ES2276673T3 - Fracciones de membranas bacterianas con efecto adyuvante. - Google Patents

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Abstract

Utilización de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae mezclada con un antígeno o hapteno, siendo seleccionado dicho antígeno o hapteno de entre los antígenos o haptenos específicos de un agente infeccioso, o de entre los antígenos asociados con células tumorales, y siendo capaz dicha mezcla de orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o hapteno, respuesta en la que la respuesta Th1 es próxima o mayor que la respuesta de tipo Th2, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas o cánceres, caracterizada porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas: a) cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo; b) en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida; c) extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción; d) digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteásicas, seguido de una centrifugación; e) realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y f) someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e), o mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas: a) cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación; b) congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células; c) eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido; d) moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida; e) precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete; f) neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y g) esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).

Description

Fracciones de membranas bacterianas con efecto adyuvante.
La presente invención se refiere a la utilización de una fracción de membrana de bacterias gram negativas, Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o hapteno, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a orientar a la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o hapteno. La invención comprende, además, las composiciones farmacéuticas que las contienen y sus aplicaciones para la prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular infecciones provocadas por paramixovirus tales como RSV, y cánceres, en particular aquellos cuyos tumores que están asociados con antígenos tumorales.
La vacunación es un medio eficaz para prevenir o reducir en particular infecciones. El éxito de las campañas de vacunación en este campo ha hecho posible extender el concepto de vacunas a los campos de enfermedades autoinmunitarias, cáncer y fertilidad. Por otro lado, la vacunación de antígenos sólos no siempre es capaz de inducir una respuesta rápida y sostenida del anticuerpo, lo que requiere la presencia de adyuvantes, es decir, compuestos que ayudan (del latín adjuvare: ayudar) a los anticuerpos a inducir tales respuestas.
Los adyuvantes constituyen un grupo de compuestos variados con respecto a su estructura y su origen. Así, se encuentran, entre otros, en esta categoría, las emulsiones de agua en aceite (adyuvante de Freund incompleto) o de aceite en agua, los compuestos de origen bacteriano tales como derivados de lipopolisacáridos procedentes de bacterias gram negativas, y sales de aluminio. Actualmente, sólo se usan en seres humanos las sales de aluminio como adyuvantes para preparaciones de vacunas.
El desarrollo de una respuesta de anticuerpos dirigida contra un antígeno requiere una serie de sucesos complejos. Implica células que presentan el antígeno, linfocitos T reguladores (Th por T "auxiliar"), y linfocitos B productores de anticuerpos. Según el perfil de citoquinas producidas, se pueden distinguir dos tipos de linfocitos Th: los linfocitos Th de tipo 1, productores de IFN-\gamma e IL-2, y que promueven la formación de IgG2a en ratones, y los linfocitos Th de tipo 2, productores de IL-4, IL-5 e IL-10 con formación de IgG1 en ratones (Mosmann, T.R. y Sad S. Immunol. Today 1996, 17:138). Además, se ha demostrado que, para el mismo antígeno dado, es el adyuvante el que orienta hacia el isotipo predominante durante la respuesta de anticuerpos (Toellner K.-M. et al. J. Exp. Med. 1998, 187:1193). Así, se sabe que las sales de aluminio, tales como Alhydrogel, inducen, en ratones, una respuesta esencialmente de tipo Th2, y promueven la formación de IgG1 o incluso de IgE (Allison A.C. en Vaccine design - The role of cytokine networks Vol. 293, 1-9 Plenum Press 1997), lo que puede plantear problemas en sujetos con una predisposición alérgica. Además, según la diana terapéutica prevista, puede ser deseada una respuesta de tipo Th1 o de tipo (Th1/Th2) mixto.
De este modo, actualmente existe una necesidad de disponer de nuevos adyuvantes capaces de inducir una respuesta inmunitaria del tipo Th1 o (Th1/Th2) mixto, preferentemente una respuesta Th1/Th2 mixta, para la que la respuesta de Th1 es próxima a o mayor que la respuesta de Th2.
