ES2275677T3 - Derivados de acido poliamidonucleico, agentes y procedimiento para su preparacion. - Google Patents
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Abstract
Derivado de PNA de la **fórmula**, en donde q es igual a 0 ó 1, D'' es igual a hidroxi, mercapto, amino, alquilamino o acilamino, V, de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre, NR1, V'', de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre, NR1, un grupo U-(CR3R4)u''-C(O)-NH o un grupo U-(CH2CH2O)u''-CH2-C(O)-NH, U de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre o NH, u'' de modo independiente entre sí, es igual a 1 a 10, con preferencia 1 a 4, con preferencia especial 1, W y W'' de modo independiente entre sí, son iguales a oxígeno, azufre o NR1, Y e Y'' de modo independiente entre sí, son iguales a hidroxi, mercapto, anión oxi, tioato o NR1 R2, X y X'' de modo independiente entre sí, son iguales a un grupo U-(alcandiil C2-C22)-U o un grupo U-(CH2CH2-O)u'', o iguales a un grupo marcador, o un grupo para la reticulación cruzada o un grupo que favorece la captación intracelular, o un grupo que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA a ácidos nucleicos, por ejemplo, un radical bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina, Z y Z'' de modo independiente entre sí, son iguales a hidroxi, mercapto, anión oxi, tioato o NR1 R2, alquilo C1-C22, arilalquilo C1-C8, alquil C1-C22-U, arilalquil C1-C8-U, hidroxi-C1-C18-U, aminoalquil-U, mercaptoalquil-U, o un grupo de la fórmula R7(CH2CH2-O)m.
Description
Derivados de ácido poliamidonucleico, agente y
procedimiento para su preparación.
La presente invención se refiere a derivados de
ácido poliamidonucleicos fosforilados carboxiterminales y
carboxi-/
aminoterminal (PNA) con propiedades mejoradas, a su uso, así como a agentes y procedimientos para su preparación.
aminoterminal (PNA) con propiedades mejoradas, a su uso, así como a agentes y procedimientos para su preparación.
Los ácidos poliamidonucleicos, también llamados
ácidos peptidonucleicos (PNA), se unen con gran afinidad como
oligonucleótidos naturales a secuencias blanco complementarias (ADN
o ARN) y tienen, frente al ADN natural, la ventaja de que son muy
estables en suero. Los PNA se describieron originariamente como
análogos no naturales de ácido nucleico, en los que todo el
esqueleto del fosfato de azúcar está reemplazado por unidades de
N-(2-aminoetil)-glicina (M. Egholm
et al. (1991) Science 254, 1497-1500;
documento WO 92/20702; M. Egholm et al. Nature (1993) 365,
566-568; P. Nielsen, (1994) Bioconjugate Chem. 5,
3-7; E. Uhlmann et al. (1998) Angewandte
Chemie Int. Ed. Engl. 37, 2796-2823). Como bases se
utilizan las nucleobases naturales o también no naturales usuales en
la química de los nucleótidos o sus formas profarmacológicas, es
decir, precursores que recién se convierten en el organismo por
biotransformación en la base libre. Más allá de ello, se
describieron PNA en los que no todas las posiciones del esqueleto
llevan radicales de bases (Greiner et al. (1999) Helv. Chim.
Acta 82, 2151), y en los que la aminoetilglicina está reemplazada
por unidades más complejas (Uhlmann et al. (1998) Angewandte
Chem. Int. Ed. 37, 2796; Falkiewicz (1999) Biochim. Pol., 46,
509-529).
El carácter de carga neutra del esqueleto del
PNA es una característica importante de esta clase de sustancias con
amplias consecuencias. Se atribuye al carácter neutro del PNA y el
reducido rechazo de carga asociado con ello que el PNA en sí mismo
se une con una baja concentración salina al ADN y ARN
complementarios (por ejemplo, Peptide Nucleic acids: protocols and
Applications; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon
Scientific Press, 1999, 3), en donde se siguen las reglas de
apareamiento de bases de Watson-Crick. Por ello, se
puede recurrir al PNA en principio para numerosas aplicaciones en
las que, caso contrario, se utilizan oligonucleótidos naturales o
derivados de oligonucleótidos. Más allá de ello, resultan en virtud
de las propiedades de unión únicas numerosas aplicaciones que no
son posibles con oligonucleótidos naturales (ver, por ejemplo:
Peptide Nucleic acids: protocols and Applications; Peter E. Nielsen
y Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999). A modo de
ejemplo, con PNA se observó una invasión de cadenas en ADN
bicatenario.
Ejemplos típicos para utilizar PNA contienen su
uso para la inhibición de la expresión génica por unión específica
de secuencias al ADN o ARN celular. "Agentes antisentido" son
derivados de ácido nucleico monocatenarios cortos que se unen con
un ARNm complementario a través de un apareamiento de bases de
Watson-Crick, cuya traducción debe ser inhibida en
la correspondiente proteína (Uhlmann y Peyman (1990) Chem. Rev. 90,
543; Larsen et al. (1999) Biochem. Biophys. Acta 1489, 159).
"Agentes antígenos" se unen a través del apareamiento de bases
de Hoogsteen en la gran hendidura de la doble hélice del ADN
formando una triple hélice, con lo cual se inhibe la transcripción
de los genes específicos de la secuencia (Praseut et al.
(1999) Biochem. Biophys. Acta 1489, 181). La expresión génica
también se puede inhibir específicamente a través de los llamados
oligómeros "Decoy" que simulan las regiones de unión para los
factores de transcripción. Por medio del tratamiento con agentes
Decoy, se pueden captar determinados factores de transcripción
específicos de la secuencia, evitando así una activación de la
transcripción (Mischiati et al. (1999) J. Biol. Chem. 274,
33114). Se recurre a otro grupo de derivados de oligonucleótidos de
acción intracelular, los quhimeraplastos, para la corrección
genética dirigida (Cole-Strauss et al.
(1996) Science 273, 1386-1389).
Por ello, los PNA se pueden usar como
medicamento y/o agente de diagnóstico o para preparar medicamentos
y/o agentes de diagnóstico.
De esta manera, el documento WO 00/33867A2
revela derivados de PNA para usar como sondas de detección de ácido
nucleico que se modifican de modo tal para reducir las interacciones
inespecíficas con ácidos nucleicos que en el interior llevan al
menos una unidad no nucleosídica con un PKa inferior a 3,0. La
desventaja de estos derivados de PNA consiste en que por una
modificación interna se introduce una unidad de carga negativa en
el interior de la molécula que provoca un rechazo de carga con los
ácidos nucleicos blanco; además, la modificación en el interior del
derivado de PNA puede llevar a alteraciones de la estructura de los
dúplex de ácido nucleico-PNA.
El documento EP 062 677 A2 revela oligómeros de
PNA-ADN para usar como medicamentos, como
iniciadores o cebadores, en donde la unión de PNA y ADN es
covalente y al menos contiene un radical orgánico o una unión con al
menos un átomo de la serie de C, N, O o S.
De la patente US 5.874.553 se conocen
monoésteres oligoméricos de ácido fosfónico (PMENA), así como
derivados de ácido fosfónico, que se basan en la unión de PMENA con
PNA y sirven como inhibidores de la expresión génica, sondas de
detección y similares. El radical fosfonato se halla en las
moléculas aquí reveladas asimismo exclusivamente en el interior de
las moléculas y sirven como puentes para la unión covalente de las
unidades monoméricas dentro de los PMENA o entre PMENA y PNA.
Para fines diagnósticos y en la biología
molecular, el PNA puede utilizarse, por ejemplo, después de la
marcación con biotina, fluoresceína u otros rotuladores como sonda
específica de hibridación. Para la introducción de grupos
marcadores, se describieron en la literatura hasta ahora cuatro
métodos (Oerum et al. (1999), en Peptide Nucleic acids:
Protocols and Applications, páginas 81-86; Lohse
et al. (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503). El primer método
se basa en la marcación del PNA libre (desprotegido) después de su
síntesis en solución. En este caso, el término amino del PNA se
hace reaccionar con un ácido carboxílico activado o un
isotiocianato. A menudo se introducen, sin embargo, radicales de
lisina adicionales en el PNA que luego se hacen reaccionar con
isotiocianato de fluoresceína (FITC).
En el segundo método, el PNA protegido se
modifica aún en la fase sólido en el término amino con derivados
activados de ácido carboxílico o isoticianatos. Este método es
apropiado únicamente para grupos marcadores que son estables en las
condiciones de la desprotección del PNA y durante la separación del
portador. Como reactivos en ambos casos se prefiere usar
isotiocianatos (P. Wittung et al., (1995) FEBS Lett. 375, 27)
o ácidos carboxílicos activados tal como, por ejemplo, éster de
N-hidroxisuccinimida (NHS) (Oerum et al.,
1999). Una desventaja de la reacción con los derivados de NHS
consiste en que sólo se produce con bajo rendimiento. Por ello, a
menudo se condensa ácido
8-amino-3,6-dioxaoctanoico
como ligador o espaciador entre PNA y grupo marcador (Oerum et
al., 1999). Ambas uniones se realizan a través de uniones amida
o uniones tiourea, que como tales llevan más bien a una
insolubilidad. De modo alternativo, se hacen reaccionar los ácidos
carboxílicos con ayuda de activadores usuales en la química de los
péptidos tales como, por ejemplo, HBTU, TBTU o HATU.
En un tercer método, se usan monómeros
conjugados con fluoresceína en la síntesis en fase sólida de PNA, en
donde la marcación de fluorescencia se realiza a través de un
enlace amida (Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503)
que, a su vez, lleva a conjugados de disolución relativamente
difícil.
Un cuarto método usa conjugados de
PNA-péptido, en los que una parte del péptido forma
un sustrato para una proteína quinasa (Koch et al. (1995)
Tetrahedron Lett. 36, 6933). De esta manera, no se modifica la parte
del PNA, sino que se fosforila enzimáticamente el radical serina
del segmento peptídico. Con este método, sólo se puede introducir
fosfato radiactivo, pero, por ejemplo, ninguna fluoresceína o
biotina en el segmento peptídico del conjugado de
PNA-péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sabe que el PNA tiende a la agregación en
solución acuosa, es decir, también en condiciones fisiológicas. Por
ello, el PNA es difícilmente soluble en tampón acuoso y no está a
disposición luego para la hibridación a secuencias complementarias.
El PNA muestra además una gran afinidad por distintos materiales
como Sephadex® (empresa Pharmacia), Bond Elut® (empresa Varian) o
distintos materiales para HPLC-cromatografía que se
usan en la purificación de los oligómeros, de modo que el PNA sólo
se ha de aislar con bajos rendimientos. Por eso es necesario
conjugar el PNA con lisina o con otros aminoácidos con carga
positiva (a través del término C) (Egholm et al (1992) J. Am.
