ES2276531T3

ES2276531T3 - Gen ly6h.

Info

Publication number: ES2276531T3
Application number: ES99943357T
Authority: ES
Inventors: Masato Horie; Keiichi Okutomi; Yoshihiro Taniguchi; Mikio Suzuki; Yutaka Ohbuchi
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-09-17
Filing date: 1999-09-16
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2019-09-16
Also published as: DK1114861T3; US7582732B2; AU5651899A; WO2000017345A1; EP1114861B8; US20080275218A1; JP4403443B2; CN1240834C; EP1114861B1; US20100261880A1; HK1038380A1; CA2342770A1; ID29573A; CN1318099A; US7432363B2; DE69934239D1; US20040254340A1; ATE346923T1; CA2342770C; DE69934239T2

Abstract

Reivindicaciones 1. Gen que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína (a) o (b) siguiente: (a) una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 (b) una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 por deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos y que presenta actividad nemónica, en la que dicha secuencia de aminoácidos es idéntica por lo menos en un 70% a la SEC. ID. nº: 1.

Description

Gen LY6H.

Campo técnico

La invención se refiere a un gen expresado con gran especificidad a alto nivel en el cerebro, más específicamente a un gen que codifica una nueva proteína que pertenece a la familia Ly6 (compárese con la bibliografía citada a continuación) que se ha utilizado en la purificación de células madre de la sangre, a los estudios sobre la diferenciación de células de la sangre, a la activación de células inmunitarias, a la inhibición de la producción de células inmunitarias activas, al tratamiento de tumores y similares. La invención se refiere además a una nueva proteína codificada por dicho gen y a su anticuerpo específico. Además, la invención se refiere a una composición terapéutica y profiláctica para enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la técnica

Las proteínas de la familia Ly6 presentan una estructura anclada en GPI de bajo peso molecular y se han identificado como una clase de glucoproteínas de la superficie celular que forman un grupo de genes en el cromosoma 15 de ratón [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1638-1643 (1987)].

La familia Ly6 se expresa específicamente a altos niveles en las células de la médula ósea y en las células linfoides y, por consiguiente, se ha utilizado como un marcador para la diferenciación de linfocitos T y en células madre hematopoyéticas [Immunol. Cell Biol., 73, 277-296 (1995)]. Aunque queda mucho por conocer sobre sus funciones in vivo, el descubrimiento de que su expresión está muy modulada en el sistema linfocítico sugiere que estas proteínas están desempeñando importantes funciones en el sistema inmunitario, particularmente en la diferenciación y función de los linfocitos T. Se ha publicado que Ly6c, por ejemplo, media en el direccionamiento de los linfocitos T CD8^{+} hacia el ganglio linfático mediante adhesión dependiente de integrina [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 6898-6903 (1997)].

Además, se sabe que muchas proteínas ancladas en GPI interactúan con las proteína cinasas [Science, 254, 1016-1019 (1991)]. Por ejemplo, la interacción de Ly6 con p561cK y p59fyn sugiere la posibilidad de su implicación en la traducción de la señal de los linfocitos T [Eur. J. Immunol., 23, 825-831 (1993)]. Se ha publicado asimismo que los linfocitos T procedentes de ratones con insuficiencia de Ly6a han aumentado la capacidad de proliferar en respuesta a la estimulación antigénica [J. Exp. Med., 186, 705-717 (1997)]. La posibilidad de su regulación no solamente de la activación de los linfocitos T sino también la de los linfocitos B se ha sugerido asimismo [J. Immunol., 144, 2197-2204 (1990)].

Además, se sabe que varias proteínas ancladas en GPI se han expresado y están funcionando tanto en el sistema linfocítico como en el sistema nervioso [Nature, 379; 826-829 (1996); Curr. Biol., 7, 705-708 (1997)]. En la familia Ly6, Ly6a.2 y Ly6E están supuestamente presentes y funcionando en ambos sistemas [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2255-2259 (1996); J. Immunol., 157, 969-973 (1996)].

La explicación de las funciones fisiológicas desempeñadas por dichas proteínas de la familia Ly6 y de los genes que codifican las proteínas y la información resultante se considera que son de utilidad en el campo de la investigación científica fundamental así como en el campo farmacéutico en relación con la purificación de células madre de la sangre, en los estudios sobre la diferenciación de células de la sangre, en la activación de células inmunitarias, en la inhibición de la activación de células inmunitarias, en la terapia de tumores y similares.

Recientemente, se ha descrito en pacientes con enfermedad de Alzheimer, una atrofia excesiva del lóbulo temporal cerebral comparada con la atrofia cerebral asociada a la edad [Jobst, K. A., et al., Lancet, 343, 829-830 (1994)], lo que sugiere que algún gen o genes que tienen su localización en el lóbulo temporal del cerebro están asociados de alguna manera al comienzo y la evolución de la enfermedad de Alzheimer. Es lógico suponer que un gen debería ser identificado o caracterizado, pueda proporcionar información útil para la terapia y profilaxis de la enfermedad de Alzheimer.

El documento WO 97/18224 se refiere a un polipéptido del antígeno 2 de las células madre humanas y al ADN (ARN) que codifica dicho polipéptido y a un procedimiento para producir dicho polipéptido por técnicas recombinantes, a los métodos de utilización de dicho polipéptido para estimular la maduración y diferenciación de timocitos, a la protección de las células neuronales, a la prevención del rechazo durante el transplante de órganos, al tratamiento de PNH, a la enfermedad de Alzheimer e inflamación, así como al análisis de diagnóstico para la identificación de mutaciones en la secuencia de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido y para la detección de niveles alterados del polipéptido para detectar la enfermedad, por ejemplo, el cáncer.

Brackenhoff et al., The Journal of Cell Biology, vol. 129, nº 6, junio de 1995, páginas 1677-1689, es una publicación científica que se refiere a la antígeno E48 humano que es muy homólogo al del antígeno ThB murino, un miembro de la familia de antígenos Ly-6, y que está implicado en la adherencia célula-célula de queratinocitos.

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Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, junio de 1996, páginas 5910-5914 es una publicación científica que se refiere a RIG-E, un homólogo humano de la familia Ly-6 murina, que está producido por el ácido retinoico durante la diferenciación de la célula de leucemia promielocítica aguda.

La regulación y expresión selectiva de Ly-6A/E, molécula de activación de linfocitos, en el sistema nervioso central, ha sido descrita por Cray et al., Molecular Brain Research, vol. 8, 1990, páginas 9-15. El análisis de tres secuencias distintas de ADNc relacionadas con Ly-6 aisladas del riñón de rata, que están más íntimamente relacionadas con Ly-6A que Ly-6C, ha sido descrito por Friedman et al., Immunogenetics vol. 31, 1990, páginas 104-111. La expresión del tejido, la estructura y función de la familia Ly-6 murina de las moléculas ha sido estudiada por Gumley et al., Immunology and Cell Biology, vol. 73, 1995, páginas 277-296, aunque las funciones in vivo de las moléculas Ly-6 no se conocieron en ese momento.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar la información anterior necesaria en función de lo descrito anteriormente, particularmente una nueva proteína humana que pertenece a la familia Ly6 y un gen que codifica la proteína.

Un objetivo adicional de la invención consiste en proporcionar una composición farmacéutica para la terapia y profilaxis de varias enfermedades neurodegenerativas, representadas por la enfermedad de Alzheimer.

El presente inventor exploró en los genes procedentes de varios tejidos humanos y consiguió aislar y caracterizar un nuevo gen específico del cerebro que reúne los objetivos anteriores. El inventor descubrió además que el nivel de expresión de este gen recién aislado está notablemente deprimido en el lóbulo temporal, incluyendo el hipocampo y la corteza cerebral endorrinal, de un paciente con enfermedad de Alzheimer, que es un factor etiológico en el comienzo y evolución de la enfermedad de Alzheimer y en la demencia y otros trastornos y que este gen y su producto de expresión pueden aprovecharse con ventajas en la terapia y profilaxis de la enfermedad de Alzheimer. La presente invención se ha llevado a cabo basándose en los descubrimientos anteriores.

Exposición de la invención

La presente invención proporciona un gen que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la siguiente proteína (a) o (b).

(a): una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1

(b): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 por deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos y que presenta actividad nemónica, en la que dicha secuencia de aminoácidos es idéntica por lo menos el 70% a la SEC. ID. nº: 1.

La invención proporciona también el gen anterior en el que la secuencia nucleotídica se muestra en la SEC. ID. nº: 2, en particular, que es un gen humano.

Además, la invención proporciona un gen que comprende los polinucleótidos (a) o (b) siguientes, particularmente el gen humano correspondiente.

(a): un polinucleótido que contiene la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3

(b): un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas con un ADN que tiene la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3, en el que dicho polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos con actividad nemónica.

La invención proporciona además un vector de expresión génica que alberga dicho gen; una célula hospedadora que alberga dicho vector de expresión génica; una proteína codificada por el gen de la invención; y un anticuerpo que se une a dicho producto de expresión o a dicha proteína.

La invención proporciona además una composición terapéutica y profiláctica para la enfermedad neurodegenerativa, que comprende dicha proteína o un equivalente de la misma o dicho producto de expresión como ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéutico. Más particularmente, la invención proporciona la composición terapéutica y profiláctica para la enfermedad neurodegenerativa, en la que dicho ingrediente activo es una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 o un equivalente de la misma o un producto génico que puede obtenerse mediante la expresión del conjunto o parte de un gen que comprende una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 2 y que tiene acción de formación de la memoria del cerebro (nemónica,
codificación).

Especialmente, la invención proporciona la composición terapéutica y profiláctica para la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la isquemia cerebral y la enfermedad de Parkinson.

Además, la invención proporciona un procedimiento de cribado de compuestos candidatos capaces de unirse a dicha proteína, equivalentes de la misma o producto de expresión o que influyen en su actividad que comprende la utilización de dicha proteína, equivalente o producto de expresión; un kit para dicho cribado; y dichos compuestos cribados de este modo.

La representación de aminoácidos, péptidos, secuencias nucleotídicas, nucleótidos, etc. mediante abreviaturas en la memoria está de acuerdo con las reglas recomendadas por la IUPAC-IUB [IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138, 9 (1984)], "Guideline for drafting patent specifications relative to nucleotide sequences and/or amino acid sequences" (editadas por la Oficina de Patentes de Japón) y los acuerdos en relación con la utilización de los códigos o símbolos en la técnica.

Un ejemplo específico del gen de la invención es el gen deducido de la secuencia de ADN del producto de PCR denominado "LY6H" tal como se describe en el ejemplo que aparece a continuación en la presente memoria. Su secuencia nucleotídica es como se muestra en la SEC. ID. nº: 3.

El gen LY6H es un ADNc que contiene un marco de lectura abierto (ORF) del codón 420 que codifica una nueva proteína específica del cerebro (proteína LY6H) que tiene una secuencia de aminoácidos de 140 restos como se muestra en la SEC. ID. nº: 1, y con una secuencia completa de 854 nucleótidos.

Se descubrió que la proteína LY6H que es el producto de expresión del gen de la invención presenta gran homología con las proteínas de la familia Ly6 de ratón [Immunol. Cell Biol., 73, 277-296 (1995)] mediante una búsqueda en la base de datos GenBank/EMBL utilizando el programa FASTA (Person, W. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)). Además, se reconoció la gran homología gen a gen. Por consiguiente, el gen de la invención se considera que es un nuevo gen Ly6 humano.

El gen LY6 de la invención se identificó que era un gen que se expresa especialmente en el cerebro por secuenciado de más de 28.000 clones de ADNc seleccionados al azar de un banco de ADNc del cerebro humano fetal. Mediante el cartografiado del cromosoma RH [Hum. Mol. Genet., 5, 339-346 (1996)], se descubrió que el locus del gen en el cromosoma era 8q24.3.

Por lo tanto, el gen y el producto de expresión de la invención, proporcionados de este modo, contribuyen a la detección de la expresión del gen en varios tejidos, a la producción de la proteína LY6H humana mediante técnicas de manipulación genética, y a la construcción de un anticuerpo contra el mismo, permitiendo por consiguiente la purificación de las células madre hematopoyéticas, el estudio de la diferenciación de las células sanguíneas, la activación o supresión de las células inmunitarias, la terapia de tumores y similares.

Además, el producto de expresión (polipéptido) de la invención, proporcionado de este modo, permite el aporte de un fármaco para la profilaxis y terapia de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la isquemia cerebral. Además, la cadena transcrita del gen según la invención puede utilizarse como composición farmacéutica para la terapia génica, con la que puede inhibirse o interrumpirse el comienzo y la evolución de las enfermedades neurodegenerativas mencionadas anteriormente.

La invención proporciona además un método de cribado de compuestos que se unen o que influyen en la actividad del producto de expresión (polipéptido) de la invención y un kit apropiado para el cribado, por consiguiente de los compuestos cribados asimismo de esta manera. Para la identificación de dichos compuestos detectados, puede utilizarse un anticuerpo que se une al producto de expresión del gen de la invención.

En la memoria, el término "gen" utilizado significa un ADN de doble cadena y su constituyente el ADN monocatenario, ya sea transcrita o complementaria, con respecto a su longitud. Por consiguiente, a menos que se indique de otra manera, el gen (ADN) de la invención incluye un ADN de doble cadena que contiene un ADN genómico humano, un ADN monocatenario (cadena transcrita) incluyendo el ADNc, un ADN monocatenario (cadena complementaria) con una secuencia complementaria a dicha cadena transcrita, y fragmentos de dichos ADN.

El gen (ADN) de la invención puede contener una secuencia principal, una zona de codificación, exones e intrones. El polinucleótido comprende tanto el ARN como el ADN. El ADN incluye el ADNc, el ADN genómico y el ADN sintético. El polipéptido incluye sus fragmentos, homólogos, derivados y mutantes. Los mutantes incluyen alelos que se producen de forma natural, mutantes que no existen en la naturaleza, mutantes con secuencias de aminoácidos mutadas por deleción, sustitución, adición y/o inserción, y mutantes que tienen secuencias de aminoácidos modificadas funcionalmente equivalentes.

Dichas modificaciones (p. ej. mutaciones) de secuencias de aminoácidos pueden producirse por ejemplo por mutación espontánea o modificación después de la traducción pero pueden producirse artificialmente utilizando un gen natural (por ejemplo, genes específicos de la invención).

La homología de dichos mutantes con el polipéptido no mutado puede ser por lo menos del 70%, preferentemente del 80%, más preferentemente del 95%, y aun más preferentemente del 97%. El polipéptido anterior y sus mutantes y homólogos presentan una característica estructural conservada en común y pueden presentar las actividades biológicas del producto de expresión del gen de la invención, tal como acción de soporte de la supervivencia neuronal, acción estimulante del crecimiento neuronal, acción de regeneración de nervios y acción estimulante de la neuroglía. La homología de los péptidos puede analizarse buscando en una base de datos tal como la base de datos SWISSPLOTS utilizando un programa informático para análisis de secuencias tal como FASTA [Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994)].

El gen que codifica dicho mutante es imperceptible o está conservado para la sustitución de aminoácidos. Por lo tanto, los restos de aminoácidos codificados por la secuencia nucleotídica no están alterados.

Los restos de aminoácidos sustituibles de manera conservadora, es decir, los restos de aminoácidos sustituibles por otros restos de aminoácidos sin perder las actividades del polipéptido que presenta dichos restos de aminoácidos originales, y los restos de aminoácidos originales correspondientes son los siguientes.

Resto de aminoácido original	Resto de aminoácido sustituido de manera conservadora
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn o Gln
Ile	Leu o Val
Leu	Ile o Val
Lys	Arg, Aln o Glu
Met	Leu o Ile
Phe	Met, Leu o Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp o Phe
Val	Ile o Leu

Además, Cys puede estar sustituido por una clase diferente de resto de aminoácidos, p. ej. Ser, Ala o Val.

El gen y el producto de expresión según la invención proporciona información y medios de gran utilización para la explicación, extensión, diagnóstico, profilaxis y terapia de las enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la isquemia cerebral y la enfermedad de Parkinson. El gen de la invención puede asimismo utilizarse ventajosamente para el desarrollo de nuevos fármacos capaces de inducir la expresión del gen para su utilización en el tratamiento de dichas enfermedades neurodegenerativas. Además, la detección de la expresión del gen de la invención y del producto de expresión resultante en individuos o tejidos, y la detección de la mutación (deleción o mutación puntual) del gen o de su expresión anormal puede utilizarse con provecho para la explicación y diagnóstico de dichas enfermedades neurodegenerativas.

El gen de la invención incluye pero no se limita al gen que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. nº: 2 que codifica una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1, por ejemplo un gen (gen LY6H) que presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. nº: 3. Por ejemplo, el gen de la invención puede ser un gen que codifica una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos definida anteriormente mediante una modificación dada, una codificación del gen para una secuencia de aminoácidos con un grado de homología dado con la secuencia de aminoácidos definida anteriormente, o un gen que presenta una secuencia nucleotídica con un grado de homología dado con cualquiera de los genes anteriores.

El grado de homología dado mencionado anteriormente con una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos definidas significa una homología por lo menos inferior al 70%, preferentemente no inferior al 90%, más preferentemente no inferior al 95%, todavía más preferentemente no inferior al 97%. La presente invención comprende homólogos (homólogos de genes y homólogos de proteínas) que presentan dicha homología.