Sorprendentemente, se han demostrado propiedades particulares de la fracción de membrana de una bacteria gram negativa como Klebsiella pneumoniae (denominada FMKp), en particular fracciones de membrana obtenidas mediante procedimientos como se describen más abajo en los ejemplos. Se ha descubierto de hecho que dicha fracción de membrana FMKp, combinada con un antígeno, no sólo tuvo la capacidad de aumentar la respuesta de anticuerpos dirigida contra dicho antígeno, sino también tuvo la capacidad para reorientar la respuesta de citoquinas hacia un perfil de Th1/Th2, correspondiendo así a la actividad del adyuvante particular buscada, todo ello independientemente del modo de administración de dichas fracciones de membrana.
De este modo, la presente invención tiene por objeto la utilización de una fracción de membrana de bacterias de Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o hapteno para orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o hapteno, o para la preparación de una composición farmacéutica destinada a orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o hapteno, caracterizada porque la fracción de membrana se prepara mediante uno de los dos procedimientos tales como se describen a continuación.
Por orientación de la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto, se prefiere en particular la orientación de la respuesta inmunitaria que promueva la inducción de una respuesta de Th1 con relación a la respuesta de Th1/Th2 obtenida con el adyuvante de alumbre.
Por orientación de la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto, se prefiere más particularmente una orientación de la respuesta inmunitaria que incremente el título de anticuerpos de IgG2a dirigidos contra el antígeno asociado en un factor de por lo menos 10, preferentemente de por lo menos 25, 50 y 100, con relación al título de IgG2a obtenido con el adyuvante de alumbre.
En una manera particularmente preferida, la respuesta inmunitaria se orienta hacia una respuesta de tipo Th1 y/o Th1/Th2 mixto, en la que la respuesta de Th1 es próxima a o mayor que la respuesta de Th2. Mediante la expresión "próxima a" se entenderá que significa una respuesta que, cuando se expresa como título de anticuerpos de IgG2a dirigidos contra el antígeno asociado, es por lo menos igual a 0,5 veces, preferentemente por lo menos igual a 0,75 veces, el título del anticuerpo de IgG1 dirigido contra dicho antígeno, con un título de anticuerpo de IgG dirigido contra el antígeno asociado próximo a o mayor que el título de anticuerpo de IgG dirigido contra el antígeno asociado obtenido con el adyuvante de alumbre o de Freund.
La invención también se refiere a la utilización según la invención, caracterizada porque la fracción de membrana comprende por lo menos fracciones de membrana de dos cepas diferentes de bacterias.
Por lo tanto, la invención se refiere a una utilización según la invención, caracterizada porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
b)
en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
c)
extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
d)
digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteolíticas, seguido de una centrifugación;
e)
realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
f)
someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e).
La etapa b) de desactivación de las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a) se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido de desactivación de enzimas, tal como, en particular, calentando el pelete bacteriano resuspendido a una temperatura preferentemente próxima a 100ºC, o añadiendo un inhibidor de la actividad de estas enzimas.
La etapa c) de extracción y eliminación de las proteínas no membránicas y de los ácidos nucleicos procedentes del pelete obtenido en la etapa a) o b) se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción que corresponde a la adición de una disolución hipertónica (disolución de extracción), preferentemente una disolución salina que tiene una molaridad próxima a 1 M, seguido, después de un período de contacto que es suficiente para el efecto deseado, de la centrifugación de la suspensión obtenida, y la eliminación del sobrenadante obtenido tras dicha centrifugación, siendo posible repetir varias veces este ciclo de lavado.
La etapa d) de digestión del pelete de la membrana obtenido en la etapa c) se puede llevar a cabo en presencia de una disolución de enzimas proteolíticas, tales como, por ejemplo, tripsina, quimiotripsina, o cualquier enzima conocida con actividad proteolítica, ajustándose preferentemente las condiciones de reacción, el pH de la disolución, la temperatura y la duración de la reacción a las condiciones óptimas para la actividad de la enzima o enzimas seleccionadas, seguido de la centrifugación, siendo posible repetir varias veces este ciclo de digestión con la misma enzima, la misma combinación de enzimas o con una enzima diferente para cada ciclo de digestión realizado.
La etapa e) de lavado del pelete obtenido en la etapa d) se lleva a cabo recogiendo el pelete en disolución salina fisiológica o en agua destilada, seguido, tras un período suficiente de contacto, de la centrifugación, siendo posible repetir varias veces este ciclo de lavado.
