ES2276908T3 - Agente de diagnostico para la funcion pancreatica exocrina. - Google Patents
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Abstract
Dipéptido representado por la fórmula (II) siguiente: X1-R1-Y1 (II) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su utilización en diagnóstico, en la que X1 es un grupo protector seleccionado de entre el grupo constituido por benzoílo, acetilo, benciloxicarbonilo y t-butiloxicarbonilo, R1 es un resto de fenilalanina, glutamina, valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e Y1 es una molécula de alanina marcada con 13C que presenta opcionalmente un grupo protector, y en la que cuando X1 es benzoílo el dipéptido es Bz-Tyr-(13C-Ala).
Description
Agente de diagnóstico para la función
pancreática exocrina.
La presente invención se refiere a agentes de
diagnóstico para la función pancreática exocrina y a nuevos
compuestos.
Las "pruebas para la función pancreática
exocrina" son útiles para el diagnóstico de las enfermedades
pancreáticas tales como la pancreatitis crónica y aguda y el cáncer
pancreático. También son útiles para evaluar la
enfermedad y el pronóstico de pacientes y para dirigir la
administración de medicinas: las descripciones generales se
encuentran en Arvanitakis y Cooke, Gastroenterology, 74:932
(1978); Niederau y Grendell, Gastroenterology, 88:1973
(1985); Goldberg, Bull. Mol. Biol. Med., 15:1 (1990);
Lankisch, Int. J. Pancreatology, 14:9 (1993); Bank y Chow,
Gastroenterologist, 2:224 (1994); y Steer et al.,
New Eng. J. Med., 332:1482 (1995).
Las pruebas para la función pancreática exocrina
se clasifican a grandes rasgos en pruebas con entubación y pruebas
sin tubos. Las pruebas con entubación implican la entubación con un
tubo a través de la boca hasta el duodeno para recoger el jugo del
duodeno. Normalmente se utiliza la prueba de la secretina en la que
la secretina se administra por vía intravenosa para estimular la
secreción del jugo pancreático antes de la recogida. Este método es
muy preciso ya que las cantidades y componentes de jugo pancreático
se analizan directamente, y se considera como el "patrón oro"
de la prueba de la función pancreática exocrina. Sin embargo, este
método no se puede utilizar de manera repetida o utilizarse con
fines de identificación debido al estrés muy fuerte producido en
los pacientes. Solamente está disponible en un número relativamente
pequeño de instalaciones clínicas ya que el médico debe ser muy
experimentado. Además, ya que este método requiere la colocación del
tubo fluoroscópico durante la recogida del jugo duodenal, existe el
problema de la exposición a rayos X.
Por otra parte, las pruebas sin tubos son
fáciles de realizar para estimar la función pancreática exocrina
sin requerir entubación y se mide la cantidad excretada de
compuestos producidos por la enzimas pancreáticas exocrinas o la
cantidad excretada de las enzimas pancreáticas exocrinas per
se. Actualmente, se utilizan principalmente los cuatro métodos
siguientes:
1. prueba PFD en la que se administra por vía
oral un sustrato sintético BT-PABA (ácido
N-benzoil-L-tirosil-p-aminobenzoico)
para quimiotripsina segregada procedente del páncreas y se mide la
cantidad de PABA (ácido p-aminobenzoico), producto
degradado por la quimiotripsina, excretado en la orina;
2. prueba PLT en la que se administra por vía
oral un sustrato sintético FDL (dilaurato de fluoresceína) para
éster de colesterol hidrolasa, esterasa, segregada en el páncreas y
se mide la cantidad del producto de degradación fluoresceína
excretado en la orina o su concentración en la sangre;
3. prueba de quimiotripsina fecal en la que se
determina cuantitativamente la quimiotripsina en las heces; y
4. prueba de elastasa fecal en la que se
determina cuantitativamente la elastasa en las heces.
Sin embargo, la sensibilidad de cualquiera de
estas pruebas es demasiado baja para detectar ligeras disminuciones
en la función pancreática exocrina.
Para resolver este problema, se han investigado
muchas pruebas de la función pancreática exocrina convenientes; se
han aplicado también pruebas de aliento con ^{13}C en las que se
administra un compuesto marcado con ^{13}C y se mide el aumento
de la concentración de ^{13}CO_{2} en la exhalación. Ejemplos de
dichas pruebas de aliento con ^{13}C se ilustran a
continuación:
1. prueba de aliento con ^{13}C en la que se
administra un lípido marcado con ^{13}C o triglicérido mezclado,
que es un sustrato para la lipasa [Chen et al., J. Nuclear
Med., 15:1125 (1974); Watkins et al., J. Lab. Clin.
Med., 90:422 (1977); Ghoos et al., Digestion,
22:239 (1981); John, SG., Gastroenterology, 83:44 (1982);
Watkins et al., Gastroenterology, 82:911 (1982);
Benini et al., Digestion, 29:91 (1984); Jones et
al., J. Lab. Clin. Med., 105:647 (1985); Knoblach et
al., Monatsschr Kinderheilkd, 136:26 (1988); Vantrappen
et al., Gastroenterology, 96:1126 (19889); Murphy
et al., Arch. Disease in Childhood, 65:574 (1990);
Kato et al., Am. J. Gastroenterol., 88:64 (1993);
McClean et al., Arch. Disease in Childhood, 69:366
(1993); Jakobs et al., Eur. J. Pediatr., 156:578
(1997); y Kalivianakis et al., Eur. J. Clin. Invest.,
27:434 (1997)];
2. prueba de aliento con ^{13}C en la que se
administra un éster de colesterol marcado con ^{13}C, que es un
sustrato para la colesterol esterasa, una lipasa, [Mundlos, et
al., Pediatric Res., 22:257 (1987); Cole et al.,
Gastroenterology, 93:1372 (1987); y Mundlos et al.,
Gut, 31:1324 (1990)];
\newpage
3. prueba de aliento con ^{13}C en la que se
administra un almidón marcado con ^{13}C, que es un sustrato para
una amilasa [Hiele et al., Gastroenterology, 96:503
(1989); Dewit et al., Pediatric Res., 32:45 (1992); y
Z. Gastroenterol., 35:187 (1997)]; y
4. prueba de aliento con ^{13}C en la que se
administra una proteína de huevo enriquecida con ^{13}C, que es
una proteína que tiene una concentración en ^{13}C aumentada hasta
1,4 atm % de abundancia natural de 1,1 atm % alimentando un pollo
con leucina con ^{13}C, y que es un sustrato para una proteasa [Y.
Ghoos, ^{13}CO_{2}-Breath Tests at the
laboratory "Digestion-Absorption", University
Hospital Gasthuisberg, Leuven, Bélgica (1996)].
Sin embargo, todos estos métodos son de baja
sensibilidad y duraderos. Por consiguiente, estos métodos no han
sido probados en campos clínicos.
Como método de ensayo de la función pancreática
exocrina muy sensible que resuelve los problemas de los métodos
convenientes descritos anteriormente y de las pruebas de aliento con
^{13}C, pone menos carga en los pacientes, y proporciona
resultados exactos inmediatamente, se ha propuesto una prueba de
aliento que utiliza péptidos marcados con ^{13}C (prueba de
aliento con péptido con ^{13}C) (publicación de patente japonesa
no examinada nº 2000-053697). La patente EP 1101499
da a conocer la utilización de
Bz-Ala-^{13}C-Ala
como agente de diagnóstico para examinar la función pancreática
exocrina.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar agentes para el diagnóstico de la función pancreática
exocrina cuyas dosis requeridas para una prueba pueden reducirse sin
disminuir el grado de aumento de la concentración de ^{13}C en el
CO_{2} exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) en la
prueba de aliento con péptido con ^{13}C que es una prueba de la
función pancreática exocrina muy sensible que pone solamente una
pequeña carga en los pacientes y que proporciona resultados exactos
inmediatamente.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar nuevos compuestos que pueden utilizarse en las
pruebas de la función pancreática exocrina utilizando pruebas de
aliento con ^{13}C.
Para reducir la dosis de un agente de
diagnóstico requerida para una prueba, es necesario seleccionar un
dipéptido que proporcione un alto grado de aumento de la
concentración de ^{13}C en el CO_{2} exhalado (\Delta^{13}C
(\textperthousand)) en las pruebas de aliento con ^{13}C.
Los presentes inventores han realizado pruebas
de aliento con ^{13}C en las que se administran
^{13}C-dipéptidos que presentan la estructura de
grupo
protector-aminoácido-(^{13}C-Ala)
a ratas de manera equimolar, y se comparan los valores
\Delta^{13}C (\textperthousand) resultantes. Como resultado,
los inventores han descubierto que determinados tipos de
^{13}C-dipéptidos presentan valores de
\Delta^{13}C (\textperthousand) mayores que
Bz-Ala-(^{13}C-Ala) que
proporcionan el valor mayor de \Delta^{13}C (\textperthousand)
en Ejemplos de la publicación de la patente japonesa no examinada
nº 2000-053697. Por lo tanto, la presente
invención se ha conseguido.
La presente invención proporciona un agente para
diagnóstico para la función pancreática exocrina que comprende un
dipéptido representado por la fórmula (I) siguiente o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
(I)X_{1}-R_{1}-Y_{1}
en la que X_{1} es un grupo
protector,
R_{1} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e
Y_{1} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que opcionalmente tiene un grupo protector.
La presente invención también proporciona un
dipéptido representado por la fórmula (II) siguiente o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
(II)X_{2}-R_{2}-Y_{2}
en la que X_{2} es un grupo
protector,
R_{2} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e
Y_{2} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que opcionalmente tiene un grupo protector.
