ES2276157T3 - Procedimiento de evaluacion cuantitativa de las capacidades globales y especificas de reparacion del adn de al medio un medio bilogico, asi como sus aplicaciones. - Google Patents
Procedimiento de evaluacion cuantitativa de las capacidades globales y especificas de reparacion del adn de al medio un medio bilogico, asi como sus aplicaciones. Download PDFInfo
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-
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Abstract
Procedimiento de evaluación cuantitativa de las capacidades globales y específicas de reparación del ADN de al menos un medio biológico, dicho procedimiento se caracteriza porque comprende las siguientes etapas: (a) la preparación de una gama de plásmidos que comprenden cada uno lesiones distintas del ADN, por tratamiento independiente de dichos diferentes plásmidos por al menos un agente físico y/o químico y recuperación de la fracción superenrollada de cada uno de dichos plásmidos; (b) la caracterización de las lesiones presentes en cada uno de los plásmidos de dicha gama de plásmidos, (c) el depósito de diferentes plásmidos de dicha gama de plásmidos y de al menos un plásmido superenrollado control sin lesiones sobre un soporte sólido único, según un esquema A preestablecido, para formar un soporte funcionalizado dividido en distintas zonas A1 a Ax correspondientes a un número entero igual al número de medios biológicos a ensayar simultáneamente, comprendiendo cada zona A1 a Ax dicha gama de plásmidos; (d) la incubación de dicho soporte funcionalizado obtenido en la etapa (c) con diferentes soluciones de reparación que comprenden cada una al menos un medio biológico susceptible de contener actividades enzimáticas de reparación de ATP, un sistema de regeneración de ATP, un nucleótido trifosfato marcado y cualquier otro componente necesario para la actividad de las enzimas de reparación presentes en dicho medio biológico, preferiblemente a una temperatura de 30ºC durante 1 a 5 horas, estando preferiblemente durante 3 horas cada una de dichas soluciones de reparación depositadas, previamente a dicha incubación, en cada una de dichas zonas A1 a Ax distintas y preestablecidas de dicho soporte funcionalizado, (e) al menos un lavado de dicho soporte funcionalizado, (f) la medición directa o indirecta de la señal producida por el marcador incorporado en el ADN durante la reacción de la reparación de la etapa (d), en cada una de dichas zonas A1 a Ax distintas y preestablecidas, (g)el registro y la cuantificación de la señal correspondiente a cada depósito de plásmido en cada zona A1 a Ax y (h) la determinación de la relación de las señales de los plásmidos que comprenden las lesiones respecto del plásmido control depositado conjuntamente.
Description
Procedimiento de evaluación cuantitativa de las
capacidades globales y específicas de reparación del ADN de al
menos un medio biológico, así como sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de evaluación cuantitativa de las capacidades globales
y específicas de reparación del ADN de un medio biológico,
evaluando las capacidades de escisión/resíntesis de dicho medio así
como a sus aplicaciones.
El ADN es sometido sin parar a agresiones
endógenas o exógenas que conducen a la formación de lesiones de
bases o de azúcares.
Estas lesiones incluyen:
- -
- las lesiones de las bases púricas o pirímicas: lesiones oxidativas inducidas por el metabolismo celular, y por fotosensibilización; lesiones por formación de aductos químicos, que resultan de la acción nociva de numerosos agentes genotóxicos tales como los hidrocarburos policíclicos contenidos en los productos de combustión; lesiones por formación de metenobases o de etenobases.
- -
- Las lesiones de la estructura de doble hélice del ADN: formación de puentes intracatenarios (entre dos bases adyacentes de una misma hebra) o intercatenarios (entre dos bases situadas en las hebras homólogas), generalmente provocados los ultravioletas (formación de puentes entre pirimidinas, que se vuelven diméricas) o los antitumorales bifuncionales, tales como la cistaplina y los agentes intercalantes, que forman enlaces covalentes estables en las bases llevadas por las hebras opuestas.
- -
- Lesiones espontáneas, debido al hecho de que el ADN es una molécula parcialmente inestable: desaminaciones o depurinaciones espontáneas.
- -
- Lesiones por rotura moncatenaria o de doble hebra: producidas por agentes tales como las radiaciones ionizantes y por la acción de los radicales libres.
- -
- Lesiones de los azúcares: la destrucción de un desoxiribosa conlleva una rotura de los enlaces fosfodiésteres en el sitio lesionado, seguida de una rotura de la hebra.
Las diversas lesiones inducidas son ilustradas
por el análisis de los fotoproductos estables detectados tras una
irradiación por los UV C: al lado de los dimeros de pirimidina
debidos a la formación de un núcleo ciclobutánico, se forman entre
dos pirimidinas adyacentes, pirimidinas (6-4)
pirimidonas. La proporción relativa de los dimeros de pirimidina y
de producto (6-4) varía de 10 a 4 por un 1. Su
eficacia respectiva en el efecto letal y en el efecto mutágeno de
los ultravioletas es igualmente diferente: los dimeros tienen una
función citotóxica más importante que los productos
(6-4), mientras que lo contrario es cierto para el
efecto mutágeno. Igualmente, las radiaciones ionizantes (rayos y
cobalto 60, por ejemplo) producen simultáneamente roturas
monocatenarias o de doble hebra (aproximadamente en una relación de
9 a 1), de numeroso productos de adición de las bases, de las
pérdidas de bases y a fuertes dosis, puentes entre ADN y proteínas
adyacentes (cromosómicas por ejemplo). Se cuenta por media una
rotura de hebra por base modificada. La función predominante de la
rotura de doble hebra en el efecto citotóxico de las radiaciones va
acompañada de un efecto mutágeno debido a las alteraciones de las
bases.
Estos diferentes tipos de lesiones pueden ser
creados sobre el ADN aislado. Por ejemplo, lesiones de tipo
fotoproductos (6-4) y dimeros de pirimidina de tipo
ciclobutano son inducidas por irradiación UVC (Hoeijmaker et
al., Mutation Res., 1990, 236, 223-238):
lesiones de tipo oxidativo son inducidas por la reacción de Fenton
en presencia de peróxido de hidrógeno y de hierro (Elliot et al.,
Free Rad. Med. 2000, 1438, 1446). Otro medio para preparar ADN
modificado consiste en manipular plásmidos por técnicas de biología
molecular e insertar un oligonucleótido obtenido por síntesis
química y que contiene una lesión de interés (Biade et al., J.
Biol. . Chem., 1997, 273. 898-902).
Todos los organismos vivos disponen de sistemas
de reparación del ADN, destinados a mantener la integridad de su
genoma.
Entre estos sistemas de reparación, dos tiene
como función eliminar las bases modificadas del ADN: se trata del
sistema de Reparación por Escisión de Bases (REB) y del sistema de
Reparación por Escisión de Nucleótidos (REN):
- -
- el sistema REB está más específicamente dedicado a la reparación de pequeñas lesiones del ADN tales como los daños oxidativos, los sitios abásicos, las fragmentaciones de base, las metilaciones de bases, las etenobases, etc.
- -
- El sistema REN se hace cargo de las lesiones voluminosas que inducen una distorsión de la doble hélice de ADN tales como los aductos acetilaminofluoreno, cisplatina y psoraleno del ADN, los dimeros derivados de la irradiación UV B y UV C del ADN, las lesiones covalentes formadas entre una base del ADN y otra molécula, etc (Sancar et al., Annu. Rev. Genetics, 1995, 29, 69-105).
