ES2274861T3

ES2274861T3 - Metodo para el diagnostico no-invasivo de transplantes y transfusiones.

Info

Publication number: ES2274861T3
Application number: ES01811266T
Authority: ES
Inventors: Wolfgang Prof. Holzgreve; Sinuhe Dr. Hahn; Hendrikus Stephanus Paulus Garritsen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-12-24
Filing date: 2001-12-24
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2021-12-24
Also published as: DE60123448D1; EP1325963A1; ATE340871T1; EP1325963B1; DE60123448T2

Abstract

Método para el diagnóstico no-invasivo de trasplantes y transfusiones caracterizado por a) extracción de ADN mitocondrial (ADNmt) no celular circulante de una muestra de fluidos corporales no celulares procedente del receptor del trasplante o transfusión; b) detección, análisis y cuantificación del ADNmt de la muestra; c) comparación del ADNmt de la muestra con el ADNmt que se obtiene del donante y del receptor antes del trasplante o transfusión; d) utilización de polimorfismos de ADNmt en regiones hipervariables para distinguir entre el daño del tejido del donante y el daño del tejido del receptor en el contexto del trasplante o para determinar la supervivencia de componentes de células sanguíneas en una transfusión.

Description

Método para el diagnóstico no-invasivo de trasplantes y transfusiones.

El trasplante de órganos sólidos y de células madre alogénicas implica el trasplante de una unidad funcional de origen alogénico a un paciente enfermo. Esta unidad funcional puede ser aceptada o rechazada por el receptor del trasplante. Existen múltiples parámetros tales como el estado funcional del órgano, la compatibilidad inmunológica, etc., que influyen en la aceptación final del órgano o de las células madre implantadas. El apoyo farmacológico después del trasplante puede modular el sistema inmunológico del receptor y con ello reducir el rechazo del
trasplante.

Debido a la escasez aguda de órganos compatibles o de células madre de donantes, es extremadamente importante minimizar las pérdidas a causa del rechazo. El resultado del trasplante se mejora mediante un extenso programa de pruebas de compatibilidad pre-trasplante y mediante control continuo del estado funcional del trasplante y de cualquier signo de rechazo. Esta forma de control es también útil para ajustar la dosis del tratamiento de inmunosupresión necesario para la aceptación del injerto.

Un factor relevante en este control no sólo es lo que debe ser medido sino también dónde debe ser medido.

Una estrategia desarrollada consiste en medir las respuestas inmunitarias específicas para los antígenos en cuestión, tales como las clases foráneas MHC I y II para el caso de trasplantes alogénicos, en el lugar del injerto (biopsia del tejido). Este procedimiento de diagnóstico invasivo presenta las desventajas siguientes:

-: Influye negativamente sobre la calidad de vida del paciente (permanencia hospitalaria).

-: Se asocia con complicaciones tales como hematuria, anuria, hematoma perirrenal, hemorragia y shock, fístula arteriovenosa y pérdida del injerto en el caso de trasplante renal. En el trasplante de hígado y de corazón se han descrito complicaciones semejantes.

-: Existe una cantidad limitada de material biológico y de reactivos necesarios, y únicamente hay un número limitado de biopsias posibles.

-: El rechazo puede ser un problema focal en un órgano: errores de muestreo causan resultados falsos negativos. Para aumentar la certeza del diagnóstico, por lo tanto, se tienen que tomar múltiples muestras de biopsia, que se asocia con un alto riesgo de pérdida del trasplante.

-: Coste general de procedimientos invasivos muy elevado.

En base a estos conocimientos se ha ideado otra estrategia y se ha llegado al desarrollo de procedimientos de diagnóstico no-invasivos para controlar los rechazos. Tales procedimientos incluyen:

a): Control de los tipos de células inmunes presentes en la circulación en un momento dado.

b): Medida de los cambios en patrones de citoquina.

c): Medida de la codificación del ARNm para la perforina y el granzima B, las proteínas citotóxicas asociadas con el rechazo del órgano.

Las ventajas de estas técnicas de diagnóstico no-invasivas son, que no interfieren en la calidad de vida del receptor del trasplante, que en general sólo se necesita una muestra de sangre o de orina y que las pruebas se pueden estandarizar y/o automatizar. Además, apenas se asocian complicaciones de proceso con los métodos de ensayo no-invasivos, que son menos costosos en comparación con los procedimientos invasivos.

