ES2276392T3

ES2276392T3 - Crecimiento in vitro de islotes funcionales de langerhans y utilizaciones in vivo de los mismos.

Info

Publication number: ES2276392T3
Application number: ES95917753T
Authority: ES
Inventors: Ammon B. Peck; Janet G. Cornelius
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2015-04-28
Also published as: CA2188648A1; EP0758376B1; WO1995029988A1; AU709165B2; JPH09512440A; ATE347585T1; MX9604845A; US5834308A; KR100374976B1; AU2369595A; JP3621106B2; DE69535328T2; EP0758376A1; DE69535328D1

Abstract

EL OBJETO DE LA INVENCION SE REFIERE A NUEVOS METODOS QUE HACEN POSIBLE, POR PRIMERA VEZ, EL CRECIMIENTO DE ISLOTES FUNCIONALES EN CULTIVOS IN VITRO. DICHO OBJETO SE RELACIONA TAMBIEN CON LA UTILIZACION DE LAS ESTRUCTURAS DE TIPO ISLOTE CRECIDAS IN VITRO, CON EL FIN DE IMPLANTARLAS EN UN MAMIFERO PARA TERAPIA IN VIVO DE LA DIABETES. EL CITADO OBJETO SE RELACIONA ASIMISMO CON UN PROCEDIMIENTO QUE UTILIZA IMPLANTES DE ISLOTES CRECIDOS IN VITRO PARA HACER CRECER UN ORGANO IN VIVO, QUE POSEE LAS MISMAS CARACTERISTICAS FUNCIONALES, MORFOLOGICAS E HISTOLOGICAS, QUE LAS OBSERVADAS EN EL TEJIDO PANCREATICO NORMAL. LA POSIBILIDAD DE HACER CRECER DICHAS CELULAS Y ORGANOS IN VIVO, ABRE NUEVAS E IMPORTANTES VIAS DE INVESTIGACION Y TERAPIA EN RELACION CON LA DIABETES.

Description

Crecimiento in vitro de islotes funcionales de Langerhans y utilizaciones in vivo de los mismos.

Antecedentes de la invención

La diabetes es un importante problema de salud público. Según se presentó en 1987 en el Report of The National Long-Range Plan to Combat Diabetes comisionado por el National Diabetes Advisory Board, se sabe que padecen diabetes seis millones de personas en los Estados Unidos y 5 millones más padecen la enfermedad sin que les haya sido todavía diagnosticada. Cada año, se identifican más de 500.000 casos nuevos de diabetes. En 1984, la diabetes causó directamente 35.000 muertes de americanos y fue un factor que contribuyó en otras 95.000.

Las complicaciones oculares de la diabetes son la causa más destacada de los casos nuevos de ceguera legal en personas de edades de 20 a 74 años en los Estados Unidos. El riesgo de una amputación de una extremidad inferior es 15 veces mayor en individuos con diabetes que en individuos sin ella. La enfermedad de riñón es una complicación de la diabetes frecuente y grave. Aproximadamente el 30 por ciento de todos los pacientes nuevos en los Estados Unidos que son tratados de enfermedad renal en etapa terminal padecen diabetes. Los individuos con diabetes tienen asimismo un riesgo incrementado para la enfermedad periodontal. Las infecciones periodontales avanzan rápidamente y llevan no sólo a la pérdida de dientes sino también a una función metabólica comprometida. Las mujeres con diabetes tienen un grave riesgo de complicaciones durante el embarazo. Las estadísticas actuales sugieren que las proporciones de mortalidad para niños de madres con diabetes son de aproximadamente 7 por ciento.

Claramente, la carga económica de la diabetes es enorme. Cada año, pacientes con diabetes o sus complicaciones gastan 24 millones de días de paciente en hospitales. Una estimación conservadora de los costes anuales atribuibles a la diabetes es de por lo menos 24 billones de dólares (American Diabetes Association est., 1988); sin embargo, el impacto económico total de esta enfermedad es incluso mayor porque los gastos médicos adicionales se atribuyen a menudo a complicaciones específicas de la diabetes más que a la diabetes en sí misma.