Estos diferentes sistemas de reparación
presentan características comunes y en particular las siguientes
etapas:
- -
- reconocimiento de la o las lesiones por proteínas pertenecientes al sistema de reparación,
- -
- escisión de la lesión y eventualmente de los nucleótidos adyacentes,
- -
- resíntesis por las polimerasas del medio, de los nucleótidos faltantes.
- -
- La reparación se termina generalmente, por la ligación de la hebra neoformada con la hebra de ADN existente.
En todos estos casos, este proceso comprende, la
eliminación del nucleótido modificado y la incorporación
reemplazando en la cadena de ADN, de al menos un nucleótido
trifosfato presente en el medio de reparación.
Sin embargo, hay que resaltar que los sistemas
de reparación, sobre todo en los eucariotas, son muy complejos y
existen numerosas variantes a este esquema simplista (reparación
global, reparación asociada a la trascripción del ADN, reparación
asociada a la replicación del ADN, etc.). Algunas proteínas están
implicadas en diversos sistemas de reparación simultáneamente,
otras son específicas de un solo sistema, algunas pueden ser
inducidas por factores celulares o externos, otras tienen una
expresión ubiquitaria y constante.
Para la continuación de la descripción:
Se denomina "sustrato" a todo ADN
susceptible de experimentar una reacción de reparación en presencia
de extracto celular y por extensión las lesiones del ADN.
Se denomina "medio biológico" o "extracto
celular" una preparación biológica purificada o no, susceptible
de contener al menos una actividad enzimática ligada a la reparación
del ADN.
Se puede generalmente asociar una lesión a las
proteínas específicas encargadas de su reparación en el ADN.
Existen diferencias según las especies; en los procariotas como
Escherichi coli., las enzimas son menos específicas,
mientras que en le hombre, se observa una asociación mucho más
estricta lesión-enzima de reparación específica
sobre todo en el sistema REB. Por ejemplo, Lindahl y Wood (Science,
1999, 286, 1897-1905) describen las enzimas del
sistema REB más importantes en el hombre así como las lesiones a las
que están asociadas. Por ejemplo, en el hombre, la proteína OGG1,
que es una glicosilasa perteneciente al sistema REB está asociada a
la reparación de la
0-oxo-2'-desoxiguanosina.
En Escherichi coli, la
formanidopirimidina.ADN-N glicosilasa repara esta
misma lesión pero más generalmente también las bases purinas
oxidadas (Seeberg et al., TIBS, 1995, 20,
391-397). La proteína humana ANPG es el equivalente
de la proteína bacteriana AlkA. Estas enzimas no tienen sin embargo
las mismas afinidades para sus sustratos y poseen constantes de
velocidad de escisión diferentes (Laval et al., Mut. Res.,
1998, 402, 93-102). Más de una cuarentena de
lesiones diferentes asumidas por el sistema REB pueden tener
consecuencias biológicas importantes y negativas si no se reparan.
Se considera que las enzimas encargadas de su reparación tienen una
función antitumoral importante. Se observa que el conocimiento
preciso de sus especificidades de sustrato es muy
importante.
importante.
Se han desarrollado ensayos de capacidades de
reparación celular y se pueden clasificar en dos categorías:
ensayos in vitro que necesitan el empleo de extracto
celulares activos y sistemas in vitro o semi in vivo
realizados sobre células vivas.
A. La mayoría de los ensayos in
vitro han sido desarrollados sobre la base de las
experimentaciones descritas por Wood et al. (Cell,
1988, 53, 97-106 y Biochemistry, 1989, 26,
8287-8292), que evalúan la etapa de
escisión/resíntesis de la reparación.
De manera más precisa, este ensayo comprende la
utilización de un ADN plasmídico en el cual se introducen lesiones
(por irradiación UV, formación de dimeros de pirimidina de un ADN
plasmídico en el cual se introducen lesiones (por irradiación UV:
formación de dimeros de pirimidina, puentes; por acción de la Dnasa
I: corte o rotura monocatenaria); el ADN así modificado es incubado
a 30ºC en presencia de una preparación de reparación que comprende
al menos: el extracto celular a evaluar, un nucleótido trifosfato
marcado en posición alfa por ^{32}P y ATP. Las enzimas contenidas
en el extracto hacen una incisión en el ADN plasmídico y eliminan
las lesiones. Se sintetiza ADN de novo reemplazado
nucleótidos eliminados. El nucleótido radiactivo introducido en el
medio se incorpora al ADN durante esta síntesis. Después del
aislamiento del plásmido reparado por electroforesis sobre gel de
agarosa, se mide la cantidad de radiactividad incorporada, que es
proporcional a la proporción de reparación del sustrato. El
procedimiento de preparación del extracto celular y las condiciones
de reacción intervienen en la calidad de la reparación. En
particular, parece que se obtiene el mejor rendimiento de reparación
con extractos de células enteras del tipo de los utilizados para
las trascripciones in vitro, mientras que extractos
citosólicos del tipo de los utilizados para promover la replicación
plasmídica a partir de un origen SV40 así como otros extractos
celulares brutos presentan una actividad nucleásica, que no permite
una interpretación correcta de la reparación.
En las condiciones establecidas por Woo et
al., la especificidad de la reacción para lo que ce refiere al
ADN irradiado es más importante en presencia de concentración en KCl
del orden de 40-100 mM. Además, la replicación del
ADN irradiado, que tiene lugar durante la reparación es muy
dependiente de la presencia de ATP y de un sistema de regeneración
de ATP(fosfocreatina + creatina fosfoquinasa), para el
mantenimiento de una proporción constante de ATP, estando este
mantenimiento más específicamente asociado a la etapa de la
reparación. Tal dependencia no se encuentra por ejemplo en los casos
de reparación de rotura de hebra. Una muestra control, constituida
por el mismo plásmido no modificado es utilizada simultáneamente en
las mezclas de reacción.
El ensayo de Woo et al., necesita el
empleo de marcadores radiactivos, lo que implica requisitos que
limitan la realización de este procedimiento en ensayos de rutina;
además, este ensayo no presenta cualidades de simplicidad y de
practicabilidad suficientes, para su utilización de manera
rutinaria.
El procedimiento de Woo et al., ha sido
propuesto en ensayos de caracterización de extractos procedentes de
células establecidas a partir de pacientes afectados por
xeroderma pigmentosum (Satoh et al., Proc. Natl
Acd. Sci. EE.UU, 1993, 90, 6335-6339; Jones
et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 991-995;
Robins et al., EMBO J. 1991, 10, 3913-3921).
El xeroderna pigmentosum es una enfermedad multigénica,
multialélica, autosómica y recesiva. Las células procedentes de
pacientes afectados por esta enfermedad son muy sensibles a los
ultravioletas y presentan defectos en la reparación del ADN. Ocho
genes están implicados en los diferentes grupos de complementación
de esta enfermedad XPA a XPG y el grupo variante XPV. Cada grupo
posee características diferentes relativas a la reparación del ADN
y especialmente a los diferentes subtipos de REN. Las lesiones del
ADN, pertenecientes a la categoría de las pequeñas lesiones o de las
lesiones voluminosas, son reparadas de manera diferente, según el
grupo de complementación.
Otras enfermedades de la reparación (Síndrome de
Cockayne; Ataxia Telangectasia) poseen también característica
propias de reparación y han sido estudiadas por el procedimiento de
Woo et al.
