ES2276844T3 - Esteres de acido 5-aminolevulinico como agentes fotosensibilizantes en fotoquimioterapia. - Google Patents

Abstract

Un compuesto para utilizar en fotoquimioterapia o diagnóstico, siendo dicho compuesto de la fórmula I: R22N-CH2COCH2-CH2CO-OR1 (I) (donde R1 representa un grupo alquilo C1 ó C2 sustituido por uno o más grupos arilo; y R2 independientemente representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

Ésteres de ácido 5-aminolevulínico como agentes fotosensibilizantes en fotoquimioterapia.

La presente invención se refiere a nuevos derivados del ácido 5-aminolevulínico (ALA), y en particular a ésteres de ALA y a su utilización como agentes fotosensibilizantes en la fotoquimioterapia o el diagnóstico.

La fotoquimioterapia, o terapia fotodinámica (PDT) como también se la conoce, es una técnica para el tratamiento de diversas anormalidades o enfermedades de la piel u otros órganos epiteliales o mucosos, especialmente cánceres o lesiones precancerosas, así como determinadas lesiones no malignas, por ejemplo lesiones de piel tales como psoriasis. La fotoquimioterapia implica la aplicación de agentes fotosensibilizantes (fotoquimioterapéuticas) en las áreas del cuerpo afectadas, seguidas por la exposición a luz fotoactivadora, con el objetivo de activar los agentes fotosensibilizantes y convertirlos a su forma citotóxica, en la que las células afectadas son eliminadas o su potencial proliferativo es disminuido.

Se conocen múltiples agentes fotosensibilizadores, incluyendo notablemente los psoralenos, las porfirinas, las clorinas y los ptalocianinas. Tales fármacos se convierten en tóxicos cuando se exponen a la luz.

Los fármacos fotosensibilizadores pueden ejercer sus efectos mediante una variedad de mecanismos, directamente o indirectamente. Así, por ejemplo, ciertos fotosensibilizadores se convierten en tóxicos directamente cuando se activan por la luz, mientras que otros actúan para generar especies tóxicas, por ejemplo agentes oxidantes tales como el oxígeno singlete u otros radicales libres derivados del oxígeno, que son extremadamente destructivos para el material celular, y biomoléculas tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los psoralenos son un ejemplo de fotosensibilizadores que actúan directamente; después de la exposición a la luz pueden formar aductos y entrecruzamientos entre las dos hebras de moléculas de DNA, inhibiendo de esta forma la síntesis de DNA. El riesgo infortunado de esta terapia es que pueden ocurrir efectos secundarios mutagénicos y carcinogénicos no desea-
dos.

Esta desventaja puede evitarse seleccionando agentes fotosensibilizadores con un mecanismo de acción alternativo, indirecto. Por ejemplo las porfirinas, que actúan indirectamente mediante la generación de especies tóxicas de oxígeno, no tienen efectos secundarios mutagénicos, y representan a los candidatos más favorables para la fotoquimioterapia. Las porfirinas son precursores naturales de la síntesis del grupo heme. En particular, el grupo heme se produce cuando el hierro (Fe^{3+}), se incorpora a la fotoporfirina IX (Pp), mediante la acción de la enzima ferroquelatasa. La Pp es un potente fotosensibilizador, mientras que el heme no tiene efecto fotosensibilizante.

Uno de tales fármacos basados en porfirinas, el Photofrin®, ha sido aprobado recientemente como fotosensibilizador en la terapia de algunos cánceres. La principal desventaja es que, como debe administrarse parenteralmente, generalmente por vía intravenosa, produce fotosensibilización de la piel que puede durar varias semanas después de la inyección intravenosa. El Photofrin consiste en oligómeros grandes de porfirina y no penetra fácilmente en la piel cuando se aplica de forma tópica. Existen problemas similares con otros fotosensibilizadores basados en porfirina, tales como el denominado "derivado de hematoporfirina" (Hpd), que también se ha referido por su utilización en fotoquimioterapia de cáncer (véase, por ejemplo, S. Dougherty, J Natl Cancer Ins., 1974, 52; 1333; Kelly and Snell, J Urol 1976; 115: 150). El Hpd es una mezcla compleja obtenida mediante el tratamiento de la hematoporfirina con ácidos sulfúrico y acético, después del cual el producto acetilado se disuelve con álcali.

Para superar estos problemas, se ha investigado el potencial fototerapéutico de los precursores de la Pp. En particular, se ha investigado el precursor de Pp ácido 5-aminolevulínico (ALA) como agente fotoquimioterapéutico para ciertos cánceres de piel. El ALA, que se forma a partir de succinil CoA y glicina en la primera etapa de la síntesis de heme, es hasta una extensión limitada, capaz de penetrar la piel, y lleva a la formación localizada de Pp; como la acción de la ferroquelatasa (la enzima metalizadora), es la etapa limitante en la síntesis de heme, un exceso de ALA lleva a una acumulación de Pp, el agente fotosensibilizador. Así, aplicando el ALA tópicamente a los tumores de piel y, después de varias horas, exponiendo los tumores a la luz, puede obtenerse un efecto quimioterapéutico beneficioso (véase por ejemplo el Documento WO91/01727). Como la piel que recubre los basilomas y los carcinomas de células escamosas es más fácilmente penetrable por el ALA que la piel sana, y como la concentración de ferroquelatasa es baja en los tumores de piel, se ha observado que la aplicación tópica de ALA lleva a una producción selectivamente aumentada de Pp en los tumores.

Sin embargo, la fotoquimioterapia con ALA no siempre es enteramente satisfactoria. El ALA no es capaz de penetrar en todos los tumores y otros tejidos con suficiente eficacia como para permitir el tratamiento de un amplio grupo de tumores u otras enfermedades, y el ALA también tiende a ser inestable en las formulaciones farmacéuticas. Estos problemas se han superado mucho mediante la utilización de alquil ésteres de ALA no sustituidos, de cadena recta, que exhiben selectividad mejorada por los tejidos anormales, localización no sistémica de los agentes administrados, ingestión y producción de PpIX mejoradas, y reducción de la sensación de dolor durante la administración (véase Documento WO96/28412).

La base de datos Xfire, entradas 3060978, 5347132, 5499790, 5620924, 5633390, 5991317 y 6517740 (Beilstein); Cosmo Sogo Kenkyusho KK, Patent Abstracts of Japan, Vol 16; Nº 156 (C-0930), 16.4.1992; Documento EP-A-316179 (Tokuyama Soda KK); Documento GB-A-2058077 (Hudson et al.) y Documento DE-A-2411382
(Boehringer Sohn Ingelheim), describen derivados alquil ésteres de ácido 5-aminolevulínico, y sus derivados y sales, y los procedimientos para su preparación.

Sin embargo, estos compuestos todavía exhiben algunas limitaciones para su uso como compuestos farmacéuticos en PDT, por ejemplo, una eficacia relativamente baja, y así existe una necesidad de agentes fotoquimioterapéuticos alternativos, en particular agentes fotoquimioterapéuticos que exhiban una eficacia mejorada sobre los conocidos en la técnica.

La presente invención investiga esta necesidad y en particular procura proporcionar agentes fotoquimioterapéuticos que son mejores compuestos farmacéuticos, es decir que tienen un efecto fotoquimioterapéutico aumentado sobre los descritos en la técnica anterior.

Se ha descrito ahora que una clase de derivados de ésteres ALA, que contienen esencialmente ésteres bencil ALA sustituidos, son adecuados para fotoquimioterapia. En particular, se ha descrito que algunos de dichos compuestos proporcionan ventajas sorprendentes, aumentando las propiedades PDT comparados con compuestos conocidos.

Así, vista desde un aspecto, la invención proporciona un compuesto para utilizar en fotoquimioterapia o diagnóstico, teniendo dicho compuesto la fórmula general I:

(I)R^{2}_{2}N-CH_{2}COCH_{2}-CH_{2}CO-OR^{1}

(en la que R^{1} representa un grupo alquilo C_{1} o C_{2} sustituido por uno o más grupos arilo; y R^{2} independientemente representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo sustituido opcionalmente) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Como aquí se utiliza, el término "alquilo", a no ser que se establezca de otra forma, incluye cualquier grupo hidrocarbonado de cadena de larga o corta, cíclica, lineal o ramificada, alifático, saturado o insaturado. Los grupos alquilo insaturados pueden ser mono o poli-insaturados, e incluyen tanto grupos alquenilo como alquinilo. A no ser que se establezca de otra forma, dichos grupos pueden contener hasta 40 átomos. Sin embargo, se prefieren los grupos alquilo que contienen hasta 10, preferiblemente hasta 8, particularmente preferiblemente hasta 6, especialmente preferiblemente hasta 4 átomos.

Los grupos R^{2} alquilo sustituidos pueden ser mono o polisustituidos.

El término "acilo" como aquí se utiliza, incluye tanto grupos carboxilato como carbonato, así, los grupos alquilo sustituidos por aciloxi incluyen por ejemplo al alquilcarboniloxi alquilo. En dichos grupos cualquier resto alquileno preferiblemente tiene contenidos de átomos de carbono definidos aquí por grupos alquilo.

Los grupos R^{2} alquilo sustituidos que están presentes en los compuestos de la fórmula I incluyen alquilo C_{1-2}, (por ejemplo metilo) sustituido (preferiblemente terminalmente sustituido), por un grupo arilo. Los grupos arilo preferidos incluyen fenilo, difenilo y miembros monocíclicos de 5-7 miembros, por ejemplo de 5 ó 6 miembros, heteroaromáticos, especialmente fenilo, y tales grupos pueden por sí mismos opcionalmente ser sustituidos, por ejemplo por uno o más (por ejemplo uno o dos) grupos alquilo C_{1-6} (preferiblemente alquilo C_{1-4}, por ejemplo metilo), grupos alcoxi (por ejemplo metoxi), grupos nitro, fluoro, cloro o trifluorometilo. Grupos heteroaromáticos adecuados incluyen aquellos que contienen al menos un heteroátomo seleccionado de oxígeno, sulfuro y nitrógeno. Un grupo heteroaromático preferido es piridina.