Finalmente, la etapa f) de someter al pelete a ultrasonidos está destinada, en particular, a disgregar y homogeneizar la fracción de membrana obtenida al final de la etapa e). Las condiciones de tratamiento con ultrasonidos (duración e intensidad) se determinarán por las personas expertas en la técnica, por ejemplo según la cantidad de fracción de membrana a tratar.
La invención se refiere también a una utilización según la invención, caracterizada porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dicha bacteria en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación;
b)
congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
c)
eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
d)
moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
e)
precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
f)
neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
g)
esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
Las condiciones de descongelación en la etapa b) del procedimiento más abajo se determinarán, por supuesto, por la persona experta en la técnica según la cantidad inicial de pelete a tratar, y preferentemente se lleva a cabo a 4ºC durante por lo menos 48 horas para el equivalente de 1 kg de células secas.
En la etapa c), la eliminación de los ácidos nucleicos se lleva a cabo, por ejemplo, mediante adición de una ADNasa, a una concentración final de 5 mg/ml de una suspensión celular a una concentración equivalente a 5% de células secas.
La molienda de las células obtenidas en la etapa c) se puede llevar a cabo por medio de cualquier sistema o aparato conocido por la persona experta en la técnica para moler células, tales como prensas o, preferentemente, tales como la molienda en un bucle Manton Gaulinet durante 30 minutos.
El aclaramiento de la suspensión obtenida tras la molienda se puede llevar a cabo por medio de cualquier sistema o aparato conocido por la persona experta en la técnica para el aclaramiento de productos molidos de células bacterianas, tal como el sistema Sharpless.
La etapa e) de precipitación en medio ácido de la suspensión obtenida en la etapa d) se puede llevar a cabo, por ejemplo, con ácido acético. A la precipitación le sigue la eliminación del pelete por medio de un sistema de tipo Sharpless, y la recuperación del sobrenadante.
La etapa f) consiste en una etapa en la que el sobrenadante, obtenido tras la precipitación en medio ácido, se neutraliza, se diluye, se dializa y después se concentra.
Finalmente, la última etapa consiste en una etapa de esterilización del concentrado de fracción de membrana obtenido en la etapa anterior, tal como, por ejemplo, calentando a 121ºC durante alrededor de 35 minutos.
La invención se refiere particularmente a la utilización según la invención, caracterizada porque dicho antígeno o hapteno se selecciona de entre los antígenos o haptenos específicos de un agente infeccioso, tal como un virus, una bacteria, un hongo o un parásito, o de los antígenos asociados con células tumorales.
Según la invención, dichos antígenos o haptenos se seleccionan preferentemente de entre los péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos o lípidos.
Por supuesto, dicho antígeno o hapteno, cuando tiene naturaleza peptídica, se puede obtener mediante síntesis química o recombinante.
Los procedimientos para preparar péptidos recombinantes son actualmente bien conocidos por las personas expertas en la técnica, y no se desarrollarán en la presente descripción. Entre las células que se pueden usar para la producción de estos péptidos recombinantes, por supuesto se pueden mencionar células bacterianas (Olins P.O. y Lee S.C., 1993, Recent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520-525), pero también células de levaduras (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542), así como células de animales, en particular cultivos celulares de mamíferos (Edwards C.P. y Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4:558-563), pero también células de insectos en cuyos procedimientos se pueden usar, que implican, por ejemplo, baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus Systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572).
En una forma de realización preferida, la invención comprende la utilización según la invención, caracterizada porque dicho antígeno o hapteno está acoplado covalentemente con un péptido de soporte para formar un complejo capaz de unirse específicamente a seroalbúmina de mamífero, preferentemente dicho péptido de soporte es un fragmento peptídico derivado de la proteína estreptocócica G, en particular el fragmento C-terminal denominado BB.
Por supuesto, dicho complejo se puede preparar mediante recombinación genética.
El complejo quimérico o híbrido se puede producir mediante técnicas de ADN recombinante, insertando o añadiendo una secuencia que codifica dicho antígeno o hapteno de naturaleza proteínica a una secuencia de ADN que codifica dicho fragmento peptídico de la proteína estreptocócica G.
