ES2276536T3 - Uso de compuestos que reducen las alfas2-antiplasminas in vivo para la preparacion de una composicion para el tratamiento del ictus isquemico. - Google Patents

Abstract

El uso de un inhibidor de a2-antiplasmina seleccionado del grupo que consiste en plasmina, miniplasmina que carece de los cuatro primeros dominios Kringle, y microplasmina que carece de los cinco dominios Kringle, para la preparación de una composición terapéutica para la reducción del tamaño de infarto cerebral tras ictus isquémico.

Description

Uso de compuestos que reducen las \alpha_{2}-antiplasminas in vivo para la preparación de una composición para el tratamiento del ictus isquémico.

La presente invención se refiere a un medio nuevo para el tratamiento del infarto cerebral isquémico focal (ictus isquémico).

El infarto cerebral isquémico focal ocurre cuando el flujo arterial de una región específica del cerebro se reduce por debajo de un nivel crítico, lo que da como resultado la muerte de células neuronales. Se cree que la degeneración neuronal en enfermedades del sistema nervioso central (SNC), tales como ictus, epilepsia y enfermedad de Alzheimer, está estimulada por un exceso del aminoácido excitador glutamato (2). La inyección de agonistas de glutamato en el SNC induce realmente una muerte de células neuronales del hipocampo similar a la observada en enfermedades neurodegenerativas (3).

La degeneración neuronal inducida por excitotoxina está mediada por el activador de plasminógeno tisular (t-PA) (4). De forma coherente con esta observación, los ratones deficientes de t-PA son resistentes a la degeneración neuronal del hipocampo mediada por excitotoxina, y la infusión de inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI-1) les protege contra ella (4-6).

Además, la deficiencia de plasminógeno (Plg), el zimógeno sustrato de t-PA, y la infusión de \alpha_{2}-antiplasmina (\alpha_{2}-AP) protege a los ratones contra la muerte de neuronas del hipocampo inducida por excitotoxina (5). Se ha propuesto que la degradación mediada por plasmina de la laminina sensibiliza a las neuronas del hipocampo a la muerte celular interrumpiendo la interacción neurona-matriz extracelular (7). El documento EP 063 1786 describe el uso de lys-plasminógeno para el tratamiento de la lesión por reperfusión.

Wang et al. (8) demostró recientemente que el daño neuronal después de la isquemia cerebral focal inducida mediante oclusión transitoria de la arteria cerebral media se redujo también en ratones con deficiencia de t-PA y se exacerbó mediante infusión de t-PA. Esto sugiere que el sistema del plasminógeno puede estar implicado tanto en establecer un infarto isquémico cerebral como en su extensión durante la terapia trombolítica. Se demostró recientemente que el efecto neurotóxico de t-PA en la isquemia cerebral focal persistente también ocurrió con otros agentes trombolíticos, que incluyen estreptoquinasa y estafiloquinasa (9). Así, en los pacientes con oclusión arterial cerebral persistente, la terapia trombolítica para ictus isquémico puede provocar la extensión del infarto, que no solamente contrarrestaría parcialmente el efecto beneficioso global establecido de la recanalización arterial (10, 11), sino que en realidad sería dañino para un subgrupo de pacientes. Debido a que no es posible distinguir entre los pacientes que conseguirán la recanalización arterial cerebral con la terapia trombolítica y los que no la conseguirán, parece ser necesario el desarrollo de estrategias conjuntas específicas para contrarrestar los efectos neurotóxicos de los agentes trombolíticos en la isquemia cerebral focal persistente.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un medio nuevo para la reducción del tamaño de infarto cerebral después de ictus isquémico.

En la investigación que llevó a la presente invención se contempló lo siguiente. Aunque se asume que la lesión neuronal durante la isquemia focal en el cerebro ocurre principalmente como resultado de la acumulación de excitotoxinas tales como glutamatos, no se ha demostrado el papel de la degradación de laminina mediada por plasmina o de los mecanismos alternativos en la patogénesis de la muerte de células neuronales corticales. Para trazar la contribución de componentes individuales del sistema del plasminógeno (fibrinolítico) en el infarto isquémico cerebral focal, los presentes inventores cuantificaron el tamaño de infarto producido por la ligadura de la arteria cerebral media izquierda (ACM) en ratones con inactivación dirigida de los genes que codifican Plg, el activador de plasminógeno tisular (t-PA) o el activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (u-PA), o los inhibidores fibrinolíticos PAI-1 o \alpha_{2}-AP. Además, se estudiaron los efectos de la transferencia adenoviral de los genes t-PA y PAI-1 y de la infusión de \alpha_{2}-AP humano en el infarto cerebral.

