ES2276405T3 - Ligandos de oligonucleotidos de alta afinidad a pdgf. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA LA IDENTIFICACION Y PREPARACION DE LIGANDOS DE ACIDO NUCLEICO DE ELEVADA AFINIDAD POR TGF BE}, PDGF Y HKGF. SE INCLUYEN EN LA INVENCION LIGANDOS DE RNA Y SSDNA ESPECIFICOS PARA TGF BE}1 Y PDGF IDENTIFICADOS MEDIANTE EL METODO SELEX. SE INCLUYEN ASIMISMO EN LA INVENCION LIGANDOS DE RNA ESPECIFICOS A HKGF IDENTIFICADOS MEDIANTE EL METODO SELEX. SE INCLUYEN ADICIONALMENTE LIGANDOS DE RNA QUE INHIBEN LA INTERACCION DE TGF BE}1 Y HKGF CON SUS RECEPTORES Y LIGANDOS DE DNA QUE INHIBEN LA INTERACCION DE PDGF CON SU RECEPTOR.

Description

Ligandos de oligonucleótidos de alta afinidad a PDGF.

Campo de la invención

Se describen en esta memoria procedimientos para identificar y preparar ligandos de ácidos nucleicos de elevada afinidad para TGF\beta, PDGF y hKGF. El procedimiento utilizado en el presente documento memoria para identificar estos ligandos de ácidos nucleicos se denomina SELEX, un acrónimo del inglés Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial). Esta invención incluye ligandos de ácidos nucleicos de elevada afinidad de PDGF. También se describen ligandos de ADN y ARN para TGF\beta1 y PDGF y ligandos de ARN para hKGF. También se incluyen oligonucleótidos que contienen derivados nucleotídicos químicamente modificados en las posiciones 2' de las pirimidinas. Adicionalmente se describen ligandos de ARN para TGF\beta1 y hKGF que contienen modificaciones 2'-NH_{2} o modificaciones 2'-F y ligandos de ARN de PDGF que contienen modificaciones 2'-F. Esta invención también incluye inhibidores de ácidos nucleicos de elevada afinidad para PDGF. Los oligonucleótidos de la presente invención son útiles como agentes de diagnóstico o compuestos farmacéuticos.

Antecedentes de la invención TGF\beta

Los polipéptidos del factor de crecimiento de transformación \beta (TGF\beta) tienen influencia en el crecimiento, la diferenciación y la expresión génica en muchos tipos celulares. El primer polipéptido de esta familia que se caracterizó, el TGF\beta1 tiene dos subunidades idénticas de 112 aminoácidos que están unidas covalentemente. El TGF\beta1 es una proteína altamente conservada con una diferencia de un único aminoácido entre la forma humana y de ratón. Hay dos otros miembros de la familia de genes de TGF\beta que se expresan en mamíferos. El TGF\beta2 es un 71% homólogo a TGF\beta1 (de Martin et al., (1987) EMBO J. 6:3673-3677), mientras que el TGF\beta3 es un 80% homólogo a TGF\beta1 (Derynck et al., (1988) EMBO J. 7:3737-3743). Las características estructurales de TGF\beta1 determinadas por resonancia magnética nuclear (Archer et al., (1993) Biochemistry 32:1164-1171) concuerdan con la estructura cristalina de TGF\beta2 (Daopin et al., (1992) Science 257:369-374; Schlunegger y Grutter (1992) Nature 358:430-434).

Aunque los TGF\beta tienen estructuras tridimensionales similares, no son fisiológicamente equivalentes. Existen al menos tres receptores extracelulares diferentes, tipo I, II y III, implicados en la señalización transmembrana de TGF\beta a células que tienen los receptores. Para revisiones, véase Derynck (1994) TIBS 19:548-553 y Massague (1990) Annu. Rev. Cell Biol 6:597-641. Para que el TGF\beta2 pueda interaccionar de manera efectiva con el receptor de TGF\beta de tipo II, el receptor de tipo III también debe estar presente (Derynck (1994) TIBS 19:548-553). Las células endoteliales vasculares no tienen el receptor de tipo III. En su lugar, las células endoteliales expresan una proteína relacionada estructuralmente denominada endoglina (Cheifetz et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:19027-19030), que únicamente se une a TGF\beta1 y TGF\beta3 con elevada afinidad. De este modo, la potencia relativa de los TGF\beta refleja el tipo de receptores expresados en un sistema celular y de órgano.

Además de la regulación de los componentes en las rutas de señalización multifactorial, la distribución de la síntesis de los polipéptidos de TGF\beta también afecta la función fisiológica. La distribución de TGF\beta2 y TGF\beta3 se encuentra más limitada (Derynck et al., (1988) EMBO J. 7:3737-3743) que TGF\beta1, por ejemplo, el TGF\beta3 está limitado a tejidos de origen mesenquimal, mientras que el TGF\beta1 está presente en células mesenquimales y epiteliales.

TGF\beta1 es una citoquina multifuncional crítica en la reparación de tejidos. Elevadas concertaciones de TGF\beta1 se envían al lugar del daño mediante gránulos plaquetarios (Assoian y Sporn, (1986) J Cell Biol. 102:1217-1223). El TGF\beta1 inicia una serie de acontecimientos que promocionan la curación incluyendo la quimiotaxis de células tales como leucocitos, monocitos y fibroblastos, y la regulación de los factores de crecimiento y citoquinas implicadas en la angiogénesis, división celular asociada a reparación de tejidos y respuestas inflamatorias. TGF\beta1 también estimula la síntesis de componentes de la matriz extracelular (Roberts et al, (1986) Proc. Natl. Acad Sci USA 83:4167-4171; Sporn et al., (1983) Science 219:1329-1330; Massague, (1987) Cell 49:437-438) y lo que es más importante para entender la patofisiología de TGF\beta1, TGF\beta1 autorregula su propia síntesis (Kim et al., (1989) J Biol Chem 264:7041-7045).

Se han asociado varias enfermedades con la sobreproducción de TGF\beta1. Las enfermedades fibróticas asociadas con la sobreproducción de TGF\beta1 se pueden clasificar en enfermedades crónicas tales como la fibrosis de riñón, pulmón e hígado, y enfermedades más agudas tales como la formación de cicatrices dérmicas y restenosis. La síntesis y secreción de TGF\beta1 por células tumorales también puede llevar a la supresión inmune tal como se ha observado en pacientes con tumores de mama o de cerebro agresivos (Arteaga et al., (1993) J Clin Invest 92: 2569-2576). El curso de la infección por leishmania en ratones se ve alterado de forma importante por TGF\beta1 (Barral-Netto et al., (1992) Science 257:545-547). El TGF\beta1 exacerbaba la enfermedad, mientras que los anticuerpos contra TGF\beta1 detenían la progresión de la enfermedad en ratones genéticamente susceptibles. Ratones resistentes genéticamente se convertían en susceptibles a infección por leishmania después de la administración de TGF\beta1.

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Se han revisado los importantes efectos del TGF\beta1 en la deposición de la matriz extracelular (Rocco y Ziyadeh, (1991) en Contemporary Issues in Nephrology v23, Hormones, autocoids y the kidney. ed. Jay Stein, Churchill Livingston, New York pp391-410; Roberts et al., (1988) Rec. Prog. Hormone Res. 44:157-197) e incluyen la estimulación de la síntesis y la inhibición de la degradación de componentes de la matriz extracelular. Debido a que la estructura y las propiedades de filtración de los glomérulos están determinadas en gran medida por la composición de la matriz extracelular de la membrana glomerular y del mesangio, no es sorprendente que el TGF\beta1 tenga efectos importantes en el riñón. La acumulación de matriz mesangial en el glomerulonefritis proliferativa (Border et al., (1990) Kidney Int. 37:689-695) y en la nefropatía diabética (Mauer et al., (1984) J. Clin Invest. 74:1143-1155) son características patológicas claras y dominantes de las enfermedades. Los niveles de TGF\beta1 se encuentran elevados en la glomeruloesclerosis diabética humana (neuropatía avanzada) (Yamamoto et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1814-1818). El TGF\beta1 es un mediador importante en la génesis de fibrosis renal en varios modelos animales (Phan et al., (1990) Kidney Int. 37:426; Okuda et al., (1990) J. Clin Invest. 86:453). La supresión de glomerulonefrito inducido experimentalmente en ratas se ha demostrado mediante antisuero contra TGF\beta1 (Border et al., (1990) Nature 346:371) y mediante una proteína de la matriz extracelular, la decorina, que se puede unir a TGF\beta1 (Border et al., (1992) Nature 360:361-363).

Demasiado TGF\beta1 lleva a la formación de tejido con cicatrices dérmicas. Anticuerpos de neutralización de TGF\beta1 inyectados en los bordes de heridas en curación en ratas ha mostrado que se inhibe la formación de cicatrices sin interferir en la velocidad de curación de la herida o en la resistencia de tracción de la herida (Shah et al, (1992) Lancet 339:213-214). Al mismo tiempo hubo angiogénesis reducida, un número reducido de macrófagos y monocitos en la herida, y una cantidad reducida de deposición de fibras de colágeno desorganizadas en el tejido cicatrizante.

El TGF\beta1 puede ser un factor en el engrosamiento progresivo de la pared arterial que resulta de la proliferación de células musculares lisas y la deposición de la matriz extracelular en la arteria después de una angioplastia con balón ("balloon angioplasty"). El diámetro de la arteria reestenosada se puede ver reducido en un 90% por este engrosamiento, y debido a que la mayor parte de la reducción en el diámetro es debida más a la matriz extracelular que a los cuerpos de células musculares lisas, puede ser posible abrir estos vasos en un 50% simplemente reduciendo la extensiva deposición de matriz extracelular. En arterias de cerdo sin daño transfectadas in vivo con un gen de TGF\beta1, la expresión del gen de TGF\beta1 estaba asociada con la síntesis de matriz extracelular y la hiperplasia (Nabel et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:10759-10763). La hiperplasia inducida por TGF\beta1 no fue tan extensa como la inducida con PDGF-BB, pero la matriz extracelular fue más extensa con transfectantes de TGF\beta1. No se asoció la deposición de matriz extracelular con hiperplasia inducida por FGF-1 (una forma secretada de FGF) en este modelo de cerdo de transferencia génica (Nabel (1993) Nature 362:844-846).

Hay diferentes tipos de cáncer donde el TGF\beta1 producido por el tumor puede ser perjudicial. Las células de cáncer de rata MATLyLu (Steiner y Barrack, (1992) Mol. Endocrinol. 6:15-25) y las células de cáncer de mama humanas MCF-7 (Arteaga et al., (1993) Cell Growth and Differ. 4:193-201) se convirtieron en más tumorigénicas y metastáticas después de la transfección con un vector que expresaba el TGF\beta1 de ratón. En cáncer de mama, se asocia una pobre prognosis con un nivel elevado de TGF\beta (Dickson et al., (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:837-841; Kasid et al., (1987) Cancer Res. 47:5733-5738; Daly et al., (1990) J Cell Biochem 43:199-21 1; Barrett-Lee et al, (1990) Br. J Cancer 61:612-617; King et al., (1989) J Steroid Biochem 34:133-138; Welch et al., (1990) Proc. Natl. Acad Sci. 87:7678-7682; Walker et al., (1992) Eur J Cancer 238: 641-644) y la inducción de TGF\beta1 por tratamiento con tamoxifeno (Butta et al., (1992) Cancer Res 52:4261-4264) se ha asociado con el fracaso del tratamiento con tamoxifeno en el cáncer de mama (Thompson et al., (1991) Br. J Cancer 63:609-614). Anticuerpos anti TGF\beta1 inhiben el crecimiento de las células de cáncer de mama humanas MDA-231 en ratones atímicos (Arteaga et al., (1993) J Clin Invest 92: 2569-2576), un tratamiento que se correlaciona con un incremento en la actividad de células asesinas ("killer cells") naturales de bazo. Células CHO transfectadas con TGF\beta1 latente también mostraron una actividad NK disminuida y un crecimiento tumoral aumentado en ratones desnudos ("nude") (Wallick et al., (1990) J Exp Med 172:1777-1784). De este modo, el TGF\beta1 secretado por tumores de mama puede causar una supresión inmune endocrina.

Se ha observado que elevadas concentraciones en plasma de TGF\beta1 indican una prognosis pobre para pacientes de cáncer de mama avanzado (Anscher et al. (1993) N Engl J Med 328:1592-8). Los pacientes con elevados niveles de TGF\beta circulante antes de una dosis elevada de quimioterapia o de un trasplante de médula ósea autólogo tienen un elevado riesgo de enfermedad veno-oclusiva hepática (15-50% de todos los pacientes con una mortalidad hasta el 50%) y neumonitis intersticial idiopática (40-60% de todos los pacientes). La implicación de estos descubrimientos es 1) que los niveles elevados en plasma de TGF\beta1 se pueden utilizar para identificar pacientes de riesgo y 2) que la reducción de TGF\beta1 podría disminuir la mortalidad y morbilidad de estos tratamientos comunes para pacientes con cáncer de mama.

PDGF

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) se aisló originalmente de lisados de plaquetas y se identificó como la actividad de promoción de crecimiento mayor presente en suero pero no en plasma. Se han identificado dos isoformas homólogas de PDGF, PDGF A y B, que son codificadas por genes separados (en los cromosomas 7 y 22). La especie más abundante de plaquetas es el heterodímero AB, aunque los tres dímeros posibles (AA, AB, y BB) se encuentran de forma natural. Después de la traducción, los dímeros de PDGF se procesan en proteínas secretadas
de =30 kDa. Se han identificado dos proteínas de superficie celular que se unen al PDGF con elevada afinidad, a y \beta (Heldin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 3664 (1981); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79: 5867 (1981)). Las dos especies contienen cinco dominios extracelulares del tipo inmunoglobulina, un único dominio transmembrana y un dominio tirosina quinasa intracelular separado por un dominio de inserción de quinasa. El receptor funcional de elevada afinidad es un dímero y la unión del dominio extracelular del receptor por el PDGF tiene como resultado la fosforilación cruzada (una tirosina quinasa del receptor fosforila a la otra en el dímero) de diversos residuos de tirosina. La fosforilación del receptor produce una cascada de acontecimientos que tienen como resultado la transducción de la señal mitogénica o quimiotáctica al núcleo. Por ejemplo, en el dominio intracelular del receptor de PDGF B, se han identificado nueve residuos de tirosina que una vez fosforilados interaccionan con diferentes proteínas que contienen dominios de homología src 2 (SH2), incluyendo la fosfolipasa C-g, la fosfatidilinositol 3'-quinasa, la proteína de activación de GTPasa y diversas moléculas de adaptación tales como Shc, Grb2 y Nck (Heldin, Cell, 80: 213 (1995)). En los últimos años se han elucidado las especificidades de las tres isoformas de PDGF para los tres receptores dímeros (aa, a\beta, y \beta\beta). El receptor a homodímero se une a las tres isoformas de PDGF con elevada afinidad, el receptor \beta homodímero se une sólo a PDGF BB con elevada afinidad y a PDGF AB aproximadamente con una afinidad 10 veces menor, y el receptor a \beta heterodímero se une a PDGF BB y a PDGF AB con elevada afinidad (Westermark & Heldin, Acta Oncologica, 32: 101 (1993)). El patrón de especificidad es el resultado de la capacidad de la cadena A para unirse únicamente al receptor a y de la cadena B a unirse a tanto las subunidades del receptor \beta como de a con elevada afinidad.

La primera indicación de que la expresión del PDGF está vinculada a transformación maligna se produjo con el descubrimiento de que la secuencia aminoacídica de la cadena de PDGF-B es virtualmente idéntica al p28^{SIS}, la proteína de transformación del virus del sarcoma de simio (SSV) (Waterfield et al. Nature, 304: 35 (1983); Johnsson et al., EMBO J., 3: 921 (1984)). El potencial de transformación del gen de la cadena PDGF-B y, en menor medida, el gen PDGF-A se demostró poco después (Clarke et al., Nature, 308: 464 (1984); Gazit et al., Cell, 39: 89 (1984); Beckmann et al., Science, 241: 1346; Bywater et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2753 (1988)). Desde entonces se ha observado que muchas líneas celulares tumorales producen y secretan PDGF, algunas de las cuales también expresan receptores de PDGF (Raines et al., Peptide Growth Factors y Their Receptors, Springer-Verlag, Part I, p 173 (1990)). Es por tanto posible la estimulación del crecimiento paracrino y, en algunas líneas celulares, autocrino, por PDGF. Por ejemplo, el análisis de biopsias procedentes de gliomas humanos ha demostrado la existencia de dos bucles autocrinos: PDGF-B/receptor \beta en células endoteliales asociadas a tumores y PDGF-A/receptor a en células tumorales (Hermansson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 7748 (1988); Hermansson et al., Cancer Res., 52: 3213 (1992)). La progresión a glioma de grado elevado vino acompañada del aumento en la expresión de PDGF-B y del receptor \beta en células endoteliales asociada a tumores y PDGF-A en células de glioma. La expresión aumentada de PDGF y/o receptores de PDGF también se ha observado en otras malignidades, incluyendo fibrosarcoma (Smits et al., Am. J. Pathol., 140: 639 (1992)) y carcinoma de tiroides (Heldin et al., Endocrinology, 129: 2187 (1991)).

En vista de su importancia en los estados de enfermedades proliferativas, antagonistas de PDGF podrían resultar útiles en aplicaciones clínicas. Actualmente, los anticuerpos de PDGF (Johnsson et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 82: 1721-1725; Ferns et al., (1991) Science 253: 1129-1132; Herren et al., (1993) Biochimica et Biophysica Acta 1173, 194-302) y los receptores solubles de PDGF (Herren et al., (1993) Biochimica et Biophysica Acta 1173: 294-302; Duan et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 413-418; Tiesman et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 9621-9628) son los antagonistas más potentes y específicos de PDGF. Se ha observado que anticuerpos neutralizantes de PDGF revertían el fenotipo transformado de SSV (Johnsson et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 1721-1725) e inhibían el desarrollo de lesiones neointimales posteriores a daño arterial (Ferns et al., (1991) Science 253: 1129-1132). Se han descrito otros inhibidores de PDGF tales como suramina (Williams et al., (1984) J. Biol. Chem. 259: 5287-5294; Betsholtz et al., (1984) Cell 39 447-457), neomicina (Vassbotn et al., (1992) J. Biol. Chem. 267 15635-15641) y péptidos derivados de la secuencia aminoacídica de PDGF (Engstrom et al., 1992) J. Biol. Chem. 267: 16581-16587), sin embargo, son o demasiado tóxicos o les falta la suficiente especificidad o potencia para ser buenos candidatos a fármacos. Otros tipos de antagonistas de posible utilidad clínica son moléculas que inhiben selectivamente la tirosina quinasa del receptor de PDGF (Buchdunger et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 92: 2558-2562; Kovalenko et al, (1994) Cancer Res. 54: 6106-6114).

hKGF a) Propiedades bioquímicas del hKGF

El Factor de Crecimiento de Queratinocitos Humanos (hKGF) es un factor de crecimiento de unión a heparina básico de tamaño pequeño (26-28 KD) y es un miembro de la familia de FGF. El hKGF es una molécula que hace relativamente poco que se ha identificado, y que también se conoce como FGF-7 (Finch et al., (1989) Science 245:752-755). Es un factor de crecimiento específico para células epiteliales (Rubin et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:802-806), y su función principal se encuentra en el desarrollo/morfogénesis (Werner et al., (1994) Science 266:819-822) y en la curación de heridas (Werner et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:6896-6900). La mayor fuente in vivo de hKGF son los fibroblastos estromales (Finch et al., (1989) Science 245:752-755). También se ha observado que las células endoteliales microvasculares (Smola et al., (1993) J Cell Biol 122:417-429) y, muy recientemente, las células T gd intraepiteliales activadas (Boismenu et al., (1994) Science 266:1253-1255) sintetizan hKGF. La expresión de hKGF se encuentra estimulada por las heridas (Werner et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:6896-6900). Se ha observado que diversas citoquinas son inductores de hKGF (Brauchle et al., (1994) Oncogene 9:3199-3204), siendo la IL-1 la más potente (Brauchle et al., (1994) Oncogene 9:3199-3204; Chedid et al., (1994) J Biol Chem 269:10753-10757). A diferencia de bFGF, el hKGF tiene un péptido señal y por lo tanto es excretado por las células que lo producen (Finch et al., (1989) Science 245:752-755). El hKGF se puede sobreexpresar en E. coli y la proteína recombinante (\sim19-21 KD) es biológicamente activa (Ron et al., (1993) J Biol Chem 268:2984-2988). La proteína recombinante proveniente de E. coli es 10 veces más mitogénica que la proteína nativa (Ron et al., (1993) J Biol Chem 268:2984-2988). Esta diferencia puede ser debida a la glicosilación. La proteína nativa tiene un sitio de glicosilación de Asn potencial (Ron et al., (1993) J Biol Chem 268:2984-2988).

La bioactividad de hKGF se encuentra mediada por un receptor de superficie celular específico (Miki et al., (1991) Science 251:72-75). El receptor de hKGF es un receptor de FGF modificado que resulta del procesamiento alternativo ("alternative splicing") de la región extracelular C-terminal del FGF-R2 (Miki et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:246-250). Las células NIH/3T3 transfectadas con el receptor de hKGF expresan sitios de unión de una elevada afinidad (\sim200 pM) para el hKGF (Mild et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:246-250). El número aproximado de sitios de unión específicos por célula NIH/3T3 es de aproximadamente 500.000 (D. Bottaro y S. Aaronson, comunicación personal). El receptor de hKGF se une a hKGF y a aFGF con afinidades similares, y a bFGF con una afinidad aproximadamente 20 veces menor (Miki et al., (1991) Science 251:72-75; Miki et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:246-250). Se ha descubierto que una variante del receptor de hKGF es un gen amplificado (es decir, un gen, múltiples copias), denominado K-SAM, en una línea celular de carcinoma estomacal humana (Hattori et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 5983-5987).

Se ha descrito que la heparina es un inhibidor de la bioactividad de hKGF (Ron et al., (1993) J Biol Chem 268:2984-2988). Esto es el contrario del efecto agonístico de la heparina por el aFGF (Spivak-Kroixman et al., (1994) Cell 79:1015-1024).

b) Papel del hKGF en enfermedades humanas

La molécula recombinante de hKGF ha estado disponible sólo desde 1993. Por lo tanto, hay poca información del papel del hKGF en enfermedades humanas. Sin embargo, la literatura publicada contiene evidencias que sugieren en gran medida un papel del hKGF en al menos dos enfermedades humanas, es decir soriasis y cáncer. El hKGF también ha estado implicado en la enfermedad inflamatoria del intestino (P. Finch, comunicación personal).

Soriasis

La soriasis es una enfermedad de la piel que puede ser debilitante (Greaves et al., (1995) N Eng J Medicine 332: 581-588), y caracterizada por una hiperproliferación de la epidermis y por una diferenciación incompleta de los queratinocitos, junto con inflamación dérmica (Abel et al., (1994) Scientific American Medicine III-1 to III-18; Greaves et al., (1995) N Eng J Medicine 2: 581-588). Aun no existe un tratamiento efectivo para la soriasis (Anónimo, (1993) Drug & Market Development 4:89-101; Abel et al., (1994) Scientific American Medicine III-1 to III-18; Greaves et al., (1995) N Eng J Medicine 2: 581-588). La soriasis la padece entre un 0,5 y un 2,8 por ciento de la población con la mayor incidencia en Escandinavia. En los Estados Unidos, en 1992, se estimó que los 4-8 millones de personas afectadas por soriasis gastaron aproximadamente 600 millones de dólares en diferentes fármacos y terapias relacionadas, ninguna de las cuales es muy efectiva. La mayor parte del gasto la realizaron los 400.000 pacientes con soriasis severa, gastando 1.000-1.500 dólares anuales en el tratamiento. Hay aproximadamente 200.000 nuevos casos de soriasis cada año.

No se conoce la causa básica de la enfermedad, pero resulta de un defecto primario o secundario en los mecanismos que regulan la división celular de queratinocitos epidérmicos (Abel et al., (1994) Scientific American Medicine III-1 to III-18). La soriasis responde a los esteroides y a la ciclosporina y en este sentido se caracteriza como una enfermedad inmune (Abel et al., (1994) Scientific American Medicine III-1 to III-18). Debido a que el hKGF es el factor de crecimiento específico primario de queratinocitos, su sobreexpresión y desregulación son candidatos como la causa de la hiperproliferación de queratinocitos en la soriasis. La demostración de que el sistema inmune es un regulador primario de la liberación de hKGF (Boismenu et al., (1994) Science 266: 1253-1255; Brauchle et al., (1994) Oncogene 9: 3199-3204; Chedid et al., (1994) J Biol Chem 269: 10753-10757) refuerza la idea de que la desregulación de hKGF es la causa de la soriasis. Además, la aplicación de hKGF en heridas en cerdos crea una aparición histológica parecida a la soriasis (Staiano-Coico et al., (1993) J Ex Med 178:865-878); el hKOF derivado de queratinocitos en ratones transgénicos causa una patología que recuerda a la soriasis (Guo et al., (1993) EMBO J 12: 973-986); experimentos de hibridación in situ demostraron desregulación moderada y fuerte del hKGF y de los receptores de hKGF, respectivamente, en soriasis (P. Finch, comunicación personal). Experimentos de hibridación in situ también demostraron la implicación del hKGF en otra enfermedad inmune, es decir, la enfermedad inflamatoria del intestino (P. Flinch, comunicación personal).

Cáncer

Está bien establecido en la literatura que la desregulación de la expresión de factores de crecimiento y del factor de crecimiento hKGF y/o su receptor es el acontecimiento de transformación en algunos cánceres en humanos. La capacidad de transformación del sistema hKGF se ha demostrado in vitro (Miki et al., (1991) Science 251:72-75). En otro estudio, se ha descubierto que líneas celulares de carcinoma expresan el receptor de hKGF y responden a hKGF aunque no a aFGF, mientras que líneas celulares de sarcoma no expresan receptores de hKGF y responden a aFGF pero no a hKGF (Ishii et al., (1994) Cancer Res 54: 518-522).

Cáncer gastrointestinal

Diversos cánceres estomacales pobremente diferenciados tienen un gen amplificado, denominado K-sam, que es una isoforma del receptor de hKGF (Katoh et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:2960-2964). La administración in vivo de hKGF a ratas provoca la proliferación de células epiteliales del conducto pancreático (Yi et al., (1994) Am J Pathol 145:80-85), hepatocitos y células epiteliales a través del tracto gastrointestinal (Housley et al., (1994) J Clin Invest 94:1764-1777).

Cáncer de pulmón

La administración de hKGF a ratas provoca una hiperplasia neumocita de tipo II similar a la variante celular broncoalveolar del carcinoma de pulmón (Ulich et al., (1994) J Clin Invest 93:1298-1306).

