ES2277461T3 - Terapia de hcg para el tratamiento de cancer de mama metastatico. - Google Patents

Abstract

Utilización de hCG para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores de mama clínicamente manifiestos, en la que el tumor de mama clínicamente manifiesto es un tumor de mama metastásico.

Description

Terapia de hCG para el tratamiento de cáncer de mama metastático.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la terapia del cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a la utilización de gonadotropina coriónica humana (hCG) para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del tumor de mama (cáncer de mama) clínicamente manifiesto que es metastásico. Se contempla asimismo el tratamiento del tumor de mama en mujeres posmenopáusicas. El medicamento comprende preferentemente hCG juntamente con un antiestrógeno y/o un interferón de tipo I.

Antecedentes de la invención

El cáncer de mama ha producido la muerte de un cuarto de millón de mujeres en todo el mundo durante muchos años y se ha estimado que es la causa principal de muerte en mujeres de edades comprendidas entre 35 y 54 años, siendo la segunda solamente las enfermedades cardiovasculares en mujeres de edades por encima de 55 años (W. P. D. Logan, Cancer of the female breast. International mortality trends. W. H. O. Stat. Rep. 28:232, 1975).

El cáncer de mama totaliza el 27% de todos los cánceres en todo el mundo. A pesar de los avances en la detección precoz de esta enfermedad, su frecuencia está aumentando y su tasa de mortalidad no ha disminuido de forma significativa. Existe una asociación bien conocida entre el embarazo precoz a término y una reducción en el riesgo de desarrollar cáncer de mama durante la vida, sin embargo los mecanismos que median este efecto protector no han sido aclarados.

En el modelo de rata, la terminación de un embarazo a término antes de la administración del carcinógeno inhibe la producción del tumor. La incidencia máxima en el tumor de mama tiene lugar cuando el carcinógeno se administra a ratas jóvenes (Russo y Russo, 1987, Lab. Invest. 57:112-137; Russo y Russo, 1978, J. Natl. Cancer Inst. 61:1439-1442; Russo et al., 1979, Am. J. Pathol. 96:721-734). La incidencia del tumor disminuye significativamente, o se llega a eliminar casi completamente cuando el carcinógeno se administra a ratas con descendencia entre 3 y 9 semanas después del parto con o sin lactancia (Russo y Russo, 1980, Am. J. Pathol. 100:497-511; Russo y Russo, 1980, Cancer Res. 40:3677-3686; Russo y Russo, 1982, Internat. Res. Com. (IRCS) 10:935-945; Russo y Russo, 1993, European J. Cancer Prevention 2:101-111).

La función desempeñada por el tratamiento endocrino en el cáncer de mama fue descubierta en 1896, cuando Bateson observó que el cáncer de mama en mujeres premenopáusicas remite tras la ovariectomía. Este descubrimiento, confirmado posteriormente por otros científicos, apoyaba las pruebas de que al menos algunos tumores de mama son directamente dependientes de las hormonas para su desarrollo y creó interés el método terapéutico de la extirpación quirúrgica con el fin de eliminar la fuente endógena de hormonas.

A medida que se descubrían fármacos que antagonizan específicamente la acción del estrógeno, se convertían en una alternativa atractiva a la extirpación quirúrgica. Se han probado varios compuestos antiestrógeno en mujeres pre y posmenopáusicas en pruebas clínicas en fase I y II. Hasta ahora el Tamoxifeno ha demostrado ser el fármaco que se aproxima más a la eficacia de la terapia quirúrgica endocrina y el único que está sustancialmente exento de efectos secundarios graves. Un estudio comprensivo de la eficacia terapéutica de los antiestrógenos en el tratamiento del cáncer de mama puede encontrarse en Legha y Carter, Antiestrogens in the treatment of breast cancer. (Cancer Tret. Rev. 3:205, 1976). Otro estudio más específicamente relacionado con la experiencia clínica con Tamoxifeno es el de Paterson et al., A review of the International clinical experience with Tamoxifen. (Jpn. J. Cancer Clin. 11 (supl.): 157, 1981).

Aproximadamente un tercio de las mujeres con cáncer de mama responde a la terapia hormonal a base de antiestrógenos, mientras que es de esperar un aumento hasta del 70% de respuesta en pacientes con tumores ricos en receptor. De hecho, se ha demostrado que el estado del receptor de estrógeno (ER) es un pronóstico de la respuesta en pacientes con cáncer de mama (Allegra, J. C., Reviews on Endocrine related cancer. Paterson AHG, Lees AW eds. supl. 14:115, 1984).

La gonadotropina coriónica es una hormona de glucoproteína compuesta por dos subunidades (\alpha y \beta) ligadas por enlace no covalente. (Labrie, Glycoprotein hormones: gonaotropins and thyrotropin. En: Hormones - From Molecules to Disease. Beanlien EE y Nelly PA - Chapman y Hall, Nueva York y Londres, págs. 257-275, 1990). Es sintetizada al principio del embarazo por el embrión en desarrollo y a lo largo del proceso de gestación por el sincitiotrofoblasto de la placenta, y se segrega en la orina.

La gonadotropina coriónica se extrae de la orina de las mujeres embarazadas tanto para usos experimentales como clínicos. La hormona puede prepararse también por vía recombinante (documento WO 85/01959). La principal función conocida de hCG es la estimulación de la producción de la hormona esteroide de la gónada mediante su interacción con el receptor LH/CG, que está presente en las células granulares del ovario en las hembras y en las células testiculares de Leydig en los varones.

Los estudios recientes han sugerido que la hCG urinaria es un potente agente preventivo que inhibe la tumorigénesis de mama inducida químicamente mediante la inducción de diferenciación. (Russo et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1286-1289, 1990). Experimentos adicionales indicaron que el tratamiento con hCG de ratas después de la exposición a carcinógenos también les protegía del desarrollo tumoral (Russo et al., Br. J. Cancer 62: 2343-2347, 1990). HCG inhibe también la proliferación de células epiteliales de cáncer humano normales y neoplásicas (Alvarado et al., In Vitro 30A: 4-8, 1994). Se ha descubierto también que la hCG urinaria de varias procedencias presenta un efecto inhibidor sobre las líneas celulares neoplásicas de varios órganos o sistemas (Gill et al., J. Natl. Cancer Inst.
89: 1797 - 1802, 1997; Albini et al., AIDS 11: 713-721, 1997; Mgbonyebi et al., Proc. Annu. Meet. A. Soc. Cancer Res. 38, págs. A1977, XP002109660, 1997).

La solicitud de patente internacional WO 97/49432 describe la inducción de la muerte celular de células de cáncer de mama in vitro mediante el tratamiento de las células con hCG urinaria. El mismo efecto se observó con varias fracciones y la subunidad \beta de hCG.

Dos estudios más, ambos realizados en un modelo de rata, demostraron que la hCG urinaria presenta un efecto preventivo contra los tumores de mama de rata inducidos por carcinógenos (Scrivastava et al., Carcinogenesis 18: 1799-1808, 1997 y You et al., Cancer Research 58/7: 1498-1502, 1998). Se pretrataron ratas con dosis diarias de hCG urinaria durante varias semanas antes de la inducción del tumor y se sacrificaron en varios puntos de tiempo después de continuar el tratamiento con hCG. En las ratas pretratadas, se redujo la frecuencia de los tumores de mama inducidos por carcinoma.

También se observó que las mujeres que habían seguido el tratamiento con hCG urinaria para infertilidad o pérdida de peso presentaban una frecuencia reducida del cáncer de mama (Bernstein et al., Cancer Epidemiol., Biomarkers and Prev. 4: 437-440, 1995). Estas observaciones, sin embargo, eran únicamente deductivas y los estudios referidos a la medición de hCG en el tratamiento de cáncer de mama humano no se ha publicado hasta ahora. A partir del modelo de rata, solamente se ha deducido un efecto protector de la hCG urinaria sobre el desarrollo del cáncer cuando se administró la hCG poco antes de la iniciación de la carcinogénesis. Sin embargo, en los seres humanos, el cáncer de mama normalmente se diagnostica solamente después de que ya se haya demostrado como nódulo palpable, o detectable en mamografía de diagnóstico.