Los procedimientos para la síntesis de moléculas híbridas incluyen los procedimientos usados en ingeniería genética para construir polinucleótidos híbridos que codifican las secuencias polipeptídicas deseadas. Se puede hacer ventajosamente referencia a, por ejemplo, la técnica para producir genes que codifican proteínas de fusión, que se describe por D.V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990).
La invención tiene asimismo por objeto la utilización según la invención, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende, además, un agente que hace posible portar dicha fracción de membrana asociada con dicho agente, hapteno o complejo, en una forma que hace posible potenciar su estabilidad y/o su inmunogenicidad, tal como en forma de una emulsión de tipo aceite en agua o de agua en aceite, o en forma de una partícula de tipo liposómico, de microesfera o de nanosfera, o cualquier tipo de estructura que permita el encapsidamiento y la presentación, en forma de partículas, de dicha fracción de membrana asociada con dicho antígeno, hapteno o complejo.
La invención también se refiere a la utilización según la invención, caracterizada porque dicho agente se selecciona de entre sales de aluminio, sales de calcio, compuestos de origen vegetal tales como Quil A o saponina, o compuestos de origen bacteriano tales como los derivados del toxoide colérico, pertúsico o tetánico, o de la toxina termolábil de E. coli.
También se comprende en la presente invención la utilización según la invención, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende, además, un agente que hace posible regular la respuesta inmunitaria inducida por dicha fracción de membrana combinada con dicho agente, hapteno o complejo.
Entre dichos agentes reguladores, se prefieren en particular las citoquinas, los factores de crecimiento, las hormonas o los componentes celulares tales como ácidos nucleicos, una proteína de la familia de las proteínas de choque térmico o los ribosomas.
La invención tiene asimismo por objeto la utilización según la invención, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas de origen vírico, bacteriano, fúngico o parasitario.
Entre dichas enfermedades infecciosas de origen vírico, se prefieren particularmente las enfermedades infecciosas provocadas por los paramixovirus, en particular por el virus de la parainfluenzae, y más particularmente por el virus sincitial respiratorio (RSV).
En una forma de realización particular, la utilización según la invención se caracteriza porque dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na, un fragmento de la proteína G del virus que tiene una secuencia de aminoácidos SEC ID nº. 4, un péptido homólogo a G2Na cuya secuencia muestra por lo menos 80%, preferentemente 90%, 95% y 99% de identidad, tras el alineamiento o la secuencia SEC ID nº. 4, o el péptido G2Na o uno de sus homólogos, acoplado covalentemente con un fragmento C-terminal (BB) de la proteína estreptocócica G para formar un complejo capaz de unirse a seroalbúmina de mamífero, péptido BB el cual se describe en los documentos de Power et al., 1997 (Virology, 230, 155-166) y WO 96/14416.
Mediante la expresión "porcentaje, grado o nivel de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, para los fines de la presente invención, se entiende que significa un porcentaje de restos nucleotídicos o de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido tras el mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente estadístico, y estando las diferencias entre las dos secuencias distribuidas aleatoriamente a lo largo de toda la longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se llevan a cabo tradicionalmente comparando estas secuencias tras haberlas alineado de manera óptima, llevándose a cabo dicha comparación mediante segmento o mediante "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencias. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se puede llevar a cabo manualmente o por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por medio del procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], mediante programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o mediante los paquetes de comparación mediante programa de ordenador BLAST N o BLAST P).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se determina contando estas dos secuencias, óptimamente alineadas, mediante la ventana de comparación, en la que la región de la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos a comparar puede comprender adiciones o supresiones con relación a la secuencia de referencia para un alineamiento óptimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o el resto del aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado obtenido por 100, a fin de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Por ejemplo, será posible usar el programa BLAST, "BLAST 2 sequences", disponible en el sitio http://www.ncbi. nlm.nih.gov/gorf/b12.html, siendo los parámetros usados aquellos dados por defecto (en particular para los parámetros "open gap penaltie": 5, y "extension gap penaltie": 2; siendo el molde seleccionado, por ejemplo, el molde "BLOSUM 62" propuesto por el programa), calculándose el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar directamente por el programa.
De este modo, la invención se refiere a un procedimiento para preparar una fracción de membrana de bacterias gram negativas, en particular Klebsiella pneumoniae, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
b)
en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
c)
extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
d)
digerir el pelete de membrana obtenido en la etapa c), en presencia de enzimas de proteasas, seguido de la centrifugación;
e)
realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d), en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
f)
someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e).