B. En diferentes publicaciones, el
equipo de B. Salles y P. Calsou (Biochimie 1995, 77,
796-802; Anal. Biochem. 1995, 232,
37-42) describe un procedimiento de detección de las
lesiones del ADN realizando reacciones de escisión/resíntesis sobre
un plásmido fijado en pocillos de microplacas. El plásmido es
adsorbido en pocillos de microplacas, y modificado a
posteriori por agentes químicos. Se añaden extractos celulares
en los pocillos así como nucleótidos trifosfato marcados con
digoxigenina. El marcador es incorporado al ADN, si ha habido
escisión de lesiones, durante la etapa de resíntesis. El marcador, a
continuación es revelado en cada pocillo por un anticuerpo acoplado
a la fosfatasa alcalina. Se añade, en cada pocillo, un sustrato que
se vuelve luminiscente después de la defosforilación por la
fosfatasa alcalina. Se mide la señal luminiscente, emitida en cada
pocillo. Es proporcional a la proporción de incorporación del
marcador.
Este procedimiento también es descrito en la
solicitud Internacional WO 96/28571, cuyos autores pertenecen
también al equipo de B. Salles y P. Calsou, y que describe un
procedimiento de detección cualitativo y cuantitativo de lesiones
del ADN en el cual, se fija ADN lesionado sobre un soporte sólido y
una composición que comprende un extracto celular a ensayar y que
contienen marcadores se pone en contacto con dicho ADN lesionado
(antes o después de la fijación sobre dicho soporte sólido).
Consideran que su procedimiento permite tratar simultáneamente una
serie importante de muestras; si se hace referencia a los ejemplos,
la reparación en presencia de un extracto celular se hace en un
medio de reacción de 50 \mul, a partir de un extracto que
comprende 150 \mug de proteína, 50 mM de Kcl, 5 mM de cloruro de
magnesio, DTT, fosfocreatina, fosfocreatinaquinasa y diferentes
NTP, estando uno de ellos marcado con digoxigenina. La reparación
se obtiene después de 3 horas de incubación a 30ºC y los pocillos
son lavados con una solución de lavado que comprende un tampón
fosfato con una sal a la cual se añade un tensioactivo no iónico
(Tween 20) en una proporción del 0,05 y el 0,15% (composición
preferida: tampón fosfato 10 mM, NaCl 137 mM y Tween 20, el 0,1%).
Se precisa que este ensayo es de una gran estabilidad, en la medida
en que la detección se lleva a cabo sobre 40 ng de ADN en lugar de
200 o 300 ng, en el marco de un ensayo en solución.
El ensayo del equipo de B. Salles y P. Calsou
propone esencialmente modificar el plásmido después de la fijación
sobre el soporte sólido. Ahora bien, se sabe que entre las lesiones
creadas por numerosos agentes químicos o físicos, se encuentras las
roturas de cadenas. Ahora bien, estas roturas son reparadas muy
rápida y eficazmente por extractos celulares activos. Con este
ensayo, es por lo tanto imposible diferenciar la reparación de las
roturas y la reparación de las otras lesiones. La reparación de las
roturas puede incluso enmascarar la reparación de las otras
lesiones con las señales atribuidas a la reparación de otras
lesiones de ADN. Se trata por lo tanto de un sistema que permite la
detección de un efecto global, sin identificar las lesiones
reconocidas por los sistemas de reparación, además, este
procedimiento no tiene como objetivo detectar y cuantificar la
actividad de las proteínas implicadas en la reparación del ADN,
sino identificar la presencia de lesiones en el ADN tratado.
Se han propuesto variantes del procedimiento de
Wood et al., y permiten especialmente medir únicamente la
actividad de incisión de las lesiones:
A. Redaelli et al., (Terat
Carcinog. Mut., 1998, 18, 17-26) describen un
procedimiento en el cual el plásmido es incubado directamente con
el extracto sin los nucleótidos trifosfato. Los cortes en el
plásmido superenrollado provocan un cambio en la velocidad de
migración en el gel de agarosa durante la electroforesis. El
plásmido superenrollado migra más rápidamente que el plásmido
cortado, debido a su conformación. Las bandas que corresponden a
las diferentes formas del plásmido son cuantificadas; la cantidad de
la forma cortada se correlaciona con la actividad de incisión de
las lesiones del plásmido, contenidas en el extracto.
De manera más precisa, este artículo estudia la
acción de incisión de la AP-endonucleasa, que
interviene en un sitio abásico, obtenido después de la acción de
una glicosilasa específica de la modificación a reparar
(alquilación, desaminación hidrolítica, oxidación,
desemparejamiento, escindiendo el enlace desoxiribósico
fosfodiéster en 3' o en 5' de este sitio abásico. En este artículo,
la actividad AP-endonucleasa se estudia más
específicamente en un extracto bruto de linfocitos humanos. El
extracto (80 \mul) es incubado por una parte con un plásmido no
dañado (control) y por otra parte con un plásmido depurinado. La
cuantificación de la actividad AP-endonucleasa se
revela así posible, en la medida en que la actividad de incisión es
dependiente del daño y sensible a EDTA.
B. El equipo de P. Calsou y B.
Salles (Biochem. Biophys. Res. Com., 1994, 202,
788-795) propone otro enfoque de la medición
específica de la actividad de incisión de las lesiones de un
plásmido. Introducen en el medio de reparación un inhibidor
específico de las polimerasas eucoariotas, la afidicolina, para
impedir la resíntesis por las polimerasas endógenas de los
fragmentos de ADN normal después de la primera etapa de escisión.
Una polimerasa procariota exógena se mezcla con el medio de reacción
en cantidad equivalente para todos los tubos. Las diferencias en
los resultados obtenidos son de este modo el reflejo de la etapa de
escisión de las lesiones y no de la resíntesis de los fragmentos de
ADN escindidos.
C. Otro procedimiento basado en
una modificación del ensayo de los cometas (electroforesis sobre gel
en medio alcalino de una sola célula) permite medir la actividad de
incisión. Ha sido desarrollado por Collins et al.,
(Mutagenesis, 2001, 16, 297-301). Se introducen
lesiones oxidativas en el ADN genómico por fotosensibilización de
célula HeLa en presencia de luz visible. Las células son a
continuación incorporadas en un gel de agarosa extendido sobre una
lámina de microscopio, y a continuación las membranas celulares y
las proteínas son eliminadas por lisis medida. Los nucleótidos
aislados en el gel son incubados en presencia de extractos celulares
que son activos para la primera etapa de incisión de las lesiones.
Las láminas son a continuación sometidas a una electroforesis en
medio alcalino. La presencia de corte induce una migración del ADN
más rápida que el conjunto nucleótido. El ovillo de ADN toma
entonces el aspecto de un cometa, estando el ADN íntegro en la
cabeza y el ADN que contiene cortes en la cola del cometa. El
porcentaje de ADN en la cola del cometa determinado por software
especializado, está directamente correlacionado con la actividad de
incisión contenida en los extractos utilizados para las lesiones
consideradas. Este ensayo se ha aplicado a la medida de las
actividades de escisión de los daños oxidativos en extractos
procedentes de linfocitos humanos. Respecto del procedimiento
descrito por Redaelli et al., 1998, que mide el corte de los
plásmidos, el procedimiento de Collins et al., pone en
práctica el procedimiento de los cometas para estimar los cortes de
hebra y considera que esta variante es por una parte
significativamente más sensible (detección de aproximadamente 0,2 a
2 cortes por 10^{9} daltones) y por otra parte económicamente
interesante (ahorros en el material utilizado), en la medida en que
el volumen de mezcla de reacción (ADN incluido en un gel) es
solamente de 50 \mul y que se obtiene suficientemente material a
ensayar a partir de 10 ml de sangre (posibilidad de realizar varias
incubaciones).