Chem. Soc. 114, 1895). Las secuencias de PNA ricas en guanina
tienden muy particularmente a la agregación, por lo cual se
desaconseja el uso de esos PNA (ver "Guidelines for sequence
design of PNA oligomers" en Peptide Nucleic acids: Protocols and
Applications (1999), páginas 253-255). Son
difícilmente solubles, por ejemplo, oligómeros largos de PNA
marcados con fluoresceína, en donde se recomienda la adición de un
disolvente orgánico y el calentamiento hasta 50ºC.
La purificación de los derivados de PNA
lipofílicos difícilmente solubles es particularmente complicada. En
el caso de la HPLC se detectan a veces varios picos que se remiten a
los agregados de PNA. La técnica de electroforesis de gel de
poliacrilamida aplicada con frecuencia para la purificación y la
separación de ácidos nucleicos (PAA) no es posible para estos
derivados de PNA.
En el caso de los métodos de los derivados de
PNA antes descritos, el grupo marcador siempre se introduce por
unión con un enlace de amida o tioamida, en donde se forman
derivados de PNA de disolución relativamente difícil. En especial
en la introducción de radicales lipofílicos como, por ejemplo, de la
fluoresceína, se producen derivados de PNA de difícil disolución.
La introducción de marcadores en ambos extremos del PNA es
técnicamente más difícil y lleva en general a una solubilidad aún
peor. Además, no se describen métodos eficaces para la derivación
de PNA amino- y carboxiterminal simultánea, en especial por síntesis
en fase sólida. Como las reacciones de marcación además se producen
sólo con bajos rendimientos, una misión por resolver consiste en
poner a disposición nuevos derivados de PNA que se puedan producir
con altos rendimientos y que presenten ventajosas propiedades como
mejor solubilidad, mejor comportamiento de unión, mejor captación
celular y, además, que permita el uso de métodos eficaces de
purificación para los oligómeros de PNA.
El objeto se resuelve según la invención por
medio de la preparación de derivados de PNA de la fórmula I
en
donde
- q
- es igual a 0 ó 1,
- D'
- es igual a hidroxi, mercapto, amino, alquilamino o acilamino, con preferencia acetilamino,
- V
- de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre, NR_{1},
- V'
- de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre, NR_{1}, un grupo U-(CR_{3}R_{4})_{u'}-C(O)-NH o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}O)_{u'}-CH_{2}-C(O)-NH,
- U
- de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre o NH,
- u'
- de modo independiente entre sí, es igual a 1 a 10, con preferencia 1 a 4, con preferencia especial 1,
W y W' de modo independiente entre
sí, son iguales a oxígeno, azufre o
NR_{1},
Y e Y' de modo independiente entre
sí, son iguales a hidroxi, mercapto, anión oxi, tioato o NR_{1}
R_{2},
X y X' de modo independiente entre
sí, son iguales a un grupo U-(alcandiil
C_{2}-C_{22})-U o un grupo
U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}, o iguales a un
grupo marcador, o un grupo para la reticulación cruzada o un grupo
que favorece la captación intracelular, o un grupo que aumenta la
afinidad de unión del derivado de PNA a ácidos nucleicos, por
ejemplo, un radical bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA,
biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo,
vitamina E, colorante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina,
psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o
digoxigenina,
Z y Z' de modo independiente entre
sí, es igual a hidroxi, mercapto, anión oxi, tioato o NR_{1}
R_{2}, alquilo C_{1}-C_{22}, arilalquilo
C_{1}-C_{8}, alquil
C_{1}-C_{22}-U, arilalquil
C_{1}-C_{8}-U,
hidroxi-C_{1}-C_{18}-U,
aminoalquil-U,
mercaptoalquil-U,
- \quad
- o un grupo de la fórmula R_{7}(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en donde R_{7} es igual a hidroxi, amino o alcoxi C_{1}-C_{22} y m es igual a 1 a 100, con preferencia 2 a 10,
- \quad
- o es igual a un grupo marcador, o un grupo para la reticulación cruzada, o un grupo que favorece la captación intracelular, o un grupo que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA a ácidos nucleicos,
- \quad
- por ejemplo, un radical monofuncional o bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina,
R_{1} y R_{2} de modo
independiente entre sí, son un radical compuesto por hidrógeno o
alquilo C_{1}-C_{6}, con preferencia
hidrógeno,
R_{3} y R_{4} de modo
independiente entre sí, son un radical compuesto por hidrógeno o
alquilo C_{1}-C_{6} o el radical de una cadena
lateral de aminoácidos, con preferencia hidrógeno, en donde los
radicales R_{3} y R_{4} adyacentes en V' también pueden formar
un anillo cicloalquilo
C_{5}-C_{8},
- n
- es igual a 0 a 10, con preferencia 0 a 3,
- m
- es igual a 0 a 10, con preferencia 0 a 3,
con la condición de que al menos un
radical Y, Y', Z o Z' sea igual a hidroxi, mercapto, anión oxi o
tioato.
\newpage
El grupo {POLY} se describe por medio de la
fórmula II,
en donde {BLOCK} es, de modo
independiente entre sí, un grupo seleccionado de la fórmula
IIIA,
o de la fórmula IIIB (Greiner
et al. (1999) Helv. Chim Acta 82,
2151),
o de las fórmulas IV A a IV G
(Uhlmann et al. (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37, 2796;
Falkiewicz (1999) Biochim. Pol., 46,
509-529),
en donde cada unidad {BLOCK} puede
ser
diferente,
y también rige que
- z''
- es igual a 0 a 100, con preferencia 1-20, con preferencia especial 4-15,
- G
- está seleccionado de los grupos (CR_{5}R_{6})_{u'}, C(O)NH-(CR_{1}R_{2})_{t'} o C(O)NH-(CH_{2}CH_{2}O)_{u'}-CH_{2}CH_{2}, en donde u' tiene el significado anterior y t' es igual a 2 a 10, con preferencia 6,
- A
- es, de modo independiente entre sí, un grupo (CR_{1}R_{2})_{s}, en donde s es igual a 1 a 3, con preferencia 1,
- B
- es, de modo independiente entre sí, un radical aromático que también puede poseer carácter heteroaromático o hidrógeno, o es hidroxi o alquilo C_{1}-C_{18},
- \quad
- o es una nucleobase natural o no natural usual en la química de los nucleótidos o su forma profarmacológica,
- \quad
- con la condición de que al menos un radical B sea una nucleobase,
- D
- es, de modo independiente entre sí, un grupo (CR_{3}R_{4})_{t}, en donde t es igual a 2 a 10, con preferencia 2 a 4, con preferencia especial 2,
- E
- es, de modo independiente entre sí, un grupo (CR_{5}R_{6})_{u'}-, en donde los radicales R_{5} y R_{6} adyacentes también pueden formar un anillo cicloalquilo C_{5}-C_{8} o un compuesto espiro,
R_{5} y R_{6} son, de modo
independiente entre sí, un radical compuesto por hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{6} o el radical de una cadena lateral
de aminoácidos, con preferencia
hidrógeno,
y en donde u', R_{1}, R_{2},
R_{3} y R_{4} tienen el mismo significado que el descrito con
anterioridad, así como sales fisiológicamente tolerables de los
derivados de PNA de la fórmula I. Las sales fisiológicamente
tolerables se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical
Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA, Estados Unidos,
página 1418. Se prefieren sales de amonio, sales de trialquilamonio,
sales de metal alcalino (como sales de sodio y de po-
tasio) y sales de metal alcalinotérreo (como sales de magnesio y de calcio). Se prefieren en especial las sales de sodio.
tasio) y sales de metal alcalinotérreo (como sales de magnesio y de calcio). Se prefieren en especial las sales de sodio.
Por grupos marcadores (rotuladores) se
entienden, en este caso, grupos que permiten la valoración
cualitativa o cuantitativa de la actividad química o biológica de
los derivados de PNA, por ejemplo, biotina o fluoresceína. Por
reticulación cruzada (crosslinking) se entiende la conformación de
uniones intra- o intermoleculares entre funcionalidades
espacialmente adyacentes. Un grupo para la reticulación cruzada es,
por ejemplo, el grupo psoraleno.
Como efecto sorprendentemente positivo se mostró
que la introducción de un radical fosforilado terminal aumenta, por
ejemplo, como fosfato o también en forma de una derivación
lipofílica (por ejemplo, como hexadecilfosfodiéster) la afinidad
del PNA con ADN o ARN complementario. Este efecto no era de esperar,
dado que la fuerte unión de PNA con ADN o ARN complementario se
atribuyó al carácter neutro del PNA y el rechazo de la carga
reducida asociada a ello (por ejemplo, Peptide Nucleic acids:
Protocols and Applications; Peter E. Nielsen y Michael Egholm
(Edit.) Horizon Scientific Press, 1999, 3).
Se produjo de modo particularmente efectivo la
introducción de la biotina a través de un radical fosforilado. El
PNA biotinilado de la fórmula I (X, X', Z y/o Z' = radical de
biotina) mostró como sondas de hibridación mejores propiedades de
unión y menos efectos secundarios inespecíficos como sondas de ADN
biotiniladas correspondientes.
Contrariamente al PNA sin carga, los derivados
de PNA de la fórmula I según la invención también pueden migrar en
el campo eléctrico, con lo cual es posible una microlocalización y
una concentración en derivados de ácido nucleico complementario
inmovilizado. Para los oligonucleótidos polianiónicos, ya se
describió este método para la rápida determinación de apareamientos
erróneos de bases con ayuda del campo eléctrico (Sosnowski et
al. (1997) proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94, 1119).
Los sustituyentes de hidroxi- o mercapto de los
radicales fosforilo de los derivados de PNA según la invención
pueden desprotonarse en un intervalo de pH de 4,5 a 14, con
preferencia 6,5 a 12, con preferencia especial 6,5 a 9. La
propiedad de la capacidad de ionización de los radicales
fosforilados puede aprovecharse ventajosamente para la purificación
de los compuestos de la fórmula I. Por un lado, los compuestos de la
fórmula I se pueden purificar por electroforesis, por ejemplo,
electroforesis de gel de poliacrilamida. Por otro lado, es posible
una purificación con ayuda de intercambiadores de aniones. En este
caso, se eluyen los productos deseados preferentemente por
aplicación de un gradiente de sal, por ejemplo, de un gradiente de
cloruro de sodio o de un gradiente de pH.
