ES2274573T3 - Inmunogenos quimericos tipo exotoxina a de pseudomonas para provocar una respuesta inmunitaria mediada por iga secretora. - Google Patents

Abstract

El uso un inmunógeno quimérico tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") no tóxico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad provocada por un patógeno que penetra en un mamífero a través de una membrana mucosa, en el que el medicamento es para aplicar a una superficie mucosa del mamífero para provocar una respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora contra el patógeno, en el que además el inmunógeno comprende por orden: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500 aminoácidos que se une a un receptor superficial celular de mucosa; (2) un dominio de translocación que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la translocación al citosol celular; (3) un dominio de epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y 1500 aminoácidos que es exógeno al dominio Ib de PE y codifica un epítopo del patógeno; y (4) una secuenciade aminoácidos que codifica un dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende una secuencia de retención en el RE y en el que el dominio de retención en el RE carece de actividad de ADP-ribosilación.

Description

Inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de Pseudomonas para provocar una respuesta inmunitaria mediada por IGA secretora.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a los campos de las proteínas quiméricas y la inmunología.

La inmunización contra las enfermedades infecciosas ha sido uno de los grandes logros de la medicina moderna. Las vacunas pueden ser útiles sólo si la vacuna en sí, no es significativamente patógena. Muchas vacunas se producen inactivando el patógeno. Por ejemplo, pueden prepararse vacunas de hepatitis calentando el virus y tratándolo con formaldehído. Otras vacunas, por ejemplo ciertas vacunas contra la polio, se producen atenuando un patógeno vivo. Sin embargo, existe preocupación sobre la producción de vacunas atenuadas para ciertos agentes infecciosos cuya patología no se comprende totalmente, tal como VIH.

La biología molecular ha permitido la producción de vacunas con subunidades; vacunas en las que el inmunógeno es un fragmento o subunidad de una proteína parental o complejo. Se están evaluando proteínas de la cubierta de VIH-1, tal como gp120, para vacunas con subunidades. Varios estudios han sugerido que los anticuerpos contra la región del bucle V3 de gp120 proporcionan protección a través de la neutralización del virus. (Emini, E.A., y cols., 1992, Nature 355, 728-30: Javaherian. K., y cols., 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 6768-72; Steimer. K.S. y cols., 1991, Science 254, 105-8; Wang, C.Y., y cols., 1991, Science 254, 285-8).

Sin embargo, las vacunas con subunidades pueden no ser lo suficientemente complejas para generar una respuesta inmunitaria apropiada. También, cuando el patógeno es muy mutable, tal como VIH, las vacunas con subunidades que provocan una inmunidad específica de cepa pueden no ser eficaces para proporcionar una protección global. Además, la inyección de virus inactivos o incluso de la proteína de la cubierta misma tiene potencial de producir una mezcla de anticuerpos neutralizadores y los denominados "potenciadores". (Toth, F.D., y cols., 1994, Clin Exp Immunol 96, 389-94; Eaton. A.M., y cols., 1994, Aids Res Hum Retroviruses 10, 13-8; Mitchell, W.M. y cols., 1995, Aids 9, 27-34; Montefiori, D.C., y cols., 1996, J Infect Dis 173, 60-7).

La capacidad inmunógena de las vacunas con subunidades algunas veces se aumenta acoplando la subunidad a una proteína transportadora creando una vacuna conjugada. Una de tales proteínas transportadoras la exotoxina A de Pseudomonas ("PE"). Los investigadores ligaron covalentemente un O-polisacárido no inmunógeno derivado de lipopolisacárido ("LPS") a PE. La vacuna conjugada resultante provocó una respuesta inmunitaria contra LPS y PE. (S.J. Cryz, Jr. y cols. (1987) J. Clin. Invest., 80: 51-56 y S. J. Cryz, Jr. y cols. (1990) J. Infectious Diseases, 163: 1040-1045). En otro estudio, los investigadores fueron capaces de evocar una respuesta inmunitaria contra un antígeno de Plasmodium falciparum acoplándolo mediante un espaciador a PE. (J. U. Que y cols. (1988) Infection and Immunity, 56: 2645-49). En un tercer estudio, los investigadores inactivaron PE y la entrecruzaron químicamente con péptidos del dominio neutralizante principal ("PND") de VIH-1. La vacuna conjugada provocó la producción de anticuerpos que reconocían el péptido PND y neutralizaban la cepa homóloga, VIH-1_{MN}. (S.J. Cryz, Jr. y cols. (1995) Vaccine, 13: 66-71).

Se han construido proteínas quiméricas que contienen componentes de VIH-1 y se han evaluado sus propiedades inmunógenas. Éstas incluyen: un antígeno de poliovirus que contiene un epítopo de la glucoproteína transmembrana gp41 de VIH-1 (Evans, D.J., y cols., 1989, Nature 339, 385-8), una proteína mucina que contiene copias múltiples del bucle V3 (Fontenot, J.D., y cols.; 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 315-9) una cadena B de cólera genéticamente modificada con secuencias del bucle V3 (Backstrom, M., y cols., 1994. Gene 149, 211-7) y un conjugado peptídico de PE inactivado químicamente y bucle V3 (Cryz, S., Jr., y cols., 1995, Vaccine 13, 67-71).

El tercer bucle variable (V3) de la proteína de la cubierta, gp120, contiene el dominio neutralizante principal de VIH-1. (Emini, E.A., y cols., 1992, Nature 355, 728-30; Javaherian, K., y cols., 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 6768-72: Rusche. J.R., y cols., [aparecen erratas publicadas en Proc Natl Acad Sci USA 22, 8697 1988, y Proc Natl Acad Sci USA 51 1667 1989]; Proc Natl Acad Sci USA 85, 3198-202 1988). Aunque los bucles V3 varían considerablemente entre las diversas cepas de VIH -1 (Berman. P. W . y cols., 1990, Nature 345, 622-5) se ha demostrado que los anticuerpos específicos contra esta región neutralizan la capacidad infecciosa del virus y evitan la fusión del virus y la célula in vitro (Kovacs, J .A. y cols. 1993, J. Clin Invest 92, 919-28). Además, la inmunización sistémica con una forma recombinante de gp120 parece ser suficiente para proteger a los chimpancés de la infección por exposición sistémica a VIH-1. White-Scharf, M.E., y cols., 1993, Virology 192, 197-206.

VIH con frecuencia penetra en el cuerpo por las superficies mucosas. Sin embargo, se desconoce que los inmunógenos contra VIH conocidos actualmente provoquen una respuesta inmunitaria secretora, que inhibiría el acceso de los virus a través de las mucosas.

Sería deseable el desarrollo de una vacuna estable que podría provocar respuestas tanto humorales como celulares, incluyendo la inmunidad mucosa y que fuera lo suficientemente flexible para incorporar secuencias de muchas cepas de un agente infeccioso, tal como VIH-1.

Sumario de la invención

Los inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipoPE") en los que se ha insertado un epítopo exógeno en el dominio Ib son útiles para provocar respuestas inmunitarias humorales, mediadas por células y secretoras contra el epítopo exógeno. En particular, el epítopo exógeno puede ser el bucle V3 de la proteína gp120 de VIH. Tales quimeras son útiles en vacunas contra la infección por VIH.

Los inmunógenos quiméricos PE ofrecen diversas ventajas. Primero, pueden prepararse completamente por medios recombinantes. Esto elimina la necesidad de unir el epítopo a PE mediante entrecruzamiento químico y de inactivar químicamente la exotoxina. La tecnología recombinante también permite preparar un "casete" quimérico que tenga un sitio de inserción para el epítopo exógeno elegido en la localización del dominio Ib. Esto permite insertar rápidamente variantes existentes de un epítopo, o variantes nuevas de epítopos que evolucionan rápidamente. Esto permite la producción de vacunas que incluyen un cóctel de inmunógenos diferentes.

Segundo, la exotoxina de Pseudomonas puede diseñarse alterando la función de sus dominios, proporcionando así una variedad de actividades. Por ejemplo, al sustituir el dominio natural de unión de células de exotoxina A de Pseudomonas (dominio Ia) por un ligando para un receptor celular particular, puede dirigirse a la quimera para que se una al tipo celular particular.

Tercero, debido a que el dominio Ib incluye un bucle de cisteína a cisteína, los epítopos que son de naturaleza muy constreñida pueden presentarse en una conformación casi natural. Esto ayuda a provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno natural. Por ejemplo, es evidente un motivo giro-giro-hélice con los péptidos circulares (restringidos por un enlace disulfuro) pero no con los lineales. (Ogata, M., y cols., 1990, Biol Chem 265, 20678-85). También los péptidos circulares son reconocidos más fácilmente por los anticuerpos monoclonales contra el bucle V3 que los lineales. (Catasti, P., y cols., 1995, J Biol Chem 270, 2224-32).

Cuarto, las quimeras descritas actualmente pueden usarse para provocar una respuesta inmunitaria humoral, una mediada por células o una secretora. Se ha reseñado que la exotoxina de Pseudomonas actúa como un "superantígeno", al unirse directamente a las moléculas de CHM Clase II sin procesamiento previo en la célula presentadora de antígeno. P.K. Legaard y cols. (1991) Cellular Inmunology 135: 372-382. Esto promueve una respuesta inmunitaria mediada por CHM Clase II contra células que portan proteínas que contienen el epítopo exógeno. También, al unirse al receptor de la superficie celular, las exotoxinas quiméricas de Pseudomonas se translocan al citosol. Esto posibilita una respuesta inmunitaria dependiente de CHM Clase I contra las células que portan el epítopo exógeno en su superficie. Este aspecto es particularmente ventajoso porque normalmente el sistema inmunitario monta una respuesta inmunitaria dependiente de CHM Clase I solamente contra proteínas producidas por la célula. También, al dirigir la quimera a una superficie mucosa, se puede provocar una respuesta inmunitaria secretora que involucre a las IgA.

Moore y cols., 1995, Vaccine, Vol 13. n.º 18, 174171-1741749 describe que la inmunización con una proteína recombinante de la cubierta de VIH atrapada en micropartículas biodegradables indujo respuestas consistentes de linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} específicas de VIH en ratones. Se describe que la inmunización con tales micropartículas por vía intranasal indujo niveles modestos de IgA secretora.

Hinkula y cols., 1997, Vaccine. Vol 15, n.º 8, 874-878 describe que puede inducirse la inmunidad contra proteínas reguladoras de VIH-1 mediante vacunación con genes. Se describe que una combinación de cinco genes proporcionó una reactividad potente contra todos ellos, y que la inmunización intranasal produjo una buena actividad en la mucosa induciendo respuestas de proliferación de IgG, IgA y linfocitos T.

Rubinstein y cols., 1995, AIDS, Vol 9, n.º 3, 243-251 se refiere a un conjugado que comprende un péptido del dominio neutralizante principal de VIH-1. El conjugado se administró por vía intradérmica y, después de la segunda inmunización, se detectaron anticuerpos en 10 de los 11 voluntarios; tras la cuarta inmunización, se detectaron anticuerpos de afinidad alta. Se detectaron valoraciones altas de IgG e IgA en el suero y la saliva de todos los sujetos analizados.

En un aspecto, esta invención proporciona un inmunógeno quimérico no tóxico tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad provocada por un patógeno que penetra en un mamífero a través de una membrana mucosa, en el que el medicamento es para su aplicación a una superficie mucosa del mamífero para provocar una respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora contra el patógeno. El inmunógeno comprende por orden: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500 aminoácidos que se une a un receptor superficial celular; (2) un dominio de translocación que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la translocación al citosol celular; (3) un dominio de un epítopo exógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y 1500 aminoácidos que comprende un epítopo exógeno; y, opcionalmente, (4) una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende una secuencia de retención en el RE. En una realización, el inmunógeno quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de una PE no tóxica en la que el dominio Ib además comprende el epítopo exógeno entre dos restos de cisteína del dominio Ib.

En ciertas realizaciones, el dominio de reconocimiento celular se une al receptor de macroglobulina \alpha2 ("\alpha2-MR"), al receptor del factor de crecimiento epidérmico ("EGF"), al receptor de IL-2, al receptor de IL-6, al receptor de transferrina humana o a gp120. En otra realización, el dominio de reconocimiento celular comprende las secuencias de aminoácidos de un factor de crecimiento. En otra realización, el dominio de translocación comprende los aminoácidos 280 a 364 del dominio II de PE. En otra realización, el dominio de epítopo exógeno comprende un bucle de cisteína a cisteína que comprende el epítopo exógeno. En otra realización, el dominio de epítopo exógeno comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del bucle V3 de VIH -1. En otra realización, el dominio de retención en el RE es el dominio III de PE que comprende una mutación que elimina la actividad de ADP-ribosilación, tal como E553. El dominio de retención en el RE puede comprender la secuencia de retención en el RE REDLK (SEC. ID. N.º: 11), REDL (SEC. ID. N.º: 12) o KDEL (SEC. ID. N.º: 13). En otra realización el epítopo exógeno es un epítopo de un patógeno (por ejemplo, un epítopo de un virus, una bacteria o un protozoo parasítico) o de un antígeno canceroso.

En otro aspecto, esta invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo IgA secretor que reconoce específicamente un epítopo de HIV-1, en la que el anticuerpo es producido mediante la administración a al menos una superficie mucosa de un sujeto, de un inmunógeno quimérico tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") no tóxico que comprende: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500 aminoácidos que se une a un receptor superficial celular de la superficie mucosa; (2) un dominio de translocación que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la translocación al citosol celular; (3) un dominio de un epítopo exógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y 1500 aminoácidos que codifica un epítopo de VIH-1; y (4) una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende una secuencia de retención en el RE.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1C. (A y B) A representación esquemática de PE y de una quimera de PE-bucle V3 que muestra la localización relativa de los bucles Ib y V3 entre los dominios II y III. También se muestra la localización aproximada de la eliminación de un aminoácido único (\DeltaE553) para eliminar la toxicidad de PE. (C) Las secuencias de aminoácidos, representadas por un código de una sola letra, que sustituyen el bucle Ib de PE natural por una secuencia de bucle V3 de gp120 (negrita) de las cepas MN o Thai-E (TE) de VIH-1 contenían dos residuos de cisteína diseñados para producir una conformación de bucle tras la formación del enlace disulfuro. La inserción de un único sitio de restricción PstI, que se usa para la introducción de secuencias de bucle V3, produjo diversas modificaciones de la secuencia de aminoácidos de PE natural adyacente al bucle Ib (cursiva). Se preparó un inserto peptídico de control irrelevante como control y se denomina ntPE-fp16. Se muestran las masas moleculares calculadas para las proteínas expresadas de longitud completa. PE natural - SEC. ID. N.º: 5; ntPE-V3MN14 - SEC. ID. N.º: 7; ntPE-V3MN26 - SEC. ID. N.º: 8; ntPE-V3Th-E26 - SEC. ID. N.º: 9; ntPE-fp16 - SEC. ID. N.º: 10.

Figuras 2A-2C. Caracterización de las quimeras de ntPE-bucle V3 tras la separación por SDS-PAGE (a) Tinción con azul Coomasie de las quimeras de ntPE-bucle V3 tras la separación por SDS-PAGE. Se cargó aproximadamente 1 \mug de proteína en cada carril. (B) Análisis por transferencia Western de las quimeras de ntPE-bucle V3. Después de la transferencia a membranas Immobilon P, las proteínas se sondaron con anticuerpos monoclonales generados contra gp120/MN (1F12) o gp120/Thai-E (1B2) intactos. Se insertó una secuencia irrelevante de 16 aminoácidos en la región del bucle Ib de ntPE (ntPE-fp16) y se usó aquí como control negativo. (C) Se usaron estudios de inmunocaptura, usando 1F12 o 1B2 inmovilizados sobre sepharose con proteína G, para caracterizar la exposición de las secuencias del bucle V3 sobre la superficie de diversas proteínas quiméricas. Las proteínas se visualizaron tiñendo geles con azul Coomasie. Se usaron Gp120 y ntPE-fp16 como controles positivos y negativos respectivamente. La captura de las proteínas de PE-bucle V3 se indica con una única punta de flecha y la de gp120 con una doble punta de flecha. El panel de la izquierda solamente muestra la presencia de la cadena pesada (hc) de los anticuerpos dado que la cadena ligera (lc) se salió del gel. El panel derecho muestra ambas cadenas.

Figuras 3A-3C. Las inserciones de las secuencias de aminoácidos del bucle V3 no alteran significativamente la estructura secundaria de PE natural. Los espectros de DC en el UV cercano (A) y en el UV lejano (B) (media de tres barridos después de la sustracción del espectro de ruido de fondo) se refinaron digitalmente, se corrigieron para tomar en cuenta la concentración, y se normalizaron con las unidades de elipticidad de peso medio de los restos. (C) Los cálculos de las estructuras secundarias se realizaron usando el programa de ajuste SELCON. *El contenido en hélices \alpha calculado es acorde a los valores determinados a partir de los cambios que se observan en la elipticidad a 222 nm.

Figura 4. Las quimeras de PE-bucle V3 tóxicas afectan a la supervivencia celular. Se determinó el grado de síntesis de proteínas, evaluado por la incorporación de ^{3}H-leucina, en células A431 humanas tras 18 horas de exposición a diversas concentraciones de PE natural o de una forma tóxica (con un resto de ácido glutámico en la posición 553 y con capacidad de ADP-ribosilación del factor de elongación 2) de PE-V3MN26.

Figuras 5A-5B. Caracterización del suero de conejo tras la inmunización o con ntPE-V3MN26 o con ntPE-V3Th-E26. (A) Se evaluó la reactividad por transferencia Western de antisuero de conejo diluido 1:1000 contra gp120/MN recombinante y gp120/Th-E después de SDS-PAGE y la transferencia de las proteínas a membranas Immobilon P. El anticuerpo primario reactivo se detectó mediante un anticuerpo secundario contra Ig de conejo conjugado con peroxidasa de rábano. (B) El suero de conejo que se obtuvo de animales a los que se había inyectado ntPE-V3MN26 se incubó previamente con gp120/MN soluble competitiva a concentraciones de hasta 50 \mug/ml. Se detectó la reactividad residual mediante análisis por transferencia Western de gp120/MN inmovilizada tal como se describe para
(A).

Figura 6. Una quimera de ntPE-bucle V3 administrada a conejos produce una respuesta de anticuerpos capaz de neutralizar la capacidad infecciosa de VIH-1 in vitro. Se inmunizó a los conejos por vía subcutánea con 200 \mug de ntPE-V3MN26 y se les inyectaron refuerzos de forma similar después de 2, 4 y 12 semanas. Se evaluaron los sueros recogidos durante hasta 27 semanas después de la administración inicial para determinar la capacidad para proteger una línea de linfocitos T humana, MT4, de la destrucción por VIH-1 MN mediante un ensayo de conversión de con tinte MTT. Los valores representan lecturas por triplicado normalizados con respecto a una incubación de MT4 de control no expuestos a virus.