Cáncer de mama

In vivo, el hKGF provoca la dilatación del conducto mamario y hiperplasia epitelial incontrolada, siendo las dos características comunes de los cánceres de mama (Ulich et al., (1994) Am J Pathol 144:862-868; Yi et al., (1994) Am J Pathol 145:1015-1022). Sin embargo, el epitelio del conducto de ratas que amamantan es resistente a los efectos de promoción del crecimiento del hKGF y esto es de interés en relación a las observaciones epidemiológicas de que el embarazo en mujeres disminuye la susceptibilidad al cáncer de mama y que las vacas lecheras casi nunca desarrollan cáncer de mama (Kuzma, 1977, Breast in Pathology, Mosby Co.). Hay pruebas adicionales en este sentido que implican el hKGF en el cáncer de mama. Recientemente se ha detectado ARNm de hKGF en tejido de mama normal y en 12 de 15 muestras de tumor de mama analizadas (Koos et al., (1993) J Steroid Biochem Molec Biol 45:217-225). La presencia de ARNm de hKGF en tumores de mama considerada conjuntamente con la observación de que el hKGF está presente en glándulas mamarias no neoplásicas y que el hKGF produce una proliferación incontrolada del epitelio mamario sugiere que el hKGF puede ser un factor de crecimiento autocrino o paracrino importante en la regulación del crecimiento de epitelio mamario normal y neoplásico (Ulich et al., (1994) Am J Pathol 144:862-868). La infiltración del adenocarcinoma mamario del conducto característicamente está envuelto por un estroma desmoplástico que se ha postulado que representa una respuesta defensiva del hospedador al carcinoma (Ulich et al., (1994) Am J Pathol 144:862-868). Debido que el hKGF deriva del estroma, es posible que el estroma desmoplástico contribuya más que inhibir el crecimiento del tumor.

Cáncer de próstata

El efecto promotor del crecimiento de los andrógenos en los tumores de próstata parece que está mediado por el hKGF (Yan et al., (1992) Mol Endo 6:2123-2128), debido a que los andrógenos inducen la expresión de hKGF en células de estroma de próstata. Los tumores de próstata que son dependientes de andrógenos in vivo, son independientes de andrógenos in vitro pero dependientes de hKGF (Yan et al., (1992) Mol Endo 6:2123-2128). En concordancia con el papel del hKGF como andromedina se encuentra la observación de que el hKGF funciona en la inducción epitelial durante el desarrollo de la vesícula seminal, un proceso que se encuentra dirigido por andrógenos (Alarid et al., (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:1074-1078). Además, el hKGF produce la activación aberrante del receptor de andrógenos, contribuyendo probablemente de este modo al fracaso de la terapia de ablación de andrógeno en cáncer de próstata (Culig et al., (1994) Cancer Res 54:5474-5478). En base a esta información, es posible que alteraciones genéticas causen que el hKGF se escape a la regulación por andrógenos y de este modo convierta el tumor dependiente de andrógenos en un tumor altamente maligno independiente de andrógenos. Estos tumores todavía serían capaces de expresar el marcador regulado por andrógenos PSA, debido a que el hKGF también provoca la activación aberrante del receptor de andrógenos. También es probable que el hKGF pueda ser responsable de la Hipertrofia de Próstata Benigna (BPH), un problema común de la salud en hombres de edad avanzada (D. Bottaro, comunicación personal).

d) Competidores de hKGF

Hasta la fecha, se han descrito un anticuerpo monoclonal y un péptido corto derivado del receptor de hKGF (25-mero) como competidores del hKGF (Bottaro et al., (1993) J Biol Chem 268:9180-9183). El anticuerpo monoclonal, denominado 1 G4, tiene una Kd de 200 pM para el hKGF. El péptido corto inhibe la unión de hKGF a la superficie celular de células NIH/3T3 que expresan el receptor humano con una Ki de aproximadamente 1-5 \muM. Bottaro et al. (WO 94/25057) dan a conocer péptidos del receptor de hKGF que inhiben la unión entre hKGF y su receptor. También se describe un método de ensayo de compuestos prueba para determinar la capacidad de inhibir la proliferación celular mediada por el receptor de hKGF.

e) Ensayo de la interacción del factor de crecimiento-receptor

El bloqueo de la interacción de los factores de crecimiento y linfoquinas con sus receptores de superficie celular utilizando antagonistas ha sido una aproximación para el tratamiento de la enfermedad. El descubrimiento de estos antagonistas requiere la disponibilidad de ensayos bioquímicos para la interacción receptor-factor de crecimiento o linfoquina. Un ensayo clásico ha sido la inhibición competitiva de linfoquina o factor de crecimiento marcado radioactivamente (trazador) a su receptor de superficie celular. Estos tipos de ensayos utilizan líneas celulares que expresan el receptor relevante en sus superficies y determinan la cantidad de trazador unido a célula en presencia de varias concentraciones de antagonistas potenciales. Adicionalmente, otros ensayos utilizan extractos de membrana de líneas celulares que expresan el receptor relevante, y la unión del trazador se sigue mediante la unión al filtro (véase Nenquest Drug Discovery System: Human Tumor Necrosis Factor-Alpha, NEN Research Products, E. I. DuPont de Nemours & Co. (Inc.), Boston, MA) o la inmovilización de los extractos de membrana en soportes sólidos (Urdal et al., (1988) J Biol Chem 263:2870-2877; Smith et al., (1991) Bioch Bioph Res Comm 176:335-342). Se ha aplicado el cambio de la movilidad electroforética inducida por el receptor del trazador para identificar la presencia y el tamaño de los receptores de superficie celular mediante el entrecruzamiento del receptor con el trazador y a continuación analizar en geles desnaturalizantes (por ejemplo, véanse Kull et al., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5756-5760; Hohmann et al., (1989) J Biol Chem 264:14927-14934; Stauber et al., (1989) J Biol Chem 264:3573-3576). El uso de geles nativos y complejos no entrecruzados no se ha descrito para factores de crecimiento o linfoquinas y sus receptores, pero se ha aplicado ampliamente al estudio de interacciones proteínas ácidos nucleicos (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

La exploración de varias líneas celulares cancerosas en busca de presencia de receptores de hKGF mediante PCR reveló que todas las líneas celulares de carcinoma expresaban el ARNm del receptor de hKGF mientras que las líneas celulares provenientes de sarcomas no. La presencia de ARNm no necesariamente significa que el receptor de hKGF estará presente en la superficie de estas células. Para el hKGF, únicamente se han descrito ensayos basados en células utilizando queratinocitos Balb/MK (Weissman, (1983) Cell 32: 599-606) o células MH/3T3 transfectadas con el receptor de hKGF (Miki, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246-250).

SELEX

Se ha desarrollado un método para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con una unión altamente específica a moléculas diana. Este método, Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial ("Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment"), denominado SELEX, se describe en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/714.131, depositada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora patente estadounidense Nº 5.475.096, la Solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/931.473, depositada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands," ahora patente estadounidense Nº 5.270.163 (véase también PCT/US91/04078; WO 91/19813). Cada una de estas solicitudes, referidas en esta memoria conjuntamente como las solicitudes de patente SELEX, describe un método fundamentalmente nuevo para producir un ligando de ácido nucleico de cualquier molécula diana deseada.

El método SELEX implica la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones paso a paso de unión, partición y amplificación, utilizado el mismo esquema de selección general, para lograr virtualmente cualquier criterio deseado de selectividad y afinidad de unión. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, preferentemente comprendiendo un segmento de secuencia aleatoria, el método SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con la diana bajo condiciones favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas diana, disociar los complejos ácido nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-diana para obtener una mezcla enriquecida de ligandos de ácidos nucleicos, a continuación reiterar las etapas de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee para obtener ligandos de ácidos nucleicos de elevada especificidad y afinidad de la molécula diana.

El método SELEX básico se ha modificado para lograr varios objetivos específicos. Por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense número de serie 07/960.093 (US 5.475.096), depositada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure," describe el uso de SELEX conjuntamente con electroforesis de gel para seleccionar moléculas de ácidos nucleicos con características estructurales específicas, tales como ADN doblado. La solicitud de patente estadounidense número de serie 08/123.935 (WO 95/08003), depositada el 17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands" describe un método basado en SELEX para seleccionar ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotorreactivos capaces de unirse y/o fotoentrecruzarse y/o fotoinactivar una molécula diana. La Solicitud de Patente estadounidense número de serie 08/134.028 (WO 95/07364), depositada el 7 de octubre de 1993, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine," describe un método para identificar ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas muy relacionadas, llamado "Counter-SELEX". La solicitud de patente estadounidense número de serie 08/143.564 (WO 95/08003), depositada el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX," describe un método basado en SELEX que logra una separación altamente eficiente entre los oligonucleótidos que tienen una elevada afinidad por una molécula diana y los que la tienen baja. La solicitud de patente estadounidense número de serie 07/964.624 (WO 94/08050), depositada el 21 de octubre de 1992, titulada "Methods of Producing Nucleic Acid Ligands" describe métodos para obtener ligandos de ácidos nucleicos mejorados después de haberse llevado a cabo el SELEX. La solicitud de patente estadounidense número de serie 08/400.440 (WO 96/27605), depositada el 8 de marzo de 1995, titulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment Chemi-SELEX," describe métodos para unir covalentemente un ligando a su diana.

El método SELEX engloba la identificación de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas sobre el ligando, tales como estabilidad in vivo mejorada, o características mejoradas de distribución. Ejemplos de estas modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones de la ribosa y/o del fosfato y/o de la base. Los ligandos de ácidos nucleicos identificados mediante SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Solicitud de Patente estadounidense número de serie 08/117,991 (WO 95/07364), depositada el 8 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que contienen derivados nucleotídicos químicamente modificados en las posiciones 5 y 2' de las pirimidinas. La solicitud de patente estadounidense número de serie 08/134.028 (WO 95/07364), anterior, describe ligandos de ácidos nucleicos altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH_{2}), 2'-fluoro (2'-F) y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). La solicitud de patente estadounidense número de serie 08/264,029 (WO 95/35102), depositada el 22 de junio de 1994, titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement" describe oligonucleótidos que contienen varias pirimidinas modificadas en 2'.

El método SELEX engloba combinar oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales no oligonucleotídicas tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense número de serie 08/284.063 (US 5.637.459), depositada el 2 de agosto de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX" y en la solicitud de patente estadounidense número de serie 08/234.997 (WO 95/07364), depositada el 28 de abril de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX", respectivamente. Estas solicitudes permiten la combinación del amplio conjunto de formas y otras propiedades, y la amplificación eficiente y las propiedades de replicación, de los oligonucleótidos con las propiedades deseables de otras moléculas.

Jellinek et al (Inhibition of Receptor Binding by High-Affinity RNA Ligands to vascular Endotelial Growth Factor. Biochemistry 1994, 33, 10450-10456) usaron SELEX para identificar ligandos de ARN que se unían a VEGF. Ligandos truncados de las seis familias de ligandos identificadas inhibían la unión de [^{125}I]VEGF a sus receptores de superficie celular.

Breve resumen de la invención

La presente invención incluye ligandos de ácidos nucleicos del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y proteínas homólogas. Por sustancialmente homólogo se entiende un grado de identidad en la secuencia de aminoácidos del 70% o más. Para el propósito de esta solicitud, PDGF se refiere a las isoformas PDGF AA, AB y BB y proteínas homólogas. Específicamente, se encuentran incluidas en la definición las isoformas de PDGF AA, AB y BB humanas. En particular, las secuencias de ARN se proporcionan de modo que son capaces de unirse específicamente a PDGF. También se proporcionan secuencias de ADNss que son capaces de unirse específicamente a PDGF. La invención puede incluir las secuencias de ligandos de ARN mostradas en la Tabla 13 (SEC ID NOS: 128-170). También se incluyen en la invención ligandos de ADNss de PDGF mostrados en las Tablas 8, 9 y en las Figuras 3, 4 y 9 (SEC ID NOS: 93-124, 171-176). También están incluidos en esta invención los ligandos de ADNss de PDGF que inhiben la función de PDGF, presumiblemente mediante la inhibición de la interacción del PDGF con su receptor.

También se describe un procedimiento para identificar ligandos de ácidos nucleicos y secuencias de ligandos de ácidos nucleicos de una diana seleccionada del grupo que consiste en TGF\beta, PDGF y hKGF que comprende las etapas de (a) poner en contacto una mezcla candidata de ácidos nucleicos con la diana (b) separar los miembros de dicha mezcla candidata en base a la afinidad a la diana y (c) amplificar las moléculas seleccionadas para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos con una afinidad relativa mayor de unión a la diana.

Adicionalmente, la presente invención puede incluir los ligandos de ADNss y ARN de PDGF identificados según el método descrito anteriormente, incluyendo los ligandos mostrados en las Tablas 8 y 13, y en las Figuras 3, 4 y 9 (SEC ID NOS: 93-124, 128-176). También se incluyen ligandos de ARN y ADN para PDGF que son sustancialmente homólogos a cualquiera de los ligandos proporcionados y que tienen sustancialmente la misma capacidad de unión a PDGF. También se incluyen en esta invención ligandos de ácidos nucleicos de PDGF que sustancialmente tienen la misma forma estructural que los ligandos presentados en esta memoria y que tienen sustancialmente la misma capacidad de unión a PDGF.

La presente invención también incluye otras secuencias nucleotídicas modificadas basadas en los ligandos de ARN identificados en esta memoria y mezclas de los mismos.

También se describe un procedimiento para analizar un compuesto de prueba para determinar su capacidad para inhibir la interacción de un factor de crecimiento con su receptor unido a la membrana plasmática que comprende las etapas de (a) solubilizar células que contienen el receptor unido a membrana plasmática; (b) crear un extracto de membrana plasmática de las células; (c) reaccionar el extracto con factor de crecimiento marcado solo y en presencia del compuesto de prueba creando de este modo complejos; (d) analizar los complejos mediante electroforesis en condiciones nativas; (e) visualizar los complejos mediante formación de imágenes; y (f) comparar la imagen del extracto con factor de crecimiento marcado solo con la imagen del extracto en presencia del compuesto de prueba para determinar si el compuesto de prueba inhibe la interacción entre el factor de crecimiento y su receptor unido a membrana plasmática.

También se describe un procedimiento para analizar células para determinar si expresan un receptor unido a membrana plasmática de un factor de crecimiento que comprende las etapas de (a) solubilizar las células; (b) crear un extracto de membrana plasmática de las células; (c) reaccionar el extracto de membrana plasmática con un factor de crecimiento marcado, (d) analizar la reacción entre el extracto de membrana plasmática y el factor de crecimiento marcado mediante electroforesis en condiciones nativas; (e) comparar la electroforesis de la etapa (d) con la electroforesis del factor de crecimiento marcado; y (e) visualizar los resultados de la electroforesis para determinar si se forma un complejo con movilidad alterada relativa a la movilidad de un factor de crecimiento marcado solo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el análisis de unión de la librería de ADN 40D7 para el TGF\beta1. Se muestran los datos de unión obtenidos del Ciclo 19 (triángulos) y del Ciclo 0 (círculos).

La Figura 2 muestra los resultados del ensayo de PAI-luciferasa de TGF\beta1 (10 pM) incubado con oligonucleótidos (0,1 \muM) o anti-TGF\beta (60 \mug/ml).

La Figura 3 muestra la estructura secundaria consenso de la secuencia mostrada en la Tabla 9. R = A o G, Y = C o T, K = G o T, N y N' indican cualquier par de bases.

La Figura 4 muestra los ligandos mínimos 20t, 36t y 41t plegados de acuerdo con el motivo de estructura secundaria consenso. [3'T] representa un nucleótido de timidina unido 3'-3' añadido para reducir la degradación por 3'-exonucleasa.

Las Figuras 5A, 5B y 5C muestran la unión de ligandos de ADN de afinidad elevada mínima a PDGF-AA, AB y BB respectivamente. Se determinó la fracción de ligandos de ADN marcados en el extremo 5' terminal con ^{32}P unidos a concentraciones variantes de PDGF mediante el procedimiento de unión a filtro de nitrocelulosa. Los ligandos mínimos probados fueron 20t (o), 36t (A) y 41t (\blacksquare). Las concentraciones de oligonucleótidos en estos experimentos fueron \approx10 pM (PDGF-AB y PDGF-BB) y \approx50 pM (PDGF AA). Los datos se ajustaron a la ec. 1 (para la unión de los ligandos de ADN a PDGF-AA) o a la ec. 2 (para la unión a PDGF AB y BB) utilizando el método no lineal menos cuadrados. Las reacciones de unión se realizaron a 37ºC en tampón de unión (PBSM con HSA al 0,01%).

La Figura 6 muestra la determinación de la velocidad de disociación para la interacción de elevada afinidad entre los ligandos de ADN mínimos y PDGF AB. La fracción de ligandos marcados en el extremo 5' terminal con ^{32}P 20t (o), 36t (A) y 41t (\blacksquare), todos a 0,17 nM, unidos a PDGF AB (1 nM) se midió mediante unión a filtro de nitrocelulosa en los tiempos indicados después de la adición de un exceso de 500 veces de un competidor no marcado. Se determinaron los valores de la constante de velocidad de disociación (k_{off}) ajustando los datos a la ec 3. Los experimentos se realizaron a 37ºC en tampón de unión.

La Figura 7 muestra el efecto de los ligandos de ADN en la unión de ^{125}I-PDGF-BB y ^{125}I-PDGF-AA a receptores a de PDGF expresados en células PAE.

La Figura 8 muestra el efecto de ligandos de ADN sobre el efecto mitogénico de PDGF-BB en células PAE que expresan receptores \beta de PDGF.

La Figura 9 muestra el patrón de sustitución de 2'-O-metil-2'-desoxi- y 2'-fluoro-2'-desoxiribonucleotidos compatible con la unión de elevada afinidad a PDGF-AB. Los símbolos subrayados indican 2'-O-metil-2'-desoxinucleótidos; los símbolos en cursiva indican 2'-fluoro-2'-desoxinucleótidos; el tipo de letra normal indica 2'-desoxiribonucleótidos; [3'T] indica nucleótidos de timidina (3'3') de orientación invertida (Glean Research, Sterling, VA); PEG en los bucles de las hélices II y III indica fosforamidita del espaciador de pentaetilenglicol (Glean Research, Sterling, VA).

La Figura 10A muestra la unión de saturación de hKGF marcado radiactivamente en la superficie de células PC-3. TB (unión total) es la unión observada en ausencia de hKGF competidor sin marcar, mientras que NSB (unión no específica) es la unión observada en presencia de un exceso molar de 100 veces de hKGF no marcado. SB (unión específica) muestra la unión específica, y esta curva se obtuvo restando la curva NSB de la curva TB. La Figura 10B es el análisis de Scatchard de los datos mostrados en 10A para la curva SB.

La Figura 11 muestra el cambio en la movilidad electroforética debido a los extractos de membrana plasmática de células PC-3. En los carriles 1-8 los extractos de membrana se hicieron reaccionar con varias concentraciones de hKGF marcado radioactivamente tal como se muestra debajo de cada carril. Además del hKGF marcado radioactivamente (tal como se muestra debajo de cada carril) para los carriles 9-12 se incluyó un exceso molar de 100 veces de hKGF sin marcar. C 1 y C2 representan dos complejos observados debido a la presencia de fragmentos de unión de hKGF en los extractos de membrana plasmática de PC-3.

Las Figuras 12A-D muestran el alineamiento propuesto de ligandos 2'F y 2'NH_{2}. Los residuos de las secuencias en cursiva y letra minúscula indican la región constante de la plantilla. En las secuencias consenso, las letras mayúsculas y minúsculas se utilizan para los residuos encontrados en una cantidad mayor o igual al 80% y al 60% de los miembros de cada familia, respectivamente. Los valores de K_{d} y K_{i} también se muestran al lado de la denominación de cada ligando. Los valores de K_{i} mostrados aquí se calcularon usando la fórmula K_{i}=IC50/(1+(C/K_{d})), donde IC50 es la concentración de inhibición de la mitad del máximo de cada ligando en los ensayos de células PC-3 tal como se describe en el Ejemplo 16; C es la concentración de ^{125}I-KGF; y K_{d} es la constante de disociación de equilibrio del KGF por su receptor, (aproximadamente 150 pM). Los ligandos marcados con asteriscos muestran curvas de unión bifásicas.

Las Figuras 12A y 12B muestran el alineamiento propuesto de los ligandos 2'F. La mayoría de los ligandos 2'F se pueden plegar en estructuras de pseudonudo. Se proponen dos clases tal como se muestra. También se muestra la estructura resumen para cada clase. Las bases que participan en el tallo 1 (S1) están subrayadas con líneas simples mientras que las bases del tallo 2 (S2) están subrayadas con líneas dobles. Se introdujeron espacios para la alineación de los diferentes elementos de los pseudonudos.

Las Figuras 12C y 12D muestran el plegamiento propuesto de los ligandos 2'NH_{2}. Estos ligandos se agrupan en dos clases. Tal como se muestra en las estructuras resumen, los ligandos de clase 1 y de clase 2 pueden formar un tallo-bucle ("stem-loop") y una estructura en forma de pesa ("dumbbell"), respectivamente. Se introdujeron espacios para permitir el alineamiento de la secuencia. Los residuos que participan en tallos se encuentran subrayados. En las estructuras resumen, los puntos (.) indican un número variable de residuos. Los ligandos 2N y 54N son permutaciones circulares de la misma estructura de pesa. Para la alineación de los correspondientes bucles estos ligandos se envuelven alrededor de dos líneas.

La Figura 13 muestra el requisito de secuencia mínima para la unión de los ligandos 6F y 14F a hKGF. Se muestra el plegamiento predicho de cada ligando. Las regiones constantes de los ligandos se muestran en letra minúscula. Las secuencias conservadas están subrayadas. Los círculos y los triángulos marcan los extremos 3' de los truncados activos e inactivos, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

Esta solicitud describe ligandos de ácidos nucleicos de elevada afinidad para TGF\beta, PDGF y hKGF identificados a través del método conocido como SELEX. SELEX se describe en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/714,131 (US 5,475,096), depositada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", la solicitud de patente estadounidense número de serie 07/931,473, depositada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands" ahora patente estadounidense Nº 5,270,163 (véase también PCT/US91/04078; WO 91/19813). Estas solicitudes se denominan colectivamente las solicitudes de patente SELEX.

En su forma más básica, el proceso SELEX se puede definir mediante la siguiente serie de etapas:

1)

Se prepara una mezcla candidata de ácidos nucleicos de secuencias diferentes. La mezcla candidata generalmente incluye regiones de secuencias fijas (es decir, cada uno de los miembros de la mezcla candidata contiene las mismas secuencias en la misma localización) y regiones de secuencias al azar. Las regiones de secuencia fija se seleccionan: (a) para ayudar en las etapas de amplificación descritas a continuación, (b) para mimetizar una secuencia conocida de unión a la diana, o (c) para aumentar la concentración de una disposición estructural dada de los ácidos nucleicos en la mezcla candidata. Las secuencias aleatorias pueden ser totalmente al azar (por ejemplo, la probabilidad de encontrar una base en cualquier posición es de una entre cuatro) o sólo parcialmente al azar (por ejemplo, la probabilidad de encontrar una base en cualquier posición se puede seleccionar a cualquier nivel entre 0 y 100 por cien).

2)

La mezcla candidata se pone en contacto con la diana seleccionada bajo condiciones favorables para la unión entre la diana y los miembros de la mezcla candidata. Bajo estas circunstancias, la interacción entre la diana y los ácidos nucleicos de la mezcla candidata se puede considerar que forma pares de ácido nucleico-diana entre la diana y aquellos ácidos nucleicos que tienen la mayor afinidad por la diana.

3)

Los ácidos nucleicos con la mayor afinidad por la diana se separan de los ácidos nucleicos con menor afinidad por la diana. Debido a que sólo existe un número extremadamente pequeño de secuencias (y posiblemente sólo una molécula de ácido nucleico) que corresponda a los ácidos nucleicos de afinidad más elevada en la mezcla candidata, generalmente se desea fijar el criterio de separación de modo que una cantidad significativa de los ácidos nucleicos en la mezcla candidata (aproximadamente 5-50%) se conserven durante la separación.

4)

Aquellos ácidos nucleicos seleccionados durante la separación de modo que tengan una afinidad relativamente mayor por la diana se amplifican a continuación para crear una mezcla candidata nueva que se encuentra enriquecida con ácidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente mayor por la diana.

5)

Repitiendo las etapas de separación y amplificación anteriores, la mezcla candidata formada de nuevo contiene menos y menos secuencias de unión débil, y el grado promedio de afinidad de los ácidos nucleicos por la diana aumentará de forma general. Llevado a su extremo, el procedimiento SELEX producirá una mezcla candidata que contenga uno o un número pequeño de ácidos nucleicos únicos que representan aquellos ácidos nucleicos de la mezcla candidata original que tenían la mayor afinidad por la molécula diana.

Las solicitudes de patente SELEX describen y dan más explicaciones sobre este proceso en gran detalle. Se incluyen dianas que se pueden utilizar en el procedimiento; métodos para separar ácidos nucleicos en una mezcla candidata; y métodos para amplificar ácidos nucleicos separados para generar una mezcla candidata enriquecida. Las solicitudes de patente SELEX también describen ligandos obtenidos de varias especies de dianas, incluyendo dianas proteicas donde la proteína tanto es como no es una proteína de unión a ácidos nucleicos.

Los ligandos de ácidos nucleicos descritos en esta memoria se pueden acomplejar con un compuesto lipofílico (por ejemplo colesterol) o se pueden unir o encapsular en un complejo que comprende componentes lipofílicos (por ejemplo, un liposoma). Los ligandos de ácidos nucleicos complejados pueden aumentar la captación celular de los ligandos de ácidos nucleicos por una célula para la distribución de los ligandos de ácidos nucleicos a una diana intracelular. La solicitud de patente estadounidense Nº 08/434.465 (WO 96/34876), depositada el 4 de mayo de 1995, titulada "Nucleic Acid Ligand Complexes" describe un procedimiento de preparación de un complejo terapéutico o diagnóstico que comprende un ligando de ácido nucleico y un compuesto lipofílico o un compuesto de elevado peso molecular no inmunogénico.

Los procedimientos descritos en esta memoria y los ligandos de ácidos nucleicos identificados mediante estos procedimientos son útiles para propósitos terapéuticos y de diagnóstico. Usos terapéuticos incluyen el tratamiento o la prevención de enfermedades o estados médicos en pacientes humanos. La utilización diagnóstica puede incluir tanto aplicaciones de diagnóstico in vivo o in vitro. El procedimiento SELEX en general, y las adaptaciones específicas del método SELEX mostradas y reivindicadas en esta memoria de forma específica, son particularmente adecuados para aplicaciones de diagnóstico. SELEX identifica ligandos de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a dianas con elevada afinidad y con sorprendente especificidad. Estas características son, por supuesto, las propiedades deseadas que una persona experta en la técnica buscaría en un ligando de diagnóstico.

Los ligandos de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden adaptar de forma rutinaria para propósitos de diagnóstico según cualquiera de las técnicas empleadas por las personas expertas en la materia. Los agentes de diagnóstico sólo han de ser capaces de permitir al usuario identificar la presencia de una diana dada en una localización o concentración determinadas. Simplemente la capacidad para formar pares de unión con la diana puede ser suficiente para desencadenar una señal positiva para propósitos de diagnóstico. Las personas expertas en la materia también serán capaces de adaptar cualquier ligando de ácido nucleico mediante procedimientos conocidos en el estado de la técnica para incorporar una etiqueta de marcaje para identificar la presencia de este ligando. Esta etiqueta se podría usar en varios procedimientos de diagnóstico. Los ligandos de ácidos nucleicos descritos en esta memoria pueden ser utilizados de forma específica para la identificación de proteínas de TGF\beta, PDGF y hKGF.