La invención también describe el procedimiento para preparar una fracción de membrana de bacterias gram negativas, en particular Klebsiella pneumoniae, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de la centrifugación;
b)
congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
c)
eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
d)
moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
e)
precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
f)
neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
g)
esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
El contenido de proteoglicano de las fracciones de membrana capaces de ser obtenidas mediante dichos procedimientos, un ingrediente activo de FMKp, representado por la suma de los contenidos de galactosa y de proteína, está preferentemente comprendido entre:
-
para galactosa: entre 1,2 g/l y 3,4 g/l;
-
para las proteínas: entre 7,5 g/l y 14,9 g/l.
Más preferentemente, este contenido será:
-
para galactosa: entre 1,6 g/l y 2,6 g/l;
-
para las proteínas: entre 9,3 g/l y 11,7 g/l.
La invención se refiere, además, a las composiciones farmacéuticas que comprenden una fracción de membrana capaz de ser obtenida mediante los procedimientos descritos anteriormente según la utilización de la invención, y un antígeno, un hapteno o un complejo, como se definen anteriormente, asociado con dicha fracción de membrana, siendo el antígeno elegido entre fragmentos peptídicos de paramixovirus.
Por supuesto, dichas composiciones farmacéuticas según la invención pueden comprender, además, los agentes tales como los vehículos y los agentes reguladores definidos anteriormente.
En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica según la invención se caracteriza porque el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio o un virus parainfluenzae, preferentemente porque dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na que tiene la secuencia SEC ID nº. 4 del virus sincitial respiratorio, teniendo uno de sus homólogos por lo menos 80% de identidad tal como se define anteriormente, o dicho péptido G2Na, o uno de sus homólogos que tiene por lo menos 80% de identidad, acoplado covalentemente con un fragmento C-terminal (BB) de la proteína estreptocócica G para formar un complejo capaz de unirse a seroalbúmina de mamífero.
Las leyendas de las figuras y los ejemplos proporcionados a continuación están destinados a ilustrar la invención sin limitar de ninguna manera su alcance.
Leyenda de las figuras
Figura 1: BBG2Na adyuvado con FMKp - estudio de dosis y respuesta (títulos de IgG anti-G2Na del suero).
*p < 0,05 (comparado con el grupo de PBS)
Figura 2: BBG2Na adyuvado con FMKp - títulos IgG1 e IgG2a anti-G2Na.
Figura 3: BBG2Na adyuvado con FMKp - estudio de protección.
Figura 4: Efecto adyuvante de FMKp con Immugrip (vacuna de la gripe).
*p < 0,05 comparado con el grupo no adyuvado ("0") en el mismo día de la recogida de muestras.
Ejemplo 1 Obtención de la fracción de membrana de K. pneumoniae FMKp)
Procedimiento nº 1
La extracción de las membranas de K. pneumoniae I145 a partir del pelete de centrifugación de la etapa está precedida preferentemente por una etapa de destrucción de las enzimas líticas de los componentes celulares contenidos en el pelete, por ejemplo calentando estos últimos a 100ºC, opcionalmente tras redisolverlos en disolución.
La extracción real de las membranas a partir del pelete de centrifugación se lleva a cabo preferentemente tratando los componentes celulares del pelete, tras la destrucción opcional de las enzimas líticas, con una disolución salina, por ejemplo cloruro sódico 1 M, una o varias veces, seguido de la centrifugación, preferentemente a 20.000 g, de la suspensión obtenida; el sobrenadante procedente de esta centrifugación, que se elimina, contiene impurezas no membránicas tales como proteínas y ácidos nucleicos, mientras que el pelete contiene las membranas.
Tras la separación de la disolución salina que contiene las impurezas, las membranas se digieren en presencia de enzimas proteolíticas, preferentemente tripsina y quimiotripsina, en disolución a pH 8 a 37ºC durante 4 horas.
Tras la digestión, la disolución se homogeneiza mediante ultrasonidos. El producto así obtenido constituye la fracción de membrana denominada FMKp.
El sobrenadante obtenido se centrifuga nuevamente en las mismas condiciones, preferentemente a 140.000 g.