Se pueden purificar de forma particularmente
sencilla y eficaz los derivados de PNA de la fórmula I según la
invención a través de intercambiadores de aniones. Se mostró que los
subproductos sin carga no se retardan en el intercambiador de
aniones, mientras que el producto cargado se adhería a la columna.
Después de lavar con agua, se pudo aislar el producto deseado con
ácido acético o una solución de cloruro de sodio en forma pura.
Como intercambiador de aniones se usa preferentemente
intercambiadores de aniones fuertes o fases de modo mixto tal como,
por ejemplo, ®Oasis MAX (Waters GmbH, Eschbom).
También se mostró que los compuestos de la
fórmula I según la invención son en general mejor solubles en medio
acuoso que los correspondientes oligómeros de PNA sin el radical
fosforilado. Esto se nota muy especialmente en el caso de los
derivados lipofílicos tales como, por ejemplo, los derivados de
fluoresceína o los derivados de hexadecilo, en forma de una
solubilidad muy mejorada en medio acuoso.
La invención se refiere en especial a derivados
de PNA, en los que A y E son iguales a CH_{2}. Además, la
invención se refiere en especial a derivados de PNA en los que D es
igual a (CH_{2})_{2}. También se prefieren los derivados
de PNA de la fórmula I, en los que W y W' son iguales a oxo, también
aquellos en los que Y e Y' son iguales a hidroxi o anión oxi, y
aquellos en los que V y V' son iguales a oxi.
Ejemplos de bases naturales son adenina,
citosina, 5-metilcitosina, guanina, timina y
uracilo. Ejemplos de bases no naturales son purina,
2,6-diaminopurina,
N^{4}N^{4}-etanocitosina,
N^{6}N^{6}-etano-2,6-diaminopurina,
5-alquinil
(C_{3}-C_{6})-uracilo,
5-alquinil
(C_{3}-C_{6})-citosina,
5-(1-propargilamino)-uracilo,
5-(1-propargilamino)-citosina,
fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina,
5-fluoro-uracilo o
pseudoisocitosina, 5-(hidroximetil)uracilo,
5-aminouracilo, pseudouracilo, dihidrouracilo,
5-alquil
(C_{1}-C_{6})-uracilo,
5-alquil
(C_{1}-C_{6})-citosina,
5-alquenil
(C_{2}-C_{6})-citosina,
5-fluorocitosina, 5-clorouracilo,
5-clorocitosina, 5-bromouracilo,
5-bromocitosina, 7-desazaadenina,
7-desazaguanina, 8-azapurina o
purinas
7-desaza-7-sustituidas.
Para derivados de PNA, que sólo llevan en
posición C-terminal un radical fosforilado (donde q
es igual a 0), el término N puede estar unido con una secuencia de
péptidos. Como secuencias de péptidos se tienen en cuenta, con
preferencia, aquellos que optimizan la distribución orgánica o la
localización celular del PNA, como por ejemplo, transportano, factor
de crecimiento símil insulina, señales de localización nuclear u
otras secuencias portadoras (Larsen et al. (1999) Biochim.
Biophys. Acta 159-166). El péptido también puede
servir como tag de afinidad, como aproximadamente una cadena
(His)_{6}.
La presente invención permite una amplia
variación de los radicales X, X', Z y Z' (se brindan ejemplos en las
Figuras 1a, 1b, 2a, 2b, 3a y 3b) y permite así la introducción de
distintas características funcionales específicas en el PNA.
Una realización preferida de Z o Z' es un
radical alquilo C_{1} a C_{22}. También se prefieren radicales
alcoxi C_{1} a C_{22}, en especial radicales alcoxi C_{16}.
Otros radicales preferidos son radicales hidroxi-(alcoxi
C_{1}-C_{18}), en especial
HO
(CH_{2})_{3-12}O. También se prefieren radicales aminoalcoxi, en especial radicales 6-aminohexoxi y 5-aminopentoxi. Además se prefieren radicales de la fórmula R_{7}-(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en donde R_{7} es igual a hidroxi, amino o alcoxi C_{1}-C_{22}, pero con preferencia es hidroxi y m es igual a 0 a 100, con preferencia 2 a 10. Se prefieren en especial HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{2},
HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{6} y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}-O)_{2}. Otros ejemplos preferidos de Z o Z' comprenden radicales mercaptoalcoxi, en especial 6-mercaptohexiloxi.
(CH_{2})_{3-12}O. También se prefieren radicales aminoalcoxi, en especial radicales 6-aminohexoxi y 5-aminopentoxi. Además se prefieren radicales de la fórmula R_{7}-(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en donde R_{7} es igual a hidroxi, amino o alcoxi C_{1}-C_{22}, pero con preferencia es hidroxi y m es igual a 0 a 100, con preferencia 2 a 10. Se prefieren en especial HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{2},
HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{6} y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}-O)_{2}. Otros ejemplos preferidos de Z o Z' comprenden radicales mercaptoalcoxi, en especial 6-mercaptohexiloxi.
En otra realización preferida, Z o Z' es un
grupo fluorescente como fluoresceína, rodamina, TAMRA o un colorante
de cianina. Los grupos fluorescentes preferidos pueden hallarse en
las Figuras 1a-3b. Tiene preferencia muy especial
la biotina para Z. Otros grupos preferidos para Z comprenden
dabcilo, psoraleno, acridina, DNP y colesterol (Figuras 1b y 2b),
radicales BODIPY, ROX o R6G (Su-Chun Hung et
al. (1998) Analytical Biochemistry 255, 32-38) y
digoxigenina (Tarrason et al., Metods in Enzymology (1999)
Vol. 313, 257-268).
Más allá de ello, Z o Z' son iguales a un grupo
compuesto por un radical monofuncional o bifuncional de
fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo,
colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina,
dabcilo, edans, lexitropsina o psoraleno. Los grupos terminales
monofuncionales se detallan por ejemplo en las Figuras 1a, 1 b, 2a y
3a, los grupos bifuncionales de puente se detallan en las Figuras 2b
y 3b. En otra realización preferida, n y/o m son, de modo
independiente entre sí, 0, es decir, la parte del PNA lleva en el
término N y/o C sólo un radical fosforilado.
Una realización preferida de X o X' es
U-(alcandiil C_{2}-C_{22})-U, en
especial O-(alcandiil
C_{2}-C_{22})-O, con preferencia
especial
O-(CH_{2})_{2-6}-O. Otra
realización preferida de X o X' es un grupo de la fórmula
U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u}, en donde u' es
igual a 1 a 10, con preferencia 1 a 6, y en donde U es
preferentemente oxi. En otra realización preferida, X o X' comprende
un grupo fluorescente como fluoresceína, rodamina, TAMRA o un
colorante de cianina, por ejemplo, Cy3® (empresa Amersham Pharmacia
Biotech). Los grupos fluorescentes preferidos pueden hallarse en las
Figuras 2a-3b. Tiene preferencia muy especial la
biotina para X o X'. Otros grupos preferidos son radicales dabcilo,
psoraleno, acridina, DNP, colesterol, BODIPY, lexitropsina,
digoxigenina, ROX y R6G.
Los distintos radicales para X, X', Z y Z' en la
fórmula I puede cumplir diferentes funciones. Los radicales de
fluoresceína tienen variadas aplicaciones en la secuenciación de
ADN, amplificación de señales o como marcadores para la
determinación de la captación celular de PNA. Los radicales de
colorante de cianina (Cy3® y Cy5®) dan como resultado una señal de
fluorescencia esencialmente más intenso y más duradero que la
fluoresceína en sí. El radical psoraleno se utiliza para la
reticulación cruzada (crosslinking) con ácidos nucleicos
complementarios. El radical acridina es un intercalador efectivo y
así puede incrementar la afinidad de unión del PNA. Los derivados de
biotina, acridina y psoraleno también se pueden emplear para
experimentos antisentido. Además, los derivados de hexadeciloxi y
colesterol se pueden emplear para el paso a través de la membrana
del PNA. Los compuestos marcados con DNP de la fórmula I se pueden
detectar con anticuerpos anti-DNP. Los radicales
aminoalcoxi se pueden utilizar para el acoplamiento de otros grupos
tales como, por ejemplo, lexitropsina (comp. ejemplo 17;
PNA-16). De forma similar, también se pueden usar
grupos mercaptoalcoxi para otra derivación.
La invención también se refiere al uso de
derivados de PNA de la fórmula I como medicamentos. Estos
medicamentos se pueden emplear para la prevención y/o el tratamiento
de enfermedades que están acompañadas de la expresión o una
sobreexpresión de determinados genes. La invención también se
refiere al uso de derivados de PNA como agentes de diagnóstico.
Estos agentes de diagnóstico pueden emplearse para el reconocimiento
precoz de las enfermedades antes mencionadas. Como medicamentos o
agentes de diagnóstico, los derivados de PNA de la fórmula se pueden
aprovechar en función de su secuencia como agentes antisentido,
antígenos, Decoy y de quimeraplastia.
Los derivados de PNA según la invención se
utilizan en especial para la preparación de medicamentos para el
tratamiento de enfermedades en las que son la causa o participan
genes definidos por sobreexpresión.
Estos medicamentos se pueden usar, por ejemplo,
para el tratamiento de enfermedades causadas por virus, por
ejemplo, por CMV, VIH, HSV-1, HSV-2,
gripe, VSV, hepatitis B o papilomavirus, en donde la correspondiente
secuencia viral es el objetivo.
Los derivados antisentido de PNA según la
invención que son activos contra estos blancos tienen, por ejemplo,
la siguiente secuencia de bases.
a) contra CMV, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 1 | 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3' |
b) contra VIH, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 2 | 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' | |
| SEQ ID NO: 3 | 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3' |
c) contra HSV-1, por
ejemplo,
| SEQ ID NO: 4 | 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3' |
Estos medicamentos también son apropiados, por
ejemplo, para el tratamiento de cáncer. En este caso, se pueden usar
preferentemente secuencias que están dirigidas contra blancos
responsables del origen del cáncer o del crecimiento del cáncer, en
especial por la inhibición de la telomerasa (E. Matthes et
al. (1999) Nucleic acids Res. 27, 1152). Estos blancos son,
además:
- 1)
- Oncoproteínas nucleares tales como, por ejemplo, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120,
- 2)
- Oncoproteínas citoplasmáticas/asociadas a membrana tales como, por ejemplo, EJras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets,
- 3)
- Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor EGF, Her-2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1), receptores de retinoides, subunidad reguladora de la proteína quinasa, c-fms, Tie-2, c-raf-1 quinasa, PKC-alfa, proteína quinasa A (R1 alfa),
- 4)
- Citoquinas, factores de crecimiento, matriz extracelular tales como, por ejemplo, CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina, fibronectina.