En un hecho particularmente preferido, R^{1} representa:

un grupo C_{1} o C_{2} alquilo sustituido por arilo,

donde preferiblemente dicho grupo arilo está sustituido, especialmente preferiblemente sustituido por uno o más grupos alquilo (por ejemplo C_{1-2} alquilo), alcoxi (por ejemplo metoxi), flúor, cloro, nitro o trifluorometilo.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona nuevos compuestos. Así, la presente invención proporciona compuestos de la fórmula I,

(I)R^{2}_{2}-N-CH_{2}COCH_{2}-CH_{2}CO-OR^{2}

(donde R^{2} representa un grupo C_{1} o C_{2} alquilo sustituido por arilo, donde dicho grupo arilo está sustituido;

R^{2}, cada uno de los cuales puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido;

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donde dichos sustitutos se seleccionan de grupos hidroxi, alcoxi, aciloxi, alcoxicarboniloxi, amino, arilo, nitro, oxo, flúor, -SR^{3}, -NR^{3}_{2} y -PR^{3}_{2}, y dichos grupos alquilo están opcionalmente interrumpidos por uno o más grupos -O-, -NR^{3}-, -S- ó -PR^{3}-; y

R^{3} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Preferiblemente R^{2} son ambos átomos de hidrógeno y así, en una realización preferida, la invención proporciona ésteres de bencil ALA sustituidos, que pueden utilizarse en métodos de la invención.

Así, los compuestos preferidos de la invención o para utilizar en métodos de la invención, comprenden éster de bencil ALA, éster de p-metilbencil ALA, éster de p-nitrobencil ALA, éster de p-[trifluorometil]bencil ALA, éster de p-fluorobencil ALA, éster de 4-clorobencil ALA, éster de metilbencil ALA y éster de 2-metilbencil ALA.

Los compuestos de la invención o para utilizar en la invención pueden prepararse utilizando procesos y procedimientos estándar bien conocidos en la técnica, para derivación de compuestos multifuncionales, y especialmente esterificación. Como se conoce en la técnica, dicha esterificación de compuestos puede implicar la protección y desprotección de grupos apropiados de tal forma que solo los grupos requeridos permanezcan activos, y tomen parte en la reacción, bajo las condiciones de esterificación. Así, por ejemplo, los sustitutos de los alcanoles sustituidos utilizados para preparar los ésteres, pueden protegerse durante la esterificación. De forma similar, el grupo NH_{3}^{2} del compuesto que contribuye este grupo de compuestos de la fórmula I, puede protegerse durante la reacción y desprotegerse posteriormente. Dichos procedimientos de protección/desprotección son bien conocidos en la técnica de preparación de derivados, y en particular, ésteres de aminoácidos bien conocidos, véase por ejemplo Mcomie en "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum, 1973, y TW Greene en "Protective Groups in Organic Chemistry", Wiley-Interscience, 1981.

En un aspecto más, la invención proporciona un proceso para preparar compuestos de la fórmula I, donde dicho proceso comprende al menos una de las siguientes etapas:

(a) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula II

(II)R^{2}_{2}N-CH_{2}COCH_{2}-CH_{2}CO-X

(donde X representa un grupo donante, por ejemplo un grupo hidroxilo, un átomo halógeno o un grupo alcoxi o COX representa un grupo anhídrido ácido y R^{2} es como se ha definido previamente)

con un compuesto de la fórmula III

(III)R^{1}-OH

(donde R^{1} es como se ha definido previamente); y

(b) convertir un compuesto de la fórmula I en una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

La reacción de la etapa (a) puede llevarse a cabo convenientemente en un disolvente o mezcla de disolventes tales como agua, acetona, dietiléter, metilformamida, tetrahidrofurano etc, a la temperatura del punto de ebullición de la mezcla, preferiblemente a temperatura ambiente.

Las condiciones de las reacciones de esterificación dependerán del alcohol utilizado y las condiciones pueden seleccionarse de tal forma que se obtenga el máximo rendimiento del éster. Como las reacciones de esterificación son reacciones de equilibrio reversibles, las condiciones de reacción pueden seleccionarse de tal forma que se obtenga el máximo rendimiento del producto éster. Dichas condiciones pueden obtenerse seleccionando un disolvente que sea capaz de eliminar el agua formada en una reacción de esterificación típica, mediante la formación de un azeotropo con agua. Ejemplos de tales disolventes son los hidrocarburos aromáticos u otros capaces de formar azeotropos con agua, por ejemplo algunos hidrocarburos clorados tales como cloroformo. Para la formación de los ésteres bajos de 5-ALA, las reacciones de equilibrio pueden dirigirse hacia la parte del éster, utilizando un exceso grande del alcohol. Con otros ésteres, el equilibrio puede dirigirse hacia el producto éster utilizando un exceso grande del
ácido.

Las reacciones de esterificación son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, como las describen Saul Patai en "The chemistry of the carboxylic acids and esters", (Cap. 11, pag. 505, Interescience 1969) y Houban Weyl, (Methoden der Organische Chemie, Band E5, "Carbonsauren und carbosauren-derivate", pag. 504, Georg Thieme Verlag, 1985). La formación de derivados de aminoácidos está descrita en Band XI/2 de la misma serie, (Houben Weyl, Methoden der Organische Chemie, Band XI/2, "Stickstoffverdindungen", pag. 269, Georg Thieme Verlag, 1958).

La reacción de la etapa (a) se llevará a cabo convenientemente en presencia de un catalizador, por ejemplo un ácido inorgánico u orgánico o un agente de unión a ácido tal como una base.

Los compuestos utilizados como materiales de inicio son conocidos en la literatura, y en muchos casos disponibles comercialmente, o pueden obtenerse utilizando métodos conocidos per se. El ALA, por ejemplo, está disponible de Sigma o de Photocure ASA, Oslo, Noruega.

Como se ha mencionado previamente, los compuestos de la invención o para utilizar según la invención, pueden tomar la forma de sales farmacéuticamente aceptables. Dichas sales preferiblemente son sales de adición de ácido con ácidos orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables. Ácidos adecuados incluyen, por ejemplo, ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, láctico, cítrico, tartárico, succínico, maleico, fumárico y ascórbico. También pueden producirse sales hidrófobas convenientemente, por ejemplo mediante precipitación. Las sales apropiadas incluyen por ejemplo, sales de acetato, bromuro, cloruro, citrato, clorhídrico, maleato, mesilato, nitrato, fosfato, sulfato, tartrato, oleato, estearato, tosilato, calcio, meglumina, potasio y sodio. Los procedimientos para la formación de sales son convencionales en la técnica.

Como se ha mencionado previamente, los compuestos de la invención y para utilizar según la invención y sus sales, tienen propiedades farmacológicas valiosas, principalmente propiedades fotosensibilizadoras que las hace útiles como agentes fotoquimioterapéuticos.

Un aspecto más de la presente invención proporciona, de acuerdo a ella, una composición farmacéutica que comprende un compuesto como el descrito aquí anteriormente, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, junto con al menos un transportador o excipiente farmacéutico.

En todavía un aspecto más, también se proporciona la utilización de un compuesto como el descrito aquí anteriormente, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un agente terapéutico para utilizar en fotoquimioterapia o un agente diagnóstico para utilizar en diagnóstico, y especialmente para el tratamiento de enfermedades o anormalidades de las superficies externa e interna del cuerpo, que responden a la fotoquimioterapia.

Las anormalidades y enfermedades que pueden tratarse según la presente invención, incluyen cualquier anormalidad o enfermedad maligna, pre-maligna y no maligna, que responde a fotoquimioterapia, por ejemplo tumores y otros crecimientos, enfermedades de la piel tales como psoriasis o queratosis actínica y acné, abrasiones de la piel, infecciones virales o fúngicas, por ejemplo infecciones por virus Herpes. La invención es particularmente adecuada para el tratamiento de enfermedades, alteraciones o anormalidades en las que se forman lesiones discretas, a las que se pueden aplicar directamente las composiciones (lesiones se utiliza aquí en un sentido amplio, para incluir tumores y similares).

Las superficies interna y externa del cuerpo que pueden tratarse según la invención, incluyen la piel y todas las otras superficies epiteliales y serosas, incluyendo por ejemplo la mucosa, las capas limitantes de los órganos, por ejemplo, el tracto respiratorio, el gastro-intestinal y el génito-urinario, y las glándulas con conductos que vacían en dichas superficies (por ejemplo el hígado, las glándulas salivares y las vesículas seminales). Además de la piel, dichas superficies incluyen por ejemplo, las capas limitantes de la vagina, el endometrio y el urotelio. Dichas superficies pueden también incluir cavidades formadas en el cuerpo después de la escisión de tumores tales como los gliomas.

Ejemplos de superficies incluyen por lo tanto: (i) la piel y la conjuntiva; (ii) la capa limitante de la boca, la faringe, el esófago, el estómago, los intestinos y los apéndices intestinales, el recto y el canal anal; (iii) la capa limitante de las fosas nasales, los senos nasales, la nasofaringe, la tráquea, los bronquios y los bronquiolos; (iv) la capa limitante de los uréteres, la vejiga urinaria y la uretra; (v) la capa limitante de la vagina, el cuello uterino y el útero; (vi) la pleura parietal y visceral, (vii) la capa limitante de las cavidades peritoneal y pélvica, y las superficies de los órganos contenidos dentro de esas cavidades; (viii) la duramadre y las meninges; (ix) cualquier tumor localizado en un tejido sólido que pueda hacerse accesible a la luz fotoactivadora, por ejemplo directamente, en el momento de la cirugía, o a través de una fibra óptica insertada a través de una aguja.

Las composiciones de la invención pueden ser formuladas de manera convencional con uno o más transportadores o excipientes fisiológicamente aceptables, según técnicas bien conocidas en la técnica. Cuando sea apropiado, en un aspecto preferido de la invención, los compuestos o composiciones de la invención según la invención son esterilizados, por ejemplo mediante irradiación \gamma, mediante autoclavado o esterilización por calor, antes o después de la adición de un transportador o excipiente cuando éste está presente, para proporcionar formulaciones estériles.

Las composiciones pueden administrarse tópicamente, oralmente o sistémicamente. Se prefieren las composiciones tópicas, e incluyen geles, cremas, ungüentos, pulverizadores, lociones, emplastos, barras, jabones, polvos, pesarios, aerosoles, gotas, soluciones y cualquier otra forma farmacéutica convencional conocida en la técnica.

Los ungüentos, geles y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes adecuados espesantes y/o gelidificantes. Las lociones pueden formularse con una base acuosa o aceitosa y también contendrán, en general, uno o más agentes emulsionantes, dispersantes, suspendedores, espesantes o colorantes. Los polvos pueden formarse con la ayuda de cualquier base de polvos adecuada. Las gotas y las soluciones pueden formularse con una base acuosa o no acuosa, y también contendrán uno o más agentes dispersantes, disolventes o suspendedores. Los pulverizadores en aerosol son liberados convencionalmente de envases presurizados, con la utilización de un propelente adecuado.

Alternativamente, las composiciones pueden proporcionarse en una forma adaptada para administración oral o parenteral, por ejemplo mediante inyecciones intradérmicas, subcutáneas, intraperitoneales o intravenosas. Así, las formas farmacéuticas alternativas incluyen tabletas simples o recubiertas, cápsulas, suspensiones y soluciones que contienen el componente activo, opcionalmente junto con uno o más transportadores y/o diluyentes convencionales inertes, por ejemplo, con almidón de maíz, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, agua, agua/etanol, agua/glicerol, agua/sorbitol, agua/polietilén-glicol, propilén-glicol, estearil-alcohol, carboximetilcelulosa, o sustancias grasas tales como grasa dura o sus mezclas adecuadas.

