pueden causar dolor a un paciente a partir de su infusión. Usualmente, para las formulaciones terapéuticas inyectables en la presente invención, se prefiere que la osmolaridad relativa de la solución inyectable sea desde aproximadamente 300 mosm hasta aproximadamente 600 mosm.

El péptido unidor del receptor del Apo-2L puede administrarse también en forma de preparaciones orales o de liberación sostenida. Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continua incluyen los derivados de la celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa), acetato isobutirato de sacarosa (SABER^{TM}) en medio no acuoso, los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982) o poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), el etilenvinilacetato no degradable (Langer et al., ver más arriba), los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). Un procedimiento opcional de suministro para fármacos que actúan de forma sistémica implica la administración mediante infusión continua (usando, por ejemplo, dispositivos de liberación lenta, o minibombas tales como las bombas osmóticas o los parches cutáneos), o mediante inyección (usando, por ejemplo, medios intravenosos o subcutáneos, incluyendo la administración en embolada simple).

La composición a usarse en la terapia se formulará y dosificará de forma consistente con la buena práctica médica, tomando en consideración la condición clínica del paciente individual, el sitio de suministro de la composición, el procedimiento de administración, el calendario de la administración, y otros factores conocidos por los médicos. Las "cantidades efectivas" de cada componente para los propósitos en la presente invención se determinan, por tanto, en base a tales consideraciones, y son cantidades que resultan en la biodisponibilidad del péptido unidor del receptor del Apo-2L u otros fármacos para el mamífero.

Se contempla que pueden emplearse otras terapias adicionales en los procedimientos. La otra terapia o terapias pueden incluir, pero no se limitan a la administración de terapia de radiación, citocina(s), agente(s) inhibidor(es) del crecimiento, agente(s) quimioterapéutico(s), agente(s) citotóxico(s), inhibidores de la tirosina quinasa, inhibidores de la transferasa ras farnesil, inhibidores de la angiogénesis, e inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina, los cuales son conocidos en el campo y se definen adicionalmente de forma particular en la SECCIÓN 1 anterior, y pueden administrarse en combinación (por ejemplo, de forma concurrente o secuencial) con el péptido o péptidos unidores del receptor del Apo-2L. Además, las terapias basadas en anticuerpos terapéuticos que apuntan a los antígenos del tumor u otras células, tales como los anticuerpos contra el CD20 (incluyendo el Rituxan^{TM}) o los anticuerpos contra el receptor Her (incluyendo la Hercepetina^{TM}), así como los anticuerpos anti-angiogénicos tales como el anti-VEGF, o los anticuerpos que apuntan a los receptores del Apo2L, tales como el DR5 o el DR4.

La preparación y programación de la dosificación para los agentes quimioterapéuticos puede usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o según determine empíricamente el médico capacitado. La preparación y los programas de dosificación para tal quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service, editor M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Puede ser deseable administrar también anticuerpos contra otros antígenos, tales como los anticuerpos que se unen al CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, al factor endotelial vascular (VEGF), u otros miembros de la familia del TNFR (tales como el OPG, TNFR1, TNFR2). Alternativamente, o además, podrían coadministrarse al pacientes dos o más anticuerpos que se unen al mismo o a dos o más antígenos diferentes descritos en la presente. A veces, podría ser beneficioso administrar también una o más citocinas al paciente.

La formulación del péptido unidor del receptor del Apo-2L puede administrarse en cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos en esta solicitud, por ejemplo, de forma concurrente o secuencial, en combinación con otros agentes, citocinas, quimioterapias, anticuerpos, etcétera, que, por ejemplo, se proporcionan específicamente en la anterior sección "Definiciones" de la solicitud. Por ejemplo, la formulación del péptido unidor del receptor del Apo-2L puede administrarse como un pre-tratamiento (antes de la administración de cualquier de tales otros agentes), tal como un pre-tratamiento de las células cancerosas, las cuales de otro modo pueden ser resistentes a los efectos apoptóticos de otros agentes terapéuticos.

Tal como se ha destacado más arriba, los péptidos unidores del receptor del Apo-2L de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, pueden emplearse péptidos agonistas del DR5 en procedimientos para tratar condiciones patológicas en mamíferos, tales como el cáncer o las enfermedades inmunitarias. En los procedimientos, el péptido unidor del DR5, preferiblemente un péptido unidor agonista, se administra a un mamífero, solo o en combinación con aún otros agentes o técnicas terapéuticos.

La diagnosis en mamíferos de las diversas condiciones patológicas descritas en la presente puede ser hecha por el médico capacitado. Hay disponibles en el campo técnicas diagnósticas que permiten, por ejemplo, la diagnosis o detección del cáncer o la enfermedad inmunitaria en un mamífero. Por ejemplo, los cánceres pueden identificarse a través de técnicas que incluyen, pero no se limitan a la palpación, el análisis de sangre, los rayos-X, la RMN y similares. Las enfermedades relacionadas con la inmunidad también pueden identificarse fácilmente. En el lupus eritematoso sistémico, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos auto-reactivos contra proteínas/tejidos propios y la generación subsiguiente de inflamación inmunomediada. Hay múltiples órganos y sistemas afectados clínicamente, incluyendo los riñones, pulmones, sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre.

Los facultativos médicos están familiarizados con un cierto número de enfermedades en las que la intervención en la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria proporciona beneficios. Por ejemplo, la artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune, sistémica y crónica, que implica principalmente la membrana sinovial de múltiples articulaciones, con lesión resultante del cartílago articular. La patogénesis es dependiente del linfocito T y está asociada con la producción de factores reumatoides, auto-anticuerpos dirigidos contra la IgG propia, con la formación resultante de inmunocomplejos que alcanzan niveles elevados en el fluido articular y en la sangre. Estos complejos pueden inducir en la articulación la infiltración muy perceptible de linfocitos y monocitos dentro del sinovio, y los marcados cambios sinoviales subsiguientes; el espacio/fluido articular es infiltrado por células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Los tejidos afectados son principalmente las articulaciones, a menudo en un patrón simétrico. Sin embargo, también ocurre la enfermedad extra-articular en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extra-articulares con enfermedad articular progresiva en curso, y lesiones típicas de la fibrosis pulmonar, la vasculitis, y las úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extra-articular es el denominado síndrome de Felty, el cual ocurre más tarde en el curso de la enfermedad RA, a veces después de que la enfermedad articular haya pasado a estar quiescente, e implica la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto puede ir acompañado por vasculitis en múltiples órganos con formaciones de infartos, úlceras de la piel y gangrena. Los pacientes desarrollan a menudo nódulos reumatoides en el tejido subcutis que recubre las articulaciones afectadas; en etapas más tardías, los nódulos tienen centros necróticos rodeados por un infiltrado celular inflamatorio mixto. Otras manifestaciones que pueden ocurrir en la RA incluyen: la pericarditis, la pleuritis, la arteritis crónica, la neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, la queratoconjuntivitis sicca, y los nódulos reumatoides.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que empieza a menudo con menos de 16 años de edad. Su fenotipo tiene ciertas similitudes con la RA; algunos pacientes que son positivos para el factor reumatoide se clasifican como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser grave y es típicamente destructiva, y conduce a la anquilosis articular y al crecimiento retardado. Otras manifestaciones incluyen la uveitis anterior crónica y la amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos con algunas características clínicas comunes, y la asociación común con la expresión del producto del gen HLA-B27. Los trastornos incluyen: la espondilitis anquilosante, el síndrome de Reiter (artritis reactiva), la artritis asociada con la enfermedad inflamatoria del intestino, la espondilitis asociada con la psoriasis, el inicio juvenil de la espondiloartropatía y la espondiloartropatía indiferenciada. Las características distintivas incluyen la sacroileitis con o sin espondilitis; la artritis inflamatoria asimétrica; la asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B del MCH de la clase I); la inflamación ocular, y la ausencia de anticuerpos asociados con otras enfermedades reumatoides. La célula más implicada como clave para la inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8+, una célula que apunta a antígenos presentados por moléculas del MHC de la clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo HLA-B27 del MHC de la clase I como si fuera un péptido extraño expresado por moléculas de la clase I del MHC. Se ha hipotetizado que un epítopo de HLA-B27 puede imitar un epítopo antigénico de bacteria u otro epítopo antigénico de microbio y, por tanto, inducir una respuesta de células T CD8+.