Derivados de PNA antisentido que son eficaces
contra tales blancos, tienen por ejemplo la siguiente secuencia de
bases:
a) contra
c-Ha-ras, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 5 | 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' | |
| SEQ ID NO: 6 | 5'-TATTCCGTCAT-3' | |
| SEQ ID NO: 7 | 5'-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3' |
b) bFGF, p. ej.,
| SEQ ID NO: 8 | 5'-GGCTGCCATGGTCCC-3' |
c) c-myc, p. ej.
| SEQ ID NO: 9 | 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3' | |
| SEQ ID NO: 10 | 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3' |
d) c-myb, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 11 | 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3' |
e) c-fos, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 12 | 5'-CGAGAACATCATCGTGG-3' | |
| SEO ID NO: 13 | 5'-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3' | |
| SEQ ID NO: 14 | 5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3' | |
| SEQ ID NO: 15 | 5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3' |
f) p120, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 16 | 5'-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3' |
g) receptor del EGF, p. ej.,
| SEQ ID NO: 17 | 5'-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3' | |
| SEO ID NO: 18 | 5'-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3' |
h) supresor tumoral p53, p. ej.,
| SEQ ID NO: 19 | 5'-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3' | |
| SEQ ID NO: 20 | 5'-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3' |
i) bcl-2, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 21 | 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3' |
k) VEGF, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 22 | 5'-GCGCTGATAGACATCCATG-3' | |
| SEQ ID NO: 23 | 5'-GGAGGCCCGACC-3' | |
| SEQ ID NO: 24 | 5'-GGTTTCGGAGGC-3' | |
| SEQ ID NO: 25 | 5'-TGGTGGAGGTAG-3' | |
| SEQ ID NO: 26 | 5'-GCATGGTGGAGG-3' | |
| SEQ ID NO: 27 | 5'-TTGGCATGGTGG-3' | |
| SEQ ID NO: 28 | 5'-GCCTGGGACCAC-3' | |
| SEQ ID NO: 29 | 5'-CAGCCTGGGACC-3' | |
| SEQ ID NO: 30 | 5'-TGCAGCCTGGGA-3' | |
| SEQ ID NO: 31 | 5'-GTGCAGCCTGGG-3' | |
| SEQ ID NO: 32 | 5'-GGTGCAGCCTGG-3' | |
| SEQ ID NO: 33 | 5'-ATGGGTGCAGCC-3' | |
| SEQ ID NO: 34 | 5'-GGCTTGAAGATG-3' | |
| SEQ ID NO: 35 | 5''-GCAGCCCCCGCA-3' | |
| SEQ ID NO: 36 | 5'-GCAGCAGCCCCC-3' |
l) c-raf quinasa, por
ejemplo,
| SEQ ID NO: 37 | 5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3' |
m) PKC-alfa, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 38 | 5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3' |
n) proteína quinasa A, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 39 | 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3' |
Los medicamentos que contienen derivados de PNA
de la fórmula I son apropiados, por ejemplo, también para el
tratamiento de enfermedades que son influidas por integrinas o
receptores de adhesión célula-célula, por ejemplo,
por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o
ELAM.
Los derivados de PNA antisentido que son
eficaces contra estos blancos, tienen, por ejemplo, la siguiente
secuencia de bases:
a) VLA-4, p. ej.,
| SEQ ID NO: 40 | 5'-GCAGTAAGCATCCATATC-3' |
b) ICAM-1, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 41 | 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3' | |
| SEQ ID NO: 42 | 5'-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3' | |
| SEQ ID NO: 43 | 5'-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3' | |
| SEQ ID NO: 44 | 5'-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3' |
c) ELAM-1, p. ej.,
| SEQ ID NO: 45 | 5'-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3' | |
| SEQ ID NO: 46 | 5'-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3' |
d) Integrina alfa(V), por ejemplo,
| SEQ ID NO: 47 | 5'-GCGGCGGAAAAGCCATCG-3' |
Los medicamentos que contienen derivados de PNA
de la fórmula I también son apropiados, por ejemplo, para impedir la
reestenosis. En este caso, se pueden usar secuencias de PNA que
estén dirigidas contra blancos que son responsables de la
proliferación o la migración. Dianas de este tipo son, por
ejemplo:
- 1)
- Proteínas de transactivadores nucleares y ciclinas tales como, por ejemplo, c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclina y cdc2-quinasa
- 2)
- Mitógenos o factores de crecimiento tales como, por ejemplo, PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF y TGF-\beta.
- 3)
- Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor bFGF, receptor EGF y receptor PDGF.
Los derivados de PNA antisentido que son
eficaces contra estos blancos, tienen, por ejemplo, la siguiente
secuencia de bases:
a) c-myb, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 48 | 5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3' |
b) c-myc, por ejemplo,
| SEQ ID NO: 49 | 5'-CACGTTGAGGGGCAT-3' |
c) cdc2-quinasa, por
ejemplo,
| SEQ ID NO: 50 | 5'-GTCTTCCATAGTTACTCA-3' |
d) PCNA (proliferating cell nuclear antigen of
rat), por ejemplo,
| SEQ ID NO: 51 | 5'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3' |
Los derivados de PNA también se pueden usar para
el tratamiento de vitiligo y otras enfermedades de despigmentación o
alteraciones de la pigmentación (por ejemplo, piel, cabello, ojos)
tales como, por ejemplo, albinismo y psoriasis, o para el
tratamiento de asma, en donde la expresión del receptor de
adenosina-A1, receptor de
adenosina-A3, receptor de bradiquinina o de
IL-13 se inhiben con ayuda de agentes antisentido
apropiados. Una secuencia de bases de este tipo es, por ejemplo:
| SEQ ID NO: 52 | 5'-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG-3' |
Los medicamentos que contienen un derivado de
PNA de la fórmula I se pueden utilizar, por ejemplo, en forma de
preparados farmacéuticos que se pueden administrar por vía ora, por
ejemplo en forma de comprimidos, grageas, cápsulas de gelatina
blanda o dura, soluciones, emulsiones o suspensiones. También se
pueden administrar por vía rectal, p. ej. en forma de supositorios,
o por vía parenteral, p. ej. en forma de soluciones para inyección.
Para la producción de preparados farmacéuticos, estos compuestos se
pueden elaborar en soportes orgánicos e inorgánicos
terapéuticamente inertes. Ejemplos de tales portadores para
comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina dura son lactosa,
almidón de maíz o sus derivados, sebo y ácido esteárico o sus sales.
Soportes adecuados para la preparación de soluciones son agua,
polioles, sacarosa, azúcar invertido y glucosa. Soportes adecuados
para soluciones para inyección son agua, alcoholes, polioles,
glicerol y aceites vegetales. Soportes adecuados para supositorios
son aceites vegetales y endurecidos, ceras, grasas y polioles
semilíquidos. Los preparados farmacéuticos pueden contener también
conservantes, disolventes, estabilizantes, humectantes,
emulsionantes, edulcorantes, colorantes, saborizantes, sales para
modificar la presión osmótica, tampones, agentes de revestimiento,
antioxidantes, así como, eventualmente, otras sustancias activas
terapéuticas.
Las formas de administración preferidas son
aplicaciones tópicas, aplicaciones locales tales como, por ejemplo,
con ayuda de un catéter o por inhalación, inyecciones o infusiones y
la administración por vía oral. Para la inyección se formulan los
derivados de PNA de la fórmula I en una solución líquida, con
preferencia en un tampón fisiológicamente aceptable como, por
ejemplo, solución de Hank o solución de Ringer. Los oligonucleótidos
también se pueden formular en forma sólida y disolver o suspender
antes de usar. Las dosis preferidas para una administración
sistemática son de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50
mg/kg de peso corporal y día.
La invención se refiere además a preparaciones
farmacéuticas que contienen derivados de PNA de la fórmula I y/o sus
sales fisiológicamente tolerables, además de vehículos y/o aditivos
farmacéuticamente aceptables.
Los derivados de PNA de la fórmula y/o sus sales
fisiológicamente tolerables se pueden administrar en los animales,
con preferencia en los mamíferos, y en especial en los seres humanos
como medicamentos en sí, en mezclas entre sí o en forma de
preparaciones farmacéuticas que permiten una aplicación tópica,
percutánea, parenteral o enteral y que contienen como componente
activo una dosis eficaz de al menos un derivado de PNA, además de
vehículos y aditivos farmacéuticamente aceptables. Las preparaciones
contienen normalmente aprox. 0,1 a 90% en peso del compuesto de
eficacia terapéutica. Para el tratamiento de enfermedades cutáneas,
se prefiere una aplicación tópica, por ejemplo en forma de
ungüentos, lociones o tinturas, emulsiones, suspensiones.
La preparación de productos farmacéuticos se
realiza de una forma conocida en sí (por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.), en donde se
usan vehículos inorgánicos y/u orgánicos farmacéuticamente inertes.
Para preparar píldoras, comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina
dura, se pueden utilizar por ejemplo lactosa, almidón de maíz y/o
sus derivados, talco, ácido esteárico y/o sus sales, etc. Los
vehículos para cápsulas de gelatina blanda y/o supositorios son, por
ejemplo, grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites
naturales y/o endurecidos, etc. Como vehículos para la preparación
de soluciones y/o jarabes son apropiados, por ejemplo, agua,
sacarosa, azúcar invertido, glucosa, polioles, etc. Como vehículos
para la preparación de soluciones para inyección son apropiados
agua, alcoholes, glicerina, polioles, aceites vegetales, etc. Como
vehículos para microcápsulas, implantes y/o parches, son apropiados
polimerizados mixtos de ácido glicólico y ácido láctico. Más allá
de ello, son apropiadas formulaciones de liposomas que son conocidas
por el especialista (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989)
1523; ``Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), por ejemplo,
liposomas HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878). La aplicación
dérmica se puede realizar, por ejemplo, también con ayuda de
métodos iontoforéticos y/o con ayuda de electroporación.
Una preparación farmacéutica puede contener,
además de los principios activos y vehículos, aditivos tales como,
por ejemplo, rellenos, extensores, disgregantes, aglutinantes,
lubricantes, reticulantes, estabilizantes, emulsionantes,
conservantes, endulzantes, colorantes, saborizantes o aromatizantes,
espesantes, diluyentes, sustancias tampón, también disolventes y/o
solubilizantes y/o agentes para lograr un efecto de depósito, así
como sales para alterar la presión osmótica, recubrimientos y/o
antioxidantes. También pueden contener dos o más derivados de PNA
diferentes de la fórmula I y/o sus sales fisiológicamente
tolerables, así como también además de al menos un derivado de PNA
de la fórmula I, una o varias otras sustancias terapéuticamente
eficaces. La dosis puede variar dentro de amplios límites y se
puede adaptar a cada caso individual.
