ES2277358T3

ES2277358T3 - Purificacion de celulas t especificas de antigeno.

Info

Publication number: ES2277358T3
Application number: ES97936461T
Authority: ES
Inventors: Alain T. Luxembourg; Michael R. Jackson; Per A. Peterson
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2017-08-12
Also published as: EP0937251B1; AU3912497A; US20060134125A1; JP4117031B2; US7125964B2; AU727541B2; PT937251E; CA2264925A1; JP2001504323A; WO1998010284A1; CA2264925C; US20040137617A1; ATE347103T1; EP0937251A4; DE69737028T2; DK0937251T3; DE69737028D1; EP0937251A1

Abstract

NUEVO PROCEDIMIENTO PARA CAPTURAR, PURIFICAR Y DESARROLLAR CELULAS T ESPECIFICAS DEL ANTIGENO DESARROLLADO MEDIANTE LA UTILIZACION DE BOLITAS MAGNETICAS RECUBIERTAS DE MOLECULAS CMH RECOMBINADAS DE CLASE I. PARA OPTIMIZAR EL PROCEDIMIENTO, SE HA UTILIZADO POBLACIONES HOMOGENEAS DE CELULAS T CANDIDAS, PURIFICADAS U OBTENIDAS DE RATONES TRANSGENICOS PARA EL RECEPTOR DE CELULAS T 2C (TCR). ESTAS CELULAS T HAN SIDO CAPTURADAS SOBRE LAS BOLITAS RECUBIERTAS DE MOLECULAS CMH DE CLASE I Y PEPTIDOS ANTIGENOS PERTINENTES. LA ESPECIFICIDAD DE LAS MOLECULAS CMH Y DE LOS PEPTIDOS HA SIDO CONFIRMADA UTILIZANDO COMBINACIONES INOPERANTES DE MOLECULAS CMH Y DE PEPTIDOS. SE HA MEDIDO UNA MEJORA DE 800 A 1.600 VECES SUPERIORES UTILIZANDO CELULAS T 2C MEZCLADAS CON CELULAS T INOPERANTES, COMENZANDO CON UNA FRECUENCIA DE CELULAS T 2C DE 1/3000. EL MISMO PLANTEAMIENTO HA SIDO ADOPTADO PARA PURIFICAR CELULAS T CD8 + ESPECIFICAS DEL AN TIGENO A PARTIR DE CELULAS T CD8'' TOTALES OBTENIDAS DE LOS RATONES CANDIDOS. LAS CELULAS RECUPERADAS PODRIAN SER DESARROLLADAS PARA MATAR ESPECIFICAMENTE CELULAS OBJETIVO IN VITRO, LAS CUALES HAN TENIDO IGUALMENTE EFECTO NO DESPRECIABLE E IN VIVO. ESTE PROCEDIMIENTO ES UTILIZADO PARA PURIFICAR Y DESARROLLAR IN VITRO CELULAS T MATADORAS DE TUMORES ESPECIFICOS Y DE VIRUS ESPECIFICOS PUDIENDO SER UTILIZADAS ESTAS CELULAS EN CITOTERAPIA.

Description

Purificación de células T específicas de antígeno.

Campo de la invención

Esta invención está dirigida a un procedimiento para derivar líneas de células T específicas de antígeno a partir de una población heterogénea de linfocitos, incluyendo poblaciones totales de linfocitos T de individuos no expuestos. Este procedimiento está basado en una etapa de enriquecimiento para linfocitos específicos de antígeno por medio de la captura de los linfocitos T específicos de antígeno en un sustrato recubierto con complejos péptido antigénico-CMH que sirven como ligandos para receptores antigénicos específicos de células T, seguido por una etapa de expansión usando superficies recubiertas con complejos péptido antigénico-CMH.

Antecedentes de la invención

Las respuestas inmunes específicas de antígeno están mediadas por linfocitos B y T efectores específicos de antígeno. Estas células se originan a partir de células precursoras latentes generalmente de baja frecuencia expresando receptores para diversos antígenos que representan el repertorio total y que, tras encontrarse con antígenos específicos y una coestimulación adecuada, se activan, expanden y diferencian en células efectoras.

El desarrollo de inmunoterapia ex vivo para afecciones tales como cáncer o infecciones virales está limitado por la baja frecuencia de linfocitos precursores específicos de antígeno. Por ejemplo, las frecuencias en tejidos linfoides periféricos de ratón de los precursores de CTL específicas de virus (CTLp) son generalmente menores que 1/100.000 -
1/1.000.000 (Lau y col., 1994; Hou y col., 1994). El aislamiento de linfocitos específicos de antígenos por medio de captura en un soporte recubierto de antígenos ha sido descrito para células B latentes de bazo de ratón específicas para TNP (Snow y col, 1983a). El procedimiento de aislamiento incluye una etapa de formación de rosetas en glóbulos rojos de caballo con hapteno y permite la recuperación de células B específicas de hapteno con una pureza del 40%. Esta técnica fue útil para estudiar los requerimientos de activación (Stein y col., 1986) así como los acontecimientos iniciales de señal que siguen a la activación (Snow y col., 1986; Myers y col, 1987; Grupp y col., 1987; Noelle y Snow, 1990; Gold y DeFranco, 1994). Sin embargo, ésta fue una situación muy favorable debido a la relativamente alta frecuencia de células B específicas para TNP (aproximadamente 1%) (Snow y col., 1983a). No se ha informado hasta la fecha de ningún otro estudio de activación de células B usando células B latentes específicas para otro antígeno con frecuencia baja de precursores (Radbruch y Recktenwald, 1995). La baja frecuencia de precursores es también un problema con las células T. Además, mientras que las células B reconocen directamente al antígeno, las células T reconocen una estructura compleja formada por la combinación de un péptido antigénico unido a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). La interacción TCR/CMH-péptido tiene una afinidad baja a moderada (intervalo 10^{-4}-10^{-7} M: Matsui y col., 1991; Weber y col., 1992; Sykulev y col., 1994a; Corr y col., 1994; Sykulev y col., 1994b). Los anticuerpos usualmente exhiben afinidades superiores de varios órdenes de magnitud y aprovechan la multivalencia. Actualmente están disponibles técnicas nuevas de aislamiento de poblaciones celulares raras. Éstas están basadas en la clasificación celular y/o separación magnética (Bellone y col., 1995; Radbruch y Recktenwald, 1995). También, se encuentran actualmente disponibles ligandos recombinantes para TCR combinando moléculas del CMH vacías recombinantes (Jackson y col., 1992) y péptidos antigénicos de unión al CMH (Engelhard, 1994; Ramensee y col., 1995). Estos complejos sintéticos CMH-péptido pueden inmovilizarse en perlas para dar ligandos multivalentes para el TCR. Teóricamente, la multivalencia ayudaría a solucionar la baja afinidad. Se ha visto previamente que la interacción entre TCR y el complejo péptido-CMH inmovilizado lleva al establecimiento de interacciones estables en ciertos sistemas in vitro. En primer lugar, los antígenos del CMH clase I inmovilizados en monocapas lipídicas (Nakanashi y col., 1983) o en perlas del tamaño de células recubiertas con lípidos (Kane y col., 1988) son suficientes para causar la unión de células T citotóxicas alogénicas clonadas (CTL). En segundo lugar, las CTL singénicas clonadas se unen a perlas recubiertas con CMH en una manera dependiente de péptidos (Kane y Mescher, 1993; Mescher, 1995). En tercer lugar, una CTL singénica clonada puede formar agregados con células RMA-S, una línea celular que expresa grandes cantidades de moléculas CMH vacías, en una manera específica de péptido (De Bruijn y col., 1992). En dos de estos informes, las interacciones TCR-CMH-péptido no fueron los mediadores primarios de adhesión. Éstos jugaron un papel más bien inicial en los acontecimientos tempranos de agregación, presumiblemente transduciendo señales que llevaron a la activación de la adhesión a través de moléculas accesorias. En este documento, se describe un procedimiento para aislar células T específicas de antígeno usando moléculas del CMH clase I vacías purificadas de células de Drosophila melanogaster (Jackson y col., 1992) inmovilizadas en perlas magnéticas y cargadas con péptido. Este sustrato artificial para células T está recubierto con una alta densidad de complejos idénticos CMH-péptido. El aislamiento de células T se optimizó usando poblaciones de células T no expuestas purificadas de ratones transgénicos para el 2C TCR (Sha y col., 1988). Se han identificado ligandos de diversas afinidades y especialidades para el 2C TCR (Sykulev y col., 1994a, b). Pudieron adsorberse las células T 2C sobre perlas con complejos péptido-CMH con una afinidad para 2C TCR tan baja como 10-4 M. La adsorción estuvo restringida a CMH y específica de péptido ya que se produjo sólo con las combinaciones adecuadas CMH-péptido reconocidas por 2C TCR. Además, pudieron recuperarse células T 2C mezcladas con células T irrelevantes a partir animales no expuestos usando este procedimiento de adsorción. Esta técnica se usó exitosamente para recuperar células T específicas de antígeno de animales no expuestos.