Las patentes U.S. nº 5.700.781 (Harris, 1997), nº 5.677.275 y nº 5.877.148 (Lunardi-Iskandar et al., 1997, 1999), así como la solicitud de patente internacional WO 96/04008 da a conocer métodos para el tratamiento de cánceres como el sarcoma de Kaposi, que se cree que es de origen endotelial, la hCG parecía presentar un efecto antiproliferante al inyectarse en ratones que presentan sarcoma de Kaposi metastásico, demostrado.

Recientemente, se han cuestionado los efectos antitumorales de hCG por una serie de experimentos publicados por el grupo de Robert Gallo (Lunardi-Iskandar et al., Nature Med. 4:418-434, 1998 y comentarios en las páginas 370 y 390 a 391 de la misma publicación). Estos experimentos demostraron convincentemente que el efecto sobre el sarcoma anti-Kaposi (KS) de las preparaciones de hCG no es debido a la propia hCG, sino en su lugar a un factor urinario no identificado, denominado HAF (factor asociado a hCG). Numerosas preparaciones de hCG disponibles en el mercado (de calidad clínica y purificadas), así como subunidades, fragmentos y hCG recombinante, demostraron su actividad inhibidora sobre las células KS neoplásicas en modelos animales in vitro e in vivo. Ni las subunidades o fracciones de hCG urinarias purificadas ni las recombinantes purificadas de hCG ejercieron ningún efecto en el modelo animal in vivo o en el análisis in vitro, respectivamente.

El hecho de que el embarazo precoz de ratones conduzca a la regresión del tumor KS incluso cuando los ratones no producen hCG en absoluto apoya además estos descubrimientos.

Consideradas en conjunto, las pruebas acumularon que los efectos beneficiosos de hCG en el tratamiento del cáncer eran solo producto de la purificación insuficiente de proteínas, siendo el agente antitumoral existente un factor todavía no identificado asociado al embarazo precoz. Los resultados obtenidos con hCG recombinante, junto con el hecho de que la procedencia del factor "HAF" asociado a hCG era la orina humana del embarazo en el primer trimestre, eliminaba la posibilidad de conseguir cualquier actividad antitumoral de las preparaciones recombinantes de hCG.

Compendio de la invención

Los inventores de la presente invención han realizado actualmente el sorprendente descubrimiento de que tanto la hCG urinaria como la recombinante es eficaz para el tratamiento del cáncer de mama humano. Este descubrimiento supera el prejuicio creado en la comunidad científica por los experimentos de Gallo et al., esbozados anteriormente (Lunardi-Iskandar et al., supra), en los que no se hizo el seguimiento de la actividad antitumoral hasta la hCG.

La presente invención por consiguiente se refiere a la utilización de hCG para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores de mama declarados y metastásicos, a las composiciones farmacéuticas correspondientes y a los artículos de preparación que comprenden dichas composiciones farmacéuticas.

Los tumores de mama humanos declarados son los tumores de mama que se manifiestan ya clínicamente.

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Otras características y ventajas de la presente invención se entenderán mejor en relación con los dibujos, la descripción detallada y los ejemplos que siguen a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Histograma que presenta el efecto del tratamiento con r-hCG sobre el índice de proliferación de cánceres de mama humanos primarios (células ki67+). Mujeres con cáncer de mama recién diagnosticado, clínicamente probado se sometieron a pretratamiento de biopsias por punción del tumor de mama. A continuación recibieron cada dos días inyecciones de 500 mcg de r-hCG o ningún tratamiento. Se eliminó a continuación el tumor de mama por mastectomía parcial o total. El índice proliferante de las biopsias por punción y de los tumores escindidos se determinó por tinción inmunohistoquímica de las células Ki67+.

Figura 2. Histograma que presenta el efecto del tratamiento con r-hCG sobre la expresión del receptor de estrógenos de cánceres de mama humano primarios (células Er+). Mujeres con cáncer de mama recién diagnosticado, clínicamente probado se sometieron a pretratamiento de biopsias por punción del tumor de mama. A continuación recibieron cada dos días inyecciones de 500 mcg de r-hCG o ningún tratamiento. Se eliminó a continuación el tumor de mama por mastectomía parcial o total. La expresión del receptor de estrógenos de células tumorales en las biopsias por punción y de los tumores escindidos se determinó por tinción inmunohistoquímica de las células Er+.

Figura 3. Histograma que presenta la evolución de la respuesta de los pacientes con cáncer de mama metastásico que fueron tratados con r-hCG. Los pacientes se clasificaron de la manera siguiente: PD = enfermedad evolutiva; SD = enfermedad estable; PR = respuesta parcial; CR = respuesta completa.

Figura 4. Diagrama esquemático del protocolo experimental diseñado para determinar la eficacia preventiva y terapéutica de la gonadotrofina coriónica (hCG) urinaria humana en el cáncer de mama de rata in vivo.

Figura 5. Efecto del placebo, de r-hCG y de u-hCG sobre la masa tumoral. Número de tumores por animal en ratas vírgenes tratadas con placebo, Regímenes 1 (R1), 4 (R4) y 9 (R9); hCG recombinante, Regímenes 2 (R2), 5 (R5) y 7 (R7), o hCG urinaria, Regímenes 3 (R3), 6 (R6) y 8 (R8) en los tiempos indicados en la Figura 4.

Figura 6. Gráfico que presenta el transcurso de la inhibición de la masa tumoral en ratas por r-hCG y u-hCG.

Figura 7. Experimentos de proliferación que utilizan la línea celular CG-5 del cáncer de mama humano. Se cultivaron las células en un medio de cultivo que contenía una cantidad fija de Tamoxifeno (TAM) y varias concentraciones de hCG. Se hizo el recuento de células después de 3 días (Fig. 7A) y 6 días (Fig. 7B) y los recuentos de células se expresan en porcentaje del número de células de referencia. La línea de puntos representa el efecto de tamoxifeno 10^{-7} solo. El tamoxifeno se añade simultáneamente con (círculos negros) o sucesivamente a (triángulos negros) la hCG.

Figura 8. Histograma que presenta los resultados del experimento de proliferación utilizando la línea celular CG-5 de cáncer de mama humano, en el que el medio de cultivo se enriqueció con hCG solo.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención se ha demostrado actualmente que hCG es eficaz en el tratamiento de tumores de mama humanos declarados, es decir de tumores de mama, que son ya clínicamente manifiestos y que son metastásicos. La invención se refiere por consiguiente a la utilización de hCG para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores de mama clínicamente manifiestos o probados, que son metastásicos.

Por clínicamente manifiesto puede entenderse que es detectable utilizando métodos de diagnóstico clínicos, tales como palpación, mamografía, ultrasonidos u otros diagnósticos por imagen como termografía, exploración a la luz, xerorradiografía o detección por imagen de resonancia magnética (MRI), gammagrafía y así sucesivamente, pero también la detección por diagnóstico a partir del examen histológico de material de la biopsia, como por ejemplo biopsia por punción fina y aspiración o marcadores serológicos de formulación.

El cáncer de mama se da en mujeres y en hombres. Sin embargo, es muy frecuente en mujeres. El cáncer de mama puede producirse en mujeres premenopáusicas o posmenopáusicas. La invención por consiguiente se refiere también a la utilización de hCG para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores de mama metastásicos en mujeres premenopáusicas o posmenopáusicas, si bien puede utilizarse para tratar el cáncer de mama metastásico también en hombres.

Como puede deducirse de los estudios clínicos en mujeres posmenopáusicas presentado en el Ejemplo 2 más adelante, las mujeres tratadas presentaban lesiones mensurables bidimensionalmente o palpables y pruebas clínicas de enfermedad metastásica, y la hCG presentaba un efecto positivo en el curso de la enfermedad en más del 50% de los pacientes. La invención se refiere preferentemente por consiguiente al tratamiento de tumores de mama en mujeres posmenopáusicas.

La utilización de hCG es muy preferida para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de carcinoma de mama metastásico en mujeres posmenopáusicas.