La diabetes es una enfermedad crónica, de metabolismo complejo que resulta de la incapacidad del cuerpo para mantener y utilizar adecuadamente los carbohidratos, grasas y proteínas. Resulta de la interacción de diversos factores hereditarios y de factores ambientales y se caracteriza por niveles elevados de glucosa en sangre causados por una deficiencia en la producción de insulina o en un deterioro de su utilización. La mayoría de los casos de diabetes se dividen en dos tipos clínicos: Tipo I, o aparición en la juventud, y Tipo II, o aparición en el adulto. Se hace referencia a menudo a la diabetes de tipo I como Diabetes Dependiente de Insulina, o IDD. Cada tipo posee un pronóstico, tratamiento y causa diferentes.

Aproximadamente de 5 a 10 por ciento de pacientes con diabetes poseen la IDD. La IDD se caracteriza por una incapacidad parcial o completa para producir insulina debido a la destrucción de las células \beta productoras de la insulina de los islotes pancreáticos de Langerhans. Los pacientes con la IDD morirían sin las inyecciones de insulina diarias para controlar su enfermedad.

Hasta mediados de 1970 se hicieron pocos avances para la resolución de la patogénesis de la diabetes cuando se empezaron a acumular evidencias que sugerían que el Tipo I de la IDD poseía una etiopatogénesis autoinmune. Se acepta en la actualidad por lo general que la IDD resulta de una respuesta autoinmune progresiva que destruye selectivamente las células \beta productoras de la insulina de los islotes pancreáticos de Langerhans en individuos que están genéticamente predispuestos. La autoinmunidad de la célula \beta en la IDD implica tanto mecanismos inmunes humorales (Baekkeskov et al, 1982, Baekkeskov et al, 1990; Reddy et al, 1988; Pontesilli et al, 1987) como los mediados por células (Reddy et al, 1988; Pontesilli et al, 1987; Wang et al, 1987). La inmunidad humoral se caracteriza por la aparición de autoanticuerpos en las membranas de células \beta (autoanticuerpos anti-69 kD y de superficie de la célula del islote), contenidos de células \beta (anticarboxipeptidasa A_{1}, autoanticuerpos anti-64 kD y/o anti-GAD), y/o productos de secreción de la célula \beta (antiinsulina). Mientras el suero no transfiere IDD, el autoanticuerpo de la célula anti-\beta se produce en una etapa muy temprana, planteando la cuestión de un activador ambiental, involucrando posiblemente el mimetismo antigénico. La presencia de la reactividad inmunológica mediada por célula en el curso natural de la IDD se evidencia por una lesión inflamatoria dentro de los islotes pancreáticos, denominada insulitis. La insulitis, en la que los infiltrados celulares inflamatorios/inmunes son visibles claramente mediante histología, se ha demostrado que está comprendida de numerosos tipos de células, incluyendo los linfocitos T y B, los monocitos y las células asesinas naturales (Signore et al, 1989; Jarpe et al, 1991). Los experimentos de transferencia adoptivos utilizando un ratón NOD (diabético no obeso) como modelo de la IDD humana ha establecido firmemente un rol primario para los linfocitos T autoagresivos en la patogénesis de la IDD (Bendelac, et al, 1987; Miller et al, 1988; Hanafusa et al, 1988; Bendelac et al, 1988). Desafortunadamente, los mecanismos de destrucción subyacentes de las células \beta pancreáticas permanecen desconocidos.