El gen de la invención incluye "un gen que codifica un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos (secuencia de aminoácidos modificada) procedente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 por deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos". El alcance y la posición o posiciones de la "deleción, sustitución o adición" no están específicamente limitados siempre que el polipéptido resultante que tiene una secuencia de aminoácidos modificada sea equivalente, en la función biológica, al polipéptido (proteína LY6H) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1. La "función" biológica mencionada anteriormente incluye funciones fisiológicas tales como la acción de soporte de la supervivencia neuronal, la acción de estiramiento de nervios, la acción de regeneración de nervios y la acción activadora de la neuroglía, la acción nemónica y el "equivalente" es un polipéptido que presenta dichas funciones. Por consiguiente, la proteína que presenta dicha secuencia de aminoácidos modificada incluye una proteína (equivalente) con un fragmento (una fracción de resto consecutiva) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 y con actividades fisiológicas similares a las mencionadas anteriormente para dicha secuencia completa de aminoácidos. Además, el gen que codifica un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos modificada anteriormente puede ser un gen con el que puede detectarse el gen de la invención que codifica un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de premodificación. El término cantidad tal como se utiliza en relación con dicha modificación significa normalmente no inferior a 2, sino hasta varios, aunque el intervalo no es limitativo.

El homólogo del gen LY6H (y el homólogo del producto de expresión del gen) según la invención significa cualquiera de una serie de genes relacionados (y sus productos de expresión) que son homólogos en la secuencia y reconocidos como una familia de genes en sus características estructurales, modelo común de la expresión génica y similitudes en dicha función biológica. Éste, desde luego, incluye los alelos de los genes de la invención.

La modificación (mutación) de la secuencia de aminoácidos puede producirse de forma natural, por ejemplo por mutación instantánea y modificación tras la traducción pero puede provocarse de forma artificial basándose en el gen natural (por ejemplo el gen específico de la invención). La invención comprende cualquiera y la totalidad de los genes modificados que presentan las características anteriores sin relación con la causa o los medios de modificación o mutación.

Los medios artificiales para dicha modificación (mutación) de la secuencia de aminoácidos incluyen técnicas de manipulación genética tal como la mutagénesis específica del sitio [Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); ibid., 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984); "Zoku Seikagaku Jikken Koza (Experiments in Biochemistry, Second Series) 1": Idenshi Kenkyuho (Methods in Gene Research) II, the Biochemical Society of Japan (ed.), pág. 105 (1986), etc.], métodos de síntesis química tales como el método del fosfotriéster y el método de la fosfoamidita [J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); ibid., 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); ibid., 24, 245 (1983)] y combinaciones de dichos procedimientos.

Más específicamente, el ADN puede sintetizarse por un procedimiento químico tal como el procedimiento de la fosfoamidita o el procedimiento del fosfotriéster y esta síntesis puede efectuarse en un sintetizador automático de oligonucleótidos disponible en el mercado. El fragmento de doble cadena puede obtenerse de un fragmento monocatenario sintetizado químicamente sintetizando una cadena complementaria e hibridándola en condiciones adecuadas o añadiendo la cadena complementaria que utiliza una secuencia de cebador adecuada y una ADN polimerasa.

Un ejemplo específico del gen según la invención es el gen que tiene una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3. La zona de codificación (la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 2) de esta secuencia nucleotídica es un ejemplo de codificación de codones que especifica los restos de aminoácidos respectivos de la secuencia de aminoácidos mostrada bajo la SEC. ID. nº: 1. El gen de la invención no se limita al gen que presenta dicha secuencia de nucleótidos definida sino que incluye cualquier gen que presente una secuencia nucleotídica que puede obtenerse seleccionando cualquier combinación arbitraria de codones para cada resto de aminoácidos. La selección de los codones puede hacerse de manera rutinaria, con relación a la utilización del codón en el hospedador que va a emplearse [Nucleic Acids Res., 9, 43 (1981)].

Además, el gen de la invención incluye el que tiene una secuencia nucleotídica que presenta un determinado nivel de homología con la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3. De dicho nivel de homología se deducen los polinucleótidos y polinucleótidos complementarios que presentan por lo menos el 70% de homología, preferentemente por lo menos el 90% de homología, más preferentemente por lo menos el 95% de homología con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. nº: 3. El gen que tiene dicho nivel de homología puede estar caracterizado por ejemplo como polinucleótido que se hibrida con un ADN que presenta la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3 en condiciones severas. Más particularmente, el gen que tiene una secuencia nucleotídica que se hibrida con el ADN que tiene la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3 en las condiciones de 6 \times SSC a 65ºC durante la noche o de 50% de formamida-4 \times SSC a 37ºC durante la noche está incluido en el concepto del gen que presenta dicho nivel de homología. En la presente memoria, SSC significa citrato salino patrón (1 \times SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M).

El gen de la invención puede producirse fácilmente y aislarse mediante la tecnología de manipulación genética general basada en la información de la secuencia en cualquier ejemplo específico del gen de la invención como se da a conocer en la presente memoria [p. ej. Molecular Cloning 2ª ed., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Koza (Experiments in Biochemistry, Second Series): ``Idenshi Kenkyuho (Methods in Gene Research) I, II, III, the Biochemical Society of Japan (ed.), (1986)].

Más específicamente, esto puede realizarse preparando un banco de ADNc a partir de una fuente adecuada, en el que el gen de la invención puede expresarse, mediante un procedimiento rutinario y seleccionar un clon deseado de este banco utilizando una sonda adecuada o anticuerpo específico contra el gen de la invención [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)].

La fuente de ADNc, que puede utilizarse en el procedimiento anterior incluye varias células y tejidos que expresan el gen de la invención, así como células cultivadas procedentes de los mismos, especialmente de los tejidos cerebrales. El aislamiento del ARN completo de dicha fuente, el aislamiento y purificación del ARNm y la adquisición y clonación del ADNc pueden realizarse también de manera convencional. Además, están disponibles en el mercado bancos de ADNc y la presente invención puede ponerse en práctica utilizando dichos bancos de ADNc, por ejemplo los bancos de ADNc disponibles en CLONTECH Lab. Inc.

El método de identificación del gen de la invención a partir de un banco de ADNc no está específicamente limitado, pero puede emplearse el procedimiento convencional. Ejemplos de métodos de cribado incluyen un método de cribado que utiliza un anticuerpo específico contra la proteína producida por un ADNc para seleccionar el clon del ADNc correspondiente, un procedimiento que utiliza una sonda que se une selectivamente a la secuencia de ADN objetivo, tal como un procedimiento de hibridación de placas y un procedimiento de hibridación de colonias y una combinación de dichos procedimientos.

Como sonda para el procedimiento anterior, puede emplearse generalmente el ADN sintetizado químicamente según la información de la secuencia nucleotídica sobre el gen de la invención. El gen de la invención que se ha obtenido ya o un fragmento del mismo pueden utilizarse también como sonda con ventaja. El cebador transcrito y el cebador complementario creados de acuerdo con la información de la secuencia nucleotídica en el gen de la invención pueden utilizarse como sondas de identificación.

La secuencia nucleotídica para su utilización como sonda puede ser una secuencia nucleotídica parcial correspondiente a la SEC. ID. nº: 2 y que comprende por lo menos 10 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos, más preferentemente 30 nucleótidos consecutivos, lo más preferentemente 50 nucleótidos consecutivos. Además, el clon positivo que presenta la secuencia oligonucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 2 como tal puede utilizarse como sonda.

En la obtención del gen de la invención, puede utilizarse con ventaja la ampliación de ADN/ARN por PCR [Science, 230, 1350 (1985)]. Específicamente, cuando un ADNc completo puede obtenerse apenas de un banco, puede utilizarse con ventaja el método RACE [Rapid amplification of cDNA ends; Jikken Igaku (Experimental Medicine), 12(6), 35 (1994)], especialmente el método 5'-RACE [M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 8998 (1988)].

Los cebadores para utilización en dichos procedimientos de PCR pueden crearse con buen criterio con relación a la información de la secuencia en el gen de la invención tal como se describe en la presente memoria y pueden sintetizarse por el procedimiento de rutina. El aislamiento y purificación del fragmento de ADN/ARN ampliado puede realizarse de manera rutinaria como se mencionó anteriormente, por ejemplo por el procedimiento de electroforesis en gel.

El secuenciado del gen de la invención tal como se obtiene de la manera anterior o varios fragmentos de ADN pueden prepararse de acuerdo con el método didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] o el procedimiento de Maxam y Gilbert [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)] o de manera más conveniente utilizando un kit comercial de secuenciado.

Por ejemplo, con el gen de la invención obtenido de este modo, puede detectarse específicamente la expresión o no expresión del gen de la invención en un individuo o un tejido dado utilizando una parte o la totalidad de la secuencia nucleotídica del gen de la invención.

La detección anterior puede realizarse por procedimientos convencionales, tales como la ampliación del ARN por RT-PCR [reacción en cadena de polimerasa transcrita a la inversa; E. S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. En PCR Protocol. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, 21-27 (1991)], análisis de transferencia Northern [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)], determinación del nivel celular por RT-PCR in situ [Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)] o hibridación in situ, NASBA [ampliación basada en secuencias de ácido nucleico, Nature, 350, 91-92 (1991)], y las técnicas convencionales similares. El procedimiento de detección preferido es la RT-PCR.

El cebador que debe utilizarse cuando se selecciona el procedimiento de PCR con el objetivo anterior no está específicamente limitado siempre que sea característico del gen de la invención y sea capaz de la ampliación selectiva del gen concreto solamente y pueda crearse con buen criterio basándose en la información de la secuencia en el gen de la invención. Habitualmente, el que presenta una secuencia parcial del gen de la invención, que es de aproximadamente 10 a 35 nucleótidos de longitud, preferentemente aproximadamente de 15 a 30 nucleótidos de longitud puede utilizarse como cebador.

El gen de la invención, por lo tanto, incluye el fragmento de ADN que puede utilizarse como cebador específico y/o la sonda específica para la detección del gen LY6H de la invención.

El fragmento de ADN mencionado anteriormente puede definirse como un polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido que presenta la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 2 en condiciones severas. Las condiciones severas mencionadas anteriormente pueden ser las condiciones normales para los cebadores o sondas y, como tales, no están específicamente limitadas. Por ejemplo, pueden mencionarse las condiciones mencionadas anterior-
mente de 6 \times SSC, 65ºC, durante la noche o la condición de 50% de formamida-4 \times SSC, 37ºC, durante la noche.

Aplicando el gen de la invención a la tecnología de manipulación genética habitual, el producto de la expresión (polipéptido) del gen o una proteína que lo contiene puede producirse fácilmente en grandes cantidades y con buena reproducibilidad.

Por consiguiente, la invención proporciona además un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la invención (el producto de la expresión de la invención), un vector que alberga el gen de la invención para la producción del polipéptido, una célula hospedadora transfectada con el vector y un procedimiento de producción del polipéptido de la invención que comprende el crecimiento de la célula hospedadora.

El polipéptido (proteína LY6H) que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 es una forma de realización específica del polipéptido de la invención. El polipéptido de la invención no se limita a su proteína LY6H sino que incluye su homólogo. El homólogo puede ser un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 mediante la deleción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos y que conserva la misma función que la proteína LY6H. Un ejemplo específico del homólogo es el producto de la expresión de un homólogo de dicho gen LY6H (el gen equivalente LY6H inclusive del alelo).

Además, el homólogo de la proteína LY6H de la invención incluye las proteínas que tienen la misma actividad o función que el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 procedente de cualquiera de los mamíferos tales como equinos, ovejas, bovinos, caninos, monos, gatos, osos, etc. y roedores tales como rata, ratón y conejo.

El polipéptido de la invención puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante convencional [p. ej. Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5990 (1983)] basada en la información de la secuencia génica proporcionada por la presente invención.

Más específicamente, la producción de dicho polipéptido se realiza por el procedimiento que comprende la construcción de un ADN recombinante (vector de expresión) que permite la expresión del gen que codifica la proteína deseada en una célula hospedadora, la transformación de la célula hospedadora con el vector, el crecimiento del transformante resultante y la recogida del polipéptido del caldo de cultivo.

La célula hospedadora mencionada anteriormente puede ser cualquiera de entre una célula procariótica y una célula eucariótica. Como hospedador procariótico, pueden mencionarse Escherichia coli, Bacillus subtilis y otras bacterias frecuentes y preferentemente células de Escherichia coli, especialmente células K12 de Escherichia coli. La célula hospedadora eucariótica incluye las células de vertebrados y las levaduras y la anterior incluye la línea celular COS de mono [Cell, 23: 175 (1981)], las células de ovario de hámster chino y las células insuficientes en dihidrofolato reductasa de las mismas [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)]. Como en este último, las células de levadura del género Saccharomyces pueden utilizarse con ventaja, pero éstas no son selecciones exclusivas.

Cuando se utilizan células procarióticas como células hospedadoras, puede utilizarse con ventaja un montaje del plásmido de expresión preparado utilizando un vector que puede replicarse en la célula hospedadora concreta y añadir un activador y la secuencia SD (Shine y Dalgarno) del gen de la invención de modo que el gen pueda expresarse en el mismo así como un codón de iniciación (p. ej. ATG) necesario para la iniciación de la síntesis de la proteína. Como vector mencionado anteriormente, es habitual emplear plásmidos derivados de Escherichia coli, tales como pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, etc. Sin embargo, estas no son selecciones exclusivas sino que pueden utilizarse varios vectores conocidos. Ejemplos de vectores comerciales para su utilización en los sistemas de expresión que utilizan E. coli incluyen pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMA1-P2 (New England Biolabs), pET21, pET21/lacq (Invitrogen) y pBAD/His (Invitrogen).

Como vector de expresión para su utilización cuando las células de un vertebrado se utilizan como células hospedadoras, se emplean habitualmente el vector que tiene un activador corriente arriba del gen de la invención que ha de expresarse, las secuencias de corte y empalme de ARN, la secuencia de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción, y este vector puede presentar además un origen de la replicación cuando sea necesario. Un ejemplo específico de vector de expresión es pSV2dhfr que alberga un activador precoz de SV40 [Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)]. Aparte de lo anterior, pueden emplearse varios vectores conocidos disponibles en el mercado. Ejemplos de vectores comerciales que se utilizan en los sistemas de expresión que utilizan células animales incluyen vectores para células animales, tales como pEGFP-N, pEGFP-C (CLONTECH), pIND (Invitrogen), pcDNA3.1/His (Invitrogen), etc., y vectores para células de insectos, tales como pFastBac HT (Gibci BRL), pAcGHLT (PharMingen), pAc5/V5-His, pMT/V5-His y pMT/Bip/V5-his (todos de Invitrogen).

El pAM82 que tiene un activador para el gen de fosfatasa ácida [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1 (1983)] es un ejemplo específico del vector de expresión para su utilización cuando se utilizan células de levadura como células hospedadoras. Los vectores de expresión comerciales para células de levadura incluyen pPICZ (Invitrogen) y pPICZ\alpha (Invitrogen).

El activador no está específicamente limitado. Cuando se utiliza una cepa del género Escherichia como hospedador, puede utilizarse con ventaja el activador de triptófano (trp), el activador lpp, el activador lac, el activador recA, el activador PL/PR, etc. Cuando el hospedador es una cepa del género Bacillus, se utilizan preferentemente el activador SP01, el activador SP02, el activador penP, etc. Cuando se utiliza una levadura como hospedador, pueden utilizarse con ventaja el activador pH05, el activador PGK, el activador GAP, el activador ADH, etc. El activador preferido para su utilización cuando las células hospedadoras son células de animales incluye los activadores derivados de SV40, los activadores de retrovirus, el activador de metalotioneína, el activador del choque térmico, el activador de citomegalovirus y el activador de Sr\alpha.

Como vector de expresión para el gen de la invención, puede utilizarse ventajosamente el vector de expresión de la proteína de fusión convencional. pGEX (Promega) para la expresión de proteínas fusionadas con glutatión-S-transferasa (GST) es un ejemplo específico de vector.

La secuencia polinucleotídica en la que la secuencia de codificación de un polipéptido maduro ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido procedente de células hospedadoras incluye la secuencia secretora, la secuencia principal y la secuencia marcadora (marcador de hexahistidina, marcador de histidina) utilizadas en la purificación de un polipéptido de fusión maduro en el caso de células bacterianas, y el marcador de hemoaglutinina (HA) en el caso de células de mamíferos.

El procedimiento de introducción del ADN recombinante (vector de expresión) en la célula hospedadora y el procedimiento de transformación asociado no están específicamente limitados sino que pueden utilizarse varios métodos normalizados.

El transformante obtenido puede cultivarse de manera rutinaria, por lo que la proteína objetivo codificada por el gen diseñado de manera deliberada según la invención se expresa y produce (se acumula/segrega) en el interior de las células, en el exterior de las células o en la membrana celular.

El medio de cultivo que debe utilizarse puede seleccionarse con buen criterio de entre varios medios de rutina según la clase de célula hospedadora adoptada y el cultivo se realiza asimismo en condiciones favorables al crecimiento de la célula hospedadora.

La proteína recombinante resultante (proteína LY6H) según la invención puede aislarse opcionalmente y purificarse mediante varias técnicas de separación que presentan la ventaja de sus propiedades físicas y/o químicas, por ejemplo ["Seikagaku Data Book (Biochemical Data Book) II", 1175-1259, primera edición, 1ª impresión, 23 de junio de 1980, Tokio Kagaku Dojin K. K.; Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.].