D. La Solicitud Internacional WO
01/90408 describe un procedimiento de detección y de
caracterización de actividades de proteínas implicadas en la
reparación de lesiones del ADN.
De manera más precisa este procedimiento
comprende la fijación sobre un soporte sólido de al menos un ADN
dañado que comprende al menos una lesión conocida; este ADN dañado
se somete a continuación a la acción de una composición de
reparación que contiene o no al menos una proteína que interviene
para la reparación de este ADN dañado y la determinación de la
actividad de esta proteína para la reparación midiendo la variación
de una señal emitida por un marcador que se fija sobre o se elimina
del soporte durante la etapa anterior.
Este sistema, que se aplica con un ADN dañado
que se presenta en forma de un oligonucleótido de 15 a 100 bases o
de un polinucleótido de 100 a 20.000 bases permite de este modo,
acceder a una información más global que los otros ensayos, puesto
que la escisión de diversos sustratos puede ser seguida
simultáneamente.
Sin embargo, este procedimiento se refiere a la
puesta en evidencia de actividades de incisión de lesiones de ADN.
De este modo se limita a la caracterización de la etapa de escisión
de lesiones que pueden ser introducidas en oligonucleótidos de
síntesis. Por otra parte, aunque da informaciones importantes sobre
las actividades de escisión, no está adaptado y no describe una
cuantificación precisa de las actividades de escisión/resíntesis
del ADN.
Además de los inconvenientes particulares de
cada técnica, indicados anteriormente, estos diferentes
procedimientos presentan también los siguientes inconvenientes:
- -
- Todos los ensayos descritos anteriormente necesitan la utilización de cantidades de material biológico y especialmente de extractos celulares superiores a 10 \mul: el volumen de reacción generalmente utilizado es de 50 \mul que comprende de 10 a 40 \mul de extracto para una cantidad de proteínas de aproximadamente 100 \mug. Los extractos son largos de preparar, la cantidad de células disponibles es a menudo reducida; lo que limita el número de ensayos realizables.
- -
- Sea cual sea el procedimiento de detección utilizado y que el ensayo sea efectuado en solución o sobre soporte, todos los sistemas escritos dan una información sobre la reparación punto por punto limitada a un sustrato dado para una fracción alícuota de extracto, en efecto, en los ensayos de determinación de capacidades de reparación tales como los propuestos por Wood et al., por ejemplo, cada ensayo es realizado individualmente en un tubo, es decir que una reacción se hace en presencia de un plásmido dado y de un extracto dado. Para cada extracto a ensayar, se compara la proporción de incorporación del marcador en el plásmido respecto de la proporción de incorporación de marcador obtenida en un sustrato preparado de manera idéntica en presencia del extracto control. El extracto control de referencia está generalmente preparado a partir de células caracterizadas transformadas por EBV o SV40. Lo mismo ocurre en la mayoría de las otras variantes del procedimiento de Woo et al., descritas anteriormente.
- -
- Al ser los ensayos relativamente arduos de realizar y requiriendo la disponibilidad de grandes cantidades de material biológico, los experimentadores limitan el número de sustratos utilizados y el número de extractos biológicos ensayados.
- -
- Las lesiones introducidas en los plásmidos no son ni medidas ni cuantificadas. Los autores, que utilizan el ensayo desarrollado por Wood et al.,, eliminan únicamente los plásmidos que han perdido su forma superenrollada para eliminar el ADN que comprende roturas de cadenas. Las informaciones obtenidas son muy parciales e insuficientes para definir y caracterizar precisamente las capacidades de reparación de un medio biológico dado.
Por consiguiente, el Solicitante se ha propuesto
como objetivo paliar los inconvenientes de la técnica anterior,
especialmente proponiendo un procedimiento que permite caracterizar
y cuantificar las actividades enzimáticas de escisión/resíntesis de
reparación del ADN en extractos biológicos de una manera rápida,
precisa, miniaturizada y eficaz y esto sin la utilización de
soluciones de reparación de control.
La presente invención tiene como objeto un
procedimiento de evaluación cuantitativa de las capacidades globales
y específicas de reparación del ADN de al menos un medio biológico,
dicho procedimiento se caracteriza porque comprende las siguientes
etapas:
- (a)
- la preparación de una gama de plásmidos que comprenden cada uno lesiones distintas del ADN, por tratamiento independiente de dichos diferentes plásmidos por al menos un agente físico y/o químico y recuperación de la fracción superenrollada de cada uno de dichos plásmidos; la selección de las fracciones superenrolladas permite excluir las roturas de hebras y evitar la acción de las nucleasas,
- (b)
- la caracterización de las lesiones presentes en cada uno de los plásmidos de dicha gama de plásmidos,
- (c)
- el depósito de diferentes plásmidos de dicha gama de plásmidos y de al menos un plásmido superenrollado control sin lesiones sobre un soporte sólido único, según un esquema A preestablecido, para formar un soporte funcionalizado dividido en distintas zonas A_{1} a A_{x} correspondientes a un número entero igual al número de medios biológicos a ensayar simultáneamente, comprendiendo cada zona A_{1} a A_{x} dicha gama de plásmidos; por consiguiente, las diferentes preparaciones de plásmidos de dicha gama de plásmidos modificados son depositados en un mismo soporte sólido en lugares definidos y localizados. Al menos un control constituido por un plásmido superenrollado sin lesiones del ADN se deposita conjuntamente.
- (d)
- la incubación de dicho soporte funcionalizado obtenido en la etapa (c) con diferentes soluciones de reparación que comprenden cada una al menos un medio biológico susceptible de contener actividades enzimáticas de reparación, ATP, un sistema de regeneración de ATP, un nucleótido trifosfato marcado y cualquier otro componente necesario para la actividad de las enzimas de reparación presentes en dicho medio biológico, preferiblemente a una temperatura de 30ºC durante 1 a 5 horas, estando preferiblemente durante 3 horas cada una de dichas soluciones de reparación depositadas previamente a dicha incubación, en cada una de dichas zonas A_{1} a A_{x} distintas y preestablecidas de dicho soporte funcionalizado,
- (e)
- al menos un lavado de dicho soporte funcionalizado,
- (f)
- la medición directa o indirecta de la señal producida por el marcador incorporado en el ADN durante la reacción de la reparación de la etapa (d), en cada una de dichas zonas A_{1} a A_{x} distintas y preestablecidas,
- (g)
- el registro y la cuantificación de la señal correspondiente a cada depósito de plásmido en cada zona A_{1} a A_{x} y
- (h)
- la determinación de la relación de las señales de los plásmidos que comprenden las lesiones respecto del plásmido control depositado conjuntamente.
Tal procedimiento según la invención presenta un
cierto número de ventajas:
- -
- Permite detectar un efecto global, identificando las diferentes lesiones, por el hecho de la posibilidad de evaluar simultáneamente la reparación de diferentes tipos de lesiones.