Se han investigado numerosas estrategias (por ejemplo, sustitución de la médula ósea, fármacos inmunosupresores e inmunizaciones de autoantígeno) como medios posibles para detener el ataque inmunológico contra las células \beta pancreáticas. Sin embargo, para que estos planteamientos sean efectivos, se deben identificar los individuos que desarrollarán eventualmente enfermedades clínicas. Muy a menudo, los pacientes se identifican demasiado tarde para una terapia de intervención eficaz ya que el ataque inmunológico ha progresado hasta un punto en el que ya se ha destruido un porcentaje elevado de células \beta. Debido a que se piensa que la célula \beta está en una etapa final de la diferenciación celular, se cree que el cuerpo posee poca capacidad para regenerar células \beta nuevas, necesitando de este modo la terapia regular de insulina de vida larga. Recientemente, un enfoque para superar este problema ha sido el transplante de células de islote. El transplante de células de islote posee la desventaja de que los islotes son alogénicos lo que, a su vez, puede invocar una respuesta aloinmune. De este modo, habría unas ventajas fundamentales para cultivar islotes de Langerhans que contienen células \beta funcionales directamente de los pacientes con IDD.

El documento WO 93/00441 describe un procedimiento para establecer células secretoras de hormonas in vitro que comprende las etapas que consisten en (a) seleccionar por lo menos una célula que posea el potencial secretor de hormona a partir de una población de células similares que posean potencial secretor de hormona, (b) colocar dicha célula en un medio establecido que es capaz de promover la viabilidad de dicha célula durante por lo menos 13 días in vitro, y (c) mantener la viabilidad de por lo menos una de dichas células y la progenie de dicha célula durante por lo menos 13 días in vitro.

Shieh et al, Autoimmunity, 1993; 15(2): 123-35 describen la preparación de suspensiones de célula única de células de islote a partir de células de islote aisladas del páncreas de ratones. Los páncreas se eliminan de los ratones macho y hembra, se trituran, y los fragmentos pequeños que resultan se colocan en viales de vidrio escintilante. Se aíslan 275-350 islotes de los animales. Después de dos lavados con solución salina equilibrada de Hank (HBSS), se digieren los fragmentos durante 15 minutos en un baño de agua agitado a 37ºC utilizando una solución de colagenasa del tipo V (4 mg/ml) y ADNasa del tipo II (2000 unidades/ml). El sobrenadante de esta primera digestión se transfiere a una placa de cultivo de Petri de 60 mm en la que se detiene la reacción enzimática con la adición de HBSS enfriada con hielo complementada con suero bovino fetal al 1% (FBS). A continuación se añade la nueva enzima al material pancreático restante no digerido. Este procedimiento se repite cada 5 minutos hasta la digestión final. El islote individual se recoge de los páncreas digeridos en un alcance de disección utilizando una micropipeta Lang-Levy y se coloca en un medio mínimo esencial de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM). Los islotes se granulan en una centrifugación de baja velocidad (200 x g durante 10 minutos), se descarta el sobrenadante y los islotes restantes se resuspenden en PBS que contiene 0,025% de tripsina, EDTA 0,02 M y 2000 unidades/ml de ADNasa de tipo II. A continuación, los islotes se dispersan en células únicas mediante pipetado suave durante por lo menos 10 minutos en un baño de agua a 37ºC. La reacción se detiene mediante la adición de IMDM enfriado con hielo, complementado con FBS al 1%. Las células dispersas se lavan dos veces con HBSS. Las suspensiones de células únicas de los islotes pancreáticos se suspenden a continuación en una solución de Percoll al 55% (d x 1,070) y se centrifugan 25 minutos a 600 x g. La vasta mayoría de las células de islote se mueven hasta la parte superior del gradiente mientras cualquiera de las células infiltradas se mueve hasta el fondo del tubo de centrífuga. Cada fracción se recoge y se lava dos veces con
HBSS.

Breve sumario de la presente invención

El objeto de la presente invención se refiere al descubrimiento de que los islotes funcionales que contienen células \beta productoras de insulina, además de otros tipos de células de islote, pueden crecer en un cultivo a largo plazo a partir de células del tallo pluripotentes únicas.