Mientras los hallazgos de Strickland et al. de que la deficiencia de t-PA protege contra el infarto isquémico cerebral focal se confirmaron completamente, y se ampliaron mediante la observación de que la deficiencia de PAI-1 dio como resultado tamaños de infarto significativamente mayores, no se pudo confirmar la observación de que la deficiencia de Plg protege contra la muerte de células neuronales inducida por excitotoxina. En lugar de ello, se descubrió que el tamaño de infarto cerebral focal fue significativamente superior en ratones con deficiencia de Plg, y, a la inversa, significativamente inferior en ratones con deficiencia de \alpha_{2}-AP.

En conjunto, estos hallazgos indican que los componentes del sistema del plasminógeno afectan al tamaño de infarto isquémico cerebral focal en dos niveles diferentes: 1) la reducción de la actividad de t-PA (inactivación del gen de t-PA o transferencia del gen de PAI-1) reduce el tamaño de infarto, mientras su aumento (transferencia del gen de t-PA o inactivación del gen de PAI-1) incrementa el tamaño de infarto, y 2) la reducción de la actividad de Plg (inactivación del gen de Plg o inyección de \alpha_{2}-AP) incrementa el tamaño de infarto, mientras su aumento (inactivación del gen de \alpha_{2}-AP o neutralización de \alpha_{2}-AP) reduce el tamaño de infarto. Los hallazgos son incompatibles con una única ruta relacionada en la que la generación de plasmina mediada por t-PA conduciría a muerte de células neuronales, y sugiere dos mecanismos independientes

\hbox{(mediado por t-PA y
mediado por Plg, respectivamente) que operan en direcciones
opuestas.}

Las observaciones internamente coherentes con \alpha_{2}-AP fueron inesperadas, pero son muy relevantes para el tratamiento de ictus isquémico. En primer lugar, se descubrió una correlación entre el tamaño de infarto y el genotipo con heterocigotos que mostraban tamaños de infarto entre los de los fenotipos de tipo natural y homocigoto. En segundo lugar, la inyección rápida de \alpha_{2}-AP humano (h\alpha_{2}-AP) en ratones \alpha_{2}-AP^{-/-} provocó una expansión del infarto relacionada con la dosis. De forma importante, los fragmentos Fab de anticuerpos policlonales anti-h\alpha_{2}-AP de conejo específicos, administrados de forma intravenosa 40 min después de la oclusión de la ACM, redujo significativamente el tamaño de infarto isquémico cerebral. Esta observación sugiere una vía potencial para contrarrestar el infarto isquémico focal con el uso de inhibidores de \alpha_{2}-AP (p.ej. anticuerpos monoclonales neutralizantes o compuestos neutralizantes de la actividad de \alpha_{2}-AP). Esta aproximación se confirmó mediante la infusión de plasmina en ratones con oclusión de ACM que, al neutralizar \alpha_{2}-AP, redujo significativamente el tamaño de infarto. La concentración de \alpha_{2}-AP en plasma humano es 1 mM (12), lo que corresponde a una reserva corporal total de aproximadamente 500 mg. Una dosis equivalente de un fragmento Fab monoclonal sería aproximadamente 400 mg, y la de plasmina aproximadamente 500 mg, que es elevada pero no excesiva para una única administración terapéutica. Además, la observación de que el tamaño de infarto es proporcional a la concentración de \alpha_{2}-AP (derivada del efecto de la dosis génica y la dosis-respuesta) sugiere que una reducción parcial de la concentración plasmática podría tener un efecto beneficioso significativo.

En vista de lo anterior, la invención se refiere al uso de compuestos que reducen la actividad de \alpha_{2}-AP in vivo para el tratamiento del infarto isquémico cerebral focal (ictus isquémico).

En una realización específica de la invención, se hace uso de compuestos que reducen la concentración de \alpha_{2}-AP circulante. Una concentración inferior de \alpha_{2}-AP llevará a una actividad inferior. En una realización alternativa, se reduce directamente la actividad de \alpha_{2}-AP circulante.

Los compuestos que neutralizan \alpha_{2}-AP son plasmina, miniplasmina (que carece de los 4 primeros dominios Kringle) o microplasmina (que carece de los cinco dominios Kringle).