La invención también se refiere al uso de
derivados de PNA de la fórmula I como agentes de diagnóstico, en
especial como elementos auxiliares en el diagnóstico de ADN y en la
biología molecular (ver, por ejemplo: Peptide Nucleic acids:
Protocols and Applications; Peter E. Nielsen y Michael Egholm
(Edit.) Horizon Scientific Press, 1999). En el diagnóstico de ADN,
las sondas génicas, también denominadas sondas de ADN o sondas de
hibridación, desempeñan un papel muy importante para la detección
específica de secuencias de determinados genes. Una sonda génica
está compuesta en general de una secuencia de reconocimiento y uno o
varios grupos marcadores apropiados (rotuladores). La especificidad
de la determinación de una secuencia blanco en una sonda analítica
por medio de hibridación con una sonda génica complementaria se
determina por medio de la secuencia de reconocimiento y su
estructura química. Esta técnica se puede transferir a los PNA. El
PNA tiene, frente a los oligonucleótidos de estructura natural, la
ventaja de que presenta una gran afinidad por la secuencia blanco y
una mayor capacidad para la discriminación de bases.
El uso de compuestos de la fórmula I se refiere,
por ello, a la hibridación in situ y la hibridación in
situ con fluorescencia (FISH). La hibridación in situ
puede servir también, por ejemplo, para la detección de
microorganismos y virus (Just et al. (1998) J. Vir. Method.
73, 163-174). Otra aplicación de los compuestos
según la invención se refiere a la detección y cuantificación de
ácidos nucleicos. Aquí se hace uso preferentemente también de la
tecnología de rayos (Stroter et al. J. Am. Chem. Soc. (2000)
122, 1205-1209; Niemeyer et al., Angew. Chem.
(1999) 111, 3039-3043; Pirrung (1997) Chem. Rev. 97,
473-488), que presenta una alta producción de sondas
y gran sensibilidad. En este caso, las sondas de PNA se fijan en un
soporte o chip de PNA apropiado. Para ello, se sintetizan PNA como
se describió en los ejemplos y luego se fijan sobre el soporte o el
chip de PNA. De modo alternativo, el PNA puede prepararse
directamente sobre el soporte. Otra aplicación es el uso de
compuestos de la fórmula I como biosensores para la detección de
ácidos nucleicos (Wang et al (1996) J. Am. Chem. Soc. 118,
7667). La aplicación de PNA de la fórmula I con un rótulo de
afinidad, por ejemplo, histidil-PNA, es otra
aplicación para la purificación de ácidos nucleicos (Oerum et
al. (1999), en Peptide Nucleic acids: Protocols and
Applications).
Ambos radicales fosforilados en el término amino
y carboxi pueden cumplir diferentes funciones. A modo de ejemplo, el
término amino puede estar sustituido lipofílicamente para aumentar
la captación celular, mientras que en el término carboxi se halla un
radical es fluoresceína para la detección de la mejor captación
celular (comp. PNA-6 en el Ejemplo 7).
Los derivados de PNA según la invención son
apropiados así como agentes antisentido, antígenos, Decoy o de
quimeraplastia.
Los compuestos de la fórmula I biderivados son
apropiados también como los llamados "Molecular Beacons" (Li
et al. (2000) Angew. Chemie 112, 1091-1094),
que recién en la unión con el ácido nucleico complementario emiten
una señal de fluorescencia. En estos Beacons, un extremo del PNA,
por ejemplo, el término amino, está provisto de un rótulo de
fluorescencia, mientras que el otro extremo, por ejemplo, el término
carboxi, está provisto de un atemperador. También es posible el caso
inverso, en el que el término N lleva un atemperador y el término
C, un rótulo de fluorescencia. Así se produce la supresión de la
señal de fluorescencia hasta que el derivado de PNA marcado dos
veces no se una a un ácido nucleico complementario. Recién en la
unión, se separan espacialmente entre sí el radical de fluorescencia
(por ejemplo, edans) y el atemperador (por ejemplo, dabcilo), de
modo que se emite una señal de fluorescencia (Sokol et al.
(1998) proc. Natl. Acad. Sci. 95, 11538).
La síntesis del esqueleto de PNA se produce de
acuerdo con los métodos descritos en la literatura, por ejemplo, de
acuerdo con la estrategia de los grupos protectores de
terc-butiloxicarbonilo (BOC),
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o
monometoxitritilo (Mmt) (Peptide Nucleic acids: Protocols and
Applications; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon
Scientific Press, 1999). Con preferencia, el grupo protector de Mmt
se usa para la protección temporaria de la función amino de la
aminoetilglicina y grupos protectores lábiles de bases en las
nucleobases heterocíclicas (D. Will et al. (1995) Tetrahedron
51, 12069; Breipohl et al. (1997) Tetrahedron 53,
14671-14686). Ejemplos de unidades monoméricas son
compuestos de la fórmula V a V D, en donde A, B, D, E, u' y V'
tienen el significado anterior, PG es un grupo protector de
aminoácido tales como, por ejemplo, benzoílo, anisoílo,
isobutiroílo, acetilo, terc-butilbenzoílo (Breipohl
et al. (1997) Tetrahedron 53, 14671-14686),
TR es un grupo protector lábil de ácidos como dimetoxitritilo (Dmt)
(para V' = O y S) o Mmt (para V' = NH).
\vskip1.000000\baselineskip
Según la estructura del esqueleto del PNA, la
función amino libre del término N se puede hacer reaccionar
directamente con el correspondiente reactivo de fosforilación, por
ejemplo, en un amidato de fósforo (V' = NR_{1} en la fórmula
I).
Los radicales fosforilados se pueden introducir
con ayuda de reactivos utilizados usualmente en la química de los
nucleótidos. Son accesibles numerosos reactivos de fosforilación a
los que se puede recurrir para la preparación de los compuestos de
la fórmula I. Una selección de los reactivos se muestra en las
Figuras 4a a 4d, pero en donde la invención no está limitada a
estos derivados especiales. Para la modificación carboxiterminal se
utilizan soportes correspondientemente modificados, en especial
soportes de CPG para la síntesis en fase sólida. Ejemplos de tales
soportes se detallan en la Figura 6.
Como reactivos de fosforilación se pueden
utilizar los reactivos usuales en la química de los nucleótidos
(Glen Research Corporation, Sterling, VA 20164, Estados Unidos;
Figura 4a a 4d), que reaccionan, por ejemplo, de acuerdo con el
método de la amidita de fósforo, el método de
H-fosfonato o el método de fosfotriéster (E.
Sonveaux (1986) Bioorganic Chemistry 14, 274; S. L. Beaucage y R. P.
lyer (1993) Tetrahedron 49, 1925; E. Uhlmann y A. Peyman (1990)
Chem. Rev. 90, 543). El sinnúmero de las posibles modificaciones
está determinada por la gran cantidad de los reactivos de
fosforilación conocidos y los soportes correspondientemente
derivados, en especial de soportes de controlled pore glass (CPG).
Como soportes sólidos se utilizan además con preferencia tentagel®
(empresa Rapp Polymers GmbH, Tübingen) y aminometilpoliestireno.
Para introducir la función fosforilo, se tienen
en cuenta en principio todos los reactivos conocidos en la química
de los nucleótidos, pero en especial los siguientes reactivos de la
fórmula VI A, la fórmula VI B, la fórmula VI C y la fórmula VI
D,
\vskip1.000000\baselineskip
en donde K es igual a halógeno, con
preferencia Cl, triazolilo, imidazolilo o dialquilamino, W puede
tener el significado antes mencionado o el significado de W' y Z
puede tener el significado antes mencionado o el significado de X,
X' o Z', en donde los grupos reactivos están correspondientemente
protegidos.
A modo de ejemplo, los grupos hidroxi de la
amidita de fósforo de fluoresceína 3 (Figura 4a) están protegidos
por esterificación con ácido piválico.
Los compuestos de la fórmula VI sólo han de
verse como ejemplos de tales reactivos que opcionalmente reaccionan
con la adición de otros reactivos auxiliares como bases, ácidos o
reactivos de condensación. Se prefieren en especial los reactivos de
la fórmula VI A, que reaccionan de acuerdo con el método de la
amidita de fósforo (Beaucage e lyer, 1993). Se hacen reaccionar como
compuesto de fósforo (III) y luego se oxidan. Si la oxidación se
lleva a cabo, por ejemplo, con yodo/agua/piridina o hidroperóxido de
terc-butilo, se obtienen los derivados de fosforilo
(W = O). Si, por el contrario, la oxidación se realiza con azufre
elemental o reactivo de Beaucage, se obtiene el correspondiente
compuesto de tiofosforilo (W = S).
Entre los reactivos (Figuras 4a a 4d) también se
hallan los "reactivos bifuncionales", que se pueden hacer
reaccionar varias veces debido a una segunda función que primero
está protegida. Ejemplos de tales reactivos bifuncionales son las
amiditas de fósforo 4, 6, 8 a 13. En este caso, se puede tratar de
la múltiple conjugación de un reactivo o también de la reacción
sucesiva con diferentes reactivos. De esta manera, por ejemplo, la
amidita de fósforo 3 de fluoresceína se puede hacer reaccionar sólo
una vez. Por el contrario, la amidita de fósforo 4 de fluoresceína
posee una función hidroxi protegida con el grupo Dmt, que se puede
hacer reaccionar después de la separación del grupo Dmt nuevamente
con un reactivo de fosforilación. De esta manera, se pueden
introducir el mismo grupo o grupos diferentes varias veces.
PNA-6 es un ejemplo de una múltiple conjugación en
el término carboxi y una modificación adicional en el término amino.
En principio, se estructuraron en el término carboxi de forma
sucesiva la fluoresceína y el aminoligador. Después de la síntesis
de la parte del PNA, se acopló en el último ciclo una unidad de
hidroxietilglicinato que reaccionó con el reactivo de fosforilación
C16 7. PNA-1 y PNA-2 son compuestos
de la fórmula I que sólo se modifican de forma carboxiterminal con
un radical fosforilo (q = 0). Estas clase de sustancias también es
nueva y es objeto de
la invención.
la invención.