- -
- Permite la determinación de las capacidades de escisión y/o de escisión/resíntesis de un extracto biológico sin recurrir a la comparación con un medio biológico control. En efecto, los resultados obtenidos por la realización del procedimiento con una sola muestra de extractos biológicos son suficientes para atribuir una eficacia de reparación al extracto respecto de las lesiones precisas y cuantificadas.
- -
- Está particularmente bien adaptado al estudio de diversos medios biológicos y constituye un buen reflejo de la situación in vivo.
- -
- El procedimiento según la invención permite "cartografiar" un medio biológico dado para sus actividades enzimáticas de reparación del ADN. Permite identificar un extracto biológico en función del mapa obtenido.
- -
- Permite determinar las proteínas de la reparación deficientes o parcialmente deficientes en un extracto biológico dado y por lo tanto servir de ensayo diagnóstico.
- -
- El procedimiento según la invención permite, además, la comparación de los rendimientos de diferentes extractos biológicos para la reparación de las lesiones del ADN.
- -
- No utiliza isótopo radiactivo.
- -
- Al estar miniaturizado, permite obtener numerosas informaciones a partir de cantidades muy reducidas de material biológico.
- -
- Es automatizable.
Según una realización ventajosa de dicho
procedimiento, los plásmidos preparados en la etapa (a) son elegido
entre los que poseen una forma de doble hebra superenrollada
/pBR322, m13,pUC, etc...).
La forma superenrollada del plásmido se obtiene
por purificación utilizando técnicas conocidas como, por ejemplo,
los kits de purificación de plásmido Qiagen. Es preferible, además,
limitar la presencia de formas no deseadas de plásmido efectuando
otras etapas de purificación, como por ejemplo la centrifugación
sobre cloruro de cesio y/o sobre gradiente de sacarosa.
Según otra realización ventajosa de la etapa (a)
de dicho procedimiento, los diferentes agentes físicos, biológicos
o químicos aptos para inducir una lesión del ADN se eligen entre los
que inducen preferiblemente: la formación de una lesión única, la
formación de un número limitado de lesiones o la formación de
diferentes lesiones pertenecientes a una misma familia.
Se pueden mencionar, por ejemplo, familias de
lesiones: las lesiones oxidativas, los fotoproductos inducidos por
los ultravioletas B o C, lo aductos químicos, las etnobases, los
sitios abásicos y las roturas de ADN.
Los agentes físicos y químicos son, por ejemplo,
elegidos entre los que funcionan principalmente:
- -
- por un mecanismo de fotosensibilización tipo II: el oxígeno singuleto tiene como diana principal la guanina; en este caso, la lesión muy mayoritaria formada es la 8-oxoguanina (Ravanat et al., Chem. Res. Tox., 1995, 8, 379.388).
- -
- por un mecanismo de fotosensibilización de tipo I o por un mecanismo que libran el radical OHº, en este caso, las lesiones del ADN obtenidas son lesiones oxidativas; estas lesiones afectan, de manera equivalente, a las bases púricas y las bases pirimídicas del ADN. Se pueden mencionar entre estas lesiones, la 8-oxoguanina, los glicoles, de timina, la fapiguanina, la fapiadenina, el hidroximetiluracilo, la 5-hidroximetilcitosina, el formiluracilo (Cadet et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharm., 1997, 31, 1,87).
- -
- Por un mecanismo de transferencia de energía de tipo, tripleto-tripleto; en este caso, las principales lesiones formadas son dimeros de pirimidina de tipo ciclobutano (Costalat et al., Photochem. Photobiol., 1990,51, 255-262).
- -
- Liberando energía absorbida directamente por las bases del ADN como los ultravioletas B o C. Los enlaces formados son los dimeros de pirimidina de tipo ciclobutano, los fotoproductos (6-4) y el isómero de Valence Dewar (Douki et al., J. Biol.. Chem. 200, 275, 11678-11685).
- -
- Liberando oxígeno singuleto. Estos agentes pertenecen, por ejemplo, a la familia de los endoperoxidos. La lesión formada es en este caso la 8-oxoguanina (Ravanat et al., J. Biol.. Chem. 2001, 276 40601-40604).
Los agentes químicos se eligen entre los que
inducen modificaciones de bases conocidas pertenecientes entre
otras a la familia de los carcinógenos. Se pueden mencionar, por
ejemplo: el acetilaminofluoreno (Hess et col 1996, Nuclei
Acid Res. 24, 824-828), la cisplatina (Pashesva
et col 2002, Int J. Biochem. Cell. Biol.., 34,
87-92) Int, los benzopirenos (Laws et col.,
2001, Mut. Res., 484, 3-18), el posraleno (Zhang
et col. Mol. Cell. Biol., 2002, 22,
2388-2397), el cloroacetaldehído
(CAA-Wang et col. 202, 13,
1149-1157), el tamixofeno (et col. 1997,
Chem, Res. Tox., 10, 189-196) y el
trans-2,4-decadienal
(DDE-Carbalho et col 1998, Chem. Res.Tox.,
11, 1042-1047).
Según otra realización ventajosa de la etapa
(a) de dicho procedimiento, diferentes agentes son aplicados en
cada plásmido de dicha gama de plásmidos.
Según otra realización ventajosa de la etapa (b)
de dicho procedimiento, la caracterización de las lesiones
comprende (i) la toma de una fracción de cada plásmido lesionado,
(ii) la digestión de cada una de dichas fracciones por enzimas que
liberan los nucleósidos del ADN, y a continuación (iii) el análisis
del resultado de la digestión utilizando una combinación de
técnicas separativas acopladas a una técnica analítica
cuantitativa.
Según una disposición ventajosa de esta
realización, la digestión se lleva a cabo con la ayuda de al menos
una de las siguientes enzimas: la fosfodiesterasa de bazo de
ternera, la nucleasa P1, la fosfodiesterasa de veneno de serpiente,
y la fosfatasa alcalina (Douki et al., J. Biol.. Chem., 2000,
275, 11678-11685).
Según otra disposición ventajosa de esta
realización, el resultado de la digestión enzimática es analizado
por una de las siguientes técnicas: Cromatografía líquida de alto
rendimiento (CLAR) acoplada acoplada a la espectrometría de masa en
Tándem (Douki et col. 2000, J. Biol.. Chem., 275,
11678-11685; Sauvagio et col, 2001,
Photochem. Photobiol., 73, 230-237; Frelon et
col., chem. Res. Tox., 2000, 13, 1002-1010), por
CLAR acoplada a la Cromatografía Gaseosa (Wang et col. 200.
13, 1149-1157; Pouget et col,. 2000, Chem
Res. Rox., 13, 541-549) o bien por CLAR acoplada a
una detección electroquímica (Pouget et col., 2000. Chem.
Res. Tox., 13, 541-549).
Según otra realización ventajosa de dicho
procedimiento, previamente a la etapa (c), las formas enrolladas de
los plásmidos obtenidos en la etapa (a) son purificadas,
preferiblemente por centrifugación sobre gradiente de sacarosa y/o
sobre gradiente de cloruro de cesio.