En otra forma de realización preferida, se utiliza hCG como adyuvante en combinación con otras terapias para el cáncer. Otras terapias para el cáncer incluyen, por ejemplo, mastectomía, mastectomía parcial, mastectomía segmentaria o cualquier otro tratamiento quirúrgico, así como quimioterapia, o terapia con fármacos o combinaciones de fármacos.

Por ejemplo, se ha observado que las terapias endocrinas específicas con antiestrógenos, progestinas o inhibidores de aromatasa son eficaces en el tratamiento del cáncer de mama. Los antiestrógenos son especialmente eficaces en el tratamiento de tumores positivos al receptor de estrógenos (ER), ya que se unen al ER y bloquean competitivamente la fijación del estrógeno a su receptor. La invención por lo tanto se refiere también a la utilización de hCG para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer de mama en la que las células tumorales tratadas son positivas al receptor de estrógenos, y a la utilización de hCG en combinación con un antiestrógeno. La administración de hCG y del antiestrógeno puede ser simultánea, sucesiva o por separado.

Se prefiere particularmente la administración del antiestrógeno sucesivamente al tratamiento con hCG. Un antiestrógeno particularmente muy apropiado es el Tamoxifeno, que puede administrarse por vía oral en una cantidad diaria de aproximadamente 30 miligramos (mg). Aunque el Tamoxifeno es el antiestrógeno preferido, en el significado de "antiestrógeno" están comprendidas otras sustancias con actividad análoga, de acuerdo con la presente invención. Ejemplos adecuados se encuentra, p. ej., en un estudio de Legha y Carter: "Antiestrogens in the treatment of breast cancer" (Cancer Treat. Rev. 3:205, 1976).

La cantidad de hCG que debe administrarse según la invención es de 100 a 20.000 Unidades Internacionales (UI) al día o cantidades equivalentes en microgramos (\mug). La unidad "UI" se adapta específicamente a las sustancias biológicamente activas. La Unidad Internacional "UI" de hCG es la actividad contenida en una cantidad indicada de la Norma Internacional, que consiste en una mezcla de extracto liofilizado de gonadotropina coriónica de la orina de mujeres embarazadas, con lactosa. La equivalencia en Unidades Internacionales de la Norma Internacional está indicada por la Organización Mundial de la Salud. La potencia de hCG se expresa en Unidades Internacionales por miligramo. La determinación de la potencia se describe en la European Pharmacopoeia 1997, págs. 913-914 o en la USP, Gold/Official Monographs, pág. 718. El contenido en proteínas de una preparación puede medirse por cualquier análisis de determinación de proteínas, conocido en la materia, como por ejemplo mediante el análisis de proteínas de Lowry o el análisis de proteínas de Bradford, basados en la medición de la densidad óptica, conocidos también por las personas expertas en la materia.

Las preparaciones de hCG urinaria comercial presentan un intervalo de actividad específica, por ejemplo, de 2.000 a 10.000 UI/mg. Las preparaciones de hCG recombinantes pueden presentar una actividad específica tan elevada como 20.000 UI/mg. Se prefieren las dosis diarias comprendidas en el intervalo de 5.000 a 10.000 UI/día/paciente. Utilizando masas para calcular la dosificación, el medicamento de la invención debe administrarse en una cantidad entre 50 y 10.000 miligramos por paciente al día. Es preferible una cantidad de 250 a 3.000 microgramos por paciente al día. Preferiblemente, el medicamento de la invención debe administrarse cada dos días, o tres veces a la semana.

La duración de la administración de hCG es preferiblemente de varias semanas. En particular, la administración del medicamento de la invención debe ser cada dos días y durar aproximadamente 12 semanas. Un régimen muy preferido consiste en una administración cada dos días durante aproximadamente 12 semanas, régimen que es particularmente aplicable al tratamiento del cáncer de mama metastásico en mujeres posmenopáusicas.

El medicamento de la invención puede administrarse localmente, es decir, directamente en el tumor o sobre el mismo, o puede administrarse en el torrente circulatorio. Puede administrarse también por vía intramuscular. En una forma de realización preferida la administración es subcutánea.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad farmacéuticamente activa de una hCG y un antiestrógeno, en presencia de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la utilización simultánea, sucesiva o independiente de sus componentes activos en el tratamiento del cáncer de mama.

Los excipientes adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen alguno y todos los disolventes, los medios de dispersión y similares que pueden ser apropiados para la vía deseada de administración de la preparación farmacéutica. La utilización de dichos excipientes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocida en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las composiciones que deben administrarse, se contempla su utilización en la composición farmacéutica. En las realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen hCG o uno de sus equivalentes biológicos (preferiblemente 250 a 500 \mug de hCG) y un azúcar (preferiblemente 30 a 60 mg de sacarosa) y un tampón de fosfato. La preparación preferiblemente se liofiliza para el almacenamiento y transporte, a continuación se redisuelve con agua o solución salina antes de su uso.

Las composiciones farmacéuticas según la invención deben administrarse en una cantidad de 100 a 20.000 UI o cantidades en masa equivalentes calculadas a partir de la actividad específica (preferiblemente alrededor de 500 \mug, equivalentes a aproximadamente 10.000 UI), preferiblemente debe administrarse por vía subcutánea. El antiestrógeno preferido para su utilización en las composiciones farmacéuticas de la invención es el Tamoxifeno, que se administra por vía oral en una cantidad diaria de aproximadamente 30 miligramos.

Los interferones (IFN) son una familia muy conocida de proteínas que se ha demostrado que poseen efectos inhibidores tanto antivíricos como del crecimiento celular. Por consiguiente, una realización preferida de la invención hace uso de un interferón, preferiblemente un interferón de tipo I para el tratamiento del cáncer de mama en combinación con hCG y un antiestrógeno. Esta combinación reduce además el crecimiento de las células de cáncer de mama. La expresión "Interferón de tipo I" significa que comprende un IFN-\alpha (alfa), IFN-\beta (beta), IFN-\omega (omega) o IFN-\tau.

Los interferones presentan un intervalo amplio de efectos celulares en las células cancerosas, así como en las células normales, incluyendo efectos sobre el fenotipo celular tal como la expresión de antígenos y receptores superficiales, entre otros. Las pruebas experimentales indican que el IFN de tipo I modifica la concentración del receptor hormonal en las células de cáncer de mama. Por ejemplo, Pouillart et al., en "Administration of fibroblast interferon to patients with advanced breast cancer: possible effects on skin metastasis and on hormone receptors" (Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18:929-935, 1982) describió el efecto del interferón del fibroblasto humano administrado a pacientes con cáncer de mama metastasizado y observó un aumento de los receptores para estrógenos y progestinas. Es por estas razones por lo que la presente invención incluye la utilización de la hCG y del interferón de Tipo I juntamente con un antiestrógeno para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de mama así como una composición farmacéutica para éste, para la utilización simultánea, independiente o sucesiva de sus componentes activos en el tratamiento del cáncer de mama.

Varias formas de hCG pueden utilizarse eficazmente de acuerdo con la presente invención. Éstas comprenden el dímero hCG completo y cualquiera de sus fragmentos que presenten actividad biológica similar de hCG y/o actividad de fijación al receptor de hCG. hCG puede ser "natural", esto es, obtenido a partir de fuentes humanas naturales (orina, por ejemplo) o de líneas celulares, o "recombinante", esto es, obtenido a partir de células bacterianas, levaduras o células eucarióticas modificadas genéticamente o modificadas de otra manera.

Bien entendido que el receptor celular al que se une hCG también es reconocido y unido por la hormona luteinizante (LH), una hormona que también es estructuralmente similar a hCG. Por esta razón, la presente invención incluye además la utilización de LH como sustituto o suplemento de hCG en cualquiera de los medicamentos, preparaciones farmacéuticas y métodos descritos en la presente memoria. La dosis y el régimen apropiados para la administración de LH serán proporcionados a la de hCG, en la que, como regla empírica, 1 UI de hCG es equivalente a 7 UI
de LH.