En la Figura 5a y 5b se muestran algunos
ejemplos de tipos de compuestos para la modificación
N-terminal de los compuestos de la fórmula I. El
tipo de compuesto A se obtiene por reacción del grupo hidroxi
terminal del PNA con el reactivo de fosforilación 1. El tipo de
compuesto B se obtiene por reacción del grupo amino terminal del PNA
con la amidita de fósforo 5 de biotina. El tipo de compuesto C se
obtiene por reacción sucesiva del PNA con un grupo hidroxi terminal
con el espaciador-18 amidita de fósforo 9,
modificador de amino-5 amidita de fósforo 12 y
lexitropsina. El tipo de compuesto D se obtiene por reacción
sucesiva del PNA con un grupo hidroxi terminal con el
espaciador-9 amidita de fósforo 8 y la
cianina-3 amidita de fósforo 10. El tipo de
compuesto E se obtiene por reacción sucesiva del PNA con un grupo
hidroxi terminal con la amidita de fósforo 4 bifuncional de
fluoresceína, el espaciador-9 amidita de fósforo 8 y
el C16-reactivo de fosforilación 7. Los pasos que se
han de realizar adicionalmente, como oxidación y separación de
grupos protectores, se describen en los ejemplos.
Un ejemplo de una modificación carboxiterminal
de PNA con ayuda de una amidita de fósforo de la fórmula V D se
representa en la Figura 7. En este caso, se parte de un soporte de
bishidroxietilsulfona 1 (Figura 6) que se hace reaccionar después de
la separación del grupo Dmt con un 3% de ácido tricloroacético con
la amidita de fósforo de la fórmula V D bajo catálisis de tetrazol.
Después de la oxidación con agua yodada, se separa el grupo Mmt
aminoterminal con 3% de ácido tricloroacético y se sintetiza luego
la parte del PNA de acuerdo con los métodos conocidos en la
literatura, por ejemplo, según el método Mmt explicado más abajo. Un
método alternativo para la modificación carboxiterminal hace uso de
soportes CPG®, que están modificados según el resto por introducir,
es decir, por ejemplo, contienen el radical de fluoresceína (Figura
8). Este método se debe explicar por medio del ejemplo de un
derivado de PNA que se modifica de forma aminoterminal con un
radical hexadecilfosfato y carboxiterminal con un fosfato de
fluoresceína. Primero se destritila el soporte de fluoresceína 3
(Figura 6) con ácido tricloroacético y luego se condensa con el
modificador de amino-C6 amidita de fósforo 13
(Figura 4d) con ayuda de tetrazol. Después de la oxidación con agua
yodada y separación del grupo Mmt, se puede sintetizar la parte del
PNA de acuerdo con métodos convencionales. En el último ciclo, se
acopla una unidad de PNA a base de hidroxietilglicina (fórmula V A,
u' = 2, V' = oxígeno) que se hace reaccionar después de separar el
grupo protector Dmt con ayuda del reactivo de fosforilación C16 7
como se muestra en la Figura 9. Tras separar todos los grupos
protectores y separar el soporte de CPG, se obtiene el derivado de
PNA doblemente modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de los siguientes compuestos se
describe a modo de ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-1:
\newpage
PNA-2:
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-3:
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-5:
\newpage
PNA-6:
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-7:
en donde la secuencia de las bases
B se describe en cada caso por SEQ ID NO: 53, y z'' es igual a
10:
| SEQ ID NO: 53 | 5'-TATTCCGTCA T-3' | (PNA-1 a PNA-7) |
Para preparar la parte de PNA se usaron los
siguientes reactivos:
- 1.
- reactivo de amidita de fósforo (0,1 M en acetonitrilo (ACN))
- 2.
- monómero de Mmt-PNA o bien monómero de Dmt-oeg-PNA (0,2 M en DMF:ACN (1:1; v:v))
- 3.
- ACN anhidro (\leq 30 ppm de agua)
- 4.
- ácido tricloroacético (3%) en diclorometano (DCM)
- 5.
- acetanhídrido, 2,6-lutidina en THF (1:1:8; v:v:v); (Cap A)
- 6.
- N-metilimidazol (16%) en THF; (Cap B)
- 7.
- solución yodada (0,05 M) en THF, agua, piridina, (7:2:1; v:v:v)
- 8.
- solución de lavado (THF, agua, piridina (7:2:1; v:v:v);
- 9.
- tetrazol (0,3 M) en ACN
- 10.
- HBTU; 0,2 M en DMF:ACN (1:1; v:v)
- 11.
- DIPEA; 0,2 M en DMF:ACN (1:1; v:v)
- 12.
- DMF (> 99,5%)
- 13.
- soporte en fase sólida: aminopropil-CPG® (550 \ring{A}) cargado con hemisuccinato de Mmt-aminohex-1-ilo (para hexilamidas de PNA).
Los monómeros protegidos con Mmt/acilo o bien
los monómeros oeg protegidos con Dmt/acilo se prepararon tal como se
acaba de describir (Breipohl et al. (1997) Tetrahedron 53,
14671-14686). la carga de
aminopropil-CPG® con el hemisuccinato de
Mmt-aminohex-1-ilo
también se acaba de describir (Will et al. (1995) Tetrahedron
51, 12069-12082). Los soportes de CPG® derivados se
pueden adquirir en comercios (Glen Research Corporation, Sterling,
VA 20164, Estados Unidos). Las síntesis de PNA se realizaron en
general en una escala de 2 a 5 \mumol.
El siguiente ciclo se utilizó para la síntesis
de PNA:
- 1.
- etapa de lavado con ACN
- 2.
- desprotección del grupo Mmt o del grupo Dmt por tratamiento con 3% de TCA en DCM; 110 seg.
- 3.
- etapa de lavado con DMF/ACN (1:1)
- 4.
- neutralización con DIPEA en DMF/ACN (1:1)
- 5.
- acoplamiento de la unidad monomérica por preactivación (15 min) con monómero de HBTU/DIPEA/PNA (relación 1:1:1; volumen total 450 \mul), carga de la fase sólida y acoplamiento (45 min)
- 6.
- etapa de lavado con ACN
- 7.
- cubrimiento con acetanhídrido/N-metilimidazol
- 8.
- etapa de lavado con ACN
- 9.
- nuevo ciclo
Primero se separa del soporte de
bishidroxietilsulfonilo 1 (1 \mumol, Figura 6) por tratamiento con
3% de ácido tricloroacético el grupo protector Dmt. Luego se hace
reaccionar la función hidroxi libre con el modificador de
amino-C6 amidita de fósforo 13 (Figura 4d) bajo
catálisis de tetrazol. En este caso, se aplican el reactivo de
fosforilación 13 en exceso (aprox. 25 veces) como solución 0,3 M en
acetonitrilo/tetrahidrofurano (1:1; v:v) y el tetrazol (aprox. 50
veces; 0,5 M en acetonitrilo). Después de realizada la condensación,
se oxida con una solución de yodo (0,05 M en tetrahidrofurano/agua,
piridina (7:2:1; v:v:v)). A continuación se prepara la parte de PNA
como se describe en el Ejemplo 1 por síntesis en fase sólida. En el
último ciclo, se acetila la función amino libre por tratamiento con
el reactivo de cubrimiento. Esto impide en la desprotección con
amoníaco concentrado la desintegración aminoterminal del PNA.
Finalmente, el PNA se separa del soporte por tratamiento con
amoníaco conc. a 50ºC durante la noche y al mismo tiempo se separan
los grupos protectores. Se obtiene 103 DO (260) del producto crudo
deseado que se purificó por electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAA) preparativa. La banda de producto deseada se eluye con 0,2 M
de tampón de bicarbonato de trietilamonio y se desaliniza a través
de una columna Bond-Elut C18 (1 g). Se obtiene 23,3
DO. El producto se analizó por espectrometría de masa con iones
negativos, que confirmó la masa calculada (calc. 3166,2; exp.
3166,8).
La preparación se realiza análogamente a lo
descrito en el Ejemplo 2 en una síntesis de 1 \mumol. Después de
separar el grupo protector Dmt del soporte 1 (Figura 6) se hace
reaccionar la función hidroxi libre con la amidita de fósforo de la
fórmula V D bajo catálisis con tetrazol. En este caso, se aplican el
reactivo de fosforilación en exceso (aprox. 20 veces) como solución
0,1 M en acetonitrilo/tetrahidrofurano (1:1; v:v) y el tetrazol
(aprox. 50 veces; 0,5 M en acetonitrilo). Después de realizada la
condensación, se oxida con una solución de yodo (0,05 M en
tetrahidrofurano/agua, piridina (7:2:1; v:v:v)). Después de la
separación con amoníaco, se obtiene 50 DO de producto crudo. De
allí se purifica por electroforesis 45 DO a través de un 15% de gel
PAA. Se obtiene 13,2 DO de producto con el peso molecular de 3052,9
(calc. 3052,9).
La preparación se realiza análogamente a lo
descrito en el Ejemplo 2 en una síntesis de 1 \mumol. Después de
estructurar el término carboxi y sintetizar la parte del PNA, se
acopla en el último ciclo una unidad a base de hidroxietilglicina
con timina como nucleobase (oegT). Después de separar el grupo Dmt
se acopla la función hidroxi libre con el modificador de
amino-C6 amidita de fósforo 13 (Figura 4d) bajo
catálisis con tetrazol y luego se oxida con agua yodada. Por
tratamiento con amoníaco conc. a 50ºC se separa el oligómero del
soporte y al mismo tiempo se separan todos los grupos protectores
lábiles de bases. Luego se separa el grupo protector Mmt terminal
por tratamiento con 80% de ácido acético. Se obtiene 130 DO del
producto crudo que se purificó por electroforesis de gel. Se obtiene
22,5 DO de producto con el peso molecular de 3303,8 (calc.
3305,0)
La preparación se realiza análogamente a lo
descrito en el Ejemplo 2 en una síntesis de 0,5 \mumol. Después de
estructurar el término carboxi y sintetizar la parte del PNA, se
acopla en el último ciclo una unidad a base de hidroxietilglicina
con timina como nucleobase (oegT). Después de separar el grupo Dmt
se acopla la función hidroxi libre con el modificador de
amino-C6 amidita de fósforo 5 (Figura 4d) bajo
catálisis con tetrazol y luego se oxida con agua yodada y se
destritila con ácido trifluoroacético. Por tratamiento con amoníaco
conc. a 50ºC se separa el oligómero del soporte y al mismo tiempo se
separan todos los grupos protectores lábiles de bases. Se obtiene 37
DO del producto crudo que se purificó por electroforesis de gel. Se
obtiene 22,5 DO.
La síntesis se realiza de forma análoga al
Ejemplo 2 a partir del soporte de fluoresceína 3 (Figuras 6a y 8).