La esclerosis sistémica (esclerodermia) tiene una etiología desconocida. Una marca característica de la enfermedad es la induración de la piel; probablemente, ésta es inducida por un proceso inflamatorio activo. La esclerodermia puede ser localizada o sistémica; las lesiones vasculares son comunes, y la lesión de las células endoteliales de la microvasculatura es un suceso temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede ser inmunomediada. Está implicada una base inmunológica, debido a la presencia de infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y por la presencia de anticuerpos antinucleares en muchos pacientes. La ICAM-1 está a menudo regulada al alza sobre la superficie celular de los fibroblastos en las lesiones de la piel, sugiriendo que la interacción de las células T con estas células puede tener un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos implicados incluyen: el tracto gastrointestinal: la atrofia del músculo liso y la fibrosis resultan en una peristalsis/movilidad anormal; el riñón: la proliferación concéntrica de la intima subendotelial que afecta las pequeñas arterias arcuatas e interlobulares puede resultar en un flujo de sangre cortical renal reducido y, por tanto, en proteinuria, azotemia e hipertensión; el músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; el pulmón: neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y el corazón: necrosis de la banda de contracción, cicatrización/fibrosis.

Las miopatías inflamatorias idiopáticas, incluyendo la dermatomiositis, la polimiositis y otras, son trastornos de la inflamación crónica del músculo, de etiología desconocida, que resultan en debilidad muscular. La lesión/inflamación del músculo es a menudo simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis están dirigidos contra e inhiben la función de los componentes, proteínas y ARN, implicados en la síntesis proteica.

El síndrome de Sjögren se debe a la inflamación inmunomediada y subsiguiente destrucción funcional de las glándulas lacrimales y de las glándulas salivares. Esta enfermedad puede estar asociada con, o acompañada por enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad está asociada con la producción de autoanticuerpos contra los antígenos Ro y La, los cuales son ambos complejos pequeños de ARN-proteína. Las lesiones resultan en queratoconjuntivitis sicca, xerostomia, y otras manifestaciones o asociaciones, incluyendo la cirrosis biliar, la neuropatía periférica o sensorial, y la púrpura palpable.

Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las que la lesión primaria es la inflamación y subsiguiente lesión de los vasos sanguíneos, lo que resulta en la isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos suministrados por los vasos afectados, y la eventual disfunción final del órgano en algunos casos. Las vasculitis pueden ocurrir también como una lesión secundaria o secuela de otras enfermedades inflamatorias inmunomediadas, tales como la artritis reumatoide, la esclerosis sistémica, etc., particularmente en enfermedades asociadas también con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades en el grupo de la vasculitis sistémica primaria incluyen: la vasculitis sistémica necrosante, la poliarteritis nudosa, la angitis alérgica y la granulomatosis, la poliangis, la granulomatosis de Wegener; la granulomatosis linfomatoide; y la arteritis de células gigantes. Las diversas vasculitis incluyen: el síndrome del nodo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de Kawasaki), la vasculitis aislada del SNC, la enfermedad de Behet, la tromboangitis obliterante (enfermedad de Buerger) y la venulitis necrosante cutánea. Se cree que el mecanismo patogénico de la mayoría de los tipos de vasculitis listados se debe principalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso, y en la inducción subsiguiente de una respuesta inflamatoria bien a través de la ADCC, bien de la activación del complemento, o ambas.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido en el cuerpo; la implicación del pulmón es la más común. La patogénesis implica la persistencia de macrófagos activados y células linfoides en los sitios de la enfermedad, con la subsiguiente secuela crónica que resulta de la liberación de productos local y sistémicamente activos, liberados por estos tipos celula-
res.

La anemia hemolítica autoinmune, incluyendo la anemia hemolítica autoinmune, la pancitopenia inmune, y la hemoglobinuria paroxística nocturna, es una consecuencia de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados sobre la superficie de los glóbulos rojos (y en algunos casos otras células sanguíneas, incluyendo también las plaquetas) y es un reflejo de la supresión de estas células recubiertas por anticuerpos a través de la lisis mediada por el complemento y/o por los mecanismos mediados por el ADCC/receptor Fc.

En la trombocitopenia autoinmune, incluyendo la púrpura trombocitopénica, y la trombocitopenia inmunomediada en otras situaciones clínicas, la destrucción/eliminación de las plaquetas ocurre a resultas de la unión del anticuerpo o complemento a las plaquetas, y la eliminación subsiguiente por mecanismos mediados por la lisis de complemento, por la ADCC o por el receptor-Fc.

La tiroiditis, incluyendo la enfermedad de Grave, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis juvenil linfocítica y la tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta autoinmune contra antígenos de la tiroides con producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes en, y a menudo específicas de la glándula tiroides. Existen modelos experimentales, incluyendo modelos espontáneos: en ratas (ratas BUF y BB) y en pollos (cepa de pollos obesos); modelos inducibles: inmunización de los animales con tiroglobulina, antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa
tiroidea).

La diabetes mellitus del tipo I o diabetes dependiente de la insulina es la destrucción autoinmune de las células \beta de los islotes pancreáticos; esta destrucción está mediada por autoanticuerpos y células T autoreactivas. Los anticuerpos contra la insulina o el receptor de la insulina pueden producir también el fenotipo de no respuesta a la insulina.

Las enfermedades renales inmunomediadas, incluyendo la glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, son el resultado de la lesión del tejido renal mediada por anticuerpos o linfocitos T, bien directamente, a resultas de la producción de anticuerpos autoreactivos o de células T contra antígenos renales, o indirectamente, a resultas del depósito en el riñón de anticuerpos y/o complejos inmunes que reaccionan contra otros antígenos no renales. Por tanto, otras enfermedades inmunomediadas que resultan en la formación de inmunocomplejos pueden inducir también una enfermedad renal inmunomediada como secuela indirecta. Tanto los mecanismos inmunes directos como los indirectos resultan en una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de una lesión en los tejidos renales, con el resultado del deterioro de la función del órgano y, en algunos casos, la progresión hacia el fallo renal. Ambos, mecanismos inmunes humorales y celulares pueden estar implicados en la patogénesis de las lesiones.

Se cree que las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo la esclerosis múltiple, la polineuropatía idiopática desmielinizante o síndrome de Guillain-Barre, y la polineuropatía inflamatoria crónica desmielinizante, tienen una base autoinmune y resultan en la desmielinización del nervio a resultas del daño causado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. En la MS hay evidencia que sugiere que la inducción y progresión de la enfermedad depende de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante que es dependiente de los linfocitos T, que tiene, o un curso recurrente-remitente o un curso progresivo crónico. La etiología es desconocida; sin embargo, todos contribuyen: las infecciones víricas, la predisposición genética, el entorno y la autoinmunidad. Las lesiones contienen infiltrados de, predominantemente, células microgliales y macrófagos infiltrantes mediados por linfocitos T; los linfocitos T CD4+ son el tipo celular predominante en las lesiones. El mecanismo de la muerte de las células oligodendrocitos y la desmielinización subsiguiente no se conoce, pero es probable que esté dirigido por los linfocitos T.

La enfermedad pulmonar inflamatoria y fibrótica, incluyendo las neumonías eosinofílicas, la fibrosis idiopática pulmonar, y la neumonitis por hipersensibilidad podrían implicar una respuesta inmuno-inflamatoria desregulada. La inhibición de esta respuesta tendría un beneficio terapéutico.

Las enfermedades de la piel autoinmunes o inmuno-mediadas, incluyendo las enfermedades de la piel ampollosa, el eritema multiforme, y la dermatitis por contacto, están mediadas por auto-anticuerpos, la génesis de los cuales depende de los linfocitos T.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células procesadores de antígeno, y algunos neutrófilos.