El dipéptido representado por la fórmula (II) o
las sales del mismo puede utilizarse como ingrediente activo en un
agente de diagnóstico para la función pancreática exocrina. Aunque
son posibles pruebas en las que la concentración de un compuesto
marcado con ^{13}C, se mide en el suero, la orina o las heces tras
la administración de un agente de diagnóstico, son deseables
pruebas de aliento en las que se mide un aumento en la concentración
de ^{13}C en el CO_{2} exhalado después de la
administración.
A continuación en la presente memoria, la
presente invención se describirá con detalle.
Los péptidos están indicados en la presente
memoria de tal manera que los terminales N están a la izquierda y
los terminales C están a la derecha.
Los restos de aminoácido se presentan en la
presente memoria con abreviaturas de tres letras. Estos pueden ser
isómeros L, isómeros D o isómeros DL.
El término "dipéptido" tal como se utiliza
en la presente memoria se refiere a cualquier compuesto que se
forme mediante el enlace de dos aminoácidos por un enlace peptídico
e incluye derivados de dichos compuestos.
La expresión "resto de fenilalanina,
glutamina, valina, tirosina, metionina, serina o treonina"
utilizada en la presente memoria se refiere a un grupo estructural
de fenilalanina, glutamina, valina, tirosina, metionina, serina o
treonina que está liberado de una molécula de H_{2}O, y este grupo
estructural constituye una unidad estructural de un dipéptido.
La expresión "molécula de alanina marcada con
^{13}C" utilizada en la presente memoria se refiere a una
molécula de alanina en la que por lo menos uno de los átomos de
carbono está sustituido con un átomo de ^{13}C y de este modo la
relación de ^{13}C en los átomos de carbono ha aumentado en
comparación con la abundancia natural de ^{13}C.
El agente para diagnóstico de la invención para
la función pancreática exocrina que comprende un dipéptido
representado por la fórmula (I) siguiente o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
(I)X_{1}-R_{1}-Y_{1}
en la que X_{1} es un grupo
protector,
R_{1} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e
Y_{1} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que opcionalmente tiene un grupo protector.
En la fórmula (I), X_{1} es un grupo
protector. El grupo protector comprende cualquier grupo protector
que se utilice generalmente en el campo de la química orgánica, por
ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1
- Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society,
publicado por Tokio Kagaku Dojin (1977); "Textbook for
Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por
Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992);
"Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo
Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi y Michinori Kaki, publicado por
Maruzen (1985); "Modification of Proteins", editado por Robert
E. Feeney y John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982);
M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis",
Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder y K.
Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. vol. 1 (1965),
vol. 2 (1966). Ejemplos específicos del grupo protector comprenden
benzoílo, acetilo, benciloxicarbonilo, benciloxicarbonilo
sustituido (tal como p-nitrobenciloxicarbonilo,
p-metoxi-benciloxicarbonilo, etc.),
t-butiloxicarbonilo,
9-fluorenilmetoxicarbonilo,
p-toluensulfonilo, ftalilo, formilo,
trifluoroacetilo, trifenilmetilo, ciclohexiloxilcarbonilo,
o-nitrofenilsulfenilo,
t-aciloxi-carbonilo,
isoborniloxicarbonilo, difenilfosfinilo, difenilfosfinotioílo,
bencilo, alquilo y aliltiocarbonilo,
o-nitrofenoxiacetilo y cloroacetilo,
bencenosulfonilo, dibencilfosforilo, trialquilsililo, alilideno y
acetoacetilo.
Los ejemplos preferidos de X_{1} incluyen
benzoílo, acetilo, benciloxicarbonilo y
t-butiloxi-carbonilo.
R_{1} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina.
Y_{1} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que opcionalmente tiene un grupo protector. El grupo
protector comprende cualquiera de los grupos protectores que se
utilizan generalmente en el campo de la química orgánica, por
ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1
- Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society,
publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1977); "Textbook for
Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por
Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992);
"Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo
Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi y Michinori Kaki, publicado por
Maruzen (1985); "Modification of Proteins", editado por Robert
E. Feeney y John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982);
M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis",
Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder y K.
Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. vol. 1 (1965), vol.
2 (1966). Específicamente, los ejemplos de grupos protectores para
el grupo carboxilo incluyen el éster metílico, el éster etílico, el
éster bencílico, el éster t-butílico, el éster
p-nitrobencílico y la hidracida
N'-sustituida.
Los aminoácidos representados por R_{1} e
Y_{1} pueden modificarse de varias maneras. Ejemplos específicos
de dicha modificación incluyen la guanidilación, succinilación y
acetilación de grupos amino; la esterificación de grupos carboxilo;
la formación de sales de sulfonio de metionina y la nitración y
yodación de la tirosina.
Los ejemplos específicos de sales
farmacéuticamente aceptables del dipéptido representado por la
fórmula (I) incluyen las sales formadas con ácidos inorgánicos
tales como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o
ácido fosfórico; las sales formadas con ácidos orgánicos tales como
el ácido acético, ácido propiónico, ácido succínico, ácido málico,
ácido tartárico, ácido cítrico o ácido maleico; las sales formadas
con metales alcalinos tales como sodio o potasio; y las sales
formadas con metales alcalinotérreos tales como el calcio.
La presente invención comprende asimismo
dipéptidos representados por la fórmula (II) siguiente o sales
farmacéuticamente aceptables de los mismos.
(II)X_{2}-R_{2}-Y_{2}
en la que X_{2} es un grupo
protector,
R_{2} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e
Y_{2} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que opcionalmente tiene un grupo protector.
En la fórmula (II), X_{1} es un grupo
protector. El grupo protector comprende cualquier grupo protector
que se utilice generalmente en el campo de la química orgánica, por
ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1
- Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society,
publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1977); "Textbook for
Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por
Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992);
"Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo
Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi y Michinori Kaki, publicado por
Maruzen (1985); "Modification of Proteins", editado por Robert
E. Feeney y John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982);
M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis",
Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder y K.
Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. vol. 1 (1965),
vol. 2 (1966). Ejemplos específicos del grupo protector comprenden
benzoílo, acetilo, benciloxicarbonilo, benciloxicarbonilo
sustituido (tal como p-nitrobenciloxicarbonilo,
p-metoxi-benciloxicarbonilo, etc.),
t-butiloxicarbonilo,
9-fluorenilmetoxicarbonilo,
p-toluensulfonilo, ftalilo, formilo,
trifluoroacetilo, trifenilmetilo, ciclohexiloxilcarbonilo,
o-nitrofenilsulfenilo,
t-aciloxi-carbonilo,
isoborniloxicarbonilo, difenilfosfinilo, difenilfosfinotioílo,
bencilo, alquilo y aliltiocarbonilo,
o-nitrofenoxiacetilo y cloroacetilo,
bencenosulfonilo, dibencilfosforilo, trialquilsililo, alilideno y
acetoacetilo.
Los ejemplos preferidos de X_{2} incluyen
benzoílo, acetilo, benciloxicarbonilo y
t-butiloxi-carbonilo.
R_{2} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina.
Y_{2} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que opcionalmente tiene un grupo protector. El grupo
protector comprende cualquiera de los grupos protectores que se
utilizan generalmente en el campo de la química orgánica, por
ejemplo, los descritos en "Textbook for Biochemical Experiments 1
- Protein Chemistry IV", editado por Japan Biochemical Society,
publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1977); "Textbook for
Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por
Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992);
"Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis", Nobuo
Izumiya, Tetsuo Kato, Tohiko Aoyagi y Michinori Kaki, publicado por
Maruzen (1985); "Modification of Proteins", editado por Robert
E. Feeney y John R. Whitaker, the American Chemical Society (1982);
M. Bodanszky, "Principles of Peptides Synthesis",
Springer-Verlag, Berlín (1984); y E. Schroder y K.
Lubke, "The Peptides", Academic Press, N.Y. vol. 1 (1965), vol.
2 (1966). Específicamente, los ejemplos de grupos protectores para
el grupo carboxilo incluyen el éster metílico, el éster etílico, el
éster bencílico, el éster t-butílico, el éster
p-nitrobencílico y la hidracida
N'-sustituida.
Los aminoácidos representados por R_{2} e
Y_{2} pueden modificarse de varias maneras. Ejemplos específicos
de dicha modificación incluyen la guanidilación, succinilación y
acetilación de grupos amino; la esterificación de grupos carboxilo;
la formación de sales de sulfonio de metionina y la nitración y
yodación de la tirosina.
Ejemplos específicos de sales farmacéuticamente
aceptables del dipéptido representado por la fórmula (II) incluyen
las sales formadas con ácidos inorgánicos tales como el ácido
clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico; las
sales formadas con ácidos orgánicos tales como el ácido acético,
ácido propiónico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico,
ácido cítrico o ácido maleico; las sales formadas con metales
alcalinos tales como sodio o potasio; y las sales formadas con
metales alcalinotérreos tales como el calcio.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el dipéptido marcado con ^{13}C representado
por la fórmula (I) y el dipéptido marcado con ^{13}C representado
por la fórmula (II) se seleccionan de entre el grupo constituido
por los compuestos siguientes:
(a)
Bz-Phe-(^{13}C-Ala),
(b)
Bz-Gln-(^{13}C-Ala),
(c)
Bz-Val-(^{13}C-Ala),
(d)
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala),
(e)
Bz-Met-(^{13}C-Ala),
(f)
Bz-Ser-(^{13}C-Ala),
(g)
Bz-Thr-(^{13}C-Ala),
(h)
Ac-Met-(^{13}C-Ala),
(i)
Z-Met-(^{13}C-Ala),
(j)
Boc-Met-(^{13}C-Ala), y
(k)
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)
en los que Bz es benzoílo, Ac es acetilo, Z es
benciloxicarbonilo y Boc es t-butiloxicarbonilo.