Las composiciones pueden adicionalmente incluir agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes suspendedores, agentes conservantes, agentes edulcorantes, agentes sazonadores, aumentadores de la absorción, por ejemplo agentes de penetración en superficie como los mencionados más adelante, y similares. Las composiciones de la invención pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo, después de la administración al paciente, empleando procedimientos bien conocidos en la técnica. También pueden utilizarse agentes disolventes y/o estabilizadores, por ejemplo ciclodextrinas (CD) \alpha, \beta, \gamma y HP-\beta ciclodextrina. Las composiciones pueden estar en cualquier forma de dosificación apropiada, por ejemplo como una emulsión o en liposomas, niosomas, microesferas, nanopartículas o similares. Los compuestos de la invención pueden ser absorbidos a, incorporados a o unidos a estas formas.

La concentración de los compuestos, tal como se describen de aquí en adelante en las composiciones, depende de la naturaleza del compuesto, la composición, el modo de administración, la enfermedad que va a tratarse y el paciente, y puede variarse o ajustarse según se seleccione. Generalmente, sin embargo, los intervalos de concentración desde 0,01 hasta 50%, por ejemplo desde 0,05 hasta 20%, por ejemplo 1-10% (peso/peso) son adecuados. Para aplicaciones terapéuticas, los intervalos de concentración de desde 0,1 hasta 50% han demostrado ser adecuados, por ejemplo desde 0,2 hasta 30% (peso/peso). Pueden utilizarse dosis menores cuando se preparan derivados que son altamente lipofílicos, por ejemplo un intervalo de concentración de desde 0,01 hasta 10%, por ejemplo desde 0,02 hasta 1% (peso/peso).

La administración tópica en lugares inaccesibles puede conseguirse mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante la utilización de catéteres u otros sistemas de liberación de fármacos apropiados.

Después de la administración a una superficie, el área tratada se expone a la luz para conseguir el efecto fotoquimioterapéutico. La cantidad de tiempo después de la administración, a la cual tiene lugar la exposición a la luz, dependerá de la naturaleza de la composición, la enfermedad que va a tratarse y la forma de administración. Esta puede estar generalmente en el orden de 0,5 a 48 horas, por ejemplo de 1 a 10 horas.

La irradiación en general se aplicará a un nivel de dosis de 40 a 200 Julios/cm^{2}, por ejemplo a 100 Julios/cm^{2}.

La longitud de onda utilizada para irradiación puede seleccionarse para conseguir un efecto fotoquimioterapéutico más eficaz. Convencionalmente, cuando las porfirinas se utilizan en fotoquimioterapia, se irradian con una luz a alrededor del máximo de absorción de la porfirina. Así, por ejemplo en el caso de la utilización de ALA en la técnica anterior en fotoquimioterapia del cáncer de piel, se han utilizado las longitudes de onda en el intervalo de 350-640 nm, preferiblemente de 610-635 nm.

Sin embargo, seleccionando un intervalo amplio de longitudes de onda para irradiación, que se extiende más allá del máximo de absorción de las porfirinas, el efecto fotosensibilizante puede aumentarse. Sin querer ligarse a una teoría, se piensa que esto es debido al hecho de que cuando la Pp, y otras porfirinas, se exponen a una luz que tiene longitudes de onda dentro de su espectro de absorción, se degrada en varios foto-productos incluyendo en particular fotoporfirina (PPp). La PPp es una clorina y tiene un efecto fotosensibilizante considerable; su espectro de absorción se alarga hasta longitudes de onda mayores, más allá de las longitudes de onda a las cuales la Pp absorbe, es decir, hasta casi 700 nm (La Pp no absorbe casi luz por encima de 650 nm).

Así en fotoquimioterapia convencional, las longitudes de onda utilizadas no excitan a la PPp y de esta forma no obtienen el beneficio de su efecto fotosensibilizante adicional. La irradiación con longitudes de onda en el intervalo de 500-700 nm se ha encontrado particularmente efectiva. Es particularmente importante incluir longitudes de onda entre 630 y 690 nm.

Un método de tratamiento fotoquimioterapéutico de enfermedades o anormalidades de las superficies externas o internas del cuerpo, comprenden administrar a las superficies afectadas, una composición como se define de aquí en adelante, y exponer dicha superficie a la luz, preferiblemente a una luz en la región de longitud de onda de 300-800 nm, por ejemplo 500-700 nm.

Métodos para irradiación de diferentes áreas del cuerpo, por ejemplo mediante lámparas o láseres, son bien conocidas en la técnica (véase por ejemplo Van den Bergh, Chemistry in Britain, May 1986, pags. 430-439). Las regiones inaccesibles pueden alcanzarse convenientemente utilizando fibras ópticas.

Los compuestos de la invención o para utilizar en la invención pueden formularse y/o administrarse con otros agentes fotosensibilizantes, por ejemplo ALA o Photofrin®, o con otros componentes activos que pueden aumentar su efecto fotoquimioterapéutico. Por ejemplo, pueden incluirse agentes quelantes beneficiosamente para aumentar la acumulación de Pp; la quelación de hierro por agentes quelantes previene su incorporación en la Pp para formar heme, mediante la acción de la enzima ferroquelatasa, dando así lugar a la construcción de Pp. El efecto fotosensibilizante es así aumentado.

Los agentes quelantes de ácido aminopolicarboxílico son particularmente adecuados para utilizar en este sentido, incluyendo cualquiera de los quelantes descritos en la literatura para la detoxificación de metales, o para la quelación de iones de metales paramagnéticos en agentes de contraste para imagen de resonancia magnética. Debe hacerse una mención particular de EDTA, CTDA (ácido ciclohexano diamino tetraacético), DTPA y DOTA, y sus bien conocidos derivados/análogos. Se prefiere el EDTA. Para conseguir el efecto quelante de hierro, pueden también utilizarse desferrioxamina y otros sideróforos, por ejemplo en conjunción con agentes quelantes de ácido aminopolicarboxílico tales como EDTA.

El agente quelante puede utilizarse convenientemente a una concentración de 0,05 a 20%, por ejemplo 0,1 a 10% (peso/peso).

Adicionalmente, se ha encontrado que los agentes de ayuda a la penetración en superficie y especialmente los dialquilsulfóxidos, tales como el dimetilsulfóxido (DMSO) pueden tener un efecto beneficioso para aumentar el efecto quimioterapéutico. Esto está descrito en detalle en el Documento WO95/07077.

El agente de ayuda de penetración en superficie puede ser cualquiera de los agentes de ayuda de penetración en la piel descritos en la literatura farmacéutica, por ejemplo quelantes (por ejemplo EDTA), surfactantes (por ejemplo dodecil sulfato sódico), no surfactantes, sales biliares (por ejemplo desoxicolato sódico) y ácidos grasos (por ejemplo ácido oleico). Ejemplos de agentes de ayuda a la penetración en superficie apropiados incluyen HPE-101 (disponible de Hisamitsu), DMSO y otros dialquilsulfóxidos, en particular n-decilmetil-sulfóxido (NDMS), dimetilsulfacetamida, dimetilformamida (DMFA), diemtilacetamida, glicoles, varios derivados pirrolidona (Woodford et al., J Toxicol Cut and Ocu-
lar Toxicology, 1986, 5: 167-177), y Azone® (Stoughton et al., Drug Dvp Ind Pharm 1983, 9: 725-744), o sus mezclas.

EL DMSO es sin embargo preferido, debido a sus actividades anti-histamina y anti-inflamatoria, y a su efecto estimulador sobre la actividad de las enzimas ALA-sintetasa y ALA-deshidorgenasa (las enzimas que, respectivamente, forman y condensan el ALA al porfobilinógeno), aumentando de esta forma la formación de la forma activa, Pp.

El agente de penetración en superficie puede proporcionarse convenientemente en un intervalo de concentración de 0,2 a 50% (peso/peso), por ejemplo alrededor del 10% (peso/peso).

Las composiciones de la invención o utilizadas según la invención, pueden adicionalmente formularse y/o administrarse con otros agentes, para mejorar la eficacia del PDT. Además, cuando se tratan tumores, por ejemplo, los inhibidores de la angiogénesis (fármacos anti-angiogénicos), que han demostrado ser útiles para tratar tumores (O’Reilly et al., Nature Medicine, 2, pags. 689-692, 1996; Yamamoto et al., Anticancer Research, 14, pags. 1-4, 1994; y Brooks et al., J Clin Invest, 96, pags. 1815-1822, 1995), pueden utilizarse junto con las composiciones de la invención en el PDT, para dañar más el sistema vascular del tumor. Los inhibidores de la angiogénesis que pueden utilizarse incluyen TNP-470 (AGM-1470, un análogo sintético de un producto de secreción fúngico denominado fumagilina; Takeda Chemical Industries Ltd., Osaka, Japón), angiostatina (Surgical Research Lab. at Children’s Hospital Medical Center of Harvard Medical School), y agonistas de la integrina \alpha_{\nu}\beta_{3} (por ejemplo anticuerpos monoclonales a la integrina \alpha_{\nu}\beta_{3}, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA).

Alternativamente, o adicionalmente, pueden utilizarse agentes inmunoterapéuticos (por ejemplo anticuerpos o efectores tales como factores activadores de macrófagos), o quimioterapéuticos, para mejorar el PDT según la invención. La administración de estos agentes suplementarios debería realizarse, en términos de vía de administración, concentración y formulación, según métodos conocidos para utilizar tales agentes. Estos agentes adicionales pueden administrarse antes, después o durante el PDT, dependiendo de su función. Por ejemplo, los inhibidores de la angiogénesis pueden añadirse 5 a 10 días después del PDT para prevenir el recrecimiento del tumor.

Otros agentes anticancerosos pueden utilizarse de forma similar, en combinación con otras composiciones de la invención, bien como parte de las formulaciones, o como tratamiento separado para administrarse simultáneamente, separadamente o secuencialmente.

La glucosa también se ha encontrado de ayuda al PDT cuando se aplica tópicamente o sistémicamente. Aunque sin desear ligarse a una teoría, parece que la administración de glucosa da como resultado una disminución del pH que aumenta las propiedades hidrófobas de las protoprofirinas, por ejemplo el ALA, de tal manera que pueden penetrar en las células más fácilmente. Cuando se contempla la administración tópica, la formulación, por ejemplo una crema, puede contener convenientemente 0,01 a 10% de glucosa (peso/peso).