Las enfermedades alérgicas, incluyendo el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad a la comida, y la urticaria, son dependientes de linfocitos T. Estas enfermedades son predominantemente mediadas por la inflamación inducida por linfocitos T, la inflamación mediada por IgE o una combinación de ambas.

Las enfermedades asociadas con los trasplantes, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad del injerto-contra-el huésped (GVHD) son linfocito-T dependientes; la inhibición de la función de los linfocitos T es aliviadora.

Otras enfermedades en las que la intervención de la respuesta inmunitaria y/o inflamatoria proporciona beneficio son las enfermedades infecciosas, incluyendo pero no limitándose a la infección vírica (incluyendo pero no limitándose al SIDA, hepatitis A, B, C, D, E), la infección bacteriana, las infecciones por hongos, y las infecciones por protozoos o parásitos (la molécula (o derivados/agonistas) que estimulan el MLR pueden utilizarse terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune contra agentes infecciosos), las enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/agonistas) que estimulan el MLR pueden utilizarse terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune en condiciones de inmunodeficiencia heredada, adquirida, inducida por infección (como en la infección por el VIH) o iatrogéncia (es decir, como procedente de la quimioterapia) y de neoplasia.

También se proporciona un procedimiento para predecir la afinidad relativa por la unión a un ligando de un péptido que compite con un polipéptido por la unión al ligando, en el cual el péptido que se deriva de una biblioteca exhibida sobre fago, en el cual el procedimiento comprende incubar un clon de fagómido correspondiente al péptido con el polipéptido en presencia del ligando, diluir seriadamente el fago, y medir el grado con el que es inhibida la unión del clon de fagómido al ligando por el péptido, en donde el clon de fagómido que es inhibido sólo a bajas concentraciones de fago tiene una afinidad mayor por el ligando que un clon de fagómido que es inhibido tanto a bajas como a elevadas concentraciones de fago.

En la presente invención también se proporcionan procedimientos diagnósticos. Por ejemplo, los péptidos unidores del receptor del Apo-2L pueden emplearse para detectar los respectivos receptores DR4 o DR5 en mamíferos que se sabe o se sospecha tienen una condición patológica relacionada con el Apo-2L, DR4 o DR5. Los péptidos unidores pueden usarse, por ejemplo, en ensayos para detectar o cuantificar el DR4 o DR5 en una muestra. Se puede incubar una muestra, tal como las células obtenidas de un mamífero, en presencia de péptido unidor marcado, y se puede realizar la detección del péptido unidor marcado unido en la muestra. Tales ensayos, incluyendo varios procedimientos de ensayo clínicos, son conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, como se describen en Voller et al., Immunoassays, University Park, 1981.

La invención también proporciona equipos que incluyen los péptidos unidores del receptor del Apo-2L descritos en la presente invención. Un equipo típico comprenderá un contenedor, preferiblemente un vial, para el péptido unidor del receptor del Apo-2L en uno o más excipientes, como se describió más arriba; e instrucciones, tal como un inserto en el producto o una etiqueta, que dirigirá al usuario sobre cómo emplear la formulación del péptido unidor del receptor del Apo-2L. Esto proporcionará preferiblemente una formulación farmacéutica. Preferiblemente, la formulación farmacéutica es para tratar el cáncer o una condición relacionada con la inmunidad. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, las botellas, los viales, las jeringas y los tubos de ensayo. Los contenedores pueden formarse a partir de una variedad de materiales, tales como el vidrio o el plástico. El contenedor contiene una formulación del péptido unidor del receptor del Apo-2L que es efectiva para diagnosticar o tratar el trastorno, y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Las marca sobre, o asociada al contenedor indica que la formulación se usa para diagnosticar o tratar el trastorno escogido. El artículo manufacturado puede comprender además un segundo contenedor que comprende agua para inyecciones, una solución farmacéuticamente aceptable, una solución salina, una solución de Ringer, o una solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos del paquete con instrucciones para su uso.

Todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones, descripciones de productos, y protocolos se citan a lo largo de esta solicitud, y sus descubrimientos se incorporan en la presente invención por referencia en su totalidad.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en modo alguno. Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas en los ejemplos siguientes y a lo largo de la memoria, mediante números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia.

Ejemplo 1 Los péptidos derivados de fagos se unen a los receptores del Apo-2L

En el siguiente conjunto de ejemplos, los \alpha-aminoácidos comunes pueden describirse mediante el código estándar de una o tres letras cuando se refieren a intermediarios y productos finales. Por \alpha-aminoácidos comunes se quiere indicar aquellos aminoácidos incorporados en las proteínas bajo la dirección del ARNm. Las abreviaturas estándares se listan en The Merck Index, 10ª edición, pp Misc-2 - Misc-3. A menos que se indique lo contrario, los \alpha-aminoácidos comunes tiene la configuración "L" o natural en el átomo de carbono alfa. Si el código está precedido por una "D", esta significa el enantiómero opuesto del \alpha-aminoácido común. Los \alpha-aminoácidos modificados o inusuales, tales como la norleucina (Nle) y la ornitina (Orn) se designan tal como se describe en la U.S. Patent and Trademark Office Official Gazette, 1114 TMOG, del 15 de mayo de 1990.

Se ha mostrado que los péptidos que se unen específicamente y con una afinidad medible a las moléculas dianas, tales como las proteínas, pueden identificarse, a partir de una biblioteca de michos péptidos unidores y no unidores, a través de selecciones mediante unión usando fusiones con proteínas de la cubierta de bacteriófagos. Smith, Science, 228:1315 (1985); Scott y Smith, Science, 249:386 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:309 (1990); Devlin et al., Science, 249:404 (1990); revisadas por Wells y Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 2:597 (1992); patente estadounidense nº 5.223.409. Además, puede potenciarse la afinidad de ambos, las proteínas y los péptidos exhibidos sobre fagos, a través de ciclos iterativos de mutaciones, selección y propagación.

Pueden construirse bibliotecas de péptidos que difieren en su secuencia en determinadas posiciones de residuos usando oligodesoxinucleótidos sintéticos Los péptidos se exhiben como proteínas de fusión con una proteína de la cubierta del fago (tal como la g3p o la g8p) sobre partículas de bacteriófagos, cada una de las cuales contiene un genoma de ADN de hebra simple que codifica la variante de péptido concreta. Después de varios ciclos de purificación por afinidad, usando una molécula diana inmovilizada, se aíslan clones individuales de bacteriófagos, y se deduce la secuencia de aminoácidos de sus péptidos exhibidos a partir de sus secuencias de ADN. I. Construcción de bibliotecas de péptidos-fagos.

Para identificar las moléculas peptídicas que tuvieran la capacidad de unirse a un receptor del Apo-2L tal como el DR4 o DR5, se construyeron varias diversas bibliotecas de péptidos en fagos, de longitud que oscilaba desde aproximadamente los 12 hasta aproximadamente los 24 residuos aminoácidos. Los péptidos de esta longitud o tamaño se escogieron, en parte, para tender a favorecer la selección de péptidos capaces de mantener estructuras bien definidas en solución. Los péptidos de aminoácidos naturales de este tamaño tienen una diversidad de secuencia potencial de 2018-2020 (es decir, 2,6 \times 1023 a 1,0 \times 1026) variantes. Ciertos residuos fueron fijos o constantes, aquellos que se esperaba que permitieran o promovieran los elementos estables de la estructura del péptido, tales como los enlaces disulfuro o los giros beta, dentro de cada péptido.