Los nuevos procedimientos del objeto de la presente invención aprovechan el descubrimiento de que las células del tallo pluripotentes existen incluso en el páncreas de individuos adultos. Las células se pueden cultivar en un medio nutriente de contenido elevado en aminoácidos que se complementa con suero normal que procede preferentemente de las mismas especies de mamífero que se utilizan como el origen de las células de islote (suero homólogo). A continuación este cultivo se deja en reposo durante varias semanas para permitir el establecimiento de células estromales. Una vez la capa de célula estromal está madura, se puede iniciar la diferenciación celular mediante la realimentación del cultivo celular con el medio de contenido elevado en aminoácidos complementado con el suero normal homólogo más la glucosa. Después de un periodo adicional de crecimiento, los islotes funcionales que contienen células que producen insulina, glucagón, somatostatina y otras hormonas endocrinas se pueden recuperar a continuación utilizando técnicas estándar.

Anteriormente no se había conocido o sospechado que las células pancreáticas se podrían utilizar para hacer crecer en un cultivo nuevas células de islote, incluyendo células \beta. El descubrimiento fortuito de las técnicas de cultivo para el crecimiento de tejido similar al islote in vitro elimina lo que anteriormente había sido una barrera fija, permanente y sustancial a la investigación de la diabetes. Los procedimientos y materiales nuevos descritos en la presente memoria posibilitarán una mejor comprensión de los mecanismos de la diabetes. Además, la capacidad de crecimiento de las células de islote en un cultivo hará posibles por primera vez ahora ciertas terapias para la diabetes. Por ejemplo, según el objetivo de la presente invención, los islotes de cultivo nuevos de individuos diabéticos se pueden implantar en un paciente como una medida de control o eliminar la necesidad del paciente de la terapia de insulina porque los islotes y/o células de islote cultivados son capaces de producir insulina in vivo. De este modo, el objeto de la presente invención se refiere asimismo a la utilización de los islotes cultivados in vitro del objeto de la presente invención para el implante en una especie de mamífero para el tratamiento in vivo de la IDD.

El objeto de la presente invención facilita asimismo enormemente la ingeniería genética de células de islote para resistir una destrucción inmunológica posterior. Por ejemplo, las células de islote cultivadas se pueden transformar para expresar una proteína o un péptido que inhibirá o evitará la destrucción del procedimiento inmune. Se pueden expresar otras proteínas o péptidos útiles.

De este modo, la capacidad para cultivar islotes que funcionan in vitro a partir de células pancreáticas de un individuo representa un importante avance técnico y facilita la utilización de nuevas estrategias para tratar la IDD. El descubrimiento de que las células de tallo pluripotentes existen en el páncreas de un adulto evita la necesidad de utilizar tejido fetal como una fuente de células.

El objeto de la presente invención se refiere asimismo a las células de islote producidas in vitro según los procedimientos descritos en la presente memoria. Estas células se pueden producir a partir de suspensiones de células pancreáticas de mamífero cultivadas in vitro y pueden proporcionar un aumento de células de islote funcionales y de las estructuras de tejido similares al islote.

El objeto de la presente invención se refiere además al crecimiento, la propagación y la diferenciación in vitro de una célula de tallo pancreática, es decir, una célula o células progenitoras que pueden proporcionar un aumento en la formación de todos los tipos diferentes de células y de tejido que componen un páncreas normal. Además, el objetivo de la presente invención se refiere a la utilización in vivo de las células de tallo pancreáticas cultivadas in vitro para producir un órgano "ectopáncreas" que presenta características histológicas, morfológicas y funcionales similares a las observadas en un páncreas normal. De esta manera, la capacidad para producir un "ectopáncreas" funcional in vivo a partir de células pancreáticas cultivadas in vitro se puede utilizar para tratar, invertir o curar una amplia variedad de enfermedades pancreáticas que es sabido que resultan de un daño o la destrucción del
páncreas.

Breve sumario de las figuras

Las figuras 1A a 1D muestran células cultivadas según los procedimientos del objeto de la presente invención.

La figura 2 muestra un cultivo de islote según el objeto de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Según el objeto de la presente invención, los islotes funcionales de Langerhans se pueden cultivar por primera vez en cultivos in vitro. Las técnicas del objeto de la presente invención resultan en cultivos celulares que pueden producir insulina, glucagón, somatostatina u otras hormonas endocrinas. Se pueden producir otras proteínas útiles mediante, por ejemplo, la transformación de la célula de islote con ADN que codifica las proteínas de interés. La capacidad para cultivar estos cultivos de células funcionales posibilita a los expertos en la materia llevar a cabo procedimientos que no eran posibles anteriormente.