El documento CA-A-2.069.541 describe la inducción una respuesta de linfocitos T específica de antígeno en un cultivo de linfocitos T. La inducción de la respuesta se logra cargando vehículos presentadores de antígeno que llevan moléculas del CMH con un péptido de unión de CMH inmunogénico de células T derivado de antígeno.

A. Stryhn y col., (1994) Eur. J. Immunol. 24:1404-1409 describen el panel de hibridomas de células T de CMH clase I específicos de antígeno que se usaron para examinar la capacidad de los complejos péptido-antígeno clase I de estimular células T.

K.P. Kane y col., (1993) J. Immunol. 150:4788-4797 describen la activación de adhesión y desgranulación de linfocitos T citotóxicos dependientes de CDH por complejos péptido-antígeno clase I. La activación de CTL requiere la unión de TCR y del correceptor de CD8.

El documento WO 96/05287 describe un procedimiento para el aislamiento de células T a partir de sangre periférica usando complejos de antígenos del CMH.

El documento EP 0814838, que es una técnica anterior para los objetivos de lograr sólo procedimientos nuevos, describe un sistema presentador de antígenos y un procedimiento para activar células T. Una forma de realización de la invención es la matriz que contiene proteínas sintéticas presentadoras de antígenos. La matriz puede usarse para activar células T CD8^{+} para convertirlas en citotóxicas.

Resumen de la invención

La presente invención provee un procedimiento para el aislamiento y expansión en cultivo de linfocitos T específicos de antígeno a partir de una población heterogénea de linfocitos. La presente invención también provee un procedimiento para preparar una población de linfocitos T específicos de antígeno de un paciente para el tratamiento de la enfermedad o afección del paciente. Esta invención provee una matriz que contiene péptidos Clase I vacíos que son funcionales porque los péptidos Clase I vacíos pueden aceptar y unir una diversidad de antígenos. Pueden prepararse estas matrices de manera que contengan cantidades específicas predeterminadas de uno o más antígenos. Tales matrices son útiles para una diversidad de objetivos incluyendo, pero no limitándose al uso en los procedimientos de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1, Paneles A, B, D y D: Análisis de unión de L^{d} biotinilada a perlas magnéticas recubiertas con avidina usando citofluorometría de flujo.

El Panel A muestra una curva de dosis-respuesta de los valores medios de fluorescencia de perlas incubadas con cantidades crecientes de L^{d}, posteriormente teñidas con anticuerpo anti-L^{d} marcado con fluoresceína 30.5.7. El Panel B muestra histogramas de fluorescencia verde (FL1) de perlas magnéticas recubiertas con avidina no marcadas. El Panel C muestra histogramas de fluorescencia verde (FL1) de perlas magnéticas recubiertas con avidina tras la incubación con 3 \mug de perlas con L^{d}/10^{6} biotiniladas; la tinción se realizó usando anticuerpos anti-L^{d} marcados con fluoresceína 30.5.7. El Panel D muestra histogramas de fluorescencia verde (FL1) de perlas magnéticas recubiertas con avidina tras la incubación con 3 \mug de perlas con L^{d}/10^{6} no biotiniladas; la tinción se realizó usando anticuerpos anti-L^{d} marcados con fluoresceína 30.5.7.

Figura 2, Paneles A, B, C, D, E y F: Evaluación de la formación de complejos perlas con L^{d}-células T 2C en presencia de péptidos antigénicos usando gráficos de puntos de fluorescencia verde (FL1) frente a fluorescencia roja (FL2). Las células se tiñeron de verde con fluoresceína; las perlas se tiñeron de rojo con ficoeritrina. Las perlas magnéticas son autofluorescentes; se estableció la compensación de manera que las perlas teñidas con ficoeritrina exhibieran la misma intensidad de fluorescencia verde que las perlas sin teñir. El Panel A muestra perlas solas. El Panel B muestra células T 2C solas. El Panel C muestra perlas recubiertas con L^{d} y células T 2C incubadas en presencia de QL9. El panel D muestra perlas recubiertas con L^{d} y células T 2C incubadas en presencia de p2Ca. El Panel E muestra perlas recubiertas con L^{d} y células T 2C incubadas en presencia de SL9. El Panel F muestra perlas recubiertas con L^{d} y células T 2C incubadas en presencia de péptido LCMV.

Figura 3, Paneles A, B, C, D, E, F, G y H: Evaluación de la formación de complejos perlas recubiertas con CMH-células T 2C en presencia de péptidos antigénicos usando gráficos de puntos de dispersión lateral (SSC) frente adispersión frontal (FSC). El Panel A muestra los límites de las regiones que contienen células, perlas y complejos perlas-células. El Panel B muestra perlas solas. El Panel C muestra células T 2C solas. El Panel D muestra perlas recubiertas con L^{d} y células T 2C incubadas en presencia de QL9. EL panel E muestra perlas recubiertas con L^{d} y células T 2C incubadas en presencia de p2Ca. El Panel F muestra perlas recubiertas con L^{d} y células T 2C incubadas en presencia de péptido LCMV. El Panel G muestra perlas recubiertas con K^{bm3} y células T 2C incubadas en presencia de dEV-8. El Panel H muestra perlas recubiertas con K^{bm3} y células T 2C incubadas en presencia de
E1.