Ejemplos de dichas técnicas son el procedimiento de reconstrucción convencional, el tratamiento con un agente precipitante de proteínas (método de salado), centrifugación, el procedimiento de choque osmótico, la descomposición sónica, la ultrafiltración, varios tipos de cromatografías tales como la cromatografía en tamices moleculares (filtración en gel), la cromatografía de adsorción, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía por afinidad y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la diálisis y combinaciones de estas técnicas. La técnica particularmente preferida incluye la cromatografía por afinidad que utiliza una columna a la que se ha acoplado un anticuerpo específico contra la proteína de la invención.

Al diseñar el gen objetivo que codifica el polipéptido de la invención, puede utilizarse la secuencia nucleotídica del gen Y6H tal como se muestra en la SEC. ID. nº: 2 con ventaja. Si se desea, este gen puede utilizarse después que se hayan alterado con buen criterio los codones que especifican los restos de aminoácidos respectivos. Además, cuando cualquier resto de aminoácidos o la secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen LY6H deba modificarse por sustitución, deleción o adición, dichas modificaciones pueden realizarse por varios métodos descritos anteriormente, por ejemplo por mutagénesis específica del sitio.

El polipéptido de la invención puede ser producido por el protocolo habitual para la síntesis química según la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1. El procedimiento incluye el procedimiento en fase líquida convencional y el procedimiento en fase sólida para la síntesis de péptidos.

Más específicamente, el procedimiento para la síntesis de péptidos incluye el método de prolongación denominado por etapas en el que los aminoácidos constituyentes se acoplan uno a uno para la prolongación de la cadena y el procedimiento de condensación del fragmento que comprende la síntesis de fragmentos consistente cada uno en varios aminoácidos de antemano y el acoplamiento de los fragmentos. La síntesis de la proteína de la invención puede realizarse por cualquiera de los dos procedimientos anteriores.

El procedimiento de condensación para su utilización en la síntesis de péptidos anterior puede ser también el convencional, incluyendo el procedimiento de la azida, el procedimiento del anhídrido de ácido mezclado, el procedimiento DCC, el procedimiento de éster activo, el procedimiento redox, el procedimiento DPPA (difenilfosforil azida), el procedimiento DCC + aditivo (1-hidroxibenzotriazol, N-hidroxisuccinamida, N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida o similares) y el procedimiento del reactivo de Woodward.

El disolvente que debe utilizarse en estos procedimientos puede asimismo seleccionarse con buen criterio de entre los disolventes habituales bien conocidos en la materia para su utilización en dichas reacciones de condensación de formación de péptidos. Ejemplos de los disolventes incluyen dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetilo (DMSO), hexafosforamida, dioxano, tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo, etc. y mezclas de los mismos.

Al realizar las reacciones de síntesis de péptidos el grupo carboxilo de cualquier aminoácido o fragmento de péptido que debería no tomar parte en la reacción puede protegerse de antemano, generalmente por esterificación en forma de éster de alquilo inferior como éster metílico, éster etílico, éster terc-butílico, etc. o un éster aralquílico tales como el éster bencílico, éster p-metoxobencílico, éster p-nitrobencílico, etc.

Con relación a cualquier aminoácido que tenga un grupo funcional en su cadena lateral, el grupo hidroxilo de un resto de tirosina, por ejemplo, puede protegerse de antemano con un acetilo, bencilo, benciloxicarbonilo, butilo terciario u otro grupo, aunque dicha protección no es necesariamente indispensable. Además, el grupo guanidino de un resto de arginina puede protegerse con un grupo protector adecuado tal como nitro, tosilo, p-metoxibencenosulfonilo, mutilen-2-sulfonilo, benciloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo o similares.

Las reacciones para eliminar dichos grupos protectores en los aminoácidos, péptidos o proteína del producto final protegidos de la invención pueden realizarse también de forma rutinaria, por ejemplo por reducción catalítica o un método que utiliza amoniaco líquido/sólido, fluoruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, cloruro de hidrógeno, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ácido metansulfónico u otro reactivo.

El polipéptido de la invención, producido de este modo, puede purificarse según se necesite por varias técnicas mencionadas anteriormente, tales como cromatografía con resinas de intercambio iónico, cromatografía de reparto, cromatografía en gel, distribución a contracorriente y procedimientos similares en utilización de rutina en el campo de la química de los péptidos.

El polipéptido de la invención puede utilizarse con ventaja como inmunógeno para la preparación de su anticuerpo específico. Al utilizar este inmunógeno, pueden proporcionarse el antisuero (anticuerpo policlonal) y el anticuerpo monoclonal.

La tecnología de la producción de anticuerpos es bien conocida por los expertos en la materia y pueden emplearse procedimientos conocidos en la presente invención [p. ej., Zoku Seikagaku Jikken Koza (Experiments in Biochemistry, second series) "Men-eki Seikagaku Kenkyuho (Methods in Immunobiochemistry)", editada por la Biochemical Society of Japan (1986)].

Por ejemplo, como animal inmune para extraer el antisuero deseado del mismo, pueden seleccionarse arbitrariamente animales ordinarios tales como conejo, cobaya, rata, ratón, pollo, etc. y la inmunización con dicho inmunógeno y la extracción de sangre puede realizarse asimismo por procedimientos convencionales.

La preparación de un anticuerpo monoclonal puede realizarse también por la técnica convencional que comprende construir un hidridoma entre la célula de plasma (célula inmunitaria) de un animal inmunizado con dicho inmunógeno y una célula de plasmacitoma, seleccionando los clones que producen el anticuerpo deseado y cultivando los clones. El animal inmune se selecciona generalmente en consideración de su compatibilidad con la célula de plasmacitoma que debe utilizarse para la fusión celular y normalmente se utiliza el ratón o la rata con ventaja. El procedimiento de inmunización puede ser el mismo que se utiliza para la preparación de dicho antisuero y, si se desea, la inmunización puede realizarse utilizando un adyuvante convencional en combinación.

La célula de plasmacitoma para su utilización en dicha hibridación no está especialmente limitada, pero incluye varias células de mieloma tales como p3 (p3/x63-Ag8) [Nature, 256: 495-497 (1975)], p3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81: 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell., 8: 405-415 (1976)], SP2/0 [Nature, 276: 269-271 (1978)], etc., R210 [Nature, 277: 131-133 (1979)] y otros en ratas, y células derivadas de las mismas.

La hibridación entre dicho inmunocito y dicha célula de plasmacitoma puede efectuarse por la tecnología conocida en presencia de un activador de hibridación convencional tal como polietilenglicol (PEG) o virus de Sendai (HVJ) y la separación del hibridoma objetivo puede realizarse también de la manera conocida [Meth. in Enzymol., 73: 3 (1981); Zoku Seikagaku Jikken Koza (ditto)].

La búsqueda del clon de la célula que produce el anticuerpo objetivo y la preparación del anticuerpo monoclonal puede realizarse también de manera rutinaria. Por ejemplo, la búsqueda del hibridoma que produce el anticuerpo puede realizarse por cualquiera de las diversas técnicas en utilización de rutina para la detección de anticuerpos, tales como ELISA [Meth. in Enzymol., 70: 419-439 (1980)], el procedimiento de placas, el procedimiento de manchas, el procedimiento de la reacción de aglutinación, el procedimiento de Ouchterlony, radioinmunoanálisis, y similares, que utilizan la proteína de la invención como antígeno.

La recogida del anticuerpo de la invención del hibridoma resultante puede conseguirse cultivando el hibridoma de manera rutina y recuperando el anticuerpo como sobrenadante del cultivo o administrando el hibridoma a un mamífero compatible y recuperando el anticuerpo en forma de ascitis. El método anterior es adecuado para la producción del anticuerpo de gran pureza, mientras que el último método es adecuado para la producción a gran escala del anticuerpo. El anticuerpo producido de este modo puede purificarse más por el método convencional tal como salado, filtración en gel, cromatografía de afinidad y similares.

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El anticuerpo obtenido de este modo se caracteriza por su afinidad de unión para la proteína LY6H de la invención y puede utilizarse con ventaja para la purificación de la proteína LY6H y la determinación o diferenciación de la proteína por técnicas inmunológicas. Además, dado que se ha confirmado una disminución de la expresión del gen de la invención en el lóbulo temporal del cerebro de un paciente con la enfermedad de Alzheimer que es una enfermedad neurodegenerativa, este anticuerpo puede utilizarse en la identificación de agonistas o antagonistas de la proteína LY6H.

La presente invención proporciona asimismo el nuevo anticuerpo descrito anteriormente.

El polipéptido de la invención es útil en el campo de la medicina como productos farmacéuticos que lo contienen como ingrediente activo. Por consiguiente, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención como ingrediente activo.

La utilidad del polipéptido de la invención en dicha composición farmacéutica o como la misma es atribuible a la acción de soporte de la supervivencia neuronal, a la acción de alargamiento del nervio, a la acción de regeneración del nervio, a la acción de la activación de la neuroglía y a la acción nemónica inherente en este polipéptido específico del cerebro. Ejemplos de los métodos para confirmar estas acciones incluyen los siguientes métodos para cada acción.

1) Acción de soporte de la supervivencia neuronal

Para cuantificar la acción de soporte de la supervivencia neuronal del polipéptido de la invención puede utilizarse el método siguiente. Por ejemplo, se aísla asépticamente el hipocampo del conjunto del cerebro de una rata SD fetal y se trata con una enzima y se siembra en una placa de 96 pocillos recubierta con poli-L-lisina (Sigma) que contiene suero de ternero fetal al 10% con DMEM a una concentración final de 2\times10^{5} células/cm^{2}.

Se cultivan las células durante 24 horas, al final de cuyo periodo se cambia el medio de cultivo a DMEM que contiene suplemento N2 al 1% (Gibco). A continuación, se añade el polipéptido ingrediente activo de la invención (el grupo de la invención). Como referencia, se añade el polipéptido de la invención que ha sido tratado térmicamente en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos (grupo de proteína hervida).

En cada grupo se cultivan durante 72 horas las células (cultivo) preparadas de la manera anterior. A continuación, puede evaluarse el efecto de soporte de supervivencia neuronal del polipéptido de la invención sobre las neuronas del hipocampo realizando un análisis MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] utilizando el sistema de análisis de 96 pocillos para la valoración de células de Promega.

Asimismo, aislando asépticamente el mesencéfalo anterior del mismo conjunto del cerebro de una rata SD fetal como anteriormente y realizando un análisis MTT de la misma manera que anteriormente, puede investigarse el efecto de soporte de la supervivencia neuronal del polipéptido de la invención sobre las neuronas del mesencéfalo.

2) Acción dopaminérgica de soporte para la supervivencia de las neuronas

Como método de evaluación de la acción de soporte para la supervivencia neuronal del polipéptido de la invención, puede mencionarse el siguiente método de cuantificación de la actividad dopaminérgica de soporte para la supervivencia de neuronas. Por lo tanto, las células (cultivo) en cada grupo preparadas como anteriormente en 1) se cultivan durante 72 horas y, a continuación, se fijan con 4% de paraformaldehído-PBS durante reposo de 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilizando Triton al 1% \times 100/PBS, se pasa el cultivo a través de una membrana.

Para impedir la fijación no específica del anticuerpo, se incuban las células en PBS con suero de cabra al 10% durante 1 hora y, a continuación, utilizando un anticuerpo policlonal antitirosina hidrolasa (Chemicon, diluido 1.000 veces en PBS), se incuban más a 4ºC durante 16 horas. Después de la eliminación del fluido del anticuerpo, se lavan las células con PBS y, tras la adición de inmunoglobulina anticonejo de cabra (Dako) acoplada al polímero de dextrano marcado con peroxidasa, se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.

La detección de las células positivas a tirosina-hidroxilasa puede realizarse mediante la reacción colorimétrica que utiliza diaminobenzidina como sustrato. De esta manera, puede analizarse la actividad dopaminérgica de soporte para la supervivencia neuronal del polipéptido de la invención utilizando numerosas células positivas a tirosina hidroxilasa como indicador.

3) Acción de alargamiento de nervios

La determinación de la acción de alargamiento de nervios (acción que favorece el alargamiento del axón) del polipéptido de la invención puede realizarse utilizando células PC12 [número de registro ATCC CRL1721; Science, 229; 393-395 (1985)] como se describe a continuación. De este modo, las células PC12 subcultivadas en MEM modificado por Dulbecco (D-MEM) que contiene 5% de suero de caballo inactivado térmicamente (56ºC, 30 min) y suero de ternero fetal al 10% (FCS) se trasplantan en una placa petri de plástico recubierta con colágeno, de 35 mm de diámetro, a una concentración de 6\times10^{4} células/3 ml. El segundo día después del trasplante, se sustituyó el medio con D-MEM que contiene una concentración variable del polipéptido de la invención así como factor de crecimiento de nervios (NFG; Wako Pure Chemical Ind.) y FCS y se continúa el cultivo en cada caso. El día 3, se examinan los cambios morfológicos de las células con un microscopio de contraste de fases. Al evaluar si la formación de neuritas o la activación de excrecencias de neuritas se observa en comparación con la referencia, puede evaluarse el potencial de activación de la elongacion del axón del polipéptido de la invención.

4) Acción activante de la neuroglía

La acción activante de la neuroglía puede evaluarse, determinando por ejemplo el efecto del polipéptido de la invención sobre la activación de la neuroglía por FGF según el procedimiento de Kniss et al. o el procedimiento de Bogler et al. [Kniss, D. A., y Burry, R. W., Brain Res., 439, 281-288 (1988); Bogler, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (16), 6368-6372 (1990)].

5) Acción nemónica

La acción nemónica puede evaluarse, por ejemplo, según el protocolo del laberinto de agua de Morris [Morris, R. G. M., J. Neurosci. Meth., 11, 47-60 (1984)].

Otro procedimiento de evaluación comprende la administración de la proteína LY6H o un agonista o antagonista de la proteína LY6H seleccionada mediante una identificación a un modelo animal de la enfermedad de Alzheimer tal como un gen de la proteína del precursor \beta-amiloide mutante o del ratón transgénico con el gen de presenilina 1 mutante [p. ej. Nature, 373, 523-527 (1995); Nature Med., 5, 560-564 (1999)] y evaluando el grado de evolución de la enfermedad y el grado de degeneración del nervio en comparación con un grupo de referencia no tratado.

Además, para tener el gen expresado en el lóbulo temporal humano (terapia génica), se utiliza un vector de adenovirus [Straus, E. S., Plenum Press New York, 451-496 (1984); Setoguchi, Y., et al., Blood, 84, 2953-2964 (1994)], por ejemplo. De este modo, un posible procedimiento comprende la clonación del gen de la invención en un vector de adenovirus, cultivándole en la célula madre, administrándole directamente en el lóbulo temporal o por vía intravenosa a través de un vaso sanguíneo periférico y comprobando para ver si ha mejorado el tipo de Alzheimer de demencia o la enfermedad de Alzheimer o se ha inhibido la evolución.

El polipéptido como ingrediente activo de la composición farmacéutica de la invención incluye su sal farmacéuticamente aceptable. Dicha sal incluye sales no tóxicas con metales alcalinos, metales alcalinotérreos o amonio, tales como las sales de sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, bario y amonio. Estas sales pueden prepararse por los métodos convencionales en la técnica. Además, dicha sal incluye las sales de adición de ácido no tóxicas que pueden prepararse haciendo reaccionar el polipéptido ingrediente activo de la invención con ácidos orgánicos o inorgánicos adecuados. La sal de adición de ácido no tóxica representativa incluye el hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, p-tolulensulfonato (tosilato), citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, sulfonato, glicolato, maleato, ascorbato, bencensulfonato, naftalensulfonato y similares.

La composición farmacéutica de la invención incluye una composición que comprende una cantidad farmacológicamente eficaz del polipéptido de la invención y un vehículo o diluyente farmacéutico no tóxico adecuado.

El vehículo farmacéutico que puede utilizarse para dicha composición farmacéutica (preparación farmacéutica) incluye diluyentes o excipientes que se utilizan convencionalmente según las formas galénicas, tales como cargas, agentes de esponjamiento, aglutinantes, humectantes, disgregadores, tensioactivos y lubricantes. Estos pueden seleccionarse con buen criterio y utilizarse según la forma galénica unitaria de la composición.

La composición farmacéutica especialmente preferida de la invención puede prepararse utilizando varios aditivos que pueden formularse en preparaciones de proteínas ordinarias, tal como el estabilizante, biocida, tampón, agente isotónico, agente quelante, agente de control de pH y tensioactivo.

El estabilizante incluye albúmina de suero humano, un L-aminoácido, un azúcar y un derivado de celulosa, por ejemplo, pueden mencionarse. Éstos pueden utilizarse solos o en combinación con un tensioactivo o similares cuando sea necesario. La utilización en combinación con un tensioactivo puede conducir a una estabilización más eficaz del ingrediente activo en particular.

El L-aminoácido no está limitado particularmente pero puede por ejemplo ser cualquiera de entre glicina, cisteína y ácido glutámico.

El azúcar no está especialmente limitado pero incluye monosacáridos tales como glucosa, manosa, galactosa, fructosa, etc.; alcoholes de azúcar tales como manitol, inositol, xilitol, etc., disacáridos tales como sacarosa, maltosa, lactosa, etc.; polisacáridos tales como dextrano, hidroxipropilalmidón, sulfato de condroitina, ácido hialurónico, etc.; y sus derivados.

El tensioactivo no está especialmente limitado, pero pueden emplearse tensioactivos tanto iónicos como no iónicos. Ejemplos de tensioactivos son los ésteres de alquino de polioxietilenglicol sorbitán, los ésteres de alquilo de polioxietileno, los ésteres de monoacilo sorbitán y los glicéridos de ácido graso.