Las desventajas de los ensayos no-invasivos conocidos son, que requieren tecnólogos especializados para obtener resultados válidos, que los ensayos basados en el análisis del ARNm están influenciados por la cortísima vida de esta molécula y por ello requieren un procesado de muestras muy rápido, que el control de las células inmunes y/o de las citoquinas implicadas en la inflamación está amparado por posibles infecciones que pueden causar alteraciones similares a las que se presentan bajo condiciones de rechazo del trasplante, y que ninguno de estos hechos ha demostrado ser útil en la identificación de rechazo del injerto en etapas tempranas.

Aparte de proteínas específicas y del ADN genómico del donante, también se sabe que cuando el tejido del injerto donante está dañado se libera ADN mitocondrial (ADNmt) a la circulación del receptor. A excepción de los eritrocitos maduros, todos los componentes sanguíneos celulares contienen mitocondrias. Miles de mitocondrias por célula están presentes en los leucocitos, y una media de 3-4 mitocondrias están también presentes en las plaquetas. Cada una de estas mitocondrias contiene por lo menos una copia de ADNmt. El ADN mitocondrial codifica un conjunto completo o ARN ribosomal y ARN de transferencia así como 13 polipéptidos de fosforilación oxidativa. Este ADNmt humano circular de 16,6 kb fue completamente secuenciado en 1981.

TRANSFUSION vol. 37, 1997, p. 1012-1019 y EUR. J. IMMUNOGENETICS vol. 28, no. 2, abril 2001, p. 209; y 15th European Histocompatibility Conference, Granada, España, 27-30 de marzo de 2001, describen el método PCR-SSP para detectar ADNmt específico del donante en un sistema in vitro que imita la composición sanguínea del receptor después de la transfusión de plaquetas, siendo los cebadores específicos de secuencia ASF y BSF localizados en las regiones hipervariables del ADNmt.

TRANSFUSION vol. 41/12, diciembre 2001, p. 1531-1538; y BRIT. J. HAEMATOL. vol. 112, no. 4, marzo 2001, p. 995-1003 describen el análisis de las regiones HVR 1 y HVR 2 del ADNmt para polimorfismos por medio de PCR-SSP o análisis de secuencia, siendo ambos métodos útiles para el diagnóstico de transfusiones mediante la detección del ADNmt específico del donante y habiendo sido probados en un sistema in vitro.

El objetivo de la presente invención es sugerir un método o proceso para medir la cantidad de ADNmt no celular circulante en fluidos corporales como indicador o marcador de daños del tejido y utilizar los polimorfismos de ADNmt para distinguir entre el daño del tejido de donante y de receptor en el contexto del trasplante. Además, el método no debe incluir el marcado de productos sanguíneos celulares ya que esto podría modificar potencialmente los productos y/o afectar a su calidad, y el método debe ser fácil de realizar.

El objetivo indicado de la presente invención se alcanza mediante el método según la reivindicación 1.

El método según la presente invención consiste en un procedimiento de diagnóstico no-invasivo caracterizado por los siguientes pasos:

a): extracción de ADN mitocondrial (ADNmt) no celular circulante de una muestra de fluidos corporales no celulares del receptor del trasplante o transfusión;

b): detección, análisis y cuantificación del ADNmt de la muestra;

c): comparación del ADNmt de la muestra con el ADNmt que se obtiene del donante y del receptor antes del trasplante o transfusión;

d): utilización de polimorfismos de ADNmt en regiones hipervariables para distinguir entre el daño del tejido del donante y el daño del tejido del receptor en el contexto del trasplante o para determinar la supervivencia de componentes de células sanguíneas en una transfusión.

Las ventajas de este procedimiento comparado con otros métodos no-invasivos son:

-: Detecta específicamente el daño del órgano objeto como si no hubiera ninguna otra fuente de ADNmt que contenga los polimorfismos específicos.

-: Utiliza ADN bicatenario que es mucho más estable en circulación que el ARNm. Utiliza el ADNmt que está presente en más de 10.000 copias sobre la base de una célula. Esto aumenta la sensibilidad 2-3 logs cuando se compara con una sola copia del marcador de polimorfismo de un solo nucleótido del genoma nuclear.

-: Utiliza la región hipervariable del ADN mitocondrial. Esta región D-bucle está presente en varias copias para una sola molécula de ADNmt. Esto proporciona un número adicional de copias de la secuencia objeto por célula.

-: La tasa de mutación del ADN mitocondrial es 10-20 veces superior a la del ADN genómico con lo que aumenta la probabilidad de encontrar los polimorfismos informativos.

-: Se ha descrito la secuencia del ADNmt y se han caracterizado muchos polimorfismos.