La presente invención se demostrará con más detalle en los siguientes ejemplos, que sin embargo no pretenden limitar el alcance de la invención. En los ejemplos se hace referencia a los siguientes dibujos:

Las Figuras 1 a 3 son histogramas que comparan el volumen (en mm^{3}) de infartos isquémicos cerebrales focales después de la ligadura de la arteria cerebral media (ACM) en ratones. Los datos representan valores medios y las barras verticales SEM, con el número de experimentos señalado en las columnas.

La Figura 1 muestra el efecto de la deficiencia de componentes del sistema del plasminógeno (genotipo en abscisas) sobre el tamaño de infarto cerebral isquémico focal (en mm^{3}). TN: tipo natural (valores mezclados de contexto genético de 50% de C57BL6/50% de S129, 100% de C57BL6 y 100% de S129).

La Figura 2 muestra el efecto de la transferencia adenoviral de los genes de t-PA o PAI-1 sobre el tamaño de infarto cerebral isquémico focal en ratones deficientes de t-PA o PAI-1, respectivamente.

La Figura 3 muestra el efecto de \alpha_{2}-AP sobre el tamaño de infarto cerebral isquémico focal.

A. Efecto del genotipo de \alpha_{2}-AP sobre el tamaño de infarto cerebral.

B. Efecto de la inyección de h\alpha_{2}-AP o de h\alpha_{2}-AP seguido de fragmentos Fab anti-h\alpha_{2}-AP sobre el tamaño de infarto cerebral.

Ejemplos

Ejemplo 1

Modelo de infarto isquémico cerebral murino 1. Introducción

Todos los ratones incluidos en el presente estudio se generaron y se criaron en la Instalación Exenta de Patógenos Específicos del Centro para la Tecnología Transgénica y la Terapia Génica, Campus Gasthuisberg, K.U. Leuven. La inactivación génica se obtuvo mediante recombinación homóloga en células pluripotenciales embrionarias dirigida a los genes que codifican el activador de plasminógeno tisular (t-PA) (13), el activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (u-PA) (13), el inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI-1) (14, 15), plasminógeno (Plg) (16), o \alpha_{2}-antiplasmina (\alpha_{2}-AP) (17), como se describió previamente. No se incluyeron ratones con genes inactivados que codifican el receptor u-PA (u-PAR) (18) debido a los resultados normales obtenidos con ratones deficientes de
u-PA.

2. Materiales y métodos 2.1 Materiales

Se preparó \alpha_{2}-AP humano a partir de plasma fresco congelado como se describió previamente (19).

Se produjeron antisueros policlonales en conejos mediante inyección subcutánea de 200 mg de \alpha_{2}-AP humano purificado suspendido en adyuvante completo de Freund, seguido por inyección del antígeno suspendido en adyuvante incompleto de Freund en dos intervalos bisemanales. El suero se obtuvo mediante punción repetida en la vena de la oreja. Los sueros mezclados se sometieron a cromatografía en Sepharose-proteína A (0,5 ml de suero por ml de gel húmedo), equilibrada con Tris.HCl 0,1 M, pH 8,1, y la IgG eluyó con glicocola.HCl 0,1 M, pH 2,8, lo que produjo aproximadamente 10 mg de proteína por ml de suero. Los anticuerpos específicos se obtuvieron a partir de la mezcla de IgG dializada mediante cromatografía en una columna de Sepharose activada con CNBr sustituida con \alpha_{2}-AP humano (2,5 mg/ml de gel húmedo) y eluyó con glicocola.HCl 0,1 M, pH 2,8, lo que produjo aproximadamente 0,1 mg de IgG específica por mg aplicado.

Los fragmentos Fab se obtuvieron a partir de la IgG específica mediante digestión con papaína. Por lo tanto, IgG se disolvió hasta una concentración de 5 mg/ml y se digirió con un 1% (p/p) de papaína en presencia de cisteína 50 mM, EDTA 1 mM, tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, durante 5 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de yodoacetamida hasta una concentración final de 75 mM. Después de la diálisis, la mezcla se purificó en una columna de Sepharose-proteína A equilibrada con PBS. La concentración de Fab se determinó mediante ELISA calibrado con un patrón de IgG. La electroforesis en gel con SDS reveló básicamente fragmentos Fab homogéneos (no
mostrado).

