ES2276362T3 - Metodos de aislamiento bacteriano de muestras biologicas. - Google Patents
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Abstract
Un método de aislamiento de bacterias de una muestra biológica, que consiste en los siguientes pasos: - la provisión de anticuerpos de unión específica a las células eucariotas que se encuentran en dicha muestra biológica, estando dichos anticuerpos carentes de un extremo Fc de unión a bacterias; - la mezcla de dichos anticuerpos y de dicha muestra biológica; y - la separación de los complejos anticuerpo-célula eucariota de la mezcla.
Description
Métodos de aislamiento bacteriano de muestras
biológicas.
La presente invención está dirigida hacia
métodos para aislar bacterias de muestras biológicas, especialmente
de muestras sanguíneas. Estos procedimientos son adecuados para la
preparación de muestras a partir de muestras biológicas destinadas
a procedimientos inmunodiagnósticos, o basados en ácidos nucleicos,
destinados a la detección de bacterias. Esta invención también está
relacionada con la utilización de anticuerpos específicos en
métodos de aislamiento de bacterias de muestras biológicas, así como
con equipos que permiten llevar a cabo estos métodos.
La determinación y el aislamiento de las
bacterias presentes en muestras biológicas es una tarea común en
las aplicaciones biotecnológicas. Por ejemplo, en el caso de las
aplicaciones médicas, la caracterización de las bacterias presentes
en muestras biológicas humanas o animales desempeña un papel
importante en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. La
septicemia sigue siendo un tema de principal importancia en cuidados
intensivos y está asociada a una elevada tasa de mortalidad y a un
coste elevadísimo para el sistema sanitario. En la actualidad, para
el diagnóstico de sepsis se utilizan, en la mayoría de los casos,
métodos de cultivo de sangre (Weinstein, M.P., et al., Clin.
Infect. Dis. 24 [1997] 584-602), lo que permite la
detección específica de bacterias en dichas muestras. Sin embargo,
la realización de estos métodos lleva mucho tiempo y con mucha
frecuencia no permiten proporcionar a tiempo el tratamiento adecuado
para el paciente. Existen métodos de diagnóstico bacteriano
alternativos basados en la detección de proteínas específicas o de
secuencias de ácidos nucleicos de estos organismos. En especial,
los métodos de detección de ácidos nucleicos están adquiriendo cada
vez más importancia en vista del progreso que se ha realizado en
este campo en los últimos años. Los métodos de amplificación de
ácidos nucleicos, en especial la reacción en cadena de la
polimerasa, permiten una detección muy específica, sensible y
rápida de las secuencias de ácido nucleico presentes en una muestra
y, por lo tanto, proporcionan una alternativa a los ensayos actuales
con cultivos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas como
la sepsis (Martineau, F., et al., J. Clin. Microbiol. 36
[1998] 618-623; Reischl, U., et al., J.
Clin. Microbiol. 38 [2000] 2429-2433;
Rantakokko-Jalava, K. y Jalava, J., J. Clin.
Microbiol. 40 [2002] 4211-4217).
No obstante, estos métodos de detección a menudo
requieren la preparación de una muestra de forma previa a la
detección de las proteínas o de los ácidos nucleicos
específicos.
Es objeto de la presente invención proporcionar
métodos mejorados de aislamiento de bacterias a partir de muestras
biológicas. Estos métodos pueden utilizarse para la preparación de
muestras en métodos diagnósticos destinados a la detección de
bacterias en muestras biológicas, especialmente en muestras
sanguíneas.
El principal objetivo de la invención es
proporcionar métodos para el aislamiento bacteriano de una muestra
biológica empleando anticuerpos específicos para las células
eucariotas de dicha muestra, careciendo estos anticuerpos de un
extremo Fc de unión bacteriana.
Una realización preferida de la presente
invención es un método de aislamiento bacteriano a partir de una
muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:
- la provisión de anticuerpos de unión
específica a las células eucariotas que contiene dicha muestra
biológica, estando estos anticuerpos carentes de un extremo Fc de
unión bacteriana; y
- la mezcla de dichos anticuerpos con la muestra
biológica mencionada; y
- la separación de los complejos
anticuerpo-célula eucariota de dicha mezcla.
En este tipo de procedimientos es importante
utilizar anticuerpos carentes de extremos Fc de unión a bacterias;
de este modo al menos se consigue que estos anticuerpos no se unan a
aquellas bacterias que deben detectarse a continuación. Los
extremos Fc de los anticuerpos utilizados frecuentemente en las
aplicaciones biotecnológicas son casi siempre capaces de unirse a
prácticamente todas las bacterias a través de las proteínas de unión
a inmunoglobulina como la proteína A, la proteína G y la proteína L
(Navarre, W.W. y Schneewind, O., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63
[1999] 174-229; Reeves, H.C., et al., Anal.
Biochem. 115 [1981] 194-196; Nilson, B., et
al., J. Immunol. Methods 99 [1987] 39-45;
\ring{A}kerström, B., et al., J. Biol. Chem. 264 [1989]
19740-19746). Sin embargo, el empleo de estos
anticuerpos en un método de aislamiento como el antes descrito no
solamente conduce a la reducción sustancial de las células
eucariotas, sino también a la reducción sustancial de las bacterias
de la muestra. Este hecho provocaría necesariamente una
subestimación de la carga bacteriana de la muestra o, en el peor de
los casos, falsos resultados negativos en los métodos posteriores de
detección de ácidos nucleicos o proteínas bacterianos. Por esta
razón, utilizar anticuerpos carentes de extremos Fc de unión a
bacterias es de gran importancia. Son especialmente adecuados para
este propósito los anticuerpos tetraméricos (Patente Estadounidense
US 2006/0092078), los fragmentos Fab y los anticuerpos con un
extremo Fc enmascarado.
\newpage
Otra realización de esta invención está dirigida
hacia la extracción de ácidos nucleicos o proteínas de la muestra
biológica tras la reducción sustancial de las células eucariotas de
dicha muestra. Los ácidos nucleicos o las proteínas extraídos de la
muestra pueden utilizarse posteriormente en métodos para la
detección de proteínas o ácidos nucleicos específicos de
bacterias.
Una realización de la presente invención está
enfocada hacia métodos de aislamiento bacteriano de muestras
biológicas mediante la reducción sustancial de las células
eucariotas presentes en dichas células.
Las muestras desprovistas de células eucariotas
presentan algunas propiedades ventajosas; por ejemplo en el caso de
la utilización de métodos inmunodiagnósticos o de detección de
ácidos nucleicos para la detección bacteriana. Es decir, el nivel
de proteínas y ácidos nucleicos eucariotas que están presentes
normalmente en las muestras biológicas, en especial en las muestras
sanguíneas, en comparación con el nivel de ácidos nucleicos y
proteínas bacterianos, es muy elevado. Esto podría perturbar la
detección de ácidos nucleicos o proteínas bacterianos en estas
muestras. Este hecho tiene una especial importancia cuando se
extraen los ácidos nucleicos o las proteínas totales de estas
muestras de forma previa a la detección de ácidos nucleicos o
proteínas específicos.