Según otra realización ventajosa de dicho
procedimiento, igualmente previamente a la etapa (c), cada uno de
los plásmidos de la gama de plásmidos se diluye a una concentración
comprendida entre 5 y 100 \mug/ml, en un tampón de dilución que
comprende, preferiblemente, un tampón de pH comprendido entre 6,5 y
8,0, eventualmente asociado a una sal y a un tensioactivo no
iónico; preferiblemente, dicho tampón es un tampón fosfato 10 mM o
un tampón SSC, que puede contener CaCl de 0,05 M a 0,5 M.
Los diferentes plásmidos se depositan
preferiblemente con la ayuda de un robot destinado a la fabricación
de las micromatrices, es decir que los volúmenes depositados están
comprendido preferiblemente entre 100 y 1000 picolitros.
Según una realización ventajosa de la etapa (c)
de dicho procedimiento, dicho soporte es un soporte sensibilizado,
de manera a aumentar su afinidad por el ADN, seleccionado en el
grupo constituido por materiales orgánicos o inorgánicos elegidos
entre el vidrio, el silicio y sus derivados y los polímeros
sintéticos o no (membranas de nylon o nitrocelulosa), y cuya
superficie está eventualmente funcionalizada; preferiblemente, dicho
soporte está constituido por láminas de vidrio recubiertas de
poli-L-lisina que adsorben el ADN o
láminas de vidrio funcionalizadas por grupos epoxi que forman
enlaces covalentes con el ADN.
Si fuese necesario, se realizan tratamientos
para aumentar la fijación del ADN sobre su soporte. Estos
tratamientos no deben crear lesiones suplementarias sobre el ADN
depositado.
Un soporte tipo según la invención que lleva
zonas A_{1} a A_{x}, comprendiendo cada zona el conjunto de la
gama de plásmidos comprende en cada una de dichas zonas:
- -
- al menos un depósito de plásmido testigo, y
- -
- un depósito de plásmido que contiene fotoproductos, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contienen daños oxidativos, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contiene etenobases, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contienen roturas del ADN, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contiene aductos de agente cancerígeno.
Conforme a la etapa(d) del procedimiento
según la invención:
- -
- el extracto biológico puede ser preparado a partir del medio biológico, según el procedimiento de Manley et col., 1983, Methods Enzymol. 101, 568-582 o según el procedimiento de Biade et col., J. Biol.. Chem., 1998, 273. 898-902, o según cualquier otro procedimiento susceptible de proporcionar un medio que contiene proteínas de la reparación.
- -
- El marcador es seleccionado entre las moléculas de afinidad, los compuestos fluorescentes, anticuerpos o biotina; preferiblemente el marcador o el revelador de marcador se elige especialmente n el grupo constituido por compuestos fluorescentes de fluorescencia directa (Cy-3 o el Cy-5) o indirecta (biotina o la digoxigenina).
- -
- El soporte se incuba a continuación a una temperatura que favorece la reacción de reparación, preferiblemente, a 30ºC durante un tiempo comprendido entre una y cinco horas, preferiblemente durante tres horas.
Según una realización ventajosa de la etapa (e)
del procedimiento según la invención, el soporte es lavado al menos
una vez con la ayuda de una solución salina que contiene un
tensioactivo no iónico, especialmente un tampón fosfato 10 mM, que
contiene Tween 20, a continuación se enjuaga con agua al menos una
vez.
Conforme a la etapa (f) del procedimiento según
la invención, la medición de la señal se realiza mediante un
procedimiento apropiado para el marcado; por ejemplo, si el marcador
es un fluoróforo, se procede a la medición directa de las señales
fluorescentes emitidas por los diferentes depósitos del soporte.
Según otra realización ventajosa de la etapa (g)
del procedimiento según la invención, dichas señales se cuantifican
con la ayuda de un aparato capaz de excitar el marcador,
preferiblemente un fluoróforo y medir la señal emitida tras la
excitación.
La medición de la señal se realiza por una
instrumentación adaptada al soporte y al marcador utilizado. Se
podrá utilizar un escáner para el análisis de imagen en
fluorescencia, preferiblemente en excitaciones láser a la longitud
de onda específica del marcador empleado.
Según una realización ventajosa de la etapa (h)
del procedimiento según la invención, se establece una relación
numérica entre las señales obtenidas con los plásmidos que contienen
las lesiones y la señal obtenida con el plásmido control situado en
el mismo soporte.
Según la invención, se obtiene de este modo un
perfil de reparación de un medio biológico dado.
Este perfil de reparación puede servir para
determinar las capacidades de reparación global y específica de un
medio, parta diagnosticar una enfermedad ligada a la reparación,
para evaluar la influencia de un tratamiento físico o químico
(producto genotóxico, por ejemplo) sobre las capacidades de
reparación de un medio dado.
Por consiguiente, la presente invención tiene
igualmente como objeto la utilización del procedimiento tal como se
ha definido anteriormente:
- -
- para el establecimiento del perfil de reparación de un medio biológico,
- -
- para el diagnóstico de una enfermedad ligada a una reparación
- -
- para evaluar la influencia de un tratamiento físico o químico sobre las capacidades de reparación de un medio biológico dado,
- -
- para el cribado de sustancias capaces de modular el sistema de reparación de un medio biológico.
Además de las disposiciones que anteceden, la
invención comprende también otras disposiciones que se desprenderán
de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de
realización del procedimiento objeto de la presente invención así
como a los dibujos anexos, en los cuales:
- la figura 1 ilustra un
ejemplo de configuración de soporte sólido; se observa un plano de
depósito en nueve zonas;
- la figura 2 representa el
plano de depósito de cada zona; y
- la figura 3 representa un
diagrama de reparación - cartografía de reparación asociado a cada
línea celular que ha servido para preparar el extracto utilizado
para la reacción de reparación.
Se ha de entender, toda vez, que estos ejemplos
s dan únicamente a título ilustrativo del objeto de la invención,
no siendo en modo alguno limitativos.
El plásmidos pBluescript II es producido por
transformación de las células "XL1-Blue MRF
supercompetent cells" de Statagène según el protocolo
proporcionado por Stratagène.
El plásmido se purifica a continuación
utilizando el kit Qiagen plasmid midi, siguiendo el protocolo
preconizado.
El plásmido es depositado en 10 ml de gradiente
de sacarosa al 5-20% en un tampón Tris HCl 25 mM pH
7,5; NaCl 1 M; EDTA 5 mM y se centrífuga en una ultracentrifugadora
Beckman utilizando un rotor SW-41, a 4ºC a 25.000
rpm durante 18 horas. Se toma delicadamente a continuación
fracciones de 1 ml y se analizan sobre gel de agarosa. No se guarda
más que las fracciones que contienen al menos el 90% de forma
enrollada del plásmido. El plásmido se precipita con etanol y se
disuelve en PBS.
- -
- Irradiación UVC - Formación de dimeros de pirimidina de tipo ciclobutano (CPD) y de fotoproductos (6-4)
El plásmido diluido a 20 \mug/ml en un PBS es
irradiado utilizando una lámpara germicida Bioblock equipada con
dos neones de 15 vatios. Tres preparaciones de plásmidos son
irradiadas respectivamente a 0,06; 0,12 y 0,2 J/cm^{2}.
- -
- Tratamiento con Cloroacetaldehído (CCA-Signa) - formación de malondialdehído - desoxiguanina (MDA - dG)
Al plásmido, preparado a 1 mg/ml en PBS, se
añade un volumen equivalente de CAA (el 50% en H_{2}O). Se
incuba esta solución una noche a 37ºC. El plásmido se recupera por
precipitación y se purifica sobre gradiente de sacaro-
sa.
sa.