Como plantilla para las construcciones de la biblioteca se usó un plásmido, el pt4.g8, que expresa péptido reconocible por anticuerpo (gDtag) fusionado a la g8p del bacteriófago M13. Este plásmido contiene orígenes de replicación del ADN de hebra simple y doble hebra. El promotor phoA y las secuencias señalizadoras de secreción STII se hallan cadena arriba del péptido gD (subrayado más abajo), el cual está seguido por un péptido de "engarce" (doble subrayado más abajo), y a continuación por la g8p del bacteriófago M13:

100

Se construyeron varios bibliotecas de péptidos de secuencia aleatoria usando la mutagénesis dirigida por plantilla de hebra simple (Kunkel et al., Methods. Enzymol., 204:125 (1991)). Las Tablas I y II siguientes identifican estas bibliotecas.

Los péptidos unidores del receptor del Apo-2L descubiertos en la presente invención se identificaron, a partir de las construcciones de la biblioteca de péptidos en bacteriófago mostradas en las Tablas I y II, usando el siguiente ensayo de unión del fagómido.

Ensayo de unión del fagómido

1. Se recubrieron los pocillos de placas de microvaloración con 80 \mul de 1 \mug/ml del ECD del receptor DR5 del Apo-2L (SEQ ID NO: 105) (en carbonato sódico 50 mM, pH 9,6) a 4ºC, durante la noche.

2. Se retiró el recubrimiento y se bloqueó con 200 \mul de PBS/0,1% de BSA. Se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

3. Se prepararon soluciones del receptor competidor (100 \mul/muestra).

-

Se dispensaron 50 \mul de tampón unidor a las hileras de la H a la B en una placa de 96 pocillos nueva y no pegajosa.

-

Se dispensaron 75 \mul de solución del receptor competidor a la hilera A.

-

Se prepararon diluciones a la tercera parte transfiriendo 25 \mul de solución a lo largo de las columnas excepto para la hilera H (usar una punta nueva para cada transferencia).

4. Se preparó la dilución subsaturante de fagos apropiada (determinada previamente a partir de series de dilución de los fagos).

-

Se transfirieron 50 \mul de diluyente de fagos a cada pocillo de microvaloración de la placa no pegajosa. Se empezó en la hilera H, a continuación, respectivamente G, F, E, D, C, B y A.

-

Se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Se agitó la placa que se había recubierto con el ECD del DR5 (SEQ ID NO: 105) y se aclaró 10 veces con PBS + 0,05% de Tween 20.

6. Se transfirieron 80 \mul de la mezcla del receptor competidor y fago procedente de la placa no pegajosa a la placa recubierta con el ECD del DR5, y se incubó 20 minutos a temperatura ambiente.

7. Se preparó una dilución 1:5000 del Ab monoclonal anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) en el tampón de unión.

-

Se aclaró la placa 10 veces con PBS/Tween 20 (ser minucioso en este paso para eliminar el enorme exceso de fagos que no exhiben).

-

Añadir 80 \mul del diluyente del Ab a las hileras de la H a la A.

-

Incubar 1 hora a temperatura ambiente.

8. Mezclar el sustrato de peroxidasa TMB y la solución B de peroxidasa con volúmenes iguales.

-

Aclarar la placa 10 veces con PBS/Tween 20.

-

Añadir 80 \mul de sustrato a las hileras de la H a la A.

-

Incubar según se requiera para revelar y detener con 80 \mul de H_{2}SO_{4} 2,5 M.

Los péptidos unidores del receptor del Apo-2L identificados usando este ensayo se clasificaron a continuación según su afinidad usando los protocolos siguientes.

Clasificación por afinidad - procedimiento 1 del péptido

Clasificación 1

1. Depositar la proteína diana (ECD del DR5 humano, SEQ ID NO: 105) sobre 24 pocillos de inmunoplacas Maxisorp con 2 \mug/ml, 100 \mul/pocillo, e incubar a 4ºC durante la noche.

2. Bloquear la placa: añadir 200 \mul de PBS con caseína durante 1 hora a temperatura ambiente.

3. Bloquear el fago: añadir tampón de bloqueo (caseína) a la solución del fago en una proporción 1:1 e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.

4. Lavar la placa 5 veces con tampón PT.

5. Añadir 100 \mul de la solución del fago de la biblioteca (procedente del paso 4) a los pocillos, e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave.

6. Lavar la placa 10 veces con tampón PT.

7. Eluir con 50 \mul de glicina 0,2 M, pH 2, en los primeros 12 pocillos, durante 30 minutos; a continuación transferir la solución a los 12 pocillos siguientes e incubar durante 30 minutos. Neutralizar el eluyente con Tris base 1,0 M (aproximadamente 1/6 del volumen).

8. Infectar 5 ml de células X11-blue (OD600 = 1,0) con 1,5 ml del eluyente de los fagos. Cultivar durante 20 minutos a 37ºC. Titular sobre placas LB/carb y transferir el cultivo a 50 ml de 2YT/carbVCS y cultivar durante la noche a 37ºC.

9. Sedimentar las células mediante centrifugación y guardar el sobrenadante, el cual está listo para la siguiente clasificación.

Clasificación 2

1. Recubrir 12 pocillos con la proteína diana.

2. Bloquear la placa: añadir 200 \mul de Superblock durante 1 hora a temperatura ambiente.

3. Bloquear el fago: añadir Superblock (Pierce, CA) al sobrenadante de fagos (procedente de la Clasificación 1, Paso 12) en una proporción 1:1, e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.

4. Infectar 1 ml de células X11-blue (OD600 = 1,0) con 0,3 ml del eluyente de los fagos. Cultivar durante 20 minutos a 37ºC. Titular sobre placas LB/carb y transferir el cultivo a 25 ml de 2YT/carbVCS y cultivar durante la noche a 37ºC.

5. Sedimentar las células mediante centrifugación y guardar el sobrenadante, el cual está listo para la siguiente clasificación.

\newpage

Clasificación 3

1. Recubrir 12 pocillos con la proteína diana.

2. Bloquear la placa: añadir 200 \mul de PBS/BSA durante 1 hora a temperatura ambiente.

3. Bloquear el fago: añadir PBS/BSA al sobrenadante de fagos en una proporción 1:1, e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.

4-5. Lo mismo que más arriba

Clasificación por afinidad - procedimiento 2 del péptido

Clasificación 1

1. Bloquear las cuentas.

4. Mezclar las cuentas minuciosamente, a continuación retirar 600 \mul de cuentas a un tubo Eppendorf.

5. Lavar 3 veces con 1 ml de PBS/BSA.

6. Resuspender la cuentas lavadas en PBS/BSA.

7. Colocar en un rotador a temperatura ambiente durante 1 hora.

2. Bloquear el fago:

a)

añadir tampón de bloqueo (PBS/BSA) a la biblioteca en fagos del péptido en una proporción de volumen de 1:1.

b)

Colocar en un rotador a temperatura ambiente durante 1/2 hora.

c)

Añadir 50 nM de IgG para DR4 (SEQ ID NO: 108) (específico para el DR5) o IgG para DR5 (SEQ ID NO: 108) (específico para el DR4).

d)

Colocar en un rotador a temperatura ambiente durante 1 hora.

3. Unir el fago con el péptido al antígeno:

a)

Añadir 100 nM de proteína marcada con biotina a la solución de fagos.

b)

Rotar a temperatura ambiente durante 1-2 horas.

4. Transferir la mezcla de fagos (procedente del Paso 3) a las cuentas bloqueadas (procedentes del Paso 1), y colocar sobre el rotador durante 15 minutos.

5. Lavar las cuentas con PBS/Tween 10 veces.

6. Eluir el fago con 100 \mul de glicina 0,2 M, pH 2, durante 30 minutos, a continuación neutralizar el eluyente con Tris base 1,0 M (aproximadamente 1/6 del volumen).

7. Infectar 5 ml de células X11-blue (OD600 = 1,0) con 0,5 ml del eluyente de los fagos. Cultivar durante 20 minutos a 37ºC. Titular sobre placas LB/carb y transferir el cultivo a 25 ml de 2YT/carbVCS y cultivar durante la noche a 37ºC.

8. Sedimentar las células mediante centrifugación y guardar el sobrenadante, el cual está listo para la siguiente clasificación.

Clasificación 2

Similar a la Clasificación 1, Concentración: consultar la tabla A más abajo. Bloquear la solución con caseína.