El caso de la detección de ácidos nucleicos
bacterianos mediante el método de la PCR ejemplifica el punto
anterior. La PCR permite la amplificación y la detección, en teoría,
de una diana presente en una muestra (sin embargo, en la práctica,
esta sensibilidad es muy difícil de conseguir). Además de la
optimización de las sondas y los cebadores, la sensibilidad de un
ensayo mediante PCR está influenciada en gran medida por la
proporción entre DNA diana y el resto del DNA. Es ampliamente
conocido que cuanto mayor es la cantidad de DNA total más disminuye
la sensibilidad de un ensayo de PCR para el DNA diana.
En las muestras humanas o animales, la mayor
parte de los ácidos nucleicos provienen de las células sanguíneas
eucariotas presentes en estas muestras, y no de las bacterias a
detectar. La proporción de ácidos nucleicos bacterianos en relación
con los ácidos nucleicos humanos es fácilmente calculable. Un ml de
sangre total de un donante humano sano contiene entre 3 x 10^{6}
y 10 x 10^{6} leucocitos. En el caso de pacientes con sepsis, los
niveles de leucocitos se elevan hasta 30 x 10^{6}/ml. Se puede
realizar la presunción de que un "típico" paciente con sepsis
posee un contenido de leucocitos de 10 x 10^{6}/ml y una carga
bacteriana de 100/ml. Si se tiene en cuenta que el tamaño del
genoma humano es del orden de 3 x 10^{9} pares de bases por
leucocito para un genoma haploide (6 x 10^{9} pares de bases para
un genoma diploide) y que el tamaño del genoma bacteriano es del
orden de 6 x 10^{6} pares de bases, esto da como resultado una
proporción entre DNA diana bacteriano y DNA total humano de 1
frente a 10^{8}.
Una práctica habitual para superar el problema
de la inhibición de los ácidos nucleicos de fondo es la utilización
de controles internos durante la amplificación y la dilución de
muestras inhibidas en los posteriores ciclos de PCR. No obstante,
la dilución de las muestras normalmente conduce a una pérdida de
sensibilidad, lo cual debe evitarse. Además, en los métodos
diagnósticos habituales tampoco se prefiere la realización de pasos
de dilución adicionales o de reacciones de amplificación por PCR.
Por lo tanto, cuando se trata de detectar bacterias en una clásica
muestra de sangre procedente de un paciente, sería ventajoso
solventar el problema de que la mayor parte de los ácidos nucleicos
extraídos de estas muestras provienen del donante. Además,
especialmente por lo que respecta a muestras provenientes de
pacientes con sepsis, no es posible obtener muestras de gran
volumen que permitirían sortear los problemas de sensibilidad de los
métodos de detección de ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona una solución a
este inconveniente al permitir la eliminación selectiva de las
células eucariotas de la muestra. Esta muestra no contiene
concentraciones elevadas de ácidos nucleicos del donante y puede
utilizarse para preparar ácidos nucleicos del agente patógeno,
especialmente de las bacterias que contiene la muestra.
A pesar de que esto ejemplifica especialmente el
problema en la detección de ácidos nucleicos, cabe resaltar que
existen problemas similares en la detección de las proteínas
bacterianas. En estos métodos, las proteínas del donante pueden
provocar una perturbación significativa. Además, estos métodos
también se pueden utilizar para mejorar los métodos de detección de
otros patógenos como los virus.
La muestra biológica puede ser de procedencia
humana, animal o cualquier otra de la naturaleza. Las muestras
preferidas son las siguientes: sangre, suero, plasma, médula ósea,
tejido, esputo, derrame o suspensión pleural o peritoneal, orina,
esperma y heces.
El término bacterias, en el contexto de la
presente invención, puede referirse a cualquier bacteria conocida,
en especial las bacterias que están implicadas en trastornos
patológicos como, por ejemplo, las enfermedades infe-
cciosas.
cciosas.
Son de especial interés las bacterias implicadas
en la sepsis, como Staphylococcus spp, Streptococcus spp,
Enterococcus spp, Enterobacter spp, Klebsiella spp, Escherichia
coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas spp, Haemophilus
influenzae y otras. La presente invención permite la detección
de varias bacterias implicadas en estas enfermedades llevando a
cabo solamente un método de aislamiento que elimina las células
eucariotas de esa muestra, extrae las proteínas o los ácidos
nucleicos y, posteriormente, detecta los ácidos nucleicos o las
proteínas específicas de una o varias de las bacterias implicadas.
Estos métodos de detección múltiple son de difícil ejecución si se
utilizan los métodos de preparación de muestras conocidos en el
campo.
La mayoría de las veces no es necesario eliminar
todas las células eucariotas presentes en una muestra biológica
para conseguir el efecto deseado. Por ejemplo, en el caso de los
métodos de diagnóstico inmunológico sería suficiente con eliminar
ciertas células eucariotas que presentan una mayor reactividad
cruzada cuando se emplea un cierto anticuerpo, o bien disminuir el
contenido en proteínas eucariotas mediante la eliminación de las
células más abundantes. En la mayoría de los casos referentes a los
métodos de detección de ácidos nucleicos es suficiente con la
eliminación de las células eucariotas nucleadas, que no poseen DNA
genómico. La eliminación de eritrocitos no es necesaria en gran
parte de los casos ya que estas células no poseen DNA genómico y los
inhibidores que éstas contienen se pueden eliminar fácilmente
mediante lavado durante el posterior procedimiento de preparación
de muestras. Asimismo, y en especial cuando se llevan a cabo
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, lo más deseado
es incrementar de forma significativa el contenido relativo de
ácidos nucleicos bacterianos respecto del DNA genómico eucariota.
Por esta razón, es suficiente con la eliminación de la mayoría de
estas células, pero no es necesario que la muestra biológica tratada
esté libre de todas las células eucariotas.
Los anticuerpos empleados en el método de la
presente invención deben cumplir dos propiedades esenciales. En
primer lugar, en efecto se unen a células eucariotas que deben ser
eliminadas de una muestra biológica, preferiblemente mediante los
dominios específicos de unión a antígeno de estos anticuerpos. Por
ejemplo, en el caso de muestras de sangre, los expertos en la
materia conocen los anticuerpos adecuados de unión específica a los
antígenos de la superficie celular de leucocitos, eritrocitos y
monocitos (p. ej. CD2/CD3 en el caso de los linfocitos T; CD14 en
monocitos; CD15 en granulocitos y monocitos; CD16 en macrófagos;
CD36 en plaquetas, monocitos y macrófagos; y CD45 en
leucocitos).