Del soporte de fluoresceína 3 se separa por tratamiento con 3% de
ácido tricloroacético el grupo protector Dmt. Luego se hace
reaccionar la función hidroxi libre con el modificador de
amino-C6 amidita de fósforo 13 (Figura 4d) bajo
catálisis de tetrazol. Después de realizada la condensación, se
oxida con una solución de yodo (0,05 M en tetrahidrofurano/agua,
piridina (7:2:1; v:v:v)). A continuación se prepara la parte de PNA
como se describe en el Ejemplo 1 por síntesis en fase sólida. En el
último ciclo se acopla una unidad a base de hidroxietilglicina con
timina como nucleobase ((t)oeg). Después de separar el grupo
Dmt se acopla la función hidroxi libre con el reactivo de
fosforilación 1 (Figura 4a) bajo catálisis con tetrazol y luego se
oxida con agua yodada. Finalmente, el PNA se separa del soporte por
tratamiento con amoníaco conc. a 50ºC durante la noche y al mismo
tiempo se separan los grupos protectores. Se obtiene 61 DO (260) del
producto crudo que se purificó por electroforesis de gel de
poliacrilamida (PAA) preparativa. La banda de producto deseada se
eluye con 0,2 M de tampón de bicarbonato de trietilamonio y se
desaliniza a través de una columna Bond-Elut C18 (1
g). Se obtiene 5,6 DO. El producto se analizó por espectrometría de
masa con iones negativos, que confirmó la masa calculada (calc.
3709,5; exp. 3706,3)
La síntesis se realiza de forma análoga al
Ejemplo 6 1 a partir del soporte de fluoresceína 3 (Figuras 6a y 8).
En el último ciclo se acopla una unidad a base de hidroxietilglicina
con timina como nucleobase ((t)oeg). Después de separar el
grupo Dmt se acopla la función hidroxi libre con el
C16-reactivo de fosforilación 7 (Figura 4c) bajo
catálisis con tetrazol y luego se oxida con agua yodada. Finalmente,
el PNA se separa del soporte por tratamiento con amoníaco conc. a
50ºC durante la noche y al mismo tiempo se separan los grupos
protectores. Se obtiene 61 DO (260) del producto crudo deseado que
se purificó por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA)
preparativa. La banda de producto deseada se eluye con 0,2 M de
tampón de bicarbonato de trietilamonio y se desaliniza a través de
una columna Bond-Elut C18 (1 g). Se obtiene 4,6 DO.
El producto se analizó por espectrometría de masa con iones
negativos, que confirmó la masa calculada (calc. 3934, exp.
3931).
La determinación de las temperaturas de fusión
se realizó con ayuda de un espectrofotómetro de haz de diodos HP
8452A, un elemento HP 89090A Peltier y el HP Temperature Control
Software Rev. B5.1 (empresa Hewlett Packard). Se mide en etapas de
0,5ºC/min en 140 mM de KCI, 10 mM de
dihidrógeno-fosfato de sodio, 0,1 mM de EDTA (pH
7,4) como tampón. La concentración de los oligómeros asciende a 0,5
hasta 1 DO_{260} por cada ml.
\newpage
Sorprendentemente, los derivados de
PNA-5 y PNA-6 modificados dos veces
con fosforilo con dos o tres cargas negativas mostraron una unión
igual de buena o mejor respecto del ADN y ARN complementario que el
PNA sin carga (sustancia de referencia).
Las células COS se dejan desarrollar hasta
confluencia en MEM de Dulbecco, que fue suplementado con FCS al 10%,
en placas de Petri de 5 cm. Las células se lavan dos veces con DMEM
exento de suero. Con ayuda de una aguja estéril se raspa una
superficie de aprox. 1 cm^{2} en el centro de la placa de Petri.
En esta superficie se coloca la solución de PNA (10 \muM) por
ensayar. Se incuba a 37ºC bajo una atmósfera de CO_{2}. Al cabo
de 2, 4 y 16 horas, las células se investigan mediante microscopoa
de fluorescencia. Para ello, las células se lavan cuatro veces con
DMEM exento de suero, se cubren con un soporte de vidrio y se
evalúan bajo el microscopio de fluorescencia o mediante contraste de
fases. Se ensayaron PNA-5 y PNA-6
microscópicamente con fluorescencia.
En este caso, se mostró que el derivado de
hexadecil-PNA (PNA-6) se captó más
eficientemente en las células que el PNA sin el radical
hexadecilo.
La secuencia de PNA-6 se dirige
contra el inicio de la traducción de ARNm de Ha-ras.
Las células REH (células de leucemia humana pre-B,
DSM ACC 22) o células tumorales A549 se cultivaron en OptiMEM (Gibco
BRL) con 10% de suero fetal de ternero (FCS,
GIBCO-BRL) a 37ºC bajo 5% de CO_{2}. La densidad
celular para el ensayo era de aprox. 1 x 106/ml). El
PNA-6 (10 \muM) se incubó con las células en
placas de 24 cavidades. Después de una incubación de 96 h a 37ºC
bajo 5% de CO_{2}, se determinó la densidad celular. Los valores
medios de la densidad celular se calcularon a partir de 3 cavidades
individuales de una concentración de PNA. Se mostró que el
PNA-13 inhibe la proliferación de las células REH.
Al cabo de > 4 Tagen de tiempo de incubación, la inhibición por
PNA-6 es mayor que por un oligonucleótido de
fosforotioato correspondiente.
La preparación se realiza análogamente a lo
descrito en el Ejemplo 2 en una síntesis de 1 \mumol. Después de
estructurar el término carboxi y sintetizar la parte del PNA, se
acopla en el último ciclo una unidad a base de hidroxietilglicina
con timina como nucleobase (oegT). Después de separar el grupo Dmt
se acopla la función hidroxi libre con el espaciador
18-amidita de fósforo (Figura 4c) y después de una
nueva destritilación con el modificador de amino-C6
amidita de fósforo 13 (Figura 4d) bajo catálisis con tetrazol y
luego se oxida con agua yodada. Por tratamiento con amoníaco conc. a
50ºC se separa el oligómero del soporte y al mismo tiempo se
separan todos los grupos protectores lábiles de bases. Luego se
separa el grupo protector Mmt terminal por tratamiento con 80% de
ácido acético. Se obtiene 57 DO del producto crudo que se purificó
por electroforesis de gel. Se obtiene 7,4 DO de producto que muestra
en el espectro de masa el peso molecular esperado de 3647,5 (calc.
3648,5).
- ACN
- acetonitrilo
- BOC.
- terc-butiloxicarbonilo
- C, c
- pseudo-iso-citosina
- COS
- CV1 Origin SV 40
- CPG
- controlled pore glass
- DCM
- diclorometano
- DIPEA
- diisopropiletilamina
- DMEM
- MEM de Dulbecco
- DMF
- dimetilformamida
- Dmt
- dimetoxitritilo
- ADN
- ácido desoxirribonucleico
- DNP
- dinitroarilo
- FITC
- isotiocianato de fluoresceína
- Fmoc
- fluorenilmetoxicarbonilo
- HATU
- hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- HBTU
- hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- hex
- -NH-(CH_{2})_{6}-OH
- MEM
- medio esencial mínimo modificado de Eagle
- Mmt
- monometoxitritilo
- DO
- densidad óptica
- oeg
- N-(2-hidroxietil)glicina
- PAA
- poliacrilamida
- PG
- grupo protector
- PNA
- ácido poliamidonucleico
- ARN
- ácido ribonucleico
- TBTU
- tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- TCA
- ácido tricloroácetico
- THF
- tetrahidrofurano
- TR
- grupo protector lábil a ácido
Figuras 1a, 1 b, 2b y 3b muestran ejemplos de
radicales terminales Z y Z'.
Figuras 2a y 3a muestran ejemplos de radicales
de puente X y X'.
Figuras 4a, 4b, 4c y 4d muestran ejemplos de
reactivos de fosforilación.
Figuras 5a y 5b muestran ejemplos de derivación
simple (A, B) y múltiple (C a E) en el término N de PNA.
Figura 6 muestra ejemplos de reactivos unidos a
portadores para la síntesis de fase sólida.
Figuras 7, 8 y 9 muestran ejemplos de la
síntesis de PNA modificado C- y N-terminal.