El derivado de celulosa que puede utilizarse no está especialmente limitado, pero incluye metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica.

El nivel de adición de alguno de dichos azúcares y otros derivados puede seleccionarse con buen criterio haciendo referencia a la cantidad en uso general. Generalmente, se utiliza el azúcar en una proporción no inferior a aproximadamente 0,0001 mg, preferentemente dentro del intervalo entre aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg, por \mug de ingrediente activo. El tensioactivo se utiliza generalmente en una proporción no inferior a aproximadamente 0,00001 mg, preferentemente comprendida dentro del intervalo entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 0,01 mg, por \mug de ingrediente activo. La albúmina de suero humano, ejemplo de estabilizante, puede utilizarse en una proporción no inferior a aproximadamente 0,0001 mg, preferentemente dentro del intervalo entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,1 mg, por \mug de ingrediente activo. La cantidad de aminoácido, otro ejemplo de estabilizante, puede seleccionarse de intervalo entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 10 mg por \mug de ingrediente activo. El nivel de adición del derivado de celulosa no es inferior a aproximadamente 0,00001 mg y se selecciona preferentemente de entre el intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1 mg.

La cantidad de ingrediente activo en la composición farmacéutica de la invención puede seleccionarse libremente de entre un amplio intervalo pero generalmente se selecciona de entre el intervalo comprendido entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 70% en peso, preferentemente entre 0,0001 y aproximadamente el 5% en peso.

La composición farmacéutica de la invención puede enriquecerse más con un tampón, un agente isotónico y un agente quelante. El tampón incluye ácido bórico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido \varepsilon-aminocaproico, ácido glutámico y las sales correspondientes (las sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos de los mismos, tales como las sales de sodio, sales de potasio, sales de calcio y sales de magnesio). El agente isotónico incluye cloruro sódico, cloruro potásico, azúcares y glicerol. El agente quelante incluye edetato sódico y ácido cítrico. El nivel de adición de alguno de estos aditivos puede estar dentro del intervalo convencional.

La preparación farmacéutica de la invención puede proporcionarse en forma de solución, y en forma liofilizada que puede almacenarse. Dichas preparaciones liofilizadas pueden disolverse de forma improvisada, por ejemplo, un tampón inclusive de agua, solución salina o similares a una concentración adecuada.

Con respecto a la forma galénica unitaria de la composición farmacéutica de la invención, pueden seleccionarse varias formas según el objetivo terapéutico. La forma representativa incluye formas galénicas sólidas tales como comprimidos, píldoras, polvos, polvos puros, gránulos, cápsulas, etc. y formas galénicas líquidas tales como soluciones, suspensiones emulsiones, jarabes, elixires y demás. Estas formas galénicas se clasifican generalmente, por la vía de administración, en preparaciones orales, preparaciones parenterales, preparaciones nasales, supositorios vaginales, supositorios rectales, comprimidos sublinguales, pomadas y otros. Cada una de dichas formas galénicas pueden formularse y moldearse o si no prepararse por el procedimiento farmacéutico creado.

Por ejemplo, pueden prepararse comprimidos utilizando, como dicho vehículo farmacéutico, cualquiera de los diversos excipientes tales como lactosa, sacarosa, cloruro sódico, glucosa, urea, almidón, carbonato cálcico, caolín, celulosa cristalina, ácido silícico, fosfato potásico, etc.; aglutinantes tales como agua, etanol, propanol, jarabe sencillo, solución de glucosa, solución de almidón, solución de gelatina, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc.; disgregantes tales como carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa cálcica, hidroxipropilcelulosa con bajo grado de sustitución, almidón anhidro, alginato sódico, polvo de agar-agar, polvo de laminarán, bicarbonato sódico, carbonato cálcico, etc.; tensioactivos tales como ésteres de ácido graso con polioxietilensorbitán, laurilsulfato sódico, estearato de monoglicerol, etc.; inhibidores de disgregación y tales como sacarosa, estearina, manteca de cacao, aceite hidrogenado, etc.; activadores de absorción tales como vasos de amonio cuaternario, lauril sulfato sódico, etc.; humectantes tales como glicerol, almidón, etc.; adsorbentes tales como almidón, lactosa, caolín, bentonita, sílice coloidal, etc.; y lubricantes tales como talco purificado, sales de ácido esteárico, polvo de ácido bórico, polietilenglicol y otros.

Cuando sea necesario, dichos comprimidos pueden estar recubiertos con recubrimientos convencionales para proporcionar comprimidos recubiertos de azúcar, comprimidos recubiertos de gelatina, comprimidos con recubrimiento entérico y comprimidos recubiertos con película. También pueden emplearse comprimidos con doble capa o multicapa.

El vehículo farmacéutico que puede utilizarse para la producción de píldoras comprende varios excipientes tales como glucosa, lactosa, almidón, manteca de cacao, aceite vegetal hidrogenado, caolín, talco, etc.; aglutinantes tales como goma arábiga en polvo, polvo de tragacanto, gelatina, etanol, etc.; y disgregadores tales como laminarán y agar-agar.

Las cápsulas pueden prepararse generalmente de manera convencional mezclando el ingrediente activo de la invención con el vehículo o vehículos farmacéuticos y rellenando la composición resultante en carcasas de cápsula de gelatina dura, carcasas de cápsulas blandas o similares.

La preparación para la administración oral incluye soluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes, elixires, etc. farmacéuticamente aceptables formuladas con diluyentes inertes de rutina, tales como agua, y estas formas galénicas pueden contener un agente humectante, un emulsionante, un agente de suspensión y/o otros aditivos auxiliares. Éstos pueden prepararse por procedimientos farmacéuticos probados.

La preparación líquida para administración parenteral, incluyendo soluciones, emulsiones y suspensiones acuosas y no acuosas esterilizadas, puede prepararse utilizando diluyentes tales como agua, alcohol etílico, propilenglicol, polietilenglicol, alcohol isoestearílico etoxilado, alcohol isoestearílico polioxilado, ésteres de ácido graso con polioxietilensorbitán y aceites vegetales tales como el aceite de oliva. Además, pueden formularse ésteres orgánicos inyectables, tal como el oleato de etilo. Además, pueden añadirse también cualquiera de los solubilizantes, tampones, agentes humectantes, emulsionantes, agentes de suspensión, conservantes, dispersantes, etc. convencionales.

Varias formas galénicas farmacéuticas anteriores se esterilizan de manera rutinaria. Esta esterilización puede conseguirse por filtración a través de un filtro bacteriano, formulación de un biocida, irradiación o un tratamiento térmico. Además, éstas pueden proporcionarse en forma de composiciones sólidas esterilizadas que pueden disolverse de forma improvisada en agua esterilizada o en un medio esterilizable adecuado.

Para la preparación de las formas galénicas para administración rectal o vaginal, pueden emplearse vehículos farmacéuticos tales como polietilenglicol, manteca de cacao, alcoholes superiores, ésteres de alcohol superior, gelatina, glicéridos semisintéticos, etc.

Pueden prepararse pomadas tales como pastas, cremas y geles utilizando un diluyente tal como vaselina blanca, parafina, glicerol, derivados de celulosa, propilenglicol, polietilenglicol, silicona, bentonita y aceites vegetales tal como el aceite de oliva.

Las composiciones para administración transnasal o sublingual pueden prepararse de manera rutinaria utilizando un excipiente normal bien conocido.

Cuando sea necesario, las preparaciones farmacéuticas de la invención pueden enriquecerse con agentes colorantes, conservantes, perfumes, agentes saborizantes, edulcorantes y otros fármacos.

El método para la administración de dichas preparaciones farmacéuticas no está especialmente limitado pero puede seleccionarse según la forma galénica específica, la edad, sexo y otros factores del paciente, la gravedad de la enfermedad y otras variables. por ejemplo, los comprimidos, píldoras, soluciones, suspensiones, emulsiones, gránulos y cápsulas se administran por vía oral, mientras que los productos parenterales se administran por vía intravenosa, ya sea solos o mezclados con la glucosa, aminoácido u otra infusión convencionales o, si es necesario, se administran solos por vía intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraperitoneal. Los supositorios rectales se administran en el recto. Los supositorios vaginales se administran en la vagina; las preparaciones nasales se administran en las fosas nasales, las preparaciones sublinguales se administran por vía bucal y las pomadas se administran por vía tópica para la administración transdérmica del fármaco.

La dosificación de cualquiera de las preparaciones farmacéuticas anteriores no está limitada especialmente pero puede seleccionarse con buen criterio de entre un amplio intervalo según el efecto terapéutico esperado, el método de administración, la duración del tratamiento, los antecedentes del paciente tales como la edad y el sexo y otros factores. Generalmente, la dosis habitual recomendada de ingrediente activo está comprendida entre 0,01 \mug y 10 mg/día, preferentemente entre aproximadamente 0,1 \mug y 1 mg/día, por kg del peso corporal del paciente. La dosis anterior puede administrarse una vez al día o en 2 o más dosis divididas.

Además, como se apunta en el ejemplo de investigación que se presentará a continuación en la presente memoria, la expresión del gen de la invención ha desaparecido o disminuido en el lóbulo temporal de los pacientes con enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, construyendo un vector de expresión arbitrario que alberga la totalidad o parte del gen de la invención e introduciendo el vector de expresión en el tejido del lóbulo temporal para la expresión forzada del gen en el tejido, pueden inhibirse cambios neurodegenerativos incluyendo una atrofia excesiva de neuronas en el lóbulo temporal y, por consiguiente, puede interrumpirse la evolución de la enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, la presente invención proporciona además una composición farmacéutica para la terapia génica (agente terapéutico génico) que posee dicha acción inhibidora de la neurodegeneración.

La presente invención proporciona además del vector de expresión anterior o del vector para la terapia génica, células transfectadas con el gen de la invención mediante la introducción de dicho vector, y una composición farmacéutica para la terapia génica que comprende alguno de los anteriores como componente activo.

La terapia génica que utiliza dicho agente terapéutico génico se realiza administrando por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo constituido por el vector para la introducción y expresión del gen de la invención y células transfectadas con el gen de la invención mediante la introducción de dicho vector en las neuronas del cerebro o en el tejido del lóbulo temporal de un paciente con enfermedad neurodegenerativa. Mediante dicho procedimiento, pueden inhibirse los cambios neurodegenerativos en dicho tejido y pueden aliviarse los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la isquemia cerebral, etc.

La terapia génica se describe a continuación con mayor detalle. En la ejecución siguiente de una terapia génica, pueden emplearse técnicas químicas, biológicas moleculares, microbiológicas, de ADN recombinante, genéticas e inmunológicas a menos que se especifique de otra manera. Estas técnicas están descritas, entre otros, en Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory), Cold Spring Harbor, Nueva York (1982)), Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory), Cold Spring Harbor, Nueva York (1981)), Ausbel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Nueva York (1992)), Glover, D., DNA Cloning, I y II (Oxford Press (1985)), Anand, Techniques for the Analysis of Complx Genomes (Academic Press (1992), Guthrie, G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press (1991)), y Fink, et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19 (1992).

La terapia génica puede realizarse utilizando un vector para terapia génica que alberga la totalidad o parte del gen de la invención o células transfectadas con el gen de la invención mediante la introducción de dicho vector. Esta terapia génica puede ser, por ejemplo, un procedimiento de aporte del gen LY6H o de su función a las células en las que dicho gen no se ha expresado. Mediante dicha terapia génica, se inhibe la neurodegeneración alrededor de la célula receptora/célula diana.

Puede introducirse en las células el gen de la invención o un fragmento del gen mediante un vector adaptado para mantener el gen de manera extracromosómica. En tales casos, el gen determinado puede dar lugar a que sea expresado por las células desde una posición extracromosómica. Además, cuando el gen LY6H debe expresarse introduciendo un fragmento del gen en el punto del lóbulo temporal del sistema nervioso del cerebro donde no se encuentra la expresión del gen, el fragmento concreto del gen puede ser un fragmento que codifique una parte de la proteína LY6H que es necesaria para la supervivencia o el crecimiento no tumorígeno de las células.

El vector de transferencia génica puede ser cualquiera de los diversos vectores conocidos en los que el gen de la invención se ha subclonado tal como se describirá más adelante en la presente memoria.

La introducción del vector de transferencia génica en la célula diana puede efectuarse fácilmente mediante la tecnología demostrada de introducción de ADN en varias células conocida por los expertos en la materia, tales como la electroporación, transfección con fosfato cálcico (coprecipitación), transducción de virus y otras técnicas. Las células transfectadas con el gen de la invención pueden utilizarse como fármaco para los trastornos neurodegenerativos del cerebro, incluyendo un inhibidor de atrofia prematura del sistema nervioso cerebral, o como modelos para investigación terapéutica.

Como se mencionó anteriormente, el gen o fragmento del gen de la invención introducido por terapia génica según la invención aumenta la expresión del producto génico correspondiente en el nervio del cerebro o en el tejido circundante para inhibir por esta razón la atrofia del nervio del cerebro en el tejido que expresa el gen. Dicha terapia génica puede aplicarse ventajosamente en el tejido neuronal del cerebro en el que la expresión del gen LY6H o la proteína LY6H ha desaparecido así como en el tejido neuronal del cerebro en el que el nivel de expresión de dicho gen ha disminuido.

La terapia génica según la presente invención se realiza de la forma siguiente. En primer lugar, se realiza una identificación de pacientes candidatos para la terapia génica registrando un tomograma computerizado (CT) con la posición de exploración fija en el lóbulo temporal del paciente con demencia de tipo Alzheimer o enfermedad de Alzheimer para comprobar la atrofia del lóbulo temporal o la evolución de la atrofia.

A continuación, para conseguir la expresión del gen de la invención, se crea LY6HARNm intracelular en la célula diana y se activa la traducción para acelerar la expresión del gen LY6H. Con este propósito, se produce preferentemente un oligonucleótido transcrito correspondiente al ARNm del gen y se suministra a la célula diana. Al proporcionar la célula con la actividad para activar la expresión del gen LY6H mediante la terapia génica anterior, puede inhibirse la alteración neurodegenerativa en la célula receptora del cerebro/célula diana.

Según la terapia génica anterior que utiliza dicho oligonucleótido transcrito, la inhibición objetiva de la alteración neurodegenerativa del cerebro y ulterior alivio o interrupción posterior de la evolución de los síntomas neurodegenerativos pueden conseguirse con éxito subclonando el gen LY6H en un retrovirus, adenovirus o vector derivado de AAV e infectando las células nerviosas del cerebro diana con el vector para producir de este modo la expresión del oligonucleótido transcrito.

Cuando se introduce un oligonucleótido transcrito del gen de la invención en el interior de la neurona o tejido cerebral para aumentar la expresión de la proteína LY6H, el oligonucleótido transcrito no necesita ser el nucleótido completo del gen LY6H sino que puede ser el producto de la modificación siempre que conserve una función sustancialmente idéntica a la función del gen precursor y active la expresión del gen LY6H o un fragmento del gen que comprende una secuencia parcial que conserva dicha función.

Los vectores que pueden utilizarse para introducir un gen objetivo tanto para la recombinación del ADN como para el mantenimiento del gen extracromosómico son ya conocidos en la técnica y puede utilizarse cualquiera de dichos vectores conocidos en la práctica de la invención. Por ejemplo, puede utilizarse como dicho vector un virus o vector del plásmido que incluya una copia del oligonucleótido transcrito del gen LY6H ligado al elemento para el control de la expresión y sea capaz de expresar el producto del oligonucleótido transcrito en la célula diana. Cualquiera de los vectores de expresión mencionados anteriormente pueden emplearse normalmente pero los preferidos son los vectores construidos utilizando cualquiera de los vectores descritos en las patentes US nº 5.252.479 y WO 93/07282 (específicamente pWP-7A, pWP-19, pWU-1, pWP-8A, pWP-21 y/o pRSVL) o el pRC/CMV (Invitrogen) como vector original. Son todavía más preferidos diversos vectores de virus descritos a continuación en la presente memoria.

Como activador para su utilización en el vector para la terapia génica, se emplean preferentemente aquellos activadores, que son intrínsecos a los tejidos afectados para ser tratados en varias enfermedades. Ejemplos de activadores son la albúmina, \alpha-fetoproteína, \alpha1-antitripsina, transferrina y transtirretina para el hígado, y anhidrasa carbónica I y antígeno carcinoembrionario para el colon. Cuando los tejidos afectados son el útero y la placenta, pueden ponerse como ejemplo estrógeno, aromatasa, citocromo P450, enzima P450 de escisión de la cadena lateral del colesterol y 17\alpha-hidroxilasa P450.

Para la próstata, a título de ejemplo pueden ser los antígenos específicos de la próstata, el gen gp91-fox y la calicreína específica de la próstata. Para la mama, a título de ejemplo puede ser erb-B2, erb-B3, \beta-caseína, \beta-lactoglobina y proteína de suero. Para los pulmones, pueden ser a título de ejemplo la proteína C tensioactiva y la uroglobulina. Para la piel, a título de ejemplo pueden ser K-14-queratina, queratina 1 humana y leuclina. Para el cerebro, a título de ejemplo pueden ser la proteína ácida fibrilar glial, la proteína madura específica de astrocitos, mielina, villina pancreática de tirosina hidroxilasa y el polipéptido amiloide de los islotes de Langerhans. Para el tiroides, a título de ejemplo pueden ser la tiroglobulina y la calcitonina. Para los huesos, a título de ejemplo pueden ser el \alpha1 colágeno, la osteocalcina y la sialoglucoproteína ósea. Para el riñón, a título de ejemplo pueden ser la renina, la fosfatasa alcalina de hígado, hueso, riñón y la eritropoyetina, y para el páncreas, a título de ejemplo pueden ser la amilasa y PAP1.