SELEX proporciona ligandos de elevada afinidad de una molécula diana. Esto representa un logro singular que no tiene precedentes en el campo de la investigación de ácidos nucleicos. Esta descripción aplica el procedimiento SELEX a las dianas específicas de TGF\beta, PDGF y hKGF. En la sección posterior de los Ejemplos, se describen los parámetros experimentales usados para aislar e identificar los ligandos de ácidos nucleicos de TGF\beta, PDGF y
hKGF.

Para producir ácidos nucleicos deseables para su uso como compuestos farmacéuticos, se prefiere que el ligando de ácido nucleico (1) se una a la diana de un modo capaz de lograr el efecto deseado en la diana; (2) sea tan pequeño como sea posible para obtener el efecto deseado; (3) sea tan estable como sea posible; y (4) sea un ligando específico a la diana seleccionada. En la mayoría de situaciones, se prefiere que el ligando de ácido nucleico tenga la mayor afinidad posible por la diana.

En la solicitud de patente estadounidense en trámite y asignada comúnmente con número de serie 07/964.624, depositada el 21 de octubre de 1992 (624), ahora la patente estadounidense Nº 5.496.938, se describen procedimientos para obtener ligandos de ácidos nucleicos mejorados después de que se haya realizado el SELEX. La solicitud ‘624, titulada "Methods of Producing Nucleic Acid Ligands" se incorpora de forma específica a esta memoria por referencia. También se incluyen en esta patente procedimientos para determinar las estructuras tridimensionales de los ligandos de ácidos nucleicos. Estos procedimientos incluyen modelado matemático y modificaciones estructurales de los ligandos derivados de SELEX, tales como modificación química y sustitución de nucleótidos.

En esta descripción, se realizaron experimentos SELEX para identificar ligandos de ADN y ARN con afinidad elevada específica para TGF\beta1 a partir de librerías degeneradas que contienen 40 ó 60 posiciones aleatorias (40N ó 60N) (Tablas 1 y 5). Esta descripción incluye los ligandos de ARN específicos de TGF\beta1 mostrados en la Tabla 3 (SEC ID NOS: 12-42), identificados mediante los procedimientos descritos en los Ejemplos 1 y 2. Esta descripción también incluye ligandos de ARN de TGFP que inhiben la función de TGF\beta1 presumiblemente inhibiendo la interacción de de TGF\beta1 con su receptor. Esta descripción incluye los ligandos de ADNss específicos de TGF\beta1 mostrados en la Tabla 6 (SEC ID NOS: 55-89) identificados mediante los procedimientos descritos en los Ejemplos 5 y 6.

En la presente invención, también se realizaron dos experimentos SELEX para identificar ADNss y ARN con afinidad específica elevada para PDGF a partir de librerías degeneradas que contenían 40 y 50 posiciones aleatorias (40N y 50N), respectivamente (Tablas 7 y 12). Esta invención puede incluir los ligandos de ADNss y ARN específicos de PDGF mostrados en las Tablas 8, 9 y 13 y en las Figuras 3, 4 y 9 (SEC ID NOS: 93-124, 128-176), identificados mediante los procedimientos mostrados en los Ejemplos 7 y 15.

En esta descripción, también se realizó un experimento SELEX en busca de ligandos de ARN con afinidad elevada específica por hKGF a partir de librerías degeneradas que contenían 40 posiciones aleatorias (40N) (Tabla 14). Esta descripción incluye los ligandos de ARN específicos de hKGF mostrados en las Tablas 16 y 23 (SEC ID NOS: 189-262, 272-304), identificados mediante los métodos descritos en los Ejemplos 16 y 17. Esta descripción también incluye ligandos de ARN de hKGF que inhiben la interacción de hKGF con su receptor.

El ámbito de los ligandos cubierto por esta invención se extiende a todos los ligandos de ácidos nucleicos de PDGF, modificados y sin modificar, tal como se definen en las reivindicaciones, y preferentemente aquéllos identificados según el procedimiento SELEX. Más específicamente, esta invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que son sustancialmente homólogas a los ligandos mostrados en las Tablas 8, 9 y 13, y en las Figuras 3, 4 y 9 (SEC ID NOS: 93-124, 128-176). Por sustancialmente homólogo se entiende un grado de homología de secuencia primaria mayor del 70%, más preferentemente mayor del 80%. Una revisión de las homologías de secuencia de los ligandos de ácidos nucleicos mostrados en las Tablas 3 y 6 (SEC ID NOS: 12-42, 55-89) para TGF\beta, Tablas 8 y 13 (SEC ID NOS: 93-124, 128-170) para PDGF, y Tablas 16 y 23 (SEC ID NOS: 189-262, 272-304) para hKGF muestra que las secuencias con poca o ninguna homología primaria pueden tener sustancialmente la misma capacidad de unión a una diana dada. Por estas razones, esta invención también puede incluir ligandos de ácidos nucleicos que sustancialmente tienen la misma estructura y capacidad de unión a PDGF que los ligandos de ácidos nucleicos mostrados en las Tablas 8, 9, 13 y en las Figuras 3, 4 y 9 (SEC ID NOS: 93-124, 128-176). Una estructura sustancialmente igual para PDGF incluye todos los ligandos de ácidos nucleicos que tienen los elementos estructurales comunes mostrados en la Figura 3 y que llevan a la afinidad por PDGF. Sustancialmente la misma capacidad de unión a PDGF significa que la afinidad se encuentra entre uno y dos órdenes de magnitud de la afinidad de los ligandos descritos en esta memoria. Se encuentra dentro de la capacidad de las personas expertas en la técnica determinar si una secuencia dada -sustancialmente homóloga a aquéllas específicamente descritas en esta memoria- tiene sustancialmente la misma capacidad de unión a PDGF.

Esta invención también incluye los ligandos descritos anteriormente, donde se realizan ciertas modificaciones químicas para aumentar la estabilidad in vivo del ligando o para aumentar o mediar en la distribución del ligando. Ejemplos de estas modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones del azúcar y/o del fosfato y/o de la base de una secuencia de ácido nucleico dada. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense número de serie 08/117.991 (WO 95/07364), depositada el 9 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides" que se incorpora de forma específica a esta memoria por referencia. Otras modificaciones serán conocidas por una persona experta en la técnica. Estas modificaciones se pueden realizar después del SELEX (modificación de ligandos modificados o no modificados identificados previamente) o mediante incorporación al procedimiento SELEX.

El Ejemplo 20 describe una modificación posterior al procedimiento SELEX de un ligando de ácido nucleico del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). El ligando de ácido nucleico se modificó mediante la adición de extremos de fosforotioato y sustitución de diversas ribopurinas con 2'-desoxi-2'-O-metilpurinas.

Tal como se describe anteriormente, debido a su capacidad para unirse selectivamente a TGF\beta, PDGF y hKGF, los ligandos de ácidos nucleicos de TGF\beta, PDGF y hKGF descritos en esta memoria son útiles como compuestos farmacéuticos. Esta invención, por lo tanto, también incluye el uso de un ligando de ácido nucleico de PDGF descrito aquí en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de estados patológicos mediados por PDGF mediante la administración de un ligando de ácido nucleico capaz de unirse a PDGF.

Las composiciones terapéuticas de los ligandos de ácidos nucleicos se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección, aunque también se contemplan otras formas de administración efectivas, tales como inyección intraarticular, nubes inhalantes, formulaciones activas oralmente, iontoforesis transdérmica o supositorios. Un portador preferente es solución salina fisiológica, aunque se contempla que también se puedan usar otros portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización preferente, se contempla que el portador y el ligando constituyan una formulación de liberación lenta compatible fisiológicamente. El disolvente principal en un portador de este tipo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el portador puede contener otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o el olor de la formulación. De forma similar, el portador aún puede contener otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener la estabilidad, la velocidad de disolución, la liberación o la absorción del ligando. Estos excipientes son sustancias que normalmente y de forma habitual se utilizan para formular dosis para administración parenteral en forma de una única dosis o multidosis.

Una vez se ha formulado la composición terapéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar en una forma lista para su uso o en una forma que requiera reconstitución inmediatamente antes de la administración. La forma de administrar formulaciones que contienen ligandos de ácidos nucleicos para distribución sistémica puede ser vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o mediante supositorios rectales u óvulos vaginales.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para explicar e ilustrar la presente invención y no pretenden ser una limitación de la invención. Los Ejemplos 1-4 describen los experimentos iniciales para identificar ARN con una afinidad elevada específica por TGF\beta 1. El Ejemplo 1 describe los diferentes materiales y procedimientos experimentales utilizados en los Ejemplos 2-4. El Ejemplo 2 describe un procedimiento representativo para identificar ligandos de ARN mediante el método SELEX que se unen a TGF\beta 1. El Ejemplo 3 describe las afinidades que los ligandos tienen por TGF\beta1 y demuestra que los ligandos son capaces de inhibir la función de TGF\beta1, presumiblemente inhibiendo la interacción de TGF\beta1 con su receptor. El Ejemplo 4 describe qué regiones de los ligandos se cree que son necesarias para la unión a TGF\beta1 y la inhibición de la unión al receptor de TGF\beta1. El Ejemplo 5 describe otro procedimiento representativo para identificar ligandos de ADN y ARN que se unen a TGF\beta1 mediante el procedimiento SELEX. El Ejemplo 6 describe los análisis de unión, los bioensayos y las secuencias de una librería SELEX de ADNss. El Ejemplo 7 describe los diferentes materiales y procedimientos experimentales utilizados en la evolución de los ligandos de ADNss de PDGF descritos en los Ejemplos 8-13. El Ejemplo 8 describe los ligandos de ADNss de PDGF y la estructura secundaria predicha de los ligandos de ácidos nucleicos seleccionados. El Ejemplo 9 describe la secuencia mínima necesaria para una unión de elevada afinidad. El Ejemplo 10 describe la estabilidad cinética de complejos de PDGF-ligandos de ácidos nucleicos. El Ejemplo 11 describe las propiedades de fusión térmicas para ligandos seleccionados. El Ejemplo 12 describe el foto-entrecruzamiento de ligandos de ácidos nucleicos y PDGF. El Ejemplo 13 describe la inhibición por ligandos de ADN de isoformas de PDGF en células en cultivo y la inhibición de los efectos mitogénicos de PDGF en células mediante ligandos de ADN. El Ejemplo 14 describe la modificación de ligandos de ácidos nucleicos de PDGF con nucleótidos modificados. El Ejemplo 15 describe los procedimientos experimentales utilizados en la evolución de ligandos de ARN de PDGF y muestra las secuencias de los ligandos. El Ejemplo 16 describe los diferentes materiales y procedimientos experimentales utilizados en la evolución de ligandos de ácidos nucleicos de hKGF descritos en los Ejemplos 17-19. El Ejemplo 17 describe los ligandos de ARN de hKGF, las afinidades que tienen los ligandos por el hKGF y la especificidad de los ligandos de ARN por el hKGF. El Ejemplo 18 describe la inhibición de la unión de hKGF a receptores de superficie celular. El Ejemplo 19 describe la inhibición de la actividad mitogénica del hKGF por un ligando seleccionado. El Ejemplo 20 describe la modificación de ligandos de ácidos nucleicos de bFGF con 2'-desoxi-2'-O-metilpurinas.

Ejemplos Ejemplo 1 Procedimientos experimentales

Este ejemplo proporciona los procedimientos generales seguidos e incorporados en los Ejemplos 2-4.

A. Materiales

El TGF\beta1 recombinante humano utilizado en este procedimiento SELEX se adquirió de Genentech. También se puede adquirir TGF\beta1 recombinante humano de R&D systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos.

El TGF\beta1 biotinilado se preparó reaccionando TGF\beta1 a 3,6 \muM con un exceso molar de 11 veces de sulfo-NHS-biotina (Pierce, Rockfold, IL, Estados Unidos) en NaHCO_{3} 50 mM durante 3 horas en un baño de hielo. La reacción se acidificó con 0,036 volúmenes de ácido acético al 10% y se aplicó a una columna de fase reversa Vydac (The Separations Group, Hesperia, CA, Estados Unidos) de 40 mg hecha en una punta de pipeta siliconizada para separar la biotina no reaccionada del TGF\beta1 biotinilado. La columna se lavó previamente con 200 \mul de etanol seguido de 200 \mul de ácido acético al 1%, se aplicó la reacción de biotinilación, se lavó la biotina libre con 200 \mul de acetato sódico 50 mM pH 5,5, seguido de 200 \mul de acetonitrilo al 20% y finalmente se eluyó con 200 \mul de acetonitrilo al 60%. La muestra se liofilizó y se resuspendió en acetato sódico 50 mM pH 5,0 a 40 \muM y se almacenó a 4ºC. El TGF\beta1 se enriqueció con TGF\beta1 yodinado 100,000 cpm para seguir la recuperación y evaluar el éxito de la reacción de biotinilación midiendo la fracción de la radioactividad que se une a bolitas de agarosa recubierta de estreptavidina (Pierce) antes y después de la biotinilación. Se sometió a cromatografía en fase reversa analítica una alícuota del TGF\beta1 antes y después de la biotinilación. El TGF\beta1 biotinilado corrió sustancialmente como un único pico que se encontraba retrasado respecto al TGF\beta no biotinilado. Se pudo detectar una pequeña cantidad (5%) de TGF\beta1 no reaccionado. La eficiencia de unión del TGF\beta1 biotinilado yodinado a bolitas de agarosa de estreptavidina (SA) (30 \mul) fue del 30% en las condiciones de unión usadas en la separación SELEX.

Se preparó TGF\beta1 yodinado mediante el método de la lactoperoxidasa (fosfato sódico 50 mM pH 7,3, 0,16% glucosa) con bolitas BioRad Enzymo (BioRad, Richmond, CA, Estados Unidos) y el yodo unido se separó del yodo libre mediante filtración en gel en G25 Sephadex en Tween 0,01% acetato sódico 50 mM.

La línea celular de pulmón de visón que expresa el gen indicador luciferasa bajo el control del promotor PAI 1 (Abe et al. (1994) Anal. Biochem. 216:276-284) fue un presente del Dr. Dan Rifkin (Department of Cell Biology, New York Medical Center, New York, New York 10016). La luciferasa se evaluó con reactivos adquiridos de Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, CA, Estados Unidos.

Se prepararon el UTP y el CTP modificados en 2'NH_{2} según el método de Pieken et al. (1991) Science 253: 314-317. Los oligonucleótidos de ADN se sintetizaron utilizando procedimientos estándar en NeXstar Pharmaceuticals, Inc. (Boulder, CO, Estados Unidos) o por Operon Technologies (Alameda, CA, Estados Unidos). El resto de reactivos y productos químicos se adquirieron de fuentes comerciales estándar y fuentes ya han sido indicadas.

B. Procedimiento SELEX

Los ligandos SELEX que se unen a TGF\beta1 se modificaron esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense Nº 5.270.163 (véase también, Tueik y Gold (1990) Science 249: 505-510). Para generar la reserva inicial de plantilla de PCR, se juntaron los productos de PCR de veinte reacciones de PCR separadas donde cada una contenía 16,1 pmol de ADN de cadena única no purificado (al menos, un total entre 2 x 10^{12} y 2 x 10^{13} moléculas diferentes) antes de la primera transcripción. Las condiciones de la PCR fueron KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9, Triton-X100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM, y 0,2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 2 \muM de cada cebador y 0,075 unidades/\mul de Taq DNA polimerasa, 100 \mul por reacción en un tubo de microfuga siliconizado. Todos los ciclos de PCR aprovecharon el inicio caliente utilizando Ampliwax (Perk y Elmer, Norwalk, CN, Estados Unidos). La duración de la PCR inicial fue de 10 ciclos; un ciclo de PCR fue 94ºC-1', 52ºC-1', 72ºC-2'. Una desnaturalización inicial era 94ºC durante 4' y la extensión final a 72ºC durante 5'. Las reacciones de PCR se combinaron, se extrajeron con fenol/cloroformo, y se precipitaron con isopropanol (acetato amónico 2,0 M, isopropanol al 50%) para eliminar los cebadores.

Las reacciones de transcripción contenían ADN 200 nM, GTP 0,9 mM, 2'-NH_{2}-UTP 0,9 mM, 2'-NH_{2}-CTP 0,9 mM, ATP 0,5 mM, Tris-HCl 87 mM pH 8,0, MgCl_{2} 17 mM, espermidina 4,4 mM, DTT 22 mM, BSA acetilado 100 \mug/ml (Promega, Madison, WI, Estados Unidos) y 4 unidades/\mul de ARN polimerasa T7. (Se utilizaron 2'-F-UTP y 2'-F-CTP (United States Biochemical, Cleveland, OH, Estados Unidos) a 3,0 mM, mientras que UTP y CTP se usaron a 0,9 mM cada uno). Las reacciones de transcripción se incubaron durante toda la noche a 28ºC (al menos 10 horas). Después de la transcripción, la plantilla se digirió añadiendo 2 \mul RQ1 Dnasa (Promega) durante 15' a 28ºC, y a continuación se extrajo con fenol/CHCl_{3}, seguido de tres precipitaciones de etanol de acetato amónico (acetato amónico 3,9 M, etanol al 72%).

Se incubaron las moléculas de ARN con TGF\beta1 unido a bolitas de agarosa SA tal como se describe a continuación en solución Krebs-Ringer (KR) (NaCl 120 mM, KCl 4,8 mM, tampón fosfato Na 10 mM pH 7,4, MgSO_{4} 1,2 mM, CaCl_{2} 2,6 mM) modificada para incluir Na-Hepes 20 mM pH 7,5 y Triton X100 al 0,2% (Pierce). Este tampón se denomina KRHT.

Los complejos de ARN- TGF\beta1 se separaron del ARN no unido lavando las bolitas. La recuperación del ARN modificado con F o 2'-NH_{2} pirimidina seleccionado de las bolitas de agarosa requirió la extracción con tiocianato de guanidina (GnSCN 5M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,0, beta mercaptoetanol 0,1M) o de las bolitas recubiertas con Seradyne SA mediante SDS al 2% (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 50 mM, Na_{2}EDTA 1 mM, SDS al 2%, DTT 1,5 mM). El ARN 2'-OH regular se recuperó fácilmente bajo condiciones menos fuertes con el mismo tampón usado para las bolitas de Seradyne que contenía sólo 0,2 % SDS. Después de la extracción y precipitación para purificar y concentrar el ARN, la muestra se transcribió de forma inversa con una MMLV RT clonada con la secuencia H de la RNasa suprimida. La reacción contenía una cantidad inferior o igual a 16 nM de ARN, 10 \muM de cebador 3', Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KCl 75 mM, MgCl_{2} 5 mM, DTT 10 mM, dNTP's 0,5 mM. Antes de la adición del tampón, el ARN y el cebador se hirvieron conjuntamente. Después de la adición del tampón y las sales, la reacción se reasoció durante 10 minutos a 28ºC antes de la adición de 600 unidades de transcriptasa inversa Superscript (Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD, Estados Unidos) y síntesis a 50ºC durante 1 hora.

La amplificación PCR de este ADNc (<1 pmol) produjo aproximadamente 250 pmol de ADN de doble cadena, de los cuales, 40 pmol se transcribieron y utilizaron para iniciar la siguiente ronda de SELEX.

C. Método de Separación para SELEX

Se unieron 2,5 pmol de TGF\beta1 biotinilado a 30 \mul de bolitas de agarosa SA (Pierce) en 200 \mul de KRHT. La mezcla se incubó en un rotor a 37ºC durante un período de tiempo entre 15 y 30 minutos. Las bolitas se lavaron tres veces mediante centrifugación y resuspensión en 200 \mul de KRHT frío para eliminar el TGF\beta1 no unido, y se resuspendieron en un volumen final de 500 \mul de KRHT. Se calentó el ARN que contenía pirimidinas 2'-NH_{2} a 70ºC durante tres minutos (los ARN que contenían pirimidinas 2'-OH o 2'F se calentaron a 95ºC) y se diluyó en KRHT que contenía TGF\beta1 unido a bolitas SA. La concentración final de ARN es 1 \muM y el TGF\beta1 fue 5 nM. La unión se produce con rotación a 37ºC durante 30 minutos. Las bolitas se lavaron mediante centrifugación y resuspensión tres veces con 200 \mul de tampón de unión para eliminar el ARN no unido. El ARN se eluyó de las bolitas tal como se ha descrito anteriormente.

D. Ensayos de unión

Cuando se llevaron a cabo los ensayos de unión para ligandos de TGF\beta1 dieron resultados equivalentes cuando se llevaron a cabo. En el ensayo de bolitas SA el TGF\beta1 biotinilado se diluyó en serie en KRHT en tubos de polipropileno (Linbro, ICN, Irving, CA, Estadios Unidos) y se unió a las bolitas tal como se ha descrito anteriormente. Después de que se eliminara el TGF\beta1 no unido, se añadieron cantidades a nivel de trazas de ARN marcado con ^{32}P (<0,1 nM) a cada tubo y se aplicó a un vórtex para mezclarlo. Después de incubación estática a 37ºC durante 30 minutos, el ARN no unido se eliminó lavando tres veces con 200 \mul de KRHT.

En el ensayo de unión de filtro de nitrocelulosa, el TGF\beta1 se diluyó en serie en KRH que contenía BSA sin grasa al 0,1% (calidad de radioinmunoensayo Fluka, Fluka, Hauppauge, NY, Estados Unidos) como portador en lugar de Triton X-100. La incubación con trazador ARN fue tal como se ha descrito anteriormente. Las muestras se pipetearon con un pipeteador multipocillo en un colector multipocillo que tenía una hoja de nitrocelulosa de 0,45 micras de BioRad humedecida, se aspiraron y se lavaron tres veces con 200 \mul de KRH (que no contenía BSA). Los filtros se secaron al aire y se contaron en un contador de centelleo líquido (Beckmann Instruments, Palo Alto, CA).

La ecuación utilizada para ajustar la unión de los ligandos a TGF\beta1 describe la unión de un ligando a un receptor (en este caso TGF\beta1) que sigue las leyes de la acción de masas y para la que hay un único sitio de unión: Y=Bmax*X/(Kd+X): donde Y es la fracción del ligando unido, B_{max} es la fracción máxima del ligando unido, X es la concentración de TGF\beta1 y Kd es la constante de disociación de TGF\beta1 y el ligando. Los puntos se ajustaron mediante regresión no lineal utilizando el programa de ordenador Graphpad Prism (Graphpad Software, San Diego, CA). El algoritmo minimizaba la suma de los cuadrados de la distancia real de los puntos de la curva. Se alcanzó la convergencia cuando dos iteraciones consecutivas cambiaban la suma de los cuadrados en menos de 0,01%.

E. Clonación y Secuenciación

Los experimentos SELEX se describen en la Tabla 2. Los cebadores para los experimentos SELEX 1 y 2 mostrados en la Tabla 1 contienen sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción Sacl (cebador 5' T7SacBam; SEC ID NO: 7) y Xbal (cebador 3' 3XH; SEC ID NO: 9). Los productos de la PCR de los experimentos SELEX 1 y 2 se clonaron direccionalmente en pGem 9zf (Promega) digerido con Sacl/Xbal. El cebador 5' T7SB2N (SEC ID NO: 8) y el cebador 3' 3XH (SEC ID NO: 9) (Tabla 1) se utilizaron para los experimentos SELEX 3-9. Los productos de la PCR de los experimentos 3-9 se clonaron direccionalmente en el sitio BamH1/Xbal de un vector de clonación pGem9zf:BamH1 modificado. El sitio BamH1 se modificó genéticamente en pGem9zf del siguiente modo. Un clon aislado de la librería 2 (lib2-6-2) que no se unía a TGF\beta1 (secuencia no mostrada) se digirió con BamH1 y Xbal. La secuencia flanqueante del sitio de clonación del vector pGem9zf modificado se muestra en la Tabla 1 (SEC ID NOS: 10-11).

Después de la digestión del plásmido con endonucleasa de restricción y la desfosforilación con CIP (fosfatasa intestinal de ternera), los vectores se purificaron mediante gel. Los insertos se ligaron y los plásmidos recombinantes se transformaron en la cepa de E. coli DH10B (Bethesda Research Labs). El ADN plasmídico se preparó mediante lisis alcalina, procedimiento mini prep. Se secuenciaron al azar de las librerías 1 y 2 veintidós clones que representaban 9 secuencias únicas. Se secuenciaron 50 clones de las librerías 3-9 utilizando una reacción de didesoxi G única (denominada G track). Las escaleras de secuenciación se compararon y se organizaron por similitudes. Los clones seleccionados de cada familia se escogieron para un análisis de secuencia completo. Los ensayos de unión del TGF\beta1 se realizaron en transcritos que representaban diferentes secuencias G en cada librería. De un total de 140 ensayos de unión, 27 ligandos se unían con una K_{d} inferior a 10 nM, y se secuenciaron 21 de éstos. Los clones se secuenciaron con el kit de secuenciación Sequenase (United Status Biochemical Corporation, Clevaland, OH).

F. Truncamiento de los Ligandos

Los experimentos de truncamiento se realizaron para determinar la secuencia mínima necesaria para una unión de elevada afinidad de los ligandos de ARN a TGF\beta1. Para la determinación de la región terminal 3', los ligandos de ARN se marcaron en el extremo 5' con \gamma-^{32}P-ATP utilizando la polinucleótido quinasa T4. La región terminal 5' se estableció con ligandos marcados en el extremo 3' utilizando \alpha-^{32}P-pCp y ARN ligasa T4. Después de la hidrólisis parcial alcalina, los ligandos de ARN marcados radioactivamente se incubaron con TGF\beta1 a concentraciones que variaban entre 1 nM y 50 nM y el ARN unido a proteína se separó mediante separación con nitrocelulosa. Los truncados de ARN se analizaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante de elevada resolución. Se generó una escalera de ligandos marcados radioactivamente que terminaban con residuos G mediante digestión parcial con RNasa T1 y se utilizó como marcadores.

G. Inhibición de la función de TGF\beta1

La transducción de la señal de TGF\beta1 empieza con la unión a un receptor de la superficie celular y tiene como resultado la inducción de la transcripción de diferentes genes. Uno de estos genes es Pail. El ensayo de TGF\beta1 utiliza las células epiteliales de pulmón de visión (MLEC) que tienen el gen indicador luciferasa fusionado al promotor Pai 1. MLEC tiene los receptores de TGF\beta1 en su superficie celular. De este modo, se puede medir la respuesta de las células a TGF\beta1 y la concentración efectiva de TGF\beta1 en el medio de cultivo midiendo la actividad enzimática de la luciferasa después de un período de inducción.

