ES2275015T3 - Promotores especificos de tejido vascular. - Google Patents

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ES2275015T3 ES02784908T ES02784908T ES2275015T3 ES 2275015 T3 ES2275015 T3 ES 2275015T3 ES 02784908 T ES02784908 T ES 02784908T ES 02784908 T ES02784908 T ES 02784908T ES 2275015 T3 ES2275015 T3 ES 2275015T3
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Chun Ping Li
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que inicia la transcripción de una manera específica del tejido vascular, que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o el SEQ ID NO.: 2; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o el SEQ ID NO.: 2; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene identidad de al menos el 70% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o el SEQ ID NO.: 2 a lo largo de toda la longitud de dicho SEQ ID NO.: 1 o 2; o un complemento de la misma.

Description

Promotores específicos de tejido vascular.
Campo de la invención
La presente invención hace referencia al campo de la biología molecular, más concretamente a la regulación de la expresión génica en plantas.
Antecedentes de la invención
La expresión de secuencias de ADN heterólogas en un huésped vegetal depende de la presencia de un promotor conectado operablemente que es funcional en el huésped vegetal. La elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde el organismo expresa la secuencia de ADN heteróloga. De este modo, cuando se desea la expresión en un tejido preferido de una planta, se utilizan los promotores preferidos para el tejido. En contraste, cuando se desea la expresión génica en todas las células de una planta, los promotores constitutivos son el elemento regulador de elección. Se pueden incluir secuencias reguladoras adicionales aguas arriba y/o aguas abajo de la secuencia promotora núcleo en los constructos de expresión de los vectores de transformación para ocasionar niveles variables de expresión preferida para los tejidos o constitutiva de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica.
Frecuentemente es deseable tener la expresión preferente de una secuencia de ADN en un tejido del organismo. Por ejemplo, se podría lograr un aumento de la resistencia de una planta a un ataque por insectos mediante manipulación genética del genoma de la planta para que comprenda un promotor específico del tejido conectado operablemente a un gen insecticida heterólogo de manera que las sustancias que refrenen al insecto sean expresadas específicamente en los tejidos de la planta susceptible. La expresión preferente de la secuencia de nucleótidos heteróloga en el tejido apropiado reduce el agotamiento de los recursos de la planta que se produce cuando un promotor constitutivo inicia la transcripción de una secuencia de nucleótidos heteróloga en todas las células de la planta.
Alternativamente, podría ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN natural dentro de los tejidos de la planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, semejante inhibición podría ser completada con la transformación de la planta para que comprenda un promotor específico del tejido conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de manera que la expresión específica del tejido de la secuencia antisentido produzca un transcrito de ARN que interfiera en la traducción del ARNm de la secuencia de ADN natural en un subgrupo de células de la planta.
El tejido floemático transporta nutrientes, hormonas, y otras sustancias por los diversos órganos vegetales. Las células del parénquima del floema participan en la carga y descarga de sacarosa y otros nutrientes contenidos en el sistema de transporte del floema. El elevado contenido en nutrientes de la savia localizada en el tejido floemático hace que el floema sea la diana de una variedad de especies de insectos, incluyendo áfidos (familia Aphididae), barrenadores del maíz (familia Pyralidae), y saltadores de hojas (Cicadellidae) entre otros. El deterioro de las plantas resultante de la infestación por estos insectos se produce a través de múltiples mecanismos, incluyendo la pérdida de nutrientes y agua por los insectos, la introducción de partículas de virus en el tejido floemático tras las infestaciones, y la creación de tejido susceptible al ataque fúngico. Existe la necesidad de promotores preferidos por el tejido vascular conectados operablemente a secuencias de nucleótidos heterólogas que ayuden a proteger a la planta frente a patógenos tales como insectos, virus, hongos, nematodos, y similares.
Existe una necesidad adicional de una secuencia promotora específica del tejido vascular que sea conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga que modifique las características de carga del tejido vascular y de ese modo afecte al desarrollo y maduración de la planta, la distribución del carbono, y el rendimiento de las cosechas. Alterando los niveles de sustancias implicadas en la carga floemática, se puede influir en las características de carga del tejido vascular, el desarrollo de la planta y el crecimiento de la planta. Existe la necesidad de secuencias promotoras que puedan ser utilizadas para modular la expresión de las sustancias que regulan la carga del tejido vascular.
También puede haber una utilización para un promotor específico del tejido vascular en la mejora de la resistencia del tallo. Por ejemplo, por medio del engrosamiento de la pared celular tal como el depósito de más celulosa. Es deseable utilizar un promotor específico del tejido vascular para expresar genes que están implicados en la biosíntesis de la celulosa con el fin de incrementar la resistencia de la pared celular. Cuando la resistencia de la pared celular aumenta en el tallo del maíz, se espera una mejor verticalidad. Esto es particularmente relevante para mejorar la resistencia de la inserción en el tallo del maíz. Un ejemplo de semejante aplicación es el uso de un promotor específico del tejido vascular para conducir un gen de la celulosa sintasa que está implicado en la formación de la pared celular secundaria, tal como el gen irx3 de Arabidopsis thaliana (Taylor NG, Scheible WR, Cutler S, Somerville CR, Turner SR. 1999. The irregular xylem3 locus of Arabidopsis encodes a cellulose synthase required for secondary cell wall synthesis. Plant Cell 11:769-80). En este caso, las células que no tienen normalmente pared secundaria potencialmente aumentarían más el crecimiento de la pared celular, conduciendo así a una estructura celular más fuerte.
De este modo, el aislamiento y la caracterización de los promotores específicos del floema que pueden servir como regiones reguladoras de la expresión específica del tejido de secuencias de nucleótidos heterólogas de interés son necesarios para la manipulación genética de las plantas para mostrar rasgos fenotípicos específicos.
Compendio de la invención
Se proporcionan composiciones y métodos para regular la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta. Las composiciones comprenden secuencias promotoras novedosas que inician la transcripción de una manera específica del tejido vascular, concretamente una manera específica del tejido floemático. Específicamente se proporciona una región de inicio de la transcripción aislada a partir de un gen de Prunus serotina que codifica la prunasina hidrolasa. Las composiciones adicionales de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o SEQ ID NO.: 2. Las composiciones de la invención comprenden adicionalmente secuencias de nucleótidos, que comprenden al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o SEQ ID NO.: 2. Las composiciones de la invención comprenden adicionalmente secuencias de nucleótidos que tienen una identidad de al menos el 70% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o SEQ ID NO.: 2, sobre la longitud completa de dicho SEQ ID NO.: 1 o SEQ ID NO.: 2. Las composiciones de la invención comprenden adicionalmente secuencias de nucleótidos, que son complementos de una cualquiera de las secuencias mencionadas antes. La secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 2 representa una modificación de la secuencia de nucleótidos elaborada con fines de clonación. La secuencia del operón de la prunasina hidrolasa incluyendo la región promotora de la prunasina hidrolasa se muestra en el SEQ ID NO.: 3. Los nucleótidos 989-2626 del SEQ ID NO.: 3 codifican un polipéptido de la prunasina hidrolasa. El SEQ ID NO.: 4 es la secuencia de aminoácidos para el polipéptido prunasina hidrolasa. Los SEQ ID NOS: 5 y 6 son variaciones afines de la secuencia de polinucleótidos descrita como SEQ ID NO.: 1.
Las composiciones de la presente invención también incluyen un constructo de ADN que comprende una secuencia promotora de la invención conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés, donde el promotor es capaz de conducir la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal. También se proporcionan las células vegetales transformadas, y las semillas transformadas que comprenden las secuencias promotoras novedosas de la invención.
Se proporcionan los métodos para expresar una secuencia de nucleótidos de interés en una planta. Los métodos comprenden incorporar establemente al genoma de una planta una casete de expresión que comprende una secuencia promotora de la invención conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés, donde el promotor es capaz de iniciar la transcripción de la secuencia de nucleótidos en una célula vegetal. Los métodos proporcionan adicionalmente un medio para expresar específicamente una secuencia de nucleótidos en el tejido vascular, más concretamente en el tejido floemático.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa la secuencia de nucleótidos de la región promotora de la prunasina hidrolasa de Prunus serotina.
La Figura 2 es un alineamiento y un consenso de dos fragmentos genómicos SEQ ID NO.: 1 (PH DL1.4 PRO) y SEQ ID NO.: 5 (PH DL1.1 PRO), que destaca los patrones de la secuencia promotora y los motivos afines: caja TATA en la posición 793-796, señal CAAT en 659-662, motivo RGATAOS (R-GATA, factor de unión al motivo GATA, requerido para la expresión del gen específico del floema del Virus Baciliforme del Tungro del Arroz) sitio de unión en 259-267.
La Figura 3 es una tabla que muestra la expresión GUS en diversos tejidos en plantas de maíz transgénicas.
La Figura 4 es la expresión GUS en plantas de Maíz T0 que portan PHP17688. A. 10541640 nervadura central 60 días; B. 10541657 internodo 85 días, sección longitudinal (puntas de flecha para la expresión GUS a lo largo de un haz vascular); C. 10541665 internodo 85 días, sección transversal; D. 10541628 otros 60 días; E. 10541665 almendra 4 DAP; F. 10541647 almendra 8 DAP.
La Figura 5 demuestra la expresión GUS en plantas de Arabidopsis después de la transformación mediada por Agrobacterium.
Descripción detallada de la invención
Las composiciones de la invención son moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos novedosa para un promotor vegetal para el gen de Prunus serotina que codifica la prunasina hidrolasa. Esta secuencia promotora confiere expresión específica del tejido vascular, más concretamente expresión específica del floema, de una secuencia de nucleótidos conectada operablemente. En particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de ADN depositada en un huésped bacteriano como Consigna de Patente Núm. PTA-3235, o la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO.: 1, y las variantes y fragmentos de la misma. Esta secuencia promotora se aisló de la región no traducida 5' que limitaba con el sitio de inicio de la transcripción de un gen de P. serotina que codificaba la prunasina hidrolasa.
Un plásmido que contenía la secuencia promotora de P. serotina de la invención fue depositado en el Patent Depository de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, el 27 de Marzo de 2.001 y se le asignó el Núm. de Consigna de Patente PTA-3235. Los dos últimos nucleótidos de SEQ ID NO.:1, los nucleótidos 987 y 988, fueron alterados de C a T en la secuencia del plásmido depositado en la ATCC. Este depósito se mantendrá bajo los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patente. Esta consigna era meramente por conveniencia para los expertos en la técnica y no se admite que se requiera una consigna en 35 U.S.C. \NAK112.
La invención abarca composiciones de ácido nucleico aisladas o sustancialmente purificadas. Una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan o interaccionan con la molécula de ácido nucleico según se encuentra en el entorno natural. De este modo una molécula de ácido nucleico aislada o purificada, o una porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando es producida mediante mecanismos recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando es sintetizada químicamente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente secuencias codificadoras de proteínas) que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada contiene menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico.
Como "promotor" o "región de inicio de la transcripción" se quiere significar una región reguladora de ADN que comprende normalmente una caja TATA capaz de dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de transcripción apropiado para una secuencia codificadora concreta. Un promotor puede comprender adicionalmente otras secuencias de reconocimiento situadas generalmente aguas arriba o 5' con respecto a la caja TATA, referidas como elementos promotores aguas arriba, que influyen en la velocidad de inicio de la transcripción. Se admite que habiendo identificado las secuencias de nucleótidos para la región promotora descrita en la presente memoria, está dentro del estado de la técnica aislar e identificar adicionalmente elementos reguladores en la región no traducida 5' aguas arriba de la región promotora concreta identificada en la presente memoria. De este modo la región promotora descrita en la presente memoria comprende adicionalmente elementos reguladores aguas arriba que confieren una expresión específica del tejido, más concretamente una expresión específica del tejido floemático, aún más concretamente una expresión específica del parénquima floemático de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga conectada operablemente a la secuencia promotora descrita.