Clasificación 3

Similar a la Clasificación 1, Concentración: consultar la tabla A más abajo. Bloquear la solución con Superblock.

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Clasificación 4

Si se desea. Similar a la Clasificación 1, Concentración: consultar la tabla A más abajo. Bloquear con leche descremada al 5%.

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TABLA A

1

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Se emplearon varias estrategias de protocolos de selección para identificar y aislar los péptidos descubiertos en la presente invención. Un primer protocolo consistía en una estrategia de selección temprana y en masa ("E.M."), en la cual se seleccionaron los clones después de dos o tres pasos de clasificación. En esta estrategia E.M., se emplearon procedimientos de selección temprana y en masa para identificar secuencias peptídicas que tuvieran una relativa diversidad de epítopos unidores (por ejemplo, diversidad tanto en estructura de la secuencia como en afinidad de unión).

Un segundo protocolo empleado para identificar los péptidos descubiertos en la presente invención consistía en un estrategia de selección tardía y limitada ("L.L"), en la cual los clones se seleccionan después de pasos de selección adicionales (por ejemplo, de cuatro a seis). La estrategia de selección L.L. se usó para seleccionar especies peptídicas con mayor afinidad.

Los materiales y procedimientos usados en estos protocolos de selección de péptidos son como sigue:

A. Materiales

1. Soporte sólido, placa de 384 pocillos de NUNC (Cat #781061).

2. Tampón de recubrimiento (CB), carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6.

3. Tampón de lavado (WB), PBS/0,05% de Tween-20, pH 7,4.

4. Diluyente de ELISA sin Thimerosal (AB), PBS/0,5% de BSA, 0,05% de Tween-20.

5. Sustrato (S), TMB.

6. Solución de detención (SS), ácido fosfórico 1 M (67,5 ml de H_{3}PO_{4} + 932,5 ml dH2O.

7. Recubrir la diana, 2 microgramos/ml.

8. Recubrir el anti-gD (5 microgramos/ml).

9. Conjugado, anti-M13/HRP, dilución a 1:5000 (Amersham Pharmacia Biotech).

B. Procedimiento

1.

a)

Cultivar el fago en 0,4 ml de 2YT/cabVCS durante la noche a 37ºC.

b)

Diluir la proteína diana (ECD del DR5, SEQ ID NO: 105) a 2 \mug/ml. Añadir 40 \mul a cada pocillo. Incubar durante la noche a 2-8ºC.

2. Lavar la placa en un lavador de placas. (100 \mul \times 3 lavados). Secar empapando.

3. Añadir 100 \mul de Tampón de Ensayo de ELISA a cada pocillo para bloquear la placa. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.

4. Lavar la placa en un lavador de placas. (100 \mul \times 3 lavados). Secar empapando.

5. Añadir 40 \mul de muestra (muestras diluidas de fagos, 1/3) a cada pocillo. Las muestras se transfieren desde una placa de 96 pocillos a una placa de 384 en cuadrantes. Incubar durante de 55 minutos a 1 hora 15 minutos, a temperatura ambiente, con agitación suave.

6. Lavar la placa en un lavador de placas. (100 PL x 6 washes). Secar empapando.

7. Añadir 40 \mul de anti-M13/HRP (1:50K) diluido en tampón de ensayo a cada pocillo. Incubar durante de 55 minutos a 1 hora 15 minutos, a temperatura ambiente, con agitación suave.

8. Lavar la placa en un lavador de placas (100 \mul \times 6 lavados). Secar empapando.

9. Combinar volúmenes iguales de sustrato y solución de peroxidasa. Añadir 40 \mul de la solución a cada pocillo. Dejar incubar hasta que se desarrolle suficiente color (\sim de 18 a 23 minutos).

10. Añadir 40 \mul de la solución de detención a cada pocillo.

11. Leer la absorbancia a 450 nm y 620 nm para referencia.

En el proceso de selección usado para identificar los péptidos descubiertos en la presente invención, los pasos 4-11 anteriores se llevaron a cabo mediante un sistema robotizado CRS (Procedimiento núcleo = Fago).

Purificación de los clones de fagos

Se generó un cierto número de clones de bacteriófago que expresaban los péptidos de interés usando los procedimientos anteriores y a continuación se purificaron usando la dilución limitante. Con objeto de caracterizar adicionalmente los clones específicos de interés (por ejemplo, para determinar los valores de LC 50), se cultivaron los clones de los pagos y a continuación se purificaron usando un procedimiento basado en el polietilenglicol, tal y como se describe en Sidhu et al., Methods Enzymol., 328:333-363 (2000). También se conocen en el estado de la técnica procedimientos alternativos para generar y purificar bacteriófagos. Consultar, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, volumen 1, unidades 1, 5 y 6, editores Frederick M. Ausubel et al., 1995.

Los clones de fagos identificados usando los procedimientos anteriores se cultivaron y a continuación se purificaron usando el siguiente procedimiento basado en el polietilenglicol. En resumen, se cultivó un cultivo bacteriano, infectado con un clon de fago de interés, en condiciones favorables para el crecimiento del fago, y a continuación se centrifugó durante 10 minutos a 2ºC y 16.000 \timesg. El sobrenadante se transfirió entonces a un tubo de centrífuga nuevo y se añadió un volumen de 1/5 de PEG-NaCl (PEG 8000 (200 g/l), NaCl (146 g/l), autoclavado). La mezcla se incubó a continuación durante 5 minutos a temperatura ambiente. Entonces se centrifugó la mezcla como más arriba, y se decantó el sobrenadante. A continuación se centrifugó brevemente el sobrenadante, y se eliminó el sobrenadante restante. Los precipitados de fagos se resuspendieron entonces en un volumen de 1/20 de PBS (u otro tampón análogo). El material insoluble se precipitó a continuación mediante centrifugación. El sobrenadante que contenía el fago purificado
se guardó y se usó en ensayos tales como los ensayos de la Ic 50 y Ec 50 que se describen en los ejemplos siguientes.

Los péptidos de la invención y sus valores de Ic 50 (por ejemplo, determinaciones del Ic 50 en ensayos basados en ELISA usando un ECD del DR5 (SEQ ID NO: 105) competidor) se identifican en la Tabla III siguiente. En las tablas proporcionadas en la presente invención, "Ic 50" se refiere a la medida de la concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% del Apo-2L (por ejemplo, los aminoácidos 114 a 281 de la SEQ ID NO: 1) que se unen a una molécula receptora del Apo-2L (por ejemplo, la DR4-IgG (SEQ ID NO: 108) o el ECD del DR5 (SEQ ID NO: 105) etcétera). Los péptidos de clasifican de forma que la clase 1-clase 4 representan respectivamente a, b, c y d.

La Tabla IV siguiente proporciona ciertas propiedades de los péptidos seleccionados, por ejemplo, los datos de Ic50 de la reactividad cruzada con los polipéptidos DR4 y DR5. La Tabla VIII identifica los números de identificación de la secuencia (SEQ ID NOs.) de los diversos polipéptidos descubiertos en la presente invención.

Ejemplo 2 Protocolos usados para manipular y/o modificar los péptidos unidores del receptor del Apo-2L

Tal como se descubre en este ejemplo, los péptidos identificados usando los procedimientos anteriores se modificaron de acuerdo con un cierto número de protocolos de la técnica aceptados.

En un primer paso, se seleccionaron péptidos específicos para la modificación adicional. Los péptidos se seleccionaron para esa modificación en base a criterios que incluyen la capacidad para unir los polipéptidos del DR5 (SEQ ID NOS: 105 y 109) con una afinidad específica y/o una capacidad para inhibir la interacción entre el Apo-2L.0 (aminoácidos 114 a 281 de la SEQ ID NO: 1) y el DR5 (SEQ ID NOs: 105 y 109) a una concentración específica. Tal como se muestra en la Figura 4A, los péptidos Hd5-10 (SEQ ID NO: 14), Hd5-11 (SEQ ID NO: 15), Hd5-8 (SEQ ID NO: 92) y Hd5-9 (SEQ ID NO: 99) se identificaron como péptidos líderes de la primera generación (G1).