Las células epiteliales de pulmón de visón (MLEC) que llevaban la construcción Pail/luc se mantuvieron en DME que contenía un suero fetal bovino al 10% y 400 \mug/ml de G418. Las células MLEC-Pail/luc se pusieron en una cantidad de 3,2 x 10^{4} células por pocillo en una placa Falcon de 96 pocillos, en 100 \mul de DME + suero fetal bovino al 10% durante toda la noche. El medio estaba hecho a partir de agua autoclavada. Las células se lavaron tres veces (100 \mul) en DME libre de suero más Solución A (1:1). La Solución A es Hepes 30 mM pH 7,6, glucosa 10 mM, KCl 3,0 mM, NaCl 131 mM, fosfato disódico 1,0 mM. Las muestras (100 \mul) se añadieron en DME que contenía Hepes 20 mM pH 7,5, y BSA al 0,1% (Fluka, calidad de radioinmunoesnayo). Todas las muestras se realizaron por triplicado. Después de seis horas a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% se eliminó el medio y las células se lavaron tres veces (100 \mul cada vez) en PBS frío. Se añadió tampón de lisis (75 \mul) (Analytical Luminiscence Laboratory) y las placas se incubaron en hielo durante 20 minutos. Las placas se sellaron y se congelaron a -80ºC hasta que se utilizaron para los ensayos. Se analizaron las muestras (25 \mul) para determinar la actividad luciferasa con el Enhanced Luciferase Assay Kit de Analytical Luminiscence Laboratory (San Diego, CA, Estados Unidos) según las instrucciones de los fabricantes utilizando el luminómetro Berthold Microlumat LB96P. La luminiscencia es de forma reproducible una función de la concentración de TGF\beta1 añadido al medio.

Los ligandos evaluados para determinar la inhibición de la actividad de TGF\beta1 se analizaron a un mínimo de cinco concentraciones. Los ligandos se diluyeron en serie en DME, Hepes 20 mM pH 7,5, BSA Fluka al 0,1% en tubos de polipropileno y se añadió un volumen igual de medio que contenía TGF\beta1 12 pM a cada tubo, se sometieron a un vórtex y se transfirieron a las células sin incubación adicional. A partir de la curva estándar de TGF\beta1 incluida en cada placa, se determinó la concentración efectiva de TGF\beta1 en presencia de ligandos inhibidores mediante la reducción en la luminiscencia medida. Algunos de los ligandos se analizaron a TGF\beta1 3 pM y 6 pM con los mismos resultados. Para determinar la IC_{50} (la concentración de ligando SELEX necesaria para reducir la actividad del TGF\beta1 en un 50%), se representaron los cinco valores obtenidos para cada ligando y se determinó gráficamente el valor del 50% de inhibición utilizando Graphpad Prism asumiendo un ajuste hiperbólico de los datos y usando regresión no lineal.

Ejemplo 2 Ligandos de ARN de TGF\beta1 A. Experimentos SELEX

Para generar ligandos de ARN de TGF\beta1, se realizaron nueve experimentos SELEX, tal como se resume en la Tabla 2, utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Tal como se muestra en la Tabla 1, las reservas ("pools") de ARN difieren en el número de bases aleatorias presentes en la parte central de las moléculas: 40 nucleótidos en el SELEX 40N6 (SEC ID NO: 2) y 64 nucleótidos en el experimento SELEX 64N6 y lib2-6-1 RN6 (SEC ID NOS: 1, 3). Debido a que el objetivo consistía en seleccionar ligandos de ARN que no sólo se uniesen a TGF\beta1 sino que también bloqueasen la unión al receptor, se seleccionó la región aleatoria mayor (64N). En dos experimentos, también se incluyó una región aleatoria más corta (40N). Los ligandos de TGF\beta1 fueron muy poco comunes con 40N y fueron cualitativamente los mismos que los ligandos de 64N6 seleccionados.

Las secuencias de los clones de los experimentos SELEX se muestran en la Tabla 3 (SEC ID NOS: 12-42). Las pirimidinas utilizadas en los diferentes experimentos SELEX diferían en la posición 2' del azúcar (Tabla 2). En los dos primeros experimentos SELEX, se desarrollaron los ligandos como pirimidinas 2'-OH. Los ligandos se modificaron después del SELEX con pirimidinas sustituidas 2'-NH_{2} o 2'-F para ver si conservaban la capacidad de unión a TGF\beta1. Debido a que las sustituciones en 2' producía que los ligandos fueran resistentes a RNasa A, también se analizaron en el ensayo de cultivo celular para determinar la inhibición de la actividad de TGF\beta1. Uno de estos ligandos lib2-6-1 (Grupo D, Tabla 3; SEC ID NO: 35) cuando estaba sustituido con 2'-NH_{2}-UTP y 2'-F-CTP mostró que inhibía la actividad mediada por el receptor de TGF\beta1. Para seleccionar más ligandos, se realizaron seis experimentos SELEX independientes adicionales (lib3-7 y lib9) utilizando pirimidinas sustituidas 2'-NH_{2} o 2'-F durante el proceso de evolución. En el experimento lib8, el clon biológicamente activo lib2-6-1 (SEC ID NO: 35) se aleatorizó y se sometió a reselección para determinar si se podía mejorar el comportamiento de inhibición y de unión del clon. Lib8 se desarrolló como ARN de pirimidina 2'-OH. En algunos casos, se realizaron modificaciones posteriores al SELEX de los ligandos de TGF\beta1 obtenidos de los experimentos 3-9, por ejemplo, para determinar si un ligando desarrollado con sustituciones de pirimidinas 2'-F también se uniría con sustituciones 2'-NH_{2}.

Cada reserva de partida para un experimento SELEX contenía 3 x 10^{14} moléculas de ARN (500 pmol). La afinidad del ARN de partida por el TGF\beta1 se estimó en más de 50 mM. Después de 4 rondas de de SELEX, las afinidades de las reservas que se desarrollaron había mejorado aproximadamente 10 nM y no se modificó de forma significativa en las siguientes rondas. El ARN se secuenció en su conjunto y se encontró que era no aleatorio y clonado.

Lib1 tardó 20 rondas en desarrollarse debido a que las concentraciones óptimas de TGF\beta1 no se utilizaron hasta la ronda 15 y las librerías 5, 6 y 7 tardaron más en desarrollarse debido a que las condiciones óptimas para la recuperación de los ligandos unidos durante la etapa de separación en el SELEX no se introdujeron hasta la ronda 8. Las concentraciones de TGF\beta1 óptimas y las condiciones de separación se describen en el Ejemplo 1.

B. Secuencias de ARN

Muchos clones en una librería SELEX son idénticos o similares en su secuencia. Las librerías se exploraron mediante G track y sólo se evaluaron los compuestos representativos de cada G track en un ensayo de unión. El ensayo de unión tenía cinco puntos (16,5 nM, 5,5 nM, 1,8 nM, 0,6 nM y 0,2 nM) y podía detectar sólo los clones de SELEX con una K_{d} inferior o igual a 10 nM. Se secuenciaron los ligandos de ARN que se unían bien (K_{d}<10 nM) en el ensayo de unión. Las secuencias se inspeccionaron visualmente y se analizaron utilizando programas informáticos que realizan alineaciones y pliegan secuencias de ácidos nucleicos para predecir regiones de estructura secundaria. Los ligandos se clasificaron en cinco grupos (A, B, C, D y huérfanos) según su homología de secuencia. Cada grupo tiene sustituciones 2' posibles características.

Se identificaron 58 clones mediante G track a partir de 7 experimentos SELEX separados que pertenecen a los ligandos del grupo A (Tabla 3; SEC ID NOS: 12-42). Se secuenciaron 15 clones; 13 eran similares aunque no idénticos, mientras que 3 clones, lib3-13 (SEC ID NO: 12), lib5-6 y lib5-13, eran idénticos. Los ligandos del Grupo A se recuperaron de siete de las ocho librerías SELEX que incluían librerías evolucionadas como pirimidinas sustituidas 2'-NH_{2}, 2'-OH o 2'-F así como una librería evolucionada como 2'-F-UTP, 2'-NH_{2}-CTP. La modificación posterior al SELEX indica que 2'-NH_{2}-UTP, 2'-F-CTP no impide la unión de lib8-9 a TGF\beta1, de este modo, la estructura de los ligandos del Grupo A parece que no requiere un fragmento 2' específico en el azúcar de la pirimidina para mantener la unión.

Los ligandos del Grupo B se unen como ARN sustituido con pirimidina 2'-NH_{2} y 2'-F. Se detectaron 28 clones del Grupo B mediante análisis de G track a partir de 3 librerías. Dos de las librarías estaban evolucionadas como 2'-NH_{2} y una como librería 2'-F. Se secuenciaron cuatro clones, dos eran idénticos (lib5-47 y lib4-12; SEC ID NO: 28). Puede existir una supresión interna en el Grupo B, como en lib3-44. El huérfano 40N, lib3-42, se ubicó en el Grupo B en base a su estructura secundaria. La supresión interna en lib3-44, la afinidad de unión, la bioactividad y los experimentos en las regiones terminales daban soporte al hecho de colocar lib3-42 en este grupo.

Los ligandos del Grupo C se unen como ligandos 2'-OH o 2'-F tal como se esperaba, debido a que miembros de este grupo se desarrollaron como ligandos 2'-OH en lib 1 y como ligandos sustituidos con pirimidinas 2'-F en lib 6. Lib1-20-3 (SEC ID NO: 32) se modificó posteriormente al SELEX como un derivado 2'-F. Lib1-20-3 no se unía con las pirimidinas 2'-NH_{2} incorporadas.

El ligando del Grupo D, lib2-6-1 (SEC ID NO: 35), se aisló después de SELEX 2'-OH pero se modificó después del SELEX y se une bien como un derivado de pirimidina 2'-F-CTP y 2'-NH_{2}-UTP. Lib2-6-1 no se une bien a TGF\beta1 con pirimidinas sustituidas con 2'-NH_{2}-CTP, 2'F-UTP, o 2'-NH_{2}, 2'-F. Sólo se volvieron a seleccionar variantes del Grupo D en otros dos experimentos SELEX, lib8, una librería 2'-OH, y lib 9, una librería 2'-NH_{2}-UTP, 2'-F-CTP, sosteniendo la observación de que hay especificidad por la posición 2' de la pirimidina en este ligando.

El grupo marcado como huérfanos no son homólogos entre sí y no se han determinado secuencias variantes para estos ligandos. G track indica que se aislaron ocho clones 40N similares a lib3-45 a partir de dos librerías. Dos de los ocho se secuenciaron y eran idénticos. Lib3-45 (SEC ID NO: 39) se une tanto si contiene pirimidinas sustituidas 2'-NH_{2} o 2'-F como si contiene la combinación 2'-F-UTP, 2'-NH_{2}-CTP. Lib1-20-5 (SEC ID NO: 40) aislado como un ligando 2'-OH se une como 2'-F, mientras que lib1-20-12 (SEC ID NO: 41) y lib2-6-8 (SEC ID NO: 42) sólo se unen bien como pirimidinas 2'-OH y no toleran modificaciones posteriores al SELEX 2'-NH_{2} o 2'-F.

Como fue poco habitual que secuencias similares se obtuvieran de diferentes experimentos SELEX que contenían diferentes modificaciones, se realizó otro conjunto de experimentos SELEX en búsqueda de ligandos de ADNss y ARN de TGF\beta1 tal como se describe en los Ejemplos 5 y 6 posteriores.

Ejemplo 3 Inhibición de la unión al receptor de TGF\beta1

Los valores de Kd y B_{max} descritos en la Tabla 4 para los ligandos del Grupo A son para la versión sustituida 2'-NH_{2} del ligando a no ser que se indique lo contrario. La B_{max} para los ligandos de Grupo A fue de 0,38\pm0,12 (n=14) que concuerda con la retención medida del TGF\beta1 en los filtros de nitrocelulosa. Las Kd para los ligandos de Grupo A fueron todas similares, 2,2\pm1,1 nM (n=14). Donde los ensayos de unión a bolitas de agarosa SA y nitrocelulosa medidos dieron resultados equivalentes.

Los valores de IC_{50} en la Tabla 4 para todos los ligandos de Grupo A se evaluaron con los ligandos sustituidos con pirimidinas 2'-NH_{2} excepto en los casos que se indique. Los ligandos 2'-NH_{2} se utilizaron en el bioensayo de cultivo de tejidos debido a que presentaban la mayor estabilidad en las condiciones del bioensayo. Cinco de los diez ligandos del Grupo A evaluados inhibían la actividad del receptor de TGF\beta1. Los valores de IC_{50} para los inhibidores se encontraban típicamente 25 veces por encima de la Kd para el TGF\beta1. Los datos son reproducibles; la Kd para el ligando lib3-13 fue de 0,83\pm0,11 nM (n=3) y la IC_{50} para lib3-13 (SEC ID NO: 12) fue de 25\pm14 nM (n=4). Las concentraciones de ARN en los bioensayos son estimaciones basadas en un coeficiente de extinción asumido y en la pureza del 100% del ligando. Las concentraciones de ARN pueden, por lo tanto, estar sobreestimadas durante el bioensayo que, a su vez, llevaría a la sobreestimación de la IC_{50}.

Los otros cinco ligandos del Grupo A no inhibían la actividad de unión al receptor de TGF\beta. Una diferencia obvia entre los ligandos no bioactivos, lib2-6-4 (SEC ID NO: 20), lib5-48 (SEC ID NO: 19) y lib6-23 (SEC ID NO: 21), y los ligandos bioactivos es la sustitución en el nucleótido 72. Se evaluaron lib7-21 (SEC ID NO: 23) y lib7-43 (SEC ID NO:24) como ligandos 2'-F-UTP, 2'-NH_{2}-CTP para determinar su bioactividad. Estos ligandos no eran bioactivos a pesar de su elevada afinidad por TGF\beta. En conclusión, la unión y la bioactividad son funciones separables de los ligandos del Grupo A de TGF\beta.

Los ligandos del Grupo B tienen diferentes propiedades de unión que los ligandos del Grupo A (Tabla 4). Tanto Kd (0,63\pm0,5 nM, n=4) como B_{max} (0,14\pm0,04, n=4) son inferiores para los ligandos del Grupo B. Un inhibidor del Grupo B, lib4-12 (SEC ID NO: 28), de hecho parece estimular la actividad de TGF\beta1 en el bioensayo de cultivo de tejidos a bajas concentraciones. La base de este comportamiento mixto antagonista/agonista no se ha determinado. El mejor inhibidor en este grupo, lib3-42 (SEC ID NO: 30) tiene una IC_{50} de 22 nM y no tiene comportamiento agonista en los rangos de concentración evaluados.

Los ligandos del Grupo C se evaluaron como derivados 2'-F y no fueron bioactivos. Tampoco lo fue el huérfano 2'-F lib1-20-5 (SEC ID NO: 40). El huérfano 40N 2'-NH_{2}, lib3-45, es un ejemplo de otro ligando con una elevada afinidad por TGF\beta1 y que no tiene capacidad para inhibir la unión al receptor de TGF\beta1.

Los ligandos del Grupo D se evaluaron en el bioensayo como derivados 2'-NH_{2}-UTP, 2'-F-CTP. Tanto lib2-6-1 (SEC ID NO: 35) como la versión truncada lib2-6-1-81 (SEC ID NO: 36) pueden inhibir la unión al receptor de TGF\beta1; sin embargo, una única mutación de una C a una G en la posición 53 disminuye la actividad en el clon lib8-23. De forma similar, una supresión de 2 pares de bases en el clon lib6-30 (SEC ID NO: 34) en las posiciones que corresponden a los nucleótidos 67 y 68 en lib2-6-1 (SEC ID NO: 35) aumenta la unión en 10 veces pero elimina la bioactividad.

Se observó que lib2-6-1 (SEC ID NO: 35) era completamente efectivo sólo contra TGF\beta1 y no contra TGF\beta2 y TGF\beta3. Lib2-6-1 (SEC ID NO: 35) era biológicamente activo en presencia de suero de caballo al 10% en el medio de cultivo celular además de BSA al 0,1%. De este modo, el ligando muestra una especificidad hacia TGF\beta1 que no se ve interferida por la presencia del suero de caballo en este ensayo. La mayor indicación de que la inhibición de la unión al receptor de TGF\beta1 es un fenómeno específico es el hecho de que no todos los ligandos de TGF\beta1 bloquean la unión al receptor, aunque los que lo hacen, lo hacen de forma reproducible. No hay ejemplos de ligandos que no se unan a TGF\beta1 bloqueando la actividad de unión al receptor de TGF\beta1.

En resumen, los ligandos de ARN que pueden bloquear la unión al receptor de TGF\beta1 son un subconjunto de ligandos. La unión es necesaria pero no suficiente para la bioactividad. De forma general, un 50% de los ligandos de elevada afinidad evaluados eran inhibidores. De los inhibidores, 30% eran buenos inhibidores (IC_{50} < 25 nM).

Ejemplo 4 Análisis de las regiones terminales

Se realizaron experimentos de truncamiento en varios ligandos de TGF\beta1 para determinar los nucleótidos esenciales para la unión. Los ligandos del Grupo A, lib3-13 (SEC ID NO: 12) y lib8-9 (SEC ID NO: 16), se truncaron con resultados consistentes. El fragmento lib3-13-79 se une a TGF\beta1, de modo que ninguno de los nucleótidos 3' hasta el nucleótido 79 en lib3-13 es esencial para la unión. De forma similar, cuando todos los nucleótidos 5' hasta el nucleótido 38 se suprimen, el fragmento restante, lib3-13-(38-123) aun puede unirse a TGF\beta1. La región terminal 5' concuerda con la secuencia lib6-23 (SEC ID NO: 21), que tiene una supresión correspondiente a los nucleótidos 19-36 de lib3-13 (SEC ID NO: 25), y aun se une a TGF\beta1. De este modo, todos los determinantes de unión de elevada afinidad para los clones del Grupo A pueden encontrarse completamente en la región aleatoria y pueden corresponder a un fragmento de 42 nucleótidos, lib3-13-(38-79). Muchos ligandos del Grupo A contienen supresiones o sustituciones en el dominio de unión esencial predicho, en la región correspondiente a lib3-13-(72-81). La supresión y sustitución en lib4-32 no tiene efecto en su región terminal 3' que corresponde al nucleótido 80 de lib3-13. De este modo, la región terminal 3' es probablemente correcta y las alteraciones en la secuencia de nucleótidos 72-81 no alteran de forma significativa la estructura del ácido nucleico requerida para la unión. Las mutaciones en esta región, especialmente en el nucleótido 72, pueden, sin embargo, modificar la capacidad del ligando para bloquear la unión al receptor de TGF\beta1 tal como se ha indicado anteriormente.

El análisis de la región terminal del extremo 3' del ligando del Grupo B, lib4-12 (SEC ID NO: 28), predice que no se requiere nada más allá del nucleótido 72 para la unión a TGF\beta1. Cuando se determinó la región terminal 5' de lib4-12, se requerían todos los nucleótidos excepto los tres primeros para la unión, indicando que la región constante 5' es una parte esencial del ligando al menos cuando se determinó la región terminal del ligando de longitud completa. Asumiendo que el ligando lib3-44 (SEC ID NO: 29) tiene un determinante de unión similar a lib4-12 (SEC ID NO: 28), también se puede concluir que los nucleótidos 37-46 de lib4-12 no se requieren para la unión debido a que éstos se encuentran suprimidos en lib3-44 y lib3-42 (SEC ID NO: 30).

La región constante 3' no es necesaria para la unión en los ligandos del Grupo C y D. Los dos tipos de ligandos se unen sin los nucleótidos 3' en la región constante. Libl-20-3-82, una versión truncada de 82 nucleótidos de lib1-20-3 (SEC ID NO: 32), se une así como lib1-20-3 de longitud completa. De forma similar, la unión y la bioactividad de lib2-6-1 no se ve afectada por el truncamiento en 3' encontrada en lib2-6-1-81 (SEC ID NO: 36).

Ejemplo 5 Procedimientos experimentales

En la realización preferida, se realizó un segundo conjunto de experimentos SELEX en búsqueda de ligandos de ARN y ADN con afinidad elevada específica para TGF\beta1 a partir de librerías degeneradas que contenían 40 posiciones aleatorias (40N). Este Ejemplo proporciona los procedimientos generales seguidos e incorporados en el Ejemplo 6.

A. Materiales

Se adquirió la transcriptasa inversa M-MLV superscript de Gibco BRL (Gaithersburg, MD). La ARN polimerasa T7 se purificó según procedimientos estándar en NeXstar Pharmaceuticals, Inc. (Boulder, CO). La Taq ADN polimerasa (Amplitaq) era de Perkin Elmer/Cetus (Richmond, CA). La polinucleótido quinasa T4, la ADN polimerasa (fragmento Klenow) y la fosfatasa alcalina se adquirieron de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Los nucleótidos trifosfatos sustituidos con 2'-amino amino-UTP y amino-CTP se sintetizaron según procedimientos estándar en NeXsatr Pharmaceuticals, Inc. (Boulder, CO). Otros reactivos utilizados en este trabajo fueron de la máxima calidad que se puede obtener.

B. Ácidos Nucleicos

Se sintetizaron ARNs mediante transcripción in vitro utilizando oligonucleótidos de ADN de doble cadena y ARN polimerasa T7. Los oligonucleótidos de ADN (Tabla 5) se adquirieron de Operon, Inc. (Alameda, CA) y se purificaron mediante electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida al 6%. Se realizó la amplificación por PCR en KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,6), MgCl_{2} 2,5 mM, BSA 170 mg/mL, y dNTPs (presentes a 1 mM cada uno). La Taq ADN polimerasa se utilizó a 100 unidades por 0,1 mL de reacción, y los cebadores 3' y 5' se encontraban presentes a 1 mM. La transcripción se realizó en NaCl 40 mM, ditiotreitol 10 mM, Tris-acetato 50 mM (pH 8,0), acetato de magnesio 8 mM, espermidina 2 mM y NTP 2 mM. La ARN polimerasa T7 estaba presente a 1 unidad/mL. La reacción se incubó a 28 grados durante 16 horas y a continuación se trató con 20 unidades de DNAsa I durante otros 10 minutos a 37 grados. La reacción se detuvo mediante la adición de una mitad de volumen de tampón de carga (formamida al 93%, EDTA 10 mM, pH 8,0) y se calentó a 95 grados durante 3 minutos antes de la electroforesis en un gel desnaturalizante de urea 8M/poliacrilamida al 6%. El transcrito de ARN se visualizó mediante "UV shadowing" y se extrajo del gel y se eluyó en tampón TE (Tris-acetato 10 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM). El transcrito de ARN se precipitó en etanol, se secó en vacío y se volvió a disolver en H_{2}O destilada. La concentración de ARN así como de ADN de cadena única se cuantificó midiendo la A_{260} y asumiendo que 1 unidad de A_{260} equivale a 40 mg/mL y 33 mg/mL, respectivamente.

C. Evolución de los Ligandos de Elevada Afinidad

Los ligandos SELEX que se unían a TGF\beta1 se modificaron esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense Nº 5,270,163 (véase también, Tuerk y Gold (1990) Science 249:505-510) utilizando los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 5 (SEC ID NOS: 43-54). Las plantillas de ADN contenían una secuencia variable de 40 nucleótidos (40N) generada mediante síntesis de ADN con mezcla de nucleótidos, así como secuencias fijas 5' y 3', necesarias para la amplificación por PCR de la plantilla. La secuencia fija 5' de los oligonucleótidos 40N7 (SEC ID NO: 43) y 40N8 (SEC ID NO: 49) también contenía un promotor de la ARN polimerasa T7. El ARN para la primera ronda de SELEX de ARN se transcribió a partir de plantillas de ADN de doble cadena generadas mediante la extensión del cebador en plantillas de ADN de cadena única 40N7 y 40N8 con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. El SELEX de ARN consistía en hasta 15 rondas de síntesis de ARN, unión a la diana, separación del ARN unido y no unido mediante filtración con nitrocelulosa, síntesis de ADNc, y amplificación por PCR para regenerar la plantilla de ADN de doble cadena. La unión a la diana por la reserva de ARN se realizó en tampón de unión A (NaCl 120 mM, KCl 2,5 mM, MgSO_{4} 0,12 mM, HEPES 40 mM, Na_{2}HPO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM pH 7,4, HSA al 0,01%) a 37 grados durante al menos 10 minutos antes de la filtración. Por el contrario, la primera ronda de SELEX de ADN de cadena única se realizó utilizando directamente los oligonucleótidos sintetizados sintéticamente 40D7 y 40D8. El SELEX consistió en 25 rondas de unión a diana, separación del ADN de cadena única unido y no unido mediante filtración con nitrocelulosa, amplificación por PCR para generar una población de ADN de doble cadena, y electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida para purificar el ADN de cadena única para la siguiente ronda de SELEX. La unión de la diana a la reserva de ADN de cadena única se realizó en tampón de unión B (NaCl 150 mM, Tris-acetato 10 mM pH 7,5, BSA al 0,001%) a 37 grados durante al menos 15 minutos antes de la filtración. El marcaje radioactivo de los repertorios de ARN y ADN se realizó mediante la incubación de 5 picomoles de ácido nucleico, 2 unidades de polinucleótido quinasa T4, y 6 mL de [\gamma^{32}P] ATP (800 Ci/mmol) en un volumen de 10 mL a 37 grados durante 30 minutos. La concentración de ácido nucleico en cada ronda del experimento SELEX variaba entre 1500 nM y 1 nM mientras que la concentración de la diana TGF\beta1 variaba entre 150 nM y 0,03 nM.

D. Clonación y Secuenciación de Ligandos

La clonación del repertorio de ácidos nucleicos se realizó tal como se describe por Tuerk y Gold (1990) Science 249:505-510 utilizando ADN de doble cadena que se generó a partir del repertorio de ARN mediante amplificación por PCR. El ADN amplificado por PCR se digirió con los enzimas de restricción SphI y HindIII y se ligó en sitios compatibles en pGEM. Los plásmidos ligados se transformaron en E. coli y se sembraron en agar LB que contenía \beta-O-galactósido de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, tiogalactósido de isopropilo y 100 mg/mL de ampicilina. Se analizaron las colonias que no expresaban la \beta-galactosidasa. Se realizó la secuenciación del ADN tal como ha sido descrito por Tuerk y Gold (1990) utilizando el procedimiento del didesoxinucleótido de Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467. Se aislaron los plásmidos de E. coli mediante el procedimiento miniprep de lisis alcalina (Manitatis et al. (1982) en Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se incubó el ADN en Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), NaCl 60 mM, acetato de magnesio 6 mM y DTT 1 mM con dNTP 0,4 mM y didesoxi-NTP 0,2 mM durante 20 minutos a 48 grados. La ADN polimerasa se encontraba presente en una cantidad de 4 unidades por reacción. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 10 mL de tampón de carga y se calentaron a 95 grados durante 3 minutos antes de la electroforesis en gel en un gel desnaturalizante de urea 8M/poliacrilamida al 6%. Se realizó la secuenciación G track tal como se ha descrito y representó un procedimiento conveniente para monitorizar rápidamente la librería clonada en búsqueda de ligandos con diferentes secuencias. Brevemente, la reacción de secuenciación G track contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), NaCl 60 mM, acetato de magnesio 6 mM y DTT 1 mM con dNTP 0,4 mM, didesoxi-GTP 0,2 mM y 4 unidades de ADN polimerasa. La reacción se realizó a 48 grados durante 20 minutos y se detuvo mediante la adición de 10 uL de tampón de carga y se calentó a 95 grados durante 3 minutos antes de la electroforesis en gel en un gel desnaturalizante de urea 8M/poliacrilamida al 6%.