Según la enfermedad que vaya a tratarse, y la naturaleza de la composición, los compuestos para utilizar en la invención pueden co-administrarse con dichos otros agentes opcionales, por ejemplo en una composición única, o pueden administrarse secuencialmente, o separadamente. Es más, en muchos casos, puede obtenerse un efecto fotoquimioterapéutico particularmente beneficioso mediante el pre-tratamiento con un agente de ayuda de penetración en superficie en una etapa separada, antes de la administración de los compuestos para utilizar en la invención.

Además, en algunas situaciones un pre-tratamiento con un agente de ayuda de penetración en superficie, seguido de la administración de un agente fotoquimioterapéutico junto con el agente de ayuda de penetración en superficie, puede ser beneficioso. Cuando se utiliza un agente de ayuda de penetración en superficie como pre-tratamiento, éste puede utilizarse en altas concentraciones, por ejemplo hasta el 100% (peso/peso). Si se emplea dicha etapa de pre-tratamiento, el agente fotoquimioterapéutico puede subsecuentemente administrarse hasta varias horas después del pre-tratamiento, por ejemplo a un intervalo de 5-60 minutos después del pre-tratamiento.

Visto desde otro aspecto más, la invención proporciona de este modo un producto que comprende un compuesto como el descrito aquí anteriormente o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, junto con al menos un agente de ayuda de penetración en superficie, y opcionalmente uno o más agentes quelantes, como una preparación combinada para utilización simultánea, separada o secuencial, para tratar enfermedades o anormalidades de las superficies externa o interna del cuerpo, que sean respondedoras a fotoquimioterapia.

Visto alternativamente, este aspecto de la invención también proporciona un kit para utilizar en fotoquimioterapia de enfermedades o anormalidades de las superficies externa o interna del cuerpo, que comprende:

a)

un primer contenedor que contiene un compuesto como el descrito aquí anteriormente, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables

b)

un segundo contenedor que contiene al menos un agente de ayuda de penetración en superficie; y opcionalmente

c)

uno o más agentes quelantes contenidos cada uno dentro del primer contenedor o en un tercer contenedor.

Cuando se aplica el agente de penetración en superficie en una etapa de pre-tratamiento separada, puede aplicarse en concentración más alta, por ejemplo hasta el 100% (peso/peso).

Se apreciará que el método de terapia utilizando compuestos como los descritos aquí anteriormente, implica inevitablemente la fluorescencia de la enfermedad o anormalidad que va a tratarse. Mientras que la intensidad de esta fluorescencia puede utilizarse para eliminar células anormales, la localización de la fluorescencia puede utilizarse para visualizar el tamaño, la extensión y la situación de la anormalidad o la enfermedad.

La anormalidad o la enfermedad así identificadas o confirmadas en el lugar de investigación, puede después tratarse a través de técnicas terapéuticas alternativas, por ejemplo tratamiento quirúrgico o químico, o mediante el método de terapia de la invención, mediante construcción continuada de fluorescencia o a través de otra aplicación de compuestos de la invención en los lugares apropiados. Se apreciará que las técnicas de diagnóstico pueden requerir niveles más bajos de fluorescencia para la visualización que los utilizados en tratamientos terapéuticos. Así, generalmente, son adecuados los intervalos de concentración de 0,2 a 30%, por ejemplo 1-5% (peso/peso). Los lugares, métodos y modos de administración han sido considerados antes con respecto a los usos terapéuticos y son aplicables también a usos diagnósticos descritos aquí.

Los compuestos de la invención o para utilizar en la invención, pueden también utilizarse para técnicas diagnósticas in vitro, por ejemplo para examinar las células contenidas en los líquidos orgánicos. La mayor fluorescencia asociada con el tejido no normal puede ser convenientemente indicativa de una anormalidad o una enfermedad. Este método es altamente sensible y puede utilizarse para la detección precoz de anormalidades o enfermedades, por ejemplo carcinoma de vejiga o de pulmón, mediante el examen de las células epiteliales en muestras de orina o de esputo, respectivamente. Otros líquidos corporales útiles, que pueden utilizarse para el diagnóstico además de la orina o el esputo incluyen la sangre, el semen, las lágrimas, el líquido espinal, etc. También pueden evaluarse las muestras de tejidos o preparaciones, por ejemplo muestras de biopsias de tejido o de médula ósea. La presente invención así se extiende a la utilización de compuestos de la invención, o sus sales, para el diagnóstico, según los métodos previamente mencionados para fotoquimioterapia, y productos o kits para realizar dicho diagnóstico.

Un aspecto más de la invención se refiere a un método para el diagnóstico in vitro, de anormalidades o enfermedades, mediante el análisis de una muestra de líquido corporal o tejido de un paciente, dicho método comprendiendo al menos las siguientes etapas:

i)

mezclar dicho líquido corporal o tejido con un compuesto como los descritos aquí anteriormente,

ii)

exponer dicha mezcla a la luz,

iii)

calcular el nivel de fluorescencia, y

iv)

comparar el nivel de fluorescencia con niveles de control

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes Ejemplos no limitantes, con referencia a los dibujos en los que:

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La Figura 1 muestra la formación de porfirina celular inducida por ALA (círculos rellenos), éster de 1-metilpentilo (círculos vacíos), éster de p-isopropilbencil ALA (triángulos invertidos rellenos), y éster de p-metilbencil ALA (triángulos invertidos vacíos);

La Figura 2 muestra la formación de porfirina celular inducida por ALA (círculos rellenos), éster de bencil ALA (triángulos rellenos) y éster de 2-feniletil ALA (triángulos vacíos), las barras indican la desviación estándar;

La Figura 3 muestra la formación de porfirina celular inducida por ALA (círculos rellenos), éster de hexil ALA (círculos vacíos), éster de ciclohexil ALA (triángulos invertidos rellenos) y éster de 4-metilpentil ALA (triángulos invertidos vacíos), las barras indican el error estándar;

La Figura 4 muestra la formación de porfirina celular inducida por ALA (círculos rellenos), éster de p-[tri-fluorometil]bencil ALA (círculos vacíos), éster de p-[t-butil]bencil ALA (triángulos invertidos rellenos) y éster de p-nitrobencil ALA (triángulos invertidos vacíos);

La Figura 5 muestra la fluorescencia de la piel después de aplicación tópica de éster de hexil ALA (cuadrados rellenos), éster de 1-metilpentil ALA (triángulos rellenos), éster de 1-etilbutil ALA (triángulos invertidos rellenos) y éster de 2-metilpentil ALA (círculos rellenos), las barras indican el error estándar;

La Figura 6 muestra la fluorescencia de la piel después de aplicación tópica de éster de hexil ALA (cuadrados vacíos), éster de ciclohexil ALA (triángulos rellenos), éster de 2-feniletil ALA (cuadrados sombreados) y éster de 4-metilpentil ALA (círculos rellenos), las barras indican el error estándar;

La Figura 7 muestra la fluorescencia de la piel después de la aplicación tópica de éster de hexil ALA (cuadrados vacíos) y éster de p-metilbencil ALA (triángulos sombreados), las barras indican el error estándar;

La Figura 8 muestra la fluorescencia de la piel después de la aplicación tópica de éster de hexil ALA (cuadrados rellenos), éster de p-(isopropil)bencil ALA (triángulos rellenos) y éster de 4-fenilbutil ALA (triángulos invertidos sombreados), las barras indican el error estándar;

La Figura 9 muestra la fluorescencia de la piel después de la aplicación tópica de éster de hexil ALA (cuadrados rellenos), éster de p-fluorobencil ALA (triángulos rellenos) y éster de p-nitrobencil ALA (círculos rellenos), las barras indican el error estándar;

La Figura 10 muestra la fluorescencia de la piel después de la aplicación tópica de éster de hexil ALA (cuadrados rellenos), éster de p(t-butil)bencil ALA (triángulos sombreados), y éster de p-[trifluorometil]bencil ALA (círculos rellenos), las barras indican el error estándar;

La Figura 11 muestra la fluorescencia de la piel después de la administración tópica de éster de hexil ALA (cuadrados rellenos), y éster de bencil ALA (círculos rellenos), las barras indican el error estándar;

La Figura 12 muestra la fluorescencia de la piel después de la administración tópica de éster de hexil ALA al 1% (cuadrados rellenos) y éster de 3,3-dimetil-1-butil ALA al 3% (triángulos rellenos), las barras indican el error estándar;

La Figura 13 muestra la fluorescencia de la piel después de la administración tópica de éster de hexil ALA al 1% (cuadrados abiertos), éster de 2-fluorobencil ALA al 10% (triángulos sombreados), éster de 2,3,4,5,6-pentafluorobencil ALA al 10% (diamantes sombreados), y éster de 4-clorobencil ALA al 10% (círculos rellenos), las barras indican el error estándar;

La Figura 14 muestra la fluorescencia de la piel después de la administración tópica de éster de hexil ALA (triángulos abiertos), éster de 2-metoxietil ALA (cuadrados rellenos), éster de 3-nitrobencil ALA (diamantes sombreados) y éster de 3,4-[di-cloro]bencil ALA (círculos abiertos), las barras indican el error estándar;

La Figura 15 muestra la fluorescencia de la piel después de la administración tópica de éster de hexil ALA (cuadrados rellenos), éster de 3,6-dioxa-1-octil ALA (triángulos rellenos), éster de 3-fluorbencil ALA (diamantes abiertos) y éster de 3,6,9-trioxa-1-decil ALA (círculos sombreados), las barras indican el error estándar;

La Figura 16 muestra la fluorescencia de la piel después de la administración tópica de éster de hexil ALA (cuadrados rellenos), éster de 3-piridinil-metil ALA (triángulos rellenos), éster de 4-difenil-metil ALA (diamantes rellenos) y éster de 4-metoxi-bencil ALA (círculos rellenos), las barras indican el error estándar; y

La Figura 17 muestra la fluorescencia de la piel después de la administración tópica de éster de hexil ALA al 1% (cuadrados abiertos), éster de 2-metilbencil ALA al 3% (triángulos rellenos), éster de bencil-5-[(1-acetiloxietoxi)-carbonil] ALA al 3% (diamantes rellenos) y éster de 3-metilbencil ALA al 3% (círculos abiertos), las barras indican el error estándar.

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Ejemplo 1 Preparación de Ésteres de clorhidrato de 5-Amino-4-oxopentoato

Procedimiento general I

Se añadió cloruro de tionilo (1,0 ml) gota a gota a alcohol agitado (6 ml ó 5-6 g) enfriado a 0ºC (temperatura del baño), seguido de clorhidrato de ácido 5-amino-oxopentanoico (1,0 g; 6 mmol) en una parte. La mezcla se agitó a 70-90ºC durante 1-4 horas, hasta que se obtuvo una solución clara. La mezcla de reacción se analizó mediante TLC [gel de sílice 60 sobre papel de aluminio eluido con acetona-MeOH (3:2)]. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió a dietil-éter (50 ml), mientras se agitaba. La filtración proporcionó un éster crudo; el exceso de alcohol podría recuperarse del filtrado.