En segundo lugar, los anticuerpos carecen de un
extremo Fc de unión a bacterias, o bien el extremo Fc del
anticuerpo está bloqueado (p. ej. al utilizar anticuerpos
tetraméricos). Los anticuerpos con extremos Fc de unión a bacterias
darían lugar a complejos célula eucariota-anticuerpo
que también contendrían bacterias. La extracción de los complejos
de la muestra daría lugar, sin haberlo pretendido, a una muestra de
la que también se habrían eliminado las bacterias. Esto, a su vez,
provocaría falsos resultados negativos en los procedimientos de
detección bacteriana que se llevasen a cabo en la muestra
posteriormente. Especialmente, los extremos Fc de los anticuerpos
IgG, que son de uso común en los procedimientos biotecnológicos, se
unen a las bacterias con una elevada
afinidad.
afinidad.
Los anticuerpos carentes de los extremos Fc de
unión bacteriana, que se pueden utilizar en los métodos de la
presente invención, son por ejemplo anticuerpos tetraméricos o
fragmentos de anticuerpos carentes de la porción Fc, como los
fragmentos Fab o F(ab')_{2} generados por digestión con
papaína o pepsina, lo cual es un procedimiento novedoso utilizado
por los expertos en el campo.
No obstante, si en la muestra biológica
solamente se detecta una especie en concreto de microorganismo, es
posible utilizar anticuerpos del tipo IgM para la eliminación de las
células eucariotas de la muestra. Esto es así puesto que algunos
microorganismos como Staphylococcus aureus o Streptococcus
spp expresan solamente proteínas de unión a inmunoglobulinas,
como la Proteína A o la Proteína B, que muestran una fuerte unión a
la fracción Fc\gamma de las IgG, aunque (prácticamente) ninguna
unión a las IgM, mientras otros organismos como
Peptostreptococcus magnus expresan Proteína L, que se une
fuertemente tanto a IgG como a IgM.
Por tanto, la utilización de anticuerpos de tipo
IgM constituye una realización alternativa de la presente
invención, ya que este enfoque no sería universal sino que estaría
limitado a la detección de microorganismos en particular, como
Staphylococcus aureus o Streptococcus spp.
En función de las propiedades de los
anticuerpos, los complejos anticuerpo-célula
eucariota pueden separarse de la muestra biológica mediante métodos
estándar conocidos en el ámbito.
Estos complejos, por ejemplo, pueden separarse
de la muestra mediante el uso de matrices que tienen la capacidad
de unirse a los anticuerpos. Si los complejos tienen una densidad de
flotación diferente a la de las bacterias, estos pueden separarse
fácilmente mediante, por ejemplo, la centrifugación por gradiente de
densidad de la muestra. En el caso del empleo de anticuerpos
entrecruzados, como IgM o anticuerpos tetraméricos, los complejos
son muy densos y pueden sedimentarse muy fácilmente en una fase de
gradiente de densidad mediante, p. ej., centrifugación de células
Fc (\rho \sim 1.080 g/ml). Otra posibilidad es la utilización de
anticuerpos acoplados directa o indirectamente a una fase sólida,
como por ejemplo a partículas magnéticas. Entonces se pueden
separar muy fácilmente los complejos
anticuerpo-célula eucariota aplicando un campo
magnético. Cuando los anticuerpos se encuentran unidos directamente
a la fase sólida éstos se acoplan mediante un enlace covalente
utilizando técnicas bien conocidas en el ámbito. Los enlaces
indirectos también se conocen ampliamente y un ejemplo de ello son
las parejas estreptavidina-biotina o
antígeno-anticuerpo (como
digoxigenina-anticuerpo
anti-digoxigenina).
En otra realización de la presente invención, no
solamente se aislaron bacterias de las muestras biológicas
empleando anticuerpos específicos para células eucariotas, que
carecen de un extremo Fc de unión bacteriana para la eliminación de
células eucariotas de dichas muestras biológicas, sino también
mediante la extracción de ácidos nucleicos o proteínas de dichas
muestras procesadas. Con esta finalidad se pueden utilizar métodos
estándar de extracción bien conocidos en el campo (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press [1989]).
Un ejemplo de preparación de ácidos nucleicos es
mediante la lisis celular, la digestión con proteinasa K, la
extracción opcional con fenol/cloroformo y la precipitación de
ácidos nucleicos utilizando acetona o propanol según los métodos
estándar (Sambrook et al., supra). No obstante,
también es posible emplear muchos métodos alternativos, como los
equipos comerciales de extracción de fácil manejo basados por
ejemplo en la técnica de unión de ácidos nucleicos a partículas
magnéticas (p. ej. MagNA Pure® comercializado por Roche
Diagnostics).
Otra realización de la presente invención está
enfocada hacia el aislamiento de bacterias en muestras biológicas
mediante la eliminación de células eucariotas utilizando anticuerpos
específicos de células eucariotas, que carecen de un extremo Fc de
unión a bacterias, la extracción de ácidos nucleicos o proteínas de
dichas muestras y la detección de secuencias de ácido nucleico o
proteínas específicas de bacterias en las muestras. Los métodos de
detección adecuados no se limitan a los diferentes métodos conocidos
en el ámbito (véase por ejemplo Sambrook et al.,
supra).
Las secuencias de ácido nucleico específicas de
bacterias pueden detectarse mediante métodos conocidos por los
expertos, como por ejemplo mediante métodos de hibridación con
sondas utilizando técnicas de transferencia Southern. Otros métodos
de detección incluyen la secuenciación de las secuencias de ácido
nucleico a detectar o la clonación de las secuencias de ácido
nucleico deseadas en vectores plasmídicos. En Sambrook et
al., supra, se puede hallar una visión general de estos
métodos.
En el caso de que el ácido nucleico diana se
encuentre solamente en concentraciones muy bajas en la muestra, los
métodos de amplificación sirven para poder conseguir la detección.
Son ejemplos de métodos de amplificación adecuados las siguientes
técnicas: LCR (patentes estadounidenses núms. 5 185 243, 5 679 524 y
5 573 907; patente europea EP 0 320 308 B1; WO 90/01069; WO
89/12696; y WO 89/09835), tecnología de la sonda cíclica (patentes
estadounidenses núms. 5 011 769, 5 403 711, 5 660 988 y 4 876 187, y
solicitudes publicadas de PCT WO 95/05480 y WO 95/00667), método
Invader^{TM} (patentes estadounidenses núms. 5 846 717, 5 614 402,
5 719 028, 5 541 311 y 5 843 669), reacción de la
Q-beta replicasa (patente estadounidense núm. 4 786
600), NASBA (patente estadounidense núm. 5 409 818; patente europea
EP-0 329 822), TMA (patentes estadounidenses núms. 5
399 491, 5 888 779, 5 705 365 y 5 710 029), SDA (patentes
estadounidenses núm. 5 455 166 y 5 130 238) y PCR (patente
estadounidense US-A-4 683 202).
La invención se refiere además a equipos que
pueden utilizarse en los procedimientos antes descritos.