Ejemplo 6 Análisis de unión, resultados de los bioensayos y secuencias de una librería de ADNss

El análisis de unión de la librería de ADN 40D7 para TGF-B1 se muestra en la Figura 1. Se muestran los datos de unión obtenidos de la ronda 19 (triángulos) y la ronda 0 (círculos). El experimento se realizó incubando ácido nucleico (inferior a 1 nM) y la concentración indicada de TGF-b1 en Tampón de Unión (NaCl 150 mM, Tris-acetato 10 mM pH 8,2, BSA al 0,001%) durante 15 minutos a 37 grados en un volumen de 0,1 mL. Las muestras se filtraron a través de nitrocelulosa y a continuación se añadió inmediatamente 3 mL de Tampón TE (Tris-acetato 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM). El porcentaje de marcaje radioactivo unido se calculó a partir de la cantidad de marcaje radioactivo retenido en el filtro de nitrocelulosa y del marcaje radioactivo total añadido a la reacción de unión. Los resultados muestran que la Kd aparente de la librería 40D7 es 1 nM, mientras que la reserva de partida tiene una Kd aparente de 30 nM. De este modo, la librería 40D7 muestra un aumento de aproximadamente tres veces en la unión.

Se realizó un ensayo de PAI-luciferasa para detectar la actividad de TGF-b1 en presencia de las librerías de ácidos nucleicos generadas en el Ejemplo 5 tal como se describe en Abe et al. (1994) Analytical Biochem. 216:276-284. Se incubaron células epiteliales de pulmón de visón que contenían el gen indicador luciferasa/PAI con TGF-b1 (10 pM) y oligonucleótidos de las librerías de ADN o anticuerpo anti-TGF-B (60 \mug/mL). Las células epiteliales de pulmón de visón se incubaron durante 18 horas y los oligonucleótidos se preincubaron con TGF-b1 antes del ensayo y se volvieron a añadir después de 8 horas. La adición de los oligonucleótidos solos (100 nM) al cultivo celular no afectó el ensayo (datos no mostrados). La identidad de las librerías de oligonucleótidos así como su efecto en la actividad luciferasa se muestra en la Figura 2. La librería de ADNss 40N7 inhibía completamente la actividad de TGF-B1, mientras que el control (una concentración igual de ácido nucleico al azar) mostraba una pequeña estimulación de la actividad de TGF-B1.

Basándose en los resultados de los análisis de unión y del ensayo de PAI/luciferasa, se secuenciaron los ligandos de ADN de la librería 40N7 tal como se describe en el Ejemplo 5. Las secuencias se muestran en la Tabla 6 (SEC ID NOS: 55-89). Debido a que la librería 40N7 de ADN mostraba inhibición en el bioensayo PAI/luciferasa, es razonable sugerir que los clones individuales de la librería son elementos de unión a TGF\beta1.

Ejemplo 7 Procedimientos experimentales

Este Ejemplo proporciona los procedimientos generales seguidos e incorporados en los Ejemplos 8-15 para el desarrollo de ligandos de ácidos nucleicos de PDGF.

A. Materiales

El PDGF-AA (Mr=29.000), PDGF-AB (Mr=27.000) y PDGF-BB (Mr=25.000) humanos recombinantes se adquirieron de R&D Systems (Minneapolis, MN) en forma liofilizada sin proteína portadora. Las tres isoformas se produjeron en E. coli a partir de genes sintéticos basados en las secuencias para la forma larga de la cadena A del PDGF humano maduro (Betsholtz et al. (1986) Nature 320: 695-699) y la forma madura natural de la cadena B del PDGF humano (Johnsson et al. (1984) EMBO J. 3: 921-928). Las librerías de ADN al azar, los cebadores de PCR y los ligandos de ADN y los ligandos de ADN sustituidos con 5'-yodo-2'-desoxiuridina se sintetizaron por NeXstar Pharmaceuticals Inc. (Boulder, CO) o por Operon Technologies (Alameda, CA) utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida estándar (Sinha et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 4539-4557).

B. SELEX de ADN de Cadena Única (ADNss)

Las características esenciales del procedimiento SELEX se han descrito en detalle en las solicitudes de patente SELEX (véanse también, Tuerk y Gold, Science, 249: 505 (1990); Jellinek et al. Biochemistry, 33: 10450 (1994); Jellinek et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 11227 (1993)), que se incorporan por referencia en esta memoria. La librería de ADNss inicial que contenía una región aleatoria contigua de cuarenta nucleótidos, flanqueada por regiones de reasociación de cebadores (Tabla 7; SEC ID NO: 90) de secuencia invariante, se sintetizó mediante el método de la fosforamidita en fase sólida utilizando una mezcla molar igual de las cuatro fosforamiditas para generar las posiciones aleatorias. La librería de ADNss se purificó mediante electroforesis en un gel de urea 7M/poliacrilamida al 8%. La banda que correspondía al ADN de longitud completa se visualizó bajo luz UV, se cortó del gel, se eluyó mediante el método de exprimir y remojar ("crush and soak"), se precipitó con etanol y se obtuvo el pellet por centrifugación. El pellet se secó en vacío y se resuspendió en una solución salina tamponada con fosfato complementada con tampón MgCl_{2} 1 mM (PBSM = Na_{2}HPO_{4} 10,1 mM, KH_{2}PO_{4} 1,8 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH 7,4). Antes de la incubación con la proteína, el ADNss se calentó a 90ºC durante 2 minutos en PBSM y se enfrío en hielo. La primera selección se inició incubando aproximadamente 500 pmol (3 x 10^{14} moléculas) de ADNss aleatorio marcado en el extremo 5' con ^{32}P con PDGF-AB en tampón de unión (PBSM que contenía albúmina de suero humano (HSA) al 0,01%). La mezcla se incubó a 4ºC hasta el día siguiente, seguido de una corta (15 minutos) incubación a 37ºC. El ADN unido a PDGF-AB se separó del ADN no unido mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% (1:30 bisacrilamida:arcrilamida) a 4ºC y a 5V/cm con Tris-borato 89 mM (pH 8,3) que contenía EDTA 2 mM como tampón de elución. La banda que corresponde al complejo PDGF-ADNss, que corre aproximadamente con la mitad de la movilidad electroforética que el ADNss libre, se visualizó mediante autorradiografía, se cortó del gel y se eluyó mediante el método de exprimir y remojar. En las selecciones de afinidad posteriores, el ADNss se incubó con PDGF-AB durante 15 minutos a 37ºC en tampón de unión y el ADNss unido a PDGF se separó del ADN no unido mediante filtración con nitrocelulosa, tal como se ha descrito previamente (Green et al. (1995) Chemistry y Biology 2, 683-695). Todas las reservas de ADNss seleccionadas por afinidad se amplificaron por PCR donde el ADN se sometió a 12-20 rondas de ciclos térmicos (30 s a 93ºC, 10 s a 52ºC, 60 s a 72ºC) en Tris-Cl 10 mM (pH 8,4) que contenía KCl 50 mM, MgCl_{2} 7,5 mM, albúmina de suero bovino 0,05 mg/ml, desoxinucleósido trifosfatos 1 mM, cebadores 5 \muM (Tabla 7) y 0,1 unidades/\mul de Taq polimerasa. El cebador de PCR 5' se marcó en el extremo 5' con polinucleótido quinasa y [\gamma-^{32}P]ATP y el cebador de PCR 3' se biotiniló en el extremo 5' utilizando biotin fosforamidita (Glen Research, Sterling, VA). Después de la amplificación por PCR, se añadió estreptavidina (Pierce, Rockfold, IL) a la mezcla de reacción de PCR no purificada en un exceso 10 veces molar sobre el cebador biotinilado y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ADNds se desnaturalizó añadiendo un volumen igual de solución de terminación (formamida al 90%, dodecilsulfatosódico al 1%, azul de bromofenol al 0,025% y xilen cianol) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La cadena marcada radioactivamente se separó de la cadena biotinilada unida a estreptavidina mediante electroforesis en geles de urea 7M/poliacrilamida al 12%. La cadena de ADNss (no biotinilada) marcada radioactivamente que migraba con mayor velocidad se cortó del gel y se recuperó tal como se ha descrito anteriormente. Se estimó la cantidad de ADNss a partir de la absorbancia a 260 nm utilizando el coeficiente de extinción de 33 \mug/ml/unidad de absorbancia (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 Ed. 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

C. Clonación y Secuenciación

La reserva enriquecida por afinidad amplificada de la ronda 12 del SELEX se purificó en un gel de poliacrilamida al 12% y se clonó entre los sitios HindIII y PstI en una cepa JM 109 de E. coli (Sanibrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 Ed. 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Se utilizaron clones individuales para preparar plásmidos mediante lisis alcalina. Los plásmidos se secuenciaron en la región de inserción utilizando el cebador de secuenciación de orientación directa y Sequenase 2.0 (Amersham, Arlington Heights, IL) según el protocolo del fabricante.

D. Determinación de las constantes de disociación de equilibrio aparentes y las constantes de velocidad de disociación

Se determinó la unión de los ligandos de ADNss a bajas concentraciones, a concentraciones variantes de PDGF mediante el método de unión a filtro de nitrocelulosa tal como se ha descrito (Green et al. (1995) Chemistry y Biology 2: 683-695). Las concentraciones de soluciones de reserva de PDGF (en PBS) se determinaron a partir de las lecturas de absorbancia a 280 nm utilizando los siguientes valores de e_{280} calculados a partir de las secuencias aminoacídicas (Gill, S. C. y von Hippel, P. H. (1989) Anal. Biochem. 182: 319-326): 19.500 M^{-1}cm^{-1} para PDGF-AA, 15.700 M^{-1}cm^{-1} para PDGF-AB y 11.800 M^{-1}cm^{-1} para PDGF-BB. El ADNss para todos los experimentos de unión se purificó mediante electroforesis en geles de urea 7M/poliacrilamida al 12% (<40 nucleótidos) o al 8% (>80 nucleótidos). Todos los ligandos de ADNss se calentaron a 90ºC en tampón de unión en elevada dilución (=1 nM) durante 2 minutos y se enfriaron en hielo antes de diluirlos más en la solución de proteínas. Las mezclas de unión se incubaron típicamente durante 15 minutos a 37ºC antes de separarlas en filtros de nitrocelulosa.

La unión de ligandos de ADN (L) a PDGF-AA (P) se describe de forma adecuada por el modelo de unión bimolecular para el que la fracción de ADN unido en el equilibrio (q) viene dada por la ec. 1,

(1)q=(f/2[L]_{t})\{[P]_{t}+[L]_{t}+K_{d}-[([P]_{t}+[L]_{t}+K_{d})^{2}-4[P]_{t}[L]_{t}]^{1/2}\}

donde [P]_{t} y [R]_{t} son las concentraciones de proteína total y ADN total, K_{d} es la constante de disociación de equilibrio y f es la eficiencia de retención de los complejos proteína-ADN en filtros de nitrocelulosa (Irvine et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 739-761; Jellinek et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11227-11231).

La unión de ligandos de ADN a PDGF-AB y PDGF-BB es bifásica y se puede describir mediante un modelo en el que el ligando de ADN está compuesto de dos componentes que no se interconvierten (L_{1} y L_{2}) y que se unen a la proteína con diferentes afinidades, descritas por las correspondientes constantes de disociación, K_{d1} y K_{d2} (Jellinek et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11227-11231). En este caso, la solución explícita para la fracción de ADN unido (q) viene dada por la ec. 2,

1

con

donde \chi_{1} y \chi_{2} (=1- \chi_{1}) son las fracciones molares de L_{1} y L_{2}. Los valores de K_{d} para la unión de ligandos de ADN a PDGF se calcularon ajustando los datos a la ecuación 1 (para PDGF-AA) o a la ecuación 2 (para PDGF-AB y PDGF-BB) utilizando el método no lineal del mínimo cuadrado.

Las constantes de velocidad de disociación (k_{off}) se determinaron midiendo la cantidad de ligandos mínimos marcados en el extremo 5' con ^{32}P (0,17 nM) unida a PDGF-AB (1 nM) como función del tiempo después de la adición de un exceso molar de 500 veces de ligandos no marcados, utilizando la unión a filtro de nitrocelulosa como el método de separación. Los valores de k_{off} se determinaron ajustando los datos a la ecuación de primer orden (ec. 3)

(3)(q-q_{\infty})/(q-q_{\infty}) = exp(-k_{off}t)

donde q, q_{o} y q_{\infty} representan las fracciones de ADN unidas a PDGF-AB en cualquier tiempo (t), t=0 y t=\infty, respectivamente.

E. Determinaciones de ligando mínimo

Para generar una población de ligandos de ADN marcados en el extremo 5' truncados en serie a partir del extremo 3', se marcó radioactivamente un cebador complementario a la región de secuencia invariante 3' de una plantilla de ligando de ADN (cebador truncado 5N2, Tabla 7; SEC ID NO: 92) en el extremo 5' con [\gamma-^{32}P]-ATP y polinucleótido quinasa T4, se reasoció a la plantilla y se extendió con Sequenase (Amersham, Arlington Heights, IL) y una mezcla de los cuatro dNTPs y ddNTPs. Después de la incubación en tampón de unión durante 15 minutos a 37ºC, se separaron los fragmentos de esta población que conservaban una unión de elevada afinidad por PDGF-AB de aquellos con una afinidad más débil mediante separación con filtro de nitrocelulosa. La resolución electroforética de los fragmentos en geles de urea 7 M/poliacrilamida al 8%, antes y después de la selección por afinidad, permite la determinación de la región terminal 3'. Para generar una población de ligandos de ADN marcados en el extremo 3' truncados en serie a partir del extremo 5', los ligandos de ADN se marcaron radioactivamente en el extremo 3' con [\alpha-^{32}P]-cordicepina-5'-trifosfato (New England Nuclear, Boston, MA) y ARN ligasa T4 (Promega, Madison, WI), se fosforilaron en el extremo 5' con ATP y polinucleótido quinasa T4, y se digirieron parcialmente con exonucleasa lambda (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). La digestión parcial de 10 pmoles de ligando marcado en 3' se llevó a cabo en un volumen de 100 \muL con glicina-KOH 7 mM (pH 9,4), MgCl_{2} 2,5 mM, BSA 1 \mug/ml, tRNA 15 \mug y 4 unidades de exonucleasa lambda durante 15 minutos a 37º. La región terminal 5' se determinó de un modo análogo al descrito para la región
terminal 3'.

F. Mediciones de la temperatura de fusión (T_{m})

Se obtuvieron los perfiles de fusión para los ligandos de ADN mínimos en un espectrofotómetro Cary Model 1E. Los oligonucleótidos (320-400 nM) se calentaron a 95ºC en PBS, PBSM o PBS con EDTA 1 mM y se enfriaron a temperatura ambiente antes de la determinación del perfil de fusión. Los perfiles de fusión se generaron calentando las muestras a la velocidad de 1ºC/minuto desde 15-95ºC y registrando la absorbancia cada 0,1ºC. Se calculó la primera derivada de los datos utilizando el programa de representación KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA). Los valores de la primera derivada se allanaron utilizando una función de allanamiento de 55 puntos promediando cada punto con 27 datos en cada lado. Se usó el pico de las curvas allanadas de primera derivada para estimar los valores de T_{m}.

G. Entrecruzamiento de ligandos de ADN sustituidos con 5-yodo-2'-desoxiuridina a PDGF-AB

Se sintetizaron ligandos de ADN que contenían una única o múltiples sustituciones de 5'-yodo-2'desoxiuridina por timidina utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida. Para evaluar la capacidad de entrecruzamiento, se incubaron cantidades traza de ligandos marcados en el extremo 5' con ^{32}P con PDGF-AB (100 nM) en tampón de unión a 37ºC durante 15 minutos antes de la irradiación. La mezcla de unión se transfirió a una cubeta de longitud de recorrido de 1 cm termostatizada a 37ºC y se irradió a 308 nm durante 25-400 s a 20 Hz utilizando un láser de excímero Lumonics Model EX748 cargado con XeCl. La cubeta se colocó 24 cm más allá del punto focal de una lente convergente, donde la energía en el punto focal era de 175 mjoules/pulso. Después de la irradiación, se mezclaron las alícuotas con un volumen igual de tampón de carga de formamida que contenía SDS al 0,1% y se incubaron a 95º durante 5 minutos antes de la resolución del complejo de PDGF/ligando entrecruzado del ligando libre en geles de urea 7 M/poliacrilamida al 8%.

Para identificar el sitio de entrecruzamiento de la proteína para el ligando 20t-I4, se realizó la unión y la asociación a una escala mayor. Se incubaron el PDGF-AB y el ligando marcado en el extremo 5' con ^{32}P, cada uno a 1 \muM en PBSM, e irradiaron (300 s) tal como se ha descrito anteriormente en dos recipientes de reacción de 1 ml. Se combinaron las mezclas de reacción, se precipitaron con etanol y se resuspendieron en 0,3 ml de tampón Tris-HCl (100 mM, pH 8,5). El complejo entrecruzado de PDGF-AB/ligando se digirió con 0,17 \mug/ml de tripsina modificada (Boehringer Mannheim) durante 20 horas a 37º. La mezcla de digestión se extrajo con fenol/cloroformo, cloroformo y a continuación se precipitó con etanol. El pellet se volvió a suspender en agua y un volumen igual de tampón de carga de formamida con \beta-mercaptoetanol al 5% (v/v) (sin SDS), se incubó a 95º durante 5 minutos y se resolvió en un gel de urea 7 M/poliacrilamida al 8% de 40 cm. El péptido tríptico/ligando entrecruzado que migraba como dos bandas separadas por poca distancia aproximadamente 1,5 cm por encima de la banda del ligando libre se cortó del gel y se eluyó mediante el método de exprimir y remojar, y se precipitó con etanol. El péptido entrecruzado secado (aproximadamente 160 pmoles basándose en la actividad específica) se secuenció mediante degradación Edman (Midwest Analytical, Inc. St. Louis, MO).

H. Ensayo de Unión al Receptor

La unión de ^{125}I-PDGF-AA y ^{125}I-PDGF-BB a células endoteliales aórticas porcinas (PAE) transfectadas con receptores \alpha o \beta de PDGF se realizó tal como se ha descrito (Heldin et al. (1988) EMBO J. 7, 1387-1394). Se añadieron diferentes concentraciones de ligandos de ADN al cultivo celular (1,5 cm^{2}) en 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato complementada con 1 mg de albúmina de suero bovino por ml junto con ^{125}I-PDGF-AA (2 ng, 100.000 cpm) o ^{125}I-PDGF-BB (2 ng, 100.000 cpm). Después de la incubación a 4ºC durante 90 minutos, se lavaron los cultivos celulares y se determinó la radioactividad asociada a las células en un contador \gamma (Heldin et al. (1988) EMBO J. 7, 1387-1394).

I. Ensayo de Incorporación de [^{3}H]timidina

Se realizó la incorporación de [^{3}H]timidina en células PAE que expresaban el receptor \beta de PDGF en respuesta a 20 ng/ml de PDGF-BB o suero fetal de ternera al 10% y en presencia de diferentes concentraciones de ligandos de ADN tal como se ha descrito (Mori et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 21158-21164). Después de la incubación durante 24 horas a 37ºC, se determinó la radioactividad de ^{3}H incorporada al ADN utilizando un contador \beta.

Ejemplo 8 Ligandos de ADNss de PDGF

Se identificaron ligandos de ADN de elevada afinidad de PDGF AB mediante el procedimiento SELEX a partir de una librería de =3 x 10^{14} moléculas (500 pmoles) de ADN de cadena única aleatorizado en cuarenta posiciones contiguas (Tabla 7; SEC ID NO: 90). El ADN unido a PDGF se separó del ADN no unido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en la primera ronda y mediante unión a filtro de nitrocelulosa en las rondas subsiguientes. Después de 12 rondas de SELEX, la reserva enriquecida en afinidad se unía a PDGF-AB con una constante de disociación aparente (K_{d}) de \approx50 pM (datos no mostrados). Esto representa una mejora en la afinidad de =700 veces comparado con la librería de ADN inicial aleatorizado. Esta reserva enriquecida en afinidad se utilizó para generar una librería de clones a partir de la cual se secuenciaron 39 aislados. Se encontró que 32 de estos ligandos tenían secuencias únicas (Tabla 8; SEC ID NOS: 93-124). Los ligandos que se sometieron a la determinación de secuencia mínima se encuentran marcados con un asterisco (*) al lado del número del clon. Los números de los clones que se encontró que conservaban la unión de elevada afinidad como ligandos mínimos se encuentran en cursiva. Todos los ligandos mostrados en la Tabla 8 se exploraron para determinar su capacidad de unión a PDGF AB utilizando el método de unión a filtro de nitrocelulosa. Para identificar los mejores ligandos de este grupo, se determinaron sus afinidades relativas por PDGF-AB midiendo la fracción de ligandos marcados en el extremo 5' con ^{32}P unidas a PDGF-AB a lo largo de un rango de concentraciones de proteína. Para los ligandos que se unían a PDGF-AB con elevada afinidad, también se examinó la afinidad por PDGF-BB y PDGF-AA: en todos los casos, la afinidad de los ligandos por PDGF-AB y PDGF-BB fue comparable mientras que la afinidad por PDGF-AA fue considerablemente inferior (datos no mostrados).

Veintiuno de los veintidós ligandos únicos se pueden agrupar en una familia de secuencias mostrada en la Tabla 9. Las secuencias de la región aleatorizada inicial (letras en mayúscula) se encuentran alineadas según el motivo de unión de tres hélices consenso. Los nucleótidos en la región invariante de la secuencia (letras en minúscula) sólo se muestran cuando participan en la estructura secundaria predicha. Se "desconectaron" varios ligandos (símbolo igual) para mostrar su relación con el motivo consenso a través de permutación circular. Los nucleótidos que se predijo que participaban en el apareamiento de bases se indican con flechas invertidas por debajo de la línea, con las puntas de las flechas apuntando hacia la unión de hélice. Las secuencias se dividen en dos grupos, A y B, basándose en el primer nucleótido de la cadena (desde el extremo 5') en la unión de hélice (A o G, entre las hélices II y III). Los emparejamientos erróneos en las regiones de la hélice se muestran con puntos debajo de las correspondientes letras (se permitieron los pares de bases G-T y T-G). En los sitios en los que se producen protuberancias de un único nucleótido, el nucleótido que se emparejaba erróneamente se muestra por encima del resto de la secuencia entre sus vecinos.

Esta clasificación se basa en parte en la homología de secuencia entre estos ligandos, pero en gran parte en base a un motivo de estructura secundaria compartido: una unión de tres hélices ("three-way helix junction") con un bucle de tres nucleótidos en el punto de ramificación (Figura 3). Estos ligandos se subdividieron en dos grupos; para los ligandos del grupo A, el bucle en el punto de ramificación tiene una secuencia invariante AGC, y en el grupo B, esta secuencia es G(T/G)(C/T). El motivo de estructura secundaria consenso propuesto viene soportado por una covariación en el emparejamiento de bases en los nucleótidos no conservados en las hélices (Tabla 10). Debido a que las uniones de tres cadenas están codificadas en cadenas de ADN continuas, dos de las hélices terminan en bucles en el extremo distal de la unión. Estos bucles son muy variables, tanto en longitud como en secuencia. Además, a través de permutación circular del motivo consenso, los bucles existen en las tres hélices, aunque son más frecuentes en las hélices II y III. En conjunto, estas observaciones sugieren que las regiones distales de la unión de hélice no son importantes para la unión de elevada afinidad a PDGF-AB. Los nucleótidos altamente conservados realmente se encuentran cerca de la unión de hélice (Tabla 9, Figura 3).

Ejemplo 9 Análisis de la región terminal

Se determinó la secuencia mínima necesaria para la unión de elevada afinidad para los seis mejores ligandos de PDGF-AB. En general, la información sobre las regiones terminales de secuencia mínima 3' y 5' se puede obtener fragmentando parcialmente el ligando de ácido nucleico y a continuación seleccionando los fragmentos que conservan una elevada afinidad por la diana. Con ligandos de ARN, los fragmentos se pueden generar de forma conveniente mediante hidrólisis alcalina suave (Tuerk et al. (1990) J. Mol. Biol. 213: 749-761; Jellinek et al. (1994) Biochemistry 33:10450-10456; Jellinek et al. (1995) Biochemistry 34: 11363-11372; Green et al. (1995) J. Mol. Biol. 247: 60-68). Debido a que el ADN es más resistente a las bases, para ADN se requiere un método alternativo para generar fragmentos. Para determinar la región terminal 3', se generó una población de fragmentos de ligandos truncados en serie en el extremo 3' extendiendo el cebador marcado en el extremo 5' reasociado a la secuencia invariante 3' de un ligando da ADN usando el método de secuenciación didesoxi. Esta población se seleccionó por afinidad mediante filtración con nitrocelulosa y los fragmentos más cortos (truncados a partir del extremo 3') que conservaban una unión de elevada afinidad por PDGF-AB se identificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La región terminal 5' se determinó de un modo análogo, excepto que una población de fragmentos de ligandos marcados en el extremo 3' truncados en serie en la posición 5' se generó mediante digestión limitada con exonucleasa lambda. El ligando mínimo se define a continuación como la secuencia entre las dos regiones terminales. Es importante tener en mente que, mientras que la información derivada de estos experimentos es útil, las regiones terminales sugeridas no son en ningún sentido absolutas debido a que las regiones terminales son examinadas un término cada vez. Los términos no truncados (marcados radioactivamente) pueden aumentar, reducir o no tener ningún efecto en la unión (Jellinek et al. (1994) Biochemistry, 33: 10450-10456).

De los seis ligandos mínimos para los que se determinaron las regiones terminales de forma experimental, dos (20t (SEC ID NO: 172) y 41t (SEC ID NO: 174); versiones truncadas de los ligandos 20 y 41) se unían con afinidades comparables (en un factor de 2) a sus análogos de longitud completa y cuatro tenían afinidades considerablemente inferiores. Los dos ligandos mínimos que conservaban una unión de elevada afinidad a PDGF, 20t y 41t, contenían el motivo de estructura secundaria de unión de tres hélices predicho (Figura 4). La secuencia del tercer ligando mínimo que se unía a PDGF-AB con elevada afinidad, 36t (SEC ID NO: 173), se dedujo del conocimiento del motivo consenso (Figura 4). En experimentos posteriores, se encontró que la región de cadena única en el extremo 5' del ligando 20t no es importante para la unión de elevada afinidad. Además, los bucles de trinucleótidos en las hélices II y III en el ligando 36t (GCA y CCA) se pueden reemplazar con espaciadores de pentaetilenglicol (más abajo). Estos experimentos proporcionan un soporte adicional de la importancia de la región de unión de hélice en la unión de elevada afinidad a PDGF-AB.