Tal como se muestra en la Figura 4B, los residuos aminoácidos originales en el péptido Hd5-11 se modificaron mediante la sustitución de aminoácidos. Se seleccionaron residuos específicos en este péptido para su modificación en base a su aparición con una frecuencia elevada en la misma posición dentro de los péptidos seleccionados como más arriba. Tal como se muestra en la Figura 4B, los residuos cisteína 4, 8 y 14 en la secuencia del péptido Hd5-11 se sustituyeron por residuos alanina. Tal como se muestra en la gráfica de la Figura 4B, a continuación se midieron los efectos de la sustitución C -> A sobre los valores de Ic 50 del péptido. Un diseño de biblioteca tal como el mostrado en la Figura 4B facilitó esta modificación del péptido. En la Figura 4B se muestra un péptido de segunda generación (G2) producido mediante estos procedimientos.

Además de la frecuencia de acontecimiento, los residuos específicos en un péptido pueden seleccionarse para esa modificación en base a una variedad de criterios adicionales, incluyendo el deseo de eliminar los residuos asociados con la formación de enlaces disulfuro (es decir, cisteínas), así como la adición de residuos que son particularmente susceptibles a la manipulación subsiguiente (por ejemplo, residuos que facilitan la conjugación a polioles).

Tal como se muestra en la Figura 4C, el péptido G2 identificado en la Figura 4B se modificó usando protocolos de barrido de truncación, en los cuales se suprimen uno o más residuos terminales de un péptido (consultar, por ejemplo, Bing Li et al., Science, 270:1657 (1995)). Tal como se muestra en la gráfica de la Figura 4C, se midieron los efectos de la truncación sobre los valores de Ic 50 del péptido. Un diseño de biblioteca tal como el mostrado en la Figura 4C facilitó esta modificación del péptido. En la Figura 4C se muestra un péptido de tercera generación (G3) producido mediante estos procedimientos.

Tal como se muestra en la Figura 4C, los residuos aminoácidos en el péptido G3 se modificaron usando protocolos de barrido de alanina (consultar, por ejemplo, Cunningham B.C. et al., Science, 244:1081 (1989)). En estos protocolos, uno o más residuos del péptido G3 se sustituyeron con alanina, y se midieron los efectos de las diversas sustituciones sobre los valores de Ic 50 del péptido Un diseño de biblioteca tal como el mostrado en la Figura 4D facilitó esta modificación del péptido. En la Figura 4D se muestra un péptido de cuarta generación (G4) producido mediante estos procedimientos.

Como se discute en los Ejemplos 5 siguientes, los efectos de la modificación del péptido se examinaron en ensayos que evaluaban la capacidad de un péptido para inhibir la interacción entre el Apo-2L y el receptor del Apo-2L. Como se discute en el Ejemplo 4 siguiente (y se muestra en la Figura 5B), los efectos de la modificación del péptido se examinaron también en un ensayo de la capacidad de un péptido unidor del receptor del Apo-2L LB881 (SEQ ID NO: 45), que está unido a una secuencia de cremallera de leucinas, para inducir la apoptosis en células SK-MES-1.

Ejemplo 3 Oligomerización del péptido unidor del DR5

Se manipularon los oligómeros definidos del péptido LB881 mostrado en la Tabla III (SEQ ID NO: 45) mediante la fusión al extremo amino terminal de la hélice enrollada del GCN4 (consultar, por ejemplo, O'Shea et al., Science, 243:538-542 (1989)). Las variantes trimérica y tetramérica del dímero del GCN4 se basan en las secuencias publicadas por Harbury et al., (consultar, por ejemplo, Harbury et al., Science, 262:1401-1407 (1993)) pero difieren de la secuencia del GCN4 en los extremos. Las tres variantes del GCN4 tenían dos residuos adicionales en el extremo amino terminal (Lys y el residuo hidrofóbico apropiado, consultar la Tabla V siguiente), y las tres acaban en la secuencia "VGER". Los péptidos se fusionaron a las variantes del GCN4 a través de engarces de diferente longitud (consultar la Tabla VI siguiente).

Metodología

Se produjeron plásmidos de expresión para las fusiones péptido-GCN4 mediante la inserción de un casete péptido-engarce en el sitio NdeI del GCN4-pR (consultar, por ejemplo, Cochran, A. G. & Kim, P. S., Science, 271:1113-1116 (1996)) (que codifica el dominio de dimerización del GCN4 o la variante apropiada) usando técnicas de clonación molecular estándares. Las variantes del engarce se produjeron a continuación mediante la mutagénesis de Kunkel de las construcciones iniciales. Los plásmidos que codificaban los péptidos de la fusión se transformaron en la cepa BL21-DE3 pLysS de E. coli (Novagen). Se inoculó un cultivo en medio L (LB) con una única colonia y se agitó durante la noche a 37ºC. A continuación se inoculó un cultivo de expresión (1 L en LB) con 10 ml del cultivo nocturno, y se agitó a 37ºC. Cuando el cultivo alcanzó una absorbancia a 550 nm de 0,5, se indujo la expresión del péptido con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (concentración final, 0,4 mM). Después de tres horas de crecimiento adicional, se recolectaron las células mediante centrifugación.

Los precipitados de células se congelaron a -20ºC, se descongelaron, y se lisaron con ácido acético glacial (10 ml por litro de cultivo original) a temperatura ambiente. Los precipitados se eliminaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se cargó sobre una columna de exclusión por tamaño de 5 cm \times 25 cm (Sephadex G75 fina; Pharmacia). El péptido de fusión se eluyó con ácido acético acuoso al 5% (v/v), a una velocidad de 3 ml min^{-1}. Las fracciones que contenían el péptido de fusión se identificaron mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas (espectrómetro de masas PE SCIEX API 150 EX, con bombas Shimadzu LC-10AD, un detector de UV de doble longitud de onda Shimadzu Modelo SPD-10AVP, y un autocargador Perkin Elmer Series 200) usando una columna Microsorb C18 (nº de la pieza: R0089203C5, Varian Chromatography Systems) y un gradiente de acetonitrilo en agua (0,05% (v/v) ácido trifluoroacético). Las fracciones del péptido de fusión se combinaron y liofilizaron.

El péptido de fusión liofilizado se disolvió en agua que contenía un 0,1% de ácido trifluoroacético, y se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa en fase inversa, usando un gradiente de acetonitrilo en agua (0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético). Las fracciones de la HPLC que contenían el péptido de fusión purificado se combinaron, oxidaron mediante la adición gota a gota de ácido acético saturado con yodo, y se liofilizaron. Para disminuir la posibilidad de entrecruzamiento intermolecular durante el proceso de oxidación, el producto liofilizado se pesó y resuspendió en condiciones desnaturalizantes en guanidina-HCl 6 M, Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM (Tampón A), a una concentración de 2 mg/ml. El péptido desnaturalizado se oxidó con ferricianuro potásico acuoso. El péptido monomérico se separó a partir de los agregados entrecruzados mediante cromatografía de filtración en gel sobre una columna Pharmacia HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 High Resolution. El tampón de análisis fue el Tampón A. Las fracciones que contenían péptido monomérico se dializaron frente a Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM durante al menos 3 horas a 4ºC. Se analizó la pureza de las fracciones dializadas mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida. Se combinaron las fracciones puras, y las fracciones dializada mezcladas se purificaron de nuevo mediante HPLC en fase inversa, para obtener un rendimiento final de 2-10 mg.

Los polvos liofilizados se disolvieron en agua a 25 mg ml^{-1}, y las concentraciones de péptido se determinaron a partir de la absorbancia como se describe, por ejemplo, en Gill, S. C. & von Hippel, P. H., "Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data". Anal. Biochem., 182:319-326 (1989). Se prepararon soluciones de reserva para su ensayo mediante la dilución de los péptidos hasta 2 mM y la adición de Na_{2}HSO_{4} para neutralizar el pH de la solución.