El dipéptido marcado con ^{13}C representado
por la fórmula (I) anterior y las sales farmacéuticamente aceptables
del mismo y el dipéptido marcado con ^{13}C representado por la
fórmula (II) anterior y las sales farmacéuticamente aceptables del
mismo se absorben a través del tubo digestivo en la reacción con
la(s) proteasa(s) pancreática(s)
exocrina(s)
y se descarboxila por acción metabólica para generar ^{13}CO_{2}. Ejemplos de proteasas pancreáticas exocrinas incluyen la quimiotripsina, tripsina, elastasa y carboxipeptidasas representadas por la carboxipeptidasa A y B.
y se descarboxila por acción metabólica para generar ^{13}CO_{2}. Ejemplos de proteasas pancreáticas exocrinas incluyen la quimiotripsina, tripsina, elastasa y carboxipeptidasas representadas por la carboxipeptidasa A y B.
Los dipéptidos marcados con ^{13}C descritos
anteriormente pueden sintetizarse por métodos convencionales
utilizando aminoácidos disponibles en el mercado. Por ejemplo,
pueden utilizarse los métodos descritos en "Textbook for
Experimental Chemistry 22 - Organic Synthesis IV", editado por
Japan Chemical Society, publicado por Maruzen (1992). Un ejemplo
ilustrativo de los mismos se describirá a continuación.
La alanina marcada con ^{13}C se disuelve en
cloruro de hidrógeno/metanol y se calienta a reflujo. El éster
metílico resultante se pone en suspensión en diclorometano, y a
continuación se añade trietilamina a ésta gota a gota mientras se
enfría con hielo y se agita. Además, a esto se le añade ácido
N-benzoíl-amino, HOBt
(1-hidroxi-1H-benzotriazol\cdotH_{2}O)
y diclorometano. A continuación, a esto se añade una solución de WSC
(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida\cdotHCl)
disuelto en diclorometano y se agita. Después de la concentración,
se extrae la solución de reacción con acetato de etilo, se lava con
HCl 1 N, NaHCO_{3} al 5% y agua, se seca sobre sulfato de
magnesio y se evapora a sequedad, o se saponifica más, para dar el
compuesto marcado con ^{13}C deseado representado por la fórmula
anterior (I) o (II).
El dipéptido marcado con ^{13}C puede
obtenerse en forma de sal. La sal puede incluir las que presentan
ácidos inorgánicos tales como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico,
ácido nítrico o ácido fosfórico; las que presentan ácidos orgánicos
tales como los ácidos fórmico, acético, propiónico, glicólico,
succínico, málico, tartárico, cítrico y trifluoroacético; las que
presentan con metales alcalinos tales como sodio o potasio; las que
presentan metales alcalinotérreos tales como el calcio; y las que
presentan aminas orgánicas tales como amonio, etanolamina,
trietilamina y diciclohexilamina.
Las pruebas que utilizan el agente de
diagnóstico para la función pancreática exocrina según la presente
invención se realizan administrando a un sujeto el dipéptido
marcado con ^{13}C representado por la fórmula (I) o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo. Aunque son posibles pruebas
en las que la concentración de un compuesto marcado con ^{13}C,
se mide en el suero, la orina o las heces tras la administración de
un agente de diagnóstico, son deseables pruebas de aliento en las
que se mide un aumento en la concentración de ^{13}C en el
CO_{2} exhalado después de la administración. Cuando el dipéptido
marcado con ^{13}C representado por la fórmula (I) o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo se administra a un individuo,
el individuo puede alimentarse con una comida de prueba o similares
para provocar la secreción de enzimas pancreáticas. Asimismo,
pueden combinarse para su utilización dos o más compuestos marcados
con ^{13}C representados por la fórmula (I) o las sales
farmacéuticamente aceptables del mismo. Específicamente, cuando se
utiliza un compuesto marcado con ^{13}C, las concentraciones de
^{13}C en el CO_{2} exhalado se determinan después de la
administración. A continuación, se diagnostica la función
pancreática exocrina a partir de los datos sobre el grado de
incremento de la concentración de ^{13}C en el CO_{2} exhalado
(\Delta^{13}C (\textperthousand)) en puntos de tiempo
predeterminados (p. ej., 5, 10 ó 15 min después de la
administración) o los datos a lo largo del tiempo del grado de
incremento de la concentración de ^{13}C en el CO_{2} exhalado
(\Delta^{13}C (\textperthousand)) hasta un punto de tiempo
predeterminado después de la administración (es decir, la pendiente
al principio, el cambio de pendiente, el pico de tiempo, etc.).
Estos métodos de ensayo utilizan el fenómeno de que cuando se
administra a un sujeto el dipéptido marcado con ^{13}C
representado por la fórmula (I) o la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, el compuesto se absorbe a través del tubo
digestivo en la reacción con las proteasas pancreáticas endocrinas
y se descarboxila mediante la acción metabólica en el cuerpo para
generar ^{13}CO_{2}.
La concentración de ^{13}C en el
^{13}CO_{2} exhalado puede determinarse por cromatografía de
masas-espectrometría de masas
(GC-MS), espectroscopia infrarroja, espectrometría
de masas, espectroscopia fotoeléctrica acústica, RMN (resonancia
magnética nuclear) y otros métodos.
El agente de diagnóstico para la función
pancreática exocrina según la presente invención puede formularse a
partir del dipéptido marcado con ^{13}C representado por la
fórmula (I) o la sal del mismo farmacéuticamente aceptable, ya sea
solo o en combinación con un excipiente o portador, en una
preparación oral tales como comprimidos, cápsulas, polvo, gránulos,
líquido, etc. El excipiente o portador puede ser cualquier
excipiente o portador farmacéuticamente aceptable que se utilice
convencionalmente en este campo, y su naturaleza y composición debe
seleccionarse de manera apropiada. Por ejemplo, puede utilizarse
agua como portador líquido. Los portadores sólidos incluyen
derivados de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa y sales de
ácidos orgánicos tales como estearato de magnesio. Asimismo, el
agente de diagnóstico de la invención puede utilizarse como
preparación liofilizada.
El dipéptido marcado con ^{13}C representado
por la fórmula (I) o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo
está contenido en preparaciones en cantidades variables dependiendo
de la clase de la preparación, pero generalmente en una cantidad
entre el 1 y el 100% en peso, preferentemente entre el 50 y el 100%
en peso. En las preparaciones en cápsulas, comprimidos, gránulo o
polvo, el dipéptido marcado con ^{13}C representado por la
fórmula (I) o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo está
contenido en la preparación en una cantidad comprendida
aproximadamente entre el 10 y el 100% en peso, preferentemente entre
el 50 y el 100% en peso, siendo el resto un portador.
La dosis de agente de diagnóstico para la
función pancreática exocrina según la presente invención debería
ser suficiente para que permita confirmar un aumento de
^{13}CO_{2} en el aliento originado por su administración. La
dosis oscilará dependiendo de la edad y del peso corporal del
paciente y el objetivo de la prueba. Por ejemplo, la dosis para la
prueba puede ser de aproximadamente 1 a 1.000 mg/kg de peso corporal
para un adulto.
La presente memoria comprende los contenidos de
la memoria y/o los dibujos de la solicitud de la patente japonesa
nº 2001-243142 basada en la cual la presente
solicitud reivindica prioridad.
La Fig. 1 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 2 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 3 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 4 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 5 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 6 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 7 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 8 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Z-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 9 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 10 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 11 presenta el espectro
^{1}H-RMN (en D_{2}O) de
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa.
La Fig. 12 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=10) y ratas normales
(\sqbullet, n=5) a razón de 12,6 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
La Fig. 13 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=6) y ratas normales
(\sqbullet, n=5) a razón de 12,0 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
La Fig. 14 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=5) y ratas normales
(\sqbullet, n=5) a razón de 11,0 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
La Fig. 15 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=10) y ratas normales
(\sqbullet, n=5) a razón de 13,2 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
La Fig. 16 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=5) y ratas normales
(\sqbullet, n=8) a razón de 12,1 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
La Fig. 17 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=5) y ratas normales
(\sqbullet, n=5) a razón de 10,6 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
La Fig. 18 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=4) y ratas normales
(\sqbullet, n=5) a razón de 11,0 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
La Fig. 19 presenta el grado de incremento de la
concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)) después de la
administración de
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa.
En el min 0, se administró por vía oral
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
a ratas con pancreatitis crónica (\bullet, n=5) y ratas normales
(\sqbullet, n=7) a razón de 8,84 mg/kg. Las barras de error
representan la DS.
A continuación en la presente memoria, la
presente invención se ilustrará con mayor detalle haciendo
referencia a los Ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente
invención no estará limitado por aquellos Ejemplos. En los Ejemplos
siguientes, los restos de aminoácido presentados en abreviaturas de
tres letras son isómeros L a menos que se especifique de otra
manera.