La unión de los ligandos mínimos 20t, 36t y 41t a concentraciones variantes de PDGF-AA, PDGF-AB y PDGF-BB se muestra en las Figuras 5A, 5B y 5C. De acuerdo con las propiedades de unión de sus análogos de longitud completa, los ligandos mínimos se unen a PDGF-AB y PDGF-BB con una afinidad sustancialmente mayor que a PDGF AA (Figuras 5A, 5B y 5C, Tabla 11). De hecho, su afinidad por PDGF-AA es comparable a la del ADN aleatorio (datos no mostrados). La unión a PDGF-AA se describe de forma adecuada con una ecuación de unión monofásica mientras que la unión a PDGF-AB y PDGF-BB es notablemente bifásica. En experimentos SELEX previos, se ha encontrado que la unión bifásica es una consecuencia de la existencia de especies de ácidos nucleicos separables que se unen a su proteína diana con diferentes afinidades (Jellinek et al. (1995) Biochemistry, 34: 11363-11372) y resultados no publicados). En estos momentos no se conoce la identidad de las fracciones de alta y baja afinidad. Debido a que estos ligandos de ADN descritos en esta memoria se sintetizaron químicamente, es posible que la fracción que se une a PDGF-AB y PDGF-BB con menor afinidad represente ADN químicamente imperfecto. Alternativamente, las especies de alta y baja afinidad pueden representar isómeros conformacionales estables que se unen a la cadena B de PDGF con diferentes afinidades. En cualquier caso, el componente de unión de elevada afinidad es la especie de ligando más poblada en todos los casos (Figuras 5B y 5C). Por comparación, un ligando de ADN de 39-mero que se une a la trombina humana con una K_{d} de 0,5 nM (ligando 39T (SEC ID NO: 177): 5'-CAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACTTCGTGGAA[3'T], donde [3'T] representa un nucleótido de timidina unido 3'-3' añadido para reducir la degradación por 3'-exonucleasas) y que tiene una estructura predicha de bucle-tallo, se une a PDGF-AB con una K_{d} de 0,23 \muM (datos no mostrados).

Ejemplo 10 Estabilidad cinética de los complejos de PDGF-ligando de ácido nucleico

Para evaluar la estabilidad cinética de los complejos de PDGF-AB/ADN, se determinaron las velocidades de disociación a 37ºC para los complejos de ligandos mínimos 20t, 36t y 41t (SEC ID NOS: 172-174) con PDGF-AB midiendo la cantidad de ligandos marcados radioactivamente (0,17 nM) unidas a PDGF-AB (1 nM) como función del tiempo después de la adición de un gran exceso de ligandos no marcados (Figura 6). A estas concentraciones de ligando de ADN y proteína, únicamente la fracción de elevada afinidad de los ligandos de ADN se une a PDGF-AB. Se obtuvieron los siguientes valores para las constantes de velocidad de disociación ajustando los datos mostrados en la Figura 6 a la ecuación de velocidad de primer orden: 4,5 \pm 0,2 x 10^{-3} s^{-1} (t_{1/2} = 2,6 min) para el ligando 20t,
3,0 + 0,2 x 10^{-3} s^{-1} (t_{1/2} = 3,8 min) para el ligando 36t, y 1,7 \pm 0,1 x 10^{-3} s^{-1} (t_{1/2} = 6,7 min) para el ligando 41t. Las velocidades de asociación calculadas para las constantes de disociación y las constantes de velocidad de disociación (k_{on}=k_{off}/K_{d}) son 3,1 x 10^{7} M^{-1}s^{-1} para 20t, 3,1 x 10^{7} M^{-1}s^{-1} para 36t y 1,2 x 10^{7} M^{-1}s^{-1} para 41t.

Ejemplo 11 Propiedades de fusión térmicas

Para examinar la capacidad de los ligandos mínimos 20t, 36t y 41t para asumir estructuras plegadas, se determinaron sus temperaturas de fusión (T_{m}'s) a partir de los perfiles de absorbancia de UV frente a la temperatura en tampones PBSM o PBSE. A las concentraciones de oligonucleótido usadas en estos experimentos (320-440 nM), únicamente se observaron las especies monoméricas como bandas únicas en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes (datos no mostrados). Los ligandos 20t y 41t experimentaron una fusión térmica que se describe bien mediante un modelo de dos estados (plegado y desplegado) con líneas de base de pendiente lineal (Petersheim y Turner (1983) Biochem. 22: 256-263) con valores de T_{m} en tampón PBSM de 43,8 \pm 0,4ºC y 49,2 \pm 0,5ºC, respectivamente. En tampón PBSE, se obtuvieron valores similares de T_{m}: 44,8 \pm 0,5ºC para el ligando 20t y 48,0 \pm 0,5ºC para el ligando 41t. El ligando 36t presentaba un perfil de fusión térmico más complejo en el que se observaban dos transiciones diferentes. En este caso, los datos se describieron bien mediante un modelo de tres estados en el que los estados completamente plegado y desplegado están conectados a través de un resultado intermedio parcialmente plegado. Utilizando este modelo, se obtuvieron dos valores de T_{m} para el ligando 36t: 47,0 \pm 0,9ºC y 67,1 \pm 3,8ºC en tampón PBSM y 44,2 \pm 1,7ºC y
64,3 \pm 4,1ºC en tampón PBSE.

Ejemplo 12 Fotoentrecruzamiento de ligandos de ácidos nucleicos y PDGF

Para determinar los sitios de los ligandos de ADN y de PDGF que se encuentran en contacto íntimo, se realizaron una serie de experimentos de fotoentrecruzamiento con los ligandos de ADN 20t, 36t y 41t (SEC ID NOS: 172-174) sustituidos con 5'-yodo-2'-desoxiuridina (IdU). Bajo excitación monocromática a 308 nm, los nucleótidos con pirimidinas sustituidas con 5-yodo y 5-bromo pueblan un estado de triplete reactivo después de un cruce entre sistemas del inicial n a uno de transición \pi*. Las especies del estado triplete excitado reaccionan a continuación con los residuos aminoacídicos ricos en electrones (tales como Trp, Tyr e His) que se encuentran cerca para producir un entrecruzamiento covalente. Este método ha sido ampliamente utilizado en estudios de interacciones ácido nucleico-proteína debido a que permite la irradiación con luz de > 300 nm que minimiza el daño producido por la luz (Willis et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4947-4952; Stump, W. T., y Hall, K. B. (1995) RNA 1: 55-63; Willis et al (1993) Science 262: 1255-1257; Jensen et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 92: 12220-12224). Se sintetizaron análogos de los ligandos 20t, 36t y 41t en los que se sustituyeron todos los residuos de timidina con residuos de IdU utilizando el método de la fosforamidita en fase sólida. La afinidad de estos ligandos sustituidos con IdU por PDGF-AB se encontraba de algún modo aumentada comparándola con la de los ligandos no sustituidos y basándose en la aparición de bandas con movilidades electroforéticas más lentas en geles de urea 7 M/poliacrilamida al 8%, los tres ligandos sustituidos con IdU y marcados en el extremo 5' se entrecruzaban con PDGF-AB bajo irradiación a 308 nm (datos no mostrados). La eficiencia de entrecruzamiento mayor se observó con el ligando 20t sustituido con IdU. Para identificar la posición o posiciones de IdU específicas responsables del entrecruzamiento observado, se analizaron siete análogos de 20t sustituidos con una solo IdU o de forma múltiple con varias IdU para determinar su capacidad de fotoentrecruzamiento con PDGF-AB: ligandos 20t-I1 a 20t-I7 (5'-TGGGAGGGCGCGT^{1}T^{1}CT^{1}T^{1}CGT^{2}GGT^{3}T^{4}ACT^{5}T^{6}T^{6}T^{6}AGT^{7}CCCG-3' (SEC ID NOS: 178-184) donde los números indican sustituciones de IdU en los nucleótidos de timidina indicados para los siete ligandos). De estos siete ligandos, se observó un entrecruzamiento eficiente a PDGF-AB únicamente con el ligando 20t-I4. La posición de IdU fotorreactiva corresponde a la timidina proximal 3' en el bucle en la unión de hélice (Figura 4).

Para identificar el residuo o residuos aminoacídicos entrecruzados en PDGF-AB, se incubó una mezcla de 20t-I4 marcado en el extremo 5' y PDGF-AB durante 15 minutos a 37ºC seguido de irradiación a 308 nm. A continuación se digirió la mezcla de reacción con tripsina modificada y los fragmentos entrecruzados se resolvieron en un gel de urea 7 M/ poliacrilamida al 8%. La degradación Edman del fragmento peptídico recuperado de la banda que migraba más cerca de la banda de ADN libre reveló la secuencia aminoacídica KKPIXKK (SEC ID NO: 185), donde X indica un aminoácido modificado que no se pudo identificar con los 20 estándares aminoacídicos derivados. Esta secuencia peptídica, donde X es fenilalanina, corresponde a los aminoácidos 80-86 en la cadena B de PDGF (Johnsson et al. (1984) EMBO J. 3: 921-928) que en la estructura cristalina de PDGF-BB comprende una parte del bucle III expuesto al disolvente (Oefner et al. (1992) EMBO J. 11: 3921-3926). En la cadena A de PDGF, no existe esta secuencia peptídica (Betsholtz et al. (1986) Nature 320: 695-699). Conjuntamente, estos datos establecen un punto de contacto entre un residuo de timidina específico en el ligando 20t y la fenilalanina 84 de la cadena B de PDGF.

Ejemplo 13 Inhibición de PDGF por ligandos de ácidos nucleicos

Para determinar si los ligandos de ADN de PDGF eran capaces de inhibir los efectos de las isoformas de PDGF en células en cultivo, se determinaron los efectos en la unión de isoformas de PDGF marcadas con ^{125}I a receptores \alpha y \beta de PDGF expresados de forma estable en células endoteliales de la aorta porcinas (PAE) mediante transfección. Los ligandos 20t, 36t y 41t (SEC ID NOS: 172-174) inhibían de forma eficiente la unión de ^{125}I-PDGF-BB a receptores \alpha de PDGF (Figura 7) o a receptores \beta de PDGF (datos no mostrados), con los efectos de la mitad del máximo alrededor de 1 nM de ligando de ADN. El ligando de ADN T39, dirigido contra trombina e incluido como control, no presentaba ningún efecto. Ninguno de los ligandos fue capaz de inhibir la unión de ^{125}I-PDGF-AA al receptor \alpha de PDGF (Figura 7), lo que concuerda con la especificidad observada de los ligandos 20t, 36t y 41t para PDGF-BB y PDGF-AB.

Se investigó la capacidad de los ligandos de ADN para inhibir los efectos mitogénicos de PDGF-BB en células PAE que expresan receptores \beta de PDGF. Tal como se muestra en la Figura 8, el efecto estimulador de PDGF-BB en la incorporación de [^{3}H]timidina se vio neutralizado por los ligandos 20t, 36t y 41t. El ligando 36t presentaba una inhibición de la mitad del máximo a la concentración de 2,5 nM; el ligando 41t era ligeramente más eficiente y el ligando 20t ligeramente menos eficiente. El ligando control T39 no tuvo efectos. Además, ninguno de los ligandos inhibió los efectos estimuladores del suero fetal de ternera en la incorporación de [^{3}H]timidina en estas células, mostrando que los efectos inhibidores son específicos para PDGF.

Ejemplo 14 Sustituciones de nucleótidos posteriores al procedimiento SELEX

La estabilidad de los ácidos nucleicos a nucleasas es un aspecto importante a tener en cuenta en los esfuerzos que se realizan para desarrollar compuestos trerapéuticos basados en ácidos nucleicos. Diferentes experimentos han mostrado que muchos, y en algunos casos la mayoría, de los nucleótidos en los ligandos derivados de SELEX se pueden sustituir con nucleótidos modificados que resistan la digestión por nucleasas, sin comprometer la unión de elevada afinidad (Green et al. (1995) Chemistry y Biology 2: 683-695); Green et al. (1995) J. Mol. Biol. 247: 60-68). Los experimentos de este tipo con los ligandos de ADN descritos en esta memoria sugieren que las sustituciones con nucleótidos modificados están toleradas en muchas posiciones (Figura 9; SEC ID NOS: 175-176). Específicamente, se ha examinado la sustitución de 2'-O-metil-2'-desoxi y 2'-fluoro-2'-desoxiribonucleótidos por 2'-desoxiribonucleótidos en el ligando 36t, examinando las propiedades de unión de PDGF-AB del ligando 36t con una sustitución o con múltiples sustituciones. El patrón de sustitución indicado en la Figura 9 es comparable con la unión de elevada afinidad a PDGF-AB. Además, este ligando tolera la sustitución de espaciadores de pentaetilenglicol (Glen Research, Sterling, VA) para los bucles de trinucleótidos en los extremos de las hélices II y III (Figura 9). Por lo tanto, estos ligandos de ADN representan compuestos cabeza de serie para una nueva clase de antagonistas específicos de elevada afinidad de PDGF-AB y PDGF-BB.

Ejemplo 15 Procedimiento experimental para desarrollar ligandos de ARN con 2'-fluoro-2'-desoxipirimidina para PDGF y secuencias obtenidas A. SELEX de ARN con 2'-fluoro-2'-desoxipirimidina

Se realizó el SELEX con ARN con 2'-fluoro-2'-desoxipirimidina dirigido a PDGF AB esencialmente tal como se ha descrito anteriormente (ver anteriormente, y Jellinek et al. (1993, 1994), referencia anterior) utilizando la plantilla de cebador mostrada en la Tabla 12 (SEC ID NOS: 125-127). Brevemente, se preparó el ARN con 2'-fluoro-2'-desoxipirimidina para realizar las selecciones de afinidad mediante transcripción in vitro a partir de plantillas de ADN sintéticas utilizando ARN polimerasa T7 (Milligan et al. Nucl. Acids Res., 15: 8783 (1987)). Se utilizaron las condiciones para la transcripción in vitro descritas anteriormente en detalle (Jellinek et al. (1994), referencia anterior), excepto que se utilizó una concentración superior (3 mM) de nucleósido trifosfatos con 2'-fluoro-2'-desoxiproirimidinas (2'-F-UTP y 2'-F-CTP) en comparación a ATP y GTP (1 mM). Se realizaron las selecciones por afinidad incubando PDGF AB con ARN con 2'-fluoro-2'-desoxipirimidina durante como mínimo 15 minutos a 37ºC en PBS que contenía albúmina de suero humano al 0,01%. La separación del ARN libre del ARN unido a proteína se realizó mediante filtración con nitrocelulosa tal como se ha descrito (Jellinek et al. (1993, 1994) referencia anterior). Se realizó la transcripción inversa del ARN seleccionado por afinidad y la amplificación por PCR tal como se ha descrito anteriormente (Jellinek et al. (1994) referencia anterior). Se realizaron diecinueve rondas de SELEX, típicamente seleccionado entre 1-12% del ARN de entrada. Para las primeras ocho rondas de selección, se incluyó suramina (3-15 \muM) en el tampón de selección para aumentar la presión de selección. La reserva enriquecida por afinidad (ronda 19) se clonó y secuenció tal como se ha descrito (Schneider et al. (1992, referencia anterior). Se han identificado cuarenta y seis secuencias únicas, y las secuencias se muestran en la Tabla 13 (SEC ID NOS: 128-170). Los ligandos de secuencia única se exploraron para determinar su capacidad de unión a PDGF AB con elevada afinidad. Mientras que ARN con 2'-fluoropirimidina aleatorio (Tabla 12) se unía a PDGF con una constante de disociación (Kd) de 35 \pm 7 nM, muchos de los ligandos seleccionados por afinidad se unían a PDGF AB con afinidades = 100 veces superiores. Entre los ligandos únicos, los clones 9 (K_{d} = 91 \pm 16 pM), 11 (K_{d} = 120 \pm 21 pM), 16 (K_{d} = 116 \pm 34 pM), 23 (K_{d} = 173 \pm 38 pM),
25 (K_{d} = 80 \pm 22 pM), 37 (K_{d} = 97 \pm 29 pM), 38 (K_{d} = 74 \pm 39 pM) y 40 (K_{d} = 91 \pm 32 pM) presentaban la mayor afinidad por PDGF AB (la unión de todos estos ligandos a PDGF AB es bifásica y se da la K_{d} para el componente de unión de mayor afinidad).

Ejemplo 16 Procedimientos experimentales

Este ejemplo proporciona los procedimientos generales seguidos e incorporados en los Ejemplos 17-19 para el desarrollo de ligandos de ácidos nucleicos de hKGF.

A. Materiales y Métodos

El Factor de Crecimiento de Queratinocitos humano (hKGF) y el Factor de Crecimiento Epidérmico humano (hEGF) recombinantes se adquirieron de Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY). haFGF, hbFGF, PDGF-AB, TGF\beta1 y el anticuerpo monoclonal neutralizante anti-KGF se adquirieron de R&D Systems (Minneapolis, MN). El KGF de rata recombinante se adquirió de QED Advanced Research Technologies (San Diego, CA). La trombina humana se adquirió de Enzyme Research Laboratorios (South Bend, IN). La ADN ligasa T4, la HpaII metilasa y los enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs (Beverly, MA). El kit de clonación pCR-Script Amp SK(+) se adquirió de Stratagene (La Jolla, CA). La transcriptasa inversa AMV se adquirió de Life Sciences (St. Petersburg, FL). La Taq ADN polimerasa se adquirió de Perkin Elmer (Foster City, CA). Los nucleótido trifosfatos ultrapuros se adquirieron de Pharmacia (Piscataway, NJ). \alpha-^{32}-p-ATP, \gamma-^{32}P-ATP y 5'^{32}P-citidina 3',5'-bis (fosfato) (5'^{32}P-pCp) fueron de DuPont NEN Research Products (Boston, MA). El KGF marcado con ^{125}I se preparó tal como se ha descrito anteriormente (Bottaro et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 12767-12770). Las células de carcinoma prostático PC-3 se obtuvieron de ATCC (número de catálogo CRL 1435). Las células Balb/MK y las células NIH3T3 transfectadas con el receptor de KGF humano (NIH3T3/KGFR) fueron un generoso presente de S. Aaronson, Mt. Sinai Medical Center, NY, y han sido descritas en otras partes (Miki et al. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 246-250; Miki et al. (1991) Science 251: 72-75: Weissman et al. (1983) Cell 32: 599-606). La ARN polimerasa T7, los UTP y CTP modificados con 2'-F y 2'-NH_{2} fueron de NeXstar Pharmaceuticals, Inc. (Boulder, CO). Los oligonucleótidos de ADN se obtuvieron de Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA). La matriz mixta de nitrocelulosa/acetato de celulosa, 0,45 \mum, y los filtros HA fueron de Millipore (Bedford, MA). La Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS) que contenía calcio y magnesio se adquirió de Life Technologies (Gaithersburg, MD). Los compuestos químicos eran como mínimo de calidad de reactivo y se adquirieron de fuentes comerciales.

B. SELEX

El procedimiento SELEX se ha descrito en detalle en la patente estadounidense 5,270,163 (véase también Tuerk y Gold (1990) Science 249: 505-510). Se utilizó una reserva de ADN de cadena única (ADNss) para generar la plantilla de doble cadena (ADNds) para generar la reserva de ARN de secuencia aleatoria inicial mediante transcripción. La plantilla de ADN contenía 40 nucleótidos aleatorios, flanqueados por regiones constantes en 5' y 3' como sitios de reasociación de los cebadores para la PCR y la síntesis de ADNc (Tabla 14; SEC ID NOS: 186-188). El cebador 5' contiene la secuencia del promotor T7 para las transcripciones in vitro. La plantilla se amplificó por PCR después de una desnaturalización inicial a 93ºC durante 3,5 minutos través de 15 ciclos de desnaturalización de 30 segundos a 93ºC, 1 minuto de reasociación a 60ºC y 1 minuto de elongación a 72ºC, en KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9, Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 3 mM, 0,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 0,1 unidades/\mul de Taq ADN polimerasa y 2,5 nM de cada uno de los cebadores 3G7 y 5G7 (Tabla 14; SEC ID NOS: 187-188). Los experimentos SELEX para el hKGF se iniciaron con una reserva de secuencias aleatorias de ARN en la que todas las pirimidinas se encontraban modificadas 2'-F o 2'-NH_{2}. Las reacciones de transcripción se realizaron con aproximadamente 5 \muM de plantilla de ADN, 5 unidades/\mul de ARN polimerasa T7, Tris-HCl 40 mM (pH8) MgCl_{2} 12 mM, DTT 5 mM, espermidina 1 mM, Triton X-100 al 0,002%, PEG 8000 al 4%, 2-4 mM de cada uno de 2'OH ATP, 2'OH GTP, 2'NH_{2} o 2'F CTP, 2'NH_{2} o 2'F UTP, y \alpha^{32}P 2'OH ATP 0,25 \muM (800 Ci/mmol). Los transcritos de longitud completa se purificaron mediante gel antes de su uso. Para preparar las reacciones de unión, las moléculas de ARN se incubaron con hKGF recombinante en Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS) con calcio y magnesio (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Número de catálogo 21300-025) que contenía albúmina de suero humano al 0,01%. Después de la incubación a temperatura ambiente (que variaba entre 10 minutos y 10 horas) los complejos de proteína-ARN se separaron del ARN no unido mediante filtración a través de nitrocelulosa. El ARN unido al filtro de nitrocelulosa se recuperó mediante extracción con fenol/urea. El ARN separado se transcribió de forma inversa en ADNc mediante la transcriptasa inversa AMV a 48ºC durante 60 minutos en Tris-HCl 50 mM pH8,3, NaCl 60 mM, Mg(OAc)_{2} 6 mM, DTT 10 mM, cebador 3' de ADN (Tabla 14) 50 pmol, 0,4 mM de cada uno de dATP, dCTP, DGTP y dTTP, y 1 unidad/\mul AMV RT. El ADNc se amplificó por PCR y se utilizó para iniciar el siguiente ciclo de SELEX.

C. Separación mediante Filtro de Nitrocelulosa

Para separar los complejos de proteína-ARN, las reacciones de unión se filtraron a través de una matriz mixta de nitrocelulosa/acetato de celulosa, tamaño de poro de 0,45 \mum (discos de filtro, Millipore Co., Bedford, MA). Para la filtración, los filtros se colocaron en un colector de vacío y se mojaron aspirando 5 ml de DPBS. Las reacciones de unión se aspiraron a través de los filtros, y después de un lavado de 5 ml, los filtros se contaron con un contador de centelleo (Beckmann). Se usaron volúmenes mayores de lavado con DPBS o urea 0,5 M como modo de aumentar la restricción de la selección tal como se muestra en la Tabla 15. Los transcritos marcados internamente con \alpha-^{32}P-ATP y purificados mediante gel se incubaron con varias concentraciones de hKGF en DPBD a 37ºC durante 10 minutos. Las mezclas de oligonucleótido proteína se filtraron a través de filtros HA de tamaño de poro de 0,45 \mum mojados previamente, seguido de un lavado de 5 ml con DPBS. Se contó la radioactividad retenida en el filtro y se corrigió para la unión de fondo en ausencia de proteína. El método del mínimo cuadrado no lineal se utilizó para ajustar los datos en las curvas de unión monofásicas o bifásicas y para obtener la constante de disociación de equilibrio K_{d} (Jellinek et al. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90: 11227-11231) utilizando el paquete informático Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA). La unión bifásica se puede describir como la unión de dos especies de afinidad que no se encuentran en el equilibrio.

D. Clonación y Secuenciación

El ARN recuperado de los filtros de la ronda 8 se transcribió de forma inversa y se amplificó mediante PCR. Después de la purificación en columna con columnas de espín rápido QIA (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) y precipitación con etanol, el ADN amplificado se metiló con HpaII metilasa (New England Biolabs, Beverly, MA). El ADN metilado se clonó en el sitio de restricción SrfI de un plásmido pCR-Script Direct SK(+) utilizando el kit de clonación pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Se secuenciaron aproximadamente 80 clones con el kit de secuenciación Sequenase (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH). El análisis de las secuencias y la predicción de la estructura secundaria se realizó utilizando el programa informático descrito anteriormente (Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 25: 351-360; Jaeger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-7710; Jaeger et al. (1990) Methods Enzymol. 183: 281-306; Zucker (1989) Science 244: 48-52).

E. Determinación de las Secuencias Mínimas Necesarias para la Unión

Los ligandos de oligonucleótidos marcados en el extremo 5' con \gamma-^{32}P-ATP utilizando polinucleótido quinasa T4, o en el extremo 3' con 5'-^{32}P-pCp y ARN ligasa T4, se utilizaron para establecer las regiones terminales 3' y 5' respectivamente (Fitzwater et al. (1996) Methods Enzymol. 267: 275-301). Después de hidrólisis parcial alcalina, se incubó el oligonucleótido marcado radioactivamente con hKGF 0,1, 0,6 y 3,0 nM, y se aisló el oligonucleótido unido a proteína mediante filtración con nitrocelulosa. Los truncados de oligonucleótido retenidos en la nitrocelulosa se analizaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante de elevada resolución. Se utilizaron una escalera de hidrólisis alcalina y una escalera de ligandos marcados radioactivamente terminados con residuos G, generada mediante digestión parcial con RNasa T1, como marcadores para mapear las regiones terminales 3' y 5'.

F. Perfiles de Desnaturalización Térmica

Los perfiles de fusión de los oligonucleótidos se obtuvieron con un espectrofotómetro Cary Model 1E. Los oligonucleótidos se calentaron a 95ºC en PBS (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, NY) o tampón fosfato 10 mM y se enfriaron a temperatura ambiente antes de registrar el perfil de fusión. Los perfiles de fusión generados muestran el cambio en la absorbancia a 260 nm en función de la temperatura. Durante el registro, las muestras se calentaron a una velocidad de 1ºC min^{-1} desde 20-95ºC.

Ejemplo 17 Ligandos de ARN para hKGF A. SELEX

Para generar ligandos de ARN para hKGF, se iniciaron dos experimentos SELEX paralelos, uno con moléculas de ARN modificadas con pirimidina 2-NH_{2} y el otro con 2'-F que eran aleatorias en 40 posiciones contiguas. Las condiciones del SELEX y los resultados de cada ronda se resumen en la Tabla 15. La reserva de partida contenía 5x10^{14} (500 pmoles) y 2,5x10^{14} (250 pmoles) de moléculas de ARN modificadas con pirimidinas 2'-NH_{2} y 2'-F, respectivamente, y se unió a hKGF con una K_{D} aproximada de 30 nM. Después de 8 rondas de SELEX, las reservas evolucionadas se unían con una K_{D} de 0,6 nM. No se observaron mejoras adicionales en la K_{D} en las dos rondas posteriores. Las reservas de ARN de la octava ronda se transcribieron de forma inversa, se amplificaron por PCR y se clonaron tal como se ha descrito.

B. Secuencias de ARN

En el SELEX 2'-NH_{2}, 29 de los 31 clones fueron únicos. En el SELEX 2'-F, los 43 clones secuenciados fueron únicos. Una secuencia única se define como una secuencia que difiere de todas las otras por tres o más nucleótidos. La Tabla 16 muestra las secuencias (SEC ID NOS: 189-262) de todos los clones secuenciados en código de letra única estándar (Cornish-Bowden (1985) Nucleic Acid Res. 13: 3021-3030). El alineamiento local y global ayudado por ordenador no reveló ninguna homología extensiva entre los clones, y no se observaron de forma evidente familias obvias. Los clones 2'-NH_{2} son en general ricos en purinas mientras que los clones 2'-F son ricos en pirimidinas. Cuando se relajaron los parámetros de la alineación, el algoritmo Feng/Doolittle agrupó los clones 2'-NH_{2} en una familia y los clones 2'-F en otra. La inspección visual de las secuencias sugirió dos y tres posibles familias para los ligandos 2'-NH_{2} y 2'-F, respectivamente. Utilizando una estructura secundaria predicha conservada, 38 ligandos 2'F se podían asignar a dos clases (Figuras 12A y 12B). De forma similar, 15 ligandos 2'-NH_{2} se podían asignar a dos clases (Figuras 12C y 12D). Las dos clases propuestas para los ligandos 2'F se pueden plegar en estructuras de pseudonudo (Wyatt et al. (1993) The RNA World 465-496; ten Dam, E. (1992) Biochemistry 31: 1665-1676). Estas estructuras están muy relacionadas y de hecho podrían ser permutaciones circulares de una estructura común. El bucle 3 (L3) de los pseudonudos de clase 1 presenta la secuencia conservada 5'RRYuy mientras que el bucle 1 (L1) de los ligandos de clase 2 presenta la secuencia 5'AaYY. Las dos secuencias contienen la secuencia consenso 5'RRYY. Algunos de los ligandos 2'F contienen dos o tres copias de la secuencia RRYY (Figuras 12A y 12B). Otra característica de estas estructuras es la distribución desigual de purinas y pirimidinas en el tallo 1 (S1). Una cadena de este tallo contiene casi exclusivamente purinas mientras que la otra cadena contiene pirimidinas.