La Figura 7 es un diagrama de la estructura de exotoxina A de Pseudomonas. Se indica la posición del aminoácido basándose en la SEC. ID. N.º: 2. El dominio Ia abarca los aminoácidos 1-252. El dominio II abarca los aminoácidos 253-364. Incluye un bucle de cisteína a cisteína formado por cisteínas en los aminoácidos 265-287. La furina provoca una escisión en el bucle de cisteína a cisteína entre los aminoácidos 279 y 280. Un fragmento de PE que empieza con el aminoácido 280 se transloca al citosol. Las construcciones en las que se eliminan los aminoácidos 345-304 también se translocan. El dominio Ib abarca los aminoácidos 365-399. Contiene un bucle de cisteína a cisteína formado por cisteínas en los aminoácidos 372 y 379. El dominio puede eliminarse completamente. El dominio III abarca los aminoácidos 400-613. La eliminación del aminoácido 553 elimina la actividad de ADP-ribosilación. La secuencia del retículo endoplasmático, REDLK (SEC. ID. N.º: 11) está situada en el extremo carboxi de la molécula, en los aminoácidos 609-613.

La Figura 8 demuestra que las quimeras de PE-bucle V3 se mueven de forma similar a PE natural. Monocapas confluentes de células Caco-2 se expusieron apicalmente a exotoxina enzimáticamente activa recombinante de Pseudomonas (rEA-PE). Se comparó la destrucción de células producida por 24 h de exposición a diversas concentraciones de PE natural (rEA-PE) con la producida mediante un tratamiento similar con versiones enzimáticamente activas de quimeras de PE que contenían 14 ó 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 de VIH-1.

La Figura 9 demuestra que las quimeras de PE-bucle V3 inducen una respuesta de IgG en suero. Se administró una quimera no tóxica (enzimáticamente inactiva) del bucle V3 que contenía 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 de VIH-1 (PEMN26) a conejos mediante seis protocolos de inoculación diferentes. Las muestras de suero extraídas en los tiempos descritos se ensayaron mediante un ELISA para determinar la IgG específica de MNgp120 usando un anticuerpo monoclonal (1F12) que reconoce el bucle V3 de esta proteína para el calibrado del ensayo.

La Figura 10 muestra que las quimeras de PE-bucle V3 inducen una respuesta de IgA salivar. Se administró una quimera no tóxica (enzimáticamente inactiva) del bucle V3 que contenía 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 de VIH-1 (PEMN26) a conejos mediante seis protocolos de inoculación diferentes. Las muestras de saliva obtenidas tras la administración de pilocarpina en los momentos descritos se ensayaron mediante ELISA para determinar IgA específica de MNgp120. No había IgA específica de gp120 disponible para el calibrado del ensayo. Los valores se expresan como valores normalizados con una muestra positiva estandarizada.

La Figura 11 muestra los niveles relativos de IgA salivar tras la inoculación a mucosas o sistémica de ntPE-V3MN26. Se midieron los anticuerpos IgA específicos de MN-gp120 mediante ELISA en muestras de saliva, normalizadas con una muestra fuertemente positiva y se expresaron en una escala arbitraria de una unidad de IgA específica de antígeno.

La Figura 12 muestra los niveles en suero de IgG tras la inoculación de mucosas o sistémica de ntPE-V3MN26. Se midieron los anticuerpos IgG específicos de MN-gp120 mediante ELISA en muestras de suero, y se normalizaron con un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce específicamente el bucle V3 de MNgp120.

La Figura 13 muestra los niveles en suero de IgG tras la inyección subcutánea de ntPE-V3MN26. La respuesta inmunitaria producida a partir de la inyección de ntPE-V3MN26 (barras sombreadas) se comparó con la inducida cuando se inyectaba conjuntamente con una pauta de adyuvante completo e incompleto de Freund (barras negras). Se inyectó PE no tóxica que no contenía los 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 con la misma pauta de adyuvante que el control. Los anticuerpos IgG específicos de MN-gp120 se midieron en muestras de suero mediante ELISA y se normalizaron con un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce específicamente el bucle V3 de MNgp120.

Las Figuras 14A y 14B muestran la neutralización de cepas aisladas clínicas de VIH con anticuerpos generados con los inmunógenos quiméricos de esta invención. Los sueros posteriores a la vacunación de conejos a los que se había inyectado ntPE-V3MN26 se mezclaron con un subtipo de virus B (Figura 14A) o E (Figura 14B). Tras una incubación de 1 hora a 37ºC, se determinó la capacidad infecciosa vírica añadiendo virus tratado a PBMC durante otros 3 días. La inhibición del crecimiento vírico se evaluó midiendo los niveles de p24. Cuadrado blanco: antígeno p24 (sin infectar); círculo negro: antígeno p24 1 en suero antes del desangramiento; círculo blanco: antígeno p24 1 suero inmunitario (24 semanas).

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente memoria tienen el significado que entiende comúnmente una persona de experiencia en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a una persona de experiencia en la técnica una definición general de muchos de los términos que se usan en esta invención: Singleton y cols. DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2ª ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker editor, 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5ª Ed., R. Rieger y cols. (editores), Springer Verlag (1991); y Hale & Marharn, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Tal como se usa en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados que se les adscriben a no ser que se indique lo contrario.

"Polinucleótido" se refiere a un polímero formado por unidades nucleotídicas. Los polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos naturales, tales como ácido desoxirribonucleico ("ADN") y ácido ribonucleico ("ARN") así como análogos de los ácidos nucleicos. Los análogos de los ácidos nucleicos incluyen los que incluyen bases no naturales, nucleótidos que se enlazan con otros nucleótidos mediante enlaces distintos del enlace fosfodiéster natural o que incluyen bases que se unen a través de enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster naturales. Así, los análogos de nucleótidos incluyen, por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosforamidatos, boranofosfatos, metilfosfonatos, fosfonatos metílicos quirales, ribonucleótidos 2-O-metílicos, ácidos péptidonucleicos (PNA), y similares. Tales polinucleótidos pueden sintetizarse por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado. El término "ácido nucleico" habitualmente se refiere a polinucleótidos grandes. El término "oligonucleótido" habitualmente se refiere a polinucleótidos cortos, generalmente de menos de aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia nucleotídica está representada por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), ésta también incluye un secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" sustituye a "T".

"ADNc" se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, o bien en forma monocatenaria o bicatenaria.

En la presente memoria se usa la notación convencional para describir las secuencias de polinucleótidos: el extremo de la izquierda de una secuencia de polinucleótidos monocatenaria es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de una secuencia de polinucleótidos bicatenaria se denomina dirección 5'. La adición de nucleótidos en dirección de 5' a 3' a transcritos de ARN en formación se denomina dirección de transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina "cadena codificante"; las secuencias de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que un ARNm tránscrito a partir de ese ADN y que están situadas en posición relativa 5' del extremo 5' del tránscrito de ARN se dice que son "secuencias aguas arriba"; las secuencias de la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están situadas en posición relativa 3' del extremo 3' del tránscrito de ARN codificante se denominan "secuencias aguas abajo".

"Complementario" se refiere a la compatibilidad topológica o acoplamiento de superficies que interactúan de dos polinucleótidos. Así, puede decirse que las dos moléculas son complementarias, y además, las características de la superficie de contacto son complementarias entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos de la cadena compañera que se une al polinucleótido del segundo polinucleótido. Así, el polinucleótido cuya secuencia es 5'-TATAC-3' es complementario a un polinucleótido cuya secuencia es 5'-GTATA-3'.

Una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos de referencia si la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos sujeto es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia.

"Codificante" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos de un polinucleótido, tales como un gen, un ADNc, o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen o una secuencia de nucleótidos definida (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia de aminoácidos definida y las propiedades biológicas que resultan de ella. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm producido por ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y que habitualmente se proporciona en los listados de secuencias, como la cadena no codificante, que se usa como plantilla para la transcripción, de un gen o ADNc puede decirse que codifican la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A no ser que se indique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas las unas de las otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.

"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que no están unidas de forma natural. Un polinucleótido recombinante amplificado o ensamblado puede estar incluido en un vector adecuado, y el vector puede usarse para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que comprende el polinucleótido recombinante se denomina "célula huésped recombinante". El gen se expresa después en la célula huésped recombinante produciendo, por ejemplo, un "polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante también puede realizar una función no codificante (por ejemplo, promotor, origen de replicación, sitio de unión de ribosomas, etc.).

"Secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que regula la expresión (transcripción y/o traducción) de una secuencia de nucleótidos ligada operativamente a ella. "Ligada operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos partes en las que la actividad de una parte (por ejemplo, la capacidad de regular la transcripción) produce una acción en la otra parte (por ejemplo, transcripción de la secuencia). Las secuencias de control de la expresión pueden incluir, por ejemplo y sin limitación, secuencias de promotores (por ejemplo, inducibles o constitutivos), potenciadores, terminadores de la transcripción, un codon de inicio (es decir, ATG), señales de procesamiento para intrones, y codones de terminación.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión ligadas operativamente a una secuencia de nucleótidos a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en posición cis para la expresión; la célula huésped o el sistema de expresión in vitro pueden proporcionar otros elementos para la expresión. Vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el the polinucleótido recombinante.

"Amplificación" se refiere a cualquier medio por el cual se copia una secuencia de polinucleótidos y así se expande a un mayor número de moléculas de polinucleótido por ejemplo, por transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa, y reacción en cadena de la ligasa.

"Cebador" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridarse de forma específica a una plantilla polinucleotídica determinada y de proporcionar un punto de iniciación para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis se produce cuando el cebador polinucleotídico se introduce en condiciones en las que se induce la síntesis, es decir, en presencia de nucleótidos, una plantilla polinucleotídica complementaria, y un agente para la polimerización tal como ADN polimerasa. Un cebador es habitualmente monocatenario, pero puede ser bicatenario. Los cebadores habitualmente son ácidos desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores sintéticos y naturales son útiles para muchas aplicaciones. Un cebador es complementario a la plantilla a la que está diseñado para hibridarse para servir de sitio de iniciación de la síntesis, pero no tiene que reflejar la secuencia exacta de la plantilla. En tal caso, la hibridación específica del cebador a la plantilla depende de lo estricto de las condiciones de hibridación. Los cebadores pueden marcarse, por ejemplo, con restos cromógenos, radioactivos o fluorescentes y usarse como restos
detectables.

"Sonda" cuando se usa refiriéndose a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridarse específicamente a una secuencia designada de otro polinucleótido. Una sonda se hibrida específicamente a un polinucleótido complementario diana, pero no tiene que reflejar la secuencia complementaria exacta de la plantilla.

En tal caso, la hibridación específica de la sonda a la diana depende de lo estricto de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden marcarse, por ejemplo, con restos cromógenos, radioactivos o fluorescentes y usarse como restos detectables.

Una primera secuencia es una "secuencia antisentido" con respecto a una segunda secuencia si un polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia se hibrida específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda secuencia.

"Hibridarse de forma específica" o "hibridación específica" o "hibridarse selectivamente a", se refiere a la unión, emparejamiento o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferentemente a una secuencia de nucleótidos particular en condiciones estrictas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de ADN o ARN, (por ejemplo ADN o ARN total de la célula).

El término "condiciones estrictas" se refiere a las condiciones en las que una sonda se hibridará de forma preferente a su subsecuencia diana, y en un grado menor, o nada, a otras secuencias. "Hibridación estricta" y "condiciones de lavado de hibridación estrictas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos tales como hibridizaciones de Southern y Northern dependen de las secuencias, y son diferentes al cambiar los parámetros del entorno. En Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York, se encuentra una extensa guía de la hibridación de ácidos nucleicos. En general, las condiciones de hibridación y lavado altamente estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica con una potencia iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (con una potencia iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente complementaria. Las condiciones muy estrictas se seleccionan para que sean iguales a la Tm de una sonda particular.

Un ejemplo de condiciones de hibridación estrictas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una transferencia de Southern o Northern son formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, realizando la hibridación toda la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente estrictas son NaCl 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado estrictas es un lavado de 0,2 x SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook y cols. para una descripción del tampón SSC). A menudo, un lavado muy estricto viene precedido por un lavado poco estricto para eliminar la señal de la sonda de ruido de fondo. Un ejemplo de lavado medianamente estricto para un emparejamiento, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, es 1 x SCC a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado poco estricto para un emparejamiento, por ejemplo, de más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSCa 40ºC durante 15 minutos. En general, una relación entre la señal y el ruido de fondo de 2 veces (o más) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica.

"Polipéptido" se refiere a un polímero compuesto por restos aminoacídicos, sus variantes estructurales naturales relacionadas, y sus análogos sintéticos no naturales ligados mediante enlaces peptídicos, sus variantes estructurales naturales relacionadas, y sus análogos sintéticos no naturales. Los polipéptidos sintéticos pueden sintetizarse, por ejemplo, usando un sintetizador polipeptídico automatizado. El término "proteína" habitualmente se refiere a polipéptidos grandes. El término "péptido" habitualmente se refiere a polipéptidos cortos.

En la presente memoria se usa la notación convencional para representar secuencias polipeptídicas: el extremo izquierdo de una secuencia polipeptídica es el extremo amino; el extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el extremo carboxilo.

"Sustitución conservadora" se refiere a la sustitución en un polipéptido de un aminoácido por un aminoácido funcionalmente similar. Los seis grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son substituciones conservadoras las unas de las otras:

1)

Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2)

Ácido aspártico(D), Ácido glutámico (E);

3)

Asparragina (N), Glutamina (Q);

4)

Arginina (R), Lisina (K);

5)

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6)

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

"Variante alélica" se refiere a cualquiera de dos o más formas polimorfas de un gen que ocupa el mismo locus genético. Las variaciones alélicas surgen naturalmente a través de mutaciones, y pueden producir polimorfismo fenotípico entre las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silentes (el polipéptido codificado no cambia) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. "Variantes alélicas" también se refieren a ADNc derivados de tránscritos de ARNm de variantes alélicas genéticas, así como a las proteínas codificadas por ellos.

Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o restos aminoacídicos que son iguales, cuando se comparan y alinean buscando la máxima correspondencia, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual.

La frase "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos 60%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad entre los nucleótidos o restos aminoacídicos, cuando se comparan y alinean buscando la máxima correspondencia, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Preferiblemente, la identidad sustancial, existe en una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente de 50 restos de longitud, más preferiblemente en una región de al menos aproximadamente 100 restos, y lo más preferiblemente las secuencias son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150 restos. En la realización más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas en la longitud completa de las regiones codificantes.

Para la comparación de las secuencias, habitualmente una secuencia actúa de secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de las secuencias. El algoritmo de comparación de las secuencias después calcula la identidad porcentual de las secuencias para la(s) secuencia(s) de ensayo comparando con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados.

Puede realizarse un alineamiento óptimo de las secuencias para compararlas, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch. J. Mol. Biol. 48: 443(1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA del Paquete de programas de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase de forma general Ausubel y cols., referencia anterior).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas, por parejas para mostrar la relación y la identidad porcentual de las secuencias. También representa un árbol o dendograma que muestra las relaciones entre los agrupamientos que se usaron para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineación progresiva de Feng y Doolittle. J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El procedimiento que se usa es similar al procedimiento descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple se inicia con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento después se alinea con la siguiente secuencia o agrupamiento de secuencias alineadas con una relación más próxima. Dos agrupamientos de secuencias se alinean mediante una simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se logra mediante una serie de alineamientos por pares progresivos. El programa se corre designando las secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de las secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede compararse con otras secuencias de ensayo para determinar la relación entre la identidad porcentual de las secuencias usando los siguientes parámetros: peso del hueco por defecto (3,00), peso de la longitud del hueco por defecto (0.10), y huecos finales ponderados.

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar la identidad porcentual de las secuencias y la similitud de las secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y cols., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El programa para realizar análisis por BLAST está disponible al público a través del Nacional Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica primero identificar pares de secuencias con puntuaciones elevadas (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que o bien concuerdan o bien satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul y cols., referencia anterior). Estas coincidencias de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contienen. Las coincidencias de palabras después se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo lo lejos que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa por un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de sanción por los restos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de la alineación acumulada decae una cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989).

Además de calcular la identidad porcentual de las secuencias, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud que proporciona el algoritmo BLAST es la probabilidad sumatoria menor (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que una coincidencia entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácidos ocurriera por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad sumatoria menor en una comparación entre el ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico sea inmunológicamente reactivo con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describe más adelante. Así, un polipéptido es habitualmente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en substituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibriden entre si en condiciones estrictas, tal como se describe en la presente memoria.

Un "ligando" es un compuesto que se une específicamente a una molécula diana.

Un "receptor" es un compuesto que se une específicamente a un ligando.

"Anticuerpo" se refiere a un ligando polipeptídico sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulinas, o sus fragmentos, que específicamente se une y reconoce un epítopo (por ejemplo, un antígeno). Los genes de inmunoglobulinas reconocidos incluyen los genes de la región constante de las cadenas ligeras kappa y lambda, los genes de la región constante de las cadenas pesadas alfa, gamma, delta, epsilon y mu, y la miriada de genes de la región variable de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos existen, por ejemplo, en forma de inmunoglobulinas intactas o en forma de un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Estos incluyen, por ejemplo, los fragmentos Fab' y F(ab)'_{2}. El término "anticuerpo" tal como se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de anticuerpos o bien producidos por la modificación de anticuerpos enteros o los sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. También incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. La porción "Fc" de un anticuerpo se refiere a la porción de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende uno o más dominios de la región constante de la cadena pesada, CH_{1}, CH_{2} y CH_{3} pero no incluye la región variable de la cadena pesada.

Un ligando o un receptor (por ejemplo, un anticuerpo) "se une específicamente a" o es "específicamente inmunorreactivo con" un compuesto analito cuando el ligando o receptor funciona en una reacción de unión que determina la presencia del analito en una muestra de compuestos heterogéneos. Así, en las condiciones de ensayo (por ejemplo, inmunoensayo) designadas, el ligando o receptor se une de forma preferente a un analito particular y no se une en una cantidad significativa a otros compuestos presentes en la muestra. Por ejemplo, un polinucleótido se une específicamente en condiciones de hibridación a un polinucleótido analito que comprende una secuencia complementaria; un anticuerpo se une específicamente en condiciones de inmunoensayo a un analito antígeno que porta un epítopo contra el que se generó el anticuerpo; y un adsorbente se une específicamente a un analito en condiciones de elución adecuadas.

"Inmunoensayo" se refiere a un procedimiento de detectar un analito en una muestra que implica poner en contacto la muestra con un anticuerpo que específicamente se une al analito y detectar la unión entre el anticuerpo y el analito. Pueden usarse una variedad de formatos de inmunoensayos para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, rutinariamente se usan inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de formatos de inmunoensayos y condiciones que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.

"Vacuna" se refiere a un agente o composición que contiene un agente eficaz para conferir un grado terapéutico de inmunidad a un organismo a la vez que provoca solo niveles muy bajos de morbidez o mortandad. Los procedimientos para preparar vacunas son, por supuesto, útiles en el estudio del sistema inmunitario y en la prevención y tratamiento de la enfermedad animal o humana.