- -
- Tratamiento con tran- trans- 2,4-decadienal (DDE-Sigma)-Formación de etenoguanosina y de etenoadenosina
A 200 \mul de plásmido preparado en agua a 1
mg/ml, se añade un volumen equivalente de tampón
carbonato/bicarbonato 0,2 M pH 9,2 y un volumen equivalente de THF.
Se añade entonces 4 \mul de DDE y 12 \mul de H_{2}O al 30%.
La solución se incuba 2 horas a 50ºC en la oscuridad. El DDE se
elimina mediante dos extracciones con diclorometano. El ADN se
precipita y a continuación se purifica sobre gradiente de
sacarosa.
- -
- Tratamiento con endoperóxido DHPNO_{2} - Formación de 8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG).
20 \mul de la solución de endoperóxido
(1,4-endoperóxido de N,
N',-di(2,3-dihidroxipropil)-1,4-naftalenodipropanamida,
preparado según el protocolo descrito en J. Biol.. Chem. 2000, 275,
40601-40604 se incuban con 200 \mul de plásmido
diluido en PBS a 1 mg/ml durante 2 horas a 37ºC. El plásmido, a
continuación se precipita y se purifica sobre gradiente de
sacarosa.
Una fracción de ADN plasmídico o de ADN de timo
de ternero en las mismas condiciones es tomada para el análisis de
la composición en bases modificadas.
El ADN es digerido como se describe en Douki
et al., J. Biol. . Chem, 275, 11678-11685, y
a continuación se realiza el análisis por
HPC-acoplada a la espectrometría de masa en
tándem.
Se obtiene la siguiente cantidad de lesiones
para 10^{4} bases normales:
\vskip1.000000\baselineskip
Se constata que los tratamientos provocan la
formación de lesiones en proporciones muy diferentes:
- -
- Los UVC provocan en muy gran medida la formación de dimeros de pirimidina de tipo ciclobutano (CPD) y minoritariamente de fotoproductos (6-4),
- -
- El DDE provoca la formación mayoritaria del eteno-desoxiguanosina,
- -
- El endoperóxido provoca la formación muy mayoritaria de 8-oxo-2'-desoxiguanosina.
Se observa que estos agentes permiten inducir la
formación mayoritaria de lesiones específicas que se refieren a
familias precisas de enzimas de reparación.
Los plásmidos son diluidos en PBS a 20
\mug/ml. Se efectúan depósitos de 500 picolitros con la ayuda de
un robot GESIM, sobre láminas de vidrio comerciales recubiertas de
poli-L-lisina (VWR). Las láminas son
conservadas a
4ºC.
4ºC.
Cada lámina (soporte S) comprende 9 zonas (A1 a
A9) idénticas dispuestas según el esquema A de la figura 1.
En cada zona, la gama de los plásmidos está
depositada según la figura 2, que ilustra por ejemplo la zona
A1.
Cada zona permite ensayar un medio biológico
diferente.
Se prepara una solución que contiene el medio o
extracto biológico a ensayar; para 5 \mul de solución, la
composición es la siguiente:
- -
- extracto 0,5 \mul,
- -
- tampón de reparación 5 x 1 \mul
- -
- CY5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech) 0,2 \mul (0,1 nmol/\mul)
- -
- KCI 2M 0,2 \mul
- -
- ATP (Roche - 100 mM) o,1 \mul
Se completa a 5 \mul con H_{2}O.
Hepes/KOH 220 Mm pH 7,8; MgCl_{2} 35 mM; DTT
2,5 mM; dATP 2 \muM, dGTP 2\muM; dCTP 2 \mu; Fosfocreatina 50
mM; Creatina fosfoquinasa 250 \mug/ml; BSA 0,5 mg/ml; glicerol al
17%.
El ejemplo se realiza con tres extractos
diferentes procedentes de líneas celulares diferentes:
- -
- Línea 1: se trata de células HeLa. Los extractos son extractos nucleares comerciales y proceden de la sociedad 4C Biotech (Bélgica). Han sido preparados por el procedimiento de Dignam et al, (Nucl. Ac. Res. 1983, 11, 1475-1489). Su contenido en proteínas es de 24 mg/ml.
- -
- Linea 2: se trata de una línea de células AS203 establecidas a partir de un paciente afectado de xeroderma pigmentosum de grupo de complementación D. Los extractos han sido preparados según el protocolo de Manley et al. La dosificación de las proteínas por el kit micro BCA kit permite evaluar la cantidad de proteínas a 44 mg/ml.
- -
- Línea 3: se trata de células XP12RO. Esta línea ha sido establecida a partir de un paciente afectado de xeroderma pigmentosum de grupo de complementación A. Los extractos han sido preparados según el protocolo de Manley et al., (Methods Enzymol., 1983, 101, 568-582). El extracto obtenido contiene 36 mg/ml de proteínas (dosificación micro BCA kit, Interchim).
Se depositan 3 \mul de cada solución de
reparación sobre el conjunto de los depósitos de una sola zona de la
lámina. La lámina es incubada a 30ºC, con humedad, durante 3 horas.
La lámina es lavada 3 veces durante 10 minutos en un tampón PBS que
contiene el 0,1% de Tween 20. A continuación es lavada en H_{2}O
durante 15 minutos. Después del secado, se procede a la lectura de
fluorescencia.
Después de la reacción de reparación, la
fluorescencia de los diferentes depósitos de cada zona es analizada
mediante un escáner Axon a 635 nm y el software de análisis GenelPix
Pro. Se realiza a continuación una media sobre tres puntos
idénticos. Se obtiene de este modo un valor para cada tipo de
modificación. Se traza un diagrama para cada línea celular. Este
diagrama corresponde a una cartografía de los sistemas de reparación
asociados a las lesiones presentes sobre el soporte o chip y es
específica del extracto utilizado. Los resultados obtenidos son
presentados en la figura 3. El nivel de fluorescencia es dado en
Unidades Arbitrarias (AU).
Se observa que cada diagrama es único y
específico de la línea celular que ha servido para preparar el
extracto celular. Puede por consiguiente servir para caracterizar
precisamente las actividades globales de reparación de un extracto
celular dado y es revelador de la funcionalidad de los sistemas
apuntados.
Se observa que la línea HeLa repara dos veces
más eficazmente las lesiones inducidas por el DDE (mayoritariamente
eteno-dG) que por los UV (mayoritariamente CPD y
(6-4)). Se observa que los daños oxidativos
(mayoritariamente 8-oxo-dG) son
reparados mucho más reducidamente.
Para la línea AS203, se observa un nivel de
reparación más elevado, aunque reducido, para las lesiones
UV-inducidas.
En lo que respecta a la línea XP12RO, se observa
que son las lesiones inducidas por el DDE las que son reparadas más
eficazmente (mayoritariamente eteno-dG), dando una
señal tres veces más elevadas que en el caso de UV C. Se sabe que
las líneas XPA no reparan los CPD; se puede de este modo atribuir
las señales obtenidas con el ADN irradiado en UVC, a la reparación
de fotoproductos (6-4).
Una ventaja no esperada de la invención es que,
incluso si la cantidad de proteína es diferente de un extracto a
otro, la relación obtenida entre las señales de los ADN que
comprenden las lesiones y el ADN control para un extracto dado,
puede ser utilizado para comparar las capacidades de reparación de
los diferentes extractos entre sí.