La clase 1 de los ligandos 2'-NH_{2} incluye 8 miembros que se pueden plegar en estructuras de tallo-bucle con bucles internos simétricos o asimétricos. El tallo contiene tres pares de bases GC consecutivas. Los bucles terminales son largos y presentan la secuencia conservada 5'GGAA(N)_{1-14}YAA(N)_{1-7}RCRR (SEC ID NO: 263). Los dos lados de los bucles asimétricos internos de los ligandos de clase 1 contienen la secuencia 5'AA. La clase 2 incluye 7 ligandos que se pueden plegar en estructuras de pesas con bucles de tamaños variables. Un bucle contiene la secuencia conservada 5'YGAY mientras que el otro bucle contiene la secuencia conservada 5'GGAA(N)_{0-4}YGA (SEC ID NO: 264). Los clones 2N y 54N son permutaciones circulares de los restantes 5 clones.

C. Afinidades

Las constantes de disociación de los ligandos de hKGF se determinaron mediante unión a filtros de nitrocelulosa y se muestran en la Tabla 17. Ocho de los 41 ligandos 2'-F se unían de forma bifásica. El resto de ligandos 2'-F y todos los ligandos 2'-NH_{2} se unían de forma monofásica. Bajo un exceso de proteína, la unión bifásica sugiere que el ligando existe como dos especies de afinidad (presumiblemente isoconfórmeros) que no se encuentran en equilibrio. El mejor ligando modificado 2'-F, K14F, se une de forma bifásica con la constante de disociación de afinidad alta y baja a aproximadamente 0,3-3 pM y 2-10 nM respectivamente. Existe alguna variabilidad observada en las determinaciones de K_{D} para los diferentes clones y el ARN aleatorio. A pesar de la variabilidad experimental en las determinaciones de K_{D}, las especies de elevada afinidad de K14F tienen una afinidad 1.000-5.000 veces mejor que el ARN aleatorio. Entre los ligandos modificados 2'-F monofásicos, K38F tenía la mejor KD de aproximadamente 0,3 nM. Los mejores ligandos modificados 2'-NH_{2} se unían con una KD de 0,4 nM, lo que representa una mejora de aproximadamente 75 veces sobre el ARN aleatorio.

D. Determinación de las Secuencias Mínimas Necesarias para la Unión

Se estudiaron dos ligandos 2'F (6F y 14F) (SEC ID NOS: 223 y 231) en más detalle para determinar las secuencias mínimas necesarias para la unión. Las regiones terminales de las secuencias se determinaron permitiendo que una escalera de hidrólisis alcalina, marcada en el extremo 3' o 5', se una a hKGF. Los fragmentos parciales se purificaron por afinidad mediante filtración en nitrocelulosa y se analizaron en geles desnaturalizantes de elevada resolución. Las regiones terminales se observaron claramente sólo en los extremos 3' para los dos ligandos (Figura 13) y concuerdan con el plegamiento propuesto de la clase 1 tal como se muestra en las Figuras 12A y 12B. A continuación se utilizaron plantillas truncadas para confirmar las regiones terminales (Figura 13). Se evaluaron tres truncados para 6F debido a que correr 7 pirimidinas consecutivas no permitía el mapeo preciso de la región terminal. A partir de estos tres truncados, uno perdió su actividad de unión a KGF tal como se muestra en la Figura 13. Se evaluó un único truncado 14F, denominado 14F3'T. Este truncado era dos bases más largo que la región terminal observada para extender el tallo 2 (S2) de la estructura de pseudonudo propuesta. El ligando truncado 14F3'T conservaba la actividad de unión con una afinidad similar a la del ligando de longitud completa. Igual que el ligando de longitud completa, el 14F3'T se unía a KGF de forma bifásica, donde la especie de alta afinidad representaba aproximadamente el 20% de las moléculas y presentaba valores de K_{d} de aproximadamente 0,3-3 pM. Cuando estas especies de elevada afinidad se separaron parcialmente de las especies de baja afinidad en base a la diferente afinidad por KGF, éstas presentaban curvas de unión con puntos medios a 0,3-3 pM y mesetas máximas de aproximadamente 70% (datos no mostrados). La Figura 13 muestra el plegamiento predicho de los truncados activos más cortos para 6F y 14F que tienen una longitud de 53 y 49 pares de bases, respectivamente. Las dos estructuras de pseudonudo propuestas contienen tallos relativamente largos. Los dos tallos propuestos de 6F se encuentran separados por una única base formando un pseudonudo no de tipo H. La estructura de 6F propuesta se parece a la estructura solución de un motivo de pseudonudo similar de un elemento de desplazamiento de pauta encontrado en el ARN de MMTV (Shen et al. (1995) J. Mol. Biol. 247: 963-978). Los dos tallos (S1 y S2) de 14F se podían representar como dos hélices apiladas coaxialmente de una longitud total de 16 pares de bases (pseudonudo de tipo H). Se ha propuesto una estructura de pseudonudo similar anteriormente, basada en datos de RMN (Du et al. (1996) Biochemistry 35: 4187-4198). Dada la poca longitud de L1, es posible que el ligando 14F forme un pseudonudo que no sea de tipo H donde no se forma el último par de bases GU de S1 permitiendo una región helicoidal más flexible y un L1 más largo. Las curvas de fusión de temperatura de 14F y 14F3'T sugieren una termoestabilidad notable para este ligando (datos no mostrados). Estas curvas de fusión son independientes de la concentración y bifásicas en sal 150 mM. Curvas de fusión bifásicas se han observado anteriormente con ARNt (Hilbers et al. (1976) Biochemistry 15: 1874-1882), y han sido atribuidas al plegamiento terciario de la molécula de ARN. También se han propuesto transiciones de temperatura multifásicas para los pseudonudos de ARN (Du et al. (1996) Biochemistry 35: 4187-4198). Las curvas bifásicas observadas incluyen una Tm baja de aproximadamente 55ºC y una Tm alta de más de 85-90ºC. En sal 10 mM no se observa la Tm baja de 14F mientras que la Tm alta se reduce a 75-78ºC. El perfil de fusión de 14F es más llano que el de 14F3'T aun cuando los valores de Tm son los mismos. Los datos sugieren que la termoestabilidad observada es atribuible a sólo el mínimo 49-mero.

En un esfuerzo por identificar ligandos de KGF más cortos que conservaban la unión, se evaluó la actividad de unión de varias supresiones del truncado más corto del ligando 14F, es decir 14F3T. Las supresiones se evaluaron en todos los elementos estructurales de la estructura de pseudonudo propuesta. Los resultados se resumen en la Tabla 23 (SEC ID NOS: 272-304). Los transcritos de ARN que contenían pirimidinas 2'F y purinas 2'OH se obtuvieron por transcripción in vitro utilizando plantillas de ADN sintéticas. La actividad de cada ligando se muestra atribuyendo + (activo) o - (no activo) tanto para el componente de afinidad alta (H) como para el de baja (L) de la curva de unión de 14F3'T. Los truncados T35 y T36 representan dos mitades complementarias de la molécula 14F3'T y se evaluaron adicionalmente como una mezcla equimolar. Los elementos estructurales de la estructura de pseudonudo propuesta están separados por (1) y están indicados por los símbolos S1 (tallo 1), S2 (tallo 2), L1 (bucle 1) y L3 (bucle 3). La estructura de pseudonudo propuesta para 14F3'T es un pseudonudo no de tipo H y le falta L2 (bucle 2). Las secuencias complementarias que forman S1 (S1 y S1') y S2 (S2 y S2') se encuentran marcadas por un único subrayado o un subrayado doble respectivamente. En las secuencias tabuladas, las bases suprimidas se reemplazaron por puntos (.). Cualquier intento de supresión en los tallos S1 y S2 de la estructura de pseudonudo propuesta tiene como resultado la pérdida de tanto el componente de alta (H) afinidad como el de baja (L) de la curva de unión tal como se ha observado con el ligando 14F3'T. Sin embargo, las supresiones en el bucle 3 (L3) eran toleradas mientras se conservara intacta una copia de la caja RRYY. El ligando más corto que conservaba la actividad es el T22, que es un 43-mero. Intentando obtener ligandos más cortos truncando más L3 se utilizó una versión mutante de T22 (denominada T22mu) donde el último par de bases GC de S1 se eliminó mediante una mutación de G a U en la posición 6. La razón de esta mutación fue la de aumentar la flexibilidad de la región de doble cadena de este ligando dejando una base no apareada entre S 1 y S2. Aunque esta mutación no afectó la unión de T22, no permitió truncamientos activas adicionales en L3.

E. Especificidad de Ligandos de ARN por hKGF

Se evaluó la especificidad del ligando K14F determinando su K_{D} frente a hKGF de rata, y los factores de crecimiento humanos que se unen a heparina, aFGF, bFGF y PDGF (Tabla 18). Los resultados sugieren que el K14F se une a todas las dianas evaluadas como el ARN aleatorio, excepto a hKGF, y puede discriminar entre el hKGF y otras proteínas similares en un factor de 400-40.000.

Se evaluó la especificidad del ligando 14F3'T determinando su K_{d} frente a diversas proteínas de unión a heparina. Los resultados resumidos en la Tabla 22 muestran que el ligando 14F3T puede discriminar entre KGF y el resto de proteínas de unión a heparina evaluadas en un factor de 1,2x10^{4}-3x10^{10}. El ligando 14F3'T se une sólo a KGF con elevada afinidad mientras que se une al resto de proteínas de unión a heparina evaluadas como el ARN aleatorio. La unión de 14F3'T al KGF de rata, que es idéntico al KGF humano en un 91%, tiene una afinidad aproximadamente 5-10 veces menor. Se observó una especificidad similar durante la inhibición de la síntesis de ADN inducida por KGF de células Balb/MK. El ligando 14F3'T inhibe la síntesis de ADN inducida por KGF de rata con una K_{1} de 1,8 nM, que es 20-50 veces superior a la K_{1} observada con el KGF humano. El ligando 14F3'T inhibe la síntesis de ADN de las células Balb/MK sólo si es el resultado de la estimación de KGF pero no de la de EGF (datos no mostrados).

Ejemplo 18 Inhibición de la unión de hKGF a receptores de superficie celular A. Ensayo de Unión a Receptor

Para evaluar la capacidad de los ligandos de hKGF para inhibir de forma competitiva la unión de hKGF a su receptor de superficie celular, se utilizaron dos líneas celulares. La primera línea celular, PC-3, es un aislado de un adenocarcinoma prostático de grado IV (ATCC CRL 1435). La segunda línea celular se denomina NIH3T3/FGFR-2 y es una línea celular NIH/3T3 recombinante que lleva el receptor de hKGF humano a aproximadamente 0,5-1x10^{6} sitios de unión de KGF de elevada afinidad por célula (Miki et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 246-250).

Las células PC-3 se depositaron en placas de 24 pocillos a aproximadamente 10^{5} células por pocillo. Después del crecimiento durante 48-36 horas, se les retiró a las células el suero durante 24 horas, se lavaron dos veces con 500 \mul de DPBS frío, y a continuación se incubaron con 500 \mul de tampón de unión (BB1; DPBS, MgCl_{2} 0,5 mM, BSA al 0,2%, azida sódica al 0,02%) que contenía diferentes concentraciones de KGF marcado con ^{125}I que variaban entre 0 y 0,8 nM. Después de una incubación de 3-3,5 horas a 4ºC, las mezclas de unión se aspiraron y las células bien adheridas a los pocillos se lavaron dos veces con 1 ml de BB1 y una vez con 1 ml de BB1 complementado con NaCl 0,5M. El resto del hKGF marcado unido se solubilizó en 600 \mul de SDS al 0,5%/NaOH 0,1M y se contó en un contador gama (Beckmannn). La unión no específica se determinó en presencia de un exceso molar de 100 veces de hKGF no marcado. Para los ensayos de competición, el hKGF marcado se mantuvo constante a 0,3 nM, y se incluyeron concentraciones variantes de moléculas competidoras en las reacciones de unión que variaban entre 0-1.000 nM. Las curvas de unión se ajustaron a la ecuación:

[Trazador de Unión]=([Trazador Total]*[Receptor])/(K_{D}+[Trazador Total])

donde [Trazador Total] y [Trazador Unido] eran fijas y la K_{D} y [Receptor] se determinaron mediante análisis por regresión utilizando el programa informático Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA).

Las células NIH3T3/KGFR-2 se depositaron en placas de 24 pocillos a aproximadamente 10^{5} células por pocillo. Después del crecimiento durante toda la noche, se les retiró a las células durante 1-5 horas, se lavaron dos veces con 500 \mul de tampón de unión (BB2: medio de crecimiento MEM libre de suero, BSA al 0,1%, HEPES 0,25 mM, pH 7,4), y a continuación se incubaron con 250 \mul de BB2 que contenía 1 \mug/ml de heparina (de pulmón de bovino, SIGMA, St. Louis, MO), hKGF marcado con ^{125}I a 0,03 nM, y concentraciones variables de moléculas competidoras (300 nM-OnM). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las mezclas de unión se aspiraron, y los pocillos se lavaron dos veces con 250 \mul de DPBS frío y una vez con 250 \mul de DPBS frío complementado con NaCl 0,5M. El hKGF marcado unido se solubilizó en 500 \mul de SDS al 0,5% y se contó en un contador de centelleo (Beckmann).

Las constantes de inhibición (Ki) de los ligandos de ARN se determinaron mediante un análisis por regresión no lineal de los datos.

En búsqueda de receptores de KGF en la superficie de las células PC-3, se utilizaron diferentes concentraciones de ^{125}I-hKGF, que variaban entre 0,002 y 0,8 nM, en presencia y ausencia de un exceso molar de 100 veces de hKGF no marcado, y se observó la unión de saturación del trazador en la superficie de las células PC-3. La Figura 10 muestra la representación de la concentración de trazador unido en función de la concentración total de trazador así como el análisis de Scatchard de los mismos datos. El análisis de los datos sugiere que hay aproximadamente 5.000 sitios de unión de hKGF específicos por célula con una K_{D} de 100-200 pM. Esta K_{D} concuerda con la K_{D} descrita para hKGF de 200 pM (Miki et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89: 246-250).

Se descubrió que los extractos de membrana plasmática de PC-3 alteraban la movilidad electroforética (desplazamiento en gel) del hKGF marcado radioactivamente en electroforesis en gel nativo (Figura 11). Para los geles de desplazamiento de movilidad electroforética, aproximadamente 3x10^{7} células PC-3 se centrifugaron suavemente y se lavaron con PBS y a continuación se lisaron mezclando un volumen igual de tampón de lisis que contenía Hepes 40 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, glicerol al 20%, triton X-100 al 2%, azida sódica al 0,1%, MgCl_{2} 3 mM, EGTA 3 mM, aprotinina 2 \muM, leupeptina 2 \muM, PMSF 2 mM, y ortovanadato sódico 400 \muM. Después de 15 minutos de incubación en hielo, el extracto se centrifugó a 11.000 g a 4ºC durante 30 minutos para eliminar restos y núcleos y el sobrenadante se alicuotó y se almacenó a -70ºC. Para el análisis en los geles, se pusieron 25 \mul de reacciones de unión en DPBS, HSA al 0,01%, MgCl_{2} 2 mM, que contenía 3 \mul de un extracto de membrana de PC-3 diluido 10 veces en HSA al 0,01%, y concentraciones variables de hKGF marcado con ^{125}I. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió tinte de carga 6X para alcanzar la concentración IX, y las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida de TBE nativo al 5% o al 10%. El gel se corrió previamente a temperatura ambiente a 100 Voltios. Después de la carga, el gel se corrió a 200 Voltios durante 5 minutos y a continuación a 100 Voltios durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. A continuación se visualizaron las bandas radioactivas mediante autorradiografía. El desplazamiento en el gel del hKGF no se observó en presencia del exceso molar de 100 veces del hKGF no marcado (Figura 11), demostrando una interacción específica entre un componente encontrado en los extractos de membrana de PC-3
y hKGF. La KD estimada a partir de los experimentos de desplazamiento en gel es de aproximadamente 8 nM.

De acuerdo con los experimentos de competición descritos en la literatura (Miki et al. Proc Natl Acad Sci USA 89: 246-250), se obtuvieron las curvas de competición de desplazamiento en gel utilizando bFGF y hKGF no marcado así como una proteína básica pequeña no relacionada, en este caso lisozima. La Tabla 21 muestra los valores de IC50 obtenidos en este experimento. De acuerdo con trabajos anteriores, los datos mostrados en la Tabla 21 muestran que el bFGF compite aproximadamente 20 veces peor que el hKGF por la unión al receptor de hKGF presente en los extractos de membrana plasmática de PC-3. La interacción observada mediante el desplazamiento en gel es una interacción específica para FGF y no es debida a una interacción carga-carga, como la lisozima, otra molécula pequeña cargada positivamente, que compite por el complejo extracto de membrana de PC-3:hKGF con aproximadamente 100 veces peor afinidad que el hKGF solo.

En la Tabla 19 se muestran los valores de IC50 para varios ligandos de ARN obtenidos con el ensayo de PC-3. Se evaluó un subconjunto de estos ligandos en las NIH3T3/FGFR-2. Se determinaron las constantes de inhibición competitivas (Ki) a partir de curvas de competición completas y éstas se resumen en la Tabla 20. En la determinación de los valores de Ki, se asumió que las células 3T3 tienen 500.000 sitios de unión por célula y las células PC-3 tienen 5.000 sitios de unión por célula.

Los datos muestran que diversos ligandos de hKGF pueden inhibir de forma competitiva la unión de hKGF a sus receptores de la superficie celular. Algunos de estos ligandos, como el K14F, tienen actividades competitivas eficaces con Ki en el rango bajo de nM.

Este trabajo no sólo demuestra que se obtuvieron competidores de ácidos nucleicos de hKGF, sino que también identifica un nuevo ensayo para explorar competidores de hKGF, incluyendo moléculas pequeñas, anticuerpos y péptidos. Este nuevo ensayo incluye el uso de la línea celular de carcinoma de próstata PC-3.

Las dos líneas celulares, PC3 y NIH3T3/FGFR-2, producen resultados ligeramente diferentes (véase la Tabla 20). La unión de KGF a células PC-3 es más sensible a la inhibición por diferentes ligandos y por heparina. Sin embargo, el ARN aleatorio no compite de forma efectiva por la unión de KGF en las células PC-3. La unión de KGF a NIH3T3/FGFR-2 es resistente a la inhibición por algunos ligandos de ARN y heparina. Esto es debido a que el ensayo de NIH3T3/KGFR es más restrictivo ya que se realiza en presencia de 1 \mug/ml de heparina. La curva de competición de oligonucleótidos aleatorios con las NIH3T3/FGFR-2 es completamente plana con K_{i} > 10^{-4} M. Los ligandos 6F y 14F muestran la mejor actividad inhibidora con valores de K_{i} de 100-200 pM y 2-8 nM en los ensayos de PC-3 y NIH3T3/FGFR-2, respectivamente. Sólo dos ligandos 2'NH_{2}, 14N y 29N, mostraban una buena actividad con las células PC-3 (valor de K_{i} de 1,4 nM). De estos dos ligandos, sólo el 14N conserva su actividad inhibidora en el ensayo NIH3T3/FGFR-2, presentando un valor de K_{i} de 100 nM. La inhibición observada de la actividad mitogénica de KGF por estos ligandos no es debida a un efecto no específico en la capacidad proliferativa de las líneas celulares debido a que estos ligandos no tienen actividad antiproliferativa en células inducidas por EGF en lugar de KGF (datos no mostrados).

Este trabajo no sólo demuestra que se obtuvieron competidores de ácidos nucleicos para hKGF, sino que también identifica un nuevo ensayo para explorar competidores de hKGF, incluyendo moléculas pequeñas, anticuerpos y péptidos. Este nuevo ensayo incluye el uso de la línea celular de carcinoma de próstata, PC-3.

Ejemplo 19 Inhibición de la actividad mitogénica de KGF

Uno de los efectos biológicos del KGF es la estimulación de la proliferación de células epiteliales (Rubin et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 802-806). Este efecto proliferativo de KGF se puede medir mediante la estimulación de la incorporación de ^{3}H-timidina en células que responden después de exposición a KGF. Anteriormente se han descrito tres de estas líneas celulares (Rubin et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 802-806). Dos líneas celulares se utilizaron para evaluar la actividad anti-mitogénica de varios ligandos. Una es 4MBr-5 (ATCC #CCL208), una línea celular de epitelio de mono de pocos pases (Caputo et al. (1979) In Vitro 15: 222-223) mientras que la segunda es Balb/MK, una línea celular de queratinocitos de rata transformada (Weissman y Aaronson (1983) Cell 32: 599-606). Las células 4-MBr5 crecidas en F12K que contenía 30 ng/ml, hEFG, y FCS al 10%, se tripsinizaron y volvieron a suspender en M199 que contenía HEPES 10 mM, pH 7,4, y FCS al 10% a 1,4x10^{5} células/ml. Se sembró una placa de microvaloración de 96 pocillos con 100 \mul de suspensión de células y se añadió KGF a 10 ng/ml (0,5 nM), así como ligando K14F a varias concentraciones que variaban entre 0-1000 nM. Cada reacción de incubación se llevó a cabo como mínimo por triplicado. Después de 24 horas de incubación a 37ºC, se añadió ^{3}H-timidina a 1 \muCi/pocillo junto con timidina no marcada a 10 nM. Las células se incubaron durante 24 horas más, se aspiró el sobrenadante y las células restantes se recuperaron por lisis en 20 \mul de NaOH 0,2 N. El grado de incorporación de ^{3}H-timidina se determinó mediante precipitación con TCA y filtración a través de discos de filtro de GFC (Whattman, Hillsboro, OR).

Las células Balb/MK crecidas en Low Ca^{++} EMEM con FCS al 10% (dializado e inactivado por calor) y 5 ng/ml de rhEGF se tripsinizaron y resuspendieron en Low Ca^{++} EMEM con FCS al 1% (dializado e inactivado por calor) y 0,5 ng/ml de rhEGF y se sembraron en placas de cultivo recubiertas de fibronectina de 96 pocillos a 4-6x10^{4} células por pocillo en un volumen total de 100 \mul. Después del crecimiento durante toda la noche, el medio se reemplazó por Low Ca^{++} EMEM sin FCS o rhEGF y se les retiró el suero durante aproximadamente 30 horas. A continuación se añadió KGF o EGF recombinante humano a 16 y 49 pM respectivamente, junto con varias concentraciones de competidores entre 0-1000 nM. Después de incubar durante toda la noche, se añadió ^{3}H-timidina a 0,2 \muCi/pocillo y la incubación continuó durante 7-8 horas más. Se determinó el grado de incorporación de la ^{3}H-timidina mediante precipitación con TCA y filtración a través de discos de filtros de GFC.

Se determinaron las constantes de inhibición (K_{i}) de los ligandos de oligonucleótidos mediante un análisis de regresión no lineal de los datos descritos anteriormente (Gill et al. (1991) J. Mol. Biol. 220: 307-324).

Los dos ensayos dan resultados ligeramente diferentes. El ensayo con 4MBr-5 se realizó en presencia de suero fetal de ternera, mientras que el Balb/MK se realizó en ausencia de suero. En ensayo con Balb/MK es más sensible y es un ensayo prototípico para la actividad mitogénica inducida por KGF. De forma similar a los resultados obtenidos con las células PC-3, el ensayo con 4MBr-5 mostró una buena actividad para el ligando 14F (valor de K_{i} de 9,8 nM pero inhibición incompleta). En el mismo ensayo, los oligonucleótidos aleatorios presentaban valores de K_{i} de >1 \muM, mientras que un anticuerpo neutralizante monoclonal presentaba un valor de K_{i} de 2,9 nM. Parece que el ligando 14F es tan bueno o incluso mejor que el anticuerpo neutralizante monoclonal. Las curvas de competición para el anticuerpo monoclonal neutralizante y el ligando 14F se allanaban a aproximadamente 20-40%, sugiriendo que estos antagonistas no abolían completamente la actividad mitogénica de KGF. A diferencia del anticuerpo monoclonal, el ligando 14F bloquea completamente la actividad mitogénica de KGF en las células 4MBr-5. En el ensayo con Balb/MK, 14N presentaba valores de K_{i} de aproximadamente 10 nM (inhibición incompleta) mientras que el oligonucleótido aleatorio presentaba valores de K_{i} de aproximadamente 300 nM. Los valores de K_{i} para 6F y 14F son 830 y 92 pM, respectivamente: De forma similar al ensayo con 4MBr-5, el ligando 14F es tan bueno, si no mejor, que el anticuerpo neutralizante monoclonal, que presenta un valor de K_{i} de 980 pM. La mejor actividad inhibidora se observó con 14F3'T con un valor de K_{i} de 34 pM.

Ejemplo 20

Los ligandos de ácidos nucleicos que se unen al factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) se han modificado mediante el método SELEX tal como se ha descrito en la patente estadounidense Nº 5.459.015 (véanse también la patente estadounidense Nº 5.270.163 y Tuerk y Gold (1990) Science 249: 505-510). Se examinó un ligando de ácido nucleico modificado 2'NH_{2} denominado 21A y que tenía la secuencia 5'-GGGAGACAAGAAUAACGCUCAAGUA
GACUAAUGUGUGGAAGACAGCGGGUGGWCGACAGGAGGCUCACAACAGGC (SEC ID NO: 265) mediante análisis por supresión para determinar la información de secuencia mínima requerida para una unión de elevada afinidad a bFGF. Este análisis llevó al ligando truncado 21A-t (GGUGUGUGGAAGACAGCGGGUGGuuc (SEC ID NO: 266) donde las G subrayadas son guaninas añadidas para mejorar la eficacia de la transcripción y las letras minúsculas son de la región constante.