El éster crudo se purificó mediante cromatografía súbita sobre una columna de gel de sílice 60 de 150-200 x 25 mm, eluida con acetonitrilo (250 ml) y MeOH 5-10% en acetonitrilo (250 ml). Las fracciones que contenían el producto se dejaron evaporar y se levaron con éter y se secaron a 30-40ºC y a 0,2 mm de Hg.

Los siguientes ésteres se prepararon mediante este método:

Clorhidrato de etil-5-amino-4-oxopentanoato (comparativo)

A partir de etanol (6,0 ml) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6 mmol) a 70ºC. La reacción se completó a las 2 horas. El rendimiento fue de 1,0 g (85%). ^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,19 (3H, t, J = 7,2 Hz), 2,54 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,96 (2H, br s), 4,05 (2H, q, J = 7,0 Hz), 8,52 (3H, br s). ^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 14,0, 27,1, 34,2, 46,4, 60,0, 171,9, 202,4.

Clorhidrato de 1-metil-pentil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 1] (comparativo)

A partir de 2-hexanol (6,0 ml) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de cerca de 4 horas. El rendimiento fue de 1,0 g (66%). ^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 0,87 (3H, t, J = 6,5 Hz), 1,15 (3H, d, J =6,2 Hz), 1,25 (4H, m), 1,51 (2H, m), 2,51 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,81 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,95 (2H, s), 4,78 (1H, m, J = 6,5), 8,47 (3H, br s). ^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 13,6, 19,4, 21,6, 26,6, 27,0, 33,8, 34,4, 44,9, 69,6, 169,5, 200,1.

Clorhidrato de 3-hexil-5-amino-4-pentanoato [compuesto 12] (comparativo)

A partir de 3-hexanol (6,0 ml) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 100ºC. La reacción se completó después de 2 días. El rendimiento fue de 0,87 g (58%) de un aceite ambarino.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 0,83 (3H, t, J = 7,4 Hz), 0,86 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,27 (2H, m, J = 7,7 Hz), 1,48 (4H, m, J = 7,5 Hz), 2,54 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,95 (2H, s), 4,73 (1H, m, J = 5,9 Hz), 8,55 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 9,3, 13,6, 17,8, 26,2, 26,8, 33,9, 34,8, 45,9, 73,7, 169,8, 200,1.

Clorhidrato de 2-metil-1-pentil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 13] (comparativo)

A partir de 2-metil-1-pentanol (6,0 ml) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 3,5 horas. El rendimiento fue de 1,43 g (95%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 0,85-0,90 (6H, m), 1,1-1,4 (4H, m), 1,74 (1H, m), 2,56 (2H, t, J = 6,7 Hz), 2,84 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,75-3,9 (2H, m), 3,95 (2H, br s), 8,52 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 13,9, 16,4, 19,1, 26,7, 31,3, 33,9, 34,5, 45,9, 67,9, 170,0, 200,1.

Clorhidrato de 4-metil-1-pentil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 8] (comparativo)

A partir de 4-metil-pentanol (6,0 ml) y de clorhidrato ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 2 horas. El rendimiento fue de 1,32 g (87%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 0,87 (6H, d, J = 6,6 Hz), 1,15-1,25 (2H, m), 1,45-1,65 (3H, m), 2,55 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,96 (2H, br s), 3,99 (2H, t, J = 6,8 Hz), 8,53 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 22,0, 22,2, 25,6, 26,7, 26,8, 34,0, 45,9, 63,5, 169,9, 200,1.

Clorhidrato de 3,3-dimetil-1-butil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 16] (comparativo)

A partir de 3,3-dimetil-butanol (5,0 g; 49 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 4 horas. El rendimiento fue de 0,91 g (60%); mp146-148º.

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^{1}H NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 0,91 (9H, s), 1,51 (2H, t, J = 7,6 Hz), 2,53 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,96 (2H, br s), 4,07 (2H, t, J = 7,0 Hz), 8,54 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,0, 29,3, 29,34, 34,3, 46,4, 61,5, 171,9, 202,4.

Clorhidrato de ciclohexil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 7] (comparativo)

A partir de ciclohexanol (6,0 ml) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 80ºC. El cloruro de tionilo se añadió a temperatura ambiente. La reacción se completó después de 3 horas. El rendimiento fue de 1,48 g (99%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,1-1,5 (6H, m), 1,5-1,9 (4H, m), 2,52 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,82 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,95 (2H, br s), 4,64 (1H, m), 8,52 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 22,8, 24,5, 27,1, 30,6, 33,9, 45,9, 71,2, 169,3, 200,1.

Clorhidrato de 2-feniletil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 5]

A partir de 2-feniletanol 85,0 g; 41 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 3 horas. El rendimiento fue de 1,43 g (88%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,50 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,82 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,89 (2H, t, J = 7,0 Hz), 3,95 (2H, br s), 4,23 (2H, t, J = 7,0 Hz), 7,1-7,4 (5H, m), 8,54 (3H, br s)

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 24,6, 28,0, 35,2, 47,4, 65,5, 127,2, 129,2, 129,7, 172,8, 203,3.

Clorhidrato de 4-fenil-1-butil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 14] (comparativo)

A partir de 4-fenil-1-butanol (5,0 g; 33 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 29 horas. El rendimiento fue de 1,22 g (68%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,60 (4H, br s), 2,5-2,6 (4H, m), 2,84 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,97 (2H, br s), 4,0 (2H, m), 7,15-7,35 (5H, m), 8,56 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,0, 27,2, 27,6, 34,3, 34,6, 46,4, 63,8, 125,6, 128,2, 141,8, 171,9, 202,4.

Clorhidrato de 2-metoxietil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 20] (comparativo)

A partir de 2-metoxietanol (5,0 g, 66 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 1 hora. El rendimiento fue de 1,25 g (93%) de un aceite amarillento.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,57 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,27 (3H, s), 3,54 (5H, br s), 3,95 (2H, br s), 4,12 (2H, br s), 8,52 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,5, 58,0, 63,2, 69,6, 172,0, 202,5.

Clorhidrato de 3,6-dioxa-1-octil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 23] (comparativo)

A partir de éter de dietilen-glicol-monoetilo (5,0 g; 37 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 4 horas. El rendimiento fue de 0,90 g (53%) de un sólido bronceado claro.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,10 (3H, t, J = 7,0 Hz), 2,58 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,35-3,65 (8H, m), 3,96 (2, br s), 4,13 (2H, t, J = 6,0 Hz), 8,52 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 15,0, 27,1, 34,3, 46,5, 63,4, 65,5, 68,1, 69,1, 69,8, 172,0, 202,5.

Clorhidrato de 3,6,9-trioxa-1-decil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 25] (comparativo)

A partir de monometil éter de trietilén glicol (5,0 g; 30 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6 mmol) a 70ºC. La reacción se completó después de 20 horas. El rendimiento fue de 1,19 g (63%) de un aceite parduzco.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,58 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,84 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,25 (3H, s), 3,4-3,65 (10H, m), 3,96 (2H, br s), 4,13 (2H, m), 8,49 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,5, 58,0, 63,4, 68,1, 69,5, 69,6, 69,7, 71,2, 171,9, 202,5.

Procedimiento general II

Una mezcla del alcohol (5,0 g) y de clorhidrato de ácido 5-amino-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol) se calentó hasta 90-100ºC (hasta 135ºC si fuera necesario para fundir el alcohol) y se añadió ácido clorhídrico 12 M (0,1 ml). La mezcla se continuó calentando hasta que se obtuvo una solución clara (hasta 5-6 días). El trabajo se realizó como en el procedimiento anterior.

Se prepararon los siguientes ésteres mediante este método:

Clorhidrato de bencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 4]

A partir de bencil alcohol (50 ml) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (10,0 g, 60 mmol). Después de 23 horas a 90ºC, el exceso de bencil alcohol se destiló a 90ºC (temperatura del baño) y 0,33 mm de Hg. El rendimiento fue de 8,1 g (53%) de un polvo bronceado.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,63 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,87 (2H, t, J = 6,5 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,11 (2H, s), 7,3-7,4 (5H, br s), 8,52 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 26,7, 33,8, 45,9, 64,8, 126,3, 126,4, 134,4, 169,8, 200,1.

Clorhidrato de 4-nitrobencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 11]

A partir de 4-nitrobencil alcohol (5,0 g, 33 mmol) y clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol): La reacción se completó después de 15 minutos a 135ºC. El rendimiento fue de 0,95 g (52%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,72 (2H, t, J = 5,8 Hz), 2,91 (2H, t, J = 6,2 Hz), 4,02 (2H, br s), 5,28 (2H, s), 7,67 (2H, d, J = 8,0 Hz), 8,25 (2H, d, J = 9,1 Hz), 8,58 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,5, 64,4, 123,5, 128,3, 143,9, 146,9, 171,8, 202,5.

Clorhidrato de 4-fluorobencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 15]

A partir de 4-fluorobencil alcohol (5,0 g; 40 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 3 horas a 90ºC: El rendimiento fue de 1,02 g (62%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,63 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,88 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,99 (2H, br s), 5,10 (2H, s), 7,22 (2H, t, J = 8,8 Hz), 7,45 (2H, d, J = 8,0 Hz), 8,57 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,5, 64,9, 115,0, 115,4, 130,1, 130,2, 132,2, 132,3, 159,3, 164,2, 171,8, 202,4.

Clorhidrato de 4-metilbencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 3]

A partir de 4-metilbencil alcohol (5,0 g; 41 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopenatanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 2 días. El rendimiento fue de 0,84 g (52%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,30 (3H, s), 2,60 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,86 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,96 (2H, br s), 5,05 (2H, s), 7,1-7,3 (4H, m), 8,55 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 23,7, 27,1, 33,1, 34,3, 46,4, 65,5, 126,2, 128,0, 133,3, 148,2, 171,8, 202,6.

Clorhidrato de 4-isopropilbencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 2]

A partir de 4-isopropilbencil alcohol (5,0 ml) y de clorhidrato de ácido 5-amino-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 2 días. El rendimiento fue de 1,0 g (56%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,19 (6H, d, J = 6,6 Hz), 2,61 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,84 (1H, m), 2,88 (2H, t, J = 6,8 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,06 (2H, s), 7,2-7,4 (4H, m), 8,56 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 23,7, 27,1, 33,1, 34,3, 46,4, 65,5, 126,2, 128,0, 133,3, 148,2, 171,8, 202,6.