En vista de la estructura común entre las subunidades alfa de FSH (hormona estimulante del folículo), TSH (hormona estimulante de las tiroides), LH y hCG, la presente invención se refiere también a la utilización de las proteínas de fusión de FSH, TSH y LH, en las que la subunidad beta se ha modificado de modo que la molécula de fusión resultante tiene un comportamiento similar a hCG. Moléculas de fusión como las contempladas en la presente memoria están descritas en la materia, p. ej., por Dias et al., J. Biol. Chem. 269(41): 25289-25294; y Grossman et al., J. Biol. Chem. 272(24): 15532-15540 (1997).

Se ha descubierto sorprendentemente en el marco de la presente invención que los carcinomas de mama preexistentes pueden ser tratados con hCG, y más específicamente con r-hCG, ya que la muerte celular programada está implicada como modo de actuación de la hCG urinaria tanto en el sarcoma de Kaposi como en el cáncer de mama, y las publicaciones mencionadas anteriormente se atribuyen a la actividad apoptósica de las preparaciones de hCG urinaria a los factores asociados a hCG (HAF) y no a la propia hCG (Lundardi-Iskandar et al., Nature Medicine 4:428-434; 1998; Samaniego et al., J. Natl. Cancer Inst. 91:135-143, 1999).

En vista de los inesperados resultados anteriores, la presente invención se refiere también a la utilización de hCG y particularmente de r-hCG para la preparación de un medicamento destinado a la prevención de tumores de mama metastásicos. Asimismo se proporcionan composiciones farmacéuticas para la prevención de tumores de mama metastásicos, que comprenden r-hCG sola o en combinación con uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales, similares a las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente para el tratamiento de tumores de mama clínicamente manifiestos.

La dosificación del medicamento de la invención, el régimen de dosificación y la duración del tratamiento para la prevención de tumores de mama metastásicos serían similares a los utilizados para el tratamiento de tumores clínicamente manifiestos. Por lo tanto, en una realización preferida, la dosis de hCG para un paciente humano es de 100 UI a 50.000 UI (Unidades Internacionales) por dosis, y en una realización más preferida, de 1.000 a 20.000 UI. En la realización más preferida, la dosificación es de 10.000 UI. El régimen de dosificación puede ser desde una vez a la semana hasta 7 veces a la semana, pero preferentemente es en días alternos o tres veces por semana. En otra realización preferida, el régimen de dosificación es de tres veces a la semana. La duración de la administración de r-hCG preferiblemente es de varias semanas, y más preferiblemente alrededor de 12 semanas.

Se proporcionan también artículos de preparación de acuerdo con la invención, para facilitar la utilización de hCG (incluyendo u-hCG, r-hCG, subunidad \beta de hCG o cualquier otro fragmento de hCG o un derivado que presente actividad anticancerosa), de hLH o de proteínas de fusión que comprendan la subunidad \beta de hCG y de las subunidades correspondientes de FSH, TSH o LH, en un medicamento, o como parte de una composición farmacéutica, en las utilizaciones descritas anteriormente para tratar tumores de mama metastásicos clínicamente manifiestos. Dichos artículos de preparación comprenden el material de envasado, una composición farmacéutica de hCG en el material de envasado y una etiqueta que indica que el agente farmacéutico contenido sirve para la prevención o el tratamiento de los tumores de mama.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para describir la invención con mayor detalle. Están destinados a ilustrar, no a limitar, la invención.

Ejemplo de referencia 1

La gonadotropina coriónica recombinante humana inhibe el crecimiento del tumor de mama primario en mujeres posmenopáusicas

Se evaluó la eficacia de hCG mediante el tratamiento con esta hormona de los pacientes con cáncer de mama primario recién diagnosticado. La eficacia del tratamiento se evaluó determinando si la administración de 10.000 UI de hCG en días alternos durante 2 semanas a mujeres con cáncer de mama recién diagnosticado reducía el tamaño del tumor, inhibía la proliferación celular y modificaba el porcentaje de células que expresan los receptores de estrógeno y progesterona. El efecto generalizado de la hormona se evaluó determinando las concentraciones de pituitaria y de hormonas ováricas en el suero en varios momentos del tratamiento. En este estudio se utilizó r-hCG.

Selección y acumulación de pacientes. En el estudio participaron veinticinco mujeres posmenopáusicas. Las pacientes presentaban cáncer de mama primario palpable y mensurable bidimensionalmente mayor de 1,5 cm de diámetro clínico. El tumor fue confirmado por análisis histopatológico. No se observó ninguna prueba de enfermedad metastásica al comenzar el estudio. Las pacientes presentaban unas funciones de la médula ósea, hepáticas y renales adecuadas. Se excluyeron las pacientes con tumores ulcerosos, afectación cutánea del cáncer de mama inflamatorio. No se observaron tumores de pituitaria ni de ovario simultáneos entre las pacientes. No hubo tromboflebitis aditiva ni antecedentes de alergia a hCG. Ninguna de las pacientes presentó terapia de sustitución hormonal. Un procedimiento de estadificación de rutina consistió en la evaluación citológica de una punción de la supuesta lesión, antecedentes médicos, examen físico y ginecológico exhaustivo, radiografía del tórax, sonografía del hígado, abdomen y pelvis, gammagrafía ósea, análisis de sangre, incluyendo el marcador tumoral CA 15.3, mamografía y sonografía de los pechos. El tumor primario se midió mediante examen clínico, mamografía y sonografía inmediatamente antes de la intervención quirúrgica.

Recogida de muestras y tratamiento posquirúrgico. Tras la autorización por escrito, la paciente se sometió a biopsias de la parte central del tumor primario bajo anestesia local con una pistola ajustada con agujas de biopsia de tipo tru-cut de calibre 12 a 14 (Bard, Covington, USA). Este procedimiento representa la referencia de tratamiento, por consiguiente no se necesitó ninguna desviación de los procedimientos de diagnóstico rutinarios. La biopsia por punción central se examinó mediante la técnica de la sección congelada. Si la sección congelada resultaba positiva al cáncer, entonces se extraían tres biopsias por punción adicionales del tumor para evaluar los marcadores sustitutos relacionados a continuación. El mismo día 0 (pretratamiento) se extrajo una muestra de suero para la determinación de las concentraciones de referencia de inhibina, estrógeno, progesterona, FSH, LH y de la subunidad beta de hCG. La muestra de suero, como era el caso para todos los sueros posteriores, procedía de la muestra de sangre y se congeló inmediatamente a -70ºC hasta el día del envío al laboratorio de investigación. Las demás muestras de suero se extrajeron los días 5, 9 y 13. El día 15 del tratamiento con hCG la paciente se sometió a intervención quirúrgica, que consistía en la mastectomía cuando se consideró que la masa tumoral (incluyendo los componentes "in situ") era mayor de 3 cm; sino se conservaba la mama y se realizaba una mastectomía parcial. La conservación del pecho se practicó solamente cuando los márgenes quirúrgicos estaban libres de enfermedad. Se realizó de manera rutinaria la disección del ganglio linfático de la axila. Todos los tejidos ectomizados se enviaron al laboratorio de patología para su examen microscópico.

Tras la intervención quirúrgica los pacientes se sometieron a tratamiento adyuvante. Éste consistía en 20 mg al día de Tamoxifeno cuando el tumor era mayor de 3 cm o estaban presentes ganglios linfáticos patológicos. Las terapias hormonales adyuvantes se continuaron normalmente durante 5 años. Se realizó radiación posquirúrgica en aquellos casos en los que se conservaba la mama, cuando los márgenes de ectomización de la pared de la mama eran positivos, o cuando los tumores estaban localizados centralmente. Se irradió la mama hasta 50 Gray en 25 fracciones de 2 Gray. El centro del tumor primario se reforzó hasta 66 Gray. Los ganglios linfáticos subclaviculares y la pared de la mama recibió una dosis de 46 Gray en 23 fracciones de 2 Gray. Cada semana se administraron 5 fracciones. Después del tratamiento primario la paciente se sometió a observación cada tres meses en el examen clínico y el análisis de sangre. Anualmente, se realizó también un control radiológico. En caso de recaída en la enfermedad, se iniciaba el tratamiento de cáncer de mama recurrente.

