ES2277332T3 - Angiotensina ii para mejorar la fertilizacion. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION HACE REFERENCIA AL USO DE ANGIOTENSINA II, O UN ANALOGO DE ESTA, PARA PROMOVER LA FERTILIZACION DE OVULOS DE MAMIFEROS. TAMBIEN SE HACE REFERENCIA A UN METODO PARA PROMOVER LA FERTILIZACION IN VITRO DE MAMIFEROS USANDO ANGIOTENSINA II.
Description
Angiotensina II para mejorar la
fertilización.
La presente invención se refiere al uso de
angiotensina II, o una sal o amida de la misma, para promover la
fertilización de óvulos de mamíferos, especialmente óvulos humanos.
En particular, se refiere al uso de angiotensina II para mejorar la
motilidad del esperma. La invención también se refiere a un
procedimiento para promover la fertilización in vitro.
La angiotensina II es un octapéptido, que se
considera que normalmente se produce en la sangre, en primer lugar
por acción de la renina, una enzima secretada por el riñón, sobre el
angiotensinógeno, dando como resultado la formación del decapéptido
precursor, angiotensina I, y en segundo lugar la acción de una
dipeptidasa "enzima conversora de angiotensina"; esta enzima
actúa sobre la angiotensina I para formar angiotensina II. La
angiotensina II, a su vez, experimenta hidrólisis por una
aminopeptidasa para producir el heptapéptido angiotensina III
(angiotensina 1 - 7).
La hormona angiotensina II (Ang II) forma parte
del sistema renina-angiotensina que ayuda a
controlar el equilibrio electrolítico y la presión sanguínea en el
cuerpo. Hay varios tejidos en el cuerpo sobre los que actúa la Ang
II, estos incluyen la glándula adrenal, útero, hígado, cerebro y
riñón.
Entre las diversas funciones establecidas de la
angiotensina II, se sabe que está implicada en la vasoconstricción,
lo que conduce a hipertensión. La mayoría de los tratamientos para
la presión sanguínea alta incluirán el bloqueo de la función de la
angiotensina de una u otra manera. La Ang II estimula también la
secreción de aldosterona por el córtex adrenal. La aldosterona es
una potente hormona que actúa principalmente sobre el riñón para
promover la retención de sodio y de este modo, entre otras cosas,
aumentar los efectos hipertensores de la angiotensina que actúa
directamente sobre la vasculatura.
Se sabe que la Ang II actúa sobre diversos
sitios del cerebro, y una de sus acciones en animales es la
regulación de la sed y la ingesta de líquidos.
La angiotensina tiene también efectos tróficos
sobre la vasculatura, promoviendo el crecimiento de los músculos en
la pared arterial. Se piensa que también es angiogénica, es decir
causa vascularización del tejido recién desarrollado.
Se ha descubierto que la mayoría de los efectos
establecidos de Ang II se producen mediante el subtipo AT1 del
receptor de Ang II, que es un receptor de siete dominios
transmembrana. Este receptor se ha clonado y secuenciado a partir de
diversos tejidos, y se ha descubierto que es un polipéptido de 359
aminoácidos con un peso molecular predicho de aproximadamente 40 kD
(Bernstein y Alexander, (1992), Endocr. Rev. 13,
381-386). Los estudios que usan marcado por
fotoafinidad y agentes de entrecruzamiento han sugerido pesos
moleculares para el receptor maduro de aproximadamente 65 kD y 116
kD, respectivamente, lo que puede reflejar la glucosilación de
restos de asparagina en el dominio extracelular.
A partir del reciente desarrollo de una línea
celular de hibridoma, véase Baker, S. y col, J. Mol. Endocr. 11,
241-245, (1993), se ha descubierto que es posible
producir anticuerpos monoclonales para el subtipo AT1 del receptor
de Ang II. Como consecuencia, se ha descubierto que dichos
receptores existen en las colas de esperma de rata y esperma humano
en desarrollo, y en esperma libre obtenido mediante lavado vaginal
de ratas que se aparearon, y en esperma humano eyaculado.
En el Journal of
Pharmacobio-Dynamics, Vol. 7, Nº. 2, febrero 1984,
p. 87-93, Kaneko y col informan de que la
angiotensina II aumenta la velocidad de avance del esperma de
donantes sanos. Sin embargo, Kaneko no descubrió aumento en el
porcentaje de motilidad a bajas concentraciones (0,1 - 10 ng/ml) de
angiotensina II, mientras que a concentraciones altas (1,0
\mug/ml) se suprimió la motilidad.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la angiotensina II, o una sal o amida de la
misma, aumenta el porcentaje de motilidad del esperma de pacientes
que asisten a clínicas de esterilidad.