Clorhidrato de 4-t-butilbencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 10]

A partir de 4-t-butilbencil alcohol (5,0 g; 30 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 2 días. El rendimiento fue de 0,84 (52%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,27 (9H, s), 2,61 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,87 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,06 (2H, s), 7,29 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,55 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 31,0, 34,16, 34,26, 46,4, 65,4, 125,0, 127,7, 133,0, 150,4, 171,8, 202,4.

Clorhidrato de 4-(trifluorometil)bencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 9]

A partir de 4-(trifluorometil)bencil alcohol (4,9 g; 28 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 2 horas. El rendimiento fue de 1,24 g (64%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,69 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,92 (2H, t, J = 6,4 Hz), 4,00 (2H, br s), 5,23 (2H, s), 7,62 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,75 (2H, d, J = 8,2 Hz), 8,58 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,0, 34,3, 46,4, 59,7, 59,8, 115,1, 115,5, 122,7, 123,0, 124,5, 130,4, 130,6, 130,7, 130,8, 157,8, 162,7, 171,8, 202,4.

Clorhidrato de 3-fluorobencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 24]

A partir de 3-fluorobencil alcohol (5,1 g; 40 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 20 horas a 100ºC. El rendimiento fue de 1,04 g (72%). Mp 115-
119ºC.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,67 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,90 (2H, t, J = 6,2 Hz), 4,00 (2H, d, J = 5,0 Hz), 5,14 (2H, s), 7,1-7,3 (3H, m), 7,4-7,5 (1H, m), 8,54 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,5, 64,7, 114,1, 114,5, 114,9, 123,1, 123,6, 130,4, 130,5, 138,8, 139,0, 159,6, 164,5, 171,8, 202,5.

Clorhidrato de 2,3,4,5,6-pentafluorobencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 18]

A partir de 2,3,4,5,6-pentafluorobencil alcohol (5,1 g; 26 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 6 días a 100ºC. El rendimiento fue de 0,25 g (13%). Mp 146-148ºC.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,59 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,85 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,95 (2H, br s), 5,22 (2H, s), 8,51 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 26,8, 34,2, 46,5, 53,2, 109,9, 123,2, 134,5, 139,5, 142,7, 147,7, 171,6, 202,4.

Clorhidrato de 4-clorobencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 19]

A partir de 4-clorobencil alcohol (5,0 g; 35 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 24 horas a 100ºC. El rendimiento fue de 0,56 g (32%). Mp 127-129ºC.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,65 (2H, t, J = 5,8 Hz), 2,89 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,99 (2H, br s), 5,11 (2H, s), 7,44 (4H, s), 8,56 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,5, 64,7, 128,4, 129,7, 132,6, 135,1, 171,8, 202,5.

Clorhidrato de 3,4-diclorobencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 22]

A partir de 3,4-diclorobencil alcohol (5,0 g; 28 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 45 horas a 100ºC. El rendimiento fue de 1,12 g (57%).

^{1}H NMR (200 MHz, DMSO-d_{6}): \delta 2,67 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,90 (2H, t, J = 6,4 Hz), 4,00 (2H, br s), 5,12 (2H, s), 7,2-7,5 (1H, m), 7,5-7,6 (2H, m), 8,50 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,7, 64,1, 129,8, 130,7, 137,3, 173,7, 202,8.

Clorhidrato de 3-nitrobencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 21]

A partir de 3-nitrobencil alcohol (5,0 g; 33 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-pentanoico (1,0 g; 6 mmol). La reacción se completó después de 20 horas a 100ºC. El rendimiento fue de 1,00 g (55%).

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,68 (2H, br s), 2,90 (2H, br s), 3,98 (2H, br s), 5,26 (2H, s), 7,6-7,9 (2H, m), 8,1-8,3 (2H, m), 8,47 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,5, 64,4, 122,3, 122,8, 130,1, 134,3, 138,4, 147,7, 171,8, 202,5.

\newpage

Clorhidrato de 2-metilbencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 29]

A partir de 2-metilbencil alcohol (5,0 g; 41 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 4 días a 100ºC. El rendimiento fue de 0,72 g (44%). Mp 107-109ºC.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,29 (3H, s), 2,62 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,86 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,96 (2H, br s), 5,10 (2H, s), 7,2-7,4 (4H, m), 8,54 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 18,4, 27,0, 34,3, 46,4, 64,1, 123,1, 125,8, 128,2, 128,8, 130,0, 133,8, 136,5, 171,8, 202,5.

Clorhidrato de 3-metilbencil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 31]

A partir de 3-metilbencil alcohol (5,0 g; 40 mmol) y de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (1,0 g; 6,0 mmol). La reacción se completó después de 2 días a 80ºC. El rendimiento fue de 1,11 g (68%). Mp 96-98ºC.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,31 (3H, s), 2,62 (2H, t, J = 6,2 Hz), 2,87 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,97 (2H, br s), 5,06 (2H, s), 7,1-7,4 (4H, m), 8,55 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 20,9, 27,1, 34,3, 46,4, 65,6, 124,9, 128,3, 128,4, 128,5, 135,9, 137,5, 171,9, 202,5.

Procedimiento general III

Se añadió alcohol bencílico (5,0 mmol) gota a gota a una mezcla de N,N’-diisopropilcarbodiimida (0,63 g; 5,0 mmol) y cloruro de cobre (I) (1 mg) enfriada a 0ºC (temperatura del baño). Después de una hora a 0ºC, la mezcla se agitó alrededor de 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla verde oscura se diluyó con pentano (3 ml) y se filtró a través de una almohadilla de Celite. El residuo se lavó con un poco de pentano y los filtrados combinados se evaporaron. El residuo se disolvió en tetrahidrofurano seco y ácido N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanoico (0,43 mmol), y se añadió diclorometano seco (10 ml). Después de dejarlo reposar durante 5 días a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y el residuo se lavó con un poco de dietil éter. El residuo se disolvió en etil acetato (20 ml) y se trató con una solución de clorhídrico en etil acetato (2 ml). Apareció un precipitado del clorhídrico después de entre 4 horas y 3 días y se purificó como se indica más adelante.

Ácido N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanoico

Se añadió trietilamina (13,9 ml; 10,1 g; 0,10 mol) gota a gota a una mezcla en agitación de clorhidrato de ácido 5-amino-4-oxopentanoico (10,0; 59,7 mmol) y de di-t-butil-dicarbonato (21,8 g; 0,10 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 6 horas a 50ºC y durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó a 35-40ºC (temperatura del baño) y 7-1 mm de Hg. El residuo se acidificó con ácido cítrico helado al 10% (50 ml), e inmediatamente se extrajo con etil acetato (6 x 15 ml). Los extractos combinados se lavaron con agua (2 x 5 ml) y solución de NaCl saturado (1 x 5 ml). Después de secarse (Na_{2}SO_{4}) durante la noche en un refrigerador, la mezcla se filtró y se evaporó. El aceite rojo se purificó mediante cromatografía súbita sobre una columna de gel de sílice de 50 x 60 eluida con etil acetato-hexano (2:1), recolectando fracciones de 50 ml, para proporcionar 12,2 g (88%) de un aceite amarillo viscoso que se solidificó en parte al conservarse en el refrigerador.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,39 (9H, s), 2,42 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,63 (2H, t, J = 5,6 Hz), 3,78 (2H, d, J = 5,8 Hz), 7,04 (1H, t, J = 5,6 Hz), 12,1 (1H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,4, 28,1, 38,6, 49,5, 78,1, 155,7, 173,6, 206,1.

Clorhidrato de 4-metoxibencil-5-amino-4-oxopentanoato (compuesto 28)

Preparado a partir de 4-metoxibnecil alcohol (1,0 g; 7,2 mmol), N, N’-diisopropilcarbodiimida (0,91 g; 7,2 mmol), CuCl (9 mg), y ácido N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanoico (1,7 g; 7,2 mmol). Se realizó cromatografía súbita sobre una columna de gel de sílice 60 de 175 x 25 mm, y se eluyó con acetonitrilo (200 ml), metanol al 5% en acetonitrilo (500 ml) y metanol al 10% en acetonitrilo (750 ml), y se recolectaron fracciones de 50 ml, para proporcionar 0,24 g (11%) de producto. Mp 110-112ºC.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,58 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,83 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,75 83H, s), 3,94 (2H, br s), 5,02 (2H, s), 6,93 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,31 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,48 (3H, br s)

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,2, 46,4, 55,0, 65,4, 113,7, 127,9, 129,8, 159,1, 171,8, 202,5.

\newpage

Diclorhidrato de 3-piridinilmetil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 26]

A partir de 3-piridinilmetanol (0,55 g; 5,0 mmol) y de ácido N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanoico 0,43 M en diclorometano (10 ml; 4,3 mmol). La evaporación de los disolventes del filtrado proporcionó 1,0 g de residuo, que se disolvió en etil acetato. Se añadió una solución de clorhídrico en etil acetato (2 ml) a la solución ambarina. Después de dejarlo a 4 horas a temperatura ambiente, el residuo se filtró y se secó sobre gel de sílice a 30ºC y 0,01 mm de Hg, para proporcionar 0,63 g (68%) de un sólido higroscópico.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,69 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,91 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,9-4,0 (2H, m), 5,35 (2H, s), 8,0-8,2 (1H, m), 8,54 (3H, br s), 8,5-8,7 (1H, m), 8,9-9,0 (2H, m).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,0, 34,3, 46,4, 61,9, 126,9, 140,8, 141,3, 144,4, 171,7, 202,5.

Clorhidrato de 4-difenilmetil-5-amino-4-oxopentanoato [compuesto 27]

A partir de 4-difenilmetanol (5,0 g; 40 mmol) y solución de ácido N-t-BOC-5-amino-4-oxopentanoico (10 ml; 4,3 mmol). El clorhidrato puro se purificó mediante cromatografía súbita sobre una columna de gel de sílice 60 de 190 x 25 mm, eluida con acetonitrilo (300 ml), metanol al 10% en acetonitrilo (250 ml), y se recolectaron fracciones de 50 ml. El rendimiento fue de 0,39 g (16%). Mp 163-166ºC.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 2,65 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,88 (2H, t, J = 6,4 Hz), 3,98 (2H, br s), 5,16 (2H, s), 7,2-7,5 (5H, m), 7,6-7,8 (4H, m), 8,52 (3H, br s).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 27,1, 34,3, 46,4, 65,3, 126,6, 126,7, 127,5, 128,5, 128,9, 135,2, 139,6, 139,8, 171,9, 202,5

Bencil-5-[[1-(acetiloxi)etoxi]carbonil]amino-4-oxopentanoato [compuesto 30]

Se añadió piridina (0,32 ml; 0,32 g; 4,0 mmol) gota a gota a una mezcla en agitación de clorhidrato de bencil 5-amino-4-oxopentanoato (0,52 g; 2,0 mmol) y de 1-cloroetil cloroformato (0,29 g; 2,0 mmol) en tetrahidrofurano seco (10 ml). Después de agitarla 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla se lavó con agua (1 x 2 ml) y solución saturada de NaCl (1 x 2 ml) y se secó (MgSO_{4}). La filtración y la evaporación dejaron 0,65 g de un aceite ambarino. El aceite se disolvió en ácido acético glacial (10 ml) y se añadió acetato de mercurio (II) (0,64 g; 2,0 mmol). Después de agitarla durante 3 días a temperatura ambiente, el exceso de ácido acético se evaporó a aproximadamente 30ºC (temperatura del baño) y 8-10 mm de Hg. El residuo se agitó con dietil éter (10 ml) y se filtró. Después de lavar el residuo con más éter (15 ml), los filtrados combinados se neutralizaron con NaHCO_{3}, y se lavaron con solución saturada de NaCl (1 x 10 ml). Después de secarse (MgSO_{4}), filtrarse y evaporarse, el producto crudo se purificó mediante cromatografía súbita sobre una columna de gel de sílice 60 de 190 x 25 mm, se eluyó con etil acetato-hexano (2:1) (500 ml), se recolectaron fracciones de 25 ml. El rendimiento fue de 0,43 g (61%) de un aceite amarillo pálido.