Los equipos preferidos para la extracción de
ácidos nucleicos o proteínas bacterianos de una muestra biológica
contienen:
- en uno o varios recipientes, anticuerpos de
unión específica a las células eucariotas de dicha muestra
biológica, carentes de un extremo Fc de unión a bacterias; y
- sistemas, en uno o varios recipientes, para la
extracción de ácidos nucleicos o proteínas.
Los sistemas para la extracción de ácidos
nucleicos o proteínas son reactivos o dispositivos para la
extracción de ácidos nucleicos o proteínas como proteinasa K,
tampón de unión (para ácidos nucleicos), tampón de lavado (para
ácidos nucleicos) o tampón de elución (para ácidos nucleicos). Si
fuera necesario, estos equipos pueden contener también otros
reactivos.
Otra realización de la presente invención está
enfocada hacia equipos que también contienen medios para detectar
ácidos nucleicos o proteínas. Estos equipos también se pueden
emplear con la finalidad de detección. Los medios de detección
pueden ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para proteínas
bacterianas. Si los ácidos nucleicos bacterianos son la diana, los
medios adecuados son sondas oligonucleotídicas específicas de
bacterias y tampones de hibridación adecuados. En el caso de que se
deba amplificar el ácido nucleico diana, estos equipos también
pueden contener medios de amplificación, por ejemplo uno o varios
cebadores, tampones de amplificación, sondas o enzimas de
amplificación.
Los medios de detección, como los anticuerpos, y
los oligonucleótidos, como los cebadores y las sondas, pueden estar
marcados de forma opcional para simplificar de esta forma la
detección. En el campo se conocen perfectamente los marcadores
apropiados.
La presente invención está ilustrada por los
ejemplos que aparecen a continuación.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo
1
El empleo de medios de gradiente de densidad es
un modo común en la química clínica de separación mediante
centrifugación de las células sanguíneas en diferentes poblaciones.
Los medios utilizados con más frecuencia son Percoll® y Ficoll®. El
Percoll® es una solución coloidal polidispersa de partículas de
sílice de entre 15 y 30 nm, recubiertas con polivinilpirrolidona
(PVP) no dializable. El Percoll® comercializado (p. ej. por
Amersham) consiste en un 23% (peso por peso) de partículas de sílice
que proporcionan una densidad de 1,130 \pm 0,005 g/ml. El medio
Ficoll-Paque Plus® de Amersham es una solución
acuosa de 5,7 g de Ficoll® 400 (un polímero de sacarosa y
epicloridrina, sintético y de elevado peso molecular) y 9,0 g de
diatrizoato sódico por 100 ml, que proporciona una densidad de
1,077 \pm 0,001 g/ml.
En principio se utilizan dos técnicas para la
separación celular: gradientes de densidad continuos y discontinuos
(en fases). En el caso de un gradiente continuo, se centrifuga una
suspensión de partículas (p. ej. células) y las células sedimentan
en la posición del gradiente donde la densidad de las células
coincide con la densidad del gradiente (densidad de flotación de
las células). Mediante esta técnica pueden separarse células que en
cuanto a la densidad difieren en tan solo 0,01 g/ml. Al utilizar
gradientes discontinuos las células sedimentan en la interfase de
dos medios de diferente densidad, donde el medio superior presenta
una densidad menor y el medio inferior una mayor que las células
sedimentadas.
La tasa de sedimentación v (que es una
velocidad) de una partícula viene definida por la ley de Stokes:
v = \frac{d^{2}(\rho p - \rho i)
\times g}{18
\eta},
que
significa
\bullet que la tasa de sedimentación aumenta a
medida que se aumenta la fuerza centrífuga (g).
\bullet que la tasa de sedimentación es
proporcional al cuadrado del tamaño de la partícula (d).
\bullet que la tasa de sedimentación es
proporcional a la diferencia entre la densidad de la partícula
(\rhop) y de la del medio que la rodea (\rhoi), que significa
que la tasa de sedimentación pasa a ser 0 cuando la densidad de la
partícula y la densidad del medio son equivalentes.
\bullet que la tasa de sedimentación disminuye
a medida que aumenta la viscosidad del medio (\eta).
Dado que la formación de gradientes continuos de
Percoll® lleva mucho tiempo y se necesitan fuerzas g muy elevadas
(20.000-35.000 g), los experimentos descritos a
continuación se realizaron con gradientes discontinuos de una
o
dos fases, en los que la densidad del medio viene dada por la disolución del Percoll® en solución isotónica de NaCl.
dos fases, en los que la densidad del medio viene dada por la disolución del Percoll® en solución isotónica de NaCl.
En este caso, las fases de densidad en el tubo
de centrifugado se preparan simplemente mediante el pipeteado y la
superposición de un medio tras otro, estando la muestra sanguínea
que posee la menor densidad en la parte superior del tubo.
La siguiente tabla expone las densidades de
flotación de diferentes células sanguíneas y de E. coli,
tomadas de una nota informativa referente a la aplicación técnica
del uso de Percoll®, de Amersham/Pharmacia.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Debido a esta lista, la asunción fue que las
bacterias poseen una densidad marcadamente superior a la densidad
de los leucocitos y, por tanto, los protocolos convencionales que
permiten separar linfocitos y monocitos (PBMC) de granulocitos y
eritrocitos deben ser adaptables para separar bacterias intactas de
leucocitos.
En un tubo Falcon de 15 ml se preparó un
gradiente de Percoll® de dos fases pipeteando en el tubo 4 ml de
una solución isotónica de Percoll® al 74% ig (\rho \sim 1,095
g/ml), superponiendo a este medio 4 ml de una solución isotónica de
Percoll® al 55% ig (\rho \sim 1,075 g/ml) y superponiendo a
estos dos medios densos 4 ml de sangre total contaminada con
bacterias.
Este gradiente en dos fases que contiene la
muestra se centrifugó durante 20 minutos a 350 g a temperatura
ambiente en una Heraeus Variofuge 3.0 R con un rotor basculante
(tipo 05315) y se determinó la cantidad de células sanguíneas que
había en las fracciones o en las interfases celulares formadas entre
los medios. Esto último se realizó midiendo alícuotas de estas
fracciones en un Beckman Coulter AcT Diff.
La cantidad de DNA genómico humano en las
fracciones se determinó mediante la amplificación del gen de la
\beta-globina en un LightCycler® 1.2 empleando el
DNA del equipo LightCycler-Control Kit®, y la
cantidad de DNA bacteriano (Staph. aureus y P.
aeruginosa) empleando ensayos de parámetro único de Roche
Diagnostics.
Con esta finalidad se procesaron alícuotas de
las fracciones en el MagNA Pure® siguiendo las instrucciones
suministradas en el manual.
La recuperación del DNA genómico humano y DNA
bacteriano de las fracciones se calculó mediante el procesado de
una alícuota de una muestra de sangre "no procesada" en el
MagNA Pure® y estableciendo la concentración de esta muestra no
centrifugada como el 100%.
Al calcular la cantidad recuperada de las
muestras centrifugadas se tuvo en cuenta la relación de volumen
entre las fracciones celulares y el volumen inicial de las
muestras.