Figura 4, Paneles A, B y C: Efecto de diversos parámetros en la adsorción de células T 2C sobre perlas magnéticas recubiertas con CMH. El Panel A muestra la dependencia del tiempo: se mezclaron células T 2C purificadas con perlas recubiertas con CMH y péptido y se incubaron a temperatura ambiente durante diversos intervalos de tiempo; posteriormente se cuantificó la unión de las células por citofluorometría de flujo. El Panel B muestra la dependencia de la temperatura: se mezclaron células T 2C purificadas con perlas recubiertas con CMH y se incubaron a diversas temperaturas y durante diversos intervalos de tiempo; posteriormente se cuantificó la unión de las células por citofluorometría de flujo. El Panel C muestra la dependencia de CD8: se mezclaron células T 2C purificadas o células T 2C CD8^{+} purificadas con perlas recubiertas con CMH y péptido y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas; posteriormente se cuantificó la unión de las células por citofluorometría de flujo.

Figura 5 Paneles A, B, C, D y E: enriquecimiento en células 2C T usando captura en perlas magnéticas recubiertas con K^{bm3}, comenzando con una mezcla de células T 2C y células T CD8^{+} en una proporción 1:3000. El Panel A muestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células T 2C purificadas marcadas con fluoresceína. El Panel B muestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células T CD8^{+} purificadas de ratón C57BL/6. El Panel C muestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células T 2C purificadas marcadas con fluoresceína mezcladas con células T CD8^{+} de ratón C57BL/6 en una proporción 1:3000. El Panel D muestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células eluidas tras la incubación con perlas magnéticas recubiertas con K^{bm3} en presencia de dEV-8. El Panel E muestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células eluidas tras incubación con perlas magnéticas recubiertas con K^{bm3} en presencia de E1.

Figura 6: Actividad funcional in vitro de CTL derivadas de ratón no expuestos C57BL/6 usando adsorción sobre perlas magnéticas recubiertas con K^{b}-OVA-8 o K^{b}-VSV-8. Se probaron las células T cultivadas para evaluar citotoxicidad por el ensayo de liberación de cromo como se indica en el Ejemplo 4. Se usaron como diana células EL4. Los péptidos se usaron en una concentración final de 1 \muM.

Figura 7: Actividad funcional in vitro de CTL derivadas de ratón no expuestos BALB/c usando adsorción sobre perlas magnéticas recubiertas con L^{d}-LCMV. Se probaron in vitro las células T cultivadas para evaluar citotoxicidad por el ensayo de liberación de cromo como se indica en el Ejemplo 4. Se usaron como diana, RMA-S con expresión de L^{d} (panel A), CL-7 de BALB/c (panel B), MC57 (panel C) o YAC-1 (panel D). Los péptidos se usaron en una concentración final de 1 \muM.

Figura 8: Actividad funcional in vitro de CTL derivadas de ratón no expuesto BALB/c usando adsorción sobre perlas magnéticas recubiertas con L^{d}-LCMV. Se ensayó la actividad in vivo en ratones con infección aguda con LCMV como se indica en el Ejemplo 4. Se inyectaron ratones BALB/c infectados con LCMV con 10^{7} CTL anti-LCMV NP 118-126 en el día 1, mientras 4 ratones BALB/c recibieron sólo PBS. Se usaron como control ratones C57BL/6-LCMV inyectados con 10^{7} CTL anti-LCMV NP 118-126 o PBS.

Descripción detallada de la invención

La presente invención provee un procedimiento nuevo para derivar in vitro líneas de células T específicas de antígeno a partir de poblaciones de células mixtas, incluyendo células T totales de individuos no expuestos. Derivar in vitro líneas de células T a partir de poblaciones de células T no expuestos tiene varios tipos de problemas: primero, las frecuencias de los precursores son típicamente muy bajas, frecuentemente menores que 10^{-5}; segundo, las células T no expuestas tienen requerimientos especiales para su activación, necesitando generalmente estímulos más fuertes que las células T previamente activadas.

El procedimiento de la presente invención comprende dos etapas: una etapa de aislamiento para enriquecer la preparación celular en células T específicas de antígeno y una etapa de expansión in vitro para derivar líneas celulares específicas de antígeno a partir de la preparación celular enriquecida. Resulta fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica que estas etapas pueden repetirse, como se necesite. La etapa de aislamiento de células T específicas de antígeno usa sustratos recubiertos con CMH, que tras la incubación con péptido antigénico y células T, permiten el aislamiento de células T específicas para el complejo péptido antigénico-CMH. Resultará fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica que son adecuadas para uso en el procedimiento de la presente invención una gran diversidad de moléculas del CMH, incluyendo, pero no limitado a proteínas del CMH clásicas y no clásicas de cualquier mamífero o especie aviar, resultando de preferencia las proteínas HLA humanas y las proteínas H-2 murinas. También será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que las moléculas del CMH de una diversidad de fuentes son adecuadas para uso en la presente invención, incluyendo, pero no limitado a CMH derivado de fuentes que se presentan en la naturaleza y fuentes recombinantes tales como proteínas del CMH expresadas en bacterias, células de insectos o células de mamíferos, siendo las células de insecto las de preferencia. Además, será fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica que son adecuados para uso en la presente invención una gran diversidad de sustratos recubiertos de CMH, incluyendo, pero no limitado a perlas de vidrio, perlas de látex y perlas magnéticas, siendo las perlas magnéticas las de preferencia. Finalmente, resultará fácilmente evidente para los expertos en la técnica que podrían usarse una diversidad de procedimientos para unir moléculas del CMH en sustratos para uso en el procedimiento de la presente invención, incluyendo, pero no limitado a adsorción pasiva, uso de entrecruzadores, biotinilado de moléculas del CMH para adsorción sobre sustrato recubierto con avidina, introducción de un sitio de reconocimiento por ingeniería genética de moléculas del CMH o uso de un sitio natural de reconocimiento para la adsorción sobre un sustrato recubierto con anticuerpos, siendo el reconocimiento con anticuerpos y avidina-biotina los de preferencia.