Las secuencias de nucleótidos para los promotores de la presente invención pueden ser secuencias de origen natural o cualquier secuencia que tenga una homología sustancial. Por "homología sustancial" se quiere significar una secuencia que muestra equivalencia funcional y estructural sustancial con la secuencia propia o de origen natural. Cualquier diferencia funcional o estructural entre secuencias homólogas no afecta a la capacidad de la secuencia para funcionar como promotor como se describe en la presente invención. De este modo, cualquier secuencia que tenga una homología de secuencia sustancial con la secuencia de un promotor concreto de la presente invención dirigirá la expresión de una secuencia de nueclótidos heteróloga conectada operablemente. Dos secuencias de nucleótidos promotoras se consideran sustancialmente homólogas cuando tienen al menos aproximadamente un 50%, 60%, hasta 70%, generalmente aproximadamente 80%, preferiblemente aproximadamente 85%, 90%, hasta un 98%.
Las secuencias promotoras aisladas de la presente invención se caracterizan por proporcionar una expresión específica de un tejido de una secuencia de nucleótidos de interés. El sistema vascular de las plantas comprende múltiples tejidos incluyendo el xilema y el floema. Los tejidos floemáticos comprenden numerosos tipos de células incluyendo elementos tamiz o miembros del tubo tamiz, las células acompañantes (en angiospermas), las células albuminosas (en gimnospermas), las células del parénquima floemático, y las fibras del floema. El promotor preferido de tejidos descrito aquí es capaz de activar específicamente la transcripción de una o más secuencias de ADN en el sistema vascular de las plantas, concretamente en el tejido floemático, más concretamente en las células del parénquima floemático. Una secuencia de nucleótidos conectada operablemente al promotor específico del floema descrito aquí da lugar a la expresión de la secuencia conectada operablemente a niveles que son superiores en tejidos vasculares, concretamente en tejido floemático, que en otros tejidos o que los que se encontrarían en el tejido vascular de la planta no transfor-
mada.
Los fragmentos y variantes de la secuencia de nucleótidos promotora descrita aquí también son abarcados por la presente invención. Por "fragmento" se quiere significar una porción de la secuencia de nucleótidos. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden conservar la actividad biológica y por tanto iniciar la transcripción de una secuencia de nucleótidos heteróloga. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia promotora que son útiles como sondas de hibridación generalmente no conservan su actividad biológica. De este modo, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden oscilar entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos completa de la invención.
De este modo, un fragmento de una secuencia de nucleótidos promotora puede codificar una porción biológicamente activa del promotor, o puede ser un fragmento que se puede utilizar como sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los métodos descritos más abajo. Una porción biológicamente activa de un promotor puede ser preparada aislando una porción de una de las secuencias promotoras de la invención y evaluando la actividad de la porción del promotor. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora comprenden al menos 50, 75, 100, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, o 988 nucleótidos para el SEQ ID NO.:1.
Los nucleótidos de semejantes fragmentos comprenden la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia promotora concreta o los elementos reguladores que confieren especificidad de tejido. Tales fragmentos se pueden obtener mediante el uso de enzimas de restricción para escindir la secuencia de nucleótidos promotora de origen natural descrita aquí; sintetizando una secuencia de nucleótidos a partir de la secuencia de origen natural de la secuencia de ADN promotora; o se pueden obtener por medio del uso de la tecnología de la PCR. Ver concretamente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York). Las variantes de estos fragmentos promotores, tales como aquellas resultantes de la mutagénesis dirigida al sitio, son abarcadas por las composiciones de la presente invención.
Por "variantes" se quieren significar secuencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos de origen natural las variantes como éstas se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación esbozadas más abajo. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, tales como las generadas, por ejemplo, utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótidos concreta de la invención tendrán al menos aproximadamente el 65%, 70%, generalmente al menos aproximadamente el 75%, 80%, 85%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 98%, 99% o más de identidad de secuencia con esa secuencia de nucleótidos concreta como se determina mediante programas de alineamiento de secuencia descritos en otra parte de la presente memoria utilizando parámetros por defecto. Las secuencias de nucleótidos variantes de la presente invención conservan la actividad biológica (es decir regulan la transcripción). Los métodos para analizar la regulación transcripcional son bien conocidos en la técnica. Los métodos de análisis incluyen transferencias Northern, RT-PCR, y el uso de secuencias informadoras tales como GUS.
Las secuencias de nucleótidos variantes también abarcan secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como el mezclado de ADN. Con semejante procedimiento, se pueden manipular una o más secuencias diferentes para crear un nuevo promotor que posee las propiedades deseadas. De esta manera, se generan genotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia afín que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y se pueden recombinar homólogamente in vitro o in vivo. Las estrategias para semejante mezclado de ADN son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.605.793 y 5.837.458.
La secuencia promotora de P. serotina de la invención puede ser utilizada para aislar las correspondientes secuencias de otros organismos, concretamente otras plantas, más concretamente otras plantas dicotiledóneas. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como la PCT, la hibridación, y similares para identificar tales secuencias basadas en su homología de secuencia con la secuencia mostrada en la presente memoria. Las secuencias aisladas basadas en su identidad de secuencia con la secuencia promotora completa mostrada en la presente memoria o con fragmentos de la misma son abarcadas por la presente invención. Una realización de la invención comprende una secuencia de nucleótidos asociada naturalmente y capaz de conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, teniendo dicho polipéptido una identidad de secuencia de al menos el 74%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la secuencia codificadora de la prunasina hidrolasa de P. serotina (Genbank Acc. Num. U50201).
En un enfoque de PCR, se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos para su uso en la PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir del ADNc o del ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar los cebadores de la PCR y la clonación por PCR son generalmente conocidos en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los métodos de PCR conocidos incluyen, pero no están limitados a, métodos que utilizan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente emparejados erróneamente, y similares.
En las técnicas de hibridación, se utiliza toda o parte de una secuencia de nucleótidos conocida como sonda que hibrida selectivamente con otras secuencias de nucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ADNc (es decir, (genotecas genómicas o de ADNc) de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable tal como P^{32}, o cualquier otro marcador detectable. De este modo, por ejemplo, se pueden elaborar sondas para la hibridación marcando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de la invención. Los métodos para la preparación de las sondas para la hibridación y para la construcción de genotecas de ADNc y genómicas son conocidos generalmente en la técnica y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
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Por ejemplo, la secuencia promotora completa descrita en la presente memoria, o una o más porciones de la misma, se pueden utilizar como sonda capaz de hibridar específicamente con las correspondientes secuencias promotoras. Para lograr la hibridación específica en una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias promotoras y tienen preferiblemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, y muy preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas pueden ser utilizadas para amplificar las correspondientes secuencias promotoras a partir de una planta seleccionada mediante PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias promotoras adicionales a partir de una planta deseada o como análisis de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias promotoras en una planta. Las técnicas de hibridación incluyen el rastreo por hibridación de genotecas de ADN cultivado en placa (placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo en condiciones restrictivas. Por "condiciones restrictivas" o "condiciones de hibridación restrictivas" se quiere significar condiciones en las cuales una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (v.g., al menos dos veces sobre el fondo). Las condiciones restrictivas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Controlando la restricción de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar las secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda (sondeo de homólogos). Alternativamente, las condiciones restrictivas se pueden ajustar para permitir cierto emparejamiento erróneo en las secuencias de manera que se detecten grados de similitud más bajos (sondeo de heterólogos). Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1.000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.
Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es una concentración de ión Na menor de aproximadamente 1,5 M, típicamente una concentración de ión Na de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (v.g., 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (v.g., más de aproximadamente 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones poco restrictivas ejemplares incluyen hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35%, NaCl 1M, SDS al 1% (dodecilsulfato de sodio) a 37ºC, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55°C. Las condiciones de restricción moderada ejemplares incluyen hibridación en formamida del 40 al 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,5X a 1X SSC de 55 a 60°C. Las condiciones muy restrictivas ejemplares incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y lavado en 0,1 X SSC de 60 a 65°C. Opcionalmente, los tampones de lavado pueden comprender SDS de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 1%. La duración de la hibridación es generalmente menor de aproximadamente 24 horas, normalmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas.
La especificidad es típicamente función de los lavados de post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la T_{f} puede ser aproximada a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: T_{f} = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T_{f} es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidas) a la cual el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La T_{f} se reduce en aproximadamente 1ºC por cada 1% de emparejamiento erróneo; de este modo, la T_{f}, la hibridación, y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para que hibriden con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se desean secuencias con una identidad \geq90%, la T_{f} se puede hacer disminuir 10ºC. Generalmente, se seleccionan las condiciones restrictivas para que sean aproximadamente 5ºC más bajas que el punto de fusión térmico (T_{f}) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. No obstante, en las condiciones severamente restrictivas se pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4°C más bajo que el punto de fusión térmica (T_{f}); en las condiciones moderadamente restrictivas se pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C más bajo que el punto de fusión térmico (T_{f}); en las condiciones poco restrictivas se pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C más bajo que el punto de fusión térmico (T_{f}). Utilizando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y una T_{f} deseada, los expertos normales en la técnica comprenderán que las variaciones en la restricción de la hibridación y/o las soluciones de lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado de emparejamiento erróneo da lugar a una T_{f} de menos de 45ºC (solución acuosa) o 32ºC (solución en formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que se puede utilizar una temperatura más elevada. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
De este modo, las secuencias aisladas que tienen actividad promotora y que hibridan en condiciones restrictivas con la secuencia promotora descrita en la presente memoria, o con los fragmentos de la misma, están abarcados por la presente invención. Tales secuencias serán homólogas al menos aproximadamente en un 40% a un 50%, aproximadamente homólogas en un 60%, 65%, o 70%, e incluso homólogas al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con la secuencia descrita. Esto es, la identidad de secuencia de las secuencias puede oscilar, compartiendo al menos aproximadamente de un 40% a un 50%, aproximadamente un 60%, 65%, o 70%, e incluso al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de la secuencia.
Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia ", y (e) "identidad sustancial".
(a) Según se utiliza en la presente memoria, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para la comparación de la secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subgrupo o la totalidad de una secuencia especificada, por ejemplo, en forma de un segmento de una secuencia de ADNc o génica completa, o de la secuencia de ADNc o génica completa.
(b) Según se utiliza en la presente memoria, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos contiguos, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100, o más. Los expertos en la técnica comprenden que para evitar una elevada similitud con una secuencia de referencia debida a la inclusión de huecos en la secuencia de polinucleótidos, se introduce típicamente una penalización de hueco y se resta del número de emparejamientos.
Los métodos de alineamiento de las secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. De este modo, la determinación del porcentaje de identidad de las secuencias entre dos secuencias cualesquiera puede ser completada utilizando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de homología local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda para la similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado por Karlin y Altschul (1993) en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.