Tratamiento hormonal: dosis y programa. Las pacientes seleccionadas para este estudio recibieron por vía intramuscular (IM) 10.000 unidades del fármaco experimental, gonadotropina coriónica recombinante humana los días 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13. El liofilizado se redisolvió con solución salina fisiológica normal inmediatamente antes de la inyección en el glúteo. Las referencias fueron a ciegas y recibieron inyecciones IM de placebo. En cada inyección las pacientes eran observadas y se les informaba acerca de su correspondiente medicación y de los posibles efectos secundarios. El tratamiento fue doble a ciegas con 20 series activas y 5 referencias. No estaba permitida ninguna modificación de la dosis. Cuando aparecían efectos secundarios o problemas clínicos correspondientes, se interrumpía el tratamiento como fue el caso en una paciente. Se valoró la eficacia del tratamiento evaluando en el tumor residual ectomizado por mastectomía parcial o total al final de la segunda semana del tratamiento con r-hCG los mismos parámetros evaluados en las biopsias por punción central iniciales.

Análisis del marcador indirecto. Se evaluaron los efectos de r-hCG sobre los tumores de mama utilizando inmunocitoquímica, realizado tanto en las biopsias de las partes centrales del tumor como en el tumor residual presente en las muestras de mastectomía parcial o total. Se evaluaron los siguientes marcadores indirectos utilizando inmunocitoquímica: tasa de proliferación celular, porcentaje de células positivas al estrógeno (ER) y receptores de progesterona (PgR) e inmunorreactividad a la inhibina. Se realizaron análisis microscópicos de estos marcadores indirectos seleccionando los fragmentos de tumor tan distantes como sea posible de los centros en los que se hayan realizado biopsias por punción a fin de evitar los efectos desorientadores producidos por cicatrización e inflamación. El estudio de los ganglios linfáticos de las mismas pacientes de las cuales se estudiaron los tumores primarios fue analizado también por las mismas técnicas.

Tratamiento del tejido del tumor de mama. Se realizó una biopsia de la parte central del tumor de mama en cada paciente seleccionada para este protocolo. Se congeló la biopsia de la parte central y fue analizada histológicamente por el histopatólogo. Si se practicaba el diagnóstico del carcinoma invasivo, se extraían tres núcleos adicionales en el momento del diagnóstico inicial. Los núcleos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% (NBF) para su análisis histopatológico e inmunocitoquímico. Las muestras quirúrgicas que contenían el tumor, es decir, las mastectomías parciales o totales, se fijaron en NBF y los fragmentos representativos del tumor residual y del tejido de mama normal distal al tumor se enviaron al laboratorio clínico. Los ganglios linfáticos que se observaban que eran positivos para la metástasis durante la disección axilar se fijaron en NBF, se empaparon en parafina, y se sometieron también bloques representativos de tejido. Cada muestra fue identificada con el número de prueba de la paciente, fecha en la que se extrajo la muestra y si era la biopsia por punción inicial del tumor o de tejido normal, o la muestra operativa final (segunda) consistente en tejido tumoral o normal. Las muestras de biopsia por punción y del tumor fijadas en formalina se enviaron al laboratorio clínico por correo urgente. Todas las muestras se identificaron a la llegada al laboratorio mediante el número de experimento (Exp. 721) y se les asignó sucesivamente un número de registro por la fecha de llegada. Todas las muestras se identificaban en cualquier momento por su número de registro; la identidad de la paciente y el tratamiento se daban a conocer únicamente después que se habían recogido todos los datos.

Estudios inmunocitoquímicos

Anticuerpos. Proliferación celular - anticuerpo monoclonal Ki67 (Oncogene Science, Inc., Cambridge, MA); receptor del estrógeno - anticuerpo receptor (ER) del estrógeno anti-humano monoclonal de ratón (clon ER1D5) (Amac Lab, Westbrook, ME) diluido 1:400; receptor de progesterona (PgR) - clon PR10A9 del anticuerpo monoclonal de ratón (Immunotech, Inc., Westbrook, ME); los anticuerpos policlonales de conejos producidos contra los péptidos sintéticos a y b de inhibina sintetizados en los Servicios del laboratorio de síntesis de proteínas se utilizaron a una dilución de 1:50.

Procedimientos. Secciones de tejido impregnadas en parafina se montaron en portaobjetos recubiertos con aminoalquilsilano, se desparafinaron, se rehidrataron y la peroxidasa endógena se enfrió con peróxido de hidrógeno al 2%. Después del bloqueo, se incubaron las secciones con los anticuerpos respectivos durante la noche, se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado anti-ratón de caballo (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Se utilizo el kit Vectastaina Elite ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) para conjugar y 3,3'-diaminobenzidina-HCl (DAB) para revelar los puntos inmunocitoquímicamente reactivos. Se utilizaron secciones incubadas con suero no inmune como referencias negativas. Todas las secciones se tiñeron ligeramente por contraste con hematoxilina. Se evaluó la proliferación celular por recuento del número de células que expresan al antígeno nuclear Ki67 en la parte externa del nucleolo y en el componente granular del núcleo. Se reguló la posibilidad de que variaciones intrapersonales puedan afectar los resultados evaluando las mismas muestras varias veces a ciegas. El estado del receptor esteroide se evaluó en varias secciones que habían reaccionado con los anticuerpos ER o PgR mediante un recuento del número de núcleos positivos a cada uno de los receptores. Los valores se expresaron en porcentaje de células positivas sobre el número total de células tumorales presentes en cada sección de tejido. Se evaluó la inmunotinción para inhibina mediante el examen de los portaobjetos en un microscopio de campo brillante y se clasificaron según la intensidad de la tinción marrón como negativa (-), poco positiva (+), positiva moderada (++) o muy positiva (+++). Se hicieron comparaciones entre los valores obtenidos en la primera biopsia y en los tejidos ectomizados después de 2 semanas de tratamiento con hCG.

Se detectó apoptosis en secciones de 5 mm de tejidos impregnados en parafina, fijados con formalina obtenidos como se describió anteriormente. Se identificaron núcleos de células apoptósicas utilizando el kit Apoptag (Oncor, Gaithersburg, MD). Se trataron en primer lugar las secciones con 20 mg/ml de proteinasa K en PBS durante 20 min. a temperatura ambiente, se enfriaron mediante H_{2}O_{2} al 0,002% durante 30 minutos, se equilibraron con tampón y se incubaron con desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) durante 20 a 40 min. Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron a continuación con tampón de terminación durante 30 min. a 37ºC y se incubaron con antidigoxigenina durante 30 min. a temperatura ambiente. Se desarrolló el color utilizando 3,3-dimetilaminobenceno al 0,05% en H_{2}O diluida al 0,01% con Tris-HCl (pH 7,5) y se tiñeron por contraste con Hematoxilina. El porcentaje de células positivas sobre el número total de células contadas representó el índice apoptósico.

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La evaluación de todas las reacciones inmunocitoquímicas fue realizada a ciegas por uno de los investigadores principales (JR), sin conocimiento del tipo de tratamiento recibido por los pacientes. Sólo una vez que todos los datos fueron recogidos y analizados, se dio a conocer la identidad y el tipo de tratamiento a fin de tabular los datos.

Evaluación de los efectos generalizados de r-hCG

Se evaluaron los efectos generalizados de este tratamiento hormonal determinando las concentraciones en el suero de las hormonas FSH y LH de la pituitaria y de las hormonas ováricas estrógeno, progesterona e inhibina como marcadores de la actividad de hCG. Se extrajeron de 26 pacientes diez ml de sangre los días 0, 5, 9 y 13 del tratamiento. Se separó inmediatamente el suero según el dibujo, se congeló a -80ºC y se identificaron las muestras con el número de ensayo de la paciente, la fecha y la secuencia de numeración en el tratamiento. Se enviaron por correo urgente los sueros desde Bélgica al laboratorio químico en nieve carbónica. Todas las muestras se identificaron a la llegada en el laboratorio mediante el número de experimento y un número de registro que se asignó sucesivamente por la fecha de llegada.