Se sabe que el ADNmt humano representa un objetivo extraordinario para detectar plaquetas transfundidas alogénicas. Mediante la secuenciación de 100 donantes de aféresis de plaquetas se han encontrado más de 20 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la región de control del ADNmt. La presente invención da a conocer la posibilidad de utilizar estos polimorfismos mediante PCR utilizando cebadores específicos de secuencia (SSP) y de esta manera, una nueva técnica adaptada para diferenciar células alogénicas de células autólogas. Dicho más específicamente, se han diseñado nuevos pares cebadores específicos de secuencia y se han optimizado las condiciones para PCR.

Por lo tanto, otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método con un sistema PCR-SSP para polimorfismos de ADN frecuentes, pares cebadores específicos de secuencia y un control de la amplificación del par cebador para indicar si la reacción PCR ha sucedido.

Un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar un conjunto SSP-PCR que detecte los polimorfismos frecuentes en el ADNmt humano. Este conjunto se puede utilizar para identificar marcadores informativos de quimerismo y estudios de supervivencia después de transfusiones de componentes sanguíneos celulares.

Las realizaciones preferentes de la presente invención quedan reflejadas en las reivindicaciones dependientes.

La presente invención se describe con más detalle a continuación mediante la siguiente explicación y en relación con el dibujo adjunto. En el dibujo,

La Figura muestra una vista general esquemática de la localización de los SNP dentro del ADNmt humano,

la Tabla 1 muestra los oligonucleótidos cebadores de HVRI Mitotyping mediante PCR-SSP,

la Tabla 2 muestra los oligonucleótidos cebadores de HVRI Mitotyping mediante PCR-SSP,

la Tabla 3 muestra los oligonucleótidos cebadores de COXI Mitotyping y el cebador de control mediante PCR-SSP,

la Tabla 4 muestra el perfil térmico y las condiciones de PCR para pares cebadores de HVRI, y

la Tabla 5 muestra el perfil térmico y las condiciones de PCR para pares cebadores de HVR2.

Utilizando dos polimorfismos bien conocidos del ADNmt, es posible establecer un sistema cebador específico de secuencia-PCR (PCR-SSP) para la detección de trombocitos alogénicos de transfusiones. Sin embargo, estos dos cebadores detectan polimorfismos de ADNmt poco frecuentes en la población caucásica y en la práctica, no son muy informativos. Para aumentar el número de cebadores informativos, es necesario cambiar a dos regiones altamente polimórficas (HVRI y HVR2) dentro de la región D-bucle de 1.024 bp. Esta región D-bucle es una región de no-codificación que contiene los elementos reguladores para la replicación y la trascripción.

La figura del dibujo muestra una vista general esquemática de la localización de los SNP dentro del ADNmt humano objeto de los cebadores específicos de secuencia. El genoma mitocondrial circular se muestra en la parte inferior izquierda de la figura. La letra L representa la hebra ligera y la letra H la hebra pesada. Leyendo en el sentido de las agujas del reloj, en la parte inferior izquierda de la figura se muestra la región de codificación de la citocromo c oxidasa I (COXI) (entre bp 7000-7500), que contiene el par cebador 20. En la parte superior derecha de la figura se representa la región D-bucle esquemáticamente. El D-bucle está unido a los genes a través de la prolina del ARNt (tRNAPro) y de la fenilalanina del ARNt (tRNAPhe). Se muestran las posiciones de las diferentes regiones hipervariables. Trece pares cebadores se localizan dentro de la primera región hipervariable (HVR1) de la región D-bucle. Seis pares cebadores se sitúan en la segunda región hipervariable (HVR2) y un par cebador se localiza dentro de la secuencia de codificación de la citocromo c oxidasa I (COXI).

Los SNP se seleccionan en base a un análisis de secuencia de nucleótidos de 100 donantes de aféresis de plaquetas. Todos los SNP seleccionados se expresan sobre el 10 por ciento de los donantes. Además, el polimorfismo a 7025 np se escoge porque es expresado por un 34% de caucásicos. Ambos cebadores, el directo y el inverso, se pueden diseñar con la ayuda de un software para el diseño de cebadores disponible en Internet bajo http//www.williamstone.com. Los oligonucleótidos cebadores se pueden analizar para potencialmente interferir en estructuras secundarias, tales como los bucles en horquilla (hairpin loops) y para diferencias de punto de fusión. Las secuencias de nucleótido y la localización de los cebadores utilizados para PCR-SSP mitotyping se muestran en las tablas 1 a 3.