Una "cantidad inmunógena" es una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto.

"Sustancialmente puro" o "aislado" quiere decir que una especie objeto es la especie presente predominante (es decir, en términos molares, más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual de la composición), y una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente 50% (en términos molares) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura quiere decir que aproximadamente del 80% al 90% o más de la especie macromolecular presente en la composición es la especie purificada de interés. La especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (la especie contaminante no puede detectarse en la composición mediante procedimientos de detección convencionales) si la composición está formada esencialmente por una única especie macromolecular. Las especies de disolventes, moléculas pequeñas (<500 Daltons), estabilizantes (por ejemplo, BSA), y especies iónicas elementales no se consideran especies macromolecular para los fines de esta definición.

"Natural" aplicado a un objeto se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo los virus) que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no ha sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio es natural.

"Detectar" se refiere a determinar la presencia, ausencia, o cantidad de un analito en una muestra, y puede incluir cuantificar la cantidad del analito en una muestra o por célula en una muestra.

"Resto detectable" o una "marcador" se refieren a una composición que puede detectarse por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, marcadores útiles incluyen ^{32}P, ^{35}S, tintes fluorescentes, reactivos con alta densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, tal como se usa comúnmente en un ELISA), biotina-estreptavadina, dioxigenina, haptenos y proteínas para los que hay disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales, o moléculas de ácido nucleico con una secuencia complementaria a una diana. El resto detectable a menudo genera una señal cuantificable, tal como una señal radioactiva, cromógena o fluorescente, que puede usarse para cuantificar la cantidad de resto detectable unido en una muestra. El resto detectable puede estar incorporado o unido a un cebador o sonda bien de forma covalente, o a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, la incorporación de nucleótidos radioactivos, o de nucleótidos biotinilados que son reconocidos por estreptavadina. El resto detectable puede detectarse directa o indirectamente. La detección indirecta puede implicar la unión de un segundo resto detectable de forma directa o indirecta. Por ejemplo, el resto detectable puede ser el ligando de una pareja de unión, tal como la biotina, que es una pareja de unión de estreptavadina, o una secuencia de nucleótidos, que es la pareja de unión de una secuencia complementaria, a la que puede hibridarse específicamente. La pareja de unión puede ser en si detectable directamente, por ejemplo, un anticuerpo puede estar marcado él mismo con una molécula fluorescente. La pareja de unión también puede ser indirectamente detectable, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria puede ser parte de una molécula de ADN ramificada que a su vez es detectable a través de su hibridación a otras moléculas de ácido nucleico marcadas. (Véase, por ejemplo, PD. Fahrlander y A. Klausner, Bio/Technology (1988) 6: 1165). La cuantificación de la señal se logra, por ejemplo, por recuento del centelleo, densitometría o citometría de flujo.

"Ligador" se refiere a una molécula que une otras dos moléculas, o bien covalentemente, o a través de enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que se hibrida a una secuencia complementaria en el extremo 5' y a otra secuencia complementaria en el extremo 3', uniendo así dos secuencias no complementarias.

"Composición farmacéutica" se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un mamífero. Una composición farmacéutica comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un agente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Cantidad farmacológicamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente eficaz para producir el resultado farmacológico que se pretende. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos, tampones, y excipientes farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, solución acuosa al 5% de dextrosa, y emulsiones, tales como una emulsión de aceite en agua o agua en aceite, y diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. Vehículos y formulaciones farmacéuticos adecuados se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19ª Ed. (Mack Publishing Co. Easton, 1995). Los vehículos farmacéuticos preferidos dependen del modo de administración del agente activo que se pretenda. Modos de administración típicos incluyen administración intestinal (por ejemplo, oral) o parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal; o administración tópica, transdérmica, o transmucosa). Una "sal farmacéuticamente aceptable" es una sal que puede formularse en un compuesto para uso farmacéutico que incluye, por ejemplo, sales metálicas (sodio, potasio, magnesio, calcio, etc.) y sales de amoniaco o aminas orgánicas.

"Molécula orgánica pequeña" se refiere a moléculas orgánicas de un tamaño comparable a las moléculas orgánicas que generalmente se usan en los fármacos. El término excluye biopolímeros orgánicos (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas preferidas varían en tamaño hasta aproximadamente 5000 Da, hasta aproximadamente 2000 Da, o hasta aproximadamente 1000 Da.

Un "sujeto" de diagnóstico o tratamiento es un ser humano o animal no humano, que incluye un mamífero o un primate.

"Tratamiento" se refiere a tratamiento profiláctico o a tratamiento terapéutico.

Un "tratamiento profiláctico" es un tratamiento que se administra a un sujeto que no muestra indicios de una enfermedad o muestra solamente indicios tempranos con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar la patología.

Un "tratamiento terapéutico" es un tratamiento que se administra a un sujeto que muestra indicios de patología con el fin de disminuir o eliminar esos indicios.

"Diagnóstico" quiere decir identificar la presencia o naturaleza de una afección patológica. Los procedimientos de diagnóstico difieren en su especificidad y selectividad. Mientras que un procedimiento diagnóstico particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una afección, es suficiente si el procedimiento proporciona una indicación positiva que ayude al diagnóstico.

"Pronóstico" quiere decir predecir el desarrollo probable (por ejemplo, gravedad) de una afección patológica.

"Pluralidad" quiere decir al menos dos.

La "exotoxina A de Pseudomonas" o "PE" es segregada por Ps aeruginosa en forma de una proteína de 67 kD compuesta por tres dominios globulares prominentes (la, II, y III) y un subdominio pequeño (Ib) que conecta los dominios II y III. (A.S. Allured y cols. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 1320-1324). El dominio Ia de PE media en la unión celular. En la naturaleza, el dominio Ia se une a la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas ("LRP") de baja densidad, también conocido como receptor de macroglobulina \alpha2 ("\alpha2-MR"). (M.Z. Kounnas y cols. (1992) J. Biol. Chem. 267: 12420-23). Abarca los aminoácidos 1-252. El dominio II media la translocación al citosol. Abarca los aminoácidos 253-364. El dominio Ib no tiene función conocida. Abarca los aminoácidos 365-399. El dominio III es responsable de la citotoxicidad e incluye una secuencia de retención en el retículo endoplasmático. Media la ADP-ribosilación del factor de elongación 2, que inactiva la síntesis de proteínas. Abarca los aminoácidos 400-613. PE es "no tóxica" si carece de actividad de ADP-ribosilación de FE2. La eliminación del aminoácido E553 ("\DeltaE553") del dominio III anula la toxicidad de la molécula. La PE que tiene la mutación \DeltaE553 se denomina en la presente memoria "PE \DeltaE553". Las formas genéticamente modificadas de PE se describen, por ejemplo, en Pastan y cols., patente de Estados Unidos 5.602.095; Pastan y cols., patente de Estados Unidos 5.512.658 y Pastan y cols., patente de Estados Unidos 5.458,878. Las formas alélicas de PE están incluidas en esta definición. Véase, por ejemplo, M.L. Vasil y cols., (1986) Infect. lmmunol. 52: 538-48. La secuencia de nucleótidos (SEC. ID. N.º: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC. ID. N.º: 2) de exotoxina A de Pseudomonas son:

1

2

3

"Bucle de cisteína a cisteína" se refiere a un resto peptídico de un polipéptido que está definido por una secuencia de aminoácidos flanqueado por dos restos de cisteína unidos mediante enlaces disulfuro.

"Epítopo exógeno" se refiere a un epítopo codificado por una secuencia de aminoácidos que no se produce de forma natural en el dominio Ib de exotoxina A de Pseudomonas.

II. Inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de Pseudomonas A. Estructura básica

Los inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") de esta invención son polipéptidos que tienen dominios estructurales organizados, a excepción de lo descrito en la presente memoria, en la misma secuencia que los cuatro dominios estructurales de PE (es decir, la, II, Ib y III), y que tienen ciertas funciones (por ejemplo, reconocimiento celular, translocación al citosol y retención en el retículo endoplasmático) que también poseen los dominios funcionales de PE. Además, los inmunógenos quiméricos tipo PE de esta invención poseen un dominio que funcionaliza un dominio de PE para el que no se ha identificado ninguna función todavía. En concreto, los inmunógenos quiméricos tipo PE sustituyen el dominio Ib de PE por un dominio de epítopo exógeno funcional que actúa como inmunógeno para provocar una respuesta inmunitaria contra el epítopo exógeno.

Por consiguiente, los inmunógenos quiméricos tipo PE incluyen los siguientes dominios estructurales que constan de secuencias de aminoácidos, confiriendo los dominios funciones particulares a la proteína quimérica: (1) un "dominio de reconocimiento celular" que funciona como ligando para un receptor superficial celular y que media la unión de la proteína a una célula; (2) un "dominio de translocación" que media la translocación desde los endosomas al citosol; (3) un "dominio de epítopo exógeno" que contiene el epítopo exógeno inmunógeno; y, opcionalmente, (4) un "dominio de retención en el retículo endoplasmático ("ER")" que funciona translocando la molécula del endosoma al retículo endoplasmático, desde el que penetra en el citosol. Cuando se elimina el dominio de retención el inmunógeno quimérico todavía puede mantener la función inmunógena.

En una realización, un inmunógeno quimérico tipo PE comprende la secuencia natural de PE, a excepción del dominio Ib, que está diseñado para que incluya la secuencia de aminoácidos de un epítopo exógeno. Por ejemplo, se puede insertar una secuencia de aminoácidos que codifica el epítopo exógeno en el bucle de cisteína a cisteína del dominio Ib. Sin embargo, la relación entre la estructura de PE y su función se ha estudiado extensamente. La secuencia de aminoácidos de PE ha sido rediseñada para proporcionar nuevas funciones, y se han identificado muchos aminoácidos o segmentos peptídicos críticos y no críticos para la función de PE. Los inmunógenos quiméricos tipo PE de esta invención pueden incorporar estas modificaciones estructurales de PE.

B. Dominio de reconocimiento celular

Las quimeras de exotoxina de Pseudomonas de esta invención comprenden una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio de reconocimiento celular". El dominio de reconocimiento celular funciona como ligando para un receptor de la superficie celular. Media la unión de la proteína a una célula. Su fin es dirigir la quimera a una célula que la transportará al citosol para su procesamiento. El dominio de reconocimiento celular puede estar localizado en la posición del dominio Ia de PE. Sin embargo, este dominio puede salirse de la organización normal de la secuencia. De forma más particular, el dominio de reconocimiento celular puede estar insertado aguas arriba del dominio de retención en el RE. De forma alternativa, el dominio de reconocimiento celular puede estar acoplado químicamente a la toxina. También, la quimera puede incluir un primer dominio de reconocimiento celular en la locación del dominio Ia y un segundo dominio de reconocimiento celular aguas arriba del dominio de retención en el RE. Tales construcciones pueden unirse a más de un tipo celular. Véase, por ejemplo, R.I. Kreitman y cols. (1992) Bioconjugate Chem. 3: 63-68.

Debido a que el dominio de reconocimiento celular funciona como un asa para unir la quimera a una célula, puede tener la estructura de cualquier polipéptido que se sepa que se une a un receptor particular. Por consiguiente, el dominio generalmente tiene el tamaño de ligandos polipeptídicos conocidos, por ejemplo, entre aproximadamente 10 aminoácidos y aproximadamente 1500 aminoácidos, o aproximadamente 100 aminoácidos y aproximadamente 300 aminoácidos.

Diversos procedimientos son útiles para identificar los dominios de reconocimiento celular funcionales para usar en los inmunógenos quiméricos. Un procedimiento implica detectar la unión entre una quimera que comprende el dominio de reconocimiento celular con el receptor o con una célula que porta el receptor. Otros procedimientos implican la detección de la entrada de la quimera en el citosol, lo que indica que la primera etapa, la unión a la célula, ha tenido éxito. Estos procedimientos se describen en detalle más adelante en la sección de pruebas.

El dominio de reconocimiento celular puede tener la estructura de cualquier polipéptido que se une a un receptor de la superficie celular. En una realización, la secuencia de aminoácidos es la del dominio Ia de PE, dirigiendo así la proteína quimérica al dominio \alpha2-MR. En otras realizaciones, el dominio Ia puede ser sustituido por: factores de crecimiento, tales como TGF\alpha, que se une al factor de crecimiento epidérmico ("EGF"); IL-2, que se une al receptor IL-2; IL-6, que se une al receptor IL-6 (por ejemplo, linfocitos B activados y células hepáticas); CD4, que se une a células infectadas por VIH-1); una quimioquina (por ejemplo, Rantes, MIP-1\alpha o MIP-1\beta), que se une a un receptor de quimioquinas (por ejemplo, CCR5 o fusina (CXCR4)); ligandos para los receptores de la superficie celular de leucocitos, por ejemplo, GM-CSF, G-CSF; ligandos para el receptor IgA; o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos a cualquier receptor (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios contra el receptor de transferrina humana). I. Pastan y cols. (1992) Annu. Rev. Biochem. 61: 331-54.

En una realización, el dominio de reconocimiento celular está localizado en el lugar del dominio Ia de PE. Puede estar unido al otro resto de la molécula a través de un ligador. Sin embargo, los estudios de ingeniería muestran que la exotoxina de Pseudomonas puede dirigirse a ciertos tipos de células mediante la introducción de un dominio de reconocimiento celular aguas arriba de la secuencia de retención en el RE, que esté localizada en el extremo carboxi del polipéptido. Por ejemplo, TGP\alpha ha sido insertado en el dominio III justo antes del aminoácido 604, es decir, aproximadamente a diez aminoácidos del extremo carboxi. Esta proteína quimérica se une a células que portan el receptor EGF. Pastan y cols., patente de Estados Unidos 5.602.095.

Los ligandos específicos de células que son proteínas a menudo pueden formarse parcial o totalmente como proteína de fusión con las quimeras de exotoxina de Pseudomonas de la presente invención. Una "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido formado mediante la unión de dos o más polipéptidos a través de un enlace peptídico formado por el extremo amino de un polipéptido y el extremo carboxi del otro polipéptido. La proteína de fusión puede formarse mediante el acoplamiento químico de los polipéptidos constituyentes pero habitualmente se expresa en forma de un único polipéptido a partir de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de fusión contigua única. Entre tales proteínas de fusión se incluyen los fragmentos Fv monocatenarios (scFv). Quimeras de exotoxina de Pseudomonas dirigidas particularmente preferidas son las proteínas estabilizadas por puentes disulfuro que pueden formarse en parte como proteína de fusión tal como se ejemplifica en la presente memoria. Otros ligandos proteínicos específicos de célu-
la pueden formarse como proteínas de fusión usando metodologías de clonado notorias para el experto en la técnica.

La unión de ligandos específicos de célula también puede lograrse a través del uso de ligadores. El ligador puede formar enlaces covalentes o enlaces no covalentes de afinidad alta con ambas moléculas. Los ligadores adecuados son notorios para los expertos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, ligadores carbonados de cadena lineal o ramificada, ligadores carbonados heterocíclicos, o ligadores peptídicos. Los ligadores pueden estar unidos a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (por ejemplo, a través de un enlace disulfuro a cisteína).

En una realización, el dominio Ia es sustituido por una secuencia polipeptídica para una cadena pesada de inmunoglobulina, de una inmunoglobulina específica para la célula diana. La cadena ligera de la inmunoglobulina puede coexpresarse con el inmunógeno quimérico tipo PE formando un dímero de cadena ligera-cadena pesada. En la proteína conjugada, el anticuerpo está unido químicamente a un polipéptido que comprende los otros dominios del inmunógeno quimérico.

El procedimiento para unir una quimera de exotoxina de Pseudomonas a un anticuerpo u otro ligando específico de célula variará dependiendo de la estructura química de la toxina. Los anticuerpos contienen una variedad de grupos funcionales; por ejemplo, grupos sulfhidrilo (-S), ácido carboxílico (COOH) o amina libre (-NH_{2}), que están disponibles para reaccionar con un grupo funcional adecuado de una toxina. De forma adicional o alternativa, el anticuerpo o quimera de exotoxina de Pseudomonas puede derivarse de forma que exponga o se una a grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar la unión de cualquiera de un número de moléculas ligadoras tales como las disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.

Un ligador bifuncional que tiene un grupo funcional que reacciona con un grupo de la quimera de exotoxina de Pseudomonas, y otro grupo que reacciona con un ligando específico de célula, puede usarse para formar un conjugado deseado. De forma alternativa, la derivatización puede implicar el tratamiento químico de la quimera de exotoxina de Pseudomonas o el ligando específico de célula, por ejemplo, escisión de glicol del resto glucídico de un anticuerpo glucoproteínico con peryodato generando grupos aldehído libres. Los grupos aldehído libres del anticuerpo pueden hacerse reaccionar con los grupos amina o hidrazina libres del anticuerpo uniendo la quimera de exotoxina de Pseudomonas a ellos. (Véase J.D. Rodwell y cols., patente de Estados Unidos n.º 4.671.958). También se conocen procedimientos para la generación de grupo sulfhidrilo libres en anticuerpos u otras proteínas. (Véase R.A. Nicoletti y cols., patente de Estados Unidos n.º 4.659.839).

C. Dominio de translocación

Los inmunógenos quiméricos tipo PE también comprenden una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio de translocación de PE". El dominio de translocación de PE comprende una secuencia de aminoácidos suficiente para efectuar la translocación de proteínas quiméricas que han sido endocitadas por la célula al citosol. La secuencia de aminoácidos es idéntica, o sustancialmente idéntica, a una secuencia que se selecciona del dominio II de PE.

La secuencia de aminoácidos suficiente para efectuar la translocación puede derivarse del dominio de translocación de PE natural. Este dominio abarca los aminoácidos 253-364. El dominio de translocación puede incluir la secuencia completa del dominio II. Sin embargo, no es necesaria la secuencia completa para la translocación. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede contener como mínimo, por ejemplo, los aminoácidos 280-344 del dominio II de PE. Las secuencias de fuera de esta región, es decir, los aminoácidos 253-279 y/o 345-364, pueden eliminarse del dominio. Este dominio también puede diseñarse con substituciones en tanto en cuanto se mantenga la actividad de translocación.

El dominio de translocación funciona de la forma siguiente. Tras la unión a un receptor de la superficie celular, las proteínas quiméricas penetran en la célula por endocitosis a través de vesículas recubiertas de clatrina. Los restos 265 y 287 son cisteínas que forman un bucle de disulfuros. Una vez se ha internado en los endosomas que tienen un entorno ácido, el péptido es escindido por la proteasa furina entre Arg279 y Gly280. Después, se reduce el enlace disulfuro. Una mutación en Arg279 inhibe la escisión proteolítica y la subsiguiente translocación al citosol. M. Ogata y cols. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20678-85. Sin embargo, un fragmento de PE que contiene la secuencia aguas abajo de Arg279 (denominada "PE37") mantiene una capacidad sustancial de translocar al citosol. C.B. Siegall y cols. (1989) J. Biol. Chem. 264: 14256-61. Las secuencias del dominio II a partir del aminoácido 345 también pueden eliminarse sin inhibir la translocación. Además, los aminoácidos de las posiciones 339 y 343 parecen ser necesarios para la translocación. C.B. Siegall y cols. (1991) Biochemistry 30: 7154-59.