Además, en la producción de un vector para la introducción de un oligonucleótido transcrito, el oligonucleótido transcrito que debe introducirse (el que tiene una secuencia completa o parcial correspondiente a la secuencia del gen de la invención) puede prepararse fácilmente y adquirirse mediante técnicas de ingeniería genética normalizadas basadas en la información de la secuencia nucleotídica en el gen de la invención como se describió en la presente memoria anteriormente.

La transferencia de dicho vector para la introducción de un oligonucleótido transcrito en las células puede realizarse mediante varias técnicas ya conocidas en la materia, tales como electroporación, transfección con fosfato cálcico (coprecipitación), transducción vírica y similares. Las células transfectadas con dicho oligonucleótido transcrito, como tales y en forma aislada, tienen una acción inhibidora de la neurodegeneración del cerebro de modo que pueden utilizarse como fármaco, o como modelo de investigación terapéutica, para la inhibición o interrupción de la evolución de las lesiones neurodegenerativas también.

En terapia génica, el vector anterior para la introducción de un oligonucleótido transcrito puede inyectarse ya sea por vía tópica en el lóbulo temporal o en la zona circundante del paciente o por vía general. Además, puede cultivarse junto con las células madre y, a continuación, administrarse mediante inyección local o general. Mediante dicha administración, el vector puede introducirse en las células nerviosas del cerebro del paciente. En caso de que el gen transducido no se establezca de forma permanente en el cromosoma de cada célula diana, la administración puede repetirse periódicamente.

El procedimiento para la terapia génica según la invención incluye tanto la técnica in vivo que comprende la administración de un montaje para la introducción de dicho oligonucleótido transcrito (un vector de transferencia del oligonucleótido transcrito) directamente en el cuerpo y la técnica ex vivo que comprende la transferencia del gen en las células madre cultivadas y, tras el cultivo, el trasplante o de otro modo la introducción de las células en el cuerpo del paciente. También es factible una terapia génica que comprende la introducción de dicho oligonucleótido transcrito directamente en la célula.

Las células diana dentro de las cuales debe introducirse el oligonucleótido transcrito del gen de la invención pueden seleccionarse con buen criterio según el objetivo de la terapia génica (tratamiento). Por ejemplo, las células diana incluyen neuronas cerebrales y tejidos nerviosos del cerebro así como linfocitos, fibroblastos, hepatocitos y células hematopoyéticas.

El procedimiento de introducción del oligonucleótido transcrito en la terapia génica anterior incluye una técnica de introducción vírica y una técnica de introducción no vírica.

En cuanto a la técnica de introducción vírica, en consideración al hecho de que el oligonucleótido transcrito que debe transferirse es una sustancia extraña que se expresa especialmente en las células normales del cerebro, puede ponerse como ejemplo el procedimiento que utiliza un vector retrovírico, por ejemplo. Otros vectores víricos que pueden utilizarse incluyen el vector adenovírico, vector VIH (virus de inmunodeficiencia humana), el vector del virus adenoasociado (AAV), el vector del herpes virus, el vector del herpes virus simple (HSV) y el vector del virus de Epstein-Barr (EBV).

El procedimiento de construcción de un vector vírico para la transferencia de un oligonucleótido transcrito y el procedimiento para la transferencia del oligonucleótido transcrito a la célula diana o al tejido diana se describirán específicamente a continuación.

El sistema de vector retrovírico está constituido por un vector vírico y una célula auxiliar (concentrado de eritrocitos). La célula auxiliar significa una célula que ha expresado genes que codifican la proteína gag estructural (proteína estructural dentro de la partícula vírica), pol (transcriptasa inversa), env (proteína de recubrimiento), etc. de un retrovirus pero que no ha formado partículas víricas. Por otra parte, el vector vírico tiene la señal de concentración y LTR (repeticiones de la terminal larga) pero carece de genes estructurales, tales como gag, pol, env, etc., que son necesarios para la replicación del virus. La señal de concentración es una secuencia que funciona como un marcador en el conjunto de la partícula vírica. Los genes selectivos (neo, hyg) y el oligonucleótido transcrito objetivo ligado en el punto de clonación se insertan en lugar de los genes víricos. A fin de que un título alto de partículas víricas pueda obtenerse, es importante utilizarse una inserción tan corta como sea posible, proporcionar una señal de concentración amplia que incluya una parte de gen gag y tener cuidado de no dejar el ATG del gen gag.

A medida que el ADN del vector que alberga el oligonucleótido transcrito objetivo se transfiere a la célula auxiliar, el ARN genómico del vector es empaquetado por la proteína estructural del virus formada por la célula auxiliar, por lo cual las partículas víricas se forman y segregan. La partícula vírica como virus recombinante infecta la célula diana y, como resultado, la secuencia de ADN transcrita a la inversa del ARN genómico del virus se integra en el núcleo de la célula de modo que el gen transcrito insertado en el vector se expresa.

Puede emplearse una técnica que utiliza un fragmento de fibronectina que contiene el dominio de adherencia celular, el punto de fijación a la heparina y el segmento de conjugación [Hanenberg, H., et al., Exp. Hemat., 23, 747 (1995)], para aumentar la eficacia de la transferencia del gen objetivo.

Un ejemplo del vector retrovírico para su utilización en el sistema de vector retrovírico anterior es el retrovirus derivado del virus de la leucemia de ratón [McLachlin, J. R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)].

El procedimiento que utiliza un vector adenovírico se describirá con detalle a continuación. El vector adenovírico puede construirse según los procedimientos descritos en Berkner, K. L., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992), Setoguchi, Y., et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994), Kanegae, H. et al. [Jikken Igaku (Experimental Medicine), 12, 28-34 (1994)] y Ketner, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6186-6190 (1994).

Por ejemplo, para construir un vector adenovírico no proliferante, se escinde la zona primaria E1 y/o E3 del adenovirus en primer lugar. A continuación, un vector del plásmido que contiene la unidad de expresión del gen extraño deseada (constituido por el oligonucleótido transcrito que debe transferirse, el activador para la transcripción de dicho oligonucleótido transcrito, poli A para asegurar la estabilidad del gen transcrito) y una parte del ADN genómico del adenovirus y un plásmido que contiene el genoma adenovírico se utilizan para cotransfectar la célula 293, por ejemplo. A medida que se produce de este modo una recombinación homóloga entre ellos para la sustitución de la unidad de expresión génica por E1, se obtiene un vector adenovírico no proliferante como un vector que alberga el oligonucleótido transcrito objetivo. Un vector adenovírico con extremo 3' con una proteína terminal añadida puede construirse asimismo ligando el ADN genómico adenovírico en un vector del cósmido. Además, el vector YAC puede utilizarse asimismo para la construcción de un vector adenovírico.

A continuación se describe brevemente la producción de un vector de virus adenoasociado (AAV). Se descubrió AAV como un virus pequeño que contamina los sistemas de cultivo de adenovirus. En cuanto a este virus se refiere, se ha identificado la existencia del género Parvovirus capaz de proliferación autónoma en el interior de la célula hospedadora sin requerir un virus auxiliar para la replicación vírica y el género Dependovirus que requiere un virus auxiliar. Este AAV tiene un intervalo amplio de hospedador y es uno de los virus normales que infectan varios tipos de células. El genoma del virus es un ADN lineal monocatenario constituido por 4.680 nucleótidos, teniendo los 145 nucleótidos en ambos extremos una secuencia característica conocida como ITR (repetición terminal invertida). Esta zona ITR funciona como origen de replicación y desempeña la función de cebador. Esta ITR es también esencial para la concentración de partículas de virus y la integración de AAV dentro del ADN cromosómico de la célula hospedadora. Con respecto a la protección del virus, la mitad izquierda del genoma codifica la proteína no estructural, que es la proteína reguladora Rep que controla la replicación y la transcripción.

La construcción del AAV recombinante puede realizarse utilizando la propiedad de AAV para integrarse dentro del ADN cromosómico, con lo cual puede prepararse el vector de transferencia del gen deseado. Este procedimiento puede describirse con detalle de la forma siguiente. En primer lugar, se construye un plásmido (plásmido del vector AAV) que conserva las ITR en los extremos 5' y 3' del AVV natural y que alberga el oligonucleótido transcrito que debe transferirse interpuesto entre éstos. La proteína del virus necesaria para la replicación del virus y la formación de partículas de virus se suministra desde un plásmido auxiliar independiente. Es necesario asegurar que no existe ninguna secuencia nucleotídica común entre los dos plásmidos de modo que el virus natural no aparezca en la recombinación del ADN. A continuación, se transfieren los dos plásmidos dentro de la célula 293 por transfección, por ejemplo, y, además, las células se infectan con un adenovirus como virus auxiliar (cuando se utiliza la célula 293, este adenovirus puede ser uno no proliferante), con lo cual se produce el AVV recombinante no proliferante deseado. Dado que este AVV recombinante está presente en el núcleo, las células se someten a congelación-descongelación y se recuperan y el adenovirus contaminante se inactiva calentando a 56ºC. A continuación, cuando sea necesario, el AAV recombinante se separa y se concentra por ultracentrifugación utilizando cloruro de cesio. De esta manera, puede obtenerse el AAV recombinante deseado para la transferencia génica.

La producción de un vector de EBV puede realizarse por el procedimiento de Shimidzu et al. [Shimidzu, N., SAIBO KOUGAKU (Cell Technology, 14(3), 280-287 (1995)].

A continuación se describe brevemente la producción del vector de EBV para la transferencia del oligonucleótido transcrito según la invención. El virus de EB (virus Epstein-Barr) es un virus de la familia Herpesviridae, que fue aislado por primera vez por Epstein y colaboradores en células cultivadas procedentes de linfoma de Burkitt [Kieff, E. y Liebowitz, D.: Virology, 2ª ed. Raven Press, Nueva York, 1990, págs. 1889-1920]. Este EBV presenta actividad transformadora de células y para utilizarlo como vector para transferencia génica, es necesario preparar un virus desprovisto de esta actividad transformadora. Esto puede realizarse de la forma siguiente.

De este modo, en primer lugar, se clona el genoma del EBV en la proximidad del ADN diana en la que el gen extraño deseado debe insertarse. A continuación, un fragmento de ADN del gen extraño y un gen resistente a fármacos se insertan para construir un vector destinado a la preparación de un virus recombinante. A continuación, el vector para la preparación de un virus recombinante escindido con una enzima de restricción adecuada se transfiere a células Akata positivas para EBV. El virus recombinante formado por recombinación homóloga se recupera junto con el EBV Akata natural, mediante estimulación de la producción del virus por tratamiento con inmunoglobulina antisuperficial. El virus recombinante se infecta para las células Akata negativas a EBV, en presencia de un fármaco, se seleccionan clones resistentes, por lo cual las células Akata infectadas exclusivamente con el virus recombinante exento de EBV natural pueden obtenerse. Además, al inducir actividad vírica en las células Akata infectadas con virus recombinante, el vector del virus recombinante objetivo puede producirse en grandes cantidades.

El procedimiento que consiste en introducir el gen objetivo en la célula diana o en el tejido diana en la terapia génica de la invención incluye los dos procedimientos representativos siguientes.

El primer procedimiento comprende recoger las células diana de un paciente que ha de ser tratado, cultivar las células ex vivo, por ejemplo con adición de interleucina-2 (IL-2) o similares, para transferir el oligonucleótido transcrito objetivo albergado en el vector retrovírico, y retrasplantar las células resultantes (procedimiento ex vivo). Este procedimiento es adecuado para la terapia de enfermedades genéticas producidas, por ejemplo, por genes defectuosos y cáncer.

El segundo procedimiento es un procedimiento para la transferencia génica directa que comprende inyectar el oligonucleótido transcrito objetivo directamente en el cuerpo del paciente o la secuencia diana tal como el tejido cerebral (procedimiento directo).

Más específicamente, el primer procedimiento puede realizarse, por ejemplo, de la manera siguiente. De esta manera, las células mononucleares, tales como las células madre, recogidas del paciente se separan de manera fraccionada de los monocitos utilizando un clasificador de sangre y se cultivan en presencia de IL-2 en un medio adecuado tal como el medio AIM-V durante aproximadamente 72 horas, seguido de adición del vector que alberga el oligonucleótido transcrito que va a introducirse. Para aumentar la eficacia de transferencia del oligonucleótido transcrito, las células pueden cultivarse en presencia de protamina a 32ºC durante 1 hora, centrifugarse a 2.500 ppm y a continuación cultivarse en dióxido de carbono gas al 10% a 37ºC durante 24 horas. Después se repite este procedimiento unas pocas veces, las células se cultivan más en presencia de IL-2 en, por ejemplo, medio AIM-V durante 48 horas y a continuación se lavan con solución salina. Se hace el recuento de células viables y se evalúa la eficacia de la introducción del oligonucleótido transcrito mediante dicha PCR in situ o, cuando el objetivo es la actividad enzimática, analizando el grado de actividad enzimática.

Las comprobaciones de seguridad tales como el cultivo de bacterias y hongos en células cultivadas, comprueban la presencia o ausencia de infección del micoplasma, la búsqueda de endotoxina, etc. se realizan para confirmar la seguridad. A continuación, las células transformadas con la dosis eficaz prevista del oligonucleótido transcrito se retornan al paciente mediante inyección intravenosa por goteo. El procedimiento anterior se repite a intervalos de varias semanas o unos pocos meses hasta consumar la terapia génica.

La dosis del vector vírico se selecciona con buen criterio según la célula diana. La dosis preferida normalmente puede ser por ejemplo entre 1\times10^{3} cfu y 1\times10^{8} cfu desde el punto de vista del título vírico por 1\times10^{8} células diana.

Puede adoptarse una versión alternativa del primer procedimiento anterior que comprende el cultivo conjunto de las células productoras de virus con el vector retrovírico que alberga el oligonucleótido transcrito objetivo y las células del paciente para por esta razón introducir el oligonucleótido transcrito en el interior de las células diana.

Al realizar el segundo procedimiento (procedimiento directo) para la terapia génica, es particularmente preferido realizar un experimento preliminar ex vivo para comprobar si el oligonucleótido transcrito objetivo puede introducirse realmente mediante procedimiento de transferencia génica realizando la PCR del ADNc del gen vector o la PCR in situ o comprobar si el efecto terapéutico deseado, por ejemplo, la elevación de una actividad específica o el crecimiento o inhibición del crecimiento de la célula diana puede conseguirse realmente mediante la introducción del oligonucleótido transcrito objetivo. Además, cuando se utiliza un vector vírico, es, desde luego, de gran importancia confirmar la seguridad de la introducción del oligonucleótido transcrito en terapia génica realizando una búsqueda por PCR del retrovirus proliferante y similares, determinando la actividad de transcriptasa inversa o controlando el gen (env) de la proteína de recubrimiento por la técnica RCR.

La terapia génica de la invención en la enfermedad de Alzheimer, demencia de tipo Alzheimer o enfermedad de Parkinson puede ser por ejemplo una terapia de enfermedad neurodegenerativa que comprenda recoger células madre o células nerviosas del cerebro del paciente, crear una línea celular cultivada mediante tratamiento enzimático o similar, introducir el oligonucleótido transcrito objetivo en las células nerviosas del cerebro diana utilizando AAV o similares, realizar una identificación con células G418, medir la cantidad de expresión de IL-12 o similares in vivo, proporcionar un tratamiento de radiación, e inocular las células en el tejido cerebral del paciente o en el punto del lóbulo
temporal.

La presente invención proporciona además una composición o preparación farmacéutica (un agente terapéutico génico) que comprende un vector de transferencia del oligonucleótido transcrito de la invención o una línea celular transformada con el oligonucleótido transcrito como ingrediente activo en una cantidad farmacológicamente eficaz en combinación con un vehículo o diluyente farmacéutico no tóxico adecuado.

El vehículo farmacéutico que puede utilizarse en la composición farmacéutica (preparación farmacéutica) de la invención incluye los diluyentes o excipientes, p. ej. cargas, agentes de esponjamiento, aglutinantes, humectantes, disgregadores, tensioactivos, lubricantes, etc., que se emplean normalmente dependiendo del modo de utilización de dicha composición, y éstos pueden utilizarse selectivamente según la forma galénica unitaria contemplada de la preparación.

La forma galénica unitaria de la preparación farmacéutica de la invención puede ser la misma mencionada para la preparación del polipéptido de la invención, y puede seleccionarse una adecuada con buen criterio según el objetivo terapéutico.

El procedimiento terapéutico y profiláctico para la enfermedad neurodegenerativa según la invención se describe con detalle a continuación. La presente invención proporciona un procedimiento para la terapia de enfermedades neurodegenerativas, tal como la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la isquemia cerebral, la enfermedad de Parkinson y enfermedades similares en las que está implicado un exceso o defecto del polipéptido LY6H. Cuando la actividad de LY6H es excesiva, pueden considerarse varias estrategias. El primer procedimiento comprende administrar un compuesto inhibidor (antagonista) en una cantidad eficaz para inhibir la función del polipéptido LY6H bloqueando su fijación a un ligando, sustrato, receptor, enzima o similares o inhibiendo una señal secundaria en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable para mejorar de esta forma un estado anormal. Un método alternativo comprende administrar un polipéptido LY6H en forma soluble capaz de unirse a un ligando, sustrato, enzima, receptor o similares en competición con la LY6H endógena. El ejemplo típico de dicha sustancia competitiva incluye un fragmento de polipéptido LY6H. En otro procedimiento, puede administrarse un polipéptido LY6H en forma soluble capaz de unirse a un ligando en competición con LY6H endógeno. Un ejemplo típico de dicha sustancia competitiva incluye un fragmento del polipéptido LY6H.