Las implementaciones de estos algoritmos matemáticos por ordenador pueden ser utilizadas para determinar la identidad de la secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a; CLUSTAL en el programa PC/Gene (asequible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Version 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (asequible de Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Los alineamientos en los que se utilizan estos programas pueden ser realizados utilizando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; y Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN está basado en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Se pueden utilizar una tabla de restos por pesos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos mediante BLAST con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Se pueden realizar búsquedas de proteínas mediante BLAST con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de la palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineamientos espaciados con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como describen Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede utilizar, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para realizar una búsqueda iterada que detecte las relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (v.g., BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. El alineamiento también se puede realizar manualmente mediante inspección. A menos que se haga constar de otro modo, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados aquí hacen referencia al valor obtenido utilizando la versión GAP 10 en la que se utilizan los siguientes parámetros: % de identidad utilizando GAP Weight de 50 y Length Weight de 3; % de similitud utilizando Gap Weight de 12 y Length Weight de 4, o cualquier programa equivalente. Por "programa equivalente" se quiere significar cualquier programa de comparación de secuencias que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genera un alineamiento que tiene idénticos emparejamientos de nucleótidos o aminoácidos e idéntico porcentaje de identidad de secuencia cuando se compara con el correspondiente alineamiento generado por el programa preferido. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de emparejamientos y minimiza el número de huecos. GAP considera todos los posibles alineamientos y posiciones de los huecos y crea el alineamiento con el número más grande de bases emparejadas y el más pequeño de huecos. Permite la provisión de una penalización de creación de huecos y una penalización de extensión del hueco en unidades de bases emparejadas. GAP debe suponer una ganancia del número de penalizaciones por creación de huecos de los emparejamientos para cada hueco que inserta. Si se selecciona una extensión del hueco mayor de cero, GAP debe, además de suponer una ganancia para cada hueco insertado de la longitud de las veces del hueco la penalización por extensión del hueco. Los valores de penalización de la creación de huecos por defecto y los valores de penalización de la extensión del hueco en la Versión 10 del Wisconsin Genetics Software Package para las secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalización de creación de huecos por defecto es 50 mientras la penalización de la extensión del hueco por defecto es 3. Las penalizaciones de creación de hueco y de extensión de hueco pueden ser expresadas como un entero seleccionado del grupo de enteros que constan de 0 a 200. De este modo, por ejemplo, las penalizaciones de creación de hueco y extensión de hueco pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o
mayores.
GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero no hay otro miembro que tenga una calidad mejor. GAP presenta cuatro cifras dignas de consideración para los alineamientos: Calidad, Razón, Identidad, y Similitud. La Calidad es la medida maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Razón es la calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente se emparejan. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están más allá de los huecos se ignoran. Una similitud se puntúa cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de similitud. La segunda matriz utilizada en la Versión 10 del Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
(c) Según se utiliza en la presente memoria, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptidos hace referencia a los restos de las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para la máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de la secuencia de identidad se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticos a menudo difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas, en las que los restos aminoácido son sustituidos por otros restos aminoácido con propiedades químicas similares (v.g., carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de la secuencia puede ser ajustado al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en tales sustituciones conservativas tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente esto implica puntuar una sustitución conservativa como un parcial en lugar de un emparejamiento erróneo completo, incrementando de ese modo el porcentaje de identidad de la secuencia. De este modo, por ejemplo, cuando se da una puntuación de 1 a un aminoácido idéntico y se da una puntuación de cero a una sustitución no conservativa, se da una puntuación entre cero y 1 a una sustitución conservativa. La puntuación de las sustituciones conservativas se calcula, v.g., como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
(d) Según se utiliza en la presente memoria, "porcentaje de identidad de secuencia" representa el valor determinado comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales aparece la base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias para producir el numero de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de la secuencia.
(e) El término "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencia del 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90% y muy preferiblemente al menos el 95%, en comparación con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineamiento descritos empleando parámetros normalizados. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en consideración la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para estos fines normalmente representa una identidad de secuencia de al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 70%, 80%, 90%, y muy preferiblemente al menos el 95%.
Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas. Generalmente, se seleccionan las condiciones restrictivas para que sean aproximadamente 5ºC menores que el punto de fusión térmica (T_{f}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. No obstante, las condiciones restrictivas abarcan temperaturas en el intervalo de aproximadamente 1ºC a aproximadamente 20ºC menores que T_{f}, dependiendo del grado de restricción deseado como se estudia por otra parte en la presente memoria. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones restrictivas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, v.g., cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida en el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas se produce cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reacción cruzada inmunológica con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.
La secuencia promotora descrita en la presente invención, así como las variantes y fragmentos de la misma, es útil en la manipulación genética de cualquier planta cuando se ensambla dentro de un constructo de ADN de manera que la secuencia promotora está conectada operablemente con una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. La casete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' conectadas operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga. Por "conectado operablemente" se quiere significar una conexión funcional entre una secuencia promotora de la invención y una segunda secuencia, donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, conectado operablemente significa que las secuencias de ácido nucleico que están siendo conectadas son contiguas y, cuando es necesario reunir dos regiones codificadoras de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. De esta manera, la secuencia de nucleótidos promotora es proporcionada en casetes de expresión junto con secuencias de nucleótidos heterólogas para la expresión en una planta de interés. Semejante casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de nucleótidos heteróloga que va a estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras que comprenden la secuencia promotora de la invención. La casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que va a ser transformado simultáneamente en el organismo. Alternativamente, el gen o los genes adicionales pueden ser proporcionados en múltiples casetes de expresión.
La casete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables. Generalmente, la casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como los que codifican la neomicin-fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina-fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato amonio, bromoxinil, imidazolinonas, y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. No se pretende que la lista anterior de genes marcadores seleccionables sea limitante. En la presente invención se puede utilizar cualquier gen marcador seleccionable.
La casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una secuencia promotora de la invención, una región de inicio de la traducción, una secuencia de nucleótidos heteróloga, y una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. La secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser natural o análoga o foránea o heteróloga para la planta huésped. Adicionalmente, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Por "foránea" se quiere significar que la región de inicio transcripcional no se encuentra en la planta nativa en la cual se introduce la región de inicio transcripcional. Según se utiliza en la presente memoria, un gen quimérico comprende una secuencia promotora conectada operablememte a una secuencia codificadora que es heteróloga para la secuencia promotora.
La región de terminación puede ser la natural con la secuencia promotora de la invención, puede ser la natural con la secuencia de nucleótidos heteróloga conectada operablemente, o puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes son asequibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Ver también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Al preparar la casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden ser manipulados, con el fin de proporcionar secuencias de ADN en la orientación apropiada, en el marco de lectura apropiado. A este fin, se pueden emplear adaptadores o conectores para reunir los fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de los sitios de restricción o similares. Para este propósito, pueden estar implicados la mutagénesis in vitro, la reparación de cebadores, la restricción, la hibridación, las re-sustituciones, v.g., transiciones y transversiones.
Cuando resulta apropiado, las secuencias de nucleótidos heterólogas pueden ser optimizadas para un aumento de la expresión en la planta transformada. Esto es, los genes pueden ser sintetizados utilizando codones preferidos por las plantas para una mejora de la expresión. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para un estudio del uso del codón preferido por el huésped. Se encuentran disponibles en la técnica métodos para sintetizar genes preferidos por las plantas. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.380.831, y 5.436.391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.
Se conocen modificaciones de la secuencia adicionales que intensifican la expresión génica en un huésped celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales del sitio de empalme exón-intrón, repeticiones de tipo transposón, y otras secuencias semejantes bien caracterizadas que pueden ser deletéreas para la expresión génica. El contenido en G-C de la secuencia puede ser ajustado a niveles medios para un huésped celular dado, como se calcula mediante la referencia a genes conocidos en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de ARNm secundarias en horquilla.
Las casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5' en el constructo de la casete de expresión o el vector de expresión. Tales secuencias líder pueden actuar para intensificar la traducción. Los líderes de la traducción son conocidos en la técnica e incluyen: lideres de picornavirus, por ejemplo el líder de EMCV (región no codificadora 5' de la Encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes de potivirus, por ejemplo líder de TEV (Virus del Grabado del Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), el líder de MDMV (Virus del Mosaico Enano del Tabaco) (Virology 154:9-20), y proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); el líder no traducido del ARNm de la proteína de la envuelta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); el líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); y el líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Se pueden utilizar otros métodos conocidos por intensificar la traducción, por ejemplo, intrones y similares.
Se reconoce que las secuencias promotoras de la invención pueden ser utilizadas para iniciar la transcripción de construcciones antisentido, complementarias al menos a una porción del ARN mensajero (ARNm) para la secuencia de nucleótidos de un gen de interés. Los nucleótidos antisentido se construyen para hibridar con el ARNm correspondiente. Se pueden elaborar modificaciones de las secuencias antisentido con tal que las secuencias hibriden con el correspondiente ARNm e interfieran en su expresión. De esta manera, se pueden usar construcciones antisentido que tienen una similitud de secuencia del 70%, preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 85% con las correspondientes secuencias antisentido. Además, se pueden utilizar porciones de los nucleótidos antisentido para desorganizar la expresión de los genes diana. Generalmente, se pueden utilizar secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, o más.
Las secuencias promotoras de la presente invención también se pueden utilizar para iniciar la transcripción de una secuencia de nucleótidos en la orientación efectora para suprimir la expresión de genes endógenos en plantas. Los métodos para suprimir la expresión génica en plantas utilizando secuencias de nucleótidos en la orientación efectora son conocidos en la técnica. Los métodos implican generalmente transformar las plantas con un constructo de ADN que comprende un promotor que conduce la expresión en una planta conectado operablemente con al menos una porción de una secuencia de nucleótidos que corresponde al transcrito del gen endógeno. Típicamente, semejante secuencia de nucleótidos tiene una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcrito del gen endógeno, preferiblemente una identidad de secuencia mayor de aproximadamente el 65%, más preferiblemente una identidad de secuencia mayor de aproximadamente el 85%, muy preferiblemente una identidad de secuencia mayor de aproximadamente el 95%. Ver las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.283.184 y 5.034.323.
Las secuencias promotoras de la presente invención son útiles en la expresión preferida del tejido de una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. Por "secuencia de nucleótidos heteróloga" se quiere significar una secuencia que no es de origen natural con la secuencia promotora. Si bien esta secuencia de nucleótidos es heteróloga con respecto a la secuencia promotora, puede ser homóloga o natural o heteróloga o foránea para la planta huésped. La secuencia de nucleótidos heteróloga conectada operablemente a uno de los promotores descritos en la presente memoria puede codificar un polipéptido de interés. Los ejemplos de tales genes heterólogos incluyen, pero no están limitados a, secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos que confieren resistencia al estrés abiótico tal como sequía, temperatura, salinidad, ozono, y toxinas tales como plaguicidas y herbicidas, o estrés biótico, tal como ataques por patógenos inclu-
yendo insectos, virus, bacterias, hongos, y nematodos, y el desarrollo de enfermedades asociadas con estos organismos.
Las secuencias de nucleótidos promotoras y los métodos descritos en la presente memoria son útiles en la regulación de la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta huésped con el fin de variar el fenotipo de una planta. Son interesantes diversos cambios en el fenotipo incluyendo la modificación de la composición de ácidos grasos en una planta, la alteración del contenido de aminoácidos de una planta, la alteración del mecanismo de defensa frente a patógenos de una planta, la alteración de la entrada y la salida de sustancias en el tejido vascular, y similares. Estos resultados se pueden lograr proporcionando la expresión de productos heterólogos o la expresión incrementada de productos endógenos en las plantas. Alternativamente, los resultados se pueden lograr proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, concretamente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios dan lugar a un cambio en el fenotipo de la planta transformada.
En una realización de la presente invención, las secuencias promotoras descritas en la presente memoria están conectadas operablemente a secuencias de nucleótidos heterólogas que modifican las características de carga del tejido vascular y de ese modo afectan al desarrollo y la maduración de la planta, la distribución del carbono, y el rendimiento de las cosechas. El floema transporta sustancias por todo el organismo vegetal. Los materiales transportados en el floema incluyen pero no están limitados a, carbohidratos, aminoácidos, péptidos, fosfato inorgánico y patógenos invasores. Estas sustancias transportadas por el floema deben ser cargadas o importadas al floema, y numerosos genes regulan la carga del floema. Por "carga del tejido vascular" se quiere significar carga y descarga de nutrientes tales como hormonas, polipéptidos, o carbohidratos en las células del sistema de transporte vascular de la planta. Alterando los niveles de sustancias implicadas en la carga floemática, se puede influir en las características de carga del tejido vascular, el desarrollo de la planta y el crecimiento de la planta. Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden utilizar para modular la expresión de las sustancias que regulan la carga del tejido vascular.