Para establecer el procedimiento, se usó una combinación de varios recursos: primero, se usaron moléculas recombinantes del CMH vacías producidas en células de Drosophila melanogaster (Jackson y col., 1992), que permiten el uso de proteína de CMH cargada de manera homogénea con el mismo péptido; secundo, se usaron células T no expuestas purificadas de nódulos linfáticos de ratones transgénicos para 2C TCR (Sha y col., 1988), estas células expresan de manera homogénea el mismo TCR al mismo nivel. Esto permitió el análisis a un único nivel celular. También se usaron varios complejos péptido-CMH diferentes cuyas afinidades para 2C TCR se ha determinado recientemente (Sykulev y col., 1994a, b). Esto permitió investigar el procedimiento usando complejos con diversas afinidades. Las moléculas del CMH clase I que se incluyeron fueron L^{d}, K^{b} and K^{bm3}. Dado que el clon de células T citotóxicas 2C derivó de ratones BALB.B (H-2^{b}) (Sha y col, 1988), L^{d} y K^{bm3} son elementos de restricción alogénicos para 2C TCR mientras que K^{b} es singénico. Se usaron L^{d}, K^{b} y K^{bm3} biotiniladas inmovilizadas en perlas magnéticas recubiertas con avidina. Se adsorbieron células 2C T sobre tales perlas en presencia de varios péptidos antigénicos. Se observó la adsorción en presencia de complejos péptido-CMH con una afinidad para 2C TCR en un intervalo de 10^{-4} a 10^{-7} M, usando L^{d}, K^{bm3} o K^{b} como elemento de restricción. Finalmente la adsorción fue específica, dado que los péptidos control no causaron interacción entre la perlas recubiertas con CMH y las células T 2C. Además se estudiaron las características de adsorción de células T sobre perlas recubiertas con CMH: la adsorción fue dependiente del tiempo, alcanzando una meseta entre 1 y 4 horas cuando se realizó a temperatura ambiente. La adsorción comenzó a disminuir cerca después de ese tiempo, lo que podría reflejar el inicio de un proceso de desadhesión. La adsorción también fue dependiente de la temperatura: fue ligeramente más baja a 37ºC que a temperatura ambiente para 3 de los complejos péptido-CMH examinados, y fue dramáticamente más baja que a temperatura ambiente para otro complejo. Esto es debido a la disminución de estabilidad de las moléculas del CMH a temperaturas más altas. La adsorción a 4ºC fue mucho más baja que a temperatura ambiente lo que probablemente fue una consecuencia de los cambios en la fluidez de la membrana celular a bajas temperaturas, que reduce las asociaciones moleculares. Además, algunos acontecimientos de señales, que se producen sólo a temperatura más elevada, podrían contribuir a la adsorción, como puede notarse en un informe previo acerca del papel de CD8 en la adhesión inducida por la interacción antígeno-TCR (Kane and Mescher, 1993). Resulta interesante destacar que la dependencia de CD8 de la formación de complejos célula-perla varió de acuerdo con el antígeno usado. Entre los péptidos probados, los más dependientes de CD8 fueron p2Ca y dEV-8, que se aislaron como péptidos que se presentan naturalmente en la superficie de células presentadoras de antígenos; QL9 y STYR, que no se han encontrado en la superficie celular, fueron independientes de CD8. En cualquier caso, la dependencia de CD8 de la captura de células T sobre perlas recubiertas con CMH no tuvo correlación completa con la afinidad TCR-ligando. Finalmente, la captura no tuvo correlación completa con la afinidad TCR-ligando, ya que se observó constantemente una captura con K^{bm3}-dEV-8 (1,8 x 10^{4} M^{-1}), K^{6}-SIYR (3,1 x 10^{4} M^{-1}) o K^{bm3}-SIYR (3,4 x 10^{4} M^{-1}), pero no con L^{d}-p2Ca-A3 (2 x 10^{4} M^{-1}) o K^{b}-dEV8 (1,2 x 10^{4} M^{-1}). Se observó captura o no se observó captura con L^{d}-SL9 (1,4 x 10^{4} M^{-1}), de acuerdo con lotes de L^{d}. Esto es coherente con la predicción de que conociendo la afinidad de un único TCR para un complejo péptido-CMH dado probablemente no es suficiente para realizar predicciones acerca de interacciones a nivel celular total (Agrawal y Linderman, 1996). Se anticipa que las perlas recubiertas con CMH serán útiles como sondas para estudiar las reglas de reconocimiento de antígenos por las células T.

Para investigar la conveniencia de esta técnica para recuperar una población con baja frecuencia de precursores de CTL específicas de antígeno, se intentó recuperar células T 2C mezcladas con células T irrelevantes de un animal no expuestos. Se demostró que el procedimiento de la presente invención permitió la purificación de células T específicas de antígeno aproximadamente 800 a 1600 veces en una etapa de purificación, comenzando a partir de una frecuencia de células T 2C tan baja como 0,03%. La recuperación celular fue de aproximadamente 50% cuando se usaron complejos péptido-CMH de baja afinidad para 2C TCR tales como K^{bm3}-dEV-8 y K^{b}-SIYR, y alcanzó una recuperación de 90-100% con el complejo de alta afinidad L^{d}-QL9. La pureza final de células T 2C fue de 47,6 \pm 2,1% al usar K^{b}, el elemento de restricción singénico para 2C TCR, y 24,8 \pm 6,9% al usar L^{d}, un elemento de restricción alogénico. Esto sugiere que esta diferencia podría explicarse por células T alogénicas anti-L^{d} capturadas usando perlas recubiertas con L^{d}. Esto podría significar que algunas de las células diferentes a las células 2C eluidas de las perlas fueron capturadas específicamente. Considerados conjuntamente, estos resultados mostraron que este procedimiento fue conveniente para purificar precursores de células T con baja frecuencia a partir de un animal no expuestos, incluyendo células cuyos TCR podrían tener baja afinidad por un complejo CMH-péptido.

Se demostró también que el procedimiento de aislamiento de la presente invención, cuando se usó en combinación con una etapa nueva de expansión de células T in vitro, fue útil para el enriquecimiento de precursores de CTL a partir de ratones no expuestos. La etapa de expansión celular se basó en el cultivo de células aisladas en placas de cultivo tisular recubiertas con complejos CMH-péptido y anticuerpo anti-CD28. Resultará fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica que otras moléculas coestimulantes son adecuadas para uso en el procedimiento de la presente invención, incluyendo, pero no limitando a, anticuerpo anti-CD28, otros ligandos de CD28 tales como B7-1 y B7-2, o ligandos o anticuerpos para otras moléculas coestimulantes de células T tales como integrinas y otras moléculas de adhesión celular, o citoquinas tales como interleuquina 2 o interleuquina 4, o cualquier combinación de las mismas. Es digno de mención que otros protocolos de expansión clásicos, incluyendo la estimulación con concanavalina A o con anticuerpos anti-TCR, no permitirían derivar CTL específicas de antígeno a partir de poblaciones de linfocitos no expuestos. Probablemente esto es porque las células no son 100% puras tras el aislamiento y por ello necesitan algún estímulo específico para poder recuperarlas. Además, es necesaria una alta densidad de ligandos homogéneos para activar células T no cebadas, lo que es provisto por un procedimiento de la presente invención, así como usando células de insecto que expresan CMH como células presentadoras de antígenos (Cai y col., 1996), pero no usando células presentadoras de antígenos clásicas que presentan un población heterogénea de antígenos en su superficie. Además, este sistema de expansión totalmente sintético de la presente invención no requiere el uso de células presentadoras de antígenos exógenas, lo que elimina complicaciones potenciales tales como contaminación y cebado cruzado. Es interesante destacar que no fue necesario separar las células de las perlas magnéticas recubiertas con CMH usadas para el aislamiento previamente a la expansión, lo que reduce el tiempo de manipulación. Sin embargo, los linfocitos T específicos de antígeno pueden eluirse o eliminarse del sustrato para cultivo o para otros objetivos, si se desea. Pueden eluirse los linfocitos T usando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como la incubación prolongada y/o el agregado de un anticuerpo anti-CMH. Usando este procedimiento, CTL específicas de virus LCM podrían derivarse de ratones BALB/c no infectados usando perlas magnéticas recubiertas con L^{d} y LCMV-péptido de nucleoproteína. El enriquecimiento se produjo ciertamente ya que al menos una célula entre las 10^{4} células recuperadas fue específica de antígeno en comparación con una frecuencia del precursor de menos de 10^{-5} en un animal no expuestos. (Oehen y col 1992, Lau y col, 1994). Además, las células T CD8^{+} totales no separadas del mismo animal cultivadas en las mismas condiciones de cultivo no dieron actividad específica de CTL. Finalmente, la actividad específica de CTL se midió tras sólo una reestimulación, lo que indica claramente una alta frecuencia de precursores específicos de células T tras el procedimiento de enriquecimiento. También se usó el procedimiento de enriquecimiento de la presente invención para recuperar CTL específica de OVA-8 así como CTL específica de VSV-8 de ratones C57BL/6. El enriquecimiento fue específico ya que no pudieron cultivarse CTL específicas de VSV-8 a partir de células capturadas usando perlas recubiertas con K^{b}-OVA-8, y no pudieron cultivarse CTL específicas de OVA-8 a partir de células capturadas usando perlas recubiertas con K^{b}-VSV-8. La frecuencia de precursores de CTL de CTL específica de OVA-8 en la población enriquecida tras la captura en perlas recubiertas con K^{b}-OVA-8 fue de aproximadamente 1/3.500. El enriquecimiento se produjo ciertamente ya que la frecuencia de precursores para CTL anti-OVA-8 en ratones C57BL/6 no expuestos es 1/30.000 (Dillon y col., 1994). Sin embargo, el enriquecimiento pareció ser más bajo de lo esperado según los experimentos usando células T 2C (Tabla II). Esto no resulta sorprendente porque las mediciones con células T 2C reflejan directamente la capacidad de la etapa de enriquecimiento, mientras que, en experimentos que comienzan con células T CD8^{+} totales, el enriquecimiento probablemente se sobreestimó: algunas células CD8^{+} podrían haber sido capturadas y expandidas sin exhibir una actividad citotóxica, o podrían haber sido capturadas pero no crecerán en cultivo, o podrían haber tenido una interacción muy débil con las perlas recubiertas con CMH para ser "capturables". Es poco probable que la captura transforme a las células T en no respondedoras porque las células T 2C pueden expandirse en CTL tras la captura.