Se disolvió ^{13}C-alanina
(Masstrace, Inc.) (10,0 g, 0,111 moles) en hidróxido sódico acuoso
(111 ml). A esta solución, se añadieron Boc_{2}O (28,0 ml, 0,122
moles) en acetona (110 ml) y trietilamina (7,71 ml, 55,5 mmoles) y
se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de
concentración a presión reducida, se añadió cloruro sódico acuoso
para dar 200 ml de solución. Se añadió ácido cítrico a ésta para
ajustar el pH a 4, seguido de saturación de la solución con cloruro
sódico. A continuación, se extrajo cuatro veces la solución
resultante con acetato de etilo. Se lavó la capa orgánica dos veces
con cloruro sódico acuoso saturado y se secó sobre sulfato de
magnesio anhidro. Tras la concentración a presión reducida, el
material resultante se disolvió en éter dietílico
(150 ml). A continuación, se añadió a ésta ciclohexilamina (12,7
ml, 0,111 moles) y la solución se dejó en reposo durante 2 h a
temperatura ambiente. Los cristales depositados se filtraron, se
lavaron con éter dietílico y se secaron a presión reducida para dar
Boc-(^{13}C-Ala)-OH\cdotCHA.
A una suspensión de
Boc-(^{13}C-Ala)-OH\cdotCHA
(32,08 g, 0,111 moles) en acetato de etilo (400 ml), se añadió
ácido cítrico acuoso al 10% (100 ml) y se agitó a temperatura
ambiente. Cuando la suspensión se volvió solución, se saturó con
cloruro de sodio para separar la capa orgánica. Después de dos
extracciones con acetato de etilo, se combinaron las capas
orgánicas y se lavaron dos veces con cloruro sódico acuoso saturado.
El material resultante se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y
a continuación se concentró a presión reducida para dar un extracto
incoloro. Este extracto se disolvió en etanol/agua (9:1) (200 ml),
seguido de adición de carbonato de cesio (19,0 g, 58,3 mmoles).
Cuando cesó la formación de espuma, se concentró la solución a
presión reducida. Se añadió tolueno al residuo, y se eliminó el
agua por destilación azeotrópica para obtener de este modo un
material pseudogelatinoso. Este material se puso en suspensión en
DMF (200 ml) y se añadió a éste bromuro de bencilo (13,2 ml, 0,111
ml) y se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. Tras la
concentración a presión reducida, se añadió acetato de etilo al
residuo, que se lavó a continuación con agua, ácido cítrico acuoso
al 10%, cloruro sódico acuoso saturado, bicarbonato sódico acuoso
saturado y cloruro sódico acuoso saturado en este orden y se secó
sobre sulfato de magnesio anhidro. Se destiló acetato de etilo a
presión reducida para dar
Boc-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 4,5 N/dioxano
(250 ml) a Boc-(^{13}C-Ala)-OBzl
(31,27 g, 0,111 moles) y la solución resultante se dejó en reposo
durante 30 min a temperatura ambiente. Tras la concentración a
presión reducida, se añadió éter dietílico (200 ml) a ésta. Se
filtraron los cristales depositados y se secaron a presión reducida
para dar 22,48 g de
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se disolvieron en DMF (10 ml)
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl (700
mg, 3,2 mmoles), Boc-Phe (Peptide Institute Inc.)
(857 mg, 3,23 mmoles) y HOBt (458 mg, 3,39 mmoles). A esta solución,
se añadió gota a gota WSCD (620 \mul, 3,39 mmoles) mientras se
enfriaba con hielo y se agitaba, seguido de agitación durante 2 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
cloruro sódico acuoso saturado, ácido cítrico acuoso al 10% y
cloruro sódico acuoso saturado en este orden. Tras el secado sobre
sulfato sódico anhidro, se destiló acetato de etilo a presión
reducida para dar
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 4,5 N/dioxano (30
ml) a
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,30 g, 3,04 moles) y la solución resultante se dejó en reposo
durante 1 h a temperatura ambiente. Después de concentración a
presión reducida, la solución se secó más a presión reducida. Se
disolvió el material resultante en DMF (10 ml). A esta solución, se
añadió ácido benzoico (371 mg, 3,04 mmoles) y HOBt (411 mg, 3,04
mmoles) mientras se enfriaba y agitaba. A continuación se añadió
gota a gota WSCD (547 \mul, 3,04 mmoles), y la solución se agitó
durante 2 h a temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de
etilo, se lavó el producto de reacción con bicarbonato sódico
acuoso saturado, cloruro sódico acuoso saturado, ácido cítrico
acuoso al 10% y cloruro sódico acuoso saturado en este orden y a
continuación se secó sobre sulfato sódico anhidro. Después de la
concentración a presión reducida, se añadió éter isopropílico para
cristalización para proporcionar
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se disolvió
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,13 g, 2,62 mmoles) en ácido acético (50 ml). Tras la adición de
paladio al 5% en carbono (500 mg) a esta solución, se insufló en
ella gas hidrógeno durante 2 h mientras se agitaba a temperatura
ambiente. Después de filtrar el catalizador, se destiló ácido
acético. Se añadió acetato de etilo al material resultante, que se
lavó con cloruro de hidrógeno acuoso saturado y a continuación se
secó sobre sulfato de sodio anhidro. Tras la concentración a presión
reducida, se añadió éter isopropílico para solidificar el material
concentrado. A continuación, se añadió agua (50 ml) para preparar
una suspensión, que se liofilizó para proporcionar
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,25H_{2}O.
Se disolvió
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,25H_{2}O
(755 mg, 2,185 mmoles) en acetonitrilo acuoso al 30% (30 ml). A
esta solución se le añadió carbonato sódico acuoso 1 M (1,093 ml,
2,185 mmoles). Cuando cesó la formación de espuma, se liofilizó la
solución para dar 747 mg de
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 1),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,6 ppm
Espectrometría de masas
(MALDI-MS): 364,3 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl (450
mg, 2,07 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo 1,
Boc-Gln (Peptide Institute Inc.) (510 mg, 2,07
mmoles) y HOBt (294 mg, 2,17 mmoles) se disolvieron en DMF (5 ml).
A esta solución, se añadió gota a gota WSCD (385 \mul, 2,17
mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido de
agitación durante 30 min bajo enfriamiento con hielo y durante 2 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
cloruro sódico acuoso saturado, ácido cítrico acuoso al 10% y
cloruro sódico acuoso saturado en este orden y a continuación se
secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato de etilo se destiló
a presión reducida. A continuación, se añadió hexano a la solución
para dar
Boc-Gln-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 4,5 N/dioxano (30
ml) a
Boc-Gln-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1300 mg, 3,18 moles) y la solución resultante se dejó en reposo
durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la concentración a presión
reducida, la solución se secó más a presión reducida. Se disolvió el
material resultante en DMF (10 ml). Se añadieron ácido benzoico
(402 mg, 3,30 mmoles) y HOBt (468 mg, 3,46 mmoles) a esta solución
mientras se enfriaba con hielo y se agitaba. A continuación, se
añadió gota a gota WSCD (633 \mul, 3,46 mmoles) y la solución se
agitó durante 2 h a temperatura ambiente. Se añadió agua a ésta y el
sólido depositado se filtró y se lavó con agua. El material
resultante se volvió a precipitar en metanol/éter y se filtró para
dar
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se disolvió
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-OBzl
(890 mg, 2,16 mmoles) en ácido acético (50 ml). Tras la adición de
paladio al 5% en carbono (500 mg) a esta solución, se insufló en
ella gas hidrógeno durante 2 h mientras se agitaba a temperatura
ambiente. Después de filtrar el catalizador, se destiló ácido
acético. Se añadió acetonitrilo/agua al residuo resultante, que se
liofilizó a continuación para dar
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-OH.
A
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-OH
(618 mg, 1,917 mmoles), se añadió agua (10 ml). A continuación se
añadió a esto, carbonato sódico acuoso 1 M (1.054 \mul, 2,108
mmoles). Cuando cesó la formación de espuma, la solución se purificó
por RP-HPLC (YMC-PAK ODS 10 \mum,
30\times250 mm, MeCN del 5 al 20%, 60 min., 20 ml/min). Las
fracciones principales se liofilizaron para dar 544 mg de
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 2),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,8 ppm
Espectrometría de masas
(MALDI-MS): 345,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl (700
mg, 3,23 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo 1,
Boc-Val (Peptide Institute Inc.) (702 mg, 3,23
mmoles) y HOBt (458 mg, 3,39 mmoles) se disolvieron en DMF (10 ml).
A esta solución, se le añadió gota a gota WSCD (620 \mul, 3,39
mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido de
agitación durante 2 h a temperatura ambiente. Tras la adición de
acetato de etilo, se lavó el producto de reacción con bicarbonato
sódico acuoso saturado, agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en
este orden. A continuación, la solución se secó sobre sulfato de
sodio anhidro y el acetato de etilo se destiló a presión reducida.
El residuo se solidificó con éter dietílico, se filtró y se secó a
presión reducida para dar
Boc-Val-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 4,5 N/dioxano (30
ml) a
Boc-Val-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,26 g, 3,32 mmoles) y la solución resultante se dejó en reposo
durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la concentración a presión
reducida, la solución se secó más a presión reducida. Se disolvió el
material resultante en DMF (10 ml). A continuación, se añadieron
ácido benzoico (405 mg, 3,32 mmoles) y HOBt (449 mg, 3,32 mmoles)
mientras se enfriaba en hielo y se agitaba. A continuación, se
añadió gota a gota WSCD (608 \mul, 3,32 mmoles) y la solución se
agitó durante 2 h a temperatura ambiente. Tras la adición de
acetato de etilo, se lavó el producto de reacción con bicarbonato
sódico acuoso saturado, cloruro sódico acuoso saturado, ácido
cítrico acuoso al 10% y cloruro sódico acuoso saturado en este
orden y a continuación se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Tras
la concentración a presión reducida, se añadió éter isopropílico
para cristalización para dar
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se disolvió
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-OBzl
(960 mg, 2,50 mmoles) en ácido acético (50 ml). Tras la adición de
paladio al 5% en carbono (500 mg) a esta solución, se insufló en
ella gas hidrógeno durante 2 h mientras se agitaba a temperatura
ambiente. Después de filtrar el catalizador, se destiló ácido
acético. Se añadió acetato de etilo al material resultante, que se
lavó con cloruro de hidrógeno acuoso saturado y a continuación se
secó sobre sulfato de sodio anhidro. Tras la concentración a presión
reducida, se añadió éter isopropílico para solidificar el material
concentrado. A continuación, se añadió agua (50 ml) e esto para
preparar una suspensión, que se liofilizó para dar
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,32H_{2}O.