A continuación se comentan las posibles
modificaciones que admite el protocolo, como la variación de las
fuerzas g, del tiempo de centrifugación y cambios en la densidad
del medio.
Una muestra de sangre total es separada
prácticamente de forma cuantitativa en tres fracciones utilizando
el gradiente en dos fases de la forma antes descrita (20 min a 350
g).
La primera fracción es una capa celular blanca
compacta situada en la interfase entre el "plasma" y el
Percoll® al 55% ig, que consiste en plaquetas concentradas y
células mononucleares de sangre periférica (PBMC = linfocitos y
monocitos).
La segunda fracción está formada por
granulocitos (células nucleares polimórficas) concentrados y está
situada en la interfase entre el Percoll® al 55% ig y el Percoll®
al 74% ig, y la tercera fracción es un sedimento rojo de
eritrocitos en el fondo del tubo, puesto que los eritrocitos poseen
una densidad ligeramente superior que la solución de Percoll® al
74% ig. (En algunos casos los eritrocitos proporcionaron un
sedimento difuso distribuido por el total del volumen de la
fracción de Percoll® al 74% ig, lo que estuvo provocado por muestras
que presentaban cantidades bajas de hemoglobina por eritrocito y
por tanto una menor densidad de flotación).
En la presunción de que las bacterias tienen una
densidad de flotación mayor que los leucocitos, las bacterias
deberían sedimentar junto con los eritrocitos en el fondo del tubo,
separándose así de los leucocitos.
Como las bacterias se encuentran en el rango de
cerca de 1 \mum mientras que los leucocitos están en el rango de
cerca de 10 \mum, y como la tasa de sedimentación v es una función
del cuadrado del diámetro celular (d^{2}), las bacterias deberían
sedimentar a una velocidad extremadamente baja en comparación con
las células sanguíneas cuando se aplican fuerzas g moderadas.
Los cálculos modelo realizados según la ecuación
de Stokes dieron tiempos de sedimentación de unas 6 horas
correspondientes a las condiciones de centrifugación antes descritas
para concentrar las bacterias en el fondo del tubo, lo cual no está
causado solamente por el tamaño de partícula pequeño sino más bien
por la pequeña diferencia de densidad existente entre el Percoll®
al 74% ig y las bacterias.
Por consiguiente, en otro conjunto de
experimentos se adaptó el protocolo a fuerzas g más elevadas dando
como resultado velocidades de sedimentación mayores, lo cual está
limitado por el fenómeno de que a fuerzas g demasiado elevadas las
partículas de sílice del Percoll® comienzan a sedimentar (formando
un gradiente continuo) y el sistema se vuelve "inestable".
La centrifugación de hasta 2 horas a 2300 g fue
posible sin llegar a destruir las fases del gradiente de densidad,
separando todavía las células sanguíneas en las 3 fracciones antes
descritas.
Además, el gradiente de dos fases se simplificó
en un gradiente de una fase que contenía solamente 4 ml de sangre
total y 4 ml de Percoll® al 74% ig. En este caso, la fracción
celular en la interfase plasma/Percoll® contenía todas las
subpoblaciones de leucocitos (y los trombocitos) y los eritrocitos
sedimentaron en el fondo del tubo.
La ventaja de este gradiente de una fase es que
la distancia de las bacterias al sedimento del fondo del tubo es
claramente menor y, por tanto, las bacterias deberían sedimentar (en
combinación con las fuerzas g más elevadas) en el fondo del tubo en
1 hora aproximadamente.
Con este protocolo optimizado se centrifugó y
analizó sangre total contaminada con bacterias de 10 donantes
diferentes.
El sobrenadante que incluye la fracción celular
en la interfase plasma/Percoll® contenía cerca del 90% del DNA
genómico humano, lo que concordaba con la cantidad correspondiente
de leucocitos hallada por el Coulter Counter.
De forma sorprendente se halló igualmente en
esta fracción cerca del 80% de las bacterias, y no en la fase
Percoll® al 74% ig como se esperaba (véase la siguiente tabla), lo
cual significa que no es posible separar los leucocitos y las
bacterias en las dos fases diferentes.
Además, no hubo prácticamente diferencia entre
una centrifugación suave (30 minutos a 350 g) y una centrifugación
fuerte (100 minutos a 2300 g), lo que indica que la densidad de
flotación de las bacterias debe ser menor que la densidad de la
solución de Percoll® al 74% ig (\rho = 1,095 g/ml).
De este modo, en un último conjunto de
experimentos se disminuyó la densidad de la solución de Percoll®
utilizando Percoll® al 65% y al 55% para facilitar la penetración
de las bacterias, junto con los eritrocitos, dentro de la fracción
de Percoll®.
En este caso, los granulocitos, que son los
leucocitos de mayor densidad, ya fueron a parar a la fase de
Percoll®, mientras que un 70% de las bacterias y la totalidad de
los linfocitos y monocitos se mantuvieron todavía en la interfase o
en el sobrenadante.
Esto significa que la densidad del Percoll®
todavía es mayor que la densidad de flotación de la mayoría de las
células bacterianas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Dado que estos resultados están en clara
contradicción con el presupuesto inicial de que las bacterias poseen
una densidad de flotación mayor que 1,10 g/ml (como estipula la
nota informativa técnica de Amersham/Pharmacia para el uso de
Percoll®), se llevó a cabo una búsqueda propia en la literatura
científica.
Bakken, L.R. y Olsen, R.A. (Appl. Environ.
Microbiol. 45 [1983] 1188-1195) publicaron valores
comprendidos entre 1,035 g/ml y 1,093 g/ml para las densidades de
flotación de varias bacterias. Pero incluso para una especie (E.
coli), los valores de densidad de flotación varían entre 1,05
g/ml y 1,10 g/ml (véase p. ej. Woldringh, C.L., et al., J.
Bacteriol. 148 [1981] 58-63).
La diferencia entre los valores expuestos se
debe en parte a los diferentes medios o técnicas utilizados, lo que
causa efectos osmóticos distintos y la penetración de sal en las
células influyendo así en la densidad de flotación de las
células.
Además, existe literatura que afirma que las
condiciones de cultivo influirán sobre la densidad de flotación de
las células bacterianas (véase, p. ej.,
Martínez-Salas, E., et al., J. Bacteriol. 147
[1981] 97-100).
La utilización de sistemas de gradiente de
densidad es un método habitual en la química clínica para la
separación de las células sanguíneas en diferentes poblaciones
mediante centrifugación. Debido a las moléculas de hemoglobina
relativamente densas que se encuentran en los eritrocitos, estos
sedimentan en el fondo del tubo durante la centrifugación. Como,
desde un punto de vista morfológico, los leucocitos son células de
clases heterogéneas, la densidad de flotación de estas células
oscila entre 1,06 g/ml para las células mononucleares (linfocitos y
monocitos) y 1,09 g/ml para las células nucleares polimórficas
(granulocitos).