Las sustancias que regulan la carga vascular incluyen, pero no están limitadas a, transportadores de sacarosa codificados por SUT1 (Núms. de Acceso Genbank AF280050, AJ272309, AF167417, AF191025, AF191024, AF109922, X82275, AJ224961, X83850, X69165), SUT2 (Núms. de Acceso Genbank Y16768, AF166498, AJ272308) y SUT4 (Núms. de Acceso Genbank AF176950, AF175322, AF237780); sacarosa sintasas codificadas por ASUS1 (Núm. de Acceso Genbank X70990), SUC1 (Núm. de Acceso Genbank X75365), SUC2 (Núms. de Acceso Genbank X75764, X79702), SUS1 (Núm. de Acceso Genbank L29418), Shrunken1 (Núm. de Acceso Genbank J01241), SS1 (Núm. de Acceso Genbank AJ001117) y SS2 (Marana et al. (1988) Gene 63:253-260); transportadores de aminoácidos codificados por NaAAP1 (Núm. de Acceso Genbank AF080542); transportadores peptídicos codificados por NaNTR1 (Schultz, et al. (1999) Plant J. 6:637-646), galactinol sintasas (Núms. de Acceso Genbank AF249912, AJ237693, AJ237694), pirofosfatos inorgánicos (Núm. de Acceso Genbank AJ252210), proteínas del canal del K+ codificadas por AKT3 (Núm. de Acceso Genbank U44745), ATPasas H+ codificadas por AHA1 (Núm. de Acceso Genbank AJ002020), AHA2 (Harper et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:13601-13608), AHA3 (DeWitt et al. (1991) Plant J 1:121-128), y pma4 (Gianinazzi-Pearson et al. (2000) Planta 211:609-613 y Núm. de Acceso Genbank X66737), aminoácido permeasas (Núm. de Acceso Genbank X71787), reguladores de carbohidratos floemáticos codificados por pgm (Núm. de Acceso Genbank AF216580) y sex1 (Núm. de Acceso Genbank AF312027), y genes de fructosiltransferasas (v.g Núm. de Acceso Genbank AJ250634).
En otra realización de la invención, las secuencias promotoras descritas en la presente memoria pueden estar conectadas operablemente a secuencias de nucleótidos heterólogas útiles en la protección de plantas frente a patógenos, comprendiendo dichos patógenos insectos, virus, hongos, nematodos, y similares. Muchos patógenos viajan a través del tejido vascular para propagar la enfermedad por toda la planta. Los insectos chupadores de savia de las plantas transfieren virus, hongos y nematodos desde las plantas infectadas a las plantas sanas. La invención permite la expresión específica del tejido vascular, más específicamente específica del tejido floemático de genes que confieren actividad antipatogénica. Por "composiciones anti-patogénicas" se quiere significar que las composiciones de la invención son capaces de suprimir, controlar, y/o eliminar el organismo patógenico invasor. Una composición anti-patogénica de la invención reducirá los síntomas de la enfermedad resultantes de la sensibilización con el patógeno de al menos aproximadamente un 5% a aproximadamente un 50%, de al menos aproximadamente un 10% a aproximadamente un 60%, de al menos aproximadamente un 30% a aproximadamente un 70%, de al menos aproximadamente un 40% a aproximadamente un 40% a aproximadamente un 80%, o de al menos aproximadamente un 50% a aproximadamente un 90% o más. Por tanto, los métodos de la invención pueden ser utilizados para proteger las plantas de enfermedades, concretamente de aquellas enfermedades que están causadas por patógenos de las plantas.
Los análisis que miden la actividad anti-patogénica son conocidos comúnmente en la técnica, como lo son los métodos para cuantificar la resistencia a una enfermedad en plantas tras la infección por patógenos. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.614.395. Tales técnicas incluyen, medir con el tiempo, el diámetro medio de la lesión, la biomasa de patógeno, y el porcentaje global de tejidos de la planta deteriorados. Por ejemplo, una planta que expresa un polipéptido anti-patogénico o que tiene una composición anti-patogénica aplicada a su superficie muestra una disminución en la necrosis de los tejidos (es decir, el diámetro de la lesión) o una disminución en la muerte de las plantas tras la sensibilización con el patógeno cuando se compara con una planta de control que no se había expuesto a la composición anti-patogénica. Alternativamente, se puede medir la actividad anti-patogénica por la disminución de biomasa de patógeno. Por ejemplo, una planta que expresa un polipéptido anti-patogénico o está expuesta a una composición anti-patogénica es sensibilizada con un patógeno de interés. Con el tiempo, se obtienen las muestras de tejido de los tejidos inoculados con el patógeno y se extrae el ARN. El porcentaje de un transcrito de ARN del patógeno específico en relación con el nivel de transcrito específico de la planta permite determinar el nivel de biomasa de patógeno. Ver, por ejemplo, Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15107-15111.
Además, los análisis antipatogénicos in vitro incluyen, por ejemplo, la adición de concentraciones variables de la composición antipatogénica a discos de papel y la colocación de los discos sobre agar conteniendo una suspensión del patógeno de interés. Tras la incubación, se desarrollan zonas de inhibición evidente alrededor de los discos que contienen una concentración eficaz del polipéptido antipatogénico (Liu et al. (1994) Plant Biology 91:1888-1892). Adicionalmente, se puede utilizar el análisis microespectrofotométrico para medir las propiedades antipatogénicas in vitro de una composición (Hu et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:949-959 y Cammue et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2228-2233).
Los genes que codifican los rasgos de resistencia a una enfermedad incluyen, pero no están limitados a, genes de destoxificación, tales como los genes de la fumonosina (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.792.931); la avirulencia (avr) y la resistencia a la enfermedad (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; y Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); y similares.
Por "resistencia a insectos" se quiere significar que las plantas evitan los síntomas y la lesión que son la consecuencia de las interacciones planta-insecto. Esto es, se evita que los insectos ocasionen una lesión en la planta, lesiones en los cultivos, desfiguración de la planta, y enfermedad de la planta, o alternativamente, la lesión de la planta, la lesión del cultivo, la desfiguración de la planta, y la enfermedad de la planta ocasionadas por el insecto son minimizadas o reducidas. Los genes de resistencia a insectos de interés incluyen proteínas toxinas de Bacillus, muchas de las cuales son conocidas en la técnica.
Las secuencias de nucleótidos heterólogas de interés concreto incluyen secuencias que confieren una resistencia a la enfermedad intensificada para una variedad de plagas de plantas incluyendo insectos con piezas bucales perforadoras y chupadoras que se alimentan de savia. Por ejemplo, los insectos del orden Homóptera, a menudo referidos como un suborden separado del orden Hemiptera, incluyen aquellos insectos conocidos como chinches de plantas. Estas plagas incluyen los áfidos [familia Aphididae], las moscas blancas [Aleyrodidae], saltadores de plantas [Delphacidae], saltadores de hojas [Cicadellidae], piojos saltadores de plantas [Psyllidae] pulgones lanígeros [Pemphigidae], chinches harinosas [Pseudococcidae], y cochinillas [Coccidae, Diaspididae, Asterolecaniidae, y Margarodidae]. Muchas especies son graves plagas de los cultivos agrícolas y hortícolas y de las plantas ornamentales, incluyendo, por ejemplo pulgón del guisante, pulgón de la judía negra; Aphis gossypii, pulgón del algodón; pulgón verde del manzano, pulgón de la patata, pulgón verde del ciruelo, pulgón del banano; Brevicoryne brassicae, pulgón de la col; pulgón del nabo, pulgón verde del melocotonero de la patata, pulgón de la hoja del maíz, pulgón del trigo, mosca blanca de las brassica, mosca blanca del tabaco, mosca blanca de los invernaderos, mosca negra de los cítricos, saltador de plantas pardo pequeño, saltador de plantas pardo del arroz, saltador de plantas de la caña de azúcar, saltador de plantas de dorso blanco, saltador de hojas verde del arroz, saltador de hojas de la remolacha, chicharrita del algodón, saltador de hojas del arroz con alas en zig zag, chupador del manzano, chupador del peral, pulgón lanígero del manzano, pulgón lanígero de la raíz de la lechuga, filoxera de la uva, piojo harinoso de cola larga, chinche harinoso de la piña, piojo harinoso rayado, piojo harinoso rosado de la caña de azúcar, queresa algodonosa, cochinilla del olivo, cochinilla coma, piojo de San José, cochinilla roja australiana, cochinilla negra circular y queresa del coco.
También tienen interés los genes de resistencia a los insectos que codifican resistencia frente a las fases masticadoras de plantas de los insectos pertenecientes a los órdenes Coleoptera, Lepidoptera y Ortoptera, incluyendo pero no limitados a: Acanthoscelides obtectus; Bruchus sp.; Callosobruchus sp. [escarabajos brúcidos]; Agriotes sp. [gusanos grasientos] concretamente Agrotis ipsilon, gusano cortador grasiento; Amphimallon sp. [escarabajos de San Juan]; Anthonomus grandis grandis, picudo algodonero; Ceutorhynchus assimilis, gorgojo de la semilla de la col; Cylas sp. [gorgojos de la batata]; Diabrotica sp. [gusano del maíz] concretamente Diabrotica virgifera, gusano del maíz oriental, Diabrotica longicornis barberi, gusano del maíz del norte, Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano del maíz del sur; Epicauta sp. [bicho moro]; Epilachna sp. [mariquitas etc.] concretamente Epilachna varivestis, conchuela del frijol; Leptinotarsa decemlineata, escarabajo de la patata; Meligisthes sp. [escarabajos de las flores]; Melolontha sp. [cochorros]; Phyleotreta sp.; Psylliodes sp. [pulguillas]; Popillia japonica, escarabajo Japonés; Scolytus sp. [escarabajos de la corteza]; Sitophilus sp. [gorgojos de los cereales] concretamente Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Tenebrio molitor [gorgojo amarillo de la harina]; Tribolium sp. [gorgojos de la harina]; Trogoderma granarium, escarabajo Khapra; Acleris sp. [tortrícidos de los frutales]; Acraea acerata, mariposa de la batata; Agrotis sp. [gusanos cortadores] concretamente Agrotis orthogonia, gusano cortador del oeste; Autographa gamma, plusias; Chilo sp. [barrenadores del tallo] concretamente Chilo partellus, barrenador del sorgo; Cydia pomonella, polilla del manzano; Diparopsis sp. [lagartas rojas]; Ephestia sp. [polilla doméstica]; Heliothis sp. concretamente Heliothis virescens, gusano de la cápsula; Helicoverpa sp. [gusanos, lagartas] concretamente Helicoverpa zea, bellotero del algodón; Mamestra brassicae, polilla de la col; Manduca sp. [gusanos del cuerno], Maruca testulalis, barreno de la vaina; Mythimna sp. [polilleros]; Ostrinia nubilalis, barreno del maíz europeo; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Phthorimaea operculella, polilla del tubérculo de la patata; Pieris brassicae, blanca de la col; Pieris rapae, blanquita de la col; Plodia interpunctella, polilla de la fruta seca; Plutella xylostella, polilla dorso de diamante; Sitatroga cerealella, polilla de los cereales; Spodoptera sp. [esciaras] concretamente Spodoptera frugiperda, gusano cogollero o gusano ejotero y Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Trichoplusia ni, gusano falso medidor de la col; Acheta sp. [grillos de campo]; Gryllotalph sp. [grillos topo]; Locusta migratoria, langosta migradora; y Schistocerca gregaria, langosta del desierto.