Se disolvió
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,32H_{2}O
(547 mg, 1,83 mmoles) en acetonitrilo acuoso al 30% (30 ml) y a
ésta se añadió carbonato sódico acuoso 1 M (915 \mul, 1,83
mmoles). Cuando cesó la formación de espuma, se liofilizó la
solución para dar 561 mg de
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 3),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,7 ppm
Espectrometría de masas
(MALDI-MS): 316,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl (700
mg, 3,23 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo 1,
Boc-Tyr (Brz) (Peptide Institute Inc.) (1,60 g,
3,23 mmoles) y HOBt (459 mg, 3,39 mmoles) se disolvieron en DMF (8
ml). A esta solución, se le añadió gota a gota WSCD (602 \mul,
3,39 mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido
de agitación durante 30 min refrigerando con hielo y durante 2 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden y a
continuación se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato de
etilo se destiló a presión reducida y el residuo cristalino
resultante se lavó con éter dietílico, se filtró, y se secó a
presión reducida para dar
Boc-Tyr-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 6 N/dioxano (30
ml) a Boc-Tyr
(Brz)-(^{13}C-Ala)-OBzl (2,01 g,
3,06 moles) y la solución resultante se agitó durante 40 min a
temperatura ambiente. Tras la concentración a presión reducida, se
disolvió el residuo en DMF (10 ml). A esta solución se añadieron
ácido benzoico (378 mg, 3,09 mmoles) y HOBt (434 mg, 3,37 mmoles).
A continuación, se añadió poco a poco WSCD (599 \mul, 3,37 mmoles)
y la solución se agitó durante 30 min enfriando con hielo y durante
2 h a temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se
lavó el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden y a
continuación se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato de
etilo se destiló a presión reducida y el residuo cristalino
resultante se lavó con éter dietílico, se filtró, y se secó a
presión reducida para dar
Bz-Tyr(Brz)-(^{13}C-Ala)-OBzl.
A una mezcla de Bz-Tyr
(Brz)-(^{13}C-Ala)-OBzl (1,81 g,
2,74 mmoles) y anisol (3,0 ml, 27,8 mmoles), se le introdujo
fluoruro de hidrógeno anhidro (15 ml) mientras se enfriaba en un
baño de metanol con hielo en agitación. A continuación, se agitó la
solución durante 1 h bajo enfriamiento con hielo. Después de
destilar el fluoruro de hidrógeno bajo enfriamiento con hielo, éter
diisopropílico (30 ml) se añadió al filtro a la materia insoluble.
La materia insoluble se lavó con éter diisopropílico y se secó a
presión reducida para dar
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-OH.
A una solución acuosa de
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-OH
(20 ml) se le añadió carbonato sódico acuoso 1 M (3,40 ml, 3,40
mmoles) para ajustar el pH a 8. Se filtraron los vestigios de
materia insoluble con un filtro de membrana. A continuación, se
purificó la solución por RP-HPLC
(YMC-PAK ODS 10 \mum, 30\times250 mm, MeCN del 1
al 60%, 80 min., 20 ml/min). Las fracciones principales se
recogieron y se liofilizaron para dar 731 mg de
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 4),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,6 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 380,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl (700
mg, 3,23 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo 1,
Boc-Met (Peptide Institute Inc.) (805 mg, 3,23
mmoles) y HOBt (459 mg, 3,39 mmoles) se disolvieron en DMF (8 ml).
A esta solución, se añadió gota a gota WSCD (602 \mul, 3,39
mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido de
agitación durante 30 min refrigerando con hielo y durante 3 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden y a
continuación se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato de
etilo se destiló a presión reducida para dar
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 6 N/dioxano (5
ml) a
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,40 g, equivalente a 3,23 moles) y la solución resultante se
agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la concentración a
presión reducida, se disolvió el residuo en DMF (8 ml). A esta
solución se le añadieron ácido benzoico (394 mg, 3,23 mmoles) y
HOBt (459 mg, 3,39 mmoles). A continuación, se añadió poco a poco
WSCD (632 \mul, 3,55 mmoles) y la solución se agitó durante 4 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden. El acetato
de etilo se destiló a presión reducida. Se añadió hexano al residuo
resultante y se filtró el sólido depositado y se secó a presión
reducida para dar
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl.
A una mezcla de
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,12 g, 2,69 mmoles) y p-cresol (1,5 ml, 14
mmoles), se le introdujo fluoruro de hidrógeno anhidro (8,5 ml)
mientras se enfriaba en un baño de metanol con hielo en agitación. A
continuación, se agitó la solución durante 1 h bajo enfriamiento con
hielo. Después de destilar el fluoruro de hidrógeno bajo
enfriamiento con hielo, éter diisopropílico se añadió al filtro a la
materia insoluble. La solución resultante se secó a presión reducida
para dar
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-OH.
A
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-OH
en acetonitrulo acuoso al 5% (40 ml), se le añadió carbonato sódico
acuoso 1 M (1,47 ml, 1,47 mmoles) para ajustar el pH a 8. Se
filtraron los vestigios de materia insoluble con un filtro de
membrana. A continuación, se purificó la solución por
RP-HPLC (YMC-PAK ODS 10 \mum,
30\times250 mm, MeCN del 1 al 60%, 80 min., 20 ml/min). Las
fracciones principales se recogieron y se liofilizaron para dar 546
mg de
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 5),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,7 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 348,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl (700
mg, 3,23 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo 1,
Boc-Ser (Bzl) (Peptide Institute Inc.) (954 mg,
3,23 mmoles) y HOBt (459 mg, 3,39 mmoles) se disolvieron en DMF (8
ml). A esta solución, se le añadió gota a gota WSCD (602 \mul,
3,39 mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido
de agitación durante 30 min refrigerando con hielo y durante 3 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden y a
continuación se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato de
etilo se destiló a presión reducida para dar
Boc-Ser(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 6 N/dioxano (30
ml) a
Boc-Ser(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,90 g, equivalente a 3,23 mmoles) y la solución resultante se
agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la concentración a
presión reducida, se disolvió el residuo en DMF (10 ml). A esta
solución se le añadieron ácido benzoico (253 mg, 3,23 mmoles) y
HOBt (279 mg, 3,23 mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se
agitaba. A continuación, se le añadió poco a poco WSCD (602 \mul,
3,39 mmoles) y la solución se agitó durante 30 min enfriando con
hielo y durante 2 h a temperatura ambiente. Tras la adición de
acetato de etilo, se lavó el producto de reacción con bicarbonato
sódico acuoso saturado, agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en
este orden y a continuación se secó sobre sulfato sódico anhidro.
El acetato de etilo se destiló a presión reducida y se filtró el
sólido depositado y se secó a presión reducida para dar
Bz-Ser(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl.
A una mezcla de Bz-
Ser(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,14 g, 2,47 mmoles) y anisol (1,5 ml, 13,9 mmoles), se introdujo
fluoruro de hidrógeno anhidro (8,5 ml) mientras se enfriaba en un
baño de metanol con hielo en agitación. A continuación, se agitó la
solución durante 1 h bajo enfriamiento con hielo. Después de
destilar el fluoruro de hidrógeno bajo enfriamiento con hielo, se
añadieron agua (20 ml) y éter dietílico (20 ml) al material
resultante y se agitó. La capa acuosa resultante se liofilizó para
dar
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-OH.
A una solución acuosa de
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-OH
(20 ml), se añadió carbonato sódico acuoso 1 M (1,48 ml, 1,48
mmoles) para ajustar el pH a 8. Se filtraron los vestigios de
materia insoluble con un filtro de membrana. A continuación, se
purificó la solución por RP-HPLC
(YMC-PAK ODS 10 \mum, 30\times250 mm, MeCN del 1
al 60%, 80 min., 20 ml/min). Las fracciones principales se
recogieron y se liofilizaron para dar 530 mg de
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 6),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,9 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 304,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl (700
mg, 3,23 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo 1,
Boc-Thr (Bzl) (Peptide Institute Inc.) (999 mg,
3,23 mmoles) y HOBt (459 mg, 3,39 mmoles) se disolvieron en DMF (8
ml). A esta solución, se le añadió gota a gota WSCD (602 \mul,
3,39 mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido
de agitación durante 30 min refrigerando con hielo y durante 1 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden y a
continuación se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato de
etilo se destiló a presión reducida y el residuo cristalino
resultante se lavó con hexano, se filtró y se secó a presión
reducida para dar
Boc-Thr(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se añadió cloruro de hidrógeno 6 N/dioxano (30
ml) a
Boc-Thr(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl
(1,38 g, a 2,92 mmoles) y la solución resultante se agitó durante 1
h a temperatura ambiente. Tras la concentración a presión reducida,
se disolvió el residuo en DMF (10 ml). A esta solución se le
añadieron ácido benzoico (356 mg, 2,92 mmoles) y HOBt (415 mg, 3,07
mmoles) mientras se enfriaba con hielo y se agitaba. A continuación,
se añadió poco a poco WSCD (574 \mul, 3,07 mmoles) y la solución
se agitó durante 30 min enfriando con hielo y durante 2 h a
temperatura ambiente. Tras la adición de acetato de etilo, se lavó
el producto de reacción con bicarbonato sódico acuoso saturado,
agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden y a
continuación se secó sobre sulfato sódico anhidro. El acetato de
etilo se destiló a presión reducida y se filtró el sólido depositado
y se secó a presión reducida para dar
Bz-Thr(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl.