Como consecuencia de esto, los leucocitos pueden
separarse en diferentes fracciones en función de la densidad del
medio utilizado en la centrifugación.
Bakken y Olsen (1983, véase más arriba)
publicaron valores entre 1,035 y 1,093 g/ml para la densidad de
flotación de diversas bacterias utilizando Percoll®.
De acuerdo con los resultados anteriores, la
densidad de flotación de las células bacterianas (experimentos con
Staph. aureus y P. aeruginosa) parece estar en el
mismo rango de valores que la densidad de flotación de los
leucocitos mononucleares (\sim 1,06 - 1,07 g/ml). En consecuencia,
no parece posible la separación de todos los leucocitos y las
bacterias en dos medios de diferente densidad.
Si se utiliza Percoll® al 74% (\rho \sim
1,095) solamente penetran en el Percoll® los eritrocitos, mientras
que las bacterias permanecen en el sobrenadante junto con los
linfocitos, monocitos y granulocitos.
Al disminuir la densidad del Percoll® a \leq
1,085 (=\leq 65%) los granulocitos sedimentan junto con los
eritrocitos en el fondo del tubo, mientras que las bacterias siguen
permaneciendo en el sobrenadante junto con los leucocitos
mononucleados.
Por lo tanto, un enfoque en el que los
leucocitos "de menor densidad" coprecipitan con los eritrocitos
"de mayor densidad", seguido de un paso de centrifugación con
un medio de una densidad mayor que la densidad de flotación de las
bacterias, debería dar como resultado una separación de las células
bacterianas respecto de la totalidad de los leucocitos. Este
enfoque está descrito en el ejemplo 3.
Ejemplo
2
La eliminación de leucocitos (y de
subpoblaciones de estos) mediante inmunocaptura representa en un
método establecido de enriquecimiento de células escasas (p. ej.
células tumorales) en muestras de sangre. Dado que diferentes tipos
de leucocitos expresan diferentes tipos de antígenos CD de
superficie, se utilizan mezclas de microesferas magnéticas y los
leucocitos se eliminan mediante separación magnética.
Se incubó 1 ml de sangre total durante 20
minutos a temperatura ambiente con 70 \mul de microesferas
Dynabeads® M-450<CD45> (Dynal, núm. de prod.
111.19) o con 70 \mul de microesferas Dynabeads®
M-450<CD15> (Dynal, núm. de prod. 111.17) en
una incubadora de balanceo. Ya que los linfocitos principalmente
expresan CD45 en la superficie celular, mientras que los monocitos
y granulocitos expresan principalmente CD15, es necesaria una
mezcla de ambos tipos de microesferas magnéticas para alcanzar una
tasa de eliminación aceptable de todos los tipos de leucocitos. Una
vez realizada la separación magnética de las microesferas, la tasa
de depleción en el sobrenadante se determinó midiendo la cantidad
de células sanguíneas restantes en un Beckman Coulter AcT Diff. A
continuación se sometió el sobrenadante a digestión por enzimas
líticas o por impacto de microesferas en un Ribolyzer utilizando
"microesferas azules" y
la muestra se procesó en el MagNA Pure® según el protocolo descrito en el manual o el folleto informativo del paquete.
la muestra se procesó en el MagNA Pure® según el protocolo descrito en el manual o el folleto informativo del paquete.
La cantidad de DNA genómico humano en el eluato
se cuantificó mediante la amplificación del gen de la
\beta-globina en un LightCycler® 1.2 (Roche
Diagnostics) empleando el DNA del equipo
LightCycler-Control Kit® (Roche, núm. de cat. 2 158
833), y la cantidad de DNA bacteriano empleando ensayos de parámetro
único para Staph. aureus y P. aeruginosa.
Utilizando una mezcla de microesferas
<CD45> y <CD15> como la antes descrita, la tasa de
eliminación de leucocitos y del DNA genómico humano correspondiente
fue de hasta el 90%.
La siguiente tabla muestra la recuperación de
una bacteria gram positiva y una gram negativa en el sobrenadante
de sangre total contaminada (100 bacterias/PCR) tras la
inmunocaptura de leucocitos.
La recuperación de DNA bacteriano se calculó
procesando una alícuota de una muestra de sangre no procesada en el
MagNA PURE® y estableciendo la concentración de la muestra como el
100%.
La tasa de recuperación de las bacterias es del
orden del 100% cuando se incuban las muestras contaminadas
solamente con microesferas <CD15>. Utilizando la misma
cantidad de microesferas <CD45>, o añadiendo las microesferas
<CD45> a las <CD15>, se disminuye la recuperación de las
bacterias en un 40%, lo que significa que, además de los
leucocitos, la mayoría de las bacterias se unen a las microesferas
<CD45>.
Al repetir el experimento con plasma contaminado
con bacterias como material de muestra se demostró que los
leucocitos no intervienen en la unión de las bacterias a las
microesferas <CD45>.
Además, es poco probable que las bacterias se
unan de forma inespecífica a las microesferas recubiertas con IgG
<CD45>, ya que la adición de diferentes tensioactivos
(NP-40, Na-Laurilsarcosina,
Zwittergent 3-12®) a la muestra sanguínea en un
orden de concentración en el que los leucocitos todavía no son
lisados (0,05% a 0,5%) no reduce la unión no deseada de las
bacterias a las microesferas.
La explicación más probable es que las bacterias
se unen a través de las proteínas de unión a inmunoglobulinas a la
fracción Fc\gamma de la IgG que recubre las microesferas
<CD45>. Por ejemplo, Staphylococcus aureus expresa
proteína A como una proteína de unión a inmunoglobulinas en la
superficie celular.
Esto explicaría el hecho de que no tenga lugar
prácticamente ninguna unión de las bacterias a las microesferas
<CD15>, ya que el anticuerpo <CD15> en estas
microesferas es una IgM y la proteína A no tiene afinidad alguna
por las IgM.
La eliminación de leucocitos mediante
microesferas magnéticas <CD45>/<CD15> es una herramienta
establecida para la separación celular (p. ej. para el
enriquecimiento de células tumorales).
Se encontró que las bacterias se unen a las
microesferas <CD45>, probablemente a través de proteínas de
unión a inmunoglobulinas expresadas en la superficie celular de la
bacteria frente al anticuerpo IgG murino que recubre la superficie
de las microesferas. Al emplear microesferas <CD15>, que
contienen un anticuerpo IgM murino, no se observó unión alguna de
las bacterias a las microesferas.
Ejemplo
3
La compañía Stemcell (Vancouver, Canadá) ofrece
en su línea de productos RosetteSep® cócteles de anticuerpos para
la eliminación de células sanguíneas. Estos reactivos RosetteSep®
entrecruzan células no deseadas (p. ej. leucocitos) con múltiples
eritrocitos formando rosetas. Cuando se centrifugan en un medio con
densidad de flotación como el Ficoll® (\rho \sim 1,080 g/ml),
las células no deseadas (en rosetas) sedimentan junto con los
eritrocitos libres (\rho \sim 1,09 - 1,10 g/ml), lo que deja las
células buscadas (p. ej. células tumorales) intactas en el
sobrenadante plasmático o, dependiendo de las condiciones de
centrifugación, en la interfase Ficoll®/plasma.