Las muestras de suero congeladas se enviaron al InterScience Institute (ISI), Inglewood, California, para la determinación cuantitativa por radioinmunoanálisis (RIA) de las concentraciones de las siguientes hormonas: subunidad beta de hCG, estradiol, progesterona, FSH; LH; e inhibina. La detección cuantitativa de beta-hCG fue confirmada por SmithKline-Beechman Clinical Laboratories en Filadelfia, PA.

Resultados

De los veinticinco pacientes registrados en este estudio pudieron completarse los análisis histopatológicos e inmunocitoquímicos en 22 de los pacientes. Los tejidos de tres pacientes no eran adecuados para el análisis porque la cantidad de tumor era insuficiente o no se conservó de manera apropiada para la determinación inmunocitoquímica de la proliferación celular, receptores de esteroides o inhibina.

Proliferación celular. La detección inmunocitoquímica de Ki67 puso de manifiesto que al principio del tratamiento no hubo una variación significativa de la tasa de proliferación celular entre las pacientes, como se muestra en los datos de la biopsia por punción (NB). Los tumores extirpados tras el tratamiento con r-hCG presentaban valores significativamente disminuidos, con pequeñas variaciones interpersonales, mientras que en los pacientes que recibieron el placebo los tumores presentaban una tasa de proliferación celular casi idéntica a los valores iniciales. La reducción de la proliferación celular fue significativa (p<0,00006) (Fig. 1) en 17 de las 18 pacientes que recibieron el tratamiento de r-hCG. En nueve pacientes tratadas con r-hCG los ganglios linfáticos que se observaron que eran positivos en el momento de la intervención quirúrgica estaban disponibles para su análisis. En estos ganglios las células metastásicas presentaban una tasa de proliferación celular en el mismo intervalo que el tumor primario estirpado en la intervención quirúrgica, y significativamente menor que en la biopsia por punción. Los ganglios linfáticos positivos en un paciente tratado con placebo presentaron la misma tasa de proliferación celular que la NB y la Exc.B. Las células metastásicas de carcinoma en los ganglios linfáticos presentaban una tasa de proliferación celular notablemente inferior que los centros germinales, que contenían numerosas células positivas a Ki67.

Para determinar si el efecto del tratamiento con r-hCG sobre la proliferación celular no estaba enmascarado o alterado por el traumatismo local producido por la biopsia de la parte central, los investigadores han realizado experimentos piloto para validar la utilización de las biopsias de la parte central de mama para determinar los los puntos finales indirectos de la proliferación celular en colaboración con el Dr. Ingemar Persson, del departamento de epidemiología del cáncer, Universidad de Uppsala, Suecia. Se diseño un estudio piloto con el fin de validar los datos en la morfología de mama normal y en la proliferación celular observada en las biopsias de la parte central de la misma obtenidas utilizando una pistola ajustada con una aguja del calibre 18 por comparación con los mismos parámetros medidos en muestras grandes obtenidas por mamoplastia de reducción. Se realizaron biopsias de la parte central en cuatro pacientes. Cada biopsia mídió aproximadamente 2 cm. de longitud por 0,2 cm de diámetro. El material se fijó en formalina tamponada, impregnando en parafina y se tiñó con hematoxilina y eosina y se hizo reaccionar frente a Ki67, un marcador de proliferación. Los investigadores observaron las mismas estructuras lobulares presentes en la biopsia de la parte central que se observaron también en la muestra quirúrgica. La actividad proliferante no fue estadísticamente diferente en las células de la biopsia de la parte central que en las muestras de la mamoplastia de reducción (observaciones no publicadas). Estos datos fueron confirmados en el presente estudio en el que los valores de la proliferación celular detectados en la muestra de la mastectomía fueron similares a los detectados en los ganglios linfáticos diseccionados. En conjunto, estos datos preliminares permitieron a los investigadores regular la posibilidad de que el efecto de r-hCG pueda haber sido inducido por la manipulación local y no por la hormona administrada.

Receptor de estrógeno y progesterona. Se consideró que la expresión inmunocitoquímica de ER era positiva cuando más del 20% de las células tumorales expresaban una reacción nuclear positiva para este receptor. Basándose en este concepto, se observó que en seis casos el tratamiento con r-hCG producía una disminución en el estado ER desde una NB positiva hasta una Exc.B negativa (Fig. 2). La metástasis del ganglio linfático de estos pacientes presentaba un nivel similar de ER, excepto en dos casos que expresaba un contenido de ER similar al de la biopsia inicial. Ninguno de los grupos tratados con placebo presentó cambios en el contenido de su receptor entre la biopsia inicial y la muestra después del tratamiento.

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El contenido de PgR se consideró también que era positivo cuando más del 20% de las células tumorales eran positivas a este anticuerpo. En seis de los casos en los que la NB inicial era positiva se volvió negativa a PgR después del tratamiento. En aquellos casos en los que la biopsia inicial era negativa, la biopsia por escisión después del tratamiento fue también negativa. En cinco de los casos en los que la NB fue positiva, las metástasis en el ganglio linfático fueron negativas a PgR. Los pacientes tratados con placebo no presentaron cambios en el estado PgR de sus tumores. La Figura 2 representa los valores de las células positivas a ER y a PR, respectivamente, expresados en porcentajes.

Inmunotinción para inhibina. En nueve de las dieciocho pacientes de cáncer de mama primario que recibieron r-hCG se observó un aumento significativo de la inmunorreactividad en las células neoplásicas. Este efecto no se observó en las muestras de tejido de pacientes que recibieron el placebo.

Perfil hormonal. Se midieron las concentraciones de las seis hormonas en el suero de pacientes de cáncer de mama tratadas con r-hCG o placebo. Existía una diferencia significativa en las concentraciones de b-hCg detectadas en el suero de pacientes tratadas conr-hCG sobre las que recibieron el placebo los días de tratamiento 5, 9 y 13 (p<0,0001, P<0,004 y p<0,007), respectivamente. No hubo ningún aumento estadísticamente significativo en la concentración de LH en la r-hCG sobre los pacientes tratados con placebo en ninguno de los puntos de tiempo muestreados. Ni los tratamientos con r-hCG ni con placebo modificaron las concentraciones de FSH, estradiol, inhibina y progesterona.

Conclusiones

En el presente trabajo los investigadores han demostrado que un tratamiento de 2 semanas con r-hCG administrada como se describió anteriormente a mujeres posmenopáusicas con cáncer de mama primario recién diagnosticado produce una reducción notable y significativa de la proliferación celular en el tumor principal. Una observación interesante fue que los ganglios linfáticos de los mismos pacientes presentaban en las células metastásicas un nivel de proliferación celular similar al de los tumores después del tratamiento con r-hCG, pero no se observaron cambios en las mujeres tratadas con placebo.

El tratamiento con hCG recombinante produjo regulación por disminución de la expresión de ER^{-} y de PgR en seis de cada nueve y seis de cada diez casos positivos, respectivamente. r-hCG no modificó las concentraciones en el suero de estradiol, progesterona, inhibina, FSH o LH, y los valores detectados fueron los descritos para las mujeres menopáusicas. r-hCG no produjo efectos secundarios clínicos en las pacientes ni alteraciones en su medio hormonal. Estas observaciones son la primera indicación de que r-hCG presenta un efecto antiproliferante en los cánceres de mama primarios y metastásicos sin producir alteraciones en el buen estado general de la paciente. Los datos publicados en este trabajo indican que r-hCG presenta un efecto directo sobre las células neoplásicas y que las hormonas de los ovarios no median en este efecto. Los pacientes son mujeres posmenopáusicas en las que el medio hormonal demuestra claramente que no fue afectado después de la administración de r-hCG.

La producción local de inhibina por las células neoplásicas fue sobreexpresada en el el 50% de las lesiones primarias de mama de pacientes tratadas con r-hCG. Debido a las limitaciones de la cuantificación por los positivos, los investigadores han publicado solamente aquellos en los que se observaron diferencias significativas. El análisis de transferencia Western sería deseable para una evaluación cuantitativa de este marcador.

En el contexto general, la única hormona que fue exaltada por el tratamiento con r-hCG fue la b-hCG. La correlación entre la disminución de la proliferación celular y el aumento de la concentración de b-hCG fue notable.