Esta propiedad recién descubierta de la
angiotensina II permite usarla para promover la fertilización usando
esperma de machos que tienen esperma de motilidad reducida, puesto
que la capacidad del esperma para fertilizar óvulos está
estrechamente relacionada con el porcentaje de motilidad.
En un aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para promover la fertilización in vitro de
óvulo de mamífero, especialmente óvulos humanos, que comprende
añadir angiotensina II o una sal o amida de la misma a un medio de
incubación que contiene oocitos y esperma de un mamífero macho que
padece esterilidad.
En otro aspecto, esta invención proporciona un
procedimiento para mejorar el porcentaje de motilidad de esperma de
mamífero in vitro, comprendiendo el procedimiento:
- Poner en contacto esperma de mamífero, especialmente humano, de baja motilidad de un mamífero macho que padece esterilidad con angiotensina II o una sal de la misma.
En los dibujos adjuntos:
La Fig. 1(a) ilustra el porcentaje de
motilidad de esperma no estimulado después de 1 y 5 minutos.
La Fig. 1(b) ilustra el porcentaje de
motilidad de esperma estimulado con angiotensina II después de 1 y 5
minutos.
La Fig. 2 ilustra el efecto de
DuP-753 sobre el porcentaje de motilidad del
esperma.
La Fig. 3 ilustra el efecto de angiotensina II y
angiotensina II con un anticuerpo monoclonal para el receptor de AT1
sobre la velocidad del esperma, Fig. 3(a) y el porcentaje de
motilidad Fig. 3(b).
La Fig. 4 ilustra el efecto de angiotensina II y
DuP-753 sobre el porcentaje de motilidad después de
5 minutos.
Las Fig. 5(a) y 5(b) ilustran el
efecto de amida de angiotensina II sobre el porcentaje de motilidad
para dos muestras durante un periodo de 30 minutos.
La Fig. 6(a y b) ilustra el efecto sobre
la velocidad curvilínea (VCL) para las muestras de la Fig. 5.
La Fig. 7(a y b) ilustra el efecto sobre
la amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (DALC) para las
muestras de la Fig. 5.
La Fig. 8 ilustra los efectos de la angiotensina
II (símbolos macizos) sobre VCL y DALC en comparación con controles
sin estimular (símbolos huecos).
Los procedimientos convencionales para
fertilización in vitro se describen en "In vitro
fertilitation: a treatment for male infertility", Cohen, J.,
Edwards, R. y col, 1985, Fertility and Sterility, 44,
422-432. En general, las muestras de esperma se
lavan en medio de cultivo tisular MEM, se centrifugan a
aproximadamente 400 g, se resuspenden y se centrifugan de nuevo.
Después se resuspenden en varias gotas de MEM y se coloca una capa
de 0,5 ml de medio recién preparado encima. Después de 30 minutos en
la incubadora a 37ºC, el 30% superior del medio, que contiene
esencialmente esperma mótil, se retira y se distribuye a los oocitos
(aproximadamente 10.000 espermatozoides por oocito) en MEM y se deja
que se produzca la fertilización durante 24 horas.
Puede añadirse angiotensina II, o una sal o
amida de la misma, en las etapas de lavado o durante la incubación
final con el oocito. Cuando se añade al medio de incubación, la
angiotensina II, o una sal o amida de la misma, se añade
preferiblemente a una concentración de 1 nmol/l.
La invención se describirá adicionalmente en
referencia a los siguientes Ejemplos:
Se obtuvieron muestras de esperma humano de 12
voluntarios y pacientes que asistían a la clínica de fertilidad
asistida del Newham Hospital. Las muestras se suspendieron en medio
mínimo esencial (MEM) con sales de Earle y glutamina y se observaron
en una cámara Makler usando un microscopio invertido Olympus
equipado con una videocámara Olympus ARTF-2. Los
campos se grabaron en cinta de vídeo y se evaluó el porcentaje de
motilidad a 1 minuto y a los 5 minutos después de mezclar con MEM en
solitario (controles no estimulados) o con MEM que contenía 1
mol/litro de amida de angiotensina II.
El porcentaje de motilidad se estimó visionando
las cintas de video y congelando el fotograma para contar todos los
espermatozoides en un campo y después, en modo de avance, contando
los espermatozoides inmótiles, es decir, los que durante el periodo
de observación no se movieron hasta un cuadro adyacente (100
\mumetros) de la rejilla de la Cámara Makler. En la práctica, rara
vez fue necesario el uso estricto de esta definición puesto que los
espermatozoides eran completamente inmótiles o avanzaban
libremente.
A partir de la Figura 1(a) puede
observarse que no había diferencia significativa en el porcentaje de
motilidad después de 5 minutos en los controles sin estimular.