La separación magnética probó ser el procedimiento de elección para purificar poblaciones celulares raras. Éstas incluyen células progenitoras hemopoyéticas de sangre periférica humanas (purificación desde 0,18% hasta 54,4%, enriquecimiento de 300 veces, recuperación >39%) (Kato y Radbruch, 1993), unidades formadoras de estallido eritroide de sangre periférica humana (purificación desde 0,04% hasta 56,6%, enriquecimiento 1.400 veces, recuperación 13%) (Sawada y col, 1990) y linfocitos B que expresan IgA_{1} de sangre periférica (purificación desde 0,1-1,5% hasta 80%, más del 80% de recuperación) (Irsch y col, 1994). El procedimiento de la presente invención para enriquecimiento de células T específicas de antígeno es sustancialmente mejor que estos procedimientos, al juzgarlos a la vista de los valores de enriquecimiento y recuperación. Esto es especialmente significativo ya que los procedimientos de purificación mencionados anteriormente usan anticuerpos como ligandos para las células específicas; los anticuerpos tienen afinidades para antígenos que son mucho más altas que aquellas de los complejos CMH-péptido para los TCR. El procedimiento de la presente invención es también útil para la purificación celular por medio de otros ligandos con baja afinidad por moléculas de la superficie celular, por ligandos con baja afinidad se entiende moléculas que tienen una afinidad demasiado baja para permanecer unidas de manera estable a la superficie celular cuando se usan en forma soluble. Por contraste, los ligandos con alta afinidad, tales como anticuerpos, permanecen unidos de manera estable en la superficie celular cuando se usan en forma soluble. Resulta interesante mencionar que aunque es posible marcar fluorescentemente las células T específicas de antígeno (Altman y col., 1996), la clasificación celular por citometría de flujo no podría ser un sustituto para la separación magnética porque los precursores de células T son usualmente demasiado raros para detectarlos con citometría de flujo, y la velocidad de análisis y clasificación sigue siendo un factor limitante. Por contraste, la separación magnética puede usarse para separar poblaciones raras de células T específicas de antígeno, así como para clasificar una gran cantidad de células rápidamente. Estas características hacen del aislamiento magnético un procedimiento atractivo par derivar células T específicas de antígeno para uso clínico.

En conclusión, este es el primer informe de un procedimiento de purificación de células T específicas de antígeno que es aplicable a individuos no expuestos. Se ha mostrado que podría aplicarse a varias moléculas del CMH diferentes y a una diversidad de péptidos. El procedimiento de la presente invención es adecuado en una diversidad de situaciones, incluyendo, pero no limitado a el uso para derivar líneas de células T citotóxicas específicas de virus o específicas de tumor a partir de sangre periférica humana. Las células derivadas usando el procedimiento de la presente invención son útiles por sí mismas para una diversidad de fines incluyendo, pero no limitando a, expansión en cultivo y reinfusión en un paciente, análisis de diagnóstico y otras aplicaciones terapéuticas.

Se proveen los siguientes Ejemplos con el fin de ilustrar la presente invención sin limitar el alcance de la invención a los ejemplos a continuación.

Ejemplo 1 Unión de moléculas del CMH clase I biotiniladas sobre perlas magnéticas recubiertas con avidina

Se expresaron las moléculas solubles del CMH clase I, L^{d}, K^{b} y K^{bm3} en células de Drosophila melanogaster (Jackson y col., 1992) y se purificaron como se describió previamente (Sykulev y col., 1994a). La biotinilación se realizó usando biotina-BMCC (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se recubrieron Dynabeads M500 (Dynal, Lake Success, NY) con neutravidina (Pierce, Rockford, IL) y se incubaron posteriormente con moléculas del CMH clase I biotiniladas diluidas en PBS conteniendo FCS al 3% durante 2 horas a 4ºC con agitación suave. Las perlas entonces se lavaron 3 veces en DMEM que contiene FCS al 10% y se incubaron durante 1 hora con péptido 20 \muM. Posteriormente se usaron las perlas inmediatamente para adsorción celular. Se usó L^{d} biotinilada como un modelo de prueba para estudiar la unión de moléculas del CMH clase I biotiniladas a perlas magnéticas recubiertas con avidina. Se incubaron diversas cantidades de esta molécula con perlas. Posteriormente se tiñeron las perlas usando anticuerpo monoclonal anti-L^{d} 30.5.7 marcado con fluoresceína sensible a la conformación. Se evaluó la unión de L^{d} por medio de análisis por citofluorometría de flujo. El valor medio de fluorescencia aumentó linealmente con la cantidad de L^{d} entre 0 y 1,5 \mug de L^{d}/10^{6} perlas, y alcanzó una meseta en 3 \mug de L^{d}/10^{6} perlas como se muestra en la Figura 1A. La cantidad necesaria de L^{d} para alcanzar la saturación fue la misma con varios lotes de perlas y de L^{d} biotinilada. Para cuantificar el número de moléculas del CMH inmovilizadas por perla, se midió las concentraciones de moléculas del CMH clase I en solución previamente y tras la unión usando el siguiente inmunoensayo en fase sólida: se adsorbieron moléculas del CMH clase I, L^{d} sobre perlas de sulfato de látex de poliestireno de 6,8 \mum (Interfacial Dynamics Corporation, Portland, OR) recubiertas con anti-L^{d} 28-14-8S (ATCC, Rockville, MD); posteriormente se tiñeron las perlas usando anti-L^{d} 30-5-7 marcado con fluoresceína; se midieron los valores medios de fluorescencia (VMF) por citofluorometría de flujo. Se estableció una curva patrón con concentraciones conocidas de L^{d} y se representó gráficamente VMF frente a concentraciones. Se encontró que la cantidad de L^{d} inmovilizada en condiciones de saturación fue 1,23 \pm 0,10 x 10^{6} moléculas por perla. Los histogramas de fluorescencia muestran la fluorescencia de las perlas sin teñir (figura 1B) y de las perlas adsorbidas con cantidades saturantes de L^{d} (figura 1C). Se produjo la unión a través de la interacción avidina-biotina ya que las moléculas no biotiniladas no se unieron a las perlas (figura 1D). Se prepararon perlas recubiertas con K^{b} y K^{bm3} y se probaron usando la misma técnica. Se alcanzó la saturación usando el mismo intervalo de concentraciones que se uso para L^{d}.