Además, la secuencia promotora de la invención permite la expresión preferida del tejido vascular de genes de resistencia a insectos que codifican la resistencia a plagas de insectos seleccionadas del orden Diptera, Himenoptera, Malofaga, Tisanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Sifonaptera, Tricoptera, etc. Las plagas de insectos para los cultivos principales incluyen: Maíz: Diatraea grandiosella, barreno del maíz del suroeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Diatraea saccharalis, barreno de la caña de azúcar; Melanotus spp., gusanos alambre; Cyclocephala borealis, escarabajo rubio norteño (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, escarabajo rubio sureño (gusano blanco); Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón de la hoja del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Hylemya platura, mosca de la semilla; Agromyza parvicornis, minador de las hojas del maíz; Anaphothrips obscrurus, trips de la hierba; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Sorgo: Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Feltia subterranea, cortador pequeño; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos alambre; Oulema melanopus, escarabajo del cereal; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón e la hoja de maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Contarinia sorghicola, mosquita del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro araña carmín; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Trigo: Pseudaletia unipunctata, esciara; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Oulema melanopus, escarabajo del cereal; Hypera punctata, picudo de la hoja del trébol; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Macrosiphum avenae, pulgón de la espiga; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio; Mayetiola destructor, mosquito del trigo; Sitodiplosis mosellana, mosquito rojo del trigo; Meromyza americana, oruga desgranadora del trigo; Hylemya coarctata, mosca del bulbo del trigo; Frankliniella fusca, trips del tabaco; Cephus cinctus, avispa del tallo del trigo; Aceria tulipae, ácaro púrpura; Girasol: Suleima helianthana, polilla de la yema del girasol; Homoeosoma electellum, polilla del girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquito de la semilla del girasol;
Algodón: Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltona; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca bandeada; Lygus lineolaris, chinche ligus; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña color carmín; Tetranychus urticae, arañuela roja; Rice: Diatraea saccharalis, barreno de la caña de azúcar; Colaspis brunnea, colaspis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, gorgojo acúatico del arroz; Nephotettix nigropictus, saltador de hojas del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Soja: Pseudoplusia includens, cuncunilla verde de la alfalfa; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Myzus persicae, pulgón verde del melocotonero; Empoasca fabae, chicharrita, Acrosternum hilare, chinche verde hedionda; Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas, Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial; Hylemya platura, mosca de la semilla; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, araña roja; Tetranychus urticae, ácaro araña de dos manchas; Cebada: Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Acrostemum hilare, chinche verde hedionda; Euschistus servus, chinche parda hedionda; Delia platura, mosca de la semilla; Mayetiola destructor, mosquito del trigo; Petrobia latens, arañuela del trigo; Aceite de Colza: Phyllotreta cruciferae, Pulguilla; Mamestra configurata, Gusano soldado; Delia ssp., Insectos de tierra.
Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos que confieren una resistencia incrementada a los insectos son conocidas en la técnica. Por ejemplo, tales secuencias incluyen, pero no están limitadas a, secuencias que codifican proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; 6.110.464; 6.033.874; 6.015.891; 5.942.664; 5.914.318; 5.567.600; 5.567.862;
5.723.440; 6.153.814; 6.063.756; 5.854.053; 5.854.053; Geiser et al. (1986) Gene 48:109); las lectinas, donde la lectina comprende la lectina de Galanthus ("snowdrop"), lectina de guisante, lectina de Canavalia modificada, lectina de germen de trigo, lectina de patata, lectina de cacahuete o aglutinina de germen de trigo, aprotinina, y lectina de Hemandia moerenhoutiana (Zhou et al. (1998) Chin J. Biotechnol 14:9; Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.545.820; WO 9416565A1; y WO 00/44780); lipoxidasas, donde la lipoxidasa comprende lipoxidasa 1 de guisante o lipoxidasa de soja; quitinasas de insectos (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.866.788); polipéptidos insecticidas (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.824.864); y similares.
Las plagas chupadoras de savia transfieren virus desde la plantas infectadas a las plantas sanas. Semejantes virus incluyen virus baciliforme del tungro del arroz (Bhattacharyya-Pakrasi et al. (1993) Plant J. 4:71), virus del mosaico del tabaco (Cheng et al. (2000) Plant J, 3:349), virus del enanismo clorótico de la batata, y virus del moteado plumoso de la batata (Karyeija et al. (2000) Virology 269:26). La expresión específica del floema de una secuencia de nucleótidos heteróloga con actividad antipatogénica disminuye o minimiza el impacto de los patógenos virales.
Los patógenos adicionales de interés incluyen, pero no están limitados a, virus o virioides y hongos. Los virus incluyen cualquier virus de plantas, por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco o el pepino, del virus de la mancha anular, el virus de la necrosis, el virus del mosaico enano del maíz, etc. Los patógenos fúngicos y virales específicos para los principales cultivos incluyen: Soja: Phytophthora megasperma fsp. glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffusa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, Virus del mosaico de la soja, Glomerella glycines, Virus de la Mancha Anular del Tabaco, virus del Estriado del Tabaco, Phakopsora pachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Virus de la marchitez del tabaco, Heterodera glycines Fusarium solani; Canola: Albugo candida, Altemaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata; Alfalfa: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae; Trigo: Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recondita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Virus del Enanismo Amarillo de la Cebada, Virus del Mosaico del Bromo, Virus del Mosaico del Trigo con Origen en el Suelo, Virus del Mosaico Estriado del Trigo, Virus del Mosaico Estriado Ahusado del Trigo, Virus Estriado del Trigo Americano, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, Virus de los Altiplanos, virus estriado del trigo Europeo; Girasol: Plasmophora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum pv. carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis; Maíz: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis O, T (Cochliobolus heferostrophus), Helminthosporium carbonum I, II y III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II y III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Trichoderma viride, Virus del Mosaico Enano del Maíz A y B, Virus del Mosaico Estriado del Maíz, Virus del Enanismo Clorótico del Maíz, Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia carotovora, Espiroplasma del Achaparramiento del Maíz (Corn stunt spiroplasma), Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Sphacelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Cephalosporium acremonium, Virus del Moteado Clorótico del Maíz, Virus de los Altiplanos, Virus del Mosaico del Maíz, Virus del rayado Fino del Maíz, Virus Estriado del Maíz, Virus Bandeado del Maíz, Virus del Enanismo Rugoso del Maíz; Sorgo: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispore sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Mosaico H de la caña de azúcar, Virus del Mosaico Enanizante del Maíz A y B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola, etc.
Los nematodos incluyen nematodos parásitos tales como los nematodos de la pudrición de las raíces, los quistes, y las lesiones, incluyendo Heterodera y Globodera spp; concretamente Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodo de los quistes de la patata); Heterodera glycines (nematodo de los quistes de la soja); Heterodera schachfii (nematodo de los quistes de la remolacha); y Heterodera avenae (nematodo de los quistes del cereal).
Una realización adicional de la invención permite la expresión de rasgos de resistencia a herbicidas. Los rasgos de resistencia a herbicidas se pueden introducir en plantas por medio de genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (v.g., el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a semejante resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra). También tienen interés los genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintasa, tales como la fosfinotricina o basta (v.g., el gen bar), u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, y los mutantes del gen ALS codifican la resistencia al herbicida clorsulfurón.
Adicionalmente se reconoce que las secuencias de nucleótidos de interés utilizadas en la presente invención son secuencias de interés que son reflejo de los mercados comerciales y de los intereses comerciales de aquellos implicados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y los mercados de interés cambian, y a medida que las naciones en desarrollo abran mercados al mundo, también emergerán nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que el conocimiento de los autores de la presente invención de los rasgos y características agronómicas tales como el rendimiento y el aumento de heterosis aumentan, la elección de genes para la transformación cambiará de acuerdo con esto.
Las categorías generales de las secuencias de nucleótidos de interés incluyen por ejemplo, aquellos genes implicados en la información, tales como los dedos de cinc, aquellos implicados en la comunicación, tales como las quinasas, aquellos implicados en el mantenimiento, tales como las proteínas de choque térmico, y aquellos implicados en la carga del floema, tales como los transportadores. Las categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican importantes rasgos para la agronomía, la resistencia a insectos, la resistencia a enfermedades, la resistencia a herbicidas, las características de exudados, y los productos comerciales. Las secuencias de nucleótidos de interés incluyen generalmente, aquellas implicadas en el metabolismo del aceite, el almidón, los carbohidratos, o los nutrientes así como aquellas que afectan al tamaño de la almendra, la carga de sacarosa, el transporte de nutrientes y similares.
Los rasgos agronómicamente importantes tales como el contenido en aceite, almidón y proteína pueden ser alterados genéticamente utilizando los métodos de la presente invención. Las modificaciones incluyen incrementar el contenido en ácido oleico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales, y modificar el almidón. Las modificaciones de la proteína hordotionina se describen en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Núms. de Serie. 08/838.763, presentada el 10 de Abril, 1997; 08/824.379, presentada el 26 de Marzo, 1997; 08/824.382, presentada el 26 de Marzo, 1997; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.703.049. Otro ejemplo es la proteína de la semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina 2S de soja descrita en el Núm. de Serie de los Estados Unidos 08/618.911, presentada el 20 de Marzo, 1996, y el inhibidor de quimotripsina de cebada, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106.
Los derivados de las secuencias codificadoras pueden ser elaborados mediante mutagénesis dirigida al sitio para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido con elevado contenido de lisina de la cebada (BHL) deriva del inhibidor de quimotripsina de la cebada, Núm. de Serie de los Estados Unidos 08/740.682, presentada el 1 de Noviembre, 1996, y PCT/US97/20441. presentada el 31 de Octubre, 1997. Otras proteínas incluyen proteínas de plantas ricas en metionina tales como la de la semilla de girasol (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502)); maíz (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; y del arroz (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123. Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento de semillas, y factores de transcripción.
La calidad del cereal se refleja en rasgos tales como los niveles y tipos de aceites, saturados e insaturados, la cualidad y cantidad de aminoácidos esenciales, y los niveles de celulosa. En el maíz, las proteínas de hordotionina modificada, descritas en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Núms. de Serie 08/838.763, presentada el 10 de Abril, 1997; 08/824.379, presentada el 26 de Marzo, 1997; 08/824.382, presentada el 26 de Marzo, 1997; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.703.049 expedida el 30 de Diciembre, 1997, proporcionan descripciones de modificaciones de proteínas para los fines deseados.
Los rasgos comerciales también pueden estar codificados en un gen o genes que incrementan por ejemplo, el almidón para la producción de etanol, o proporcionan la expresión de las proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.602.321 expedida el 11 de Febrero, 1997. Los genes tales como la B-Cetotiolasa, PHBasa (polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (ver Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de los polihidroxialcanoatos (PHA). Una realización concreta de la invención abarca la expresión preferida del floema de dichos polímeros y bioplásticos para facilitar la recolección y la cosecha de estos productos a partir del exudado o la savia de la planta.
Los productos exógenos incluyen enzimas y productos de plantas así como aquellos de fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas, y similares. Se puede incrementar el nivel de proteínas, concretamente proteínas modificadas que tienen una distribución de los aminoácidos mejorada para mejorar el valor nutriente de la planta.
La casete de expresión que comprende la secuencia promotora de la presente invención conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos de interés puede ser utilizada para transformar cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitada a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de las especies de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maíz (Zea mays), Brassica sp. (v.g., B. napus, B. rapa, B. juncea), concretamente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (v.g., mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), mijo de cola de zorra (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), casava (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), te (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendro (Prunus amygdalus), remolachas azucareras (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avenas, cebada, hortalizas, ornamentales, y coníferas.
Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (v.g., Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), frijoles de lima (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), melón Cantaloupe (C. cantalupensis), y melón (C. melo). Los ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia común (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo.