^{1}H NMR (200 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 1,41 (3H, d, J = 5,6 Hz), 2,00 (3H, s), 2,57 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,73 (2H, t, J = 6,0 Hz), 3,90 (2H, d, J = 6,0 Hz), 5,08 (2H, s), 6,68 (1H, q, J = 5,4 Hz), 7,36 (5H, s), 7,71 (1H, t, J = 5,8 Hz).

^{13}C NMR (50 MHz; DMSO-d_{6}): \delta 19,6, 20,6, 27,3, 33,7, 49,5, 65,5, 88,8, 127,8, 127,9, 128,4, 136,1, 154,2, 168,6, 172,0, 205,1.

Ejemplo 2 Medición de la formación de porfirina en cultivo cellular in vitro Métodos

Se analizaron los siguientes compuestos, relativos a ALA:

1.

Éster de 1-metilpentil ALA (comparativo)

2.

Éster de p-isopropilbencil ALA

3.

Éster de metilbencil ALA

4.

Éster de bencil ALA

5.

Éster de 2-feniletil ALA

6.

Éster de hexil ALA (comparativo)

7.

Éster de ciclohexil ALA (comparativo)

8.

Éster de 4-metilpentil ALA (comparativo)

9.

Éster de p-[tri-fluorometil]bencil ALA

10.

Éster de p-[t-butil]bencil ALA

11.

Éster de p-nitrofenil ALA

El compuesto a analizar se disolvió en DMSO hasta una concentración de 100 mM (solución de stock). Se obtuvieron las concentraciones apropiadas mediante dilución de las soluciones de stock con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o con medio de cultivo.

Cultivo celular

Células WiDr, derivados de un adenocarcinoma primario de colon rectosigmoideo, se subcultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco), que contenía suero de ternera fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y glutamina al 1%. Las células se dividieron a 1:100 dos veces por semana, y se mantuvieron a 37ºC y CO_{2} al 5% en un ambiente húmedo.

Condiciones de tratamiento

Se añadieron 5 x 10^{5} células WiDr en 2 ml de medio RPMI como se describió en el párrafo anterior, se añadieron a cada pocillo de placas de cultivo tisular de plástico de 6 pocillos (Nunc), y se dejaron durante 48 horas a 37ºC y CO_{2} al 5% en un ambiente húmedo para que se adhirieran apropiadamente al sustrato. Las células se lavaron después dos veces con RPMI 1640 sin suero, seguido de la adición a los pocillos de las diluciones apropiadas de los compuestos a analizar en 2 ml de medio de cultivo fresco, hasta una concentración final de 0,001, 0,01, 0,1 y 1 mM, por duplicado. Las células se incubaron a 37ºC durante cuatro horas.

Medición del contenido de porfirina celular

Después del tratamiento como el descrito en el párrafo "condiciones de tratamiento", las células se lavaron dos veces con PBS y se llevaron a una solución de HClO_{4} 1M, en MeOH al 50%, despegando las células del sustrato mediante un raspador celular Costar. El detritus celular se eliminó mediante centrifugación. El contenido de porfirina de cada muestra se determinó fluorimétricamente utilizando un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS50B (excitación a 407 nm, la emisión se midió a 606 nm, utilizando un filtro de corte de pase largo (530 nm) en el lado de la emisión). La fluorescencia en cada muestra se calculó en relación al contenido de proteína en células testigo, como se mide mediante el método de Bradford.

Resultados

Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 4 para los compuestos 1-3, 4 y 5, 6-8 y 9-11, respectivamente.

Puede observarse en la Figura 1 que se encontraron curvas dosis-respuesta empinadas para ambos ésteres, p-metilbencilo y p-isopropilbencilo. Estos ésteres fueron igualmente eficientes para inducir la síntesis de porfirina celular, y aproximadamente 200 veces más potentes que el ALA. La curva del éster de 1-metilpentilo aumentaba lentamente con el aumento de las concentraciones del éster. El éster de 1-metilpentilo a concentraciones bajas era solo levemente mejor que el ALA en la inducción de formación de porfirina.

En la Figura 2 puede observarse que ambos ésteres, bencilo y 2-feniletilo, eran considerablemente más eficientes que el ALA para inducir la síntesis de porfirina celular. De hecho, la formación de porfirina inducida por éster de bencilo 0,001 mM iguala a la obtenida con ALA 0,6 mM. De forma similar, puede observarse que la fluorescencia que sigue a la adición de éster de 2-feniletilo 0,001 mM corresponde a la inducida por ALA 0,4 mM.

La Figura 3 muestra que los ésteres tanto de hexilo como de 4-metilpentilo fueron igualmente eficientes. También puede observarse en la Figura que las capacidades de estos ésteres para inducir la formación de porfirina celular eran aproximadamente 100 veces mayores que la de ALA. El éster de ciclohexilo fue, a bajas concentraciones, solo levemente más eficiente que el ALA para inducir la formación de porfirina. A concentraciones más elevadas, el éster de ciclohexilo fue menos eficaz que el ALA.

Puede observarse en la Figura 4 que los ésteres de p-[tri-fluorometil]bencilo, p-[t-butil]bencilo y p-nitrobencilo fueron aproximadamente 200 veces mejores que el ALA en la inducción de formación de porfirina.

Los resultados pueden resumirse como sigue:

1

Ejemplo 3 Formación de porfirina después de la administración tópica sobre la piel murina Métodos

Los siguientes compuestos se analizaron en relación a ALA (incluyendo los compuestos 1 a 11 analizados en el Ejemplo 2)

(# = comparativo):

1.

Éster de 1-metilpentil ALA #

2.

Éster de p-isopropilbencil ALA

3.

Éster de p-metilbencil ALA

4.

Éster de bencil ALA

5.

Éster de 2-feniletil ALA

6.

Éster de hexil ALA #

7.

Éster de ciclohexil ALA #

8.

Éster de 4-metilpentil ALA #

9.

Éster de p-[tri-fluorometil]bencil ALA

10.

Éster de p-[t-butil]bencil ALA

11.

Éster de p-nitrobencil ALA

12.

Éster de 1-etilbutil ALA #

13.

Éster de 2-metilpentil ALA #

14.

Éster de 4-fenil butil ALA #

15.

Éster de p-fluorobencil ALA

16.

Éster de 3,3’-dimetil-1-butil ALA #

17.

Éster de 2-fluorobencil ALA

18.

Éster de 2,3,4,5,6-pentafluorobencil ALA

19.

Éster de 4-clorobencil ALA

20.

Éster de 2-metoxietil ALA #

21.

Éster de 3-nitrobencil ALA

22.

Éster de 3,4-[di-cloro]bencil ALA

23.

Éster de 3,6-dioxa-1-octil ALA #

24.

Éster de 3-fluorobencil ALA

25.

Éster de 3,6,9-trioxa-1-decil ALA #

26.

Éster de 3-piridinil-metil ALA

27.

Éster de 4-difenil-metil ALA

28.

Éster de 4-metoxi-bencil ALA

29.

Éster de 2-metilbencil ALA

30.

Levulinato de bencil-5-[(1-acetiloxietoxi)-carbonil]amino

31.

Éster de 3-metilbencil ALA

Métodos

Los compuestos a analizar se formularon en Unguentum Merck (crema base disponible de Merck, que consiste en dióxido de silicona, parafina líquida, albúmina, cetostearol, polisorbato 40, monoestearato de glicerol, Myglyol®812 (una mezcla de ácidos grasos de plantas), polipropilenglicol y agua purificada), a la concentración deseada. Las concentraciones se dan como % (peso/peso) calculada como clorhidratos. Las formulaciones se prepararon el día anterior a que comenzara el experimento y se guardaron en el refrigerador hasta el día de su utilización.

En los estudios se utilizaron ratones hembra Balb/c desnudos atímicos, que pesaban alrededor de 22 g, obtenidos del Departamento de Animales de Laboratorio, The Norwegian Radium Hospital (Montebello, Oslo, Noruega).

Se utilizaron tres ratones por grupo. Cada ratón recibió 0,05-0,1 g de la formulación, aplicada tópicamente en el flanco derecho del cuerpo, distribuido uniformemente y cubierto con un apósito (Opsite Flexigrid; Smith and Nephew Medical Ltd., Hull, England). El aparato de medida de punta de fibra consistía en un manojo de fibras ópticas conectadas a un espectrofluorímetro que producía la excitación de la luz a 407 nm. La luz de excitación, que era capaz de penetrar 0,1-0,5 mm en el tejido, se traspasó a través de la mitad de las fibras a la piel del ratón. El espectro de fluorescencia de emisión (550-750) nm, se recolectó y se traspasó a través de las restantes fibras a un fotomultiplicador para su cuantificación.

Después de la aplicación de la crema en formulación, el espectro de fluorescencia de las porfirinas en la piel se midió mediante el método de la fibra óptica a diferentes intervalos de tiempo después de la administración.

La intensidad de la fluorescencia variaba de experimento a experimento. Así, se incluyó en cada experimento hexil-5-aminolevulinato-HCl al 1% (peso/peso), como control interno.