Para aumentar la estabilidad del ligando 21A-t frente a la degradación por nucleasas, se añadieron terminaciones cortas de fosforotioato en los extremos 5' y 3'. Además, se identificaron nueve posiciones de ribopurina que se podían sustituir con 2'-desoxi-2'-O-metilpurinas sin una pérdida en la afinidad de unión por bFGF, utilizando el método descrito en Green et al. Chem.Biol. 2: 683-695, y teniendo como resultado el ligando denominado NX-286 (5'-TsTsTsTs mGmGaU rGaUrG aUrGrG mArArG mAaCrA rGaCmG mGmGaU mGmGaU aUaC TsTsTsTsTs-3' (SEC ID NO: 267), donde s representa una unión internucleósidos de fosforotioato, aU y aC son residuos de 2'-desoxi-2'-aminouridina y 2'-desoxi-2'-aminocitidina, respectivamente, mA y mG son residuos de 2'-desoxi-2'-O-metiladenosina y guanosina, respectivamente, rA y rG son residuos de adenosina y guanosina y T es 2'-desoxitimidina). El ligando de ácido nucleico modificado tenía una K_{d} de 0,4 nM medida mediante el ensayo del desplazamiento en la movilidad electroforética.

TABLA 1 Secuencias de Ácido Nucleico utilizados en los ensayos SELEX descritos en los Ejemplos 1-4

2

TABLA 1 (continuación)

3

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TABLA 2 Experimentos SELEX con los ARN descritos en los Ejemplos 1-4: plantilla, nucleótidos de pirimidina y ronda clonada

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300

4

5

6

TABLA 4 Constantes de disociación e inhibición

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7

TABLA 5 Oligonucleótidos de ADN utilizados en los Ejemplos 5 y 6'

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8

9

10

TABLA 7

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11

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12

13

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}

14

TABLA 10

15

TABLA 11 Afinidades de los ligandos de ADN mínimos para PDGF AA, PDGF AB y PDGF BB

16

TABLA 12 Cebadores de inicio de ARN y PCR para el experimento SELEX de ARN con 2'-fluoropirimidina

400

TABLA 13 Secuencias de los ligandos de alta afinidad de ARN con 2'-fluoropirimidina para PDGF AB

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17

TABLA 14

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500

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TABLA 15

18

TABLA 15 (continuación)

19

20

21

22

TABLA 17 Valores de Kd para ligandos hKGF

23

TABLA 17 (continuación)

24

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TABLA 18

25

Las proporciones son la media de al menos dos determinaciones.

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TABLA 19 Valores de IC_{50} a partir del ensayo PC-3

26

TABLA 20 Valores de Ki de competidores de hKGF en el ensayo de competición NIH3T3/FGFR-2

27

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TABLA 21 Valores de IC_{50} obtenidos con ensayo de desplazamiento en gel

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TABLA 22 Especificidad de unión del ligando K14F3'T

29

30

31

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Larry Gold; Nejbosa Janjic; Steven Ringquist; Nikos Pagratis; Penelope J. Toothman.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Ligandos oligonucleotídicos de elevada afinidad para el factor de crecimiento transformante \beta (TGF \beta), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento de querotinocitos humanos (hKGF)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 304

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Swanson & Bratschun, L. L. C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 8400 E. Prentice Avenue, Suite 200.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Englewood

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Colorado

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 80111

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE PARA ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

MEDIO: Diskette, 3,5 pulgadas, 1,44 Mb de almacenamiento

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: WordPerfect 6.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/458.423

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 de Junio de 1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/458.424

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 de Junio de 1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/465.594

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 05 de Junio de 1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/465.591

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 05 de Junio de 1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/479.725

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07 de Junio de 1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/479.783

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07 de Junio de 1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/618.693

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 de Marzo de 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN AGENTE/ABOGADO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Barry J. Swanson

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.215

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CASO/EXPEDIENTE:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (303) 793-3333

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (303) 793-3433

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 1

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 2

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 3

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 4

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 5

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 6

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG GGAGTCTGCG GATCC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG GGAGAACGCG GATCC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACCCTCAC TAAAGGGAGA TCTAGAGCGA AGCTT

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTAGGTG ACACTATAGA ATATGCATCA CTAGTAAGCT TTGCTCTAGA

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCCGGA GCTCCCTATA GTGAGTCGTA TTA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 125 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2'con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 12

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 125 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 13

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 125 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2'con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 14

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con amino (2'-NH_{2})

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 15

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 16

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con amino (2'-NH_{2})

\vskip0.500000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 17

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 123 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con amino (2'-NH_{2})

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 18

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 115 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con amino (2'-NH_{2})

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 19

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 20

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 98 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 21

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 22

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas los Us son 2'-F uracilo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las citosinas son 2'-NH_{2} citosinas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 23

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los Us son 2'-F uracilo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las citosinas son 2'-NH_{2} citosinas

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 24

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)OTRA

INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCUUCCGAGU AGACAGGAGG GAGGGGUGGA UGUGGCGUCU AC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CUUCCGAGUA GACAGGAGGG AGGGGUGGAU GUGGCGUCUA CUC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2'con amino (2'-NH_{2})

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 27

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con amino (2'-NH_{2})

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 28

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 29

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 30

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con amino (2'-NH_{2})

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 31

\vskip1.000000\baselineskip

540

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 32

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 33

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 34

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las C's son 2'F-uracilo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los U's son 2'NH_{2}-citosina

\vskip0.500000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 35

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 36

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 81 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las C's son 2'F-uracilo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los U's son 2'NH_{2} citosina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 36

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 37

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las C's son 2'F-uracilo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los U's son 2'NH_{2} citosina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 37

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 38

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 115 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las C's son 2'F-uracilo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los U's son 2'NH_{2} citosina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 38

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 39

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 39

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 40

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas están modificadas en 2' con Flúor (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 40

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 41

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 41

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 42

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 119 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 42

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 43

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 44

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG AGGACGATGC GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 45

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGGGCGAGT CGTCTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 46

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 46

\vskip1.000000\baselineskip

541

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 47

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA TGCGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 48

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en posición

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNTCGGGCG AGTCGTCTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 49

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 49

\vskip1.000000\baselineskip

542

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 50

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG AGACAAGAAT AAACGCTCAA

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 51

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTGTTGTG AGCCTCCTGT CGAA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 52

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 52

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 53

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGACAAG AATAAACGCT CAA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 54

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 1-3 es biotina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNGCCTGTT GTGAGCCTCC TGTCGAA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 55

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 55

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 56

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 56

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 57

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 57

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 58

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 58

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 59

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 59

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 60

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 60

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 61

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 61

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 62

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 62

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 63

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 63

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 64

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 64

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 65

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 65

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 66

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 66

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 67

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 67

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 68

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 68

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 69

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 69

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 70

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 70

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 71

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 71

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 72

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 72

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 73

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 73

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 74

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 74

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 75

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 75

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 76

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 76

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 77

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 77

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 78

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 78

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 79

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 79

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 80

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 80

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 81

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 81

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 82

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 82

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 83

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 83

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 84

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 84

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 85

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 85

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 86

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 86

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 87

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 87

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 88

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 88

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 89

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 89

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 90

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 90

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 91

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA CARACTERÍSTICA: N en posiciones 1 a 3 es biotina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNCCCCTGC AGGTGATTTT GCTCAAGT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 92

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAAGCTTA ATACGACTCA CTATAGGGAT CCGCCTGATT AGCGATACT

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 93

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 93

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 94

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 94

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 95

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 95

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 96

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 96

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 97

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 97

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 98

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 98

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 99

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 99

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 100

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 100

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 101

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 101

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 102

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 102

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 103

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 103

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 104

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 104

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 105

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 105

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 106

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 106

\vskip1.000000\baselineskip

117

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 107

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 107

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 108

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 108

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 109

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 109

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 110

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 110

\vskip1.000000\baselineskip

121

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 111

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 111

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 112

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 112

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 113

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 113

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 114

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 114

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 115

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 115

\vskip1.000000\baselineskip

126

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 116

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 116

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 117

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 117

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 118

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 118

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 119

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 119

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 120

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 120

\vskip1.000000\baselineskip

131

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 121

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 121

\vskip1.000000\baselineskip

132

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 122

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 122

\vskip1.000000\baselineskip

133

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 123

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 123

\vskip1.000000\baselineskip

134

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 124

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 124

\vskip1.000000\baselineskip

135

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 125

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 125

\vskip1.000000\baselineskip

136

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 126

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG AGACAAGAAT AACGCTCAA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 127

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTGTTGTG AGCCTCCTGT CGAA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 128

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 128

\vskip1.000000\baselineskip

137

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 129

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 129

\vskip1.000000\baselineskip

138

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 130

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 130

\vskip1.000000\baselineskip

139

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 131

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 131

\vskip1.000000\baselineskip

140

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 132

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 132

\vskip1.000000\baselineskip

141

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 133

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 133

\vskip1.000000\baselineskip

142

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 134

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 134

\vskip1.000000\baselineskip

143

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 135

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 135

\vskip1.000000\baselineskip

144

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 136

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 136

\vskip1.000000\baselineskip

145

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 137

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 137

\vskip1.000000\baselineskip

146

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 138

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 138

\vskip1.000000\baselineskip

147

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 139

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 139

\vskip1.000000\baselineskip

148

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 140

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 140

\vskip1.000000\baselineskip

149

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 141

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 141

\vskip1.000000\baselineskip

150

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 142

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 142

\vskip1.000000\baselineskip

151

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 143

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 143

\vskip1.000000\baselineskip

152

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 144

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 144

\vskip1.000000\baselineskip

153

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 145

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 145

\vskip1.000000\baselineskip

154

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 146

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 146

\vskip1.000000\baselineskip

155

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 147

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 147

\vskip1.000000\baselineskip

156

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 148

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 148

\vskip1.000000\baselineskip

157

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 149

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 149

\vskip1.000000\baselineskip

158

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 150

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 150

\vskip1.000000\baselineskip

159

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 151

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 151

\vskip1.000000\baselineskip

160

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 152

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 152

\vskip1.000000\baselineskip

161

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 153

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 153

\vskip1.000000\baselineskip

162

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 154

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 98 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 154

\vskip1.000000\baselineskip

163

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 155

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 155

\vskip1.000000\baselineskip

164

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 156

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 156

\vskip1.000000\baselineskip

165

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 157

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 157

\vskip1.000000\baselineskip

166

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 158

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 158

\vskip1.000000\baselineskip

167

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 159

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 159

\vskip1.000000\baselineskip

168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 160

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 160

\vskip1.000000\baselineskip

169

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 161

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 161

\vskip1.000000\baselineskip

170

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 162

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 162

\vskip1.000000\baselineskip

171

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 163

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 163

\vskip1.000000\baselineskip

172

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 164

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 164

\vskip1.000000\baselineskip

173

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 165

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 165

\vskip1.000000\baselineskip

174

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 166

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 166

\vskip1.000000\baselineskip

175

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 167

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 167

\vskip1.000000\baselineskip

176

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 168

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 168

\vskip1.000000\baselineskip

177

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 169

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 169

\vskip1.000000\baselineskip

178

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 170

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-F

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 170

\vskip1.000000\baselineskip

179

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 171

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADM

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 1 y 23 par de bases entre sí y puede ser 1-4 pares de bases de longitud.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 5 y 10 está en cualquier par de bases

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 6 y 9 está en cualquier par de bases

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 7 y 8 está en cualquier par de bases

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NGGCNNNNNN GRKYAYYRRT CCN

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 172

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 38 está en una posición T invertida (3'-3' enlazada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCGT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 173

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 40 está en una posición T invertida (3'-3' enlazada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAGGCTAC GGCACGTAGA GCATCACCAT GATCCTGTGT

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 174

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 45 está en una posición T invertida (3'-3' enlazada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACTCAGGGC ACTGCAAGCA ATTGTGGTCC CAATGGGCTG AGTAT

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 175

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: C en las posiciones 8, 11, 25 y 26 es 2'O-metil-2'-deoxicitadina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: G en las posiciones 9, 10, 17, 19 y 35 es 2'-O-metil-2'-deoxiguanosina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: A en las posiciones 12, 24 y 27 es 2'-O-metil-2'-deoxiadenosina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: U en la posición 34 es 2'-0-metil-2'-deoxiuridina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: U en las posiciones 6 y 22 es 2'-fluoro-2'-deoxiuridina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: C en las posiciones 23, 32 y 33 es 2'-fluoro-2'deoxicitidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 36 está en una posición T invertida (3'-3' enlazada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGCUACGG CACGTAGAGC AUCACCATGA TCCUGT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 176

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: C en la posición 8 es 2'O-metil-2'-deoxicitadina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: G en las posiciones 9, 17 y 31 es 2'-O-metil-2'-deoxiguanosina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: A en la posición 22 es 2'-O-metil-2'-deoxiadenina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: U en la posición 30 es 2'-0-metil-2'-deoxiuridina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: U en las posiciones 6 y 20 es 2'-fluoro-2'-deoxiuridina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: C en las posiciones 21, 28 y 29 es 2'-fluoro-2'deoxicitidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 10 y 23 es separador de fosforamidita pentaetileno glicol.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 32 está en una posición T invertida (3'-3' enlazada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGCUACGN CGTAGAGCAU CANTGATCCU GT

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 177

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Nucleótido 39 está en una posición T invertida (3'-3' enlazada)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTCCGTGG TAGGGCAGGT TGGGGTGACT TCGTGGAAT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 178

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en las posiciones 13, 14, 16 y 17 es sustituida con IdU

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 179

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en la posición 20 es sustituida con IdU

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 180

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en la posición 23 es sustituida con IdU

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 181

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en la posición 24 es sustituida con IdU

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 182

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en la posición 27 es sustituida con IdU

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 183

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en las posiciones 28 y 30 es sustituida con IdU

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 184

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en la posición 33 es sustituida con IdU

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAGGGCG CGTTCTTCGT GGTTACTTTT AGTCCCG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 185

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: Péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Xaa en la posición 5 es un aminoácido modificado que no pudo Identificarse.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 185

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Pro Ile Xaa Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 186

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 186

\vskip1.000000\baselineskip

180

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 187

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG AGGACGATGC GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 188

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGGGCGAGT CGTCTG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 189

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 189

\vskip1.000000\baselineskip

181

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 190

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 190

\vskip1.000000\baselineskip

182

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 191

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 191

\vskip1.000000\baselineskip

183

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 192

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 192

\vskip1.000000\baselineskip

184

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 193

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 193

\vskip1.000000\baselineskip

185

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 194

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 194

\vskip1.000000\baselineskip

186

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 195

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 195

\vskip1.000000\baselineskip

187

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 196

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 196

\vskip1.000000\baselineskip

188

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 197

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGAUGGA GCUGAAAUCA GACGACUCGC CCGA

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 198

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 198

\vskip1.000000\baselineskip

189

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 199

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 199

\vskip1.000000\baselineskip

190

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 200

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGAUGGA GCUGAAAUCA GACGACUCGC CCGA

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 201

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 201

\vskip1.000000\baselineskip

191

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 202

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 202

\vskip1.000000\baselineskip

192

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 203

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 203

\vskip1.000000\baselineskip

193

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 204

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 204

\vskip1.000000\baselineskip

194

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 205

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 205

\vskip1.000000\baselineskip

195

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 206

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGAUGGA GCUGAAAUCA GACGACUCGC CCGA

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 207

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 207

\vskip1.000000\baselineskip

196

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 208

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 208

\vskip1.000000\baselineskip

197

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 209

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 209

\vskip1.000000\baselineskip

198

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 210

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 210

\vskip1.000000\baselineskip

199

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 211

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 211

\vskip1.000000\baselineskip

200

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 212

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 212

\vskip1.000000\baselineskip

201

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 213

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 213

\vskip1.000000\baselineskip

202

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 214

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 214

\vskip1.000000\baselineskip

203

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 215

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 215

\vskip1.000000\baselineskip

204

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 216

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 216

\vskip1.000000\baselineskip

205

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 217

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 217

\vskip1.000000\baselineskip

206

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 218

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 218

\vskip1.000000\baselineskip

207

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 219

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 219

\vskip1.000000\baselineskip

208

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 220

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 220

\vskip1.000000\baselineskip

209

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 221

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 221

\vskip1.000000\baselineskip

210

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 222

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 222

\vskip1.000000\baselineskip

211

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 223

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 223

\vskip1.000000\baselineskip

212

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 224

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 224

\vskip1.000000\baselineskip

213

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 225

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 225

\vskip1.000000\baselineskip

214

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 226

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 226

\vskip1.000000\baselineskip

215

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 227

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 227

\vskip1.000000\baselineskip

216

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 228

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 228

\vskip1.000000\baselineskip

217

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 229

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'- fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 229

\vskip1.000000\baselineskip

218

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 230

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 230

\vskip1.000000\baselineskip

219

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 231

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 231

\vskip1.000000\baselineskip

220

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 232

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 232

\vskip1.000000\baselineskip

221

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 233

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 233

\vskip1.000000\baselineskip

222

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 234

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 234

\vskip1.000000\baselineskip

223

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 235

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 235

\vskip1.000000\baselineskip

224

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 236

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 236

\vskip1.000000\baselineskip

225

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 237

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 237

\vskip1.000000\baselineskip

226

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 238

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 68 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 238

\vskip1.000000\baselineskip

227

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 239

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 239

\vskip1.000000\baselineskip

228

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 240

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 240

\vskip1.000000\baselineskip

229

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 241

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 241

\vskip1.000000\baselineskip

230

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 242

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 242

\vskip1.000000\baselineskip

231

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 243

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 243

\vskip1.000000\baselineskip

232

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 244

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 244

\vskip1.000000\baselineskip

233

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 245

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 245

\vskip1.000000\baselineskip

234

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 246

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 246

\vskip1.000000\baselineskip

235

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 247

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 247

\vskip1.000000\baselineskip

236

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 248

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 248

\vskip1.000000\baselineskip

237

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 249

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 249

\vskip1.000000\baselineskip

238

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 250

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 250

\vskip1.000000\baselineskip

239

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 251

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 251

\vskip1.000000\baselineskip

240

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 252

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 252

\vskip1.000000\baselineskip

600

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 253

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 253

\vskip1.000000\baselineskip

241

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 254

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 69 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 254

\vskip1.000000\baselineskip

242

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 255

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 255

\vskip1.000000\baselineskip

243

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 256

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 256

\vskip1.000000\baselineskip

244

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 257

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 257

\vskip1.000000\baselineskip

245

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 258

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 258

\vskip1.000000\baselineskip

246

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 259

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 259

\vskip1.000000\baselineskip

247

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 260

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 260

\vskip1.000000\baselineskip

248

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 261

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 261

\vskip1.000000\baselineskip

249

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 262

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 262

\vskip1.000000\baselineskip

250

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 263

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAANYAANR CRR

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 264

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAANYTGA

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 265

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 76 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los C's son 2'-NH_{2} 2 citosina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los U's son 2'-NH_{2} 2 uracil

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 265

\vskip1.000000\baselineskip

251

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 266

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los C's son 2'-NH_{2} 2 citosina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los U's son 2'-NH_{2} 2 uracil

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGUGUGUGGA AGACAGCGGG UGGUUC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 267

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todos los U's y C's son residuos de 2'-deoxi-2'-aminouridina y 2'-deoxi-2' aminocitidina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: A en las posiciones 14 y 17 es 2'-deoxi-2'-O-metilguanosina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: G en las posiciones 5, 6, 22, 23, 24, 26 y 27 es 2'-deoxi-2'-O-metilguanosina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: T en las posiciones 1-4 y 31-35 es 2'-deoxitimidina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 267

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTGGUGUG UGGAAGACAG CGGGUGGUUC TTTTT

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 268

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGSGSG GUYUCYYRRY UYYYSYS

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 269

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RGGRRGRAYY RSBRSYYYYY BSYBSY

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 270

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAAGGAAY AARCRRGACC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 271

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-NH_{2}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAYGAYGA Y

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 272

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 272

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU AAACUUUCUC CAUCGUAUC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 273

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU AAACUUUCUC CAUCGUA

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 274

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACUG CGGUGGUCUC CCAAUUCUAA ACUUUCUCCA UCGUA

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 275

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCCUAAAC UUUCUCCAUC GUAUC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 276

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 276

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU AUUCUCCAUC GUAUC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 277

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU AAACUCCAUC GUAUC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 278

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUAA CUCCAUCGUA UC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 279

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 279

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGACGAUG CGGUGGUCUC CCAAUUCUAA ACUUUCUCCA UCGUAUC

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 280

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 280

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUUU CUCCAUCGUA UC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 281

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU ACCAUCGUAU C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 282

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 282

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGGACGAU GCGGUGGUCU CCCAAUUCUA UUCUCCAUCG UAUC

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 283

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGGACGAU GCGGUGGUCU CCAAUUCUAU UCUCCAUCGU AUC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 284

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGACGAUG CGGUGGUCUC CCAAUUCUAU UCUCCAUCGU AUC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 285

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGACGAUG CGGUGGUCUC AAUUCUAUUC UCCAUCGUAU C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 286

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGCGAU GCGGUGGUCU CCCAAUUCUA UUCUCCAUCG UAUC

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 287

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU AUCUCCAUCG UAUC

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 288

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 288

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU ACUCCAUCGU AUC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 289

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU AUCCAUCGUA UC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 290

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU UUCUCCAUCG UAUC

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 291

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 291

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU UCUCCAUCGU AUC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 292

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 292

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGACGAUG CGGUGGCCCC AAUUCUAUUC UCCAUCGUAU C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 293

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 293

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGACGAUGC GGUGGCCCAA UUCUAUUCUC CAUCGUAUC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 294

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 294

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGAUGCGG UGGCCCAAUU CUAUUCUCCA UCGUAUC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 295

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 295

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACGAUGCG GUGGCCCAAU UCUAUUCUCC AUCGUAUC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 296

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 296

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAUGCGGUGG CCCAAUUCUA UUCUCCAUCG UAUC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 297

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 297

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAUGCGGUGG UCUCCCAAUU CUAUUCUCCA UCGUAUC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 298

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGUGGUCUCC CAAUUCUAUU CUCCAUCGUA UC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 299

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 299

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UG

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 300

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU CUCCAUCGUA UC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 301

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 301

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGUGUCU CCCAAUUCUU CUCAUCGUAU C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 302

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 302

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGGGUCU CCCAAUUCUU CUCCUCGUAU C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 303

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 303

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGGACGA UGCGGGUCUC CCAAUUCUUC UCUCGUAUC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 304

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO MOLECULAR: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: Todas las pirimidinas son modificadas por 2'-fluoro (2'-F)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGUACGA UGCGGUGGUC UCCCAAUUCU UCUCCAUCGU AUC

\hfill

43

Claims (33)

1. Ligando de ácido nucleico que se une específicamente al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y que comprende un motivo de estructura secundaria con una unión de tres hélices que tiene una estructura de secuencia consenso según A o B, donde A es:

\vskip1.000000\baselineskip

252

\vskip1.000000\baselineskip

en donde N-N' son cualquier par de bases, R = A o G, Y = C o T, K = G o T; y B es:

253

2. Ligando de ácido nucleico que se une específicamente al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que comprende las secuencias:

(i)

N_{1}G_{2}G_{3}C_{4}N_{5}N_{6}N_{7}

(ii)

N'_{7}N'_{6}N'_{5}G_{4}RKYA_{8}Y_{9}Y_{10}

(iii)

R_{10}R_{9}T_{8}C_{3}C_{2}N'_{1}

en donde cada uno de N_{1}-N'_{1}, N_{5}-N'_{5}, N_{6}-N'_{6} y N_{7}-N'_{7} son cualquier par de bases, R = A o G, Y = C o T, K = G o T, y G_{2}-C_{2}, G_{3}-C_{3}, C_{4}-G_{4}, A_{8}-T_{8}, Y_{9}-R_{9}, Y_{10}-R_{10} son pares de bases: o

(a)

C_{1}A_{2}G_{3}G_{4}C_{5}U_{6}A_{7}C_{8}G_{9}

(b)

C_{10}G_{11}T_{12}A_{13}G_{14}A_{15}G_{16}C_{17}A_{18}U_{19}C_{20}A_{21}

(c)

T_{22}G_{23}A_{24}T_{25}C_{26}C_{27}U_{28}G_{29}

en donde C_{1}-G_{29}, A_{2}-U_{28}, G_{3}-C_{27}, G_{4}-C_{26}, C_{5}-G_{14}, U_{6}-A_{13}, A_{7}-T_{12}, C_{8}-G_{11}, G_{9}-C_{10}, A_{18}-T_{25}, U_{19}-A_{24}, C_{20}-G_{23} y A_{21}-T_{22} son pares de bases;

en donde se forma un motivo de estructura secundaria con una unión de tres hélices mediante dicho apareamiento de bases entre las secuencias (i), (ii) y (iii) o (a), (b) y (c).

3. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia RKY es AGC.

4. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia RKY es una de GTC, GTT, GGC o GGT.

5. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó reivindicación 3, en el que la unión de tres hélices tiene la estructura de secuencia:

254

en donde PEG es un pentaetilenglicol.

6. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando tiene la secuencia de SEC ID No. 175 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con la SEC ID No. 175 superior al 70%.

7. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando tiene la secuencia de SEC ID No. 175 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con la SEC ID No. 175 superior al 80%.

8. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando tiene la secuencia de SEC ID No. 176 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con la SEC ID No. 176 superior al 70%.

9. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando tiene la secuencia de SEC ID No. 176 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con la SEC ID No. 176 superior al 80%.

10. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligando tiene la secuencia de SEC ID No. 171 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con la SEC ID No. 171 superior al 70%.

11. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ligando tiene la secuencia de SEC ID No. 171 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con la SEC ID No. 171 superior al 80%.

12. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ligando tiene una afinidad de unión por PDGF que se encuentra dentro de uno o dos órdenes de magnitud de la afinidad de unión de una de la SEC ID Nos. 175 ó 176.

13. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el ligando tiene la secuencia de una de la SEC ID Nos. 172, 173 ó 174 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con una de dichas SEC ID Nos. superior al 70%.

14. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que el ligando tiene la secuencia de uno de la SEC ID Nos. 172, 173 ó 174 o una secuencia que tiene un grado de homología de secuencia primaria con una de dichas SEC ID Nos. superior al 80%.

15. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se une específicamente a PDGF e inhibe la unión de PDGF al receptor de PDGF.

16. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un antagonista específico de PDGF-AB y/o PDGF-BB.

17. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicho ligando comprende nucleótidos modificados.

18. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 17, en el que la modificación aumenta la estabilidad in vivo del ligando o aumenta o media en la liberación del ligando y comprende una sustitución química en las posiciones del azúcar y/o fosfato y/o base.

19. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un ácido desoxirribonucleico.

20. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que es un ácido ribonucleico.

21. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es de cadena única.

22. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicho ligando se encuentra purificado y aislado.

23. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en terapia.

24. Uso de un ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se une específicamente al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por PDGF.

25. Uso según la reivindicación 24 en donde dicha enfermedad es una enfermedad proliferativa.

26. Uso según la reivindicación 25 en donde dicha enfermedad es un tumor.

27. Uso o ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 en el que dicho PDGF es el dímero PDGF-BB.

28. Uso o ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 en el que dicho PDGF es el heterodímero PDGF-AB.

29. Uso o ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 en el que dicho PDGF es el dímero PDGF-AA.

30. Uso o ligando según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29 en el que dicho receptor de PDGF es el homodímero \alpha\alpha.

31. Uso o ligando según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28 en el que dicho receptor de PDGF es el heterodímero \alpha\beta.

32. Uso del ligando según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28 en el que dicho receptor de PDGF es el homodímero \beta\beta.

33. Uso o ligando según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicho PDGF y receptor de PDGF son humanos.