Los complejos de anticuerpos tetraméricos del
cóctel consisten en dos anticuerpos IgG murinos, uno dirigido
frente a los antígenos de superficie de los leucocitos (CDxx), el
otro frente a glicoforina A como antígeno de superficie expresado
sobre los eritrocitos y dos anticuerpos IgM de rata <Fc\gamma
de ratón> que hacen de puente entre los dos anticuerpos murinos,
a través de la fracción Fc\gamma, y un complejo tetramérico.
Estos reactivos se utilizan de forma habitual
para el enriquecimiento de células tumorales y proporcionan (según
el fabricante) una tasa de eliminación de las células en roseta en
el rango de 2 a 3 órdenes de magnitud para una tasa de recuperación
de las células tumorales de cerca de un 30%.
Por lo que respecta a la fase de
inmunoprecipitación, no se esperaba ninguna unión inespecífica de
las bacterias a los anticuerpos del cóctel (tal como se vio con el
empleo de Dynabeads M 450 <CD45>, véase el ejemplo 2), porque
en este enfoque, la fracción Fc\gamma de las IgG murinas
utilizadas está oculta por los anticuerpos IgM de rata conectores,
y las proteínas de unión a inmunoglobulinas expresadas por las
bacterias no muestran ninguna interacción con la IgM de rata o una
muy leve.
En experimentos anteriores que utilizaban medios
de gradientes de densidad (véase el ejemplo 1) se observó que las
bacterias no pueden penetrar en los medios de densidad cuyas
densidades de flotación fueran \geq a 1,070 (Percoll® al 55 -
74%).
Por tanto, se espera que las bacterias
permanezcan en el sobrenadante durante la centrifugación suave,
mientras que los eritrocitos, que son relativamente densos, y los
leuco-coprecipitados se separen formando un
sedimento en la fase de Ficoll®.
El punto de inicio de los experimentos con
muestras de sangre contaminadas con bacterias fue un protocolo
tomado de una nota informativa de aplicación técnica de Stemcell
para la eliminación de leucocitos.
El protocolo utiliza el cóctel de anticuerpos
denominado "CD45 Depletion for Enrichment of Circulating
Epithelial Tumor Cells", núm. de cat. 15 122 (2 ml para marcar
40 ml de sangre total) que está dirigido, aparte de <CD45>,
frente a <CD66b> y <CD36>.
Además, se utiliza un medio de densidad especial
denominado DM-L (núm. de cat. 15 705, 100 ml; \rho
= 1,081 g/ml). La compañía Stemcell afirma que el Ficoll® utilizado
habitualmente (\rho = 1,077 g/ml) también se puede utilizar
aunque proporciona una tasa de recuperación ligeramente menor para
las células tumorales del sobrenadante.
De acuerdo con este protocolo, se incubaron 2,0
ml de sangre total con 100 \mul de cóctel de eliminación de CD45
durante 20 minutos a temperatura ambiente con una ligera agitación
en un mezclador para tubos Eppendorf. La muestra se diluyó con 2,0
ml de PBS que contenía RPLA-4 (albúmina plasmática
bovina) al 2%. Se pipetearon 3,0 ml de medio de densidad
DM-L en un tubo Sarstedt de fondo cónico de 15 ml
(Núm. de cat. 62 554 502 PP) y la muestra diluida se dispuso sobre
el medio de tipo Ficoll®. La muestra se centrifugó durante 20
minutos en un Heraeus Variofuge 3,0 R utilizando un rotor
basculante (tipo 05315) a 2700 rpm (= 1200 g).
Tras la centrifugación, la interfase entre el
"plasma" generado y el medio de tipo Ficoll® que contiene las
células sanguíneas sedimentadas fue claramente visible. Las dos
fases se separaron mediante pipeteado, y se midieron alícuotas de
estos en el Beckman Coulter Counter para compararlas con el recuento
celular inicial de la muestra, determinando de esta forma la tasa
de eliminación de los leucocitos.
La cantidad de DNA genómico humano y DNA
bacteriano se determinó procesando alícuotas de 750 \mul de ambas
fases en el MagNA PURE® de Roche Diagnostics según el protocolo
descrito en el manual o el folleto informativo del producto. El DNA
de los eluatos se cuantificó mediante PCR con LightCycler®, tal como
se ha descrito anteriormente, y se expresó en tasas de recuperación
de bacterias y tasas de eliminación de DNA genómico humano, tomando
como el valor del 100% el contenido de DNA de las muestras
procesadas con el MagNA PURE® sin haber sido previamente sometidas
a la fase de inmunoprecipitación.
Utilizando el protocolo de Stemcell original del
modo antes descrito, no se detectaron leucocitos ni eritrocitos
mediante recuento celular de la fase plasmática tras la
centrifugación. Incluso la fase de tipo Ficoll®, excepto un
sedimento compacto de células, no contenía células sanguíneas. Estos
resultados están de acuerdo con los valores del contenido de DNA
genómico humano de las dos fases.
Dado que este protocolo emplea unas condiciones
de centrifugado relativamente duras (20 minutos a 1200 g), las
fuerzas g y el tiempo de centrifugado se disminuyó en un primer
conjunto de experimentos para así obtener una buena tasa de
recuperación de las bacterias del sobrenadante.
Se encontró que un centrifugado de 5 minutos a
130 o 350 g (= 800 rpm o 1500 rpm) proporcionaba una tasa de
recuperación para Staph. aureus y P. aeruginosa del
orden del 80 al 90% en la fase plasmática.
No se observaron diferencias entre las tasas de
recuperación correspondientes a 130 g y 350 g, lo que indica que
las bacterias no son capaces de penetrar de forma significativa en
el medio denso de tipo Ficoll®.
Utilizando estas condiciones de centrifugación,
el sedimento de células sanguíneas en la fase de tipo Ficoll® era
más difuso que compacto aunque, sin embargo, el contenido de DNA
genómico humano de la fase plasmática que contenía las bacterias
todavía se encontraba en el rango de un 1%.
Fue también posible centrifugar la muestra
incubada sin diluirla con PBS/RPLA-4, evitando de
esta manera la dilución del contenido inicial de bacterias del
sobrenadante.
Gracias al empleo de un cóctel de anticuerpos
RosetteSep® para la eliminación de leucocitos, fue posible
coprecipitar las células sanguíneas mediante una fase de incubación
de 20 minutos y sedimentar las células en un medio de tipo Ficoll®
en una fase de centrifugación corta (5 minutos a 130 o 350 g). Ya
que la eliminación de los leucocitos es muy efectiva, tendría
incluso que ser posible reducir el tiempo de la fase de incubación.