Las coníferas que se pueden emplear en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino de incienso (Pinus taeda), el pino resinoso (Pinus elliotii), el pino ponderosa (Pinus ponderosa), el pino contorta (Pinus contorta), y el pino de Monterrey (Pinus radiata); el abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); la tsuga del Canadá (Tsuga canadensis); la picea blanca (Picea glauca); la sequoya (Sequoia sempervirens); los abetos verdaderos tales como el pinabeto del Pacífico (Abies amabilis) y el abeto balsámico (Abies balsamea); y los cedros tales como el cedro gigante (Thuja plicata) y el ciprés de Notka (Chamaecyparis nootkatensis). Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), más preferiblemente plantas de maíz y soja, aún más preferiblemente plantas de maíz.
Los protocolos de transformación así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en las plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, elegida como diana para la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias de nucleótidos en células vegetales y la posterior inserción en el genoma de la planta incluyen la microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), la electroporación (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, la transformación mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5,563,055; Zhao et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5,981,840), la transferencia génica directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y la aceleración de partículas balística (ver, por ejemplo, Sanford et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.945.050; Tomes et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.879.918; Tomes et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.886.244; Bidney et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlin); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926). Ver también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soybean); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.240.855; Buising et al., Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.322.783 y 5.324.646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.736.369 (cereales); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por "whisker"); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz vía Agrobacterium tumefaciens).
Las células que han sido transformadas se pueden hacer crecer en plantas según los medios convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden hacer crecer después, y se polinizan con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y se identifica el híbrido resultante que tiene la expresión de la característica fenotípica deseada. Se pueden hacer crecer dos o más generaciones para asegurarse de que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda establemente y después se cosechan las semillas para asegurarse de que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Experimentos Ejemplo 1 Aislamiento de Secuencias Promotoras
La región promotora del gen de Prunus serotina que codifica la prunasina hidrolasa se aisló de cerezos utilizando el GenomeWalker Kit™ (Clontech). La secuencia para el promotor de la prunasina hidrolasa se muestra en el SEQ ID NO.: 1. La secuencia para el operón de la prunasina hidrolasa que incluye la región promotora de la prunasina hidrolasa se muestra en el SEQ ID NO.: 3. Los nucleótidos 989-2626 del SEQ ID NO.: 3 codifican un polipéptido de la prunasina hidrolasa.
Se extrajo ADN genómico de hojas de Black Cherry (Prunus serotina) utilizando el "DNeasy Plant mini kit" (Qiagen Núm. Cat. 69104). Se siguió el protocolo como se describe (edición de Noviembre 1999). Después se crearon cinco genotecas GenomeWalker® a partir del ADN Genómico según el manual para el "Universal GenomeWalker™ Kit" (Clontech K1807-1). Se crearon utilizando enzimas de corte romo:
Genoteca Enzima
DL-1 EcoRV
DL-2 ScaI
DL-3 DraI
DL-4 PvuII
DL-5 StuI
Los cebadores específicos del gen (GSP1/SEQ ID NO.: 7 y GSP2/SEQ ID NO.:8) se diseñaron utilizando la secuencia conocida para la prunasina hidrolasa (Núm. de Acc. U50201).
Cebadores GenomeWalker® de la Prunasina Hidrolasa
GSP1/SEQ ID NO.: 7 5'-GTATCGAAATGGGTCCTGTTGAGAGT
GSP2/SEQ ID NO.: 8 5'-ATATGTCCCGGCAGCATTGGTATTTG
Después se llevaron a cabo amplificaciones según el manual del "Universal GenomeWalker™ Kit", utilizando el cebador GSP1 primer para la amplificación con GenomeWalker™ primaria y GSP2 para la amplificación secundaria. Se produjo una banda de 1,5 kb en la genoteca DL-1. Este fragmento se clonó en pGEMT-easy (Promega Núm. de Catálogo A1360) y se secuenció. Los resultados de la secuencia indicaban que estaban presentes dos productos diferentes en el producto clonado. Estos se denominaron DL1.4 y DL1.1. Se confirmó que ambos productos eran genómicamente adyacentes a la prunasina hidrolasa amplificando los productos utilizando cebadores directos basados en la secuencia de los fragmentos de GenomeWalker™ y cebadores inversos de la secuencia de prunasina hidrolasa. Una vez confirmado, se amplificaron los promotores PH DL1.1 y PH DL1.4 a partir del ADN Genómico de Black Cherry utilizando los cebadores de más abajo para añadir sitios NcoI en el codón de iniciación. Los fragmentos producidos se clonaron en pGEMT-easy y se secuenciaron para su confirmación.
Cebadores de PCR para el Promotor de la Prunasina Hidrolasa
DL1.1/SEQ ID NO.: 5
Producto de longitud 1260 (puntuación: 162
pone NcoI en el codón de iniciación)
Tf: 74,5 C Ta Opt: 54,0 C GC: 36,8
SEQ ID NO.: 9 ACCGTGCGAAAGGTCTTCTTG
SEQ ID NO.: 10 ATGCCATGGCTGAGAGGAGGG 
\vskip1.000000\baselineskip
DL1.4/SEQ ID NO.: 1
Producto de longitud 871 (puntuación: 162)
pone NcoI en el codón de iniciación)
Tf: 73,7 C Ta Opt: 55,6 C GC: 35,6
SEQ ID NO.: 11 GGGGTGCTTACACCCACAATCATCC
SEQ ID NO.: 12 GCAATGCCATGGCTCAGTGGAG 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Transformación y Regeneración de Plantas Transgénicas
Se bombardean embriones de maíz inmaduros de plantas donadoras de invernadero con un plásmido que contiene el promotor de la prunasina hidrolasa conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga y al gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialaphos. Alternativamente, se proporciona el gen marcador seleccionable en un plásmido separado. la transformación se realiza como sigue. Más abajo siguen las recetas de los medios.
Preparación de Tejido Diana
Las mazorcas se desvainan y la superficie se esteriliza en hipoclorito de calcio al 30% más detergente el 0,5% durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se separan por corte y se coloca el eje del embrión boca abajo (lado del escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y después se alinean en la zona diana de 2,5 cm como preparación para el bombardeo.
Preparación del ADN
Se elabora un vector plasmídico que comprende el promotor de la prunasina hidrolasa conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga. Este vector más un marcador seleccionable PAT, en el mismo vector o en uno separado, se precipitan sobre peletes de tungsteno de 1,1 \mum (diámetro medio) utilizando un procedimiento de precipitación con CaCl_{2} como sigue:
100 \mul de partículas de tungsteno preparadas en agua
10 \mul (1 \mug) de ADN en tampón Tris EDTA (1 \mug de ADN total)
100 \mul de CaCl_{2} 2,5 M
10 \mul de espermidina 0,1 M
Cada reactivo se añade sucesivamente a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene en el Multitube Vortexer. La mezcla final se somete a sonicación brevemente y se incuba con un vórtice constante durante 10 minutos. Tras el período de precipitación, los tubos se centrifugaron brevemente, el líquido se separó, se lavó con 500 ml de etanol del 100%, y se centrifugó durante 30 segundos. De nuevo se separa el líquido, y se añaden 105 \mul de etanol del 100% al sedimento de partículas de tungsteno final. Para el bombardeo con el cañón de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se someten brevemente a sonicación y se salpican 10 \mul sobre el centro de cada macroportador y se permite que se sequen aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.
Tratamiento con Cañón de Partículas
Las placas con la muestra se bombardean en el nivel número 4 del cañón de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un único disparo a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/ADN preparado.
Tratamiento Posterior
Tras el bombardeo, los embriones se mantienen en medio 560Y durante 2 días, después se transfieren a medio de selección 560R conteniendo 3 mg/litro de Bialaphos, y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callos resistentes a la selección se transfieren a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Tras la maduración de embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones bien desarrollados se transfirieron a medio para la germinación y se transfirieron a una cámara de cultivo iluminada. Aproximadamente 7-10 días más tarde, las plántulas en desarrollo se transfieren a medio sin hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plantas están bien establecidas. Después las plantas se transfieren a insertos en plataformas (equivalentes a tiestos de 6,35 cm) conteniendo tierra de siembra y se desarrollan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, después se transfieren a tiestos clásicos (1,6 galones) y se desarrollan hasta la madurez. Las plantas se controlan y se puntúa la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga.
Bombardeo y Medio de Cultivo
El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/litro de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/litro de tiamina HCl, 120,0 g/litro de sacarosa, 1,0 mg/litro de 2,4-D, y 2,88 g/litro de L-prolina (llevado hasta el volumen con H_{2}O D-I tras el ajuste a pH 5,8 con KOH); 2,0 g/litro de Gelrite (añadido después de llevar hasta el volumen con H_{2}O D-I); y 8,5 mg/litro de nitrato de plata (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a la temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4,0 g/litro de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/litro de tiamina HCl, 30,0 g/litro de sacarosa, y 2,0 mg/litro de 2,4-D (llevado hasta el volumen con H_{2}O D-I tras el ajuste a pH 5,8 con KOH); 3,0 g/litro de Gelrite (añadido después de llevar hasta el volumen con H_{2}O D-1); y 0,85 mg/litro de nitrato de plata y 3,0 mg/litro de bialafos (ambos añadidos después de esterilizar el medio y enfriar a la temperatura ambiente).
El medio de regeneración de las plantas (288J) comprende 4,3 g/litro de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/litro de solución de partida de vitaminas MS (0,100 g ácido nicotínico, 0,02 g/litro tiamina HCL, 0,10 g/litro de piridoxina HCL, y 0,40 g/litro de glicina llevado hasta el volumen con H_{2}O D-I sutilizada (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/litro de mio-inositol, 0,5 mg/litro de zeatina, 60 g/litro de sacarosa, y 1,0 ml/litro de ácido abscísico 0,1 mM (llevado hasta el volumen con H_{2}O D-l después de ajustar a pH 5,6); 3,0 g/litro de Gelrite (añadido después de llevar hasta el volumen con H_{2}O D-I); y 1,0 mg/litro de ácido indolacético y 3,0 mg/litro de bialafos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C). El medio sin hormona (272V) comprende 4,3 g/litro de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/litro de solución de partida de vitaminas MS (0,100 g/litro de ácido nicotínico, 0,02 g/litro de tiamina HCL, 0,10 g/litro de piridoxina HCL, y 0,40 g/litro de glicina llevado hasta el volumen con H_{2}O D-I sutilizada), 0,1 g/litro de mio-inositol, y 40,0 g/litro de sacarosa (llevada hasta el volumen con H_{2}O D-I sutilizada después de ajustar el pH a 5,6); y 6 g/litro de bacto-agar (añadido después de llevar hasta el volumen con H_{2}O D-I sutilizada), esterilizado y enfriado a 60ºC.
Ejemplo 3 Transformación Mediada por Agrobacterium de Maíz
Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con un promotor de prunasina hidrolasa de la invención, se emplea preferiblemente el método de Zhao (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.981.840, y publicación de patente PCT WO98/32326; cuyos contenidos se incorporan aquí como referencia). Brevemente, los embriones inmaduros se aíslan del maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir el promotor de la prunasina hidrolasa conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros son sumergidos preferiblemente en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones son cultivados simultáneamente durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cultivo simultáneo). Preferiblemente los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido tras la etapa de infección. Tras este período de cultivo simultáneo se contempla una etapa de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia al menos un antibiótico conocido por inhibir el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes de la planta (etapa 3: etapa de reposo). Preferiblemente los embriones inmaduros se cultivan sobe medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivan en medio que contiene un agente selectivo y se recupera callo transformado en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido con un agente selectivo dando lugar al crecimiento selectivo de las células transformadas. Después el callo se regenera en las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración), y preferiblemente los callos desarrollados sobre medio selectivo se cultivan en medio sólido para regenerar las plantas.
Transformación con Constructos de Fusión Gus en Maíz
Se utilizó un constructo que contenía el promotor de la prunasina hidrolasa fusionado a GUS para transformar maíz mediante el método de Zhao supra. Se generaron un total de 3 plantas por evento y se transplantaron en el invernadero.