A una mezcla de
Bz-Thr(Bzl)-(^{13}C-Ala)-OBzl
(779 mg, 1,64 mmoles) y anisol (1,0 ml, 9,26 mmoles), se le
introdujo fluoruro de hidrógeno anhidro (9 ml) mientras se enfriaba
en un baño de metanol con hielo en agitación. A continuación, se
agitó la solución durante 1 h bajo enfriamiento con hielo. Después
de destilar el fluoruro de hidrógeno bajo enfriamiento con hielo,
se añadieron agua (20 ml) y éter dietílico (20 ml) al material
resultante y se agitó. La capa acuosa resultante se liofilizó para
dar
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-OH.
A una solución acuosa de
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-OH
(20 ml), se añadió carbonato sódico acuoso 1 M (900 \mul, 0,90
mmoles) para ajustar el pH a 8. Se filtraron los vestigios de
materia insoluble con un filtro de membrana. A continuación, se
purificó la solución por RP-HPLC
(YMC-PAK ODS 10 \mum, 30\times250 mm, MeCN del 1
al 60%, 80 min., 20 ml/min). Las fracciones principales se
recogieron y se liofilizaron para dar 353 mg de
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 7),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,8 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 318,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl
(6,50 g, 30,0 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo
1, Z-Met (Peptide Institute Inc.) (8,50 g, 30,0
mmoles) y HOBt (4,26 g, 31,5 mmoles) se disolvieron en DMF (60 ml).
A esta solución, se añadió gota a gota WSCD (5,58 ml, 31,5 mmoles)
mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido de agitación
durante la noche a temperatura ambiente. Tras concentración a
presión reducida, se le añadió acetato de etilo. Se lavó el
producto de reacción resultante con agua, bicarbonato sódico acuoso
saturado, agua, ácido cítrico acuoso al 10% y agua en este orden y
a continuación se secó sobre sulfato de sodio anhidro. El acetato
de etilo se destiló a presión reducida y el residuo resultante se
lavó con éter diisopropílico y se filtró para dar
Z-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl.
A una suspensión de
Z-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl
(13,13 g, 29,5 mmoles) en metanol (90 ml), se añadió hidróxido
sódico acuoso 2 N (29,5 ml, 58,9 mmoles) y se agitó durante 1 h a
temperatura ambiente. Se destiló el metanol a presión reducida y el
ácido clorhídrico concentrado se añadió a la solución para ajustar
el pH a 1. A continuación, se extrajo la solución dos veces con
acetato de etilo, se lavó con cloruro sódico acuoso saturado y se
secó sobre sulfato de magnesio. Después de concentración a presión
reducida, se solidificó el residuo con hexano/éter diisopropílico.
El sólido incoloro resultante se filtró, se redisolvió en acetato de
etilo y se lavó con agua ultrapura. Después de la concentración a
presión reducida, se lavó el residuo con hexano y se secó a presión
reducida para dar
Z-Met-(^{13}C-Ala)-OH.
A
Z-Met-(^{13}C-Ala)-OH
(10,07 g, 28,3 mmoles) en acetonitrilo al 30% (50 ml), se añadió
bicarbonato sódico (2,38 g, 28,3 mmoles) y se disolvió. Se diluyó
la solución resultante con agua (100 ml) y a continuación se
liofilizó para dar 10,72 g de
Z-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 8),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,7 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 378,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl
(27,4 g, 110 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo
1, Boc-Met (Peptide Institute Inc.) (27,4 g, 110
mmoles) y HOBt (15,6 g, 115 mmoles) se disolvieron en DMF (200 ml).
A esta solución, se le añadió gota a gota WSCD (21,0 ml, 115 mmoles)
mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido de agitación
durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, se añadió a esto
acetato de etilo (500 ml), y el producto de reacción resultante se
lavó con agua, bicarbonato sódico acuoso saturado, agua, ácido
cítrico acuoso al 10% y agua en este orden, y se secó sobre sulfato
sódico anhidro. La destilación del acetato de etilo a presión
reducida produjo un material aceitoso incoloro. Este material se
secó a presión reducida para dar
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl
(12,9 g, 31,3 mmoles) se puso en suspensión en metanol al 50% (100
ml). Se añadió hidróxido sódico 1 N (47,0 ml, 47,0 mmoles) a ésta
bajo enfriamiento con hielo y se agitó durante 30 min a temperatura
ambiente. Se destiló el metanol a presión reducida. A continuación,
se añadió agua al residuo resultante, que se lavó a continuación
con éter dietílico dos veces. Se añadió a esto ácido clorhídrico 6
N para ajustar el pH a 1. A continuación la solución se extrajo dos
veces con acetato de etilo. Se combinó la capa orgánica y la mezcla
se lavó con ácido clorhídrico 1 N, agua y cloruro sódico acuoso
saturado en este orden, y a continuación se secó sobre sulfato
sódico anhidro. Después de concentración a presión reducida, se
lavó el residuo con hexano. Para eliminar los vestigios de
impurezas, se disolvió el residuo en 150 ml de metanol, y se añadió
a esto 5 g de carbón activo, seguido de filtración. Después de la
concentración a presión reducida, se disolvió el residuo en
acetonitrilo al 20% y se liofilizó para dar
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,1H_{2}O.
A
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,1H_{2}O
(5,96 g, 18,4 mmoles) en acetonitrilo al 10% (100 ml), se añadió
bicarbonato sódico (1,55 g, 18,4 mmoles) y se disolvió. Tras la
eliminación de vestigios de materia insoluble con un filtro de
membrana se liofilizó la solución para dar 6,28 g de
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 9),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,7 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 344,1 (M+Na).
A
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl
(17,6 g, 42,8 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo
9, se añadió HCl 4,5 N/dioxano (95 ml, 0,428 moles) bajo
enfriamiento con hielo, seguido de agitación durante 60 min a
temperatura ambiente. Se destiló el dioxano a presión reducida, y se
añadió éter dietílico al residuo para lavado. A continuación, se
descartó el sobrenadante y el material aceitoso resultante se
solidificó con hexano. Se filtró el sólido resultante, se lavó con
hexano y se disolvió en DMF (150 ml). Se añadieron gota a gota
trietilamina (9,00 ml, 62,3 mmoles) y anhídrido acético (4,4 ml,
46,8 moles) a la solución bajo enfriamiento con hielo, que se agitó
a continuación durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la adición
de acetato de etilo, el producto de reacción se lavó con agua y
cloruro sódico acuoso saturado en este orden, y se secó sobre
sulfato sódico anhidro. El disolvente se destiló a presión reducida
y se añadió éter dietílico al residuo durante el lavado. A
continuación, el residuo se filtró y se secó a presión reducida para
dar
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl.
A una suspensión de
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-OBzl
(9,64 g, 27,3 mmoles) en metanol al 50% (200 ml), se añadió
hidróxido sódico acuoso 1 N (40,9 ml, 40,9 mmoles) bajo enfriamiento
con hielo y se agitó durante 1,5 h a temperatura ambiente. Se
destiló el metanol a presión reducida. A continuación, se añadió
agua al residuo resultante, el cual se lavó a continuación con éter
dietílico dos veces. Se añadió ácido clorhídrico 6 N a la capa
acuosa para ajustar el pH a 1, seguido de extracción con cloroformo.
Sin embargo, no se obtuvo ningún extracto. A continuación, se
añadió bicarbonato sódico a la solución para ajustar el pH a 5, y la
solución se dejó toda la noche. Después del ajuste de pH a 2 con
TFA, se recogieron las fracciones principales por
RP-HPLC (MeCN
1-1-60% acuoso
(0-10-60 min)) y se liofilizaron
para dar
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-OH.
A
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-OH
(6,00 g, 22,8 mmoles) en acetonitrilo acuoso al 10% (100 ml), se le
añadió bicarbonato sódico (1,91 g, 22,8 mmoles) y se disolvió.
Después de la eliminación de los vestigios de materia insoluble con
un filtro de membrana, se liofilizó la solución. El material
aceitoso resultante se disolvió en agua (150 ml) y se liofilizó de
nuevo para dar 6,24 g de
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 10),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
180,7 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 286,1 (M+Na).
El
HCl\cdotH-(^{13}C-Ala)-OBzl
(20,8 g, 96,0 mmoles) obtenido de la misma manera que en el Ejemplo
1, Boc-Phe (Peptide Institute Inc.) (25,5 g, 96,0
mmoles) y HOBt (13,6 g, 101 mmoles) se disolvieron en DMF (200 ml).
A esta solución, se le añadió gota a gota WSCD (18,4 ml, 101 mmoles)
mientras se enfriaba con hielo y se agitaba, seguido de agitación
durante 3 h a temperatura ambiente. A continuación, se añadió a esto
acetato de etilo (500 ml), y el producto de reacción resultante se
lavó con agua, bicarbonato sódico acuoso saturado, agua, ácido
cítrico acuoso al 10% y agua en este orden, y se secó sobre sulfato
sódico anhidro. El acetato de etilo se destiló a presión reducida,
seguido de cristalización con hexano y filtración de los cristales.
Después de lavar con hexano, se secaron los cristales a presión
reducida para dar
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-OBzl.