La recuperación de Staph. aureus y P. aeruginosa en
la fracción plasmática fue del orden del 80% al 90%.
Por consiguiente, este protocolo permite
eliminar de forma considerablemente efectiva leucocitos de muestras
de sangre total sin perder una cantidad significativa de bacterias.
Esto se consigue proporcionando anticuerpos específicos para
células eucariotas, anticuerpos que carecen de un extremo Fc de
unión a bacterias.
Ejemplo
4
Un protocolo más apropiado podría ser un formato
experimental que combinara anticuerpos carentes de un extremo Fc de
unión a bacterias (por ejemplo, el enfoque descrito en el ejemplo 3
que incluye el uso de anticuerpos tetraméricos y la
inmunoprecipitación) con separación mediante la tecnología de
microesferas magnéticas. Un formato de este estilo tiene la ventaja
de que se puede integrar fácilmente en un dispositivo automatizado
como por ejemplo el sistema del MagNA PURE® (Roche Diagnostics).
En este enfoque, los leucocitos se
coprecipitarían a través de complejos
anticuerpo-célula eucariota unidos directa o
indirectamente a microesferas magnéticas (en lugar de a eritrocitos
como en el caso de la aproximación con anticuerpos
tetraméricos/inmunoprecipitación). Podrían utilizarse microesferas
recubiertas de polihapteno digoxigenina y anticuerpos
<Dig>.
Parece ser que se excluyen las interacciones no
deseadas entre las proteínas de unión a inmunoglobulinas de las
bacterias y el inmunorreactivo utilizado debido al bloqueo de la
fracción Fc\gamma de las IgG presentes en los complejos de
anticuerpos tetraméricos.
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Woldringh, C.L. et al., J.
Bacteriol. 148 (1981) 58-63.
Claims (18)
1. Un método de aislamiento de bacterias de una
muestra biológica, que consiste en los siguientes pasos:
- la provisión de anticuerpos de unión
específica a las células eucariotas que se encuentran en dicha
muestra biológica, estando dichos anticuerpos carentes de un
extremo Fc de unión a bacterias;
- la mezcla de dichos anticuerpos y de dicha
muestra biológica; y
- la separación de los complejos
anticuerpo-célula eucariota de la mezcla.
2. Un método de extracción de ácidos nucleicos
bacterianos o proteínas bacterianas de una muestra biológica, que
consiste en los siguientes pasos:
- la provisión de anticuerpos de unión
específica a las células eucariotas que se encuentran en dicha
muestra biológica, estando dichos anticuerpos carentes de un
extremo Fc de unión a bacterias;
- la mezcla de dichos anticuerpos y de dicha
muestra biológica;
- la separación de los complejos
anticuerpo-célula eucariota de la mezcla; y
- la extracción de los ácidos nucleicos
bacterianos o las proteínas bacterianas que contiene dicha mezcla
de la que se han separado los complejos
anticuerpo-célula eucariota.
3. Un método de detección de ácidos nucleicos
bacterianos o proteínas bacterianas de una muestra biológica, que
comprende los siguientes pasos:
- la provisión de anticuerpos de unión
específica a las células eucariotas que se encuentran en dicha
muestra biológica, estando dichos anticuerpos carentes de un
extremo Fc de unión a bacterias;
- la mezcla de dichos anticuerpos y de dicha
muestra biológica;
- la separación de los complejos
anticuerpo-célula eucariota de la mezcla;
- la extracción de los ácidos nucleicos
bacterianos o las proteínas bacterianas que contiene dicha mezcla
de la que se han separado los complejos
anticuerpo-célula eucariota; y
- la detección de los ácidos nucleicos
bacterianos o las proteínas bacterianas que se encuentran en dicha
muestra biológica.
4. Un método de la reivindicación 3 para la
detección de ácidos nucleicos bacterianos en una muestra biológica,
en el que estos ácidos nucleicos bacterianos son detectados mediante
una reacción de amplificación de ácidos nucleicos que incluye de
forma opcional un paso de hibridación de sonda.
5. Un método según las reivindicaciones 1 a 4 en
el que los complejos anticuerpo-célula eucariota son
separados de la muestra biológica mediante centrifugación.
6. Un método según la reivindicación 5 en el que
la centrifugación se realiza en presencia de un medio de gradiente
de densidad.
7. Un método según las reivindicaciones 1 a 4 en
el que los complejos anticuerpo-célula eucariota son
separados de la muestra biológica mediante filtración.
8. Un método según las reivindicaciones 1 a 4 en
el que dichos anticuerpos están recubriendo microesferas magnéticas
de forma directa o indirecta.
9. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que dichos anticuerpos son complejos de
anticuerpos tetraméricos.
10. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que dichos anticuerpos son fragmentos
Fab o fragmentos F(ab')2.
11. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que dichos anticuerpos tienen el
extremo Fc oculto.
12. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que dichos anticuerpos son anticuerpos
del tipo IgM.
13. La utilización de anticuerpos de unión
específica a células eucariotas, y que carecen de un extremo Fc de
unión a bacterias, para la reducción significativa del número de
células eucariotas de una muestra biológica en un método de
aislamiento bacteriano de una muestra biológica.
14. La utilización de anticuerpos de unión
específica a células eucariotas, y que carecen de un extremo Fc de
unión a bacterias, para la extracción de ácidos nucleicos
bacterianos o proteínas bacterianas de una muestra biológica.
15. La utilización de anticuerpos de unión
específica a células eucariotas, y que carecen de un extremo Fc de
unión a bacterias, para la detección de ácidos nucleicos bacterianos
o proteínas bacterianas de una muestra biológica.
16. Un equipo para la extracción de ácidos
nucleicos bacterianos o proteínas bacterianas de una muestra
biológica, que consiste en:
- uno o varios recipientes, anticuerpos de unión
específica a las células eucariotas de dicha muestra biológica,
carentes de un extremo Fc de unión a bacterias; y
- sistemas, en uno o varios recipientes, para la
extracción de ácidos nucleicos o proteínas.
17. Un equipo para la detección de ácidos
nucleicos bacterianos o proteínas bacterianas de una muestra
biológica, que además consiste en:
- uno o varios recipientes, anticuerpos de unión
específica a las células eucariotas de dicha muestra biológica,
carentes de un extremo Fc de unión a bacterias;
- sistemas, en uno o varios recipientes, para la
extracción de ácidos nucleicos o proteínas; y
- sistemas para la detección de ácidos nucleicos
o proteínas.
18. Un equipo para la detección de ácidos
nucleicos bacterianos de una muestra biológica, que además consiste
en:
- uno o varios recipientes, anticuerpos de unión
específica a las células eucariotas de dicha muestra biológica,
carentes de un extremo Fc de unión a bacterias;
- sistemas, en uno o varios recipientes, para la
extracción de ácidos nucleicos o proteínas;
- sistemas para la detección de ácidos nucleicos
o proteínas; y
-sistemas para la amplificación de una región
diana de ácido nucleico bacteriano, preferiblemente mediante
PCR.
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