En otro procedimiento todavía, la expresión del gen que codifica el polipéptido LY6H endógeno puede inhibirse aplicando una técnica de inhibición de la expresión al producto génico LY6H. La técnica conocida de este tipo incluye la utilización de una secuencia complementaria generada internamente o administrada por separado [p. ej. Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988), O'Connor, J. Neurochem 56: 560 (1991)]. Como procedimiento alternativo, puede suministrarse un oligonucleótico capaz de formar una triple hélice con el gen [p. ej. Lee et al., Nucleic Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251 : 1360 (1991)]. Estos oligómeros pueden administrarse como tales o los oligómeros relacionados pueden producirse para ser expresados in vivo.

Para la terapia de los síntomas anormales relacionados con una infraexpresión de LY6H y su actividad, pueden utilizarse varios procedimientos. El primer procedimiento comprende administrar un compuesto capaz de activar LY6H (agonista) en una cantidad terapéuticamente eficaz junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable a un paciente para mejorar de este modo los síntomas anormales. En otro procedimiento, la producción endógena de LY6H por células relacionadas en el paciente puede ponerse en servicio por terapia génica. Por ejemplo, el polinucleótido de la invención puede manipularse de modo que se exprese con un vector retrovírico defectuoso como se mencionó anteriormente en la presente memoria. A continuación, se aísla este montaje de la expresión del retrovirus y se introduce en concentrado de eritrocitos transducido con un vector del plásmido retrovírico que alberga el ARN que codifica el polipéptido de la invención de modo que el concentrado de eritrocitos forme partículas víricas infecciosas que contengan el gen objetivo. Estas células productoras se administran al paciente para la manipulación in vivo de las células de modo que el polipéptido pueda expresarse in vivo. Para una visión general de la terapia génica, se hace referencia a Human Molecular Genetics, T. Strachan y A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996), capítulo 20 - Gene Therapy and Other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, inclusive de las referencias específicas citadas en la presente memoria. Un procedimiento alternativo comprende administrar una dosis terapéutica de polipéptido LY6H en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado.

Las células pueden formularse por ejemplo en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), solución de Ringer o inyección de composición intracelular o en una forma galénica tal que puedan ser administradas en combinación con una sustancia conductora para un aumento de la eficacia de la transferencia génica, tal como la protamina.

El procedimiento de administrar la preparación farmacéutica anterior no está específicamente limitado pero puede crearse un régimen adecuado según la forma galénica concreta, la edad, sexo y otros factores del paciente, la gravedad de la enfermedad y similares.

La cantidad de ingrediente activo que debe incorporarse en la preparación farmacéutica y la dosis no están especialmente limitadas pero cada una puede seleccionarse libremente de entre un amplio intervalo según el beneficio terapéutico esperado, el método de administración, la duración del tratamiento, los antecedentes del paciente incluyendo edad y sexo y otras variables.

Generalmente, la dosis de vector retrovírico que alberga el oligonucleótido transcrito como preparación farmacéutica puede ser por ejemplo de aproximadamente 1\times10^{3} pfu a 1\times10^{15} pfu desde el punto de vista del título retrovírico por kilogramo de peso corporal al día.

En el caso de las células que llevan el oligonucleótido transcrito para la introducción, la dosis puede seleccionarse propiamente de entre el intervalo comprendido entre aproximadamente 1\times10^{4} células/peso corporal y 1\times10^{15} células/peso corporal.

La preparación anterior puede administrarse una vez al día o en unas pocas divididas al día, o incluso intermitente a intervalos de 1 o varias semanas. Preferentemente, puede administrarse en combinación una sustancia conductora para una eficacia de transferencia génica aumentada, tal como una protamina, o una preparación que contenga la misma.

Cuando la terapia génica según la invención se aplica a la terapia de una enfermedad neurodegenerativa, puede realizarse en una combinación adecuada con otras terapias génica (terapia génica conjuntiva) o en combinación con una farmacoterapia que utiliza un inhibidor de acetilcolinesterasa o similar y/o una terapia de rehabilitación. La terapia génica de la invención puede realizarse con referencia a las orientaciones de NIH, inclusive de su aspecto de seguridad [Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)].

Además, según la invención, con el fin de detectar la presencia del gen LY6H, es posible preparar una muestra biológica tal como sangre o suero, opcionalmente extraer el ácido nucleico y analizar el gen LY6H.

El procedimiento de detección del gen puede comprender preparar un fragmento de ADN del gen de la invención y diseñarlo de modo que pueda utilizarse en la identificación del gen LY6H y/o su ampliación. Más específicamente, es posible construir un fragmento de ADN con las propiedades de una sonda para la hibridación en placa, hibridación de colonias, transferencia Southern, transferencia Northern, etc. o una sonda para la preparación de un ADN completo o parcial del gen de la invención ampliado mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) que amplíe una secuencia nucleotídica con una polimerasa. Para este fin, se prepara en primer lugar un cebador que tenga la misma secuencia que el gen LY6H. A continuación, este cebador se hace reaccionar, como sonda para identificación, con una muestra biológica (muestra de ácido nucleico) para comprobar la presencia de una secuencia concreta del gen LY6H. La muestra de ácido nucleico puede prepararse por alguna de las diversas técnicas que facilitan la detección de la secuencia diana, tales como la desnaturalización, digestión con enzima de restricción, electroforesis o transferencia de manchas.

Como procedimiento para dicha identificación, se prefiere especialmente la utilización de una técnica de PCR desde el punto de vista de la sensibilidad, y esta técnica no está especialmente limitada siempre que se utilice un fragmento del gen de la invención como cebador. Por lo tanto, pueden utilizarse cualquiera de las técnicas conocidas hasta el presente [Science, 230, 1350-1354 (1985)] y las versiones modificadas de PCR que se han desarrollado últimamente o se desarrollarán en el futuro [Sakaki, Yoshiyuki et al. (ed.), Jikken Igaku (Experimental Medicine), Suplemento 8(9) (1990), Yodosha; Protein, Nucleic Acid, Enzyme: suplemento especial, Kyoritsu Shuppan, 35(7) (1990)].

El fragmento de ADN para su utilización como cebador es un oligo-ADN sintetizado químicamente, y dicho oligo-ADN puede sintetizarse utilizando un sintetizador de ADN automático o similar, por ejemplo Pharmacia LKB Gene Assembler Plus (Pharmacia). La longitud preferida del cebador (cebador transcrito o cebador complementario) que debe sintetizarse puede ser por ejemplo de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos. La sonda para los autores en dicha identificación es normalmente una sonda marcada pero puede ser una no marcada, o la detección puede hacerse según el enlace específico a un ligando marcado directa o indirectamente. El marcador adecuado y el procedimiento de marcado de la sonda o ligando pertenecen a la técnica anterior. De este modo, el marcador de la técnica anterior incluye radioisótopos, biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes, enzimas, anticuerpos, etc., que pueden ser aceptados mediante procedimientos conocidos tales como traducción de la muestra, cebado aleatorio y tratamiento con cinasa.

La técnica PCR que debe utilizarse para la detección puede ser por ejemplo RT-PCR pero pueden utilizarse varias modificaciones de la técnica que son de uso rutinario en la materia.

Además, el procedimiento de análisis anterior puede realizarse convenientemente utilizando un kit de reactivos para detectar un gen LY6H en muestras.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un kit de reactivos de detección del gen LY6H que comprende un fragmento de ADN del gen de la invención.

Este kit de reactivos comprende por lo menos un fragmento de ADN que se hibrida con una parte del conjunto de la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 2 o su secuencia nucleotídica complementaria como componente esencial y puede opcionalmente contener otros componentes tales como un agente de marcado y reactivos de PCR (por ejemplo, Taq ADN polimerasa, trifosfatos de desoxinucleótido, cebadores, etc.).

El agente de marcado puede ser un radioisótopo o un producto químico modificador tal como una sustancia fluorescente, pero el fragmento de ADN como tal puede haber estado conjugado con dicho agente de marcado. Este kit de reactivos puede contener además un disolvente o diluyente de reacción adecuado, un anticuerpo normal, tampón, solución de lavado, solución de interruptor de la reacción, etc. que facilita la realización del análisis.

La presente invención en un aspecto adicional proporciona un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas que comprende la utilización del procedimiento de análisis anterior y un agente de diagnóstico o un kit de reactivos de diagnóstico para su utilización en la práctica de dicho procedimiento.

Mediante el secuenciado directo o indirecto de los genes LY6H obtenidos de las muestras de ensayo utilizando el procedimiento anterior, es posible descubrir nuevos genes relacionados con el gen LY6H que tengan mucha homología con el gen LY6H natural.

Por consiguiente, la presente invención proporciona además un método de cribado de genes relacionados con el gen LY6H humano en muestras que comprende la realización de dicho análisis y el secuenciado de los genes LY6H contenidos en las muestras de análisis.

El LY6H natural y/o el LY6H mutante pueden determinarse utilizando la proteína codificada por el gen LY6H humano de la invención (un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1), un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia presentada en SEC. ID. nº: 1 mediante la deleción, sustitución o adición de 1 o varios aminoácidos, un fragmento de uno de ellos, o un anticuerpo contra cualquiera de dichas proteínas.

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento de determinación de un LY6H antinatural y/o un anticuerpo de LY6H mutante o un procedimiento de determinación del antígeno. Mediante este procedimiento, puede detectarse el grado de alteración del nervio cerebral a partir de un cambio en el LY6H natural (polipéptido). Dichos cambios pueden detectarse mediante el secuenciado de LY6H por la tecnología muy demostrada descrita anteriormente en la presente memoria, más preferentemente detectando las diferencias en el polipéptido LY6H o la presencia o ausencia del polipéptido LY6H mediante la utilización de dicho anticuerpo (anticuerpo policlonal o monoclonal).

El siguiente es un ejemplo específico de determinación de dicho LY6H natural y/o mutante. El anticuerpo antiLY6H puede utilizarse para inmunoprecipitar el polipéptido LY6H en una solución que contiene una muestra biológica extraída de un cuerpo humano, tal como sangre o suero o puede hacerse reaccionar con el polipéptido LY6H en gel de poliacrilamida de transferencia Western o inmunotransferencia. El polipéptido LY6H en una sección de parafina o muestra de tejido congelado puede detectarse mediante una técnica inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo antiLY6H. La tecnología de producción y purificación de anticuerpos son bien conocidas en la materia y son técnicas adecuadas que pueden emplearse selectivamente.

La tecnología preferida aplicable a la detección de un LY6H natural o de un mutante del mismo incluye el ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), análisis inmunorradiométrico (IRMA) y análisis inmunoenzimométrico (IEMA) con una técnica sandwich que utiliza un anticuerpo monoclonal y/o un anticuerpo policlonal.

La invención proporciona además un ligando LY6H o un receptor LY6H que existe en una fracción de la membrana celular o en una superficie celular y que presenta afinidad de unión para el polipéptido LY6H. El receptor de LY6H puede obtenerse conjugando un polipéptido LY6H marcado en una muestra biológica que contiene una fracción de la membrana celular, extrayendo, aislando y purificando el producto de la conjugación e identificando la secuencia de aminoácidos del producto aislado. El procedimiento para la preparación y el método de secuenciado de este polipéptido receptor de LY6H es obvio para un experto en la materia.

Además, aplicando el receptor LY6H o un fragmento del mismo a una identificación de varios fármacos, la invención permite seleccionar varios compuestos (que reaccionan con el receptor de LY6H, incluyendo compuestos de bajo peso molecular, compuestos de alto peso molecular, proteínas, fragmentos de proteínas, antígenos, anticuerpos, etc.). Preferentemente, el receptor de LY6H se utiliza en conjunto. El polipéptido receptor LY6H o un fragmento del mismo para su utilización en dicha identificación puede haber sido inmovilizado sobre una matriz sólida o ser una sustancia libre en una solución que debe ser transportada a la superficie de la célula.

Un ejemplo de la identificación farmacéutica anterior es un sistema de identificación en el que las células hospedadoras procarióticas o eucarióticas transformadas de forma estable con un ADN recombinante que codifica un polipéptido LY6H, o un fragmento del mismo, se utilizan preferentemente en un análisis de fijación competitivo. Como alternativa, dichas células hospedadoras, tanto en forma libre o inmovilizada, se utilizan en el análisis de fijación normalizado. Más específicamente, la identificación farmacéutica anterior puede comprender hacer reaccionar el polipéptido receptor LY6H, o un fragmento del mismo, con el polipéptido LY6H, o un fragmento del mismo, en presencia de un fármaco experimental, que produzca la formación de un complejo y detectar el grado de inhibición de la formación del complejo mediante el fármaco experimental anterior.

Así, según la invención, puede proporcionarse un procedimiento de cribado farmacéutico que comprende poner en contacto un fármaco experimental con el polipéptido receptor LY6H, o un fragmento del mismo y, a continuación, detectar la presencia del complejo resultante o la presencia de un complejo del polipéptido receptor LY6H, o un fragmento del mismo, con un ligando mediante una técnica conocida por sí misma. Además, analizando la actividad del receptor LY6H, es posible evaluar si un fármaco experimental es capaz de antagonizar el receptor LY6H y por consiguiente puede modificar la actividad de LY6H definida anteriormente, es decir puede ser capaz de modular el crecimiento de neuronas, o modular la conjugación proteína-proteína o la actividad formadora del complejo. En dicho ensayo de fijación competitivo, se marca el polipéptido receptor LY6H, o un fragmento del mismo. Cuando el polipéptido receptor LY6H o un fragmento del mismo se separa del complejo proteína-proteína y se mide la cantidad de marcado de la sustancia libre (que no forma complejo), el valor medido sirve como canon de la fijación de factor de la prueba para el receptor LY6H. El valor medido sirve también como medición de la inhibición de la fijación del receptor LY6H al polipéptido LY6H. Analizando un péptido pequeño (pseudopéptido) del polipéptido LY6H de esta manera, el fármaco experimental puede analizarse como una sustancia con actividad antagonizante del receptor LY6H.

Otro protocolo para la identificación farmacéutica según la invención es el de la identificación de un compuesto que presenta una afinidad de unión adecuada para el polipéptido receptor LY6H. En resumen, este procedimiento comprende sintetizar un gran número de diferentes compuestos del péptido de la prueba en un soporte sólido tal como la superficie de un alfiler de plástico u otro mineral, haciendo reaccionar los compuestos del péptido de ensayo con el polipéptido receptor LY6H y, después de lavar, detectar los productos de reacción de unión del polipéptido receptor LY6H por un procedimiento conocido [p. ej. publicación de patente PCT nº WO 84-03564]. El receptor LY6H purificado puede recubrirse directamente en la placa que debe utilizarse en dicho método de cribado farmacéutica. El anticuerpo puede capturarse con un anticuerpo no neutralizante contra el polipéptido y el polipéptido receptor LY6H inmovilizarse en una fase sólida.

La invención se refiere además a la utilización de un análisis de identificación farmacéutica competitivo. Para la fijación al polipéptido receptor LY6H, o a un fragmento del mismo, un anticuerpo neutralizante capaz de fijación específica al polipéptido receptor LY6H se hace que compita con el compuesto experimental. Mediante dicha reacción competitiva con el anticuerpo neutralizante, puede detectarse la presencia de cualquier péptido que tenga uno o más determinantes antigénicos del polipéptido receptor LY6H.

Como método adicional para la identificación farmacéutica, el polipéptido LY6H de la invención o el producto génico LY6H de la invención pueden utilizarse para la identificación de compuestos que activen (agonistas) o inhiban (antagonistas o inhibidores) la actividad del polipéptido LY6H o del producto génico LY6H.

Utilizando el polipéptido LY6H o el producto génico LY6H de la invención, pueden identificarse agonistas o antagonistas de las células, preparaciones exentas de células, bancos químicos y composiciones naturales. Estos agonistas o antagonistas pueden ser sustratos naturales o modificados, ligandos, enzimas o receptores del polipéptido LY6H de la invención o copias estructurales o funcionales del polipéptido de la invención [Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), capítulo 5 (1991)].

Los estudios de hibridación in situ pusieron de manifiesto la expresión del gen LY6H de la invención en varios tejidos del cerebro normal humano, a niveles particularmente altos en el hipocampo y corteza cerebral endorrinal que normalmente están gravemente alterados en los pacientes de Alzheimer, y se ha observado que su nivel de expresión está considerablemente deprimido en el lóbulo temporal incluyendo el hipocampo y la corteza endorrinal de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, es muy probable que este gen esté asociado al comienzo y la evolución de dicha enfermedad.

Por consiguiente, un agonista o antagonista de esta proteína LY6H o un producto génico LY6H es de esperar que encuentren aplicación como fármaco terapéutico o profiláctico para enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la isquemia cerebral y la enfermedad de Parkinson.