Más adelante se describen procedimientos para determinar la funcionalidad de un dominio de translocación en la sección de pruebas.

D. Dominio de epítopo exógeno

Los inmunógenos quiméricos tipo PE también comprenden una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio de epítopo exógeno". El dominio de epítopo exógeno comprende la secuencia de aminoácidos de un epítopo exógeno. El dominio funciona conteniendo el epítopo inmunógeno exógeno para la presentación al sistema inmunitario. El dominio de epítopo exógeno está insertado en la localización del dominio Ib de PE, entre el dominio de translocación (por ejemplo, el dominio II) y el dominio de retención en el RE (por ejemplo, el dominio III). Más adelante se describen procedimientos para determinar la capacidad inmunógena de un dominio de translocación en la sección de pruebas.

El epítopo exógeno puede ser cualquier secuencia de aminoácidos que sea inmunógena. El dominio de epítopo exógeno puede tener entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 1500 aminoácidos. Esto incluye dominios que tienen entre aproximadamente 15 aminoácidos y aproximadamente 350 aminoácidos o aproximadamente 15 aminoácidos y aproximadamente 50 aminoácidos.

En la exotoxina A de Pseudomonas natural, el dominio Ib abarca los aminoácidos 365 a 399. El dominio Ib natural está caracterizado estructuralmente por un enlace disulfuro entre dos cisteínas en las posiciones 372 y 379. El dominio Ib no es esencial para la actividad de unión celular, translocación, retención en el RE o ADP-ribosilación. Por lo tanto, puede rediseñarse completamente.

El dominio de epítopo exógeno puede ser lineal o puede incluir un bucle cisteína-cisteína que comprenda el epítopo exógeno. En una realización, el dominio de epítopo exógeno incluye un bucle de cisteína a cisteína que comprende el epítopo exógeno. Esta distribución ofrece diversas ventajas. Primero, cuando el epítopo exógeno existe de forma natural en un bucle de cisteína a cisteína con enlaces disulfuros, o lo engloba, el dominio de epítopo exógeno presentará el epítopo en una conformación casi natural. Segundo, se cree que los restos aminoacídicos cargados en el dominio natural Ib producen una estructura hidrófila se sobresale de la molécula hacia el disolvente, donde está disponible para interactuar con componentes del sistema inmunitario. Por lo tanto, introducir el epítopo exógeno en un bucle de cisteína a cisteína produce una presentación más eficaz cuando el epítopo exógeno también es hidrófilo. Tercero, el dominio Ib es altamente insensible a la mutación. Por lo tanto, aunque el bucle de cisteína a cisteína del dominio Ib natural tiene solamente seis aminoácidos entre los restos de cisteína, pueden insertarse secuencias mucho más largas en el bucle sin alterar la actividad de unión celular, translocación, retención en el RE o ADP-ribosilación.

Esta invención prevé diversas formas de insertar el dominio de epítopo exógeno en el dominio Ib. Un procedimiento implica insertar la secuencia de aminoácidos del epítopo exógeno directamente en la secuencia de aminoácidos del dominio Ib, con o sin eliminación de secuencias de aminoácidos naturales. Otro procedimiento implica eliminar todo o parte del dominio Ib y sustituirlo por una secuencia de aminoácidos que incluye el epítopo exógeno entre dos restos de cisteína de forma que las cisteínas se impliquen en un enlace disulfuro cuando la proteína se expresa. Por ejemplo, si el epítopo exógeno existe normalmente dentro de una estructura de bucle de cisteína a cisteína de un polipéptido, una porción del polipéptido que incluye el bucle y el epítopo exógeno pueden insertarse en lugar del dominio del bucle de cisteína a cisteína.

La elección del epítopo exógeno es a discreción del investigador. Al elegir, el investigador puede considerar lo siguiente. Aunque el dominio de epítopo exógeno puede ser linear, los epítopos exógenos que existen de forma natural en un bucle de cisteína-cisteína se aprovechan de la estructura natural del bucle Ib de la exotoxina A de Pseudomonas. Los epítopos de agentes que son responsables de infecciones poco activas o de antígenos específicos de cánceres son atractivos porque estos antígenos tienden a resistir el ataque del sistema inmunitario. También, la tecnología recombinante permite insertar rápidamente un polinucleótido que codifica un epítopo en un vector que codifica la proteína quimérica. Por lo tanto, es posible cambiar las secuencias rápidamente al cambiar un epítopo exógeno. Por consiguiente, los epítopos de agentes infecciosos que cambian muy rápidamente son insertos atractivos.

Así, por ejemplo, los epítopos pueden elegirse a partir de cualquier patógeno, por ejemplo, virus, bacteria y parásitos protozoos. Las fuentes víricas de epítopos incluyen, por ejemplo, VIH, herpes zoster, influenza, polio y hepatitis. Las fuentes bacterianas incluyen, por ejemplo, tuberculosis, Chlamydia o Salmonella. Las fuentes de protozoos parasíticos incluyen, por ejemplo, Trypanosoma o Plasmodium. En particular, el agente puede ser uno que penetre en el cuerpo a través de membranas de mucosas epiteliales. Los antígenos específicos de cáncer útiles incluyen los que se expresan en la superficie celular y, por lo tanto, pueden ser diana de una respuesta de linfocitos T citotóxicos, tales como un marcador específico de cáncer de próstata (por ejemplo, PSA), un marcador específico de cáncer de mama (por ejemplo, BRCA-1 o HER2), un marcador específico de cáncer pancreático (por ejemplo, CA9-19), un marcador de melanoma (por ejemplo, tirosinasa) o una forma mutante específica de cáncer de EGF.

En una realización, el epítopo exógeno se deriva del bucle neutralizador principal de un retrovirus, tal como VIH-1 o VIH-2. En particular, el epítopo puede derivarse del bucle V3 de la proteína gp120 de VIH-1. Un bucle neutralizador puede identificarse mediante anticuerpos neutralizadores, es decir, anticuerpos que neutralizan la capacidad infecciosa del virus. Las secuencias pueden ser de cualquier cepa, en particular, de cepas circulantes. Tales cepas incluyen, por ejemplo, MN (por ejemplo, subtipo B) o Thai-E (por ejemplo, subtipo E). Los bucles V3 de diversas cepas de VIH-1 tienen aproximadamente 35 aminoácidos. Las cepas de VIH pueden ser linfocito T-trópicas o macrófago-trópicas. En una realización, las secuencias del bucle V3 incluyen al menos 8 aminoácidos (por ejemplo, un péptido suficientemente largo para encajar en una zona de unión de CHM clase II) que incluye un vértice del bucle V3. El bucle V3 de la cepa MN de VIH tiene la secuencia: CTRPNYNKRK RIHIGPGRAF YTTKNIIGTI RQAHC (SEC. ID. N.º: 3). El bucle V3 la cepa Thai-E de VIH tiene la secuencia: CTRPSNNTRT SITIGPGOVF YRTGDTIGDI RKAYC (SEC. ID. N.º: 4). El vértice del bucle V3 está subrayado. La secuencia es de una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 26 aminoácidos de largo. Una vacuna puede comprender una pluralidad de inmunógenos que tengan epítopos víricos diferentes.

En otra realización, el epítopo exógeno puede ser un epítopo expresado por una célula durante una enfermedad. Por ejemplo, el epítopo exógeno puede ser un marcador de célula cancerosa. Por ejemplo, ciertos cánceres de mama expresan un receptor de EGF ("factor de crecimiento epidérmico") mutante que resulta de una variante de procesamiento. Esta forma mutante exhibe un epítopo único.

E. Dominio de retención en RE

Los inmunógenos quiméricos tipo PE también pueden comprender una secuencia de aminoácidos que codifica un "dominio de retención en el retículo endoplasmático". El dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE") funciona translocando la proteína quimérica desde el endosoma al retículo endoplasmático, desde donde se transporta al citosol. El dominio de retención en el RE está localizado en la posición del dominio III en PE. El dominio de retención en el RE comprende una secuencia de aminoácidos que tiene, como extremo carboxi, una secuencia de retención en el RE. La secuencia de retención en el RE en PE natural es REDLK (SEC. ID. N.º: 11). La lisina puede eliminarse (es decir, REDL (SEC. ID. N.º: 12)) sin un descenso de la actividad. REDLK (de la SEC. ID. N.º: 1) puede sustituirse por otras secuencias de retención en el RE, tales como KDEL (SEC. ID. N.º: 12), o polímeros de estas secuencias. M. Ogata y cols. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20678-85. Pastan y cols., Patente de Estados Unidos 5.458.878. I. Pastan y cols. (1992) Annu. Rev. Biochem. 61: 331-54.

Las secuencias aguas arriba de la secuencia de retención en el RE pueden ser el dominio III de PE natural (preferiblemente inactivada), puede eliminarse completamente, o puede sustituirse por otra secuencia de aminoácidos. Si se sustituye por otra secuencia de aminoácidos, la secuencia puede, en si misma, ser muy inmunógena o puede ser ligeramente inmunógena. Es preferible un dominio de retención en el RE muy inmunógeno para usar en la provocación de una respuesta inmunitaria humoral. Las quimeras cuyo dominio de retención en el RE es solamente ligeramente inmunógeno serán más útiles cuando se desee una respuesta inmunitaria mediada por células dependiente de CHM Clase I.

La actividad de este dominio puede evaluarse analizando la translocación de la proteína al citosol de la célula diana usando los ensayos que se describen más adelante.

En PE natural, la secuencia de retención en el RE está localizada en el extremo carboxi del dominio III. El dominio III tiene dos funciones en PE. Muestra actividad de ADP-ribosilación y dirige la toxina endocitada al retículo endoplasmático. La eliminación de la secuencia de retención en el RE de la proteína quimérica no altera la actividad de la exotoxina A de Pseudomonas como superantígeno, pero si inhibe su utilidad para provocar una respuesta inmunitaria mediada por células dependiente de CHM Clase I.

La actividad de ribosilación de PE está localizada aproximadamente entre los aminoácidos 400 y 600 de PE. En los procedimientos de vacunar a un sujeto usando las proteínas quiméricas de esta invención, es preferible que la proteína no sea tóxica. Un procedimiento para lograrlo es eliminando la actividad de ADP-ribosilación. De este modo, la proteína quimérica puede funcionar como vector para que las secuencias de epítopos exógenos sean procesadas por la célula y presentadas en la superficie celular con moléculas de CHM Clase I, en lugar de cómo toxina. La actividad de ADP-ribosilación puede eliminarse, por ejemplo, eliminando el aminoácido E553 ("\DeltaE553"). M. Lukac y cols. (1988) Infect. and Immun. 56: 3095-3098. De forma alternativa, puede eliminarse de la proteína la secuencia de aminoácidos del dominio III, o porciones de ella. Por supuesto, en el extremo carboxi debería incluirse una secuencia de retención en el RE.

En una realización, la secuencia del dominio de retención en el RE es sustancialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos naturales del dominio III, o a un fragmento de ellos. En una realización, el dominio de retención en el RE es el dominio III de PE.

En otra realización, se inserta un dominio de reconocimiento celular en la secuencia de aminoácidos del dominio de retención en el RE (por ejemplo, en el dominio III). Por ejemplo, el dominio de reconocimiento celular puede insertarse justo aguas arriba de la secuencia de retención en el RE, de forma que la secuencia de retención en el RE esté conectada directamente o a diez aminoácidos del extremo carboxi del dominio de reconocimiento celular.

F. Procedimientos para preparar inmunógenos quiméricos tipo PE

Los inmunógenos quiméricos tipo PE preferiblemente se producen por medios recombinantes, tal como se describe más adelante. Esta invención también prevé la producción de proteínas quiméricas de PE mediante síntesis química usando procedimientos disponibles en la técnica.

G. Pruebas de quimeras inmunógenas tipo PE

Habiendo seleccionado diversas estructuras como dominios del inmunógeno quimérico, la función de estos dominios, y de la quimera en conjunto, puede analizarse para detectar la funcionalidad. Las quimeras inmunógenas tipo PE pueden analizarse para determinar el reconocimiento celular, la translocación al citosol y la capacidad inmunógena usando ensayos rutinarios. Puede analizarse la proteína quimérica completa, o puede analizarse la función de diversos dominios sustituyéndolos por dominios naturales de la toxina natural.

1. Unión del receptor/reconocimiento celular

La función del dominio de unión celular puede analizarse como una función de la quimera de unirse al receptor diana o bien aislado o en la superficie celular.

En un procedimiento, la unión de la quimera a una diana se realiza por cromatografía de afinidad. Por ejemplo, la quimera puede unirse a una matriz de una columna de afinidad, y detectarse la unión del receptor a la matriz.

La unión de la quimera a los receptores de las células puede analizarse, por ejemplo, marcando la quimera y detectando su unión a las células, por ejemplo, mediante separación de células fluorescentes, autorradiografía, etc.

Si se han identificado anticuerpos que se unen al ligando del que se deriva el dominio de reconocimiento celular, también son útiles para detectar la existencia del dominio de reconocimiento celular del inmunógeno quimérico mediante inmunoensayo, o mediante un ensayo competitivo para el receptor cognado.

2. Translocación al citosol

La función del dominio de translocación y del dominio de retención en el RE puede analizarse en función de la capacidad de la quimera de penetrar en el citosol. Debido a que la penetración requiere primero la unión a la célula, estos ensayos también son útiles para determinar si el dominio de reconocimiento celular está funcionando.

a. Presencia en el citosol

En un procedimiento, la penetración en el citosol se determina detectando la presencia física de la quimera en el citosol. Por ejemplo, la quimera puede estar marcada y exponer la quimera a la célula. Después, se aísla la fracción citosólica y se determina la cantidad de marcador de la fracción. Detectar el marcador en la fracción indica que la quimera ha penetrado en el citosol.

b. Actividad de ADP-ribosilación

En otro procedimiento, puede analizarse la capacidad del dominio de translocación y del dominio de retención en el RE de efectuar la translocación al citosol con una construcción que contiene un dominio III que tiene actividad de ADP-ribosilación. En resumen, se siembran las células en placas de cultivo tisular y se exponen a la proteína quimérica o a una exotoxina de PE genotecnológica que contiene el dominio de translocación o secuencia de retención en el RE modificados en lugar de los dominios naturales. La actividad de ADP-ribosilación se determina en función de la inhibición de la síntesis de proteínas, por ejemplo, controlando la incorporación de ^{3}H-leucina.

3. Capacidad inmunógena

La función del epítopo exógeno puede determinarse determinando la capacidad inmunógena humoral o mediada por células. La capacidad inmunógena puede analizarse mediante diversos procedimientos. La respuesta inmunitaria humoral puede analizarse inoculando a un animal y detectando la producción de anticuerpos contra el inmunógeno exógeno. Las respuestas inmunitarias citotóxicas mediadas por células pueden analizarse inmunizando a un animal con el inmunógeno, aislando los linfocitos T citotóxicos, y detectando su capacidad de eliminar células cuyas moléculas de CHM Clase I portan secuencias de aminoácidos del epítopo exógeno. Debido a que la generación de una respuesta de linfocitos T citotóxicos requiere tanto la unión de la quimera a la célula como la translocación al citosol, esta prueba también analiza la actividad del dominio de reconocimiento celular, del dominio de translocación y del dominio de retención en el RE.

III. Polinucleótidos recombinantes que codifican inmunógenos quiméricos tipo PE A. Polinucleótidos recombinantes 1. Fuentes

Esta invención proporciona polinucleótidos recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica los inmunógenos quiméricos tipo PE de esta invención. Estos polinucleótidos son útiles para preparar los inmunógenos quiméricos tipo PE. En otro aspecto, esta invención proporciona una plataforma de clonado de proteínas tipo PE que comprende una secuencia de polinucleótidos recombinante que codifica un dominio de reconocimiento celular, un dominio de translocación, un dominio de retención en el RE y, entre el dominio de translocación y el dominio de retención en el RE, un sitio de clonado para una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio de epítopo exógeno.

Los polinucleótidos recombinantes de esta invención se basan en polinucleótidos que codifican exotoxina A de Pseudomonas, o sus porciones. Anteriormente se presenta una secuencia de nucleótidos que codifica PE. El investigador puede usar esta secuencia para preparar cebadores de PCR para aislar una secuencia de longitud completa. La secuencia de PE puede modificarse para diseñar un polinucleótido que codifique el inmunógeno quimérico tipo PE o la plataforma.

Un polinucleótido que codifica PE o cualquier otro polinucleótido que se usa en las proteínas quiméricas de la invención puede clonarse o amplificarse mediante procedimientos in vitro, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencias automantenido (3SR) y el sistema de amplificación de la replicasa Q\beta (QB). Por ejemplo, puede aislarse un polinucleótido que codifica la proteína mediante la reacción en cadena de la polimerasa de ADNc usando cebadores basados en la secuencia de ADN de PE o una molécula de reconocimiento celular.

Para las personas de experiencia ordinaria en la técnica es notoria una amplia variedad de metodologías de clonación y amplificación in vitro. Los procedimientos de PCR se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.º 4.683.195; Mullis y cols. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; y Erlich, editor, PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Los polinucleótidos también pueden aislarse evaluando adenotecas genómicas o de ADNc con sondas que se seleccionan de las secuencias del polinucleótido deseado en condiciones de hibridación estrictas.

2. Versiones mutadas

Las versiones mutadas de las proteínas pueden prepararse mediante mutagénesis específica de sitio de otros polinucleótidos que codifican las proteínas, o por mutagénesis aleatoria provocada aumentando la tasa de error de la PCR del polinucleótido original con MnCl_{2} 0,1 mM y concentraciones de nucleótidos no equilibradas.

La eliminación de los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1-252 proporciona una construcción que se denomina "PE40". La eliminación de los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1-279 proporciona una construcción que se denomina "PE37". (Véanse Pastan y cols., patente de Estados Unidos 5.602.095). El investigador puede ligar secuencias que codifican los dominios de reconocimiento celular en el extremo 5' de estas plataformas para diseñar proteínas quiméricas tipo PE que se dirigen a receptores particulares de la superficie celular. Estas construcciones opcionalmente pueden codificar una metionina en el extremo amino. Puede insertarse un dominio de reconocimiento celular en tales construcciones en la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de retención en el RE.

3. Plataformas de clonación de proteínas quiméricas

Puede introducirse un sitio de clonación para el dominio de epítopo exógeno entre los nucleótidos que codifican los restos de cisteína del dominio Ib. Por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos, puede eliminarse una secuencia de nucleótidos que codifica una porción del dominio Ib entre los restos que codifican las cisteínas y sustituirse por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos y que incluye un sitio de clonación PstI. En el vector puede insertarse un polinucleótido que codifica el epítopo exógeno y flanquearse con secuencias PstI.