Protocolo de detección GUS
Se seccionaron con la mano diversas muestras de tejido recogidas de plantas transgénica, y los patrones de expresión de GUS se verificaron histoquímicamente mediante tinción durante la noche en una solución e tinción a 37ºC. La solución contenía tampón fosfato 0,1 M, pH 7,5, Triton X-10 al 0,1% y 0,5 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucuronido (X-gluc). La enzima GUS producida en las células que expresaban los transgenes convertirían X-gluc en un producto precipitado de color azul in situ, permitiendo de ese modo la localización de los transgenes (Jefferson et al., 1987 EMBO J 6:3901). La clorofila de los tejidos verdes se blanqueaba con etanol del 75% para facilitar la visualización de a tinción azul a partir de la expresión de GUS. Las secciones de tejido se examinaron después y se fotografiaron bajo el microscopio de disección.
Expresión de GUS en Maíz
Se realizó un examen de las muestras de nervio principal foliar de 16 eventos en cuanto a la expresión de GUS. Quince de los 16 eventos contenían una tinción detectable utilizando el análisis histoquímico. Se seleccionaron plantas de 10 eventos al azar para exámenes adicionales, con muestras de 5 de estos eventos tomadas de múltiples momentos puntuales para detectar la expresión en los núcleos en desarrollo. Se examinaron una variedad de tejidos y órganos, y se encontró la expresión de GUS constantemente en los haces vasculares. En algunas secciones de tejidos, también se observó la difusión en las células circundantes próximas a los haces vasculares. Los datos de expresión recogidos en estas plantas indican que el promotor de la prunasina era completamente activo en maíz, y que conservaba su especificidad para el tejido vascular.
Las Figuras 3 y 4 detallan adicionalmente la expresión en el tejido vascular asociada con la transformación de maíz con el constructo GUS/promotor de prunasina.
Ejemplo 4 Transformación de Embrión de Soja
Los embriones de soja se bombardean con un plásmido que contiene el promotor de prunasina hidrolasa conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés (Figura 1) como sigue. Para inducir embriones somáticos, se cultivan cotiledones, de 3-5 mm de longitud diseccionados de semillas inmaduras, de superficie esterilizada, del cultivar A2872 de soja en luz u oscuridad a 26ºC en un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se separan por corte después y se colocan en un medio líquido adecuado. Tras la selección repetida para las agrupaciones de embriones somáticos que se multiplican en forma de embriones en fase globular, temprana, las suspensiones se mantienen como se describe más abajo.
Los cultivos en suspensión embriogénicos de soja se pueden mantener en 35 ml de medio líquido en un sacudidor giratorio, 150 rpm, con luces fluorescentes en programa de 16:8 horas día/noche. Los cultivos se sub-cultivaron cada dos semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio líquido.
Después se pueden transformar los cultivos en suspensión embriogénicos de soja mediante el método de bombardeo con un cañón de partículas (Klein et al. (1987) Nature (London) 327:70-73, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.945.050). Se puede utilizar un aparato Du Pont Biolistic PDS1000/HE (helio readecuado) para estas transformaciones.
Un gen marcador seleccionable que se puede utilizar para facilitar la transformación de la soja es un transgen compuesto por el promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), el gen de la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188), y la región 3' del gen de la nopalina sintasa de ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. La casete de expresión que comprende el promotor de la prunasina hidrolasa conectado operablemente a la secuencia de nucleótidos heteróloga se puede aislar en forma de un fragmento de restricción. Este fragmento se puede insertar después en un sitio de restricción único para el vector que porta el gen marcador.
A 50 \mul de una suspensión de 60 mg/ml de partículas de oro de 1 \mum se añaden (por orden): 5 \mul de ADN (1 \mug/\mul), 20 \mul de espermidina (0,1 M), y 50 \mul de CaCl_{2} (2,5 M). La preparación de partículas se agita después durante tres minutos, se centrifuga durante 10 segundos y después se separa el sobrenadante. Las partículas recubiertas de ADN se lavan una vez en 400 \mul de etanol del 70% y se resuspenden en 40 \mul de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede someter a sonicación tres veces durante un segundo cada vez. Después se cargan cinco microlitros de las partículas de oro recubiertas de ADN en cada disco macro portador.
Se colocan aproximadamente 300-400 mg del cultivo en suspensión de dos semanas en una placa de petri de 60x15 mm vacía y el líquido residual se separa del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardean normalmente alrededor de 5-10 placas de tejido. La presión de ruptura de la membrana se ajusta a 74,8 atm (1.100 psi), y la cámara se evacua a un vacío de 71,12 (28 pulgadas de mercurio). El tejido se coloca aproximadamente a 8,89 centímetros (3,5 pulgadas) del tamiz de retención y se bombardea tres veces. Tras el bombardeo, el tejido se puede dividir por la mitad y se puede volver a colocar en el líquido y cultivarlo como se ha descrito antes.
Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido puede ser intercambiado por medio de nueva aportación, y once a doce días después del bombardeo por medio de nueva aportación que contiene 50 mg/ml de higromicina. Este medio selectivo puede ser repuesto semanalmente. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar el tejido transformado creciendo a partir de agrupaciones embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se separa y se inocula en matraces individuales para generar cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados clónicamente, nuevos. Cada nueva línea puede ser tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar después y mantener en forma de agrupaciones de embriones inmaduros o regeneradas a plantas completas por maduración y germinación de embriones somáticos individuales.
Ejemplo 5 Transformación de Tejido Meristemático de Girasol
Se transforman tejidos meristemáticos de girasol con una casete de expresión que contiene el promotor de la prunasina hidrolasa conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga como sigue (ver también la Patente Europea Número EP 0 486233, incorporada a la presente memoria como referencia, y Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Science 103:199-207). Se descascaran las semillas de girasol maduras (Helianthus annuus L.) utilizando una trilladora de cereales para maíz sencilla. Las semillas se esterilizan en la superficie durante 30 minutos en una solución de blanqueo Clorox al 20% con la adición de dos gotas de Tween 20 por 50 m de solución. Las semillas se enjuagan dos veces con agua destilada estéril.
Se preparan explantes de ejes embriónicos divididos mediante una modificación de los procedimientos descritos por Schrammeijer et al. (Schrammeijer et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Las semillas se empapan en agua durante 60 minutos después del procedimiento de esterilización superficial. Los cotiledones de cada semilla se desprenden, produciendo una fractura limpia en el plano del eje embriónico. Tras la separación de la punta de la raíz, los explantes se biseccionan longitudinalmente entre las hojas primordiales. Las dos mitades se colocan, con la superficie cortada hacia arriba, en medio GABA que consta de elementos minerales de Murashige y Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497), adiciones de vitaminas de Shepard (Shepard (1980) en Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), 40 mg/litro de sulfato de adenina, 30 g/litro de sacarosa, 0,5 mg/litro de 6-bencil-aminopurina (BAP), 0,25 mg/litro de ácido indol-3-acetico (IAA), 0,1 mg/litro de ácido giberélico (GA_{3}), pH 5,6, y 8 g/litro de Phytagar.
Los explantes se someten a bombardeo con microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Se colocan treinta a cuarenta explantes en un círculo en el centro de una placa de 60 X 20 mm para este tratamiento. Se resuspenden aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1,8 mm en 25 ml de tampón TE estéril (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se utilizan alícuotas de 1,5 ml para el bombardeo. Cada placa se bombardea dos veces a través de una pantalla Nytex de 150 mm colocada 2 cm por encima de las muestras en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®.
La cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 desactivada se utiliza en todos los experimentos de transformación. Un vector plasmídico binario que comprende la casete de expresión que contiene el promotor de la prunasina hidrolasa conectado operablemente a la secuencia de nucleótidos heteróloga se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium por medio de congelación-descongelación como describen Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187. Este plásmido comprende adicionalmente un gen marcador seleccionable de kanamicina (esto es, nptII). Las bacterias para la transformación de la planta se hacen crecer durante la noche (28°C y agitación continua a 100 RPM) en medio YEP líquido (10 gm/litro de extracto de levadura, 10 gm/litro de Bactopeptona, y 5 gm/litro de NaCl, pH 7,0) con los antibióticos apropiados requeridos para el mantenimiento del plásmido binario y la cepa bacteriana. La suspensión se utiliza cuando alcanza una DO_{600} de aproximadamente 0,4 a 0,8. Las células de Agrobacterium se sedimentan y se suspenden a una DO_{600} de 0,5 en un medio de inoculación comprendido por MES 12,5 mM pH 5,7, 1 gm/litro de NH_{4}Cl, y 0,3 gm/litro de MgSO_{4}.
Los explantes bombardeados de nueva aportación se colocan en una suspensión de Agrobacterium, se mezclan, y se dejan sin tocar durante 30 minutos. Los explantes se transfieren después a medio GBA y se cultivan simultáneamente, con la superficie cortada hacia abajo, a 26°C y días de 18 horas. Al cabo de tres días de cultivo simultáneo, los explantes se transfieren a 374B (medio GABA que carece de reguladores del crecimiento con un nivel de sacarosa del 1%) suplementado con 250 mg/ml de cefotaxima y 50 mg/ml de sulfato de kanamicina. Los explantes se cultivan durante dos a cinco semanas sobre la selección y después se transfieren a medio 374B de nueva aportación que carece de kanamicina durante una a dos semanas de desarrollo continuado. Los explantes con diferenciación, áreas de crecimiento con resistencia a antibiótico que no han producido vástagos adecuados para la separación por corte son transferidos a medio GABA conteniendo 250 mg/ml de cefotaxima para un segundo tratamiento con fitohormonas de 3 días. Las muestras de hojas de los vástagos verdes, resistentes a kanamicina se analizan en cuanto a la presencia de NPTII mediante ELISA y en cuanto a la presencia de expresión transgénica analizando la expresión conducida por el promotor de la prunasina hidrolasa de la secuencia de nucleótidos heteróloga.
Los vástagos positivos a NPTII se injertan a un rizoma de plántula de girasol desarrollado in vitro 6440. Las semillas esterilizadas en la superficie se hacen germinar en medio 48-0 (Murashige de fuerza media y sales de Skoog, sacarosa al 0,5%, Gelrite el 0,3%, pH 5,6) y se desarrollan en las condiciones descritas para el cultivo de explantes. La porción superior de la plántula se separa, se realiza un corte vertical de 1 cm en el hipocotilo, y la raíz transformada se inserta en el corte. Se envuelve el área completa con Parafilm para fijar la raíz. Las plantas injertadas se pueden transferir a tierra al cabo de una semana de cultivo in vitro. Los injertos en tierra se mantienen en condiciones de elevada humedad seguido de una lenta aclimatación al entorno del invernadero. Los sectores transformados de las plantas T_{0} (generación parental) que maduran en el invernadero se identifican por medio de ELISA NPTII y/o por análisis de la actividad de transcripción de pequeñas porciones de cotiledón de semilla seco.
Un protocolo de transformación de girasol alternativo permite la recuperación de la progenie transgénica sin el uso de una presión de selección química. Las semillas se descascaran y se esteriliza su superficie durante 20 minutos en una solución de blanqueo de Clorox al 20% con la adición de dos a tres gotas de Tween 20 por 100 ml de solución, después se enjuagan tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se empapan en la oscuridad a 26ºC durante 20 horas sobre un filtro de papel mojado con agua. Los cotiledones y el radical de la raíz se separan, y los explantes meristemáticos se cultivan en 374E (medio GBA que consta de sales MS, vitaminas de Shepard, 40 mg/litro de sulfato de adenina, sacarosa al 3%, 0,5 mg/litro de 6-BAP, 0,25 mg/litro de IAA, 0,1 mg/litro de GA, y Phytagar al 0,8% a pH 5,6) durante 24 horas en la oscuridad. Las hojas primarias se separan para exponer el meristemo apical, se colocan alrededor de 40 explantes con el domo apical encarado hacia arriba en un círculo de 2 cm en el centro de 374M (medio GBA con Phytagar al 1,2%), y después se cultivan en el medio durante 24 horas en la oscuri-
dad.