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Derivados de ácido
poliamidonucleico, agentes y procedimientos para su preparación
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AVE D-2000/A023
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10019135.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-04-18
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_binding
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtttgctc ttcttcttgc g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
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artificial: oligonucleótidos
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artificial: oligonucleótidos
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
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\vskip0.400000\baselineskip
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artificial: oligonucleótidos
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
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<220>
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
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<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_binding
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatggagggc ggcatggcgg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótidos
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<220>
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<221> misc_binding
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<222> (1)..(11)
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<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptattccgtca t
\hfill11
Claims (41)
1. Derivado de PNA de la fórmula I
en
donde
- q es igual a 0 ó 1,
- D' es igual a hidroxi, mercapto, amino, alquilamino o acilamino,
- V, de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre, NR_{1},
- V', de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre, NR_{1}, un grupo U-(CR_{3}R_{4})_{u'}-C(O)-NH o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}O)_{u'-}CH_{2}-C(O)-NH,
- U de modo independiente entre sí, es igual a oxígeno, azufre o NH,
- u' de modo independiente entre sí, es igual a 1 a 10, con preferencia 1 a 4, con preferencia especial 1,
- W y W' de modo independiente entre sí, son iguales a oxígeno, azufre o NR_{1},
- Y e Y' de modo independiente entre sí, son iguales a hidroxi, mercapto, anión oxi, tioato o NR_{1} R_{2},
- X y X' de modo independiente entre sí, son iguales a un grupo U-(alcandiil C_{2}-C_{22})-U o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}, o iguales a un grupo marcador, o un grupo para la reticulación cruzada o un grupo que favorece la captación intracelular, o un grupo que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA a ácidos nucleicos, por ejemplo, un radical bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina,
- Z y Z' de modo independiente entre sí, son iguales a hidroxi, mercapto, anión oxi, tioato o NR_{1} R_{2}, alquilo C_{1}-C_{22}, arilalquilo C_{1}-C_{8}, alquil C_{1}-C_{22-}U, arilalquil C_{1}-C_{8}-U, hidroxi-C_{1}-C_{18}-U, aminoalquil-U, mercaptoalquil-U,
- o un grupo de la fórmula R_{7}(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en donde R_{7} es igual a hidroxi, amino o alcoxi C_{1}-C_{22} y m es igual a 1 a 100, con preferencia 2 a 10,
- o es igual a un grupo marcador, o un grupo para la reticulación cruzada, o un grupo que favorece la captación intracelular, o un grupo que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA con ácidos nucleicos, por ejemplo, un radical monofuncional o bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina,
- R_{1} y R_{2} de modo independiente entre sí, son un radical compuesto por hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6}, con preferencia hidrógeno,
- R_{3} y R_{4} de modo independiente entre sí, son un radical compuesto por hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6} o el radical de una cadena lateral de aminoácidos, con preferencia hidrógeno, en donde radicales R_{3} y R_{4} adyacentes en V' también pueden formar un anillo cicloalquilo C_{5}-C_{8},
- n es igual a 0 a 10, con preferencia 0 a 3,
- m es igual a 0 a 10, con preferencia 0 a 3,
y en donde {POLY} se describe por
medio de la fórmula
II,
en donde también {BLOCK} es, de
modo independiente entre sí, un grupo seleccionado de la fórmula
IIIA,
o de la fórmula
IIIB,
- G está seleccionado de los grupos (CR_{5}R_{6})_{u'}, C(O)NH-(CR_{1}R_{2})_{t'} o C(O)NH-(CH_{2}CH_{2}O)_{u'}-CH_{2}CH_{2}, en donde t' es igual a 2 a 10, con preferencia 6,
- A de modo independiente entre sí, es un grupo (CR_{1}R_{2})_{s}, en donde s es igual a 1 a 3, con preferencia 1,
- B de modo independiente entre sí, es un radical aromático que también puede poseer un carácter heteroaromático, o hidrógeno, o es hidroxi o alquilo C_{1}-C_{18}, o una nucleobase natural o no natural usual en la química de los nucleótidos o su forma profarmacológica,
- D de modo independiente entre sí, es un grupo (CR_{3}R_{4})_{t}, en donde t es igual a 2 a 10, con preferencia 2 a 4, con preferencia especial 2,
- E de modo independiente entre sí, es un grupo (CR_{5}R_{6})_{u'}, en donde los radicales R_{5} y R_{6} adyacentes también pueden formar un anillo cicloalquilo C_{5}-C_{8} o un compuesto espiro,
- R_{5} y R_{6} de modo independiente entre sí, son un radical compuesto por hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6} o el radical de una cadena lateral de aminoácidos, con preferencia hidrógeno,
y en donde u', R_{1}, R_{2},
R_{3} y R_{4} tienen el mismo significado que el descrito con
anterioridad, así como sales fisiológicamente tolerables del
derivado de PNA de la fórmula
I,
o de las fórmulas IV A a IV
G,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde cada unidad {BLOCK} puede
ser
diferente,
y también rige que
z'' es igual a 0 a 100, con preferencia
1-20, con preferencia especial
4-15,
con las condiciones de que al menos un radical
Y, Y', Z o Z' sea igual a hidroxi, mercapto, anión oxi o tioato, y
que al menos un radical B sea una nucleobase.
2. Derivado de PNA de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde al menos un radical Y, Y', Z o Z' en la
fórmula I en un intervalo de pH de 4,5 a 14, con preferencia 6,5 a
12, con preferencia especial 6,5 a 9 es igual a anión oxi o
tioato.
3. Derivado de PNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde n y m son, de modo independiente
entre sí, 0.
4. Derivado de PNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde q es igual a 1.
5. Derivado de PNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde W y W' son iguales a oxo.
6. Derivado de PNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde Y e Y' son iguales a hidroxi o
anión oxi.
7. Derivado de PNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde V y V' son iguales a oxi.
8. Derivado de PNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde X y X' son, de modo independiente
entre sí, un grupo U-(alcandiil
C_{2}-C_{22})-U, con preferencia
O-(alcandiil C_{2-}C_{22})-O, con preferencia
especial O-
(CH_{2})_{2-6}O, o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}, con preferencia O(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}-, en donde u' es 1 a 6.
(CH_{2})_{2-6}O, o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}, con preferencia O(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}-, en donde u' es 1 a 6.
9. Derivado de PNA de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde X, X', Z y Z' están seleccionados,
de modo independiente entre sí, del grupo de fluoresceína, rodamina,
TAMRA o colorante de cianina, biotina, dabcilo, psoraleno,
acridina, DNP, colesterol, vitamina E, dabcilo, edans, lexitropsina,
psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina.
10. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 9, en donde X, X', Z y Z' están
seleccionados, de modo independiente entre sí, del grupo
monofosfato, derivado de biotina y derivado de fluoresceína.
11 Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 9, en donde Z es un marcador de
fluorescencia y Z' es un atemperador.
12. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 9, en donde Z es un atemperador y Z' es un
marcador de fluorescencia.
13. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 9, en donde Z y Z' son, de modo
independiente entre sí, un radical alquilo
C_{1}-C_{22},
- o un radical C_{1}-C_{22}-U, con preferencia un radical alcoxi C_{1}-C_{22}, con preferencia especial alcoxi C_{16},
- o hidroxi-C_{1}-C_{18}-U, con preferencia hidroxi-C_{1}-C_{18}-O, con preferencia especial HO-(CH_{2})_{3-12}O,
- o un radical aminoalquil-U, con preferencia un radical aminoalcoxi, con preferencia especial 6-aminohexoxi o 5-aminopentoxi,
- o un grupo de la fórmula R_{7}-(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en donde R_{7} es con preferencia OH o NH_{2} y m es igual a 1 a 6, con preferencia especial HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{2}, HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{6} y H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}-O)_{2},
- o un radical mercaptoalquil-V, con preferencia un radical mercaptoalcoxi, con preferencia especial 6-mercaptohexiloxi.
14. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 3, en donde q es igual a 0.
15. Derivado de PNA de acuerdo con la
reivindicación 14, en donde D' es igual a acilamino, con preferencia
acetilamino.
16. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 15, en donde D es igual a
(CH_{2})_{t}, con preferencia
(CH_{2})_{2}.
17. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 16, en donde A, E y G es igual a
CH_{2}.
18. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 17, en donde B es igual a adenina,
citosina, 5-metilcitosina, guanina, timina y
uracilo, o es igual a purina, 2,6-diaminopurina,
N^{4}N^{4}-etanocitosina,
N^{6}N^{6}-etano-2,6-diaminopurina,
5-alquinil
(C_{3-}C_{6})-uracilo,
5-alquinil
(C_{3}-C_{6})-citosina,
5-(1-propargilamino)-uracilo,
5-(1-propargilamino)-citosina,
fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina,
5-fluoro-uracilo o
pseudoisocitosina, 5-(hidroximetil)uracilo,
5-aminouracilo, pseudouracilo, dihidrouracilo,
5-alquil
(C_{1}-C_{6})-uracilo,
5-alquil
(C_{1}-C_{6})-citosina,
5-alquenil
(C_{2}-C_{6})-citosina,
5-fluorocitosina, 5-clorouracilo,
5-clorocitosina, 5-bromouracilo,
5-bromocitosina, 7-desazaadenina,
7-desazaguanina, 8-azapurina, o una
purina
7-desaza-7-sustituida.
19. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 18, en donde la secuencia de bases se
dirige contra partes de genes supresores de tumores, oncogenes o
telomerasas o sus productos de transcripción.
20. Derivado de PNA de acuerdo con la
reivindicación 19, en donde la secuencia de bases de la parte del
PNA está dirigida contra el inicio de la traducción de ARNm de
HA-ras.
21. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1-10 o 13-20
para usar como medicamento.
22. Uso de un derivado de PNA de acuerdo
con una de las reivindicaciones 1-10 o
15-22 para preparar un medicamento para la terapia
tumoral.
23. Derivado de PNA de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 20 para usar como agente de
diagnóstico.
24. Uso de un derivado de PNA de acuerdo
con una de las reivindicaciones 1 a 20 para la detección de
microorganismos y/o virus.
25. Uso de un derivado de PNA de acuerdo
con una de las reivindicaciones 1 a 20 para la detección y/o la
cuantificación de ácidos nucleicos.
\newpage
26. Uso de un derivado de PNA de acuerdo
con una de las reivindicaciones 1 a 20 como reactivo de detección
para la hibridación in situ o in situ de
fluorescencia.
27. Uso de un derivado de PNA de acuerdo
con una de las reivindicaciones 1 a 20 como agente antisentido,
antígeno, Decoy o de quimeraplastia.
28. Uso de un derivado de PNA de acuerdo
con una de las reivindicaciones 11 ó 12 como Molecular Beacon.
29. Reactivo de detección que contiene un
derivado de PNA de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a
20.
30. Chip de PNA que contiene un derivado
de PNA de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 20.
31. Biosensor que contiene un derivado de
PNA de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 20.
32. Medicamento que contiene un derivado
de PNA de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-10 o 15-22 y eventualmente otros
aditivos y/o vehículos farmacológicamente tolerables.
33. Agente antisentido, antígeno, Decoy o
de quimeraplastia, que contiene un derivado de PNA de acuerdo con
una de las reivindicaciones 1 a 20.
34. Procedimiento para preparar un
derivado de PNA de la fórmula I, en donde
- a)
- el término C de un ácido amidonucleico se une con un reactivo de fosforilación unido con fibras sólidas o un ácido amidonucleico fosforilado C-terminal se une con un soporte sólido,
- b)
- el esqueleto del oligómero de PNA se prolonga por acoplamiento con monómeros de ácido amidonucleico,
- c)
- se hace reaccionar opcionalmente en el término N con un reactivo de fosforilación.
35. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 34, en donde el PNA se prepara usando los grupos
protectores t-butiloxicarbonilo (BOC),
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o
monometoxitritilo (Mmt).
36. Procedimiento de acuerdo con una de
las reivindicaciones 34 ó 35, en donde el PNA se prepara usando
portadores sólidos.
37. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 36, en donde como portador sólido se usa CPG®,
Tentagel® o aminometilpoliestireno.
38. Procedimiento para preparar un
medicamento, en donde
- a)
- se prepara un derivado de PNA de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-10 o 15-20 y
- b)
- se mezcla opcionalmente con otros aditivos y/o vehículos farmacológicamente tolerables.
39. Procedimiento para preparar un chip de
PNA, en donde primero se prepara un derivado de PNA de acuerdo con
una de las reivindicaciones 1 a 20 y luego se fija sobre un portador
sólido, o bien se prepara directamente el derivado de PNA sobre el
portador.
40. Procedimiento para preparar un
derivado de PNA de la fórmula I de acuerdo con la reivindicación
34 a 37, también caracterizado porque el PNA se purifica por
aprovechamiento del carácter ácido del radical fosforado por medio
de cromatografía o electroforesis.
41. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 40, en donde el derivado de PNA se purifica por
cromatografía mediante una fase estacionaria básica y un gradiente
de un eluyente ácido o básico.
42. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 41, en donde la fase estacionaria es un
intercambiador de aniones o una fase de modo mixto.
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