Se disolvió
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-OBzl
(9,40 g, 22,0 mmoles) en ácido acético (100 ml), y paladio al
5%-carbono (2 g) se añadió a éste. Se insufló gas hidrógeno dentro
de ésta durante 120 min agitando a temperatura ambiente. El
catalizador se filtró, y se destiló el ácido acético. Se disolvió el
residuo en acetato de etilo, se lavó con cloruro sódico acuoso
saturado y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de
concentración a presión reducida, se lavó el residuo con hexano y
se filtró para dar
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,15
hexano\cdot0,24H_{2}O.
A
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-OH\cdot0,15
hexano\cdot0,24H_{2}O (7,35 g, 20,7 mmoles) en acetonitrilo al
50% (80 ml), se le añadió bicarbonato sódico (1,74 g, 20,7 mmoles)
y se disolvió. Tras la adición de agua (100 ml), se filtraron los
vestigios de materia insoluble con un filtro de membrana. A
continuación se liofilizó la solución para dar 7,10 g de
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa.
La confirmación de la estructura del compuesto
resultante y el análisis de la posición marcada con ^{13}C se
realizaron por ^{1}H-RMN (Fig. 11),
^{13}C-RMN y espectrometría de masas.
^{13}C-RMN (en D_{2}O):
181,7 ppm
Espectrometría de masas
(ESI-MS): 360,3 (M+Na).
Ratas en ayunas durante la noche (Wistar, macho,
de 8 semanas) en estado de vigilia se fijaron una a una en un
soporte de ratas de un aparato de irradiación de microondas. Se
recogió el aliento a un caudal de aproximadamente 100 a 300 ml/min
utilizando una bomba de emboladas (Variable Stroke Pump
VS-500; Shibata Kagaku Kogyo) y se mantuvo en ésta
la concentración de CO_{2} a aproximadamente 3%. Se instaló un
secador Perma Pure (MD-050-12P;
Perma Pure INC.) entre el soporte de ratas y la bomba de emboladas
para eliminar el vapor de agua del aliento. Cuando se estabilizó la
concentración de CO_{2}, la rata se soltó temporalmente del
soporte de ratas. Un dipéptido marcado con ^{13}C o una sal
sódica del mismo disuelto en agua destilada se administró al
estómago de la rata utilizando una sonda oral [dosis: 35
\mumoles/kg (5 ml/kg)]. Se tomaron muestras del aliento con una
jeringuilla cada 5 minutos hasta 20 min. Se transfirió una muestra
de 15 ml desde la jeringuilla a un vial con vacío (10 ml), se selló
y se sometió a análisis automático por GC-MS (Breath
MAT) (FinninganMAT). Se calculó \Delta^{13}C
(\textperthousand) de los valores \delta^{13}C que son los
valores ^{13}C de una muestra (es decir diferencias de la
sustancia patrón PDB) utilizando la fórmula siguiente.
\Delta^{13}C
(\textperthousand) = (\delta^{13}C) tmin - (\delta^{13}C)
0
min
- Aparato: Breath MAT plus (Finningan)
- Gas portador: He
- Iones medidos: m/z = 44, 45 y 46
Mientras que se utilizaron 19 dipéptidos
marcados con ^{13}C y sales de sodio de los dipéptidos marcados
con ^{13}C en la prueba de aliento,
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa
y
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa
se prepararon en los Ejemplos 1 a 7, respectivamente; se preparó
Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-ONa
por los métodos descritos en los Ejemplos 4 y 5 en la publicación
de patente japonesa no examinada nº 2000-053697;
Bz-Arg-(^{13}C-Ala),
Bz-Leu-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Asn-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Ile-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Trp-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Lys-(^{13}C-Ala),
Bz-His-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Gly-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Cys-(^{13}C-Ala)-ONa,
sal sódica de Bz-Glu-(^{13}C-Ala)
y la sal sódica de
Bz-Asp-(^{13}C-Ala) se prepararon
por los métodos basados en los descritos en los Ejemplos 4 y 5 en
la publicación de la patente japonesa no examinada nº
2000-053697.
Se realizaron pruebas de aliento con dipéptido
^{13}C utilizando dipéptidos que presentan una estructura de
Bz-aminoácido-(^{13}C-Ala) y sales
sódicas del mismo [dosis: 35 \mumoles/kg (5 ml/kg)] y se
compararon los valores pico en el transcurso del tiempo de los
valores \Delta^{13}C (\textperthousand) (denominado en
adelante "valor(es) pico ^{13}C
(\textperthousand)"). Como se muestra en la Tabla 1, los
valores pico \Delta^{13}C (\textperthousand) en las pruebas de
aliento con
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa
y
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa
eran mayores que el valor pico \Delta^{13}C (\textperthousand)
de
Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-ONa
que presentaron un valor mayor de \Delta^{13}C
(\textperthousand) en la prueba de aliento con péptido con
^{13}C que cualquier otro péptido descrito en la publicación de la
patente japonesa no examinada nº 2000-053697.
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(Tabla pasa a página
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Utilizando
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Z-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-ONa
o
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
[dosis: 35 \mumoles/kg (5 ml/kg)], se realizaron pruebas de
aliento con ^{13}C de la misma manera que en el Ejemplo 12. Los
valores pico \Delta^{13}C (\textperthousand) resultantes se
compararon con el valor pico \Delta^{13}C (\textperthousand)
en la prueba de aliento con
Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-ONa.
Como se muestra en la Tabla 2, los valores pico \Delta^{13}C
(\textperthousand) en las pruebas de aliento con
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Z-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-ONa
y
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
eran mayores que el valor pico \Delta^{13}C (\textperthousand)
en la prueba de aliento con
Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-ONa.
Se prepararon
Ac-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Z-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Boc-Met-(^{13}C-Ala)-ONa
y
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
en los Ejemplos 8 a 11, respectivamente. Se preparó el
Bz-Ala-(^{13}C-Ala)-ONa
por los métodos descritos en los Ejemplos 4 y 5 en la publicación
de la patente japonesa no examinada nº
2000-053697.
Se crearon ratas con pancreatitis crónica según
el método de Mundlos et al., Pancreas 1:29 (1986). Se inyectó
ácido oleico en el conducto pancreático de ratas macho Wistar de 5
semanas. Tras el apareamiento durante 3 semanas, se utilizaron en
pruebas de aliento con dipéptido con ^{13}C.
Como en el Ejemplo 12, se administró por vía
oral
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
[dosis: 12,6 mg/kg (35 \mumoles/kg)],
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa
[dosis: 12,0 mg/kg (35 \mumoles/kg)],
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa
[dosis: 11,0 mg/kg (35 \mumoles/
kg)], Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 13,2 mg/kg (35 \mumoles/kg)], Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 12,1 mg/kg (35 \mumoles/kg)], Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 10,6 mg/kg (35 \mumoles/kg)], Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 11,0 mg/kg (35 \mumoles/kg)] o Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 8,84 mg/kg (24,6 \mumoles/kg)] a ratas normales y ratas con pancreatitis crónica. A continuación se midió el grado de incremento de la concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2} exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)).
kg)], Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 13,2 mg/kg (35 \mumoles/kg)], Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 12,1 mg/kg (35 \mumoles/kg)], Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 10,6 mg/kg (35 \mumoles/kg)], Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 11,0 mg/kg (35 \mumoles/kg)] o Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa [dosis: 8,84 mg/kg (24,6 \mumoles/kg)] a ratas normales y ratas con pancreatitis crónica. A continuación se midió el grado de incremento de la concentración de ^{13}C a lo largo del tiempo en el CO_{2} exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)).
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Met-(^{13}C-
Ala)-ONa, Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa y Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa se prepararon en los Ejemplos 1 a 7, respectivamente; se preparó Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa en el Ejemplo 11.
Ala)-ONa, Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa y Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa se prepararon en los Ejemplos 1 a 7, respectivamente; se preparó Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa en el Ejemplo 11.
Los resultados de la prueba de aliento con
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 5 min después de la administración fue
4,17 \pm 3,95 en ratas con pancreatitis crónica, mientras que el
valor en ratas normales fue de 29,32 \pm 13,57; el valor fue muy
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis
crónica (p<0,001). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand)
a los 10 min después de la administración fue de 14,56 \pm 10,79
en las ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas
normales el valor fue de 55,62 \pm 6,62; el valor fue
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica
(p<0,0001). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los
15 min después de la administración fue de 22,80 \pm 12,36 en las
ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales
el valor fue de 45,44 \pm 3,44; el valor fue significativamente
más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,01).
(Véase la
Fig. 12).
Fig. 12).
Los resultados de la prueba de aliento con
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 5 min después de la administración fue
3,41 \pm 3,44 en ratas con pancreatitis crónica, mientras que el
valor en ratas normales fue de 13,86 \pm 4,98; el valor fue muy
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis
crónica (p<0,01). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand)
a los 10 min después de la administración fue de 15,32 \pm 13,04
en las ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas
normales el valor fue de 54,56 \pm 14,10; el valor fue
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica
(p<0,01). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los
15 min después de la administración fue de 28,06 \pm 19,01 en las
ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales
el valor fue de 51,27 \pm 3,21; el valor fue significativamente
más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,05).
(Véase la Fig. 13).
Los resultados de la prueba de aliento con
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 5 min después de la administración fue
2,21 \pm 2,74 en ratas con pancreatitis crónica, mientras que el
valor en ratas normales fue de 13,98 \pm 6,59; el valor fue muy
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis
crónica (p<0,01). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand)
a los 10 min después de la administración fue de 10,62 \pm 12,40
en las ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas
normales el valor fue de 35,22 \pm 8,02; el valor fue
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica
(p<0,01). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los
15 min después de la administración fue de 18,80 \pm 19,39 en las
ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales
el valor fue de 52,89 \pm 11,18; el valor fue significativamente
más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,01). El
valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los 20 min después de
la administración fue de 23,25 \pm 19,38 en las ratas con
pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales el valor
fue de 45,38 \pm 6,53; el valor fue significativamente más pequeño
en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,05). (Véase la Fig.