El procedimiento del objeto de la presente invención implica preparar suspensiones de células de tallo a partir del páncreas de un mamífero. Preferentemente, las células de tallo serían de páncreas de un mamífero prediabético. Sin embargo, se contempla asimismo que las células de mamífero que ya muestren signos clínicos de diabetes se puedan utilizar con el objeto de la presente invención. Las suspensiones celulares se preparan utilizando técnicas estándar. A continuación la suspensión celular se cultiva en un medio nutriente que facilita el crecimiento de las células. En una forma de realización preferida, el medio nutriente es uno que posee una concentración elevada de aminoácidos. Dicho medio se conoce como medio EHAA de Click y es bien conocido y está fácilmente a disposición de los expertos en la materia. Se podrían preparar otros medios nutrientes equivalentes y ser utilizados por los expertos en la materia. El medio utilizado para suspender las células del islote se complementa de forma ventajosa con suero normal de las mismas especies de mamíferos a partir de las cuales se originan las células del islote. De este modo, en el caso de los islotes de ratón el medio se complementa con suero de ratón normal, mientras que en el caso de células de islote humano el medio se complementa con suero humano normal. La preparación de suero normal es bien conocida por los expertos en la materia. La concentración del suero normal utilizado con el procedimiento de cultivo celular del objeto de la presente invención puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%, pero para los ratones es preferentemente de aproximadamente 1%. Para el suero humano, se prefiere una concentración más elevada, por ejemplo, de aproximadamente 5%.

A continuación se incuba la suspensión celular en el medio nutriente complementado con suero normal bajo condiciones que facilitan el crecimiento celular, preferentemente a aproximadamente 35-40ºC y, preferentemente, en aproximadamente 5% de CO_{2} atmosférico. Este periodo de incubación, de esta manera, se lleva a cabo utilizando procedimientos estándar bien conocidos por los expertos en la materia. A continuación el cultivo celular se deja en reposo sin alimentación durante por lo menos aproximadamente 3 semanas. Durante este tiempo las células estromales proliferan y establecen una monocapa que proporcionará en última instancia un aumento de células de islote. La iniciación de la diferenciación celular se puede provocar mediante la realimentación de los cultivos con medio EHAA de Click complementado con suero normal según se ha descrito anteriormente. La realimentación rápida se encontró que inducía a una extensiva formación de focos de islote con una considerable diferenciación celular. Tras el examen histológico de las células en las estructuras similares a un islote, se identificaron por lo menos tres tipos distintos de células y parecieron similares a las células de islote preparadas a partir de los islotes de ratones de control. El tiempo requerido para que se produzca la diferenciación celular dentro de estos focos disminuyó a medida que la frecuencia de realimentación se incrementaba.

Los presentes inventores son capaces de propagar y expandir los cultivos productores de islotes mediante la transferencia en serie de células estromales derivadas de islotes más los focos de islote a nuevos matraces de cultivo. Esto facilita la generación de números suficientes de islotes según se requiera para su utilización en los procedimientos descritos anteriormente en la presente memoria, por ejemplo, invirtiendo los problemas metabólicos de la
IDD.

Para determinar si las estructuras similares a un islote y/o las células de islote producidas in vitro según el objetivo de la presente invención podrían invertir la IDD, se implantaron estructuras similares a los islotes en ratones NOD. Los ratones que recibieron los implantes de islote mostraron una inversión de la diabetes dependiente de la insulina, mientras que los ratones NOD que no se trataron mostraron los signos de la enfermedad clínica. De esta manera, los implantes de islotes objeto de la presente invención se pueden utilizar in vivo para tratar la diabetes en mamíferos, incluyendo humanos.