La construcción también puede diseñarse para que codifique una secuencia secretora en el extremo amino de la proteína. Tales construcciones son útiles para producir los inmunógenos en células de mamífero. In vitro, tales construcciones simplifican el aislamiento del inmunógeno. In vivo, las construcciones son útiles como vacunas de polinucleótidos; las células que incorporan la construcción expresarán la proteína y la segregarán donde pueda interactuar con el sistema inmunitario.

B. Vectores de expresión

Esta invención también proporciona vectores de expresión para expresar inmunógenos quiméricos tipo PE. Los vectores de expresión son moléculas recombinantes de polinucleótidos que comprenden secuencias de control de la expresión ligadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido. Los vectores de expresión pueden adaptarse para funcionar en procariotas o eucariotas mediante la inclusión de promotores, secuencias de replicación, marcadores, etc. adecuados para la transcripción y traducción de ARNm. La construcción de vectores de expresión y la expresión de genes en células transfectadas implica el uso de técnicas de clonación molecular también notorias en la técnica. Sambrook y cols., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1989) y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y cols., editores, (Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc.). Promotores útiles para tal fin incluyen un promotor de metalotioneína, un promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de MRP polIII, un promotor de MPSV constitutivo, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor inmediato-temprano de CMV humano), y un promotor de CMV constitutivo. Un plásmido de utilidad para la terapia génica puede comprender otros elementos funcionales, tales como marcadores seleccionables, regiones de identificación, y otros genes.

Los vectores de expresión de utilidad en esta invención dependen del uso que se pretenda. Tales vectores de expresión deben, por supuesto, contener señales de expresión y replicación compatibles con la célula huésped. Los vectores de expresión de utilidad para expresar los inmunógenos quiméricos tipo PE incluyen vectores víricos tales como retroviruses, adenoviruses y virus adenoasociados, vectores plasmídicos, cósmidos, y similares. Para transfectar células de mamífero se prefieren los vectores víricos y plasmídicos. El vector de expresión pcADN1 (Invitrogen, San Diego, CA), en el que la secuencia de control de la expresión comprende el promotor de CMV, proporciona buenas tasas de transfección y expresión. Los vectores víricos adenoasociados son útiles en los procedimientos de terapia génica de esta invención.

Hay disponibles una variedad de medios para introducir polinucleótidos en las células que incluyen, por ejemplo, captación directa de la molécula de una solución por una célula, captación facilitada mediante lipofección (por ejemplo, liposomas o inmunoliposomas), transfección mediada por partículas, y expresión intracelular a partir de un casete de expresión que tiene una secuencia de control de la expresión ligada operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polinucleótido inhibidor. Véase también Inouye y cols., Patente de Estados Unidos 5.272.065; Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA (D.V. Goeddel, editor) (1990) o M. Krieger, Gen Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York, NY, (1990). Los plásmidos de expresión de ADN recombinante también pueden usarse para preparar los polinucleótidos de la invención para administrar por medios distintos de la terapia génica, aunque puede ser más económico preparar oligonucleótidos cortos mediante la síntesis química in vitro.

La construcción también puede contener un marcador para simplificar el aislamiento de la proteína. Por ejemplo, puede incorporarse un marcador de polihistidina, por ejemplo, de seis restos de histidina, al extremo amino de la proteína. El marcador de polihistidina permite aislar la proteína de forma conveniente en una única etapa mediante cromatografía en quelato de níquel.

C. Células recombinantes

La invención también proporciona células recombinantes que comprenden un vector de expresión para la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican un inmunógeno quimérico tipo PE de esta invención. Las células huéspedes pueden seleccionarse para niveles de expresión elevados para purificar la proteína. Las células pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas. Células eucariotas adecuadas incluyen células de levaduras y mamíferos. La célula puede ser, por ejemplo, una célula recombinante en cultivo o una célula in vivo.

E. coli se ha usado con éxito para producir inmunógenos quiméricos tipo PE. En esta célula puede plegarse la proteína y pueden formarse enlaces disulfuro.

IV. Inmunógeno quimérico tipo exotoxina A de Pseudomonas Vacunas

Los inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles en vacunas para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra agentes que portan el epítopo exógeno. Una vacuna puede incluir uno o una pluralidad (es decir una vacuna multivalente) de inmunógenos quiméricos tipo PE diferentes. Por ejemplo, una vacuna puede incluir inmunógenos quiméricos tipo PE cuyos epítopos exógenos provengan de diversas cepas circulantes de un patógeno. Al ir evolucionando el patógeno, pueden construirse nuevos inmunógenos quiméricos tipo PE que incluyan los epítopos alterados, por ejemplo, de virus interrecurrentes. En una realización, la vacuna comprende epítopos de un virus linfocito T-trópico y de un virus macrófago-trópico. Por ejemplo, una vacuna contra la infección por VIH puede incluir inmunógenos cuyos epítopos exógenos se deriven del bucle V3 de las cepas MN y Thai-E de VIH. También, los epítopos pueden derivarse de cualquier péptido de VIH que esté implicado en la fusión a la membrana, por ejemplo, gp120 o gp41. De forma alternativa, debido a que son vacunas con subunidades, la vacuna puede incluir inmunógenos quiméricos tipo PE cuyos epítopos exógenos se seleccionan de diversos epítopos del mismo patógeno.

La vacuna puede venir liofilizada o ya reconstituida en solución estéril para su uso. Una dosis de inmunización está entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 1000 \mug, más usualmente entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 50 \mug de la proteína recombinante. Para determinar las dosis de inmunización véase, por ejemplo, Manual of Clinical Immunology, H.R. Rose y H. Friedman, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1980). Una dosis unitaria es de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 1 ml, más usualmente aproximadamente 0,5 ml. Una dosis preferiblemente se administra subcutánea o intramuscularmente. Una inyección puede venir seguida de varias inyecciones más separadas entre si de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 semanas. Puede seguirse con dosis de refuerzo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 años después. La vacuna puede prepararse en formas farmacéuticas que contienen 1 y 50 dosis (por ejemplo, 0.5 ml a 25 ml), más usualmente entre 1 y 10 dosis (por ejemplo, 0,5 ml a 5 ml). La vacuna también puede incluir un adyuvante, que potencia la respuesta inmunitaria cuando se usa junto con un antígeno. Adyuvantes útiles incluyen alumbre, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.

V. Procedimientos de provocar una respuesta inmunitaria

Los inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles para provocar una respuesta inmunitaria contra antígenos que portan el epítopo exógeno. Provocar una respuesta inmunitaria humoral es útil en la producción de anticuerpos que específicamente reconocen el epítopo exógeno y en la inmunización contra células, virus u otros agentes que portan el epítopo exógeno. Los inmunógenos quiméricos tipo PE también son útiles para provocar respuestas inmunitarias mediadas por células dependientes de MHC Clase I o MHC Clase II. También son útiles para provocar una respuesta inmunitaria secretora.

A. Tratamientos profilácticos y terapéuticos

Los inmunógenos quiméricos tipo PE pueden incluir epítopos exógenos de organismos patógenos o de células patológicas de un sujeto, tales como células cancerosas. Por consiguiente, esta invención proporciona tratamientos profilácticos y terapéuticos para enfermedades que implican la actividad patológica de agentes, ya sean patógenos o células aberrantes, que portan el epítopo exógeno. Los procedimientos implican inmunizar a un sujeto con inmunógenos quiméricos tipo PE que portan el epítopo exógeno. Las respuestas inmunitarias resultantes montan un ataque contra los patógenos mismos, o contra células que expresan el epítopo exógeno. Por ejemplo, si la patología se produce por una infección bacteriana o de protozoos parasíticos, el sistema inmunitario monta una respuesta contra los patógenos mismos. Si el patógeno es un virus, las células infectadas expresarán el epítopo exógeno en su superficie y serán la diana de una respuesta citotóxica. Las células aberrantes, tales como las células cancerosas, a menudo expresan epítopos anormales, y también pueden ser objeto de una respuesta inmunitaria citotóxica.

B. Respuesta inmunitaria humoral

Los inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles para provocar la producción de anticuerpos contra el epítopo exógeno por un sujeto. Los inmunógenos quiméricos tipo PE son inmunógenos atractivos para desarrollar anticuerpos contra epítopos exógenos presentes de forma natural en un bucle de cisteína a cisteína. Debido a que contienen el epítopo exógeno en un bucle de cisteína a cisteína, presentan el epítopo al sistema inmunitario en una conformación casi natural. Los anticuerpos resultantes generalmente reconocen el antígeno natural mejor que los que se desarrollan contra versiones lineales del epítopo exógeno.

Los procedimientos para producir anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. En resumen, un inmunógeno, preferiblemente un polipéptido purificado, un polipéptido acoplado a un vehículo apropiado (por ejemplo, GST, hemocianina de lapa californiana, etc.), o un polipéptido incorporado a un vector de inmunización, tal como un virus vaccinia recombinante (véase, la patente de Estados Unidos n.º 4.722.848) se mezcla con un adyuvante. Los animales se inmunizan con la mezcla. La respuesta inmunitaria de un animal a la preparación inmunógena se controla extrayendo sangre para analizar y determinando la valoración de la reactividad contra el polipéptido de interés. Cuando se obtienen valoraciones apropiadamente elevadas de anticuerpo contra el inmunógeno, se extrae la sangre del animal y se preparan antisueros. Cuando se desea se realiza un fraccionamiento adicional del antisuero para enriquecerlo en anticuerpos reactivos contra el polipéptido. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboralory Manual Cold Spring Harbor Press, NY.

En diversas realizaciones, los anticuerpos producidos finalmente pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o fragmentos de anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que segregan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se evalúan para determinar su unión a polipéptidos que comprenden el epítopo, o se evalúan para determinar la actividad de agonista o antagonista, por ejemplo, la actividad mediada a través del agente que comprende el epítopo exógeno. En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diversos huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se encuentra, por ejemplo, en Stites y cols. (editores) Basic and Clinical Immunology (4ª edición) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias que se citan en él; Harlow y Lane, Referencia anterior; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª edición) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497.

En otra realización, los anticuerpos son inmunoglobulinas humanizadas. Los anticuerpos humanizados se preparan ligando las regiones CDR de anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante técnicas de recombinación de ADN. Véase Queen y cols., patente de Estados Unidos n.º 5.585.089.

En otra realización de la invención, se proporcionan fragmentos de anticuerpos contra el epítopo exógeno. Típicamente, estos fragmentos muestran unión específica al epítopo exógeno similar a la de una inmunoglobulina completa. Los fragmentos de anticuerpos incluyen cadenas pesadas, cadenas ligeras, Fab, Fab' F(ab')_{2} y Fv por separado. Los fragmentos se producen mediante técnicas de recombinación de ADN, o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de adenotecas de anticuerpos recombinantes en macrófagos o vectores similares. Véase, Huse y cols. (1989) Science 246: 1275-1281; y Ward y cols. (1989) Nature 341: 544-546.

Una estrategia para aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de unión del mismo es evaluando una adenoteca de linfocitos B humanos de acuerdo con el protocolo general descrito por Huse y cols., Science 246: 1275-1281 (1989) y después clonando y amplificando las secuencias que codifican el anticuerpo (o fragmento de unión) de la especificidad deseada. El protocolo descrito por Huse se hace más eficiente combinado con la tecnología de presentación en macrófagos. Véase, por ejemplo, Dower y cols., documento WO 91/17271 y McCafferty y cols., documento WO 92/01047. La tecnología de presentación en macrófagos también puede usarse para mutar regiones CDR de anticuerpos que anteriormente se haya demostrado que presentan afinidad por los polipéptidos de esta invención o sus ligandos. Se seleccionan anticuerpos que tienen una afinidad de unión mejorada.

Los anticuerpos de esta invención son útiles para la cromatografía por afinidad para aislar agentes que portan el epítopo exógeno. Por ejemplo se preparan columnas con los anticuerpos ligados a un soporte sólido, por ejemplo, partículas, tales como agarosa, Sephadex, o similares, donde un lisado celular se pasa a través de la columna, se lava, y se trata con concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, mediante lo cual se liberan agentes purifica-
dos.

Se produjeron anticuerpos contra gp120 usando un inmunógeno quimérico tipo PE que tenía el bucle V3 de gp120 como epítopo exógeno. Los anticuerpos monoclonales selectivamente capturaron las proteínas quiméricas solubles de MN y Th-E, confirmando que los bucles V3 estaban expuestos y accesibles a las sondas de los anticuerpos. También, el suero de conejos inmunizados neutralizó la capacidad infecciosa del VIH-1 en un ensayo in vitro.

C. Respuesta inmunitaria mediada por células dependiente de CHM Clase II

En otro aspecto, esta invención proporciona procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria dependiente de CHM Clase II contra células que expresan el epítopo exógeno. Las moléculas de CHM Clase II se unen a péptidos que tienen motivos de aminoácidos particulares notorios en la técnica. La respuesta dependiente de CHM Clase II implica la captación de un antígeno por las células presentadoras de antígenos (CPA), su procesamiento, y presentación sobre la superficie celular como parte de un complejo de CHM Clase II y péptido antígeno. De forma alternativa, las moléculas de CHM Clase II sobre la superficie celular pueden unirse a péptidos que tienen el motivo apropiado.

Las células presentadoras de antígenos interactúan con linfocitos T cooperadores positivos para CD4, activando así los linfocitos T cooperadores. Los linfocitos T cooperadores activados estimulan a los linfocitos B para que produzcan anticuerpos contra el antígeno. Los anticuerpos marcan las células que portan el antígeno sobre su superficie. Las células marcadas son objeto de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, en la que las células NK o los macrófagos que portan receptores Fc, atacan las células marcadas.

Los procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria dependiente de CHM Clase II implican administrar a un sujeto una vacuna que incluye una cantidad inmunógena de una exotoxina quimérica de Pseudomonas que incluye un motivo de aminoácidos que reconocen las moléculas de CHM Clase II del sujeto. De forma alternativa, las células presentadoras de antígenos pueden cultivarse con tales péptidos permitiendo la unión, y las células pueden administrarse al sujeto. Preferiblemente, las células son autólogas al sujeto.

D. Respuesta inmunitaria mediada por células dependiente de CHM Clase I

En otro aspecto, esta invención proporciona procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria mediada por células dependiente de CHM Clase I contra células que expresan el epítopo exógeno en un sujeto. Las moléculas de CHM Clase I se unen a péptidos que tienen motivos de aminoácidos particulares notorios en la técnica. Las proteínas que se expresan en una célula se digieren a péptidos y se presentan en la superficie celular asociadas a moléculas de CHM Clase I. Allí, son reconocidas por linfocitos positivos para CD8, generando una respuesta de linfocitos T citotóxicos contra células que expresan los epítopos asociadas a moléculas de CHM Clase I. Debido a que los linfocitos T positivos para CD4 infectados con VIH expresan gp120 y, así, el dominio V3, la generación de linfocitos T citotóxicos que atacan tales células es útil en el tratamiento profiláctico o terapéutico de infecciones por VIH.

El motivo de unión HLA-A1 incluye un primer resto conservado de T, S o M, un segundo resto conservado de D o E, y un tercer resto conservado de Y. Otros segundos restos conservados son A, S o T. El primer y segundo restos conservados están adyacentes y preferiblemente están separados del tercer resto conservado por de 6 a 7 restos. Un segundo motivo consiste en un primer resto conservado de E o D y un segundo resto conservado de Y donde el primer y segundo restos conservados están separados por de 5 a 6 restos. El motivo de unión HLA-A3.2 incluye un primer resto conservado de L, M, I, V, S, A, T y F en la posición 2 y un segundo resto conservado de K, R o Y en el extremo C. Otros primeros restos conservados son C, G o D y de forma alternativa E. Otros segundos restos conservados son H o F. El primer y segundo restos conservados están separados preferiblemente por de 6 a 7 restos. El motivo de unión HLA-A11 incluye un primer resto conservado de T o V en la posición 2 y un resto conservado en el extremo C de K. El primer y segundo restos conservados están separados preferiblemente por de 6 a 7 restos. El motivo de unión HLA-A24.1 incluye un primer resto conservado de Y, F o W en la posición 2 y un resto conservado en el extremo C de F, I, W, M o L. El primer y segundo restos conservados están separados preferiblemente por de 6 a 7 restos.

Otro procedimiento implica transfectar células ex vivo con tales vectores de expresión, y administrar las células al sujeto. Las células preferiblemente son autólogas al sujeto.

Los procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria contra un virus en un sujeto son útiles en procedimientos profilácticos para prevenir la infección con el virus cuando se administra la vacuna a un sujeto que no está infectado todavía.

E. Respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora

Las membranas mucosas son las principales vías de entrada de muchos patógenos infecciosos. Tales patógenos incluyen, por ejemplo, VIH, herpes, vaccinia, citomegalovirus, yersinia y vibrio. Las membranas mucosas incluyen la boca, nariz, garganta, pulmón, vagina, recto y colon. Como defensa contra la entrada, el cuerpo segrega IgA secretora sobre las superficies de las membranas mucosas epiteliales contra patógenos. Además, los antígenos que se presentan a una superficie mucosa pueden desencadenar respuestas en otras superficies mucosas debido a la circulación de las células que segregan anticuerpos entre estas mucosas. Se ha sugerido que la estructura de IgA secretora es crucial para su presencia sostenida y función eficaz en la superficie del lumen de una mucosa. Tal como se usa en la presente memoria, "IgA secretora" o "sIgA" se refiere a una molécula polimérica que comprende dos inmunoglobulinas IgA unidas mediante una cadena J y unidas además a un componente secretor. Aunque la administración de antígenos a las mucosas puede generar una respuesta de IgG, la administración parenteral de inmunógenos ráramente produce respuestas de sIgA potentes. La generación de una respuesta inmunitaria secretora para la defensa contra VIH es una necesidad reconocida. (Bukawa, H., y cols.1995, Nat Med 1, 681-5; Mestecky, J., y cols., 1994, Aids Res Hum Retroviruses 10, S11-20).

La exotoxina de Pseudomonas se une a receptores de las membranas mucosas. Por lo tanto, los inmunógenos quiméricos tipo PE son un vector atractivo para llevar epítopos exógenos a una superficie mucosa. Allí, los inmunógenos provocan una respuesta inmunitaria mediada por IgA contra el inmunógeno. Por consiguiente, esta invención proporciona inmunógenos quiméricos tipo PE que comprenden un epítopo exógeno de un patógeno que penetra a través de membranas mucosas. El dominio de reconocimiento celular puede dirigirse a cualquier receptor de las superficies mucosas. Estos inmunógenos quiméricos tipo PE son útiles para provocar una respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora contra inmunógenos que penetran en el cuerpo a través de superficies mucosas. Los inmunógenos quiméricos tipo PE que se usan para este fin deberían tener ligandos que se unen a receptores de las membranas mucosas como sus dominios de reconocimiento celular. Por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico de las superficies mucosas.