Claims (21)
1. Procedimiento de evaluación
cuantitativa de las capacidades globales y específicas de reparación
del ADN de al menos un medio biológico, dicho procedimiento se
caracteriza porque comprende las siguientes etapas:
- (a)
- la preparación de una gama de plásmidos que comprenden cada uno lesiones distintas del ADN, por tratamiento independiente de dichos diferentes plásmidos por al menos un agente físico y/o químico y recuperación de la fracción superenrollada de cada uno de dichos plásmidos;
- (b)
- la caracterización de las lesiones presentes en cada uno de los plásmidos de dicha gama de plásmidos,
- (c)
- el depósito de diferentes plásmidos de dicha gama de plásmidos y de al menos un plásmido superenrollado control sin lesiones sobre un soporte sólido único, según un esquema A preestablecido, para formar un soporte funcionalizado dividido en distintas zonas A_{1} a A_{x} correspondientes a un número entero igual al número de medios biológicos a ensayar simultáneamente, comprendiendo cada zona A_{1} a A_{x} dicha gama de plásmidos;
- (d)
- la incubación de dicho soporte funcionalizado obtenido en la etapa (c) con diferentes soluciones de reparación que comprenden cada una al menos un medio biológico susceptible de contener actividades enzimáticas de reparación de ATP, un sistema de regeneración de ATP, un nucleótido trifosfato marcado y cualquier otro componente necesario para la actividad de las enzimas de reparación presentes en dicho medio biológico, preferiblemente a una temperatura de 30ºC durante 1 a 5 horas, estando preferiblemente durante 3 horas cada una de dichas soluciones de reparación depositadas, previamente a dicha incubación, en cada una de dichas zonas A_{1} a A_{x} distintas y preestablecidas de dicho soporte funcionalizado,
- (e)
- al menos un lavado de dicho soporte funcionalizado,
- (f)
- la medición directa o indirecta de la señal producida por el marcador incorporado en el ADN durante la reacción de la reparación de la etapa (d), en cada una de dichas zonas A_{1} a A_{x} distintas y preestableci- das,
- (g)
- el registro y la cuantificación de la señal correspondiente a cada depósito de plásmido en cada zona A_{1} a A_{x} y
- (h)
- la determinación de la relación de las señales de los plásmidos que comprenden las lesiones respecto del plásmido control depositado conjuntamente.
2. Procedimiento según la reivindicación,
caracterizado porque los plásmidos según la etapa (a) son
elegidos entre los que poseen una forma de doble hebra
superenrollada.
3. Procedimiento según la reivindicación 1
o la reivindicación 2, caracterizado porque en la etapa (a)
de dicho procedimiento, los diferentes agentes físicos o químicos
aptos `para inducir una lesión del ADN son elegidos entre los que
inducen preferiblemente: la formación de una lesión única, la
formación de un número limitado de lesiones o la formación de
diferentes lesiones pertenecientes a una misma familia.
4. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en la etapa
(a) de dicho procedimiento, diferentes agentes son aplicados sobre
cada plásmido de dicha gama de plásmidos.
5. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa
(b) de dicho procedimiento, la caracterización de las lesiones
comprende (i) la toma de una fracción de cada plásmido lesionado,
(ii) la digestión de cada una de dichas fracciones por enzimas que
liberan los nucleósidos del ADN, y a continuación (iii) el análisis
del resultado de la digestión utilizando una combinación de técnicas
separativas acopladas a una técnica analítica cuantitativa.
6. Procedimiento según la reivindicación
5, caracterizado porque la digestión se lleva a cabo con la
ayuda de al menos una de las siguientes enzimas: la fosfodiesterasa
de bazo de ternero, la nucleasa P1, la fosfodiesterasa de veneno de
serpiente, y la fosfatasa alcalina.
7. Procedimiento según la reivindicación 5
o la reivindicación 6, caracterizado porque el resultado de
la digestión enzimática es analizado por uno de los siguientes
procedimientos: Cromatografía Líquida de alto Rendimiento (CLAR)
acoplada a la espectrometría de masa en Tándem, por CLAR acoplada a
la Cromatografía Gaseosa o por CLAR acoplada a una detección
electroquímica.
8. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque previamente
a la etapa (c), las formas enrolladas de los plásmidos obtenidos en
la etapa (a) son purificadas por centrifugación sobre gradiente de
sacarosa y/o sobre gradiente de cloruro de cesio.
9. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque igualmente
previamente a la etapa (c), cada uno de los plásmidos de la gama de
plásmidos se diluye a una concentración comprendida entre 5 y 100
\mug/ml, en un tampón de dilución que comprende, preferiblemente,
un tampón de pH comprendido entre 6,5 y 8,0, eventualmente asociado
a una sal y a un tensioactivo no iónico;
10. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque en la etapa
(c) de dicho procedimiento, los volúmenes de los depósitos de la
gama de plásmidos están comprendido preferiblemente entre 100 y
1000 picolitros.
11. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque en la etapa
(c) de dicho procedimiento, dicho soporte es un soporte
sensibilizado, de manera a aumentar su afinidad por el ADN,
seleccionado en el grupo constituido por materiales orgánicos o
inorgánicos elegidos entre el vidrio, el silicio y sus derivados y
los polímeros sintéticos o no, y cuya superficie está eventualmente
funcionalizada;
12. Procedimiento según la reivindicación 11
caracterizado porque dicho soporte está constituido por
láminas de vidrio recubiertas de
poli-L-lisina que adsorben el ADN o
láminas de vidrio funcionalizadas por grupos epoxi que forman
enlaces covalentes con el ADN.
13. Procedimiento según la reivindicación 11
o la reivindicación 12, caracterizado porque dicho soporte
comprende zonas distintas A_{1} a A_{x}, comprendiendo cada una
de dichas zonas:
- -
- al menos un depósito de plásmido testigo, y
- -
- un depósito de plásmido que contiene fotoproductos, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contienen daños oxidativos, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contiene etenobases, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contienen roturas del ADN, y/o
- -
- un depósito de plásmido que contiene aductos de agente cancerígeno.
14. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque en la etapa
(e) del procedimiento según la reivindicación 1, el soporte es
lavado al menos una vez con la ayuda de una solución salina que
contiene un tensioactivo no iónico, especialmente un tampón fosfato
10 mM, que contiene Tween 20, a continuación se enjuaga con agua al
menos una vez.
15. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque en la
etapa (f) del procedimiento según la reivindicación 1, la medición
de la señal se realiza mediante un procedimiento apropiado para
dicho marcador;
16. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque en la
etapa (g) del procedimiento según la reivindicación 1, dichas
señales se cuantifican con la ayuda de un aparato capaz de excitar
el marcador y medir la señal emitida tras la excitación.
17. Procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque en la
etapa (h) del procedimiento según la reivindicación 1, se establece
una relación numérica entre las señales obtenidas con los plásmidos
que contienen las lesiones y la señal obtenida con el plásmido
control situado en el mismo soporte.
18. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para el establecimiento
del perfil de reparación de un medio biológico dado.
19. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para el diagnóstico de
una enfermedad ligada a la reparación.
20. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para evaluar la
influencia de un tratamiento físico o químico sobre las capacidades
de reparación de un medio dado.
21. Utilización del procedimiento según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para el cribado de
sustancias capaces de modular el sistema de reparación de un medio
biológico.
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