2.2 Producción de vectores adenovirales

Se generaron los adenovirus recombinantes AdCMVt-PA y AdCMVPAI-1 mediante recombinación homóloga en células 293 básicamente como se describió previamente (20). Para AdCMVt-PA, se ligó un fragmento XbaI del plásmido pSTEt-PA que codifica t-PA humano de tipo natural en pACCMVpLpA digerido con XbaI (21) para producir pACCMVt-PA. El precursor de adenovirus pACCMVPAI-1 se generó ligando el fragmento EcoRI/BglII de 1,4 kb de pPAI-1RBR que contiene la secuencia codificante entera de PAI-1 humano en pACCMVpLpA digerido con EcoRI/BamHI. En estos plásmidos, el cADN de t-PA y PAI-1 se coloca entre el potenciador/promotor temprano inmediato de citomegalovirus y el intrón del antígeno t/señal de poliadenilación de SV40 para formar una unidad de transcripción completa.

Se cotransfectaron cultivos en monocapa de células 293 (22) con 10 mg de pACCMVt-PA o pACCMVPAI-1 y 5 mg de pJM17 (20), un plásmido que contiene un genoma completo de adenovirus 5 d1309. La recombinación homóloga entre estos plásmidos da como resultado la formación de genomas virales recombinantes, en los que la región E1 del adenovirus se sustituye por los transgenes de t-PA o PAI-1 respectivos. La replicación de los virus recombinantes en células 293 cultivadas está apoyada por los productos del gen E1A proporcionados en trans de una copia de E1 integrada en el genoma de las células 293.

Tras la transfección, las placas virales recombinantes se recogieron y se amplificaron como se describe (23). La identidad de los virus recombinantes se determinó mediante análisis de restricción y transferencia de Southern del ADN viral preparado a partir de las células 293 infectadas de manera productiva. El adenovirus AdRR5 recombinante, que carece de un gen insertado en la posición de E1, se generó a partir depACRR5 y pJM17 de la misma manera, y se usó como un adenovirus de control (24, 25). Los virus recombinantes se volvieron a colocar en placas para asegurar la identidad de los clones antes de su uso posterior. Se realizó una producción a gran escala de adenovirus recombinantes como se describe (23). Los virus purificados se complementaron con 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino estéril (BSA), se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su uso. Se determinó el título de partículas virales infecciosas en las reservas purificadas mediante análisis de placas en monocapas de células 293 con 1 hora de adsorción a 37ºC. Se obtuvieron de forma rutinaria reservas virales purificadas de >10^{10} unidades formadoras de placas (ufp) por ml. La cinética y la distribución por órganos de la expresión de t-PA y PAI-1 tras la transferencia adenoviral mediante inyección rápida intravenosa se ha descrito en otra parte
(26, 27).

2.3 Preparación de plasmina humana

Se preparó plasminógeno humano a partir de plasma humano fresco congelado de banco sanguíneo, esencialmente como se describió previamente (28). El plasma humano (6 litros), al que se le añadieron 20 unidades de aprotinina por ml (Trasylol, Bayer, Alemania), se aclaró mediante centrifugación a 4000 rpm durante 15 min a 4ºC. Se añadió lisina-Sepharose (200 g de peso húmedo, nivel de sustitución de aproximadamente 1 mg de lisina por g de gel húmedo de Sepharose) al sobrenadante, la mezcla se agitó durante 1 hora a 4ºC y se recuperó el gel en un embudo Buchner. Después, se añadieron 120 g de lisina-Sepharose al filtrado, la mezcla se agitó y se recuperó el gel como anteriormente. Las fracciones de gel combinadas se lavaron con 18 litros de tampón de K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 0,2 M, pH 7,5, que contenía 10 unidades de aprotinina por ml, después se vertió en una columna de 5 x 60 cm y se lavó con tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,02 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5, que contenía 10 unidades/ml de aprotinina, a 4ºC hasta que la absorbancia del líquido de lavado a 280 nm fue menor de 0,05. La columna se eluyó después con tampón de lavado que contenía ácido 6-aminohexanoico 0,05 M, y las fracciones que contenían proteína se mezclaron. A partir de 6 litros de plasma se obtuvieron aproximadamente 145 ml de líquido que contenía 650 mg de proteína. La mezcla se concentró 2,5 veces en un filtro Amicon PM10 y se filtró en gel en una columna de 5 x 90 cm de Ultragel AcA44 equilibrada con tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,02 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5, a un caudal de 60 ml por hora. El pico principal, que contenía aproximadamente 590 mg de proteína, se concentró en un filtro Amicon PM10 hasta una concentración de 10 mg/ml, y se congeló hasta su uso.