En la localización de las tablas, se muestra el tamaño del fragmento y la secuencia de los cebadores utilizados para la amplificación específica de secuencia de patrones de ADN mitocondrial. La letra F indica el cebador directo y la letra R indica el cebador inverso. Los cebadores se numeran según su posición en el extremo 5' en la secuencia de referencia (Anderson y otros, Nature, 1981, 290, 457-465). La letra H se utiliza para la hebra pesada, que es rica en purina. La letra L se utiliza para la hebra ligera (rica en pirimidina). * indica la base que diferencia el alelo. Las bases que no se complementan con su correspondiente patrón objeto están subrayadas.

En cada reacción PCR se incluye un par cebador, que amplifica una secuencia conservada del ADNmt y así funciona como cebador de control de la amplificación. La concentración del par cebador de control se mantiene de 4 a 20 veces más baja que la concentración de los cebadores específicos de alelo para aumentar la especificidad y evitar resultados falsos negativos debidos a la cebación competitiva.

Las condiciones de amplificación específicas y las mezclas de reacción para cada reacción PCR-SSP se muestran en las tablas 4 y 5. El volumen total de la reacción de PCR es de 10 \muL. Cada mezcla de reacción de PCR contiene un par cebador SSP (tablas 1-3) y el par cebador de control positivo interno (tabla 3). Para concentraciones específicas de los pares cebadores ver tablas 4 y 5. Además de los cebadores, las mezclas de reacción de PCR contienen también patrón de ADNmt, PCR, tampón, dNTP, dimetilsulfóxido, Taq polimerasa y cloruro de magnesio. Dado que cada reacción de PCR se tiene que optimizar para cada uno de los componentes, la concentración de los diferentes componentes y las temperaturas de alineación varían. Las concentraciones exactas de los diferentes componentes se pueden encontrar en las tablas 4 y 5. El volumen de reacción de 10 \muL se completa por adición de agua bidestilada.

La PCR se puede realizar utilizando un secuenciador térmico programable. Otros 10 \muL de producto amplificado se pueden visualizar y analizar mediante la presencia o ausencia de productos PCR utilizando un 2 por ciento de gel de agarosa con luz ultravioleta después de tinción con bromuro de etidio.

Los resultados de los experimentos según las condiciones descritas con anterioridad se describen a continuación.

En cuarenta casos, se encontraron reacciones PCR-SSP positivas en el patrón de ADNmt de individuos previamente no probados y se confirmaron mediante secuenciación automatizada del patrón de ADNmt en una instalación de secuenciación independiente.

Detección de leucocitos alogénicos

Cada célula nucleada contiene miles de mitocondrias. Teóricamente, esto indicaría que hay más patrones de ADNmt que de ADN genómico disponibles sobre la base de una célula. Para investigar si esto se podía demostrar, se compararon dos sistemas PCR-SSP. Uno corresponde a un sistema de PCR-SSP para ADN genómico (HLA-B low kit, Genovision, Viena, Austria), y el otro a un sistema mitotyping PCR-SSP para ADNmt según la presente invención. Se aislaron las células mononucleares de 6 individuos mediante centrifugación en gradiente de densidad, de las cuales se conocían los polimorfismos genómicos (HLA tipo B) y los polimorfismos mitocondriales (mitotyping). Para simular las combinaciones donante/receptor, se prepararon seis pares con una dilución en serie de 10 veces de células de donante. El punto de partida fue de 10^{6} células mononucleares. El ADN se extrajo utilizando un conjunto comercial (Puregene, gentra systems) y se realizó la PCR. La cantidad de ADN y las condiciones de secuenciación (30 ciclos) se mantuvieron semejantes para ambos sistemas. 10 \muL del producto amplificado se visualizaron y se analizaron según la presencia o la ausencia de productos PCR utilizando un 2 por ciento de gel de agarosa con luz ultravioleta después de tinción con bromuro de etidio.

Se encontró que, en las seis combinaciones, las secuencias específicas del donante detectadas mediante cebadores específicos de ADNmt eran de 102 a 103 veces más sensibles que los cebadores para la detección de polimorfismos HLA.

Detección de plaquetas alogénicas transfundidas

Las plaquetas sólo contienen un número muy pequeño de mitocondrias. Esto está completamente compensado por la gran cantidad de plaquetas que se transfunden (10^{12}/unidad). Para investigar el límite de detección del sistema PCR-SSP desarrollado para el ADN mitocondrial en esta aplicación, se prepararon una serie de diluciones de plaquetas de donante aisladas de 6 individuos con polimorfismos conocidos de ADNmt. Para simular las combinaciones de donante/receptor, se prepararon seis pares con una dilución en serie de 10 veces de células de donante. El punto de partida fue de 10^{8} plaquetas. El ADN se extrajo utilizando un conjunto comercial y se realizó la PCR con un par cebador indicador del polimorfismo informativo. Las condiciones de secuenciación fueron idénticas a las mencionadas con anterioridad. 10 \muL del producto amplificado se visualizaron y se analizaron según la presencia o la ausencia de productos PCR utilizando un 2 por ciento de gel de agarosa con luz ultravioleta después de tinción con bromuro de etidio.