Se resuspenden aproximadamente 18,8 mg de partículas de tungsteno de 1,8 \mum en 150 \mul de etanol absoluto. Tras la sonicación, se añaden gota a gota 8 \mul de esto en el centro de la superficie del macroportador. Cada placa se bombardea dos veces con discos de ruptura de a 44,2 atm en el primer asiento a 26 mm de Hg de helio de una pistola de vacío.
El plásmido de interés se introduce en Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 por medio de congelación-descongelación como se ha descrito previamente. El sedimento de bacterias desarrolladas durante la noche a 28ºC en un medio YEP líquido (10 g/litro de extracto de levadura, 10 g/litro de Bactopeptona, y 5 g/litro de NaCl, pH 7,0) en presencia de 50 \mug/litro de kanamicina se resuspende en un medio de inoculación (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 12,5 mM 2-mM, MES, 1 g/litro de NH_{4}Cl y 0,3 g/litro de MgSO_{4} a pH 5,7) para alcanzar una concentración final de 4,0 a una DO de 600. Los explantes bombardeados con partículas se transfieren a medio GBA (374E), y se coloca una gotita de suspensión de bacterias sobre la parte superior del meristemo. Los explantes se cultivan simultáneamente en el medio durante 4 días, después de lo cual los explantes se transfieren a medio 374C (GBA con sacarosa al 1% y sin BAP, IAA, GA3 y suplementado con 250 \mug/ml de cefotaxima). Las plántulas se cultivan en el medio durante aproximadamente dos semanas en condiciones de días de 16 horas y 26ºC de incubación.
Los explantes (alrededor de 2 cm de longitud) de dos semanas de cultivo en medio 374C se rastrean en cuanto a la expresión utilizando análisis conocidos en la técnica tales como la transferencia Northern. Una vez identificados los explantes positivos (es decir, para la expresión conducida por el promotor de la prunasina hidrolasa) aquellos vástagos que fracasan al exhibir la expresión conducida por el promotor de la prunasina hidrolasa se descartan, y cada explante positivo se subdivide en explantes nodales. Un explante nodal contiene al menos un nodo potencial. Los segmentos nodales se cultivan en medio GBA durante tres a cuatro días para promover la formación de yemas auxiliares de cada nodo. Después se transfieren a medio 374C y se deja que se desarrollen durante cuatro semanas más. Las yemas en desarrollo se separan y se cultivan durante cuatro semanas más en medio 374C. Las muestras de hojas reunidas de cada vástago recién recuperado se rastrean de nuevo mediante el análisis de la actividad de la proteína adecuado. En este momento, los vástagos positivos recuperados de un único nodo se habrán enriquecido generalmente en el sector transgénico detectado en el análisis inicial antes del cultivo nodal.
Los vástagos recuperados positivos para la expresión regulada por el promotor de la prunasina hidrolasa se injertan en rizoma de plántulas de girasol desarrolladas in vitro 6440 híbrido. Los rizomas se preparan de la siguiente manera. Las semillas se descascaran y se esteriliza su superficie durante 20 minutos en una solución de blanqueo de Clorox al 20% con la adición de dos a tres gotas de Tween 20 por 100 ml de solución, grupos, y se enjuagan tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se hacen germinar sobre papel de filtro mojado con agua durante tres días, después se transfieren a medio 48 (sal MS de fuerza media, sacarosa al 0,5%, Gelrite el 0,3% pH 5,0) y se hacen crecer a 26ºC en la oscuridad durante tres días, después se incuban en condiciones de cultivo de días de 16 horas. La porción superior de la plántula seleccionada se separa, se realiza un corte vertical en cada hipocotilo, y el vástago transformado se inserta en un corte en V. El área cortada se envuelve en Parafilm. Después de una semana de cultivo en el medio, las plantas injertadas se transfieren a tierra. En las dos primeras semanas, se mantienen en condiciones de elevada humedad para aclimatarlas al entorno del invernadero.
Ejemplo 6 Transformación con el constructo de fusión GUS en Arabidopsis
Se utilizó un constructo que contenía el promotor de la prunasina hidrolasa fusionado a GUS para transformar Arabidopsis mediante el método de Bechtold y Pelletier. (N. Bechtold y G. Pelletier In Plant Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration, in ARABIDOPSIS PROTOCOLS.
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY Vol. 82, pp 259-266 (J.M. Martinez-Zapate y J. Salinas, eds., Humana Press, Totowa, New Jersey).
Transformación de Arabidopsis
Se separaron plantas de Arabidopsis de 4-6 semanas de edad de la tierra cuidadosamente, para mantener los sistemas radiculares intactos. Las raíces se enjuagaron después con agua para separar cualquier partícula sólida unida a ellas. Se colocaron 25-50 plantas en una bandeja de aluminio. Se colocó una segunda bandeja perforada del mismo tamaño sobre la primera bandeja para evitar el movimiento de las plantas. Después se vertió una suspensión de Agrobacterium en las bandejas. Luego se colocaron las bandejas en una cámara de vacío de 10 litros. Se aplicó una presión de vacío de 10^{4} Pa (0,1 atm.) durante 20 minutos. Durante el tratamiento de vacío, se preparó una bandeja de plástico llena de compost, tratamiento y agua. El vacío se interrumpió suavemente, y las bandejas se sacaron de la cámara. Las plantas infiltradas se volvieron a plantar inmediatamente y se cubrieron con una envoltura de plástico perforado o con una bandeja de siembra con agua debajo. La cubierta se separó de las plantas al cabo de 3-4 días. Se dejó que las plantas continuaran creciendo, con riego moderado, hasta que alcanzaron la madurez deseada.
Protocolo de detección GUS
Se cortaron a mano diversas muestras de tejido de las plantas transgénicas, y se verificaron los patrones de expresión GUS histoquímicamente mediante tinción durante la noche en una solución de tinción 37ºC. La solución contenía tampón fosfato 0,1 M, pH 7,5, Triton X-100 al 0,1% y 0,5 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucuronido (X-gluc). La enzima GUS producida en las células que expresaban los transgenes convertirían X-gluc en un producto precipitado de color azul in situ, permitiendo de ese modo la localización de los transgenes (Jefferson et al., 1987 EMBO J 6:3901). La clorofila de los tejidos verdes se blanqueó con etanol del 75% para facilitar la visualización de la tinción azul de la expresión de GUS. Las secciones de tejido se examinaron después y se fotografiaron bajo el microscopio de disección.
La Figura 5 detalla adicionalmente la expresión vascular asociada la transformación de Arabidopsis utilizando el constructo GUS/prunasina.
<110> Pioneer Hi-Bred Int'l
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<120> Vascular Tissue-Preferred Promotors
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<130> 1309-PCT
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<150> 60/305362
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<151> 2001-07-13
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<160> 12
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 988
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<212> DNA
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<213> Prunus serotina 
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<400> 1
1 
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<210> 2
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<211> 865
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<212> DNA
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<213> Prunus serotina 
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<400> 2
2 
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<210> 3
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<211> 2998
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<212> DNA
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<213> Prunus serotina 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (989)...(2626)
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<400> 3
3
4
5
6 
\newpage
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<210> 4
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<211> 545
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<212> PRT
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<213> Prunus serotina 
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<400> 4
7
8 
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<210> 5
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<211> 1260
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<212> DNA
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<213> Prunus serotina 
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<400> 5
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9 
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<210> 6
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<211> 862
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<212> DNA
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<213> Prunus serotina 
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<400> 6
10 
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<210> 7
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> promotor
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<222> (1)...(26)
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<400> 7
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gtatcgaaat gggtcctgtt gagagt 
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26 
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<210> 8
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> promotor
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<222> (1)...(26)
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<400> 8
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atatgtcccg gcagcattgg tatttg 
\hfill
26 
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<210> 9
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> promotor
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<222> (1)...(21)
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accgtgcgaa aggtcttctt g 
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21 
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<210> 10
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<211> 21
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atgccatggc tgagaggagg g 
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21 
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<213> Secuencia Artificial
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ggggtgctta cacccacaat catcc 
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25 
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<222> (1)...(22)
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<400> 12
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gcaatgccat ggctcagtgg ag 
\hfill
22 
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Claims (29)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que inicia la transcripción de una manera específica del tejido vascular, que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por:
(a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o el SEQ ID NO.: 2;
(b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o el SEQ ID NO.: 2;
(c) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene identidad de al menos el 70% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO.: 1 o el SEQ ID NO.: 2 a lo largo de toda la longitud de dicho SEQ ID NO.: 1 o 2;
o un complemento de la misma.
2. Un ácido nucleico de la reivindicación 1, parte (c), donde dicho porcentaje de identidad es de al menos el 80%.
3. Un ácido nucleico de la reivindicación 1, parte (c), donde dicho porcentaje de identidad es de al menos el 90%.
4. Un ácido nucleico de la reivindicación 1, parte (c), donde dicho porcentaje de identidad es de al menos el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
5. Una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, donde dicha transcripción específica del tejido vascular es una transcripción específica del floema.
6. Un constructo de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que inicia la transcripción de una manera específica del tejido vascular, conectada operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.
7. El constructo de ADN de la reivindicación 6, donde la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un polipéptido que tiene actividad antipatogénica.
8. El constructo de ADN de la reivindicación 7, donde la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un polipéptido que tiene actividad antipatogénica hacia los insectos.
9. El constructo de ADN de la reivindicación 8, donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un polipéptido tóxico de Bacillus thuringiensis (B.t.) o un polipéptido tóxico de B.t. quimérico.
10. El constructo de ADN de la reivindicación 8, donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por lectinas y lipoxidasas.
11. El constructo de ADN de la reivindicación 8, donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por una quitinasa de insecto y un polipéptido insecticida.
12. El constructo de ADN de la reivindicación 6, donde dicha secuencia de nucleótidos heteróloga de interés codifica un polipéptido que regula la carga de tejido vascular.
13. El constructo de ADN de la reivindicación 12, donde dicho polipéptido se selecciona del grupo formado por sacarosa sintetasas, transportadores de sacarosa, galactinol sintasas, canales de K+, transportadores de aminoácidos, ATPasas H+, aminoácido permeasas, transportadores de sulfato, fructosiltransferasas, y reguladores de carbohidratos del floema.
14. Un vector de expresión que comprende el constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.
15. Una célula huésped que tiene incorporado establemente en su genoma el constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.
16. Una célula vegetal que tiene incorporado establemente en su genoma el constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.
17. La célula vegetal de la reivindicación 16, donde dicha célula vegetal es de una planta dicotiledónea.
18. La célula vegetal de la reivindicación 16, donde dicha célula vegetal es de una planta monocotiledónea.
19. Una planta que tiene incorporado establemente en su genoma un constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.
20. La planta de la reivindicación 19, donde dicha planta es una planta dicotiledónea.
21. La planta de la reivindicación 19, donde dicha planta es una planta monocotiledónea.
22. Una semilla de la planta de la reivindicación 19, 20, o 21, donde la semilla comprende el constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.
23. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta, comprendiendo dicho método integrar establemente en una célula vegetal un constructo de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13.
24. El método de la reivindicación 23, donde dicha planta es dicotiledónea.
25. El método de la reivindicación 23, donde dicha planta es monocotiledónea.
26. La célula vegetal de la reivindicación 17, donde dicha planta dicotiledónea es de la especie Glycine max.
27. La planta de la reivindicación 20, donde dicha planta dicotiledónea es de la especie Glycine max.
28. La célula vegetal de la reivindicación 18, donde dicha planta monocotiledónea es de la especie Zea mays u Oryza sativa.
29. La planta de la reivindicación 21, donde dicha planta monocotiledónea es de la especie Zea mays u Oryza sativa.
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