Ejemplo 2 Captura de células T específicas de antígeno sobre perlas magnéticas recubiertas con CMH clase I en presencia de péptidos antigénicos Ratones y líneas celulares

Los ratones BALB/c (H-2^{d}) y C57BL/6 (H-2^{b}) eran de Harlan Sprague Dawley (San Diego, CA). Se criaron ratones transgénicos 2C (Sha y col, 1988) en el vivero de R. W. Johnson P.R.I.. Se mantuvo a todos los ratones bajo condiciones específicas libres de patógenos. Se usaron células RMAS expresando L^{d} (Cai y Spent, 1996) y células EL4 (H-2^{b}, obtenidas de ATCC, Rockville, MD) como células diana en ensayos de CTL. El hibridoma anticlonotípico 1B2 se describió previamente (Kranz y col., 1994).

Purificación de células T CD8^{+} de ratones normales

La purificación se realizó a 4ºC bajo condiciones estériles. Se diseccionaron ganglios linfáticos inguinales, axilares, cervicales, ilíacos y mesentéricos de los ratones y se separaron en una única suspensión de células individuales. Se recubrieron perlas magnéticas recubiertas con avidina (Dynal, Lake Success, NY) con Ig de anti-ratón de cabra biotinilado (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) y posteriormente se incubaron con la suspensión celular para adsorber las células que expresan Ig. Posteriormente se incubaron las células no adsorbidas con H129.19 2 \mug/ml (anti-CD4, Gibco BRL, Gaithersburg, MD), AF6-120.1 1 \mug/ml (anti-I-A^{b}, Pharmingen, San Diego, CA), KH74 1 \mug/ml (anti-I-A^{b}, Pharmingen, San Diego, CA) y 34-5-3 1 \mug/ml (anti-I-A^{d,b}, Pharmingen, San Diego, CA) para ratón con un fondo de H-2^{b}; o con H129.19 2 \mug/ml y 34-5-3 1 \mug/ml para ratón con un fondo de H-2^{d}. Posteriormente se lavaron las células 3 veces y se eliminaron las células que expresan CD4 o CMH-clase II por adsorción en perlas magnéticas recubiertas con Ig anti-rata de oveja (Dynal, Lake Success, NY). La pureza alcanzó 90 a 94% de células CD8^{+} lo indican los resultados mediante tinción con anticuerpos y citofluorometría de flujo.

Purificación de células T 2C de ratones transgénicos

Se purificaron células T 2C de ganglios linfáticos de ratón de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Las células purificadas fueron un 97-98% reactivas con el anticuerpo anticlonotípico 1B2. Además, pudieron también prepararse células CD8^{-} (CD4^{-}) eliminando las células CD8^{+} con el anticuerpo anti-CD8a 53-6.7 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y perlas magnéticas recubiertas con Ig anti-rata de oveja.

Péptidos

Los péptidos de unión de L^{d} y K^{b} usados en estos estudios se sintetizaron en los instrumentos Applied Biosystem 430A y 431 A mediante un procedimiento convencional de síntesis de péptidos en fase sólida (química tBoc). Las secuencias de péptidos fueron las siguientes:

QL9:: QLSPFPFDL [SEQ. ID. Nº: 1]

p2Ca:: LSPFPFDL [SEQ. ID. Nº: 2]

SL9:: SPFPFDLLL [SEQ. ID. Nº:3]

p2Ca-A3:: LSAFPFDL [SEQ. ID. Nº: 4]

dEV-8:: EQYKFYSV [SEQ. ID. Nº: 5]

SIYR:: SIYRYYGL [SEQ. ID. Nº: 6]

LCMV:: RPQASGVYM [SEQ. ID. Nº: 7]

MCMV:: YPHFMPTNL [SEQ. ID. Nº: 8]

OVA-8:: SIINFEKL [SEQ. ID. Nº: 9]

VSV-8:: RGYVYQGL [SEQ. ID. Nº: 10]

E1:: EIINFEKL [SEQ. ID. Nº: 11].

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Adsorción de células T 2C sobre perlas magnéticas recubiertas con CMH

Para probar la capacidad de las perlas recubiertas con moléculas del CMH clase I de capturar células T específicas de antígeno, se usaron perlas magnéticas recubiertas con L^{d}, K^{bm3} o K^{b}, y células T purificadas de ratones transgénicos TCR 2C. El TCR 2C ha sido caracterizado extensivamente y se han informado varios péptidos antigénicos, reconocidos con diversas afinidades en asociación con L^{d} (Tabla I), (Sykulev y col, 1994 a, b). Más aún, K^{bm3} y K^{b} demostraron recientemente servir como elementos de restricción para el TCR 2C en asociación con los péptidos dEV-8 y SIYR (Tallquist y Pease, 1995; Ukada y col, 1996; Tallquist y col., 1996). Se determinó recientemente que las afinidades de los complejos K^{bm3}-dEV-8 y K^{b}-SIYR para el TCR 2C fueron de 1,8 x 10^{4} M^{-1} y 3,1 x 10^{4} M^{-1} respectivamente. A menos que se establezca de otra manera, las perlas se recubrieron con cantidades saturantes de moléculas L^{d}, K^{bm3} o K^{b} biotiniladas.

Se suspendieron células con perlas hasta alcanzar una concentración final de 10^{7} perlas/ml. Las concentraciones de las células fueron 10^{6}/ml en las Figuras 2, 3 y 4 y 10^{7}/ml en las Figuras 5, 6 y 7. Los péptidos se agregaron en una concentración de 20 \muM. La adsorción se realizó bajo agitación suave durante los tiempos indicados y a las temperaturas indicadas en el texto. Posteriormente se contaron las células adsorbidas a perlas bajo el microscopio. En los casos en los que no se observó una roseta definida (3 perlas o más por célula), se probó la unión golpeando ligeramente el cubreobjetos. Tras incubación a temperatura ambiente en presencia del péptido de alta afinidad QL9, péptido de afinidad intermedia p2Ca y péptido de baja afinidad SL9, la mayoría de las células T 2C se unieron a las perlas recubiertas con L^{d}, tal como lo indica el examen microscópico tras 4 horas de incubación (Tabla I). Se obtuvieron resultados similares (60-80% de células capturadas) en 5 experimentos independientes. La unión celular fue específica ya que no se produjo en presencia de complejos L^{d}-LCMV y L^{d}-MCMV no reactivos para 2C.