Dentro del grupo estimulado con angiotensina II, sin embargo, el
porcentaje de motilidad después de 5 minutos era significativamente
diferente del porcentaje de motilidad después de 1 minuto.
Se mezclaron una serie de seis muestras de
esperma, obtenidas de la misma fuente que en el Ejemplo 1, con MEM
sin modificar o MEM que contenía DuP-753 (1
nmol/1)
Se estimó el porcentaje de motilidad de la misma
manera que en el Ejemplo 1.
A partir de la Figura 2 es evidente que, en
presencia de DuP-753,
(2-n-butil-4-cloro-5-hidroximetil-1-[(2'-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il)metil]imidazol,
sal de potasio), el porcentaje de motilidad disminuyó de forma
significativa en relación con los controles no tratados.
Se obtuvieron muestras de esperma de la misma
fuente que en el Ejemplo 1. Se guardó una serie de muestras como
controles. A una segunda serie se le añadió amida de angiotensina II
(10 nmoles/l). Una tercera serie se trató con anticuerpo monoclonal
para el receptor de AT_{1} antes de añadir la angiotensina.
Se midió la velocidad cronometrando el avance
progresivo de los espermatozoides que atravesaban la rejilla en la
Cámara Makler y cronometrándolos manualmente.
A partir de la Figura 3(a) puede
observarse que la estimulación con angiotensina II estimulaba de
forma significativa la velocidad de avance progresivo en comparación
con los controles no tratados, mientras que la adición del
anticuerpo monoclonal inhibía la respuesta a angiotensina II.
A partir de la Figura 3(b) puede
observarse que se obtuvieron resultados similares para el efecto
sobre el porcentaje de esperma mótil.
Se obtuvieron muestras de esperma de la misma
fuente que en el Ejemplo 1. Se guardó una serie de muestras como
controles. Una segunda serie se expuso a angiotensina II (1
\mumol/l) durante 5 minutos. Una tercera serie se expuso a
angiotensina II (1 \mumol/l) durante 5 minutos y después se añadió
DuP-753 (1 \mumol/l).
El porcentaje de esperma mótil se midió usando
el mismo procedimiento que se usó en el Ejemplo 1.
A partir de la Figura 4 puede observarse que,
cuando se comparan con los controles, en la mayoría de las muestras
la angiotensina II potenció el porcentaje de espermatozoides que
eran mótiles después de 5 minutos. Este potenciamiento se redujo de
forma generalizada en muestras a las que se les añadió
DuP-753.
Se obtuvieron muestras de esperma de la misma
fuente que en el Ejemplo 1. Se guardó una serie de muestras como
controles. A una segunda serie se le añadió amida de angiotensina II
(1 nmol/l).
La motilidad del esperma se ensayó usando un
sistema informático que mide diferentes aspectos de la motilidad del
esperma, concretamente la velocidad curvilínea (VCL) y la amplitud
del desplazamiento lateral de la cabeza (DALC).
Las Figuras 5(a) y 5(b) muestran
el porcentaje de esperma mótil en cada una de las dos muestras,
durante un periodo de 30 minutos en presencia (barras sombreadas) y
ausencia (barras claras) de amida de angiotensina II (1nmol/l).
Las Figuras 6(a) y 6(b) muestran
el ensayo de VCL en las mismas muestras.
Las Figuras 7(a) y 7(b) muestran
el ensayo de DALC en las mismas muestras.
La Figura 8 compara VCL y DALC en muestras de
esperma de control (no estimuladas, símbolos huecos) y estimuladas
con angiotensina II (AII) (símbolos macizos).
A partir de las figuras está claro que la amida
de angiotensina II estimula VCL y DALC, dos parámetros que están
asociados con un aumento en la fertilidad.
Claims (8)
1. Un procedimiento para promover la
fertilización in vitro de óvulos de mamífero que comprende
añadir angiotensina II o una sal o amida de la misma a un medio de
incubación que contiene oocitos y esperma de baja motilidad de un
mamífero macho que padece esterilidad.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la angiotensina II o sal o amida de la
misma se añade a una concentración de aproximadamente 1
nmol/litro.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que se usa amida de angiotensina II para
promover la fertilización.
4. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el mamífero es
un ser humano.
5. Un procedimiento para mejorar el porcentaje
de motilidad de esperma de mamífero in vitro, comprendiendo
el procedimiento:
- poner en contacto esperma de mamífero de baja motilidad de un mamífero macho que padece esterilidad con angiotensina II o una sal de la misma.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la angiotensina II o sal o amida de la
misma se añade a una concentración de aproximadamente 1
nmol/litro.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que se usa amida de angiotensina II para
mejorar la motilidad.
8. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el mamífero es
un ser humano.
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