Utilizando 10^{8} plaquetas se determinaron los límites de reactividad en 10^{2}-10^{3} para cebadores informativos diferentes, lo que significa que con el método según la presente invención se pueden detectar 100-1000 plaquetas alogénicas sobre un fondo de 100 millones de plaquetas.

En dos casos el segundo experimento anteriormente mencionado fue ampliado mezclando cantidades preestablecidas de plaquetas alogénicas (series de dilución de 10 veces, punto de partida de 10^{6} plaquetas) en un tubo de sangre EDTA de un receptor. Esto para simular una transfusión de plaquetas. Después de mezclar durante 15 minutos con un rodillo, el plasma rico en plaquetas se aisló mediante centrifugación de densidad. El ADN se extrajo utilizando un conjunto comercial y se realizó la PCR con un par cebador indicador del polimorfismo informativo. Las condiciones de secuenciación fueron idénticas a las mencionadas con anterioridad. 10 \muL del producto amplificado se visualizaron y se analizaron según la presencia o la ausencia de productos PCR utilizando un 2 por ciento de gel de agarosa con luz ultravioleta después de tinción con bromuro de etidio. De manera similar a las mezclas de plaquetas, se pudo alcanzar una sensibilidad de 10^{2} o 10^{3} plaquetas alogénicas en todas estas mezclas sanguíneas.

La especificidad también se ensayó tomando 10 individuos seleccionados aleatoriamente y analizando los 20 polimorfismos de ADNmt más frecuentes. El siguiente paso consistió en complementar estos individuos y determinar si se podían distinguir entre ellos en base a los resultados del análisis. En un 94% de las combinaciones se pudieron identificar utilizando el conjunto de cebadores mitotyping de la presente invención.

Como se ha demostrado con anterioridad, según la presente invención, el uso de SNP con ADN mitocondrial como objetivo potencial es posible y cubre la mayor parte de los asuntos ya mencionados. Además del objetivo, la selección de la técnica de amplificación de la genética molecular es también de suma importancia. La presente invención ha elegido la técnica cebador específico de secuencia-PCR. Los sistemas PCR-SSP presentan múltiples y pequeños volúmenes de reacción PCR en los que cada reacción es específica para un polimorfismo de un solo nucleótido. La especificidad de PCR-SSP deriva de complementar el nucleótido del extremo 3' de los cebadores con la secuencia de ADN objetivo. La Taq polimerasa puede extender los cebadores 3'-complementados pero no los cebadores 3'-no complementados, por lo que únicamente el ADN objetivo complementario a ambos cebadores se amplifica eficientemente. El PCR-SSP funciona porque la Taq polimerasa carece de actividad exonucleolítica de 3' a 5'. Por ello, la no-complementariedad de 3' se puede utilizar para identificar virtualmente cualquier simple punto de mutación dentro de una o dos reacciones PCR-SSP. Esta técnica también ha sido escogida porque presenta importantes ventajas con respecto a otras técnicas de genética molecular: es fácil de realizar con el mínimo gasto técnico, y la detección post-amplificación es mínima. Además, el sistema se puede adaptar fácilmente a nuevos polimorfismos.

El método según la presente invención también tiene sus limitaciones: debido a la herencia maternal del ADNmt, las células que derivan de individuos maternalmente relacionados no pueden ser discriminadas entre sí. Además los eritrocitos maduros no contienen mitocondrias por lo que se tienen que excluir del análisis.

Claims

1. Método para el diagnóstico no-invasivo de trasplantes y transfusiones caracterizado por

a): extracción de ADN mitocondrial (ADNmt) no celular circulante de una muestra de fluidos corporales no celulares procedente del receptor del trasplante o transfusión;

b): detección, análisis y cuantificación del ADNmt de la muestra;

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección, el análisis y la cuantificación del ADNmt de la muestra del receptor se realizan mediante sondas Taqman, molecular beacons u otros medios para PCR en tiempo real, serie de genes, o densitometría SSCP.

3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el análisis de las regiones hipervariables HVR1, HVR2, HVR3 del ADNmt.

4. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido corporal no celular es orina, plasma o suero.