En una forma de realización preferida objeto de la presente invención, se puede disminuir o detener la progresión de la diabetes mediante la reimplantación de islotes autólogos diseñados para ser resistentes a los factores específicos implicados en el ataque inmunológico. Por ejemplo, los islotes se pueden diseñar de forma que sean resistentes al interferón \gamma derivado de la célula T citotóxica. La disponibilidad de cultivos a largo plazo de islotes completos se puede utilizar asimismo en investigaciones en la patogénesis de la IDD, incluyendo el reconocimiento celular de las células \beta, el modo de infiltración de islote y los mecanismos inmunes de la destrucción de las células \beta. Además, esta tecnología facilitará el transplante de islotes, la sustitución de islotes autólogos e incluso el desarrollo de islotes artificiales. El crecimiento de estas células según los procedimientos objeto de la presente invención posee una gran utilidad en la enseñanza a los estudiantes de los aspectos importantes relacionados con la diferenciación y función celular.

En una forma de realización adicional objeto de la presente invención, se han cultivado in vitro las células de tallo pancreáticas pluripotentes a partir de las células de páncreas aisladas de un mamífero. Un descubrimiento sorprendente utilizando estas células crecidas in vitro en conjunción con los procedimientos del objeto de la presente invención fue la capacidad para cultivar y producir, in vivo, un órgano que mostró tejidos funcionales, morfológicos e histológicos endocrinos y exocrinos. El ectopáncreas (un órgano similar al páncreas situado en un sitio anormal dentro de la cavidad corporal) producido in vivo según el objeto de la presente invención representa un descubrimiento científico fundamental y proporciona un medio nuevo para el estudio, tratamiento, inversión o curación de un número de condiciones patogénicas asociadas con el páncreas.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "crecimiento" se refiere al mantenimiento de las células en un estado vivo y puede incluir, pero no se limita a, la propagación y/o diferenciación de las células. El término "propagación" se refiere a un incremento en el número de células presentes en un cultivo como resultado de la división celular.

A continuación siguen ejemplos que ilustran estos procedimientos, incluyendo el mejor modo de poner en práctica la presente invención. Estos ejemplos no se deberían interpretar como limitativos. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de disolventes son en volumen a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1

Cultivo de los islotes funcionales de Langerhans

Se prepararon suspensiones celulares únicas de células de islote a partir de islotes completos aislados del páncreas de ratones NOD/UF machos prediabéticos de 19-20 semanas de edad, según se detalla en otras partes (Shieh et al, 1993). Típicamente, aproximadamente el 25% de los ratones macho en una colonia NOD tendrán una IDD manifiesta a esta edad y todos padecerán insulitis grave. Se resuspendieron las células de islote en el medio EHAA de Click complementado con suero de ratón normal (NMS) al 1% (Peck and Bach, 1973; Peck and Click, 1973), se colocaron en matraces de cultivo de tejido de 25 cm^{2} y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. En esta etapa, son posibles dos resultados: primero, pueden dominar las células infiltradas en el islote, permitiendo de este modo el establecimiento de las líneas celulares inmunes, o segundo, pueden dominar las células similares a las estromales, permitiendo de este modo el crecimiento de una monocapa de "células nodriza". El crecimiento de las monocapas celulares similares a las estromales pareció resultar cuando las células infiltradas en el islote se colocaron en placas simultáneamente pero en número limitado. El enriquecimiento de las células del islote con números disminuidos de células infiltradas se puede conseguir mediante la separación de gradiente (Jarpe et al, 1991). Los cultivos de células estromales, cuando se dejaron en reposo durante 4-5 semanas (es decir, sin realimentación) proliferaron hasta cubrir completamente la superficie del fondo del recipiente de cultivo. A partir de esta monocapa de células, las células redondas pequeñas parecieron brotar a partir de la capa celular estromal.