Preparación de los glicopéptidos de membrana
Esta fracción se prepara a partir del pelete obtenido mediante centrifugación a 40.000 g durante 20 minutos. Dicho pelete se resuspende en disolución salina fisiológica, y después esta suspensión se calienta durante 10 minutos a 100ºC en un baño maría de agua hirviendo, para inactivar las enzimas líticas. Después de enfriar, el medio se centrifuga durante 30 minutos a 20.000 g. El pelete obtenido se extrae dos veces con NaCl 1 M a fin de eliminar las proteínas y los ácidos nucleicos. Las membranas se recuperan mediante centrifugación durante 30 minutos a
20.000 g.
Después se someten a digestión con tripsina, a pH 8 y a 37ºC durante 4 horas, y seguidamente con quimiotripsina en las mismas condiciones.
Las membranas se recuperan entonces mediante centrifugación a 2000 g durante 30 minutos, se lavan con disolución salina fisiológica, y después con agua destilada, y se someten a disgregación mediante ultrasonidos, durante 15 minutos.
Procedimiento nº 2
Después de descongelar a +4ºC durante un mínimo de 48 h, se resuspendió 1 kg de células de K. pneumoniae secas, en disolución a 5% de células secas. Se añadió ADNasa a 5 mg/l. Después se lleva a cabo una molienda en un bucle Manton Gaulin durante 30 minutos, seguido del aclaramiento en SHARPLES a 50 l/h, seguido de la precipitación con ácido acético a pH = 4,2 + 0,1 durante 30 minutos. El pelete se eliminó (SHARPLES a 25 l/h), y el sobrenadante se neutralizó y se diluyó hasta el doble del volumen inicial con agua sometida a ósmosis. Después, se llevó a cabo la diálisis a volumen constante en PUF 100 hasta 800 \Omegacm, seguido de la concentración de la suspensión de membrana (MS) así obtenida hasta 11 l/kg de células secas. La MS se sometió entonces a autoclave a +121ºC durante 35 min., y se conservó a +4ºC durante 6 semanas.
Características de la FMKp
Por definición, el contenido de proteoglicano, un ingrediente activo de FMKp, es igual a la suma de los contenidos de galactosa y de proteínas.
-
Galactosa: por término medio 2,2 g/l;
-
proteínas: por término medio 10,5 g/l.
Ejemplo 2 Efecto adyuvante de FMKp sobre una proteína recombinante, BBG2Na
BBG2Na es una proteína recombinante producida en E. coli. Consiste en el péptido G2Na que tiene la secuencia SEC ID nº: 4, el fragmento de la proteína G del virus sincitial respiratorio (RSV) de tipo A que se extiende desde el resto 130 hasta el resto 230, fusionado con BB, un fragmento de la proteína estreptocócica G, que tiene la capacidad para unirse a seroalbúmina. BBG2Na es una vacuna anti-RSV (Power U. Virology 1997, 230:155-166).
Ratones BALB/c recibieron 2 inyecciones subcutáneas de 20 \mug de BBG2Na, y diversas cantidades de FMKp. Se recogieron muestras de sangre en el D28, y se determinaron los títulos de anticuerpos séricos mediante ELISA con G2Na en fase sólida. Los resultados obtenidos se ilustran mediante la figura 1. Sorprendentemente, muestran que FMKp aumenta significativamente la respuesta de IgG anti-G2Na; el título de IgG anti-G2Na alcanzado es similar a los inducidos por el adyuvante de alumbre o de Freund. El efecto depende de la dosis: se observa a partir de 5 \mug de FMKp, es máximo a partir de 50 \mug de FMKp, y permanece estable con 100 \mug de FMKp. Por lo tanto, FMKp es un adyuvante potencial para BBG2Na.
Para conocer el efecto de FMKp sobre la orientación de la respuesta inmunitaria, en términos de respuesta de Th1/Th2, se determinaron los títulos de IgG1 e IgG2a anti-G2Na en los sueros obtenidos como se especifica anteriormente. Los resultados (figura 2) muestran que, sorprendentemente, FMKp es capaz de modificar la relación IgG1/IgG2a anti-G2Na, en contraste con lo que se observa con el alumbre, para el cual el isotipo predominante es IgG1. Este perfil está próximo al inducido mediante el adyuvante de Freund. Esto indica que FMKp se puede usar como adyuvante de inmunidad para inducir una respuesta de tipo (Th1/Th2) mixta.