Los compuestos que pueden obtenerse mediante la identificación de fármacos experimentales para dichas enfermedades relacionadas con el gen LY6H presentan las funciones de la proteína de la invención (el producto de expresión del gen de la invención), tales como la acción de soporte para supervivencia neuronal, la acción de alargamiento de nervios, la acción de regeneración de nervios, la acción de activación de neuroglía, etc. en los sistemas nerviosos central y otros y la acción nemónica del cerebro (formación de la memoria), entre otras acciones fisiológicas, y, por consiguiente, puede utilizarse como fármaco terapéutico o profiláctico para varias enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la isquemia cerebral y la enfermedad de Parkinson. Por consiguiente, las proteínas de la invención (incluyendo los productos de expresión génica, los péptidos parciales de los mismos y las sales de los mismos) son de utilización como reactivos para la identificación de compuestos que activan las funciones de la proteína de la invención.

La invención proporciona un método de cribado para los compuestos que activan las funciones de la proteína de la invención (en adelante cada una se denominará a veces potenciador funcional de la proteína de la invención). Más específicamente, la invención proporciona (a) un método de cribado para un potenciador funcional de la proteína de la invención que comprende poner en contacto (1) la proteína de la invención con las células nerviosas o un tejido nervioso por una parte y (2) la proteína y un compuesto de ensayo con dichas células o tejido nervioso por otra parte y comparar los resultados y (b) un método de cribado para un potenciador funcional de la proteína de la invención que comprende administrar (1) la proteína de la invención a un vertebrado por una parte y (2) la proteína de la invención y un compuesto de ensayo al vertebrado por otra parte y comparar los resultados.

Más específicamente, en el método de identificación anterior (a), una actividad fisiológica en los sistemas nervioso central u otro, tal como la actividad neuronal de soporte para supervivencia, la actividad de estiramiento de nervios, la actividad de regeneración de nervios o la actividad activadora de neuroglía, se mide en las condiciones (1) y (2) anteriores y se comparan los resultados. En el método de identificación (b), la actividad nemónica (formadora de memoria) en el cerebro, por ejemplo, se mide en dichas dos condiciones (1) y (2) y se comparan los resultados.

Las células nerviosas (neuronas y neuroglía) para su utilización en la identificación anterior incluyen las células de neuroblastoma, células de glioma y sus células de hibridoma (p. ej. células N18TG-2, IMR-32, GOTO (p. ej. GOTO-P3), NB1, C6BU-1, U251, KNS42, KNS81 y células NG108-15, y células PC12 que tienen una potencia de diferenciación de células nerviosas). El tejido nervioso que puede utilizarse incluye la célula neuroepitelial de ratón, la célula de cultivo primario de hipocampo de rata, la célula de Prukinje del cultivo de ratón fetal y los ganglios de la raíz dorsal de ratón. El compuesto de ensayo incluye péptidos, proteínas, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos, productos de fermentación, extractos celulares, extractos vegetales, extractos de tejido animal y plasma. Estos compuestos pueden ser compuestos nuevos o compuestos conocidos.

Al realizar dicho procedimiento (a) de identificación, la proteína de la invención (incluyendo uno de sus péptidos parciales o una de sus sales) se disuelve o se pone en suspensión en un tampón de identificación para preparar una muestra de la proteína de la invención. El tampón puede ser cualquier solución de tampón que no interfiera con el contacto entre la proteína de la invención y la célula o tejido nervioso (p. ej. tampón fosfato, tampón Tris-HCl, etc. a un pH aproximadamente de 4 a 10, preferentemente a un pH aproximadamente entre 6 y 8). La duración del contacto normalmente es aproximadamente entre 1 y 10 días, preferentemente aproximadamente entre 7 y 10 días. La temperatura de contacto normalmente es de aproximadamente 37ºC. Las actividades de la proteína de la invención en los sistemas nerviosos central u otro, tales como la actividad neuronal de soporte a la supervivencia, de la actividad de estiramiento de nervios, la actividad de regeneración de nervios y la actividad activadora de la neuroglía, pueden determinarse por los procedimientos de rutina tal como una evaluación visual del alargamiento del axón, medición de la concentración del Ca^{2+} intracelular y similares.

Cualquier compuesto de ensayo que favorezca cualquiera de dichas actividades fisiológicas, tales como la actividad neuronal de soporte a la supervivencia, de la actividad de estiramiento de nervios, la actividad de regeneración de nervios y la actividad activadora de la neuroglía, por lo menos aproximadamente el 20%, preferentemente no menos de aproximadamente el 30%, más preferentemente no menos de aproximadamente 50%, aún más preferentemente no menos del 70%, con la condición (2) mencionada anteriormente en comparación con la condición (1) puede seleccionarse como potenciador funcional de la proteína de la invención.

Al realizar el procedimiento (b) de identificación anterior, la proteína de la invención, sola o en combinación con el compuesto de ensayo, se administra para hacer pruebas en los animales por inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular o por vía oral. La dosis de la proteína de la invención para la administración oral generalmente está comprendida entre aproximadamente 0,1 y 100 mg/día, preferentemente entre aproximadamente 1,0 y 50 mg/día, más preferentemente entre aproximadamente 1,0 y 20 mg/día, por mamífero (referido a 50 kg de peso corporal). La dosis parenteral debería seleccionarse según el receptor y el procedimiento de administración, pero se prefiere administrar aproximadamente entre 0,01 y 30 mg/día, preferentemente aproximadamente entre 0,1 y 20 mg/día, más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 10 mg/día, por mamífero (50 kg de peso corporal) por vía intravenosa.

Los animales de ensayo incluyen mamíferos tales como el hombre, mono, chimpancé, ratón, rata, conejo, oveja, cerdo, ovejas, caballo, gato y perro y peces (p. ej. carpa, salmón, arenque, trucha arco iris, dorada, etc.).

La actividad nemónica (formadora de memoria) de la proteína de la invención en el cerebro puede probarse según, por ejemplo, un protocolo de la prueba del laberinto de agua [Morris, R. G. M., J. Neurosci. Meth., 11, 47-60 (1984)]. Cualquier compuesto de ensayo que favorezca el efecto nemónico anterior en no menos de aproximadamente el 20%, preferentemente no menos del 50%, más preferentemente no menos del 70%, en dicha condición (2) en comparación con dicha condición (1) es de utilización como potenciador funcional de la proteína de la invención.

El kit de identificación como forma de realización adicional de la invención contiene la proteína de la invención (inclusive del producto de expresión del gen, uno de sus péptidos parciales y cualquier sal de uno de ellos) como componente esencial. Un kit constituido por los siguientes componentes 1 a 4 es un ejemplo de kit de identificación de la invención.

Componente 1: Solución de Hank como tampón de análisis

Componente 2: Proteína patrón (proteína de la invención o una sal de la misma)

Componente 3: Células nerviosas o tejido nervioso (cultivo de dichas células nerviosas o de tejido nervioso en una placa de 24 pocillos, 10^{4} células/pocillo, como cultivo utilizando MEM de Eagle, solución de Hanks en 5% de CO_{2} a 37ºC).

Componente 4: Microscopio invertido para observación

La identificación con el kit de identificación anterior puede realizarse de la forma siguiente.

Procedimiento

Se cuenta el número por campo de visión de células axonales positivas a la elongación en el pocillo que contiene el compuesto de ensayo y se compara con el número de células axonales positivas a la elongación en el pocillo de referencia (exento de compuesto de ensayo) y se determina la diferencia estadísticamente.

El compuesto o la sal obtenida por el método de cribado o con el kit de identificación según la invención es un elemento seleccionado de entre la clase mencionada anteriormente constituido por péptidos, proteínas, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos, productos de fermentación, extractos celulares, extractos vegetales, extractos de tejido animal etc. y es un compuesto capaz de activar la función de la proteína de la invención. El compuesto que activa las funciones de la proteína de la invención como tal puede presentar actividades fisiológicas tales como la actividad neuronal de soporte a la supervivencia, la actividad de estiramiento de nervios, la actividad de regeneración de nervios y la actividad activadora de la neuroglía, etc. y por esta razón activar la función de la proteína de la invención o similar activa o sinérgicamente o, aunque sin presentar dichas actividades fisiológicas por sí mismo, puede activar la función de la proteína de la invención. Ejemplos de las sales del compuesto incluyen las sales con bases fisiológicamente aceptables (p. ej. metales alcalinos) o ácidos (p. ej. ácidos orgánicos, ácidos inorgánicos). Son especialmente preferidas las sales de adición de ácido fisiológicamente aceptables, tales como las sales de ácidos inorgánicos (p. ej. ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico) o ácidos orgánicos (p. ej. ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metansulfónico y ácido bencensulfónico).

El compuesto o sal que activa la función de la proteína de la invención es de valor como fármaco seguro terapéutico-profiláctico de baja toxicidad para varias enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la isquemia cerebral y la enfermedad de Parkinson.

El método de cribado anterior implica la utilización de células que expresan el polipéptido LY6H en la superficie celular o responden a la proteína de la invención. Entre dichas células están las células procedentes de mamíferos, levaduras, Drosophilia y E. coli. Las células que expresan el polipéptido LY6H (o la membrana celular con el polipéptido expresado) o responden al polipéptido LY6H se ponen en contacto con el compuesto de ensayo para observar la estimulación o inhibición de la fijación o respuesta funcional. A continuación, la actividad de LY6H de las células puestas en contacto con el compuesto experimental se compara con la de las células similares no contactadas.

El ensayo anterior puede realizarse detectando la adherencia a las células que albergan el polipéptido LY6H utilizando un marcador directa o indirectamente acoplado a un compuesto experimental o en un sistema de análisis que utiliza una competición con una sustancia competitiva del marcador. De esta manera, la fijación del compuesto experimental puede probarse fácilmente. Además, utilizando un sistema de detección apropiado a las células que llevan el polipéptido LY6H en dichos ensayos, puede probarse si el compuesto experimental producirá una señal atribuible a la activación del polipéptido LY6H. El inhibidor de activación se ensaya generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto de compuesto experimental sobre la activación debido al agonista. El ensayo puede comprender un procedimiento sencillo que comprende mezclar el compuesto experimental con una solución que contiene el polipéptido LY6H para formar una mezcla, determinar la actividad de LY6H en la mezcla y comparar la actividad de LY6H en la mezcla con un patrón.

El compuesto de bajo peso molecular (agonista o antagonista) que se une a la proteína LY6H puede obtenerse por identificación con BIACORE 2000, por ejemplo [Markgren, P. O., et al., Analytical Biochemistry, 265, 340-350 (1998)].

Según la invención, a fin de desarrollar un derivado del polipéptido LY6H más activo o estabilizado o un fármaco que potencie o bloquee la función del polipéptido LY6H in vivo, es posible construir un polipéptido biológicamente activo o un análogo estructural del mismo por interacción, tal como un agonista de LY6H, antagonista de LY6H, inhibidor de LY6H o similares. El análogo estructural mencionado anteriormente puede obtenerse, por ejemplo, determinando la estructura tridimensional de un complejo del polipéptido LY6H con otra proteína por cristalografía de rayos X, modelado por ordenador o una combinación de dichas técnicas. La información de la estructura de un análogo estructural puede asimismo adquirirse por modelado del polipéptido basándose en las estructuras de las proteínas homólogas.

Para obtener dicho derivado de polipéptido LY6H más activado o estabilizado, puede emplearse el análisis por exploración de alanina. Este procedimiento comprende la sustitución de Ala para cada resto de aminoácido para evaluar la influencia de la sustitución sobre la actividad del péptido. Por lo tanto, como cada resto de aminoácido de un péptido se analiza de este modo, se determina la zona de importancia para la actividad o estabilidad del péptido. Mediante este procedimiento, es posible diseñar un derivado de polipéptido LY6H más activo o estable.

También es posible aislar el anticuerpo específico para la diana seleccionado por análisis funcional y analizar su estructura cristalina. Como norma, mediante este método, se obtiene el núcleo farmacéutico que proporciona una base para el ulterior diseño farmacéutico. Al producir un anticuerpo antiidiotípico contra el anticuerpo activo farmacológicamente funcional, es posible identificar y aislar un péptido de un banco de péptidos generado química o biológicamente. Por consiguiente, es previsible que el péptido seleccionado pueda servir también como núcleo farmacéutico.

De esta manera, es posible diseñar y desarrollar fármacos que presenten una actividad mejorada o estabilizada de LY6H o que actúen como inhibidores, agonistas o antagonistas de actividad de LY6H.

La evaluación de dicho fármaco puede realizarse valorando su efecto en la supervivencia neuronal utilizando neuronas del hipocampo de cultivo primario [Japan. J. Pharmacol., 53, 221-227 (1990)] o investigando su efecto sobre las lesiones neurodegenerativas en animales del modelo de Alzheimer tal como el gen de la proteína precursora \beta-amiloide mutante o ratones transgénicos con gen de presenilina 1 mutante [Nature, 373, 523-527 (1995): Nature Med., 5, 560-564 (1999)].

El compuesto obtenido de este modo puede utilizarse no solamente como fármaco para la enfermedad de Alzheimer sino también como un fármaco terapéutico para el infarto cerebral y otras enfermedades neurodegenerativas.

Además, según la invención, al construir ratones transgénicos que llevan el gen LY6H (ratones transgénicos con antecedentes transgénicos de LY6H), es posible determinar qué punto o puntos de la secuencia nucleotídica del gen LY6H tienen influencia sobre dichas actividades de LY6H múltiples in vivo, es decir qué funciones presentan in vivo los productos de expresión del gen LY6H y de un gen LY6H modificado.

Este procedimiento es una técnica para modificar expresamente la información genética de un ser vivo utilizando genes recombinantes homólogos, e incluye un procedimiento que utiliza células madre embrionarias de ratón (células ES) como ejemplo [Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989)].

El procedimiento de construcción de dicho ratón mutante es por ahora una tecnología de rutina para los expertos en la materia, y el ratón mutante puede construirse fácilmente aplicando un gen de LY6H natural humano o un gen LY6H mutante en una versión modificada de la tecnología anterior [Noda, Testuo (ed.): Jikken Igaku (Experimental Medicine), suplemento, 14(20) (1996), Yodosha]. Por consiguiente, utilizando esta técnica, es posible diseñar y desarrollar fármacos que presenten actividad de LY6H mejorada o estabilizada o inhibidores, agonistas y antagonistas de la actividad de LY6H.

Breve descripción del dibujo

La Fig. 1 es una representación en diagrama de transferencias Northern que presentan el modelo de expresión del gen LY6H en varios puntos del cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer.

Mejor modo de poner en práctica la invención

Los ejemplos siguientes están destinados a ilustrar la invención con mayor detalle.

Ejemplo 1 (1) Clonación y secuenciado de ADN del gen LY6H humano

Se adquirió ARNm extraído de cerebro fetal humano en CLONTECH Laboratories y se utilizó como material de partida. A partir de este ARNm, se sintetizó un ADNc y se ligó dentro del vector \lambdaZAPII (Stratagene) para construir un banco de ADNc (Otsuka GEN Research Institute, Otsuka Pharmaceutical Co.). Utilizando el procedimiento de escisión in vivo [in vivo excision: Short, J. M., et al., Nucleic Acids Res., 16, 7583-7600 (1988)], se formaron en medio de agar-agar colonias de Escherichia coli que llevan el gen humano y se seleccionaron al azar para registrar los clones de E. coli que llevan el gen humano en una microplaca de 96 pocillos. Estos clones se almacenaron a -80ºC.

A continuación, cada clon registrado se cultivó en 1,5 ml de medio LB durante la noche y se extrajo el ADN y se purificó utilizando un extractor de plásmidos automático PI-100 (Kurabo). El ARN de E. coli contaminado se descompuso con ARNasa y se eliminó. Por último, se prepararon 30 \mul de una solución de ADN y utilizando una parte de 2 \mul, se comprobaron el tamaño aproximado y la cantidad de ADN por el procedimiento del minigel. Se utilizó una parte de 7 \mul para una reacción de secuenciado y los 21 \mul restantes se almacenaron como ADN de plásmido a 4ºC. Mediante este procedimiento, un cósmido que puede utilizarse también como sonda para FISH (hibridación in situ de fluorescencia) descrito a continuación puede extraerse mediante una modificación menor del programa.

A continuación, se realizó una reacción con terminador didesoxi de Sanger et al. utilizando T3, T7 o un cebador oligonucleotídico sintético [Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] o una reacción de secuenciado cíclico [Carothers, A. M., et al., Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989)] que es la reacción con terminador didesoxi más PCR. Estas son las técnicas para la prolongación de la cadena con terminación específica para 4 clases de bases que utilizan una pequeña cantidad (aproximadamente 0,1 a 0,5 \mug) de ADN plásmido como plantilla.

Utilizando un cebador marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) como cebador de la secuencia, se realizaron aproximadamente 25 ciclos de reacción utilizando la Taq polimerasa. Del fragmento de ADN marcado con fluorescencia, se determinó la secuencia de aproximadamente 400 nucleótidos desde el extremo 5' del ADNc con el secuenciador de ADN automático ALF^{TM} ADN Sequencer (Pharmacia).

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La zona no traducida en 3' es muy heterogénea entre los genes y adecuada para la diferenciación de genes aislados. Por consiguiente, el secuenciado de la zona del extremo 3' se realizó asimismo en algunos casos.

La enorme información de la secuencia nucleotídica generada con el secuenciador de ADN se transmitió al ordenador DEC3400 de 64 bit para análisis por homología computerizada. Este análisis por homología se realizó mediante una búsqueda en la base de datos (GenBank, EMBL) según el programa FASTA de UWGCG [Pearson, W. R. y Lipman, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)].

Fujiwara et al. describen con detalle aproximadamente el procedimiento anterior de análisis para un banco de ADNc de cerebro fetal humano [Fujiwara, T., et al., DNA Res., 2, 107-111 (1991)].