Los inmunógenos pueden aplicarse a la superficie mucosa mediante cualquiera de los medios habituales, que incluyen las composiciones farmacéuticas en forma de líquidos o sólidos, por ejemplo, pulverizadores, ungüentos, supositorios o polímeros erosionables impregnados con el inmunógeno. La administración puede implicar aplicar el inmunógeno a una pluralidad de diferentes superficies mucosas en una serie de inmunizaciones, por ejemplo, como inmunizaciones de refuerzo. Una inoculación de refuerzo también puede administrarse parenteralmente por ejemplo, por vía subcutánea. El inmunógeno puede administrarse en una dosis de aproximadamente 1 \mug a 1000 \mug, por ejemplo, de aproximadamente 10 \mug a 100 \mug.

Se desconoce que la inoculación subcutánea con vacunas que comprenden un epítopo del dominio neutralizante principal de gp120 de VIH genere IgA secretora. Por consiguiente, la presentación a las mucosas de los inmunógenos quiméricos de esta invención es útil para producir estos anticuerpos desconocidos hasta la fecha. Esta invención también proporciona IgA secretora que reconoce específicamente epítopos de otros patógenos que penetran en el cuerpo a través de una membrana mucosa.

La respuesta de IgA es más fuerte en superficies mucosas expuestas al inmunógeno. Por lo tanto, en una realización, el inmunógeno se aplica a una superficie mucosa que es probable que sea un sitio de exposición al patógeno particular. Por consiguiente, los inmunógenos quiméricos contra las enfermedades de transmisión sexual pueden administrarse a las superficies mucosas vaginal, anal u oral.

La administración a las mucosas, de los inmunógenos quiméricos de esta invención produce respuestas de memoria potente, tanto de IgA como de IgG. Por lo tanto, cuando se vacune con ellos, es útil proporcionar una dosis de refuerzo bien por vía mucosa o parenteral. La respuesta de memoria puede provocarse administrando una dosis de refuerzo más de un año después de la dosis inicial. Por ejemplo, puede administrarse una dosis de refuerzo aproximadamente 12, aproximadamente 16, aproximadamente 20 o aproximadamente 24 meses tras la dosis inicial.

VI. Vacunas con polinucleótidos y procedimientos de terapia génica

Las vacunas que comprenden polinucleótidos que codifican una proteína inmunógena, a menudo denominadas "vacunas de ADN" ofrecen ciertas ventajas comparadas con las vacunas con polipéptidos. Las vacunas de ADN no corren el riesgo de contaminación con inmunógenos proteínicos indeseados. Tras la administración a un sujeto, el polinucleótido es captado por una célula. Se realiza la transcripción inversa del ARN a ADN. El ADN se integra en el genoma de algún porcentaje de las células transfectadas. Cuando el ADN se integra de forma que esté ligado operativamente con unas secuencias de control de la expresión, o si tales secuencias se proporcionan con el polinucleótido recombinante, la célula expresa el polipéptido codificado. Tras la secreción de la célula, el polipéptido actúa como inmunógeno. El ADN desnudo, de forma preferente es captado por el hígado y por las células musculares. Por consiguiente, el polipéptido puede inyectarse en el tejido muscular, o administrarse, por ejemplo, mediante inyección biolística. Generalmente, la dosis de polinucleótido desnudo será de aproximadamente 1 \mug a 100 \mug para un paciente típico de 70 kg.

Las vacunas con polinucleótidos de esta invención pueden incluir polinucleótidos que codifican inmunógenos quiméricos tipo PE que se usan en las vacunas con polipéptido. Esto incluye inmunógenos múltiples que incluyen diversas variantes de un epítopo.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no a modo de limitación.

Ejemplos I. Construcción de inmunógenos quiméricos tipo PE

Para generar proteínas quiméricas, el subdominio Ib de ntPE se sustituyó por secuencias del bucle V3 bien de una cepa MN (subtipo B) o Thai-E subtipo de VIH-1. La secuencia de MN proviene de una cepa linfocito T-trópica mientras que la secuencia Thai-E proviene de una cepa macrófago-trópica.

PE natural (WT) está compuesto por 613 aminoácidos y tiene una masa molecular de 67.122 Da. La eliminación de un ácido glutámico 553 (\DeltaE553)produce una versión no tóxica de PE (Lukac, M., y cols.,1988 Infect and Immun 56: 3095-3098), que se denomina ntPE.

Se construyeron plásmidos insertando parejas de oligonucleótidos que codificaban secuencias del bucle V3 en un nuevo vector con base de PE que se diseñó con un sitio PstI novedoso. Esforzándose por producir un bucle V3 de topología similar a la que se encuentra en gp120, los insertos de 14 ó 26 aminoácidos se flanquearon con restos de cisteína (Figura 1C - negrita). La construcción del vector novedoso produjo diversos cambios en la secuencia de aminoácidos de ntPE cerca del punto de inserción del bucle V3 (Figura 1C - cursiva). Las quimeras no tóxicas, ntPE-V3MN14, ntPE-V3MN26 y ntPE-V3Th-E26, contenían bucles V3 de 14 ó 26 aminoácidos de la cepa MN o de 26 aminoácidos de la cepa Thai-E, respectivamente (nt = "no tóxica"). La inserción de una secuencia de 16 aminoácidos irrelevante produjo la construcción de una quimera de control que se denomina ntPE-fp126. La eliminación del bucle Ib (6 aminoácidos) y la modificación de los aminoácidos que flanquean el inserto del bucle V3 produjo un pequeño aumento de la masa molecular comparado con PE natural (Figura 1C).

Más específicamente, el plásmido pMOA1A2VK352 (Ogata, M., y cols. 1992, J Biol Chem, 267, 25396-401), que codifica PE, se digirió con Sfi1 y ApaI (restos 1143 y 1275, respectivamente) y después se volvió a ligar con un dúplex que contenía un sitio PstI novedoso. La cadena codificante del dúplex tenía la siguiente secuencia: 5'-tggccctgac cctggccgcc gccgagagcg agcgcttcgt ccggcagggc accggcaacg acgaggccgg cgcggcaaac ctgcagggcc-3' (SEC. ID. N.º: 5). El plásmido resultante codificaba una versión ligeramente menor de PE y carecía de gran parte del dominio lb. Después se usó el sitio PstI para introducir dúplex que codificaban secuencias del bucle V3 flanqueadas por restos cisteína. Para preparar proteínas no tóxicas, se modificaron los vectores subclonándolos en un dominio III enzimáticamente inactivo de pVC45\DeltaE553. Fue necesario un subclonado adicional, de pJH4 (Hwang, J., y cols., 1987, Cell, 48, 129-136), para producir un vector que carecía de la secuencia de señal. La inserción de los dúplex y el subclonado de las modificaciones se verificaron inicialmente mediante análisis por restricción mientras que las construcciones finales se confirmaron mediante secuenciación bicatenaria didesoxi.

II. Caracterización de quimeras A. Expresión

Todas las proteínas quiméricas del ntPE-bucle V3 se expresaron en E coli SA2821/BL21(\lambdaDE3) usando un sistema de promotor de T7 y polimerasa de T7 (Studier, F.W., y cols.; 1990, Methods Enzymol 185, 60-89). Las células SA2821/BL21(\lambdaDE3) se transformaron con el plásmido apropiado y se cultivaron hasta una absorbancia de 1,0 (600 nm) en medio que contenía ampicilina. Para inducir una expresión de proteínas de nivel alto, se añadió isopropil-\beta-D-tiogalactosida (1 mM) al cultivo y se incubó durante 90 minutos más. Los sedimentos de células E. coli, se volvieron a suspender en Tris 50 mM/EDTA 20 mM, a pH 8,0 (tampón de TE) y se dispersaron usando un Tissue Miser. El lisado de las células se logró con lysozyme (concentración final de 200 \mug/ml; Sigma) y las proteínas asociadas a la membrana se solubilizaron mediante la adición de Triton X-100 al 2,5% y NaCl 0,5 M.

Las quimeras de PE-bucle V3 estaban presentes en los cuerpos de inclusión, que se recuperaron por centrifugación. Después de lavar con TE que contenía Triton X-100 al 0,5% y después con TE solo, los cuerpos de inclusión se solubilizaron mediante la adición de guanidina 6 M y ditioeritritol 65 mM. Se dejó que se realizara el plegamiento a una concentración final de proteína de 100 \mug/ml durante un mínimo de 24 horas a 8ºC en Tris 0,1 M (pH 8,0) que contenía L-arginina 0,5 M (Sigma), EDTA 2 mM y glutationa 0,9 mM. Se añadió inhibitor de proteasas AEBSF (Boerhinger Mannheim) a una concentración final de 0,5 mM. Las proteínas se dializaron con Tris 20 mM, EDTA 2 mM y urea 100 mM, a pH 7.4. Tras la diálisis, las proteínas se aplicaron a una columna de Q-sepharose (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ). Después de lavar con Tris 20 mM (pH 8-0) que contenía NaCl 0,1 M, se eluyeron las proteínas quiméricas con NaCl 0,3 M en el mismo tampón y se concentraron usando dispositivos de ultrafiltración Centriprep-30 (Amicon, Inc.; Beverly, MA). Se usó una columna de filtración en gel de HPLC (G3000SW de Toso Haas; Montgomeryville, PA) para aislar los productos finales. Un rendimiento típico de proteína plegada apropiadamente por 4 l de cultivo bacteriano era de 50-100 mg con una pureza superior al 95%.

B. Caracterización bioquímica

Las proteínas quiméricas se separaron por SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida en gradiente de 8-16% (Novex; San Diego, CA), y se visualizaron tiñendo con Coomassie Blue. Para el análisis por transferencia Western, las proteínas se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore Corp., Bedford, MA) y se expusieron o bien a un anticuerpo monoclonal de ratón contra PE (M40-1 (Ogata, M., y cols., 1991, Infect and Immun 59, 407-414) o a un anticuerpo monoclonal de ratón contra gp120 (1F12 para las secuencias MN o 1B2 para las secuencias Thai-E; Genentech, Inc.; South San Francisco, CA). El anticuerpo primario fue detectado mediante un anticuerpo secundario contra ratón conjugado a peroxidasa de rábano. Los productos reactivos se visualizaron mediante la adición de diaminobenzadina y peróxido de hidrógeno. Se realizaron experimentos de inmunocaptura durante 30 minutos a 23ºC usando el anticuerpo monoclonal 1F12 contra gp120. Los complejos de anticuerpo-proteína quimérica se recuperaron con perlas de sepharose con proteína G (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) y se separaron usando SDS-PAGE (como anteriormente). Las formas recombinantes de gp120 derivadas de las cepas aisladas VIH-1-MN (120/MN; Genentech, Inc.) y Thai subtipo E (gp120/Th-E - Chiang Mai; Advanced Biotechnologies, Columbia MD) se usaron como patrones.

El análisis por SDS-PAGE de quimeras de ntPE-bucle V3 purificadas (Figura 2A) era consistente con las masas calculadas (Figura 1C). Las transferencias Western, usando anticuerpos monoclonales generados contra gp120/MN (IF12) o gp120/Th-E (1B2), mostraron reactividad específica de cepa con las quimeras de bucle V3 de MN y de Thai-E (Figura 2B).

El análisis de los sulfhidrilos libres de las quimeras de ntPE-bucle V3 purificadas no mostraron cisteínas desparejadas, lo que sugiere que las quimeras de ntPE-bucle V3 purificadas se habían vuelto a plegar y se habían oxidado formando un enlace disulfuro en la base del bucle V3 (Figura 1A). Se esperaba que la formación de este enlace disulfuro produjera la exposición del bucle V3 en la superficie de las quimeras.

Para determinar en contenido en sulfhidrilos, se hicieron reaccionar proteínas quiméricas (15 nmols) en PBS (a pH 7,4) que contenían EDTA 1 mM con tionitrobenzoato (DTNB) 1 mM (Pierce Chem Co, Rockford, IL) durante 15 minutos a 23ºC. La liberación de tionitrobenzoato se controló a 412 nm. La reactividad de DTNB se confirmó usando cisteína.

Esto se analizó directamente mediante estudios de inmunocaptura (Figura 2C). Los anticuerpos monoclonales 1F12 y 1B2 capturaron selectivamente las proteínas quiméricas solubles de MN y Th-E confirmando que los bucles V3 estaban expuestos y accesibles para las sondas de los anticuerpos. A pesar del hecho de que el anticuerpo 1F12 reaccionó con fuerza con ntPE-V3MN14 en las transferencias Western (Fig 2B), solamente capturó una pequeña cantidad de proteína soluble (Figura 2C, Carril 3), lo que sugiere que el epítopo reactivo no estaba expuesto completamente cuando se insertaban únicamente 14 aminoácidos.

C. Dicroismo circular

Para evaluar el impacto de los insertos de aminoácidos sobre la estructura secundaria de las quimeras, se realizaron análisis espectrales de DC en el UV cercano y lejano con proteínas ntPEV3MN14 y ntPE-V3MN26 purificadas y estos se compararon con los espectros de PE natural (wtPE) (Figuras 3A y 3B). Los espectros de dicroismo circular (DC) se obtuvieron en un espectropolarímetro Aviv 60DS. Los espectros de DC en el UV cercano (400 nm a 250 nm) se obtuvieron con incrementos de 0,2 nm con una anchura de banda de 0,5 nm y una constante de tiempo de 5 segundos (150 lecturas/segundo promediadas) para las muestras en una cubeta de 1 cm de recorrido. Los espectros en el UV lejano (250 nm a 190 nm) se obtuvieron con incrementos de 0,2 nm con una anchura de banda de 0,5 nm y una constante de tiempo de 3 segundos, en una cubeta de 0,05 cm de recorrido. Cada espectro se refinó digitalmente usando el algoritmo Savitsky-Golay (Gorry, P.A. 1990, Analytical Chem 62, 570-573), se corrigió tomando en cuenta la concentración, y se normalizó a unidades de elipticidad del peso medio del resto (\thetaPMR) usando la siguiente relación:

\theta_{PMR} = \frac{\theta_{obs} \ (PM_{monómero}/n_{monómero})}{10 \ (d) \ (c)}

donde \theta_{obs} es la elipticidad observada, PM_{monómero} es el peso molecular del monómero, n_{monómero} es el número de aminoácidos en el monómero, d es el recorrido de la cubeta (cm), y c es la concentración de la muestra en la cubeta (mg/ml).

Los cálculos de la estructura secundaria (Figura 3C) sugirieron que no había diferencias significativas entre estas proteínas y wtPE. ntPE-V3MN14 demostró una elipticidad más negativa que ntPE-V3MN26 y wtPE, lo que sugiere que puede haber una mayor tensión en el enlace disulfuro en la base del inserto del bucle para esta quimera. Tanto ntPE-V3MN14 como ntPE-V3MN26 mostraron un aparente desplazamiento a rojo a 290 nm, posiblemente debido a los restos adicionales de tirosina de las quimeras. De forma alternativa, este desplazamiento a rojo podría producirse por una ligera perturbación del entorno de un resto triptófano. En conjunto, estos resultados sugieren que los insertos del bucle V3 no produjeron grandes alteraciones en la estructura secundaria comparando con la toxina natural y que los cambios en la estructura terciaria eran consistentes con la presencia de los insertos de 14 y 26 aminoácidos.

III. Translocación al citosol

Tras la unión al receptor LRP, las quimeras de ntPE-bucle V3 deberían endocitarse, ser escindidas por furina y la porción del extremo C que contiene los dominios II, el bucle V3 y III deberían translocarse al citosol de forma similar a wtPE (Ogata, M., y cols., 1990, Biol Chem 265, 20678-85). Esto se analizó directamente produciendo versiones enzimáticamente activas de PE-V3MN14 y 26 (que contienen ácido glutámico 553 y que tienen la capacidad de ADP-ribosilar el factor de elongación 2) y comparar su actividad con wtPE en ensayos de citotoxicidad.

Se sembraron células A431 humanas (carcinoma epidermoide) en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a 1 x 10^{5} células/pocillo en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 5%. Después de 24 horas, las células se trataron durante 18 horas a 37ºC con diluciones por un factor de 4 de wtPE o de formas tóxicas (con un resto ácido glutámico en la posición 553 y capaces de ADP-ribosilar el factor de elongación 2) de las proteínas quiméricas. La inhibición de la síntesis de proteínas se evaluó controlando la incorporación de ^{3}H-leucina.

Cuando se ensayó para determinar su capacidad de inhibir la síntesis de proteína, PE-V3MN26 mostró una toxicidad similar a wtPE en células A431 humanas (Figura 4). PE-V3MN14 también era completamente tóxico. Estos resultados confirmaron que el tamaño y la locación de los insertos del bucle V3 no impidieron el transporte de la toxina al citosol. Además, estos datos sugieren que el protocolo de aislamiento, replegado y purificación que se usó para preparar estas quimeras dio como resultado la producción de una proteína correctamente plegada y funcional.

IV. Capacidad inmunógena

Para investigar su utilidad como inmunógenos, se inyectaron 200 \mug de cualquiera de las quimeras de MN o Thai-E a conejos por vía subcutánea. Los conejos se inmunizaron subcutáneamente en cuatro zonas con 200 \mug (en total) de ntPE-V3MN26. La primera inyección se administró con adyuvante completo de Freund. Todas las inyecciones subsiguientes (a las 2, 4 y 12 semanas) se administraron con adyuvante incompleto de Freund. Semanalmente se extrajo sangre venosa después de la tercera inyección y se evaluaron por inmunotransferencia con gp120.

En las transferencias Western, las muestras de suero de conejos inmunizados con las proteínas ntPE-V3MN mostraron una fuerte reactividad con gp120/MN recombinante inmovilizada (Figura 5A). Las valoraciones de la reactividad aumentaron en función del tiempo: a las 6 semanas se observó reactividad a una dilución 1:200, a las 12 semanas a una dilución de 1:5.000 y después podía detectarse la reactividad a 1:25.000. Estos sueros contra bucle V3/MN no reaccionaban con gp120/Thai-E (Figura 5A). El suero de conejos a los que se había inyectado PE no tóxica (es decir ntPE sin inserto) no mostró reactividad con gp120. Los conejos a los que se había inyectado, ntPE-V3Th-E produjeron suero reactivo con gp120/Thai-E pero no con gp120/MN (Figura 5A).

El suero de los conejos inmunizados con ntPE-V3MN26 se caracterizó adicionalmente. La reactividad con gp120/
MN inmovilizada fue absorbida cuando estos sueros se premezclaron con gp120/MN recombinante soluble (Figura 58). Esta actividad bloqueante, que era dependiente de la dosis y máxima a 50 \mug/ml indicaba que los conejos respondían principalmente a las secuencias del bucle V3 que están expuestas en la superficie de gp120.

También se encontró que el suero de los conejos inmunizados también neutralizaba la capacidad infecciosa de VIH-1 en un ensayo in vitro (Figura 6). Este ensayo utilizó células MT4 como indicador de la destrucción celular mediada por VIH-1 (Miyoshi, I., y cols., 1981, Nature 294, 770-1). Se incubaron diluciones seriadas de antisuero por duplicado con VIH-1/MN cultivado en células FDA/H9 (Popovic, M., y cols., 1984, Science 224, 497-500) y la mezcla se añadió a las células durante 7 días. La muerte celular mediada por virus se calculó usando un ensayo de tinción con MTT (Robertson, G.A., y cols., 1988, J Virol Methods 20, 195-202) y análisis espectrofotométrico a 570 nm. Se calculó la con-
centración de suero que producía una inhibición del 50% y se expresó en términos de valoración de la neutralización.