Se inició la diferenciación de los cultivos mediante la realimentación de los cultivos con medio EHAA de Click complementado con NMS y una solución de azúcar que comprende glucosa o sacarosa u otros equivalentes de azúcar. Típicamente, el azúcar es glucosa. La concentración de glucosa puede estar entre aproximadamente 10 mM y 25 mM, pero típicamente está entre 15 y 17 mM. Preferentemente, la concentración de glucosa en el medio es de aproximadamente 16 mM. Las técnicas para la realimentación de cultivos celulares in vitro son bien conocidas en la materia y implican típicamente la eliminación de aproximadamente 50% a aproximadamente 90% del medio nutriente viejo y la adición de medio fresco al matraz de cultivo. La realimentación rápida indujo la formación de un incremento del número de centros de crecimiento de islote (referida en la presente memoria como focos) presentando diferenciación celular. La velocidad de realimentación puede ser, por ejemplo, aproximadamente a intervalos de una semana. Preferentemente, la velocidad de realimentación es aproximadamente a intervalos de 5 a 6 días.

En la producción de pico, se produjeron tantos como 150-200 focos simultáneamente en un único matraz de cultivo de tejido de 25 cm^{2}. A medida que se produjo la proliferación y la diferenciación celular, tuvo lugar la organización del islote y el islote incluso pareció rodearse a sí mismo de un material capsular. Los islotes por lo general crecieron hasta un tamaño constante (aunque varios crecieron hasta aproximadamente dos veces el tamaño general), a continuación se separaron de las capas estromales para flotar en el medio. Estos islotes que flotaban libremente en el medio tendieron a romperse a las 48-72 horas, de forma similar a los islotes pancreáticos aislados cultivados bajo condiciones similares.

Las estructuras similares al islote, recogidas después de la separación natural o de la eliminación a partir de las capas estromales utilizando una pipeta pasteur, se lavaron suavemente en el medio, a continuación se introdujeron en suspensiones celulares únicas mediante el pipetado de reflujo. Las suspensiones celulares únicas se prepararon mediante citocentrifugación, se tiñeron a continuación para la morfología general y para la producción de insulina. Las células contenían focos que produjeron las hormonas endocrinas glucagón (células \alpha), insulina (células \beta) y/o somatostatina (células \delta). Además, la población principal de células se tiñeron positivas con el anticuerpo de antiinsulina, indicando que el tipo de célula principal contenido en el islote cultivado es una célula \beta productora de insulina. Las Figuras 1A a 1D muestran los tipos de células diversos que se desarrollan durante el procedimiento de cultivo. La Figura 2 muestra un islote bien desarrollado obtenido después del cultivo in vitro de células según el procedimiento del objeto de la presente invención.

Ejemplo 2

Cultivo de células de islote humano

Para cultivar las células de islote humano, se utilizó un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1. El procedimiento del objeto de la presente invención es ventajoso particularmente porque no es necesario utilizar células fetales para iniciar el cultivo celular. En una forma de realización preferida, se pueden suspender células humanas en medio EHAA de Click (o el equivalente del mismo) complementado con suero humano normal. Preferentemente, la concentración del suero humano normal en el medio es de aproximadamente 5%. Los cultivos se deberían dejar en reposo sin realimentación, preferentemente durante varias semanas. Después de aproximadamente 4-5 semanas de cultivo, se puede iniciar la diferenciación celular mediante la realimentación de los cultivos con medio EHAA de Click complementado con suero humano normal y glucosa según se describe en el Ejemplo 1. Se pueden recoger posteriormente las estructuras similares al islote y se pueden preparar las suspensiones celulares únicas para la propagación adicional según se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

Implantación de células de islote cultivadas in vitro

Para probar la eficacia de estas estructuras similares al islote generadas in vitro para invertir las complicaciones de la IDD, se sacaron del matraz de cultivo de tejido aproximadamente 150-200 focos más algo de células estromales cultivadas in vitro según el procedimiento del objetivo de la presente invención a partir de tejido pancreático de ratones NOD mediante pipetado de reflujo. A continuación se implantaron las células por debajo de la cápsula del riñón de ratones NOD diabéticos singeneicos y se mantuvieron con inyecciones de insulina diarias. El implante se llevó a cabo mediante el pinchazo de la cápsula de riñón con una aguja hipodérmica, ensartando una región de córtex delgada. El tubo capilar se retiró cuidadosamente y se cauterizó el sitio de la punción. La incisión quirúrgica de cada ratón implantado se fijó hasta que la piel mostró signos de curación. Los ratones implantados se mantuvieron con inyecciones de insulina durante 4 días a una dosificación diaria completa, y a continuación durante 2 días a la mitad de la dosificación diaria, después de lo cual los ratones se retiraron completamente del tratamiento de insulina. Los animales de control consistieron en ratones NOD diabéticos que no recibieron ningún implante.