Ejemplo 2 La gonadotropina coriónica recombinante humana inhibe el cáncer de mama metastásico en mujeres posmenopáusicas

Se realizó un único estudio en el centro, con etiqueta abierta para probar el efecto inhibidor de la gonadotropina coriónica humana recombinante (r-hCG) sobre el cáncer metastásico de mama en mujeres posmenopáusicas. El objetivo principal de este estudio consistió en evaluar el efecto de r-hCG sobre la tasa de respuesta tumoral de lesiones mensurables en dos dimensiones o palpables. Los objetivos secundarios fueron: i.) evaluar el efecto del tratamiento con r-hCG sobre los síntomas producidos por lesiones de tumor metastásico de mama, ii.) determinar si r-hCG ejerce algún efecto generalizado adverso, iii.) medir el tiempo para la evolución del tumor y, iv.) determinar los efectos de r-hCG sobre los parámetros endocrinológicos y los marcadores tumorales.

Se ingresaron en el estudio trece mujeres menopáusicas diagnosticadas de cáncer de mama probado por biopsia y pruebas clínicas de enfermedad metastásica. Se tratan las pacientes con 500 mcg de r-hCG tres veces a la semana durante al menos dos meses. La evaluación del tumor y la medición de las lesiones del indicador diana se realizan cada dos meses por rayos X, exploración por CT, MRI o examen físico. Después de 60 días de tratamiento, se realiza una reevaluación de lesiones metastásicas utilizando el/los mismo(s) procedimiento(s) de diagnóstico. En el caso de evolución de la enfermedad (es decir, aparición de nuevo tumor o crecimiento de las lesiones del indicador en al menos el 25% en dimensiones cuadradas) se interrumpe el tratamiento en estudio, de otro modo, se interrumpe el tratamiento, con reevaluaciones del paciente cada ocho semanas, hasta que se note la evolución de la enfermedad.

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Una paciente murió debido a complicaciones del cáncer de mama antes de la visita del día 60, doce pacientes completaron la visita del día 60. De estas 12, cuatro pacientes se retiraron debido a la evolución de la enfermedad y ocho pacientes permanecen en tratamiento activo en la fase de mantenimiento del estudio (Fig. 3). Dos pacientes se han clasificado como respuestas parciales, sobre la base de más del 50% de reducción en la metástasis del hígado. Seis de las trece pacientes presentaron enfermedad estable.

Estos primeros datos clínicos demuestran que hCG es eficaz en el tratamiento de los tumores de mama metastásicos en mujeres posmenopáusicas.

Ejemplo 3 La gonadotropina coriónica humana protege contra la inhibición del tumor e inhibe el crecimiento del tumor en ratas en las etapas inicial y última del desarrollo del tumor

Una vez demostrada químicamente la eficacia de hCG en el tratamiento de tumores de mama primarios y metastásicos en mujeres posmenopáusicas, los inventores pretendieron extender y clarificar sus observaciones mediante la utilización de un sistema de modelo animal demostrado. Los resultados experimentales indicados en este ejemplo demuestran en el sistema de modelo de rata que la gonadotropina coriónica humana recombinante (u-hCG o r-hCG) presenta un efecto protector contra el desarrollo del cáncer de mama, y un efecto terapéutico contra los tumores de mama en la etapa inicial y última.

Protocolo experimental y procedimientos

Evaluación de la eficacia de r-hCG en la prevención del cáncer de mama. Los regímenes 1 a 9 utilizados en los experimentos descritos a continuación se presentan esquemáticamente en la Figura 4. Los animales utilizados en los Regímenes 1 a 9 consistían en 450 ratas Sprague-Dawley vírgenes sanas que se adquirieron en Taconic Farms (Nueva York, NY).

El potencial de hCG para inhibir la iniciación de carcinomas de mama de rata provocados por DMBA se evaluó en las ratas vírgenes sanas tratadas con placebo (Régimen 1); 100 UI de r-hCG/día (Régimen 2), o 100 UI de u-hCG/día (Régimen 3). Se inyectaron a diario todos los animales durante 21 días, comenzando cuando las ratas tenían 45 días. El carcinógeno DMBA se administró en una sola dosis intragástrica (8 mg/100 g de peso corporal) administrada 21 días después de la última inyección de placebo u hormona. En estos protocolos el primer efecto evaluado fue la aparición de tumores detectados por palpación y su localización con respecto a las glándulas mamarias específicas. Otros parámetros evaluados fueron el ritmo de crecimiento del tumor, la ulceración del tumor y la regresión del tumor o la cicatrización de la úlcera y la necrosis tumoral en respuesta al tratamiento hormonal. Estos resultados se correlacionaron con el nivel de referencia de diferenciación del parénquima de mama, ritmo de proliferación celular, nivel de expresión de los genes que controlan la muerte celular programada, ritmo de apoptosis y síntesis de inhibina en el epitelio mamario en el momento de la administración del carcinógeno.

Evaluación de la eficacia terapéutica de r-hCG en el cáncer de mama. Se determinó la eficacia tumorestática y tumoricida de r-hCG y u-hCG en el cáncer de mama precoz y avanzado en ratas vírgenes sanas que habían recibido una sola dosis de DMBA cuando tenían 45 días (Figura 4, Regímenes 4 a 9). El efecto sobre el desarrollo del tumor precoz se determinó en los Regímenes 4, 5 y 6. Se evaluó iniciando el tratamiento con r-hCG 20 días después de la administración de DMBA, cuando las lesiones precoces, tales como las proliferaciones intracanaliculares (IDP) y los carcinomas in situ (CIS) están ya presentes, pero no hay tumores palpables todavía. Se evaluó el efecto del desarrollo del tumor avanzado comenzando el tratamiento hormonal 60 días después de la administración de DMBA o cuando los tumores palpables habían alcanzado al menos 1 cm de diámetro máximo (Regímenes 7, 8 y 9). En ambos grupos se administró la hormona durante 40 días y se evaluó la respuesta tumorígena final 20 semanas después de la administración de DMBA. El efecto del tratamiento hormonal sobre el ritmo de crecimiento del tumor, con especial énfasis en la regresión del tumor, ausencia de ulceración de la piel y tamaño del tumor final y la necrosis se evaluaron en el momento de la evaluación de la respuesta tumorígena final. Estos resultados se correlacionaron con el ritmo de la proliferación celular, expresión de la síntesis de inhibina, contenido del receptor de estrógenos y progestina, expresión de los genes de la muerte celular programada y de la apoptosis en los tumores desarrollados por los animales tratados por r-hCG y u-hCG en comparación con los desarrollados por las ratas que recibieron el placebo.

Todos los tratamientos se iniciaron cuando los animales tenían 45 días. Durante el Régimen 1 cincuenta ratas recibieron una inyección intraperitoneal (ip) diaria de 0,5 ml de placebo durante 21 días. En los Regímenes 2 y 3 el mismo número de animales recibieron durante 21 días 100 UI/días de r-hCG o de u-hCG (Steris Laboratories, Phoenix, AZ) respectivamente. Veintiún días después de la terminación de la última inyección, cuando los animales tenían 87 días, los tres grupos de animales se inocularon con una sola dosis intragástrica (ig) de 8 mg de DMBA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) por 100 g de peso corporal (bw). Después todos los animales se palparon periódicamente para la detección del desarrollo del tumor y la determinación del ritmo de crecimiento del tumor. La respuesta tumorígena final se evaluó 15 semanas después de la administración de DMBA.

Durante los Regímenes 4 a 9, se inocularon 300 animales con una sola dosis ig de 8 mg de DMBA/100 g bw cuando tenían 45 días. Se evaluó la respuesta tumorígena por palpación de las áreas cervical mamaria derecha e izquierda, torácica, abdominal e inguinal y las extensiones desde la ventral hasta la dorsolateral de las glándulas. Todos los tumores se numeraron sucesivamente en el orden en que habían aparecido, se registró su posición y se determinó el ritmo de crecimiento del tumor midiendo el tamaño del tumor con un calibre Vernier. Se registraron todos los cambios en el estado de salud de los animales, el crecimiento rápido del tumor o la ulceración de la piel. Aquellos animales en los que los tumores eran excesivamente grandes o se volvieron ulcerosos se les practicó la eutanasia, independientemente del estado del tratamiento hormonal, en cumplimiento con las normas de la IACUC. Aquellos animales a los que se les practicó la eutanasia antes del inicio o antes de la terminación de los tratamientos hormonales fueron eliminados de los análisis estadísticos de la respuesta tumorígena final.