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Resultados

Los resultados se muestran en las Figuras 5 a 17 para los siguientes compuestos de ensayo: Figura 5 - compuestos 1, 6, 12 y 13; Figura 6 - compuestos 5-8; Figura 7 -compuestos 3 y 6; Figura 8 - compuestos 2, 6, y 14; Figura 9 - compuestos 6, 11 y 15; Figura 10 - compuestos 6, 9 y 10; Figura 11 - compuestos 4 y 6; Figura 12 - compuestos 6 y 16; Figura 13 - compuestos 6 y 17-19; Figura 14 - compuestos 6 y 20-22; Figura 15 - compuestos 6 y 23-25; Figura 16 - compuestos 6 y 26-28; Figura 17 - compuestos 6 y 29-31. Todos los compuestos se utilizaron al 1% (peso/peso), excepto en las Figuras 12 y 17 en las que el éster de 3,3-dimetil-1-butil ALA, el éster de 2-metilbencil ALA, el éster de bencil-5-[(acetiloxietoxi)-carbonil] ALA y el éster de 3-metilbencil ALA se utilizaron al 3% (peso/peso), y en la Figura 13, en la que el éster de 2-fluorobencil ALA, el éster de 2,3,4,5,6-pentafluorobencil ALA y el éster de 4-clorobencil ALA se utilizaron al 10% (peso/peso).

Puede observarse en la Figura 5 que los ésteres de hexilo, 1-metilpentilo, 1-etilbutilo y 2-metilpentilo, todos producían formación de porfirina. Además, el éster de hexilo producía la fluorescencia más alta, seguida por los ésteres de 2-metilpentilo y de 1-etilbutilo. El éster de 1-metilpentilo producía unos niveles de fluorescencia intermedios en este estudio.

La Figura 6 muestra que el éster de hexilo y el éster de 4-metilpentilo daban como resultado unos niveles elevados de fluorescencia, mientras que los ésteres de ciclohexilo y el de 2-feniletilo proporcionaban niveles bajos de fluorescencia.

La Figura 7 que ambos ésteres, de hexil- y de p-metilbencil ALA producían niveles de fluorescencia elevados y similares.

Es evidente en la Figura 8 que el p-isopropil-bencil-5-aminolevulinato daba como resultado unos niveles intermedios de fluorescencia, mientras que el 4-fenil-butil-5-aminolevulinato producía solo niveles bajos de fluorescencia. Es interesante en este aspecto que un análogo de la última sustancia (el 2-fenil-etil-5-aminolevulinato) también proporcionaba niveles de fluorescencia relativamente modestos (Figura 6). Esto muestra que cuando el bencil 5-aminolevulinato (Figura 11) se "extiende" con uno o más grupos metileno (-CH_{2}-) entre el bencil y el ALA, aparece una capacidad reducida para inducir la formación de porfirina.

La Figura 9 muestra que ambos ésteres, de p-nitrobencilo y de hexilo, producían niveles elevados de fluorescencia. Se obtenían niveles levemente inferiores con el éster de p-fluorobencilo.

La Figura 10 muestra que se obtenía una formación de porfirina elevada (como lo indican los niveles elevados de fluorescencia) con los ésteres de hexilo y de p-[tri-fluorometil]bencilo. Se obtenían niveles intermedios con el éster de p-(tert-butil)bencilo. Esto es posiblemente debido a que el grupo éster es bastante voluminoso.

Es evidente en la Figura 11 que se obtenían niveles elevados de fluorescencia con ambos ésteres, el de hexilo y el de bencilo.

Puede verse en la Figura 12 que se obtenían valores similares de fluorescencia para el éster de hexilo al 1% y para la formulación del éster de 3,3’-dimetil-1-t-butilo al 3%. Así, los dos ésteres son aproximadamente igualmente efectivos para inducir la formación de porfirinas en la piel.

Puede verse en la Figura 13 que el éster de 4-clorobencilo producía niveles de fluorescencia elevados, mientras que los ésteres de 2,3,4,5,6-pentafluorobencilo y de 2-fluorobencilo producían actividades intermedias/elevadas.

Puede observarse en las Figuras 14 y 15 que todos los ésteres de ALA analizados, diferentes del éster de hexilo, producían fluorescencia de la piel intermedia después de la administración tópica.

Es evidente en la Figura 16 que el éster de hexilo proporcionaba niveles elevados de fluorescencia y los ésteres de 3-piridinil-metilo y de 4-metoxi-bencilo proporcionaban una fluorescencia intermedia. El éster de 4-difenil-metilo proporcionaba una fluorescencia relativamente baja.

Puede observarse en la Figura 17 que el éster de bencil ALA N-sustituido, proporcionaba una fluorescencia intermedia/elevada, mientras que los otros tres ésteres analizados proporcionaban niveles de fluorescencia elevados.

Los resultados pueden resumirse como sigue:

2

Claims (27)

1. Un compuesto para utilizar en fotoquimioterapia o diagnóstico, siendo dicho compuesto de la fórmula I:

(I)R^{2}_{2}N-CH_{2}COCH_{2}-CH_{2}CO-OR^{1}

(donde R^{1} representa un grupo alquilo C_{1} ó C_{2} sustituido por uno o más grupos arilo; y

R^{2} independientemente representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. Un compuesto como el de la reivindicación 1, en el que en el grupo R^{1} dicho grupo alquilo es sustituido terminalmente por dicho grupo arilo.

3. Un compuesto como el de la reivindicación 1 o el de la reivindicación 2, en el que en el grupo R^{1} dicho grupo alquilo es metilo.

4. Un compuesto como el de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho grupo arilo está sustituido por uno o más grupos alquilo, alcoxi, fluoro, cloro, nitro o trifluorometilo.

5. Un compuesto como el de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho grupo arilo es fenilo, difenilo, o un grupo heteroaromático de 5-7 miembros monocíclico.

6. Un compuesto como el de la reivindicación 5, en el que dicho grupo arilo es fenilo.

7. Un compuesto como el de la reivindicación 5, en el que dicho grupo heteroaromático es piridinilo.

8. Un compuesto como el de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que cada R^{3} representa un átomo de hidrógeno.

9. Un compuesto de la fórmula I:

(I)R^{2}_{2}N-CH_{2}COCH_{2}-CH_{2}CO-OR^{1}

(donde

R^{1} representa un grupo alquilo C_{1} ó C_{2} sustituido por arilo, donde dicho grupo arilo está sustituido;

R^{2}, cada uno de los cuales puede ser el mismo o diferente, representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo opcionalmente sustituido;

donde dichos sustitutos se seleccionan de hidroxi, alcoxi, aciloxi, alcoxicarboniloxi, amino, arilo, nitro, oxo, fluoro, grupos -SR^{3}, -NR^{3}_{2} y -PR^{3}_{2}, y dicho grupo alquilo está opcionalmente interrumpido por uno o más grupos -O-, -NR^{3}-, -S- o -PR^{3}_{2}-; y

R^{3} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

10. Un compuesto como el de la reivindicación 9, en el que R^{1} representa un grupo alquilo C_{1} o C_{2} sustituido por un arilo no heteroaromático, en el que dicho grupo arilo está sustituido.

11. Un compuesto como el de la reivindicación 9 ó la reivindicación 10, en el que en R^{1} dicho grupo arilo está sustituido por uno o más grupos alquilo, alcoxi, fluoro, cloro, nitro o trifluorometilo.

12. Un compuesto como el de la reivindicación 4 o la reivindicación 11, en el que dicho grupo alquilo sustituto es un grupo alquilo C_{1-6}.

13. Un compuesto como el de la reivindicación 4 o la reivindicación 11, en el que dicho grupo alcoxi sustituto es un grupo metoxi.

14. Un compuesto como el de una cualquiera de las reivindicaciones 9 u 11 a 13, en el que dicho grupo arilo es fenilo, difenilo o un grupo heteroaromático de 5,7 miembros monocíclico.

15. Un compuesto como el de la reivindicación 14, en el que dicho grupo arilo es fenilo.

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16. Un compuesto como el de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que en la fórmula I, cada R^{2} representa un átomo de hidrógeno.

17. Un compuesto como el reivindicado en la reivindicación 16, en el que en el grupo R^{1} dicho grupo arilo es fenilo y dicho grupo alquilo es metilo.

18. Un compuesto como el de la reivindicación 9 que se selecciona de éster de p-metilbencil ALA, éster de p-nitrobencil ALA, éster de p-[trifluorometil]bencil ALA, éster de p-fluorobencil ALA, éster de 4-clorobencil ALA, éster de 3-metilbencil ALA y éster de 2-metilbencil ALA.

19. Un compuesto como el de la reivindicación 18, o éster de bencil ALA, para utilizar en fotoquimioterapia o diagnóstico.

20. Un proceso para preparar compuestos de la fórmula I como los reivindicados en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, dicho proceso comprendiendo al menos una de las siguientes etapas:

(a) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula II

(II)R^{2}_{2}N-CH_{2}COCH_{2}-CH_{2}CO-X

(donde X representa un grupo donante o COX representa un grupo anhídrido ácido y R^{2} es como se ha definido en la reivindicación 11)

con un compuesto de la fórmula III:

(III)R^{1}-OH

(donde R^{1} es como se ha definido en la reivindicación 11); y

(b) convertir un compuesto de la fórmula I en una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

21. Un proceso como el de la reivindicación 20, en el que dicho grupo donante se selecciona de un grupo hidroxilo, un átomo halógeno o un grupo alcoxi.

22. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, junto con al menos un transportador o excipiente o farmacéuticamente aceptables.

23. La utilización de un compuesto como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un agente terapéutico para utilizar en fotoquimioterapia, o un agente diagnóstico para utilizar en diagnóstico.

24. La utilización como la de la reivindicación 23, en la que la fotoquimioterapia o el diagnóstico se realiza en enfermedades o anormalidades de las superficies externa o interna del cuerpo, que responden a la fotoquimiotera-
pia.

25. Un producto que comprende un compuesto como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, junto con al menos un agente de ayuda de penetración en superficie, y opcionalmente uno o más agentes quelantes, como una preparación combinada para utilización simultánea, separada o secuencial, en el tratamiento de enfermedades o anormalidades de las superficies externa o interna del cuerpo, que responden a la fotoquimioterapia.

26. Un kit para utilizar en fotoquimioterapia en enfermedades o anormalidades de las superficies externa o interna del cuerpo, que comprende:

a)

un primer contenedor que contiene un compuesto como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o una de sus sales faramcéuticamente aceptables,

b)

un segundo contenedor que contiene al menos un agente de ayuda de penetración en superficie; y opcionalmente,

c)

uno o más agentes quelantes contenidos o bien dentro de dicho primer contenedor o bien en un tercer contenedor.

27. Un método de diagnóstico in vitro de anormalidades o enfermedades, mediante análisis de una muestra de un líquido corporal o tejido de un paciente, dicho método comprendiendo al menos una de las siguientes etapas:

i)

mezclar dicho líquido corporal o tejido con un compuesto como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19;

ii)

exponer dicha mezcla a la luz;

iii)

calcular el nivel de fluorescencia; y

iv)

comparar el nivel de fluorescencia con niveles de control.