14).
Los resultados de la prueba de aliento con
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 5 min después de la administración fue
4,35 \pm 3,11 en ratas con pancreatitis crónica, mientras que el
valor en ratas normales fue de 10,33 \pm 6,34; el valor fue muy
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis
crónica (p<0,05). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand)
a los 10 min después de la administración fue de 15,65 \pm 7,93
en las ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas
normales el valor fue de 33,62 \pm 4,76; el valor fue
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica
(p<0,001). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los
15 min después de la administración fue de 24,68 \pm 9,48 en las
ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales
el valor fue de 52,64 \pm 11,32; el valor fue significativamente
más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,001). El
valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los 20 min después de
la administración fue de 29,55 \pm 9,98 en las ratas con
pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales el valor
fue de 45,61 \pm 5,27; el valor fue significativamente más pequeño
en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,01). (Véase la Fig.
15).
Los resultados de la prueba de aliento con
B\alpha-Met-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 5 min después de la administración fue
1,52 \pm 1,47 en ratas con pancreatitis crónica, mientras que el
valor en ratas normales fue de 19,76 \pm 10,16; el valor fue muy
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis
crónica (p<0,01). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand)
a los 10 min después de la administración fue de 7,69 \pm 5,15 en
las ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas
normales el valor fue de 48,88 \pm 17,45; el valor fue
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica
(p<0,001). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los
15 min después de la administración fue de 14,59 \pm 8,50 en las
ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales
el valor fue de 45,53 \pm 8,00; el valor fue significativamente
más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,0001). El
valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los 20 min después de
la administración fue de 20,25 \pm 9,43 en las ratas con
pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales el valor
fue de 38,58 \pm 3,79; el valor fue significativamente más pequeño
en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,001). (Véase la Fig.
16).
Los resultados de la prueba de aliento con
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 5 min después de la administración fue
1,07 \pm 1,43 en ratas con pancreatitis crónica, mientras que el
valor en ratas normales fue de 8,29 \pm 4,94; el valor fue muy
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis
crónica (p<0,05). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand)
a los 10 min después de la administración fue de 5,94 \pm 8,13 en
las ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas
normales el valor fue de 35,91 \pm 11,85; el valor fue
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica
(p<0,01). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los
15 min después de la administración fue de 10,34 \pm 11,99 en las
ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales
el valor fue de 47,48 \pm 12,89; el valor fue significativamente
más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,01). El
valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los 20 min después de
la administración fue de 12,80 \pm 11,97 en las ratas con
pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales el valor
fue de 43,04 \pm 5,30; el valor fue significativamente más pequeño
en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,001). (Véase la Fig.
17).
Los resultados de la prueba de aliento con
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 10 min después de la administración fue
de 12,67 \pm 19,74 en las ratas con pancreatitis crónica,
mientras que en las ratas normales el valor fue de 47,36 \pm
10,99; el valor fue significativamente más pequeño en las ratas con
pancreatitis crónica (p<0,05). El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 15 min después de la administración fue
de 19,78 \pm 24,70 en las ratas con pancreatitis crónica, mientras
que en las ratas normales el valor fue de 47,11 \pm 5,67; el
valor fue significativamente más pequeño en las ratas con
pancreatitis crónica (p<0,05). (Véase la Fig. 18).
Los resultados de la prueba de aliento con
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
fueron los siguientes. El valor \Delta^{13}C
(\textperthousand) a los 5 min después de la administración fue
0,74 \pm 0,54 en ratas con pancreatitis crónica, mientras que el
valor en ratas normales fue de 5,02 \pm 3,79; el valor fue muy
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis
crónica (p<0,05). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand)
a los 10 min después de la administración fue de 3,43 \pm 1,46 en
las ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas
normales el valor fue de 24,36 \pm 7,52; el valor fue
significativamente más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica
(p<0,001). El valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los
15 min después de la administración fue de 6,36 \pm 2,67 en las
ratas con pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales
el valor fue de 28,13 \pm 4,43; el valor fue significativamente
más pequeño en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,0001). El
valor \Delta^{13}C (\textperthousand) a los 20 min después de
la administración fue de 10,16 \pm 3,95 en las ratas con
pancreatitis crónica, mientras que en las ratas normales el valor
fue de 25,09 \pm 2,00; el valor fue significativamente más pequeño
en las ratas con pancreatitis crónica (p<0,0001). (Véase la Fig.
19).
Mediante una prueba de aliento con
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Gln-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Val-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Met-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Ser-(^{13}C-Ala)-ONa,
Bz-Thr-(^{13}C-Ala)-ONa
o
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa,
es posible detectar disminuciones de la función pancreática
exocrina.
Ejemplo de formulación
1
Se añadió agua purificada a 5 partes en peso de
Bz-Phe-(^{13}C-Ala)-ONa
hasta preparar un total de 100 partes en peso. Después de la
disolución, se esterilizó la solución con un filtro. El filtrado se
transfirió a viales y se selló para preparar una preparación
líquida interna.
Con el agente de diagnóstico para la función
pancreática exocrina de la invención, ha sido posible una prueba de
la función pancreática exocrina en la que la dosis de una prueba
puede reducirse en comparación con los péptidos con ^{13}C
utilizados en los métodos de ensayo convencionales, sin disminuir el
grado de incremento de la concentración de ^{13}C en el CO_{2}
exhalado (\Delta^{13}C (\textperthousand)).
El agente de diagnóstico para la función
pancreática exocrina de la invención puede utilizarse para pruebas
de detección de pancreatitis en exploraciones en masa o en personas
hospitalizadas para la exploración física completa. Además, el
agente de diagnóstico de la invención puede utilizarse también para
el criterio de la gravedad de la pancreatitis crónica, para el
pronóstico de empeoramiento de la hepatitis aguda que presenta
todavía una elevada mortalidad (30%), para el diagnóstico de los
factores etiológicos de la pancreatitis y para el diagnóstico
precoz del cáncer pancreático. El agente de diagnóstico de la
invención sirve también para realizar un diagnóstico que rechace la
pancreatitis en el examen médico de pacientes ambulatorios
generales.
Claims (9)
1. Dipéptido representado por la fórmula (II)
siguiente:
(II)X_{1}-R_{1}-Y_{1}
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo para su utilización en
diagnóstico,
en la que X_{1} es un grupo protector
seleccionado de entre el grupo constituido por benzoílo, acetilo,
benciloxicarbonilo y t-butiloxicarbonilo,
R_{1} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e
Y_{1} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que presenta opcionalmente un grupo protector, y en la que
cuando X_{1} es benzoílo el dipéptido es
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala).
2. Dipéptido o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo para su utilización en diagnóstico según la
reivindicación 1, en el que la utilización es como agente de
diagnóstico para el diagnóstico de la función pancreática
exocrina.
3. Dipéptido o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo para su utilización en diagnóstico según la
reivindicación 1 ó 2, en el que X_{1} se selecciona de entre el
grupo constituido por benzoílo, acetilo, benciloxicarbonilo y
t-butiloxicarbonilo.
4. Dipéptido o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo para su utilización en diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dipéptido se
selecciona de entre el grupo constituido por los compuestos
siguientes:
(a)
Ac-Met-(^{13}C-Ala),
(b)
Z-Met-(^{13}C-Ala),
(c)
Boc-Met-(^{13}C-Ala), y
(d)
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)
en los que Ac es acetilo, Z es
benciloxicarbonilo y Boc es t-butiloxicarbonilo.
5. Dipéptido o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo para su utilización en diagnóstico según la
reivindicación 1 ó 2, en el que el dipéptido es
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala).
6. Dipéptido o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo para su utilización en diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se utiliza en pruebas
de aliento.
7. Dipéptido representado por la fórmula (II)
siguiente:
(II)X_{2}-R_{2}-Y_{2}
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo,
en la que X_{2} es un grupo protector
seleccionado de entre el grupo constituido por acetilo,
benciloxicarbonilo y t-butiloxicarbonilo.
R_{2} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e
Y_{2} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que presenta opcionalmente un grupo protector.
8. Dipéptido o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo según la reivindicación 7, que se selecciona de
entre el grupo constituido por los compuestos siguientes:
(a)
Ac-Met-(^{13}C-Ala),
(b)
Z-Met-(^{13}C-Ala),
(c)
Boc-Met-(^{13}C-Ala), y
(d)
Boc-Phe-(^{13}C-Ala)
en los que Ac es acetilo, Z es
benciloxicarbonilo y Boc es t-butiloxicarbonilo.
9. Utilización de un dipéptido representado
por la fórmula (II) siguiente:
(II)X_{1}-R_{1}-Y_{1}
o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo para la preparación de un agente de diagnóstico
destinado al diagnóstico de la función pancreática
exocrina,
en la que X_{1} es un grupo protector
seleccionado de entre el grupo constituido por benzoílo, acetilo,
benciloxicarbonilo y t-butiloxicarbonilo,
R_{1} es un resto de fenilalanina, glutamina,
valina, tirosina, metionina, serina o treonina, e
Y_{1} es una molécula de alanina marcada con
^{13}C que presenta opcionalmente un grupo protector, y en la que
cuando X_{1} es benzoílo el dipéptido es
Bz-Tyr-(^{13}C-Ala).
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