Se preparó plasmina humana a partir de plasminógeno como sigue. Se añadió lisina-Sepharose (20 g de gel húmedo) a una disolución de plasminógeno humano (200 mg), la mezcla se agitó durante 3 horas a 4ºC, el gel se lavó en un embudo Buchner y se resuspendió en 30 ml de tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 7,4. Se añadió uroquinasa (500 \mul de una disolución 50 \muM, preparada mediante activación de Saruplase (Grünenthal, Aachen, Alemania) con plasmina-Sepharose, y la mezcla se agitó durante 15 horas a 4ºC. El gel se lavó después en un embudo Buchner con tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 7,4, se vertió en una columna de 1,5 x 16 cm, se lavó con tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 7,4 hasta que la absorbancia a 280 nm del líquido de lavado fue menor de 0,05, y se eluyó con tampón NaH_{2}PO_{4} 0,1 M que contenía ácido 6-aminohexanoico 0,05 M. Las fracciones que contenían proteína se mezclaron, se añadió glicerol a una concentración final del 10% y la mezcla se dializó a 4ºC con tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M que contenía un 10% de glicerol. La recuperación final fue de 25 ml de una disolución con una concentración de proteína de 4,0 mg/ml y una concentración de plasmina activa de 25 \muM.

2.4 Medida de \alpha_{2}-antiplasmina en plasma

Las concentraciones de \alpha_{2}-antiplasmina en plasma murino se midieron mediante un análisis con sustrato cromógeno, basado en su rápida inhibición de la plasmina (29). Brevemente, se mezclan 10 \mul de plasma de ratón (diluido al 1/10 en tampón de NaH_{2}PO_{4} 0,05 M, pH 7,4, que contiene un 0,01% de Tween 20) a 37ºC con 420 \mul de tampón Tris HCl 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 7,4, que contiene un 0,01% de Tween 20, y con 20 \mul de plasmina humana 0,125 \muM (concentración final 5 nM). Después de 10 s de incubación, se añaden 50 \mul de S2403 3 mM (Chromogenics, Antwerp, Bélgica), y se mide el cambio de absorbancia a 405 nm. El cambio de absorbancia es aproximadamente 0,18 min^{-1} con tampón y 0,09 min^{-1} con plasma murino mezclado.

2.5 Experimentos con animales

Los experimentos con animales se llevaron a cabo según los principios directores de la Sociedad Fisiológica Americana y del Comité Internacional de Trombosis y Hemostasia (30).

Se produjo isquemia cerebral focal mediante oclusión persistente de la ACM según Welsh et al. (31). Brevemente, se anestesiaron ratones de ambos sexos, con pesos de 20 a 30 g, mediante inyección intraperitoneal de cetamina (75 mg/ml, Apharmo, Arnhem, Holanda) y xilazina (5 mg/ml, Bayer, Leverkusen, Alemania). Se administró de forma intramuscular atropina (1 mg/kg; Federa, Bruselas, Bélgica), y se mantuvo la temperatura corporal manteniendo a los animales en una almohadilla calefactora. Se hizo una incisión en forma de "U" entre la oreja izquierda y el ojo izquierdo. Los segmentos superior y trasero del músculo temporal se disecaron transversalmente, y se expuso el cráneo mediante retracción del músculo temporal. Se hizo una pequeña abertura (1 a 2 mm de diámetro) en la región sobre la ACM con un taladro de mano, con perfusión con suero salino para evitar lesiones térmicas. Se extrajeron las meninges con un fórceps y se ocluyó la ACM mediante ligadura con hilo de nailon 10-0 (Ethylon, Neuilly, Francia) y se disecó transversalmente de forma distal al punto de ligadura. Finalmente, se suturaron el músculo temporal y la piel de vuelta a su lugar.

Se administraron AdCMVt-PA, AdCMVPAI-1 o AdRR5 en forma de inyección rápida intravenosa de 1,3 x 10^{9} unidades formadoras de placas (u.f.p.) 4 días antes de la ligadura de la ACM. Se administró \alpha_{2}-AP humano (h\alpha_{2}-AP) de forma intravenosa dividido en 2 inyecciones, administradas 1 min antes y 30 min después de la ligadura de la ACM, respectivamente. Se inyectaron fragmentos Fab de forma intravenosa en forma de inyección rápida, 10 min después de la segunda inyección de h\alpha_{2}-AP. Se administró plasmina humana intravenosamente en forma de inyección rápida, 15 min antes o 15 min después de la ligadura de la ACM.