La Tabla VII siguiente proporciona datos para el péptido LB881 (SEQ ID NO: 45) fusionado al extremo amino terminal de la hélice enrollada del GCN4.

Ejemplo 4 Ensayo con azul de Alamar de la capacidad de los péptidos unidores del receptor del Apo-2 para inducir agonísticamente la apoptosis

Se usó un bioensayo que mide la viabilidad celular, a partir de la conversión metabólica de un colorante fluorescente, para determinar la actividad apoptótica del péptido unidor del receptor del Apo-2L LB881, mostrado en la Tabla IX, fusionado al extremo amino terminal de la hélice enrollada del GCN4 (SEQ ID NO: 113). Los datos de este bioensayo se muestran en la Figura 5B.

En resumen, se prepararon diluciones en serie de 2 veces de del Apo-2L.0 o su péptido unidor del receptor del Apo-2L en medio RPMI-1640 (Gibco) que contenía un 0,1% de BSA, y se transfirieron 50 \mul de cada dilución a pocillos individuales de microplacas Falcon de 96-pocillos para el cultivo de tejidos. Los términos "Apo-2L.0" y "Apo2L.0" se refieren a una forma del polipéptido del ligando de Apo-2 consistente en los aminoácidos 114 a 281 de la Figura 1 (aminoácidos 114 a 281 de la SEQ ID NO: 1), y no unida o conjugada a ninguna secuencia de etiqueta de epítopo. Después del paso de dilución del péptido unidor del receptor del Apo-2L.0 o Apo2L, se añadieron 50 \mul de células de carcinoma pulmonar humano SK-MES-1 (ATCC HTB58) (en RMPI-1640, 0,1% de BSA) a una densidad de 2 \times 10^{4} células/pocillo. Estas mezclas se incubaron a 37ºC durante 24 horas. A las 21 horas, se añadieron 25 \mul de azul de Alamar (AccuMed, Inc., Westlake, Ohio). Se leyó la fluorescencia usando un fluorímetro de 96 pocillos con la excitación a 530 nm y la emisión a 590 nm. Los resultados se expresan en unidades de fluorescencia relativa (RFU). Para el análisis de los datos se uso el programa de ajuste de una curva con 4 parámetros (Kaleidagraph).

Usando estos procedimientos de bioensayo, se generaron los valores de Ec 50 para los péptidos unidores del receptor del Apo-2L, y se proporcionan en la Tabla VII siguiente. "Ec 50" se refiere a la concentración efectiva media del péptido que se ha observado induce la apoptosis en el 50% de la población celular.

Ejemplo 5 Ensayo de la capacidad de los péptidos unidores del receptor del Apo-2 para inhibir la unión del Apo-2L al receptor del Apo-2L

Los péptidos unidores del receptor del Apo-2L purificados de la invención (como se describe en el Ejemplo 1 anterior) se ensayaron en función de su actividad para inhibir la SEQ ID NO: 1) a la construcción ECD-DR5 humano receptora del Apo-2L (SEQ ID NO: 105). En resumen, en el ELISA, se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) añadiendo 100 \mul de 0,5 \mug/ml de EDC-DR5 (SEQ. ID NO: 105) en Tampón de Recubrimiento (tampón carbonato 50 mM, pH 9,6) a cada pocillo e incubando a 4ºC durante la noche. A continuación se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (PBS conteniendo un 0,05% de Tween 20). Los pocillos se bloquearon entonces con 200 \mul de albúmina de suero bovina al 2% en PBS, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se lavaron de nuevo las placas tres veces con tampón de lavado.

A continuación de los pasos de lavado, se añadieron 100 \mul de una dilución en tres veces del péptido unidor del recepctor del Apo-2L (50 \mug/ml) en tampón de ensayo (albúmina de suero bovina al 0,5%, 0,05% de Tween 20 en PBS) a los pocillos señalados. Las placas se incubaron a continuación a temperatura ambiente durante 1 hora en un aparato agitador, y se lavaron tres veces con tampón de lavado.

A continuación, se añadieron 100 \mul de Apo-2L.0 biotinilado (aminoácidos 114 a 281 de la SEQ ID NO: 1), diluidos 1:1000 en tampón de ensayo, a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. A continuación se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado, seguidas por la adición de 100 \mul de estreptoavidina-HRP (Zymed, South San Francisco, CA) diluida 1:1000 en tampón de ensayo, y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente en un aparato agitador, y entonces se lavaron tres veces con tampón de lavado.

Seguida por la adición de 50 \mul de sustrato (sustrato de peroxidasa TMB Microwell, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo, y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 50 \mul de la solución de detención del componente TMB-1 (dietilglicol; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo para detener la reacción, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microvaloración automatizado.

Usando estos procedimientos, se generaron los valores de Ic 50 para varios clones de fagos que expresan secuencias peptídicas de interés, y se proporcionan en las tablas siguientes. En las tablas, "Ic 50" se refiere a la medida de la concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% de la unión del Apo-2L a una molécula receptora del Apo-2L (por ejemplo, la DR4-IgG (SEQ ID NO: 108) o el ECD del DR5 (SEQ ID NO: 105) etcétera).

Aunque este ejemplo describe un protocolo de ensayo ELISA que usa una construcción ECD-DR5 (SEQ ID NO: 105) como molécula receptora diana, la capacidad de estos péptidos unidores del receptor del Apo-2L puede examinarse usando estos procedimientos basados en el ELISA.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Tablas I-II

Bibliotecas ingenuas para la exhibición del G8 TABLA I G1-G2

2

3

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TABLA II G3-G5

4

5

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TABLA III Clones positivos con la competición de fago Ic5 (Comp/DR5 ECD)

6

7

8

9

10

11

12

13

14

TABLA IV Ciertas propiedades de péptidos seleccionados

16

17

18

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TABLA V Variantes de la hélice enrollada del GCN4

19

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TABLA VI Variantes de los engarces

20

21

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TABLA VII Valores de Ic 50 de péptidos ilustrativos fusionados a dominios de cremallera de leucinas

22

23

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TABLA VIII Números de identificación de la secuencia para los péptidos unidores del receptor del Apo-2L

24

25

26

27

28

29

30

TABLA IX Secuencias polipeptídicas de los reactivos usados para caracterizar los péptidos unidores del receptor del Apo-2L

31

35

38

<110> GENENTECH, INC.

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<120> PÉPTIDOS UNIDORES DEL RECEPTOR DEL APO-2L Y USOS DE LOS MISMOS

\vskip0.400000\baselineskip

<130> SJK/FP6339873

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 04760861.7

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2004-04-29

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US04/013576

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2004-04-29

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/469.436

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-05-09

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<160> 113

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<210> 1

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<211> 281

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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40

41

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<210> 2

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<211> 1042

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> Poco seguro

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<222> 447

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<223> Base desconocida

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<400> 2

42

420

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<210> 3

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<211> 1407

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

43

44

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<210> 4

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<211> 468

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 411

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

47

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 440

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

49

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 33

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

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<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> la secuencia se sintetiza

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<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Ser Gly Gly Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Ser Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Val Asp Gln Glu Cys Met Thr Thr Cys}

\sac{Thr Arg Leu Arg Glu Cys Gln Leu Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Asp Lys}

\sac{Leu Met Lys Cys Asn Trp Met Ala Ala Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Ala Met Thr Thr Cys Glu Lys Leu}

\sac{Arg Leu Cys Gln Ser Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

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\sa{Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Glu Lys Leu}

\sac{Met Ser Ala Leu Ser Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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\sa{Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Asp Arg Leu}

\sac{Lys Gln Ala Phe Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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\sa{Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Glu Lys Leu}

\sac{Met Ser Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Glu Lys Leu}

\sac{Met Ser Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

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<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Glu Lys Leu}

\sac{Met Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Glu Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Glu Val Ala Met Thr Ser Cys Asp Lys}

\sac{Leu Met Lys Cys Asn Trp Met Ala Ala Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Glu Val Cys Met Thr Ser Ala Asp Lys}