El suero anterior a la inmunización no mostró ninguna protección de una línea de linfocitos T humanos, MT4, frente a la destrucción por VIH-1 MN. Aunque el suero de la semana 5 después de la inmunización tampoco mostró protección, los sueros de la semana 8 y de la semana 27 eran protectores contra la exposición a virus produciéndose un 50% de neutralización aproximadamente a una dilución de 1:400. Basándose en el calendario de inmunización utilizado, el suero de la semana 5 reflejaba la respuesta en los animales inmunizados y con una dosis de refuerzo, mientras que el suero de la semana 8 era de animales con dos dosis de refuerzo y el suero de la semana 27 provenía de animales con tres dosis de refuerzo. Los valores de supervivencia de las células MT4 obtenidos para las diluciones de suero inferiores a 1:100 para las extracciones de la semana 8 y de la semana 27 fueron superiores a los de las células de control no expuestas que se usaron para la normalización. Esto era probablemente debido a la estimulación por los factores de crecimiento presentes en el suero de conejo. Los datos sugieren que la respuesta inmunitaria tras las inyecciones
subcutáneas de quimeras de ntPE-bucle V3 pueden dar como resultado la producción de anticuerpos neutralizadores.

V. Neutralización de la capacidad infecciosa

Se demostró que los anticuerpos que se generaron contra el inmunógeno quimérico tenían la capacidad de neutralizar la capacidad infecciosa de VIH-1 en ensayos de crecimiento vírico en los que se usaba la supresión de la producción de p24 como indicador de la neutralización de VIH. Se incubaron cepas aisladas clínicas que correspondían al subtipo B, RVL05, y al subtipo E, Th92009, con diluciones de suero de conejo y se cultivaron en PBMC (células mononucleares de sangre periférica) durante un total de 5 días.

Un ensayo utilizó células MT4 como indicadores de la muerte celular mediada por VIH-1. I. Miyoshi y cols. (1981) Nature 294: 710-771. Se incubaron diluciones seriadas de antisuero por duplicado con VIH-1/MN y se cultivaron en células FDA/H9 y la mezcla se añadió a células MT4 durante 7 días. Popovic, M., y cols., 1984, Science 224, 497-500. La muerte celular mediada por virus se calculó usando un ensayo de tinción con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio y análisis espectrofotométrico a 570 nm. G.A. Robertson, y cols., 1988, J Virol Methods 20, 195-202. Se calculó la concentración de suero que producía una inhibición del 50% y se expresó en términos de valoración de la neutralización.

Un segundo ensayo usó la producción de p24 como indicador del crecimiento vírico. T. Wrin y cols. (1995) J. Virol. 69: 39-48. Primero se valoró el virus primario para determinar la cantidad que de forma reproducible proporcionaba cantidades significativas pero submáximas de p24. Las preparaciones de virus se incubaron durante 1 hora a 37ºC con diversas diluciones de suero de conejo, bien inmunizado o de antes de la exposición, y esta mezcla después se añadió por cuadruplicado a 2,5 x 10^{5} PBMC. El cultivo continuó durante 3 días, momento en el cual se lavaron las células y las quimeras 9952 de bucle V3-toxina se resuspendieron en medio que contenía interleuquina 2. La acumulación de p24 se detectó mediante un ELISA.

Debido a que el suero extraído de los conejos inmunizados con ntPE-V3MN26 neutralizaba los virus en el ensayo con MT4 a una dilución de 1:400, se usó este suero para evaluar la actividad contra las cepas clínicas aisladas. Una muestra de suero extraída a las 24 semanas mostró actividad de neutralización contra las cepas aisladas subtipos B y E (véase Figura 14). No se observó actividad de neutralización con el suero anterior a la exposición de sangre del mismo conejo.

VI. Provocación de respuesta inmunitaria mediada por IgA

La inoculación a las mucosas con un inmunógeno quimérico tipo PE que contenía 26 aminoácidos del bucle V3 de gp120 de VIH-1 indujo una tanto respuesta inmunitaria humoral como una mediada por células contra VIH-1. Una versión tóxica de esta quimera fue capaz de destruir una línea celular intestinal humana, Caco-2, cultivada en monocapas a confluencia. Una forma no letal de la quimera se administró a ratones bien subcutáneamente o a la superficie mucosa vaginal, rectal, gástrica o nasal. Los refuerzos subsiguientes se realizaron a estas diversas superficies mucosas o por administración subcutánea. La medición de anticuerpos específicos de MNgp120 en las muestras de saliva y suero demostraron respuestas tanto de IgA como de IgG en cada uno de los grupos de administración mucosa y subcutánea. Estos resultados demuestran que los inmunógenos quiméricos tipo PE de esta invención pueden penetrar en las células epiteliales, circular de forma similar a una toxina natural, transportarse a través de una barrera epitelial intacta e inducir la producción de anticuerpos tanto IgA como IgG.

A. Inmunógenos quiméricos tipo PE

Las quimeras tipo PE que se usan en estos experimentos se describen en el Ejemplo I. El gen estructural que codifica PE natural (tóxica) se modificó eliminando la región Ib y proporcionando un único sitio PstI para la inserción de secuencias del bucle V3 de 26 aminoácidos. Las versiones no tóxicas de quimeras de PE-bucle V3 se prepararon sin el resto ácido glutámico en la posición 553 (\DeltaE553) y así no presentaban actividad de ADP-ribosilación. Todas las proteínas quiméricas de PE-bucle V3 se expresaron en E. coli BL21(\lambdaDE3) usando el sistema de promotor de T7 y polimerasa de T7. Se añadió IPTG (1,0 mM durante 90 minutos) para potenciar la expresión de proteínas. Las proteínas de PE-bucle V3 se aislaron de los cuerpos de inclusión y se purificaron mediante tandas sucesivas de cromatografía de intercambio aniónico y una filtración en gel final.

B. Estudios con base celular

Se aplicó una versión tóxica de la quimera de la exotoxina de Pseudomonas (PE) que contenía 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 (tPE-MN26) a la superficie apical de mococapas concluyentes de células Caco-2 polarizadas. Las células Caco-2 se cultivaron y se mantuvieron tal como se ha descrito anteriormente (W. Rubas y cols. (1996) "Flux measurements across Caco-2 monolayers might predict transport in human large intestinal tissue" J. Pharm. Sci. 85: 165-169) sobre soportes de filtro de policarbonato recubiertos de colágeno previamente humedecidos (PBS, 15 minutos fuera y después dentro) (Snapwells™). El medio de cultivo se cambió cada dos días y se usaron monocapas confluentes el día 25 después de la siembra y al pase 30-35. Se añadieron versiones tóxicas de PE y quimeras de PE-bucle V3 a la superficie apical en medio de cultivo. Después de 24 horas de incubación continuada a 37ºC, las monocapas de Caco-2 se lavaron tres veces con PBS eliminando las actividades de las ésterasas del suero y se incubaron con homodímero de calceína AM y etidio para determinar la proporción de células vivas/muertas (LIVE/DEAD® Eukolight kit; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).

La quimera destruyó estas células epiteliales intestinales con una potencia similar a la de PE auténtica (Figura 8). La viabilidad celular se midió en términos de la proporción entre células vivas y muertas.

En todos los estudios de inmunización subsiguientes se usó una quimera no tóxica (\Delta553) (ntPE-V3MN26) para examinar la capacidad de ntPE-V3MN26 de bloquear las acciones tóxicas de PE en monocapas de Caco-2 (Figura 8). Así, los resultados de la Figura 8 muestran que la incorporación de 26 aminoácidos del bucle V3 de MNgp120 (ntPE-V3MN26) en lugar del bucle Ib endógeno bucle de PE no altera la capacidad de la quimera de PE de ser captada y procesada por células epiteliales, confluentes, polarizadas. Esta capacidad de la quimera de PE-bucle V3 de ser captada y procesada por las células epiteliales es importante contra un patógeno tal como VIH-1 que puede infectar y alterar la función de las células epiteliales intestinales humanas. D.M. Asmuth y cols. (1994) "Physiological effects of VIH infection on human intestinal epithelial cells: an in vitro model for HIV enteropathy" AIDS 8: 205-211.

C. Protocolos de inmunización

Se obtuvieron ratones hembra balb-c de Simonsen de 6-8 semanas de edad y se mantuvieron en cuarentena durante 2 semanas antes del estudio. Los animales se asignaron a uno de 6 grupos que se inocularon 3 veces con intervalos de dos semanas. Los animales disponían de comida y agua a voluntad. Los grupos de animales se inmunizaron de la forma siguiente: (1) oral, oral, oral; (2) vaginal, vaginal, vaginal; (3) rectal, rectal, rectal; (4) vaginal, oral, oral; (5) rectal, oral, oral; y (5) subcutánea, subcutánea, subcutánea. Cada inoculación oral usó 40 \mug de quimera de PE-bucle V3 en 200 \mul de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, 1 mg/ml de BSA y NaHCO_{3} 0,2 M (a pH = 8,1). Todas las inoculaciones vaginales, rectales y subcutáneas contenían 20 \mug de quimera de PE-bucle V3 en 20 \mul de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%.

D. Valoraciones de anticuerpos

Tras la inyección intraperitoneal de 0,1 mg de pilocarpina, se recogió saliva de ratón (habitualmente 50 \mul) usando pipetas de Pasteur de polipropileno y se introdujo en tubos de polipropileno. Las muestras de suero (100 \mul) se obtuvieron por sangrado periorbital usando tubos separadores de suero. Las muestras de suero y saliva recogidas se almacenaron a -70ºC hasta su análisis. Se realizó un ELISA específico de gp120 usando placas Costar 9018 de E.I.A./R.I.A. recubiertas con gp120. Tras el lavado con PBST (PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y timerosol al 0,01%), las placas se bloquearon con tampón de ensayo (PBST que contenía BSA al 0,5%). Se realizó un lavado subsiguiente antes de la introducción de una muestra de suero p saliva (100 \mul/pocillo). Las inmunoglobulinas unidas se marcaron usando anticuerpos de cabra enteros biotinilados que reconocían selectivamente IgA de ratón o IgG de ratón (Amersham). Como control positivo para los ensayos de IgG se usó un anticuerpo monoclonal de ratón denominado 1F12 (Genentech, Inc.). No había disponible ninguna IgA de ratón específica de gp120 como patrón positivo. Se usaron conjugado de ExtrAvidin® y peroxidasa (Sigma), ácido 2,2'-azino-bis(2-etilbenzotiazolino-6-sulfónico) (Sigma) y un tampón de fosfato y citrato que contenía urea y peróxido de hidrógeno para cuantificar el anticuerpo unido a 405 nm.

Se administró PE-V3MN26 no tóxico a ratones balb-c con combinaciones de cebado oral, aplicación a la mucosa vaginal, aplicación a la mucosa rectal o por inyección subcutánea. Se recogieron muestras de suero y saliva uno, dos y tres meses después de la inoculación inicial de cada grupo de administración y se analizaron mediante ELISA para determinar las valoraciones de anticuerpos IgG e IgA específicos de MNgp120. Las muestras de saliva y suero anteriores a la inmunización no mostraron una reacción de ruido de fondo significativa en estos ELISAS específicos de gp120. Se observaron cantidades cuantificables de IgG específica de gp120 en el suero de todos los grupos administrados (Figura 9). Aunque la respuesta de IgG observada fue inicialmente mayor en el grupo de administración subcutánea, finalmente todos grupos demostraron fuertes respuestas de IgG en suero. Los grupos que fueron expuestos oralmente a la ntPE-V3MN26 también parecieron obtener una respuesta de IgG más rápido que aquellos grupos expuestos solamente en la mucosa vaginal o rectal. Comparados con una IgG_{1} monoclonal de ratón que reconoce selectivamente el bucle V3 de MNgp120, los niveles más altos medidos en cada uno de los grupos de IgG específica de Ig120 estaban entre 5-25 \mug/ml de suero.

Los anticuerpos IgA parecen contribuir a la resistencia contra patógenos estrictos de la mucosa y contra agentes invasores que pasan a provocar una enfermedad sistémica tras la colonización de las mucosas. R.I. Walker y cols. (1994) "New strategies for using mucosal vaccination to achieve more effective immunization" Vaccine 12: 387-400. Se usó un ELISA para determinar los niveles de IgA específica de Ig120 en muestras de saliva recogidas como índice de la respuesta de anticuerpos en las mucosas. Dado que no había disponible ninguna IgA monoclonal específica de MNgp120, los valores obtenidos mediante el ELISA solamente se compararon entre grupos y no se caracterizaron en términos de valores absolutos. Las muestras de saliva de los 6 grupos de administración contenían IgA específica de gp120 (Figura 10). La respuesta más potente de IgA se observó en animales que recibieron una dosis vaginal inicial y dosis orales subsiguientes de quimera de PE-bucle V3. Fue interesante que los animales que recibieron solamente inyecciones subcutáneas demostraron niveles de IgA comparables a algunos de los observados en grupos que solamente recibían exposición a las quimeras en las mucosas. Esto puede estar relacionado con los anticuerpos que se usaron en el ELISA de IgA. A pesar de todo, estos resultados demuestran que puede inducirse tanto la inmunidad sistémica como de las mucosas mediante inmunización de las mucosas de forma similar a lo que se observó anteriormente con la inmunización oral usando toxina de tos ferina. M. J. Walker, y cols. (1992) "Specific lung mucosal and sistemic immune responses alter oral immunization of mice with Salmonella typhimurium aro A, Salmonella typhi Ty21a; and invasive Escherichia coli expressing recombinant pertussis toxin S1 subunit" Infect. Immun. 60: 4260.

Se ha reseñado que las vacunas con subunidades de VIH-1 solamente producen una respuesta de IgG tras la administración subcutánea (M. B. Vasudevachari y cols. (1992) "Envelope specific antibodies in the saliva of individuals vaccinated with recombinant VIH-1 gp160" J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 5: 817-821) o de IgG e IgA tras la inyección intramuscular (G. J. Gorse y cols. (1996) "Salivary binding antibodies induced by human immunodeficiency virus type 1 recombinant gp120 vaccine" Clin. Diagnostic Lab. Immunol. 3: 769-773.). Aunque esos autores sugirieron que la maximización de la producción de anticuerpos de las mucosas será importante para una vacuna contra VIH-1, sin embargo, no queda claro si los anticuerpos IgA detectados eran secretores. Es probable que sIgA fuera la forma principal de IgA en las muestras de saliva y que IgA dimérica fuera la forma primaria en las muestras de suero en esos así como en los presentes estudios. El reactivo de unión de IgA que se usó en este momento se desarrolló contra IgA en suero y así puede haber provocado un sesgo en las mediciones de IgA. Así, los niveles de IgA medidos en suero pueden parecer mayores que los niveles en saliva solamente debido a una menor afinidad por sIgA que por IgA dimérico. Los valores de IgA que se proporcionan en el presente estudio, por lo tanto, se presentan solamente en una escala relativa.

Se ha demostrado que un número de factores liberados por células Th1 y Th2 regulan las respuestas de IgA (J. R. McGhee y cols. (1993) "New perspectives in mucosal immunity with emphasis on vaccine development" Seminars in Hematology. 30: 3-15).Por ejemplo, en presencia de IL-5, IL-2 forma una sinergia con TGF-\beta aumentando la síntesis de IgA, lo que abre la posibilidad de manipular farmacológicamente la respuesta inmunitaria. La forma de presentación de antígenos, sin embargo, viene dictada significativamente por el destino del inmunógeno. Se ha demostrado que las células epiteliales de las superficies mucosas, que tienen el receptor LRP para unirse e internalizar ntPE-V3MN26, expresan las proteínas de CHM Clase II y la clase II puede alcanzar eficientemente la superficie de las células para la presentación de antígenos de origen lisosómico (V. G. Brachet y cols. (1997) "Ii chain controls the transport of major histocompatability complex class II molecules to and from lysosomes" J. Cell Biol. 137: 51-65). Así, ntPE-V3MN26 puede ser presentado por las estructuras de CHM Clase II sobre la superficie celular de las células epiteliales. De forma alternativa, si el inmunógeno atraviesa la barrera de la mucosa y alcanza una célula de presentación de antígenos profesional de la lamina propria subyacente en forma intacta, debería inducir una respuesta de Th2 y producir como resultado una presentación de antígenos restringida a MHC clase I.

VII. Respuesta de memoria provocada por la administración a las mucosas de inmunógeno quimérico

La administración a la mucosa de ntPE-V3MN26 produjo una respuesta de memoria significativa caracterizada por una combinación de isotipos de IgG en suero tanto de las rutas de Th1 como de Th2. Dado que se ha propuesto que la respuesta de Th2 es ventajosa para neutralizar virus y que pueden ser necesarias respuestas inmunitarias citotóxicas asociadas a eventos de Th1 para respuestas inmunitarias eficaces contra virus intracelulares (J.R. McGhee y cols. (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6: 369-379), estos resultados sugieren que la inmunización de las mucosas con ntPE-V3MN26 proporcionó los tipos de respuestas deseados para la protección contra la infección por VIH-1 (G.L. Ada y cols. (1997) AIDS Res. Hum. Retroviruses 13: 205-210.

A. Materiales y procedimientos 1. Reactivos

La estructura y preparación de las ntPE-V3MN26 que se usan en estos estudios se describe en la presente memoria. MNgp120 y el anticuerpo monoclonal 1F12 que reconoce el bucle V3 de MNgp120 se prepararon en Genentech, Inc. (South San Francisco, CA). Los anticuerpos de cabra biotinilados desarrollados contra IgG de ratón o IgA de ratón se compraron en Amersham Life Sciences (Arlington Heights, IL). Los anticuerpos de rata biotinilados que reconocen IgG_{1}, IgG_{2a}, IgG_{2b}, IgG_{3} e IgE se obtuvieron de Pharmingen (San Diego, CA).

2. Protocolos de inmunización y de recogida de muestras

Se obtuvieron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad y se mantuvieron en cuarentena durante 2 semanas antes del estudio y con comida y agua a voluntad. Los animales se asignaron aleatoriamente a grupos (n = 6) que recibieron combinaciones de administraciones orales, vaginales, rectales o subcutáneas. Las inoculaciones orales se realizaron por cebado oral de 200 \mul de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, 1 mg/ml de BSA, NaHCO_{3} 0,2 M (pH final = 8,1) y 40 \mul de ntPE-V3MN26. Las inoculaciones vaginales, rectales, y subcutáneas contenían 20 \mug de ntPE-V3MN26 en 20 \mul de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. La saliva de ratón (habitualmente 50-100 \mul) se recogió durante aproximadamente 10 minutos usando pipetas de Pasteur de polipropileno tras la hipersalivación inducida mediante inyección intraperitoneal de 0,1 mg de pilocarpina por animal. Las muestras de suero (100 \mul)se obtuvieron por sangrado periorbital usando tubos separadores de suero. Las muestras de suero y saliva recogidas se almacenaron a -70ºC hasta su análisis.