La adsorción también se cuantificó por citofluorometría de flujo usando un FACSscan® (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) registrando gráficos de puntos de fluorescencia verde frente a roja, o de dispersión frontal frente a dispersión lateral. Para evaluar la formación de complejos célula-perla usando gráficos de fluorescencia verde frente a roja, se marcaron las perlas en rojo con ficoeritrina (Figura 2A: perlas solas) y se marcaron las células en verde con NHS-fluoresceína (Pierce, Rockford, IL) (Figura 2B: células solas). Se evaluó la formación de complejos célula-perla mediante la aparición de acontecimientos verdes (V) y rojos (R). Se calculó el porcentaje de células complejadas con perlas como la relación RV/V+RV, donde V es la cantidad de acontecimientos en el cuadrante inferior derecho y RV es la cantidad de acontecimientos en el cuadrante superior derecho. Se descubrió que en tales gráficos de puntos de fluorescencia verde frente a roja (Figura 2), la formación de complejos célula-perla fue bastante evidente en presencia de péptidos antigénicos QL9 (Figura 2C), p2Ca (Figura 2D) y SL9 (Figura 2E), con más de 85% de las células cambiando a un valor alto de fluorescencia roja. Se detectaron algunos acontecimientos coloreados de rojo y verde (2,2%) en la muestra incubada con un péptido control (LCMV) (Figura 2F). Esto se debió con mayor probabilidad a la adsorción no específica de una pequeña cantidad de detritus celulares marcados con fluoresceína a las perlas.

Se dispuso también de gráficos de puntos de dispersión lateral frente a dispersión frontal para esta cuantificación, gracias al hecho de que las células (Figura 3C) y las perlas (Figura 3B) tuvieron difracciones laterales y frontales muy diferentes, lo que hizo fácil marcar regiones diferentes de manera clara (Figura 3A) conteniendo las poblaciones de acontecimientos que representan a las células y a las perlas respectivamente. La aparición de una población adicional de acontecimientos con una difracción frontal más alta que las perlas y una difracción lateral más alta que las células, reflejó la formación de complejos célula-perla; esto permitió definir una región de complejos, distinta de las regiones de células y de perlas. Se calculó el porcentaje de células adsorbidas a perlas como la relación CO/CO+CE, donde CO fue la cantidad de acontecimientos en la región de complejos y CE fue la cantidad de acontecimientos en la región de células. Tales mediciones de difracción frontal y lateral mostró la adsorción específica de antígeno de células T 2C a las perlas: en el experimento mostrado en la Figura 3, 91,0% y 78,9% de las células estaban adsorbidas a perlas recubiertas con L^{d} en presencia de QL9 (Figura 3D) y p2Ca (Figura 3E) respectivamente y 63,8% de las células estaban adsorbidas a perlas recubiertas con K^{bm3} en presencia de dEV-8 (Figura 3G) y 75,7% de las células estaban adsorbidas a perlas recubiertas con K^{b} en presencia de SIYR (no mostrado) tras 4 horas de incubación. Varias poblaciones, que diferían en sus valores de difracción lateral, estaban visibles en la región de complejos; representaban probablemente complejos conteniendo diferente cantidad de perlas. En presencia de complejos L^{d}-LCMV (Figura 3F), K^{bm3}-E1 (Figura 3H) y K^{b}-E1 no reactivos para 2C, se encontró el 2,6%, 1,1% y 0,2% de los acontecimientos en la región de complejos, respectivamente.

Se usó un análisis de citofluorometría de flujo para cuantificar la influencia de diversos parámetros en la formación de complejos célula-perla. La unión de células a perlas fue dependiente del tiempo. Se detectó unión tras 5 min. de incubación, aumentó posteriormente hasta alcanzar una meseta entre 1 y 4 horas y disminuyó notablemente tras 6 horas (Figura 4A). Las cinéticas de adsorción fueron marcadamente paralelas para diversos complejos péptido-CMH. La unión fue también dependiente de la temperatura, como se muestra en la Figura 4B. A 4ºC, se capturó sólo un pequeño porcentaje de células en las perlas, incluso tras incubación prolongada. La adsorción a temperatura ambiente fue muy similar a la adsorción a 37ºC con la excepción de L^{d}-p2Ca, para el que los niveles de unión a 37ºC fueron aproximadamente el 25% de los valores medidos a temperatura ambiente, consistentes con la incapacidad de p2Ca para estabilizar L^{d} a 37ºC (Cai y Sprent, 1996). Finalmente, la dependencia de CD8 de la captura de células varió con el complejo péptido-CMH: por ejemplo, las capturas con L^{d}-QL9 y K^{bm3}-SIYR fueron muy independientes de CD8, mientras que L^{d}-p2Ca y K^{bm3}-dEV-8 exhibieron dependencia de CD8 (Figura 4C).

Ejemplo 3 Recuperación de células T específicas de antígeno mezcladas con células T irrelevantes

Las frecuencias de precursores de células T en animales no expuestos son típicamente bajas. Se vio que las perlas magnéticas resultaron adecuadas en otros sistemas para enriquecer poblaciones celulares con baja frecuencia (Sawada y col., 1990; Kato y Radbruch, 1993). Para evaluar si las perlas magnéticas recubiertas con CMH clase I podían usarse para enriquecimiento de precursores de células T, se mezclaron células T 2C marcadas con fluoresceína con células T CD8^{+} purificadas de ratones C57BI/6 no expuestos. Tras incubar con perlas magnéticas recubiertas con CMH en presencia de péptido, se eluyeron las células adsorbidas y se contaron, y se determinó el porcentaje de células T 2C por citofluorometría de flujo. En el experimento mostrado en la Figura 5, las células T 2C fueron no detectables en la frecuencia inicial de 0,03%. Tras la adsorción usando perlas recubiertas con K^{bm3} y péptido dEV-8, se observó un pico definido de fluorescencia verde, exhibiendo la misma intensidad que la población de células T 2C marcadas con fluoresceína originales. Este pico representó el 65,1% de las células eluidas. No se observó pico cuando se usó péptido control en vez de dEV-8. Se logró un enriquecimiento de 800-1600 veces en experimentos comparables de células T 2C usando perlas recubiertas con 3 complejos CMH-péptido diferentes (Tabla II). En todos los casos, las células no fluorescentes en la población eluida representaron sólo una fracción menor de la población celular inicial (aproximadamente 0,2%).

Ejemplo 4 Aislamiento in vitro y expansión de CTL específica de antígeno de ratones no expuestos Citotoxicidad mediada por células in vitro

Se usaron como células diana: células RMA.S expresando L^{d}, células EL4 (H-2^{b}), células MC57 (H-2^{b}) infectadas con LCMV Armstrong (48h; multiplicidad de infección: 1 UFP por célula) o células BALB/c CL-7 (H-2^{d}) infectadas con LCMV Armstrong (48h; multiplicidad de infección: 1 UFP por célula). Se cargaron las células diana con 100 \muCi de Na_{2}^{51}CrO_{4} (New England Nuclear, Wilmington, DE) por 10^{6} células a 37ºC durante 60 min., en presencia de FCS al 20%. Se lavaron tres veces y se tomaron alícuotas en placas de 96 pocillos a razón de 4.000 a 10.000 células por pocillo. Posteriormente se agregaron péptidos y células efectoras. El volumen final fue de 200 \mul/pocillo. Se incubaron las placas a 37ºC durante 5 horas. Se recogieron cien \mul de sobrenadante y se contaron en un contador gamma. Se calculó el porcentaje de lisis específica como se informó anteriormente (Wunderlich y Shearer, 1991).