Se dejó que los animales se recuperaran y después se devolvieron a sus jaulas. Después de 24 horas, se sacrificó a los animales con una sobredosis de nembutal (500 mg/kg, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) y se les decapitó. Se extrajo el cerebro y se colocó en una matriz para seccionarlo en segmentos de 1 mm. Las secciones se sumergieron en un 2% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) en solución salina (32), se incubaron durante 30 min a 37ºC y se colocaron en un 4% de formalina en solución salina tamponada con fosfato. Con este procedimiento, el área necrótica de infarto permanece sin teñir (blanca) y es claramente distinguible del tejido viable teñido (rojo ladrillo). Las secciones se fotografiaron y se sometieron a planimetría. Se definió el volumen de infarto como la suma de las áreas sin teñir de las secciones multiplicado por su grosor.

Los datos se representan como media \pm SEM de n determinaciones. La significatividad de las diferencias se determinó usando un análisis de varianza seguido de la prueba PLSD de Fisher, usando el paquete informático Statview o mediante la prueba t de Student.

\newpage

Ejemplo 2

Tamaño de infarto isquémico cerebral en ratones con inactivación dirigida de genes que codifican componentes del sistema del plasminógeno

La ligadura de la ACM izquierda indujo un infarto cerebral con un volumen de 7,6 \pm 1,1 mm^{3} (n= 11) en ratones de tipo natural con un contexto genético mezclado de (50%) S129 y (50%) C57BL/6, de 9,3 \pm 2,7 mm^{3} (n= 6) en ratones C57BL/6 consanguíneos y de 6,4 \pm 1,3 mm^{3} (n= 6) en ratones S129 consanguíneos(p= NS respecto del contexto mezclado, resultados no mostrados).

La inactivación del gen de t-PA se asoció con una reducción significativa del tamaño de infarto a 2,6 \pm 0,80 mm^{3} (n= 11) (p< 0,0001 respecto de ratones de tipo natural), mientras la inactivación del gen de u-PA no tuvo efecto sobre el tamaño de infarto (7,8 \pm 1,0 mm^{3}, n= 8, p= NS respecto de tipo natural).

La inactivación del gen de PAI-1 estuvo asociada con un incremento significativo del tamaño de infarto (16 \pm 0,52 mm^{3}, n= 6, p< 0,0001 respecto de tipo natural) (Figura 1). En ratones con genes de Plg inactivados, el tamaño de infarto cerebral fue significativamente mayor que en ratones de tipo natural (12 \pm 1,2 mm^{3}, n=9, p=0,037 respecto de tipo natural), mientras, de forma inversa, en ratones deficientes de gen de \alpha_{2}-AP, el tamaño de infarto se redujo notablemente (2,2 \pm 1,1 mm^{3}, n= 7, p= 0,0001 respecto de tipo natural) (Figura 1).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Efecto de la transferencia de genes de t-PA y PAI-1 sobre el tamaño de infarto cerebral

La inyección de 1,3 x 10^{9} u.f.c. de AdCMVt-PA en 6 ratones t-PA^{-/-} 4 días antes de la ligadura de ACM se asoció con un tamaño de infarto cerebral de 6,0 \pm 1,3 mm^{3}, significativamente mayor que los infartos en 5 ratonest-PA^{-/-} a los que se les inyectó el virus de control AdRRS (1,8 \pm 0,63, p= 0,028) (Figura 2A). De forma inversa, la inyección de 1,3 x 10^{9} u.f.c. de AdCMVP-AI-1 en 5 ratones PAI-1^{-/-} se asoció con un tamaño de infarto cerebral de 10 \pm 1,4 mm^{3}, significativamente inferior que los infartos en 5 ratones PAI-1^{-/-} a los que se les inyectó el virus de control AdRR5 (13 \pm 1,0 mm^{3}, p= 0,019) (Figura 2B).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Efecto de \alpha_{2}-antiplasmina sobre el tamaño de infarto cerebral

El tamaño de infarto cerebral se correlacionó con la dosis de gen de \alpha_{2}-AP, que correspondió a 11 \pm 2,0, 4,9 \pm 2,0 y 2,2 \pm 1,1 mm^{3} en ratones de tipo natural, deficientes heterocigotos y homocigotos, respectivamente (Figura 3A). La inyección de \alpha_{2}-AP humano en grupos de 4 ratones \alpha_{2}-AP^{-/-} incrementó el tamaño de infarto hasta 13 \pm 2,5 mm^{3} (n= 4) con una dosis total de 1 mg, y hasta 11 \pm 1,5 mm^{3} (n= 6) con una dosis total de 0,2 mg. La inyección de 1,7 mg de Fab específico contra \alpha_{2}-AP humano en ratones a los que se les administraron 0,2 mg de \alpha_{2}-AP humano redujo el tamaño de infarto cerebral a 5,1 \pm 1,1 mm^{3} (n= 7, p= 0,0040 respecto de 0,2 mg de \alpha_{2}-AP humano)
(Figura 3B).