A continuación, cuando se retiraron los ratones NOD de control de las inyecciones de insulina diarias, mostraron una rápida aparición manifiesta de la enfermedad, incluyendo letargia, disnea, pérdida de peso, niveles de glucosa incrementados en sangre, síndrome debilitante, fallo en la curación de heridas y muerte a las tres semanas. Los ratones NOD con implante mantuvieron un nivel de glucosa en sangre de aproximadamente 180 mg/dl (que es ligeramente superior al intervalo normal de los ratones), mostraron una actividad incrementada, una rápida curación de los sitios quirúrgicos y de los de la extracción de sangre, no desarrollaron disnea y permanecieron saludables hasta que se sacrificaron para estudios histológicos. Se han apreciado observaciones similares con implantes intraesplénicos.

Ejemplo 4

Producción de ectopáncreas in vivo

Los exámenes histológicos de los sitios de implantes en ratones que se implantaron con las células de islote según se describe en el Ejemplo 3 revelaron una característica adicional de las células de tallo formadoras de islotes generados in vitro. Las células implantadas que "fugaron" del sitio de implante del riñón experimentaron proliferación adicional y una diferenciación y formaron un ectopáncreas elevadamente estructurado. En primer lugar, el tejido del ectopáncreas consistió completamente en células exocrinas proliferadoras que se organizaron en un páncreas exocrino completo con vasos sanguíneos inervados. Este páncreas exocrino progresó para formar estructuras endocrinas similares a los islotes. De este modo, los cultivos celulares in vitro producidos según los procedimientos del objeto de la presente invención contienen células de tallo pancreáticas pluripotentes capaces de regenerar un páncreas completamente nuevo. El crecimiento de un páncreas que contiene tanto tejido exocrino como endocrino proporciona nuevos procedimientos para el tratamiento de enfermedades pancreáticas, incluyendo pancreatitis y cáncer de páncreas.

Referencias

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Claims

1. Procedimiento para la generación in vitro de estructuras similares a un islote y a células de islote, que comprende cultivar células de páncreas derivadas de una especie de mamífero en un medio nutriente complementado con suero normal, permitir a dichas células pancreáticas crecer en reposo durante por lo menos aproximadamente 3 semanas hasta que proliferan las células estromales y establecer una monocapa de células que incluye células de tallo pancreáticas e iniciar la diferenciación celular de las células de tallo de la monocapa en células de islote funcionales y estructuras similares a un islote mediante la realimentación de las células de la monocapa con un medio nutriente complementado con suero normal.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células pancreáticas derivadas de la especie de mamífero son células de islote.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el suero normal se obtiene de la especie de mamífero a partir del cual se obtuvieron las células de islote.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que las células pancreáticas son células de islote humano y el suero es suero humano normal.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho medio nutriente comprende un medio nutriente de contenido elevado en aminoácidos.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de cultivo utilizado para realimentar dicha monocapa de células comprende además glucosa.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la diferenciación se inicia entre 4 y 5 semanas de crecimiento de cultivo mediante la realimentación de las células de la monocapa con el medio nutriente complementado con el suero normal homólogo.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que a continuación de que la diferenciación sea iniciada mediante realimentación de las monocapas de células, las células se realimentan aproximadamente a intervalos de una semana.

9. Procedimiento para la producción de una hormona endocrina, que comprende llevar a cabo el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y recuperar dicha hormona endocrina a partir de las estructuras similares a un islote y las células de islote.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha hormona endocrina es insulina, glucagón o somatostatina.