\sac{Leu Met Lys Cys Asn Trp Met Ala Ala Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Asp Lys}

\sac{Leu Met Lys Ala Asn Trp Met Ala Ala Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Arg Gly Glu Val Cys Cys Thr Met}

\sac{Cys Glu Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Glu Ala Gly Glu Val Cys Leu Thr Leu}

\sac{Cys Glu Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Glu Gln Gly Glu Val Cys Met Thr Leu}

\sac{Cys Glu Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Arg Val Gly Glu Val Cys Met Thr Thr}

\sac{Cys Glu Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Val Gly Glu Val Cys Met Thr Met}

\sac{Cys Asp Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gln Ala Gly Glu Val Cys Met Thr Leu}

\sac{Cys Glu Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Ser Gly Glu Val Cys Met Thr Ser}

\sac{Cys Glu Lys Leu Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Pro Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Ser Arg Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asn Phe Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Ser Arg Leu Arg Gly Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg His Glu Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Ser Arg Val Lys Arg Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln His Gly Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Ser Lys Ile Gln Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Val Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Ser Ser Leu Ile Ala Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Asn Ser Gly Glu Val Cys Met Thr Ser}

\sac{Cys Ala Lys Ile Arg Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Pro Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Glu Arg Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ser Arg Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Glu Arg Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Pro Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Glu Arg Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Phe Arg Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Glu Lys Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Val Arg Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser}

\sac{Cys Glu Lys Leu Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Glu}

\sac{Arg Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Glu Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Met Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Ser Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Thr Cys Ser Arg}

\sac{Ile Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Met Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Glu Arg}

\sac{Ile Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Asp Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Ile Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Val Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Lys Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Ala Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Ala Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Ala Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ala Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ala Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Ala}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Ser Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Val Gly Glu Val Cys Leu Thr Glu Cys}

\sac{Ser Arg Leu Ile Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Leu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Arg}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Val Cys Leu Thr Glu Cys Ser Lys}

\sac{Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Ala Met Thr Thr Cys Ser Lys Leu}

\sac{Arg Gln Cys Leu Ser Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Ala Met Thr Ser Cys Glu Lys Leu}

\sac{Arg Ser Cys Leu Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Ala Met Thr Thr Cys Asp Lys Leu}

\sac{Arg Glu Cys Met Ala Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Ala Met Thr Thr Cys Glu Lys Leu}

\sac{Arg Leu Cys Gln Ser Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Ala Met Thr Ser Cys Asp Lys Leu}

\sac{Arg Leu Cys Gln Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Val Ala Met Thr Thr Cys Glu Lys Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Lys Thr Glu Asp Thr Cys Gln Val}

\sac{Phe Met Ser Cys Arg Leu Lys Thr Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Lys Thr Glu Asp Thr Cys Gln Val}

\sac{Phe Met Ser Cys Arg Pro Leu Pro Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Glu Gln Thr Glu Asp Thr Cys Gln Val}

\sac{Phe Met Ser Cys Arg Pro Lys Lys Val Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Lys Pro Ala Glu Asp Thr Cys Gln Val}

\sac{Ile Met Thr Cys Arg Gln Lys Thr Val Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Gln Thr Glu Asp Thr Cys Gln Val}

\sac{Phe Met Ser Cys Arg Pro Lys Thr Ile Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Met Thr Glu Asp Thr Cys Gln Val}

\sac{Phe Met Ser Cys Arg Pro Met Ala Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Glu Pro Ala Glu Asp Thr Cys Gln Val}

\sac{Ile Met Thr Cys Arg Gln Lys Thr Val Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asn Ser Met Met Cys Asp Gly Pro Met}

\sac{Val Thr Ala Glu Gly Cys Ser Thr Phe Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asn Ser Ile Met Cys Asp Gly Pro Ile}

\sac{Val Thr Ala Glu Thr Cys Ser Thr Phe Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asn Ser Met Met Cys Asp Gly Pro Met}

\sac{Val Thr Ala Glu Gly Cys Ser Ile Phe Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asn Ser Met Met Cys Asp Gly Pro Val}

\sac{Val Thr Ala Glu Ser Cys Ser Phe Phe Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asn Ser Leu Met Cys Asp Gly Pro Ile}

\sac{Val Ser Ala Glu Ser Cys Ser Phe Phe Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asn Ser Met Met Cys Asp Gly Pro Val}

\sac{Val Thr Ala Glu Ser Cys Ser Phe Phe Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

58

59

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 466

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 415

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

65

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 413

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

68

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

70

71

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> la secuencia se sintetiza

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

73

Claims (27)

1. Péptido unidor del receptor del Apo-2L aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEQ ID NO: 14 a SEQ ID NO: 104 (Tabla VIII).

2. Molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de la reivindicación 1.

3. Vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2.

4. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. Célula huésped de la reivindicación 4 en donde dicha célula huésped es E. coli, una célula ovárica de hámster chino (CHO), o una célula de levadura.

6. Procedimiento para construir el péptido unidor del receptor de Apo-2L, que comprende los pasos de: proporcionar una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4; (b) proporcionar el medio de cultivo; (c) cultivar la célula huésped en el medio de cultivo en condiciones suficientes para expresar el péptido unidor del receptor de Apo-2L; (d) recuperar el péptido unidor del receptor de Apo-2L a partir de la célula huésped o del medio de cultivo; y (e) purificar el péptido unidor del receptor de Apo-2L.

7. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido inhibe la interacción entre un polipéptido del receptor DR4 humano y un polipéptido del ligando Apo-2 que comprende los aminoácido 114 a 281 de la Figura 1.

8. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido inhibe la interacción entre un polipéptido del receptor DR5 humano y un polipéptido del ligando Apo-2 que comprende los aminoácido 114 a 281 de la Figura 1.

9. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido induce la apoptosis en una o más células de mamífero.

10. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido tiene un residuo cisteína en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 7, numeradas a partir de su extremo N-terminal.

11. Péptido de la reivindicación 1, en la cual el péptido incluye el motivo siguiente: cisteína-X1-X2-X3-cisteína, en el cual X1 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en metionina y leucina, X2 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en treonina y alanina, y X3 es un residuo aminoácido seleccionado de entre el grupo consistente en serina, metionina, leucina y ácido glutámico.

12. Péptido de la reivindicación 1 que une un receptor DR5 pero no une un receptor DR4.

13. Péptido de la reivindicación 1 que une un receptor DR5 y además se une a un receptor DR4, un receptor DcR1, y/o un receptor DcR2.

14. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-13, en las cuales el péptido unidor del receptor del Apo-2L está unido a una secuencia polipeptídica heterólogas.

15. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-14, en las cuales la secuencia polipeptídica heterólogas es un dominio de cremallera de leucina que comprende la secuencia de aminoácidos glicina-glicina-metionina.

16. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-15, en las cuales el péptido unidor del receptor del Apo-2L está conjugado o unido a uno o más grupos poliol.

17. Composición que comprende el péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16 en un portador.

18. Composición de la reivindicación 17 que es estéril.

19. Composición de la reivindicación 17, en la cual el péptido induce la apoptosis en una o más células de mamífero.

20. Péptido unidor del receptor del Apo-2L de las reivindicaciones 1 ó 7 a 16 para su uso en terapia.

21. Procedimiento in vitro para inducir la apoptosis en células de mamífero, que comprende exponer las células de mamífero a una cantidad efectiva de un péptido unidor del receptor del Apo-2L de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16.

22. Procedimiento de la reivindicación 21 en el cual las células de mamífero son células cancerosas.

\newpage

23. Uso de un péptido unidor del receptor del Apo-2L de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7 a 15 para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer en un mamífero.

24. Uso de la reivindicación 23, en la cual dicho cáncer es un cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de colon o cáncer colorectal.

25. Uso de un péptido unidor del receptor del Apo-2L de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7 a 15 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inmunitaria en un mamífero.

26. Uso de la reivindicación 25, en la cual dicha enfermedad inmunitaria es la artritis o la esclerosis múltiple.

27. Equipo que comprende un contenedor que contiene al menos un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-16 e instrucciones que guían al usuario para utilizar el péptido.