Ensayo in vivo para actividad de CTL

Se inyectaron los ratones receptores en el día 0 con 2 x 10^{3} UFP de LCMV Armstrong i.v. y se les transfirieron células por vía i.v. en el día 1. En el día 2 se sacrificaron los ratones, se ensayaron los bazos en busca de valoraciones infecciosas de virus por ensayo en placa en células Vero como se describió previamente (Byrne y Oldstone, 1984). Se expresaron las valoraciones de virus como unidades formadoras de placas por gramo de tejido (ufp/g).

Cultivo celular

Se recuperaron células adsorbidas sobre perlas lavando las perlas 3 veces con DMEM conteniendo FCS al 10% y posteriormente se cultivaron en placas de 96 pocillos recubiertas con la molécula del CMH clase I adecuada y anticuerpo anti-CD28 en presencia de 10 \muM de péptido; estas condiciones son suficientes para activar las células T 2C latentes. Se usaron placas con fondo plano para asegurar que cada célula esté en contacto con las moléculas estimulantes inmovilizadas. Tras 2 días de cultivo a 37ºC bajo atmósfera húmeda conteniendo 8% de CO_{2}, se reemplazó la mitad del volumen del medio por medio fresco conteniendo 20% de sobrenadante del cultivo de esplenocitos de rata activados con concanavalina A (sobrenadante conA). Tras 8-12 días, se reestimularon las células con células de bazo pulsadas con 1 \muM de péptido y se cultivaron en presencia de 10% de sobrenadante conA y 2 ng/ml de TGF\beta_{1} (Lee y Rich, 1991; Zhang y col, 1995).

Generación de líneas CTL específicas de antígeno a partir de células T de ratón no expuestos usando adsorción sobre perlas magnéticas recubiertas con CMH; especificidad de antígeno de la etapa de aislamiento

Para investigar si el procedimiento de captura podría aplicarse para aislar células T específicas de antígeno a partir de un animal no expuestos, se incubaron dos alícuotas de células T CD8^{+} purificadas de ganglios linfáticos de ratón C57BL/6 (haplotipo H-2^{b}) con perlas magnéticas recubiertas con K^{b} en presencia de péptido OVA-8 (alícuota 1) o péptido VSV-8 (alícuota 2) durante 4 horas a temperatura ambiente. Tras 3 lavados, se pusieron las células en cultivo en 12 pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con K^{b} y mAb anti-CD28, en presencia de 10 \muM de péptido OVA-8 o VSV-8. Se procesaron los cultivos como se indicó en el párrafo anterior. El crecimiento celular se hizo visible tras 7 días en pocillos conteniendo células adsorbidas. Se reestimularon las células en celdas de alimentación en el día 9 y se probó la actividad citotóxica en el día 18. Las células de la alícuota 1 cultivada con OVA-8 exhibieron una actividad CTL específica para péptido OVA-8 (Figura 6A), y las células de la alícuota 2 cultivadas con VSV-8 exhibieron una actividad CTL específica para VSV-8 (Figura 6C). Se proveyeron controles mediante la combinación inversa: las células capturadas usando péptido OVA-8 contenían precursores de CTL anti-VSV-8 no detectables, ya que no generaron CTL anti-VSV-8 cuando se usó VSV-8 más que OVA-8 para activarlas en cultivo (Figura 6B); de manera similar, las células capturadas usando péptido VSV-8 contenían precursores de CTL anti-OVA-8 no detectables (Figura 6D).

Para obtener una estimación de las frecuencias de CTLp tras el enriquecimiento, se repitió el experimento de enriquecimiento usando perlas recubiertas con K^{b} y péptido OVA-8. En un experimento representativo, se tomaron alícuotas de las 12.000 células recuperadas por adsorción a perlas magnéticas recubiertas con K^{b}-OVA8 y se cultivaron de manera separada en 12 pocillos de placas de 96 pocillos inmediatamente tras la captura. Se recuperó CTL específica de las células capturadas en 3 pocillos, indicando que la frecuencia del precursor tras la captura fue de aproximadamente 1/3.500. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.

Generación de CTL anti-LCMV a partir de células T de ratón no expuestos; actividad antiviral in vitro e in vivo

Se derivaron CTL anti-LCMV incubando 10^{7} células T CD8^{+} purificadas de ganglios linfáticos de ratón BALB/c (haplotipo H-2^{d}) junto con perlas magnéticas recubiertas con L^{d} en presencia de péptido de LCMV durante 4 horas a temperatura ambiente. Tras 3 lavados, se recuperaron aproximadamente 104 células y se cultivaron en 12 pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con L^{d} y mAb anti-CD28, en presencia de 10 \muM de péptido de LCMV. Se cultivaron las células como se indicó en el párrafo anterior. Como se muestra en la Figura 7A, se obtuvieron linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para péptido de LCMV. Las células también mataron dianas infectadas con LCMV de haplotipo H-2^{d}, mientras que exhibieron sólo una actividad de fondo contra dianas no infectadas (Figura 7B). También estuvo presente una actividad antialotípica (Figura 7C) así como algo de actividad NK/LAK (Figura 7D). Todas las células expresaron CD8, como lo indica la citofluorometría de flujo. El ensayo in vivo mostró que las células fueron capaces de reducir marcadamente las valoraciones de virus en ratones BALB/c (H-2^{d}) con infección aguda con LCMV (Figura 8). Esta reducción fue específica para CMH ya que no se observó reducción significativa de las valoraciones de virus en ratones C57/BL6 (H-2^{b}) tras la inyección de CTL.

Referencias bibliográficas

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TABLA I Captura de células T 2C en perlas magnéticas recubiertas con L^{d} en presencia de diversos péptidos tal como se evaluó por medio de examen microscópico

1

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TABLA II Recuperación de células T 2C mezcladas con células T CD8^{+} de ratón B6 no expuestos por adsorción sobre perlas magnéticas recubiertas con CMH clase I

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Claims

1. Un procedimiento para enriquecer linfocitos T específicos de antígeno que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto una población heterogénea de linfocitos T específicos de antígeno con un sustrato para capturar antígenos, dicho sustrato comprendiendo:

i): un soporte que tiene en su superficie una población homogénea inmovilizada de moléculas del CMH de Clase I vacías, en el que dichas moléculas de Clase I son capaces de unir uno o más antígenos y dichas moléculas de Clase I son moléculas K^{bm3} o L^{d} expresadas por una línea celular recombinante de Drosophila; y

ii): una perla;

: a la que se ha unido uno o más antígenos, durante un período de tiempo suficiente para permitir a los linfocitos T específicos de antígeno interaccionar con el sustrato; y

(b): eluir los linfocitos T específicos de antígeno del sustrato para proveer una población enriquecida de linfocitos T específicos de antígeno.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha perla es una perla magnética.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que el antígeno o antígenos es(son) péptido(s).