Los ejemplos anteriores demuestran que la reducción de actividad de \alpha_{2}-AP (expresión génica reducida de \alpha_{2}-AP o reducción de \alpha_{2}-AP circulante con inhibidores) reduce el tamaño de infarto isquémico cerebral focal, tal como se da durante ictus isquémico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Efecto de plasmina sobre el tamaño de infarto cerebral

La inyección de 50, 100 ó 150 \mug de plasmina humana (Pli) en ratones de un peso aproximado de 30 g disminuyó las concentraciones de \alpha_{2}-AP en las muestras de sangre tomadas después de 30 s hasta un 67, 40 y 31% del valor inicial, respectivamente (media de 2 ratones, con menos de un 15% de variabilidad). La inyección de 200 \mug de Pli en 3 ratones redujo las concentraciones plasmáticas de \alpha_{2}-AP hasta 59 \pm 4,8, 67 \pm 4,4 y 70 \pm 2,5 por ciento después de 2, 4 y 6 horas, respectivamente.

La ligadura de la arteria cerebral media izquierda (ACM) indujo un infarto cerebral con un volumen de 27 \pm 1,3 mm^{3} (n= 10) en ratones Balb/c consanguíneos, y de 16 \pm 1,3 mm^{3} (n= 12) en ratones C57BL/6 consanguíneos.

La inyección de 0,2 mg de Pli en ratones Balb/c redujo el tamaño de infarto a 22 \pm 1,0 mm^{3} (n= 9) (p= 0,006 respecto de solución salina). Se observaron disminuciones similares cuando la inyección de Pli se administró 15 min antes o 15 min después de la ligadura de ACM (Tabla 1). En ratones C57Bl/6, la inyección de 0,2 mg de Pli redujo el tamaño de infarto a 10 \pm 1,2 mm^{3} (n= 12) (p= 0,004 respecto de solución salina).

Referencias

1. Collen D. Staphylokinase: a potent, uniquely fibrin-selective thrombolytic agent. Nature Medicine 1998; 4: 279-284.

2. Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science 1993; 262: 689-695.

3. Coyle JT, Molliver ME, Kuhar MJ. In situ injection of kainic acid: a new method for selectively lesioning neuronal cell bodies while sparing axons of passage. J Comp Neurol 1978; 180: 301-323.

4. Tsirka S, Gualandris A, Amaral DG, Strickland S. Excitotoxin induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator. Nature 1995; 377: 340-344.

5. Tsirka S, Rogove AD, Bugge TH, Degen JL, Strickland S. An extracellular proteolytic cascade promotes neuronal degeneration in the mouse hippocampus. J Neurosci 1997; 17: 543-552.

6. Tsirka S, Rogove AD, Strickland S. Neuronal cell death and t-PA. Nature 1996; 384: 123-124.

7. Chen ZL, Strickland S. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmin-catalyzed degradation of laminin. Cell 1997; 91: 917-925.

8. Wang YF, Tsirka SE, Strickland S, Stieg PE, Soriano SG, Lipton SA. Tissue plasminogen activator (t-PA) increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild-type and tPA-deficient mice. Nature Medicine 1998; 4: 228-231.

9. Nagai N, Vanlinthout I, Collen D. Comparative effects of tissue-type plasminogen activator, streptokinase and staphylokinase on cerebral ischemic infarction and pulmonary clot lysis in hamster models. Presentado.

10. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. N Engl J Med 1995; 333: 1581-1587.

11. Hacke W, Kaste M, Fieschi C, Toni D, Lesaffre E, von Kummer R, Boysen G, Bluhmki E, Haxter G, Mahagne MH, Hennerici M, para el ECASS Study Group. Intravenous thrombolysis with recombinant tissue plasminogen activator for acute hemispheric stroke: the European Cooperative Actue Stroke Study (ECASS). J Am Med Ass 1995; 274: 1017-1025.

12. Collen D, Wiman B. Turnover of antiplasmin, the fast-acting plasmin inhibitor of plasma. Blood 1979; 53: 313-324.

13. Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J, Bronson R, De Vos R, van den Oord J, Collen D, Mulligan R. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice. Nature 1994; 368; 419-424.