Se secuenciaron a continuación las EST (etiquetas de la secuencia expresada: secuencias de ADN parcial del fragmento del gen expresado) seleccionadas al azar del banco de ADNc de cerebro fetal humano construido como anteriormente.

El clon denominado GEN-425D01 en la búsqueda de la secuencia GenBank/EMBL según el programa FASTA se descubrió que era muy homólogo con el gen que codifica la proteína de la familia Ly6 de ratón.

Utilizando un ADN de doble cadena insertado en un vector (vector pBluescript; Stratagene) como plantilla y un oligonucleótido sintético como cebador, se determinó la secuencia nucleotídica del ADNc inclusive de la zona de codificación completa del clon anterior por el procedimiento de terminación de la cadena didesoxi de Sanger.

El secuenciado con el secuenciador de ADN automático ABIPRISMTM377 puso de manifiesto que la secuencia del ADNc del clon obtenida anteriormente contenía una zona de codificación de 420 bases de aminoácidos deducida y la secuencia de aminoácidos codificada por la misma tenía 140 restos de aminoácidos. La secuencia de ácido nucleico del clon de ADNc completo estaba compuesta por 854 nucleótidos. La secuencia completa se presenta en la SEC. ID. nº: 3; la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto se presenta en la SEC. ID. nº: 2; y la secuencia de aminoácidos deducida codificada por dicha secuencia de nucleótidos se presenta en la SEC. ID. nº: 1.

La secuencia de aminoácidos de la proteína LY6H humana se comparó con la secuencia de otras proteínas de la familia Ly6, y la secuencia nucleotídica conservada en la zona de iniciación de la traducción de aminoácidos [Kozak, M., J. Biol. Chem., 266, 19867-19870 (1991)] se comparó con la zona 5' del gen LY6H humano. El codón de iniciación determinado de este modo se situó en la posición 99 a 101, que es el segundo triplete ATG, de la secuencia nucleotídica presentada en la SEC. ID. nº: 3. Además, la señal de poliadenilación (AATAAA) se situó en la posición 832 a 837 en la misma secuencia de nucleótidos.

(2) Análisis por transferencia Northern

Para definir el perfil de expresión de LY6H en tejidos, se realizó el análisis por transferencia Northern utilizando varios tejidos humanos.

En el análisis por transferencia Northern, se utilizaron transferencias I y II MTN humano (Northern de múltiples tejidos) (CLONTECH).

Se amplió el fragmento de ADNc por PCR utilizando una serie de cebadores de las secuencias de activadores T3 y T7.

El producto de ampliación por PCR de dicho clon GEN-425D01ADNc se marcó con [^{32}P]-dCTP (kit de marcado de ADN cebado al azar, Boehringer Mannheim GmbH) para su utilización como sonda.

La transferencia que contiene el producto de ampliación se prehibridó (en las condiciones según el protocolo del producto) y, a continuación, se sometió a hibridación según el protocolo del producto.

La hibridación se realizó a 65ºC durante la noche en una solución compuesta por NaCl 1 M/Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)/2 \times solución de Denhardt/10% de sulfato de dextrano/1% de solución de SDS (que contenía 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado). Después de lavar dos veces con 2 \times SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente, se lavó el producto una vez con 0,1 \times SSC/SDS al 0,1% a 65ºC durante 40 minutos. Se expuso el filtro a película de rayos X (Kodak) a -70ºC durante 18 horas.

Se realizó la prueba anterior utilizando los tejidos de adulto humano siguientes: cerebro, páncreas, testículos, intestino delgado, colon, timo, próstata, ovario, corazón, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, bazo, testículos y leucocitos de sangre periférica. Como resultado, los transcritos de aproximadamente 1 kb que presentan homología a LY6H se observaron en el cerebro, páncreas, testículos, intestino delgado, colon, timo, próstata y ovario, especialmente altos en el cerebro.

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(3) Localización del gen en los cromosomas por FISH utilizando clones de cósmido

Se realizó la FISH para la localización cromosómica utilizando 0,5 \mug de cada ADN cósmido como sonda según el procedimiento conocido [Takahashi, E. et al., Hum. Genet., 86, 14-16 (1990)]. Éste captó señales de FISH en película Provia 100 (Fuji, ISO 100) o CCD Camera System (Applied Imaging Cyto Vision).

Como resultado, se descubrió que el gen LY6H humano estaba situado en q24.3 del cromosoma 8. De este modo, se cartografió el GEN-425D01 en la banda de cromosomas 8q24.3.

Los anticuerpos contra las proteínas que pertenecen a la familia Ly6 se han utilizado en la purificación de células madre de la sangre como diana de terapia génica [van de Rijn, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4634-4638 (1989)], los estudios sobre la diferenciación de las células sanguíneas [van de Rijn, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4634-4638 (1989); Classon, B. J. y Coverdale, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5296-5300 (1994)], activación de inmunocitos [Malek, T. R., et al., J. Exp. Med., 164, 709-722 (1986)], inhibición de la producción de inmunocitos activos [Haque, A. et al., Immunology, 69, 558-563 (1990)] y similares, y se ha descubierto que presentan asimismo efectos antitumorales [Lu, L., et al., J. Immunol., 142, 719-725 (1989)]. El gen LY6H humano proporcionado en el presente ejemplo permite la detección de la expresión del gen en varios tejidos, la producción de la proteína LY6H humana mediante técnicas de ingeniería genética y la construcción de un anticuerpo utilizando el gen, permitiendo por consiguiente dicha purificación de las células madre de la sangre, la investigación en la diferenciación de las células de la sangre, la activación de inmunocitos, la inhibición de la activación de inmunocitos y la terapia de tumores.

Además, el LY6H expresado a alto nivel en el cerebro permite una investigación en la diferenciación de las células nerviosas, la activación de neuronas y la terapia de enfermedades neuronales y mentales.

La identificación de compuestos con la proteína LY6H humana como diana se hace asimismo posible y los compuestos así obtenidos son tan útiles como el anticuerpo de la proteína LY6H antihumana.

Ejemplo 2 (1) Análisis por transferencia Northern en los tejidos del cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer

Se realizó el análisis por transferencia Northern según el Ejemplo 1 (2).

Para investigar la expresión del gen LY6H en los tejidos del cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer, se realizó el análisis por transferencia Northern utilizando los tejidos del cerebro de un paciente de Alzheimer y los tejidos del cerebro humano normales.

Se realizó la transferencia Northern utilizando la transferencia II de cerebro normal humano y la transferencia II de Alzheimer humano (ambos Invitrogen) y la expresión del gen LY6H en varios tejidos cerebrales, a saber lóbulo frontal, lóbulo temporal, lóbulo parietal, lóbulo occipital, protuberancia, tálamo y cuerpo calloso, se comparó entre cerebros normales y con Alzheimer.

Los resultados se presentan en la Fig. 1.

Como se apuntó en el Ejemplo 1, el gen LY6H se expresa a alto nivel en el cerebro. El análisis anterior puso de manifiesto que, aunque la expresión del gen se confirmó en varios tejidos de cerebro normal humano, el gen se expresó a niveles particularmente altos en el lóbulo temporal incluyendo el hipocampo y la corteza endorrinal se sabe que están gravemente alterados en pacientes con enfermedad de Alzheimer mientras que se apreciaron disminuciones notables en el lóbulo temporal inclusive del hipocampo y de la corteza endorrinal en el paciente con enfermedad de Alzheimer, lo que indica que es muy probable que el gen esté implicado en el comienzo y la evolución de esta enfermedad.

Por consiguiente la cadena transcrita del gen LY6H, el producto de expresión de LY6H y la proteína LY6H es de esperar que encuentren aplicación como fármacos terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer, la demencia de tipo Alzheimer, la isquemia cerebral y la enfermedad de Parkinson.

Además, es de esperar asimismo que sean de utilización los agonistas y antagonistas de la proteína LY6H como fármacos terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades.

Ejemplo 3 (1) Construcción de un vector de expresión de LY6H

El ADNc de LY6H obtenido por el procedimiento de escisión in vivo se escinde con MvlI y XhoI para dar un fragmento de aproximadamente 800 bases. Este fragmento, que contiene la zona de codificación completa del gen LY6H mostrado en la SEC. ID. nº: 1, está ligado al pAc5.1 /V5-HisA (Invitrogen) escindido por EcoRV/XhoI, para construir un vector de expresión (vector de expresión pAC/LY6H).

(2) Expresión y purificación de la proteína del ingrediente activo de la invención

El ADN del vector de expresión pAC/LY6H y el ADN del vector pCoHYGRO (Invitrogen) se mezclan en una proporción de 19:1 y se introducen en células de mosca de la fruta (Schneider 2) mediante transfección con fosfato cálcico. Una vez las células se cultivan en suero de ternero fetal al 10%-medio de expresión DES (Invitrogen) a 23ºC durante 48 horas, se añaden 300 \mug/ml de higromicina (Hygromycini B, Boehringer Mannheim) al cultivo y se realiza la selección de clones de células resistentes a fármacos durante 2 semanas. Un transformante estable se somete a cultivo estacionario a una concentración de 5\times10^{6} células/ml utilizando 20 matraces de cultivo Falcon 5000 (Becton Dickinson) que contiene 20 ml de suero de ternero fetal al 10%-medio de expresión DES (Invitrogen) y se recogen las células cultivadas. Después de lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se ponen en suspensión en PBS que contiene albúmina de suero bovino al 2% y 0,5 U/ml de fosfolipasa C específica para fosfatidil-inositol (PIPLC) y se cultiva a 37ºC durante 1 hora. A partir del sobrenadante del cultivo, puede purificarse la proteína objetivo por cromatografía en columna de intercambio iónico o similar.

(3) Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo

El cerebro completo se aísla asépticamente en ratas SD embrionarias de 18 días y se escinde el hipocampo. El tejido escindido se corta en secciones finas con un bisturí y se incuba para tratamiento enzimático en PBS que contiene tripsina al 0,25% y ADNasa I al 0,002% a 37ºC durante 20 minutos. Una vez interrumpida la reacción enzimática añadiendo suero de ternero fetal, se repite 3 veces la aspiración-eyección del digesto celular con una pipeta que presenta una punta de plástico para dispersar las células. La dispersión celular se pasa a través de un filtro consistente en 2 hojas superpuestas de papel de lentes para eliminar el tejido no digerido y se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 minutos. Se lavan las células con DMEM (Gibco) y se siembran en una placa de 96 pocillos recubierta con poli-L-lisina (Sigma) que contiene FCS-DMEM al 10% a una concentración final de 2\times10^{5} células/cm^{2}.

(4) Tratamiento con la proteína ingrediente activo de la invención

Se cultivan las células anteriores durante 24 horas y a continuación se cambia el medio de cultivo por suplemento N_{2} al 1% (Gibco)-DMEM, se añade la proteína ingrediente activo de la invención preparada en (2) (grupo de la invención).

Para comparación, la proteína ingrediente activo de la invención se trata térmicamente en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y se añade (el grupo de la proteína hervida).

(5) Evaluación de la supervivencia neuronal del hipocampo

Las células (cultivo) en cada grupo preparadas en (4) se cultivan durante 72 horas. A continuación, el efecto de soporte de supervivencia neuronal del hipocampo de la proteína ingrediente activo de la invención puede evaluarse mediante el análisis MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio]. Este análisis MTT puede realizarse utilizando, por ejemplo, el sistema de análisis "CellTiter 96" de Promega.

(6) Aislamiento y cultivo de neuronas del mesencéfalo

El cerebro completo se aísla asépticamente en ratas SD embrionarias de 14 días y se escinde el mesencéfalo anterior. El tejido se corta en secciones finas con un bisturí y se incuba para tratamiento enzimático en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene tripsina al 0,25% y ADNasa I al 0,002% a 37ºC durante 20 minutos. Una vez interrumpida la reacción enzimática añadiendo suero de ternero fetal, se repite 3 veces la aspiración-eyección del digesto celular con una pipeta que tiene una punta de plástico para dispersar las células. La dispersión celular se pasa a través de un filtro constituido por 2 hojas superpuestas de papel de lentes para eliminar el tejido no digerido y se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 minutos. Se lavan las células con DMEM/F12 (Gibco) y se siembran en una placa de 96 pocillos recubierta con poli-L-lisina (Sigma) que contiene 10% de FCS-DMEM a una concentración final de 3\times10^{5} células/cm^{2}.

(7) Tratamiento con la proteína ingrediente activo de la invención

Se cultivan las células preparadas en (6) durante 24 horas y después se cambia el medio de cultivo por suplemento N_{2} al 1% (Gibco)-DMEM/F12, se añade la proteína ingrediente activo de la invención preparada en (2) (grupo de la invención).

Para comparación, la proteína ingrediente activo de la invención se trata térmicamente en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y se añade (grupo de la proteína hervida).

(8) Evaluación del efecto de soporte de la supervivencia neuronal del hipocampo

Las células (cultivo) en cada grupo preparadas en (7) se cultivan durante 72 horas. A continuación, el efecto de soporte de supervivencia neuronal del hipocampo de la proteína ingrediente activo de la invención puede evaluarse mediante el análisis MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio]. Este análisis MTT puede realizarse utilizando, por ejemplo, el sistema de análisis "CellTiter 96" de Promega.

(9) Evaluación del efecto dopaminérgico de soporte de la supervivencia neuronal

Las células (cultivo) en cada grupo preparadas en (7) se cultivan durante 72 horas y, a continuación, se fijan dejándolas reposar en 4% de paraformaldehído-PBS a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, se pasan a través de una membrana utilizando 1% de Triton X100/PBS.

Para impedir la unión no específica del anticuerpo, las células se incuban en 10% de suero de cabra -PBS durante 1 hora y, a continuación, utilizando un anticuerpo policlonal de hidrolasa antitirosina (Chemicon; diluido 1.000 veces con PBS), se incuban las células a 4ºC durante 16 horas. Una vez se elimina la solución del anticuerpo, se lavan las células con PBS y con inmunoglobulina anticonejo de cabra conjugada con polímero dextrano marcado con peroxidasa (Dako) añadida, las células se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.

Las células positivas a tirosina hidroxilasa pueden detectarse por reacción colorimétrica utilizando diaminobenzidina como sustrato. Utilizando como marcador el número de células positivas a tirosina hidroxilasa, puede evaluarse el efecto dopaminérgico de soporte de la supervivencia neuronal.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un nuevo gen específico para el cerebro y una proteína codificada por esta razón y, al utilizarlos, pueden proporcionarse tecnologías valiosas para la purificación de células madre de la sangre, la investigación en la diferenciación de células de la sangre, la activación de inmunocitos, la inhibición de la producción de inmunocitos activos y la terapia de tumores. La presente invención proporciona asimismo nuevos genes con actividades fisiológicas tales como la actividad de soporte a la supervivencia neuronal del cerebro, actividad de estiramiento de nervios, actividad de regeneración de nervios, actividad de la activación de la neuroglía y actividad de la formación de la memoria cerebral.

En vista de la disminución notable de su nivel de expresión en el lóbulo temporal de pacientes con enfermedad de Alzheimer, el gen de la invención se considera que inhibe los cambios neurodegenerativos del tejido, utilizándose así como un fármaco para la terapia génica. Además, el producto de la expresión del gen de la invención encuentra aplicación como fármaco profiláctico y terapéutico en dichas enfermedades neurodegenerativas.

<110> 0stuka Pharmaceutical Co., ltd.

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<120> Gen LY6H

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<130> P99-45

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 140

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<212> PRT

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<213> cerebro embrionario humano

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 420

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<212> ADN

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<213> cerebro embrionario humano

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 854

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<212> ADN

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<213> cerebro embrionario humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (99) .. (518)

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<400> 3

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3

4

5

Claims

1. Gen que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína (a) o (b) siguiente:

(b): una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. nº: 1 por deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos y que presenta actividad nemónica, en la que dicha secuencia de aminoácidos es idéntica por lo menos en un 70% a la SEC. ID. nº: 1.

2. Gen según la reivindicación 1, en el que la secuencia nucleotídica se presenta en la SEC. ID. nº: 2.

3. Gen que comprende el polinucleótido (a) o (b) siguiente:

(b): un polinucleótido que se hibrida en condiciones severas con un ADN que presenta la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. nº: 3, en el que dicho polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos con actividad nemónica.

4. Vector de expresión génica que comprende el gen según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Célula hospedadora que comprende el vector de expresión génica según la reivindicación 4.

6. Proteína que es codificada por el gen según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Proteína según la reivindicación 6, que es un producto de expresión derivable del vector de expresión según la reivindicación 4.

8. Anticuerpo específico para la proteína según la reivindicación 6 o el producto de expresión según la reivindicación 7.

9. Composición que comprende la proteína según las reivindicaciones 6 ó 7, como ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéutico para la terapia y la profilaxis de una enfermedad neurodegenerativa, en la que la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de entre el grupo constituido por enfermedad de Alzheimer, demencia de tipo Alzheimer y enfermedad de Parkinson.

10. Método de cribado para compuestos candidatos, que comprende utilizar la proteína según las reivindicaciones 6 ó 7, en el que dichos compuestos candidatos se unen o influyen en la proteína o el producto de expresión.

11. Utilización de la proteína según las reivindicaciones 6 ó 7, para la producción de un medicamento para la terapia y la profilaxis de una enfermedad neurodegenerativa, en la que la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de entre el grupo constituido por enfermedad de Alzheimer, demencia de tipo Alzheimer y enfermedad de Parkinson.