Los animales inmunizados como se describe anteriormente recibieron una exposición vírica mediante la vía nasal con 10^{5} TCID_{50} de RSV-A. Esto se llevó a cabo 3 semanas después de la última inmunización. Cinco días después de la exposición vírica, los animales se sacrificaron, y se retiraron los pulmones a fin de determinar los títulos de RSV-A. Los resultados (figura 3) muestran que los animales que recibieron BBG2Na adyuvado con FMKp están protegidos contra una exposición de RSV-A.
En conclusión, FMKp permite reorientar la respuesta de anticuerpos sin afectar la capacidad de proteger a los ratones frente a una exposición de VRS-A.
Ejemplo 3 Efecto adyuvante de FMKp sobre un virus inactivado (vacuna de la gripe)
Ratones BALB/c recibieron una única inyección de 0,01 \mug de Immugrip^{TM} (vacuna de la gripe comercializada por Laboratoires INAVA), y diversas cantidades de FMKp. Los productos se coadministraron. La inyección se realiza subcutáneamente en el D0. Las muestras de sangre se recogieron en los días D7, D14 y D21. Se determinó el título de anticuerpos IgG séricos anti-Immugrip mediante ELISA, con Immugrip a 2 \mug/ml en fase sólida. Los resultados presentados (figura 4) muestran que FMKp incrementa significativamente el título de anticuerpos anti-Immugrip, ocurriendo esto desde la dosis más baja de FMKp, a saber, 0,1 \mug. El efecto adyuvante depende de la dosis. Interesantemente, se observa que la presencia de FMKp induce la generación de una respuesta de anticuerpos más temprana, obtenida a partir del día D7, en comparación con el control de Immugrip no adyuvado. Este efecto no se obtiene con el adyuvante de referencia, el adyuvante Freund completo (CFA).
<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT
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<120> UTILIZACIÓN DE FRACCIONES DE MEMBRANAS BACTERIANAS CON EFECTO ADJUVANTE, SUS PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN Y COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE LAS CONTIENEN.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D17975
\vskip0.400000\baselineskip
<140> FR 99 03513
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<141> 15-03-1999
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<160> 4
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<170> PatentIn Vers. 2.0
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<210> 1
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<211> 1035
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<212> ADN
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<213> Klebsiella pneumoniae 
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<220>
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<221> exón
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<222> (1)..(1032)
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<220>
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<221> intrón
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<222> (1033)..(1035)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1032)
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<400> 1
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1
2 
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<210> 2
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<211> 344
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<212> PRT
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<213> Klebsiella pneumoniae 
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<400> 2
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3
4 
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<210> 3
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<211> 303
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<212> ADN
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<213> Virus sincitial respiratorio, G2Na
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(303)
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<400> 3
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5 
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<210> 4
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<211> 101
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<212> PRT
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<213> Virus sincitial respiratorio, G2Na
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<400> 4
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6

Claims (22)

1. Utilización de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae mezclada con un antígeno o hapteno, siendo seleccionado dicho antígeno o hapteno de entre los antígenos o haptenos específicos de un agente infeccioso, o de entre los antígenos asociados con células tumorales, y siendo capaz dicha mezcla de orientar la respuesta inmunitaria hacia una respuesta de tipo Th1 y/o de tipo Th1/Th2 mixto dirigida contra dicho antígeno o hapteno, respuesta en la que la respuesta Th1 es próxima o mayor que la respuesta de tipo Th2, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas o cánceres, caracterizada porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
b)
en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
c)
extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
d)
digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteásicas, seguido de una centrifugación;
e)
realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
f)
someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e), o
mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación;
b)
congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
c)
eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
d)
moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
e)
precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
f)
neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
g)
esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque la fracción de membrana comprende por lo menos fracciones de membrana de dos cepas distintas de bacterias.
3. Utilización según la reivindicación 2, caracterizada porque dicho antígeno o hapteno se selecciona de entre péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos o lípidos.
4. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicho antígeno o hapteno se acopla covalentemente a un péptido de soporte para formar un complejo capaz de unirse específicamente a la seroalbúmina de mamífero.
5. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada porque dicho péptido de soporte es un fragmento peptídico que proviene de la proteína G del estreptococo.
6. Utilización según una de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizada porque dicho complejo se prepara mediante recombinación genética.
7. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende además un agente que permite vehicular dicha fracción de membrana asociada a dicho antígeno, hapteno o complejo, en una forma que permite mejorar su estabilidad y/o su inmunogenicidad.
8. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque dicho agente es una emulsión de tipo aceite en agua o agua en aceite.
9. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque dicho agente es una partícula de tipo liposoma, microesfera, nanoesfera o cualquier tipo de estructura que permita el encapsulamiento y la presentación en forma de partículas de dicha fracción de membrana asociada a dicho antígeno, hapteno o complejo.
10. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque dicho agente se selecciona de entre sales de aluminio, sales de calcio, compuestos de origen vegetal tales como Quil A o saponina, o compuestos de origen bacteriano tales como los derivados del toxoide colérico, pertúsico o tetánico, o de la toxina termolábil de E. coli.
11. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende además un agente que permite regular la respuesta inmunitaria inducida por dicha fracción de membrana asociada a dicho antígeno, hapteno o complejo.
12. Utilización según la reivindicación 11 caracterizada porque dicho agente de regulación se selecciona de entre citoquinas, factores de crecimiento, hormonas o componentes celulares tales como ácidos nucleicos, una proteína de la familia de las proteínas de choque térmico o los ribosomas.
13. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 12, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas, caracterizada porque la enfermedad infecciosa es de origen vírico, bacteriano, fúngico o parasitario.
14. Utilización según la reivindicación 13, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención o tratamiento de infecciones mediante paramixovirus.
15. Utilización según la reivindicación 14, caracterizada porque el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio.
16. Utilización según la reivindicación 15, caracterizada porque dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na de secuencia SEC ID nº 4, o uno de sus homólogos cuya secuencia presenta un grado de identidad de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 4.
17. Utilización según la reivindicación 16, caracterizada porque dicho péptido G2Na o uno de sus homólogos se acopla mediante unión covalente a un fragmento C-terminal (BB) de la proteína G de estreptococo para formar un complejo capaz de unirse a la seroalbúmina de mamífero.
18. Utilización según la reivindicación 14, caracterizada porque el paramixovirus es un virus parainfluenzae.
19. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una fracción de membrana y un antígeno o hapteno mezclado con dicha fracción de membrana, caracterizada porque dicho antígeno se selecciona de entre fragmentos peptídicos de paramixovirus, y caracterizada porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido de la centrifugación de dicho cultivo;
b)
en caso necesario, desactivar las enzimas líticas del pelete bacteriano obtenido en la etapa a), seguido de la centrifugación de la suspensión obtenida;
c)
extraer y eliminar las proteínas no membránicas y los ácidos nucleicos del pelete obtenido en la etapa a) o b) mediante por lo menos un ciclo de lavado del pelete en una disolución de extracción;
d)
digerir el pelete de la membrana obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteásicas, seguido de una centrifugación;
e)
realizar por lo menos un ciclo de lavado del pelete obtenido en la etapa d) en disolución salina fisiológica y/o en agua destilada; y
f)
someter a ultrasonidos el pelete obtenido en la etapa e), o
mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a)
cultivar dicha bacteria en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en caso necesario, de una centrifugación;
b)
congelar el medio de cultivo o el pelete obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y secado de las células;
c)
eliminar, por medio de una ADNasa, los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), las cuales se han resuspendido;
d)
moler las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
e)
precipitar, en un medio ácido, la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el pelete;
f)
neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de la diálisis y concentración de la suspensión de membrana; y
g)
esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, caracterizada porque el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio o un virus parainfluenzae.
21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, caracterizada porque dicho antígeno asociado con la fracción de membrana comprende el péptido G2Na de secuencia SEC ID nº 4 del virus sincitial respiratorio, o un péptido cuya secuencia presenta un grado de identidad de por lo menos 80% con la secuencia SEC ID nº 4.
22. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, caracterizada porque dicho péptido G2Na o uno de sus homólogos se acopla mediante unión covalente a un fragmento C-terminal (BB) de la proteína G de estreptococo para formar un complejo capaz de unirse a la seroalbúmina de mamífero.
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