14. Carmeliet P, Kieckens L, Schoonjans L, Ream B, van Nuffelen A, Prendergast G, Cole M, Bronson R, Collen D, Mulligan RC. Plasminogen activator inhibitor-1 gene-deficient mice. I. Generation by homologous recombination and characterization. J Clin Invest 1993; 92: 2746-2755.

15. Carmeliet P, Stassen JM, Schoonjans L, Ream B, Van den Oord JJ, De Mol M, Mulligan RC, Collen D. Plasminogen activator inhibitor-1 deficient mice. II. Effects on hemostasis, thrombosis and thrombolysis. J Clin Invest 1993; 92: 2756-2760.

16. Poplis VA, Carmeliet P, Vazirzadeh S, Van Vlaenderen I, Moons L, Plow EF, Collen D. Effects of disruption of the plasminogen gene on thrombosis, growth and health in mice. Circulation 1995; 92:2585-2593.

17. Lijnen HR, Okada K, Matsuo O, Collen D, Dewerchin M. \alpha_{2}-antiplasmin gene-deficiency in mice is associated with enhanced fibrinolytic potential without overt bleeding. Blood 1999; 93:2274-2281.

18. Dewerchin M, Van Nuffelen A, Wallays G, Bouché A, Moons L, Carmeliet P. Mulligan RC, Collen D. Generation and characterization of urokinase receptor-deficient mice. J Clin Invest 1996; 97: 870-878.

19. Lijnen HR, Holmes WE, Van Hoef B, Wiman B, Rodriguez H, Collen D. Amino-acid sequence of human \alpha_{2}-antiplasmin. Eur J Biochem 1987; 166: 565-574.

20. McGrory WJ, Bautista DS, Graham FL. A simple technique for the rescue of early region 1 mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 1988; 163: 614-617.

\newpage

21. Gomez-Foix AM, Coats WS, Baque S, Alam T, Gerard RD, Newgard CB. Adenovirus-mediated transfer of the muscle glycogen phosphorylase gene into hepatocytes confers altered regulation of glycogen metabolism. J Biol Chem 1992; 267: 25129-25134.

22. Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 1977; 36: 59-74.

23. Gerard RD, Meidell RS. Adenovirus vectors. En: Hames BD, Glover D (eds): DNA Cloning - A practical approach: mammalian systems. Oxford, R.U., 1995, págs 285-307.

24. Alcorn JL, Gao E, Chen Q, Smith ME, Gerard RD, Mendelson CR. Genomic elements involved in transcriptional regulation of the rabbit surfactant protein-A gene. Mol Endocrinol 1993; 7: 1072-1085.

25. Kopfler WP, Willard M, Betz T, Willard JE, Gerard RD, Meidell RS. Adenovirus-mediated transfer of a gene encoding human apolipoprotein A-I into normal mice increases circulating high-density lipoprotein cholesterol. Circulation 1994; 90: 1319-1327.

26. Carmeliet P, Stassen JM, Van Vlaenderen I, Meidell RS, Collen D, Gerard RD. Adenovirus-mediated transfer of tissue-type plasminogen activator augments thrombolysis in tissue-type plasminogen activator-deficient and plasminogen activator inhibitor-1-overexpressing mice. Blood 1997; 90: 1527-1534.

27. Carmeliet P, Moons L, Lijnen R, Janssens S. Lupu F, Collen D, Gerard RD. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation. Circulation 1997; 96: 3180-3191.

28. Deutsch DG, Mertz ET. Plasminogen purification from human plasma by affinity chromatography. Science 1970; 170: 1095-1096.

29. Edy J, De Cock F, Collen D. Inhibition of plasmin by normal and antiplasmin-depleted human plasma. Thromb Res. 1976; 8: 513-518.

30. Giles AR. Guidelines for the use of animals in biomedical research. Thromb Haemost 1987; 58: 1078-1084.

31. Welsh FA, Sakamoto T, McKee AE, Sims RE. Effect of lactacidosis on pyridine nucleotide stability during ischemia in mouse brain. J Neurochem 1987; 49: 846-851.

32. Bederson JB et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke 1986; 17: 472-476.

Claims (2)

1. El uso de un inhibidor de \alpha_{2}-antiplasmina seleccionado del grupo que consiste en plasmina, miniplasmina que carece de los cuatro primeros dominios Kringle, y microplasmina que carece de los cinco dominios Kringle, para la preparación de una composición terapéutica para la reducción del tamaño de infarto cerebral tras ictus isquémico.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el inhibidor es plasmina y la cantidad de plasmina en la composición terapéutica es aproximadamente 500 mg.