En un estudio aparte, a los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 20 \mug de ntPE-V3MN26 o 20 \mug de ntPE y se les administraron refuerzos a las 2 y 7 semanas. A un grupo de animales que recibió ntPE-V3MN26 (n = 3) y a los animales que recibieron ntPE (0 = 2) se les administraron simultáneamente 40 \mul de adyuvante completo de Freund inicialmente y 40 \mul de adyuvante incompleto de Freund las semanas 2 y 7. Un grupo de animales (n = 3) a los que se había administrado 20 \mug de ntPE-V3MN26 formulada en 40 \mul de solución salina normal sirvió de control. Las muestras de suero (100 \mul) se obtuvieron semanalmente y se almacenaron tal como se describe anteriormente.

3. Medición de las respuestas de anticuerpos

Se midieron los anticuerpos específicos contra gp120 mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). En resumen, placas Costar 9018 de E.I.A./R.I.A. de 96 pocillos se recubrieron con 1 \mug/pocillo de MNgp120, se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (v/v) y después se bloquearon toda la noche 4ºC con PBS que contenía BSA al 1%. Después de lavar con PBS/Tween 20, las placas se incubaron con diluciones de muestras de suero o saliva (diluidas con PBS/Tween 20 que contenía BSA al 0,1%). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave, después se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 y se incubaron con un anticuerpo de cabra conjugado con biotina contra IgA o IgG de ratón, para determinar las respuestas de subclase IgG o IgE, con anticuerpo de rata conjugado con biotina contra IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, o IgE de ratón durante 1 hora usando las mismas condiciones de incubación. Después de lavar con PBS/Tween 20, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano. Los anticuerpos unidos se visualizaron mediante el conjugado de ExtrAvidin® y peroxidasa (Sigma), ácido 2,2'-azino-bis(2-etilbenzotiazolino-6-sulfónico) (Sigma) y un tampón de fosfato y citrato que contenía urea y peróxido de hidrógeno para cuantificar el anticuerpo unido a 405 nm.

B. Resultados 1. Respuestas de anticuerpos IgA contra ntPE-V3MN26

Los animales se inocularon (n = 6/grupo) por una variedad de vías con ntPE-V3MN26 seguido de 2 refuerzos los días 14 y 21 y después el mes 16. Los animales recibieron ntPE-V3MN26 bien por vía oral (PO), vaginal (V), rectal (R), vaginal y oral (V/PO), rectal y oral (R/PO), o subcutánea (SC). Las muestras de saliva que se recogieron a los 30, 60 y 90 días y después de nuevo a los 16,5 meses se analizaron para determinar IgA específica de los antígenos (Figura 11). Sin un anticuerpo IgA contra el bucle V3 para estandarizar los ensayos, las respuestas se normalizaron con una muestra muy positiva. Los valores se expresaron en una escala arbitraria de unidades de IgA específica de antígeno. Todos los grupos que habían sido administrados demostraron respuestas de IgA salivar comparables a los 30 y 60 días. A los 90 días, la respuesta más potente de IgA salivar se observó en el grupo que recibió una dosis inicial vaginal y refuerzos subsiguientes orales. A los 16,5 meses los grupos de todas orales, todas vaginales y todas rectales mostraron los niveles más elevados de IgA salivar específica de antígeno. Las respuestas de los grupos de inoculación mucosa combinada (vaginal/oral y rectal/oral) eran comparables a los observados en el grupo de administración subcutánea.

Para asegurar que estas respuestas de IgA salivar reflejaban una unión específica de antígeno y no una unión no específica a componentes salivares, se evaluaron muestras de saliva anteriores a la inmunización y se realizó un estudio en el que se administraba una mezcla de péptido del bucle V3 y ntPE a los ratones. Los estudios demostraron que las muestras de saliva no diluidas anteriores a la inmunización no demostraron un ruido de fondo cuantificable en el formato ELISA. También, los animales a los que se administró simultáneamente ntPE y un bucle V3 sin conjugar unidos por un enlace disulfuro no presentaron niveles cuantificables de IgA específica de MNgp120. Estos resultados indican que se produjo poca o ninguna reactividad cruzada no específica en el ELISA.

No se observaron respuestas detectables de IgA en suero específica de antígeno en ninguno de los grupos de administración en los tiempos de obtención de muestras de 1, 2 ó 3 meses. Sin embargo, a los 16,5 meses, los sueros recogidos de todos los grupos demostraron IgA específica de antígeno (Tabla 1). Es posible que la capacidad de detectar IgA en suero en este momento pueda haberse debido a una respuesta inmunitaria global elevada en lugar de a una estimulación específica. De forma interesante, los niveles relativos de IgA en suero no se correlacionaban con los niveles de IgA salivar. Por ejemplo, las inoculaciones mediante la combinación rectal/oral proporcionaron una de las respuestas de IgA salivar de memoria más débil, pero la respuesta de IgA en suero de memoria más potente (Tabla 1, Figura 11). Los grupos de todas orales, todas vaginales o todas rectales, que proporcionaron loas respuestas de IgA salivar más potentes a los 16,5 meses presentaban algunas de las respuestas de IgA en suero más débiles en este tiempo. Al contrario que la administración a las mucosas de ntPE-V3MN26 donde los niveles opuestos en saliva y suero eran la norma, las inoculaciones subcutáneas de ntPE-V3MN26 produjeron una respuesta moderada de IgA, tanto en la saliva como en el suero de los ratones (Tabla 1, Figura 11). Fuera cual fuera el estímulo de la producción de IgA, los niveles de IgA específica de antígeno en suero fueron transitorios. En el muestreo a los 22 meses, sólo dos animales del grupo rectal/oral representaban los únicos positivos de IgA que reconocía MNgp120 en suero cuantificable. Ninguno de los otros grupos, incluso el grupo de inyección subcutánea, mostró niveles detectables de IgA en suero en este punto.

TABLA 1 La inmunización con ntPE-V3MN26 estimula la producción de IgA en suero e IgG salivar específicas de antígeno en ratones

Calendario de inmunizaciones ^{a}	IgA en suero ^{b} (unidades arbitrarias)	IgG ^{c} salivar (\mug/ml)
PO/PO/PO/PO	0,233 \pm 0,074	10,9 \pm 2,2
V/V/V/V	0,172 \pm 0,061	9,52 \pm 1,6
R/R/R/R	0,178 \pm 0,042	9,93 \pm 1,7
V/PO/PO/PO	0,160 \pm 0,021	9,90 \pm 1,3
R/PO/PO/PO	0,450 \pm 0,128	11,0 \pm 0,49
SC/SC/SC/SC	0,273 \pm 0,078	7,1 \pm 0,63
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Las inmunizaciones se realizaron los días 0, 14, 21 y el mes 16 en animales bien por vía oral (PO), vaginal (V), rectal (R) o subcutánea (SC).\end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm}Los niveles de IgA específica de MNgp120 se midieron mediante ELISA a los 16,5 meses y se normalizaron con un patrón de muestra única y se expresaron en unidades arbitrarias.\end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm}Los niveles de IgG específica de MNgp120 se midieron mediante ELISA a los 16,5 meses y se calibraron comparando con un anticuerpo monoclonal de ratón (1F12) que reconoce el bucle V3 de la proteína.\end{minipage}

2. Respuestas de anticuerpos IgG contra ntPE-V3MN26

Las respuestas de IgG específica de antígeno en suero y saliva, medidas mediante ELISA, se estandarizaron usando un anticuerpo monoclonal de ratón (1F12) que reconoce el bucle V3 de MNgp120. El ensayo era lineal en el intervalo de 0,05 - 2,5 \mug para 1F12 y los sueros y salivas anteriores a la inmunización eran negativos en el formato ELISA. Aunque la respuesta de IgG producida por una inoculación inicial seguida de dos dosis de refuerzo fue finalmente mayor en el grupo de inyección subcutánea, todos los grupos de inoculación a las mucosas demostraron respuestas potentes de IgG en suero los días 30, 60 y 90 (Figura 12). Dos semanas después de una dosis de refuerzo con ntPE-V3MN26 el mes 16, el grupo de inyección subcutánea tenía la respuesta de memoria más elevada de IgG en suero. Todos los grupos de mucosas también mostraron respuestas de memoria fuertes en este tiempo (Figura 12). Sin embargo, para el mes 22 las valoraciones de IgG específica de antígeno en suero habían disminuido en todos los grupos.

3. Comparación de los niveles de IgG e IgA en suero y saliva

Los estudios anteriores han sugerido que la IgG en suero puede trasudarse a las superficies mucosas, posiblemente proporcionando alguna forma de protección inmunitaria. M.B. Vasudevachari y cols. (1992) J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 5: 817-821. Otros no han sido capaces de demostrar tal evento de trasudación. E. -L. Johansson y cols. (1998) Infect. Immun. 66: 514-520. En estos estudios, no se observó IgG específica de antígeno en muestras de saliva en los meses 1, 2 y 3 pero aumentó a niveles detectables después de una dosis de refuerzo el mes 16 (Tabla 1). Todos los grupos de animales que habían sido inoculados en las mucosas tenían respuestas de IgG salivar comparables en este tiempo que eran superiores a las que se observaban para los animales que recibían ntPE-V3MN26 subcutánea (Tabla 1). Esta falta de correlación entre los niveles relativos en suero y saliva de IgG específica de antígeno (Figura 12, Tabla 1) sugiere una separación de las reservas de IgG en suero y salivar resultado de esta respuesta de memoria. Así, parece que la IgG presente en saliva de los estudios puede haber sido resultado, en un grado significativo, de la producción local de anticuerpos en lugar de un "derrame" de los anticuerpos circulantes en suero.

4. Respuestas de isotipos de IgG en suero a ntPE-V3MN26

En los ratones, la inducción de una respuesta de Th1 habitualmente conlleva la producción de IgG2a e IgG3 por los linfocitos B mientras que una respuesta de Th2 conlleva la producción de IgG1 y posiblemente IgE. A.K. Abbas y cols. (1996) Nature 383: 787-793. El desarrollo de una respuesta de Th1 o Th2 está dirigido por citoquinas específicas tales como interferón-\gamma e IL-4. la introducción de ntPE-V3MN26 bien sistémicamente mediante inyección subcutánea o mediante aplicación a tejidos orales, vaginales o rectales produjo el desarrollo de una respuesta de IgG específica de antígeno en suero. Se investigó la población de los isotipos de IgG de estas muestras de suero y se encontró que la respuesta específica de MNgp120 estaba dominada (\sim55%) por IgG3. Se encontraron cantidades menores y comparables de IgG2a específica de antígeno (\sim20%) e IgG2b (\sim20%) junto con cantidades reducidas (\sim5%) de IgG3. No se detectó IgE específica de antígeno. Estos resultados sugieren que la administración subcutánea de ntPE-V3MN26 induce tanto respuestas de Th1 como de Th2 en ratones BALB/c, dominando el fenotipo Th2.

VIII. Evaluación de ntPE-V3MN26 como adyuvante

Los adyuvantes pueden actuar facilitando la presentación de un antígeno y/o activando la respuesta inmunitaria en el sitio de la inoculación. F.R. Vogel y cols. (1995) A compendium of vaccine adyuvants and excipients, páginas 141-228. EnM. F. Powell, y M. J. Newman (editores), VACCINE DESIGN: THE SUBUNIT AND ADYUVANT APPROACH, vol. 6. Plemun Press, Nueva York. Reconocido como uno de los adyuvantes más potentes disponibles, el adyuvante de Freund es una mezcla de aceite mineral, tensioactivo y Mycobacterium tuberculosis. Se realizó un estudio para evaluar la eficacia de la inducción de IgG en suero por ntPE-V3MN26 inyectando a los ratones inicialmente ntPE-V3MN26 y adyuvante completo de Freund por vía subcutánea, con dosis de refuerzo con ntPE-V3MN26 y adyuvante incompleto después de 14 y 49 días, y después comparando las respuestas de IgG en suero con las de los animales que recibieron ntPE-V3MN26 sin adyuvante de Freund (Figura 13). Los animales que recibieron la misma pauta de administración subcutánea de ntPE-V3MN26 con solución salina normal en lugar de adyuvante de Freund mostraron aproximadamente un tercio de la respuesta inmunitaria específica de antígeno que se observó en los animales que recibían esta quimera junto con adyuvante de Freund. El nivel de respuesta a ntPEV3MN26 en este espacio de tiempo fue similar al observado en el grupo de inyección subcutánea que se representa en la Figura 12 a los 1, 2 y 3 meses, lo que sugiere un resultado bastante consistente para esta forma de administración de la quimera. Un control en el que se inyectó la pauta de adyuvante de Freund junto con una PE no tóxica que carecía del bucle V3 de MNgp120 demostró la especificidad de la respuesta inmunitaria que se estaba midiendo (Figura 13).

La presente invención proporciona inmunógenos quiméricos tipo exotoxina A de Pseudomonas y procedimientos de provocar una respuesta inmunitaria. Aunque se han proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Para las personas de experiencia en la técnica serán obvias muchas variaciones de la invención al revisar esta memoria descriptiva. El alcance de la invención, por lo tanto, debería determinarse no refiriéndose a la descripción anterior, sino que debería determinarse refiriéndose a las reivindicaciones anexas.

Claims (40)

1. El uso un inmunógeno quimérico tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") no tóxico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad provocada por un patógeno que penetra en un mamífero a través de una membrana mucosa, en el que el medicamento es para aplicar a una superficie mucosa del mamífero para provocar una respuesta inmunitaria mediada por IgA secretora contra el patógeno, en el que además el inmunógeno comprende por orden: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500 aminoácidos que se une a un receptor superficial celular de mucosa; (2) un dominio de translocación que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la translocación al citosol celular; (3) un dominio de epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y 1500 aminoácidos que es exógeno al dominio Ib de PE y codifica un epítopo del patógeno; y (4) una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende una secuencia de retención en el RE y en el que el dominio de retención en el RE carece de actividad de ADP-
ribosilación.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho patógeno es un virus, bacteria o protozoo.

3. El uso de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que la enfermedad es provocada por un patógeno que se selecciona de VIH, herpes zoster, influenza, polio, hepatitis, tuberculosis, Chlamydia, Salmonella, Trypanosoma, Plasmodium, vaccinia, citomegalovirus, Yersinia y vibrio.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de aminoácidos del dominio de epítopo exógeno tiene de aproximadamente 15a 350 aminoácidos.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de epítopo exógeno consiste en aproximadamente 50 aminoácidos.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de epítopo exógeno consiste en aproximadamente 15 aminoácidos.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el epítopo exógeno es un epítopo de herpes, vaccinia, citomegalovirus, yersinia o vibrio y dicho anticuerpo IgA secretor reconoce el epítopo exógeno.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el dominio de epítopo exógeno comprende un bucle de cisteína a cisteína que comprende el epítopo exógeno.

9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el epítopo exógeno comprende un vértice del bucle V3 de VIH-1.

10. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el dominio de retención comprende la secuencia REDLK.

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el dominio de retención comprende la secuencia RDEL.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el dominio de reconocimiento celular es el dominio de reconocimiento celular Ia de PE.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el dominio de reconocimiento celular comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el dominio de translocación es idéntico al menos al 95% al dominio de translocación de PE.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que el dominio de translocación es idéntico al menos al 98% al dominio de translocación de PE.

16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la superficie de la mucosa se selecciona de boca, nariz, pulmón, intestino, vagina, colon o recto.

17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 que es para la fabricación de un medicamento para la administración a diferentes superficies mucosas.

18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que comprende el uso del inmunógeno quimérico para la fabricación de medicamento(s) para la administración inicial y de refuerzo.

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19. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende el uso del inmunógeno quimérico para la fabricación de un medicamento para uso como refuerzo y para la administración parenteral.

20. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende el uso del inmunógeno quimérico para la fabricación de un medicamento para uso como refuerzo, a una superficie mucosa al menos un año después de una dosis inicial.

21. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el medicamento se formula en forma de un spray, ungüento, supositorio o polímero erosionable.

22. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el mamífero es un ser humano.

23. Un procedimiento no terapéutico de producir un anticuerpo contra un epítopo diana, que comprende la administración vía mucosa a un animal no humano de un inmunógeno quimérico tipo exotoxina A de Pseudomonas ("tipo PE") no tóxico, en el que el inmunógeno comprende por orden: (1) un dominio de reconocimiento celular de entre 10 y 1500 aminoácidos que se une a un receptor de la superficie de células mucosas; (2) un dominio de translocación que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una secuencia del dominio II de PE suficiente para lograr la translocación al citosol celular; (3) un dominio de epítopo diana que comprende una secuencia de aminoácidos de entre 5 y 1500 aminoácidos que es exógeno al dominio Ib de Pe y codifica un epítopo de un patógeno que penetra en un mamífero a través de una membrana mucosa; y (4) una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio de retención en el retículo endoplasmático ("RE") que comprende una secuencia de retención en el RE y en el que el dominio de retención en el RE carece de actividad de ADP-ribosilación.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

25. El procedimiento de la reivindicación 23 que además incluye la fabricación de un anticuerpo monoclonal utilizando células que segregan anticuerpos producidas en dicho animal mediante la administración de dicho inmunógeno.

26. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que dicho patógeno es un virus, bacteria o protozoo.

27. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que la enfermedad es provocada por un patógeno que se selecciona de VIH, herpes zoster, influenza, polio, hepatitis, tuberculosis, Chlamydia, Salmonella, Trypanosoma, Plasmodium, vaccinia, citomegalovirus, Yersinia y vibrio.

28. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que la secuencia de aminoácidos del dominio de epítopo diana tiene de aproximadamente 15 a 350 aminoácidos.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de epítopo diana está formado por aproximadamente 50 aminoácidos.

30. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de epítopo diana está formado por aproximadamente 15 aminoácidos.

31. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, en el que el epítopo diana es un epítopo de herpes, vaccinia, citomegalovirus, yersinia o vibrio y dicho anticuerpo IgA secretor reconoce el epítopo diana.

32. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, en el que el dominio de epítopo diana comprende un bucle de cisteína a cisteína que comprende el epítopo diana.

33. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en el que el epítopo exógeno comprende un vértice del bucle V3 de VIH-1.

34. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en el que el dominio de retención comprende la secuencia REDLK.

35. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en el que el dominio de retención comprende la secuencia RDEL.

36. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, en el que el dominio de reconocimiento celular es el dominio de reconocimiento celular Ia de PE.

37. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, en el que el dominio de reconocimiento celular comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

38. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 37, en el que el dominio de translocación es idéntico al menos al 95% al dominio de translocación de PE.

39. El procedimiento de la reivindicación 38, en el que el dominio de translocación es idéntico al menos al 98% al dominio de translocación de PE.

40. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30 que además comprende preparar un anticuerpo humanizado.