Se diseñaron los Regímenes 4 a 6 para probar el efecto de los tratamientos hormonales sobre el desarrollo tumoral precoz. Veintiún días después de la administración de DMBA los animales asignados al Régimen 4 comenzaron recibiendo una inyección ip diaria de 0,5 ml de placebo durante 40 días. En los Regímenes 5 y 6 el mismo número de animales recibieron durante 40 días 100 UI/día de r-hCG o u-hCG, respectivamente. Todos los animales se palparon dos veces a la semana para la detección del desarrollo del tumor y la determinación del ritmo de crecimiento del tumor. La respuesta tumorígena final se evaluó 20 semanas después de la administración de DMBA.

Los Regímenes 7 a 9 demostraron los efectos de r-hCG y u-hCG sobre el desarrollo del tumor tardío (palpable): Sesenta días después de la inoculación de DMBA, cuando las ratas tenían 105 días, los animales asignados al Régimen 7 comenzaron recibiendo una inyección ip diaria de 100 UI/día de r-hCG durante 40 días. En los Regímenes 8 y 9 el mismo número de animales recibieron durante 40 días 100 UI/día de u-hCG o de 0,5 ml de placebo, respectivamente. La respuesta tumorígena se evaluó dos veces a la semana por palpación. Todos los tumores se numeraron sucesivamente, se registró su posición y el ritmo de crecimiento del tumor se determinó mediante la medición del tamaño del tumor con un calibre Vernier. La respuesta tumorígena final se evaluó 20 semanas después de la administración de DMBA.

Evaluación de la respuesta tumorígena final. Al final del experimento se anestesiaron todos los animales con una inyección ip de Ketamina (90 mg/kg bw)-Nembutal (40 mg/kg bw), se extrajo sangre de la vena cava inferior y se separó el suero y se mantuvo congelado a -70ºC. Los tumores se diseccionaron rápidamente, se midieron en tres dimensiones y se hicieron secciones en serie. Las secciones adyacentes fueron:

1)

fijadas en formalina tamponada neutra (NBF) al 10% para análisis histopatológico e inmunocitoquímico,

2)

congeladas en nitrógeno líquido para la extracción del ARN,

3)

congeladas en nitrógeno líquido para las determinaciones de receptor de estrógeno (ER) - receptor de progesterona (PR), y

4)

colocadas en medio de cultivo esterilizado para el análisis del ADN por citometría de flujo.

Los tumores que eran menores de 1 cm de diámetro se fijaron en NBF al 10% únicamente. En ausencia de tumores las glándulas mamarias torácica derecha (2ª y 3ª) y la abdominal derecha (4ª) se fijaron en NBF al 10% para la evaluación histopatológica del grado de desarrollo de la glándula. Se disecaron los ovarios derecho e izquierdo de todos los animales, se midieron en tres dimensiones con un calibrador Vernier y se fijaron en NBF al 10%. Todos los órganos internos se examinaron para pruebas de ganglios metatásicos, adherencias o hemorragias. Se documentaron los cambios en el hígado, bazo y pulmones y fragmentos representativos de los tejidos se fijaron en NBF al 10% para su examen histopatológico. Se fotografiaron las lesiones representativas.

Se utilizaron los siguientes criterios para evaluar la respuesta tumorígena final:

1. Ritmo de crecimiento del tumor, basado en la medición sucesiva de los dos diámetros mayores de los tumores en animales vivos utilizando un calibrador Vernier y expresando los resultados en mm.

2. Tamaño final del tumor, basado en la medición de la longitud, anchura y altura de los tumores disecados con un calibrador Vernier. Los resultados se expresaron en mm. Un tamaño del tumor progresivamente más pequeño en las mediciones sucesivas era indicativo de la regresión del tumor. Los tumores palpables que habían desaparecido en el momento de la disección se consideraron que presentaban una regresión del 100%. El tejido mamario en el que el tumor se había identificado originalmente se fijó en NBF al 10% para el análisis histopatológico. Este criterio era indicativo de un efecto inhibidor de los tratamientos hormonales en el crecimiento del tumor.

3. Necrosis tumoral en tumores grandes palpables. Aun cuando en los animales tratados con hormonas los tumores mamarios conservaban su tamaño original o continuaban creciendo, en la disección los tumores se observaron que constaban de una formación quística blanda rellena de tejido necrótico en el que casi no existía tejido viable. Estos síntomas se interpretaron que eran indicativos de la destrucción del tumor inducida por el tratamiento hormonal, y equivalente a la regresión tumoral inducida por el tratamiento con hCG.

4. Presencia de ulceración de la piel en animales vivos, indicativo del ritmo rápido de crecimiento del tumor, más frecuentemente localizado en los animales tratados con placebo. Este estado es obligatorio para practicar la eutanasia a los animales.

5. Análisis estadístico. La significación de las diferencias en la respuesta tumorígena entre los grupos se determinó por el análisis de ji al cuadrado y la prueba de la T de Student.

Resultados

Efecto de r-hCG y u-hCG en la prevención del cáncer de mama - Regímenes 1, 2 y 3. Ratas vírgenes tratadas con placebo, r-hCG o u-hCG durante 21 días y que recibieron DMBA 21 días después de la última inyección cuando tenían 87 días, aparecieron sanas a lo largo de todo el estudio. Un animal del Régimen 1 y uno del Régimen 2 murieron como consecuencia de la reacción aguda a la anestesia y se eliminaron del estudio, reduciendo la población animal total a 49 en cada uno de estos dos regímenes. Ninguno de los animales requirió que se le practicara la eutanasia antes del final del experimento. La inmensa mayoría de los tumores se observaron en el momento de la autopsia y ninguno de ellos estaba ulcerado.

El tratamiento de los animales con hCG redujo significativamente el número de tumores en todas las glándulas mamarias y no se observaron tumores en la zona del cuello ni del oído (tumores del conducto del oído); el número de animales con tumores se redujo desde 22/49 (22 de los 49 animales totales) hasta 4/49 6/50, respectivamente, para r-hCG y u-hCG. Como se muestra en la Figura 5, el número de tumores por animal disminuyó también significativamente, desde 0,80 (placebo) hasta 0,10 (r-hCG) y 0,14 (u-hCG), respectivamente.

Efecto de r-hCG en el desarrollo precoz del tumor. Regímenes 4, 5 y 6. De los 50 animales inoculados con DMBA un animal del Régimen 4 y un animal del Régimen 5 murieron debido a la reacción aguda a la anestesia. El tratamiento de los restantes animales con placebo, r-hCG o u-hCG se inició 21 días después de la administración del carcinógeno (Fig. 4).

Diez de los 49 animales del Régimen 4 (placebo) habían desarrollado al menos un tumor palpable a los 42 días después de la administración de DMBA. Un animal que estaba gravemente enfermo y murió en el momento de la decimocuarta inyección de placebo se eliminó del análisis final. Dos animales que murieron 12 y 14 días después de la última inyección se incluyeron en el análisis final. Uno de éstos estaba exento de tumores y el otro presentaba tres tumores palpables.

Como se observó en los regímenes preventivos, el tratamiento de los animales con hCG redujo significativamente el número de tumores en las glándulas mamarias y en el tejido no mamario; el número de animales con tumores se redujo desde el 48/49 hasta el 38/49 ó 30/46, respectivamente, para r-hCG y u-hCG. Como se muestra en la Figura 5, el número de tumores por animal se redujo también significativamente, desde 5,6 (placebo) hasta 2,2 (r-hCG) y 1,9 (u-hCG), respectivamente.

Efecto de r-hCG en el desarrollo avanzado del tumor. Regímenes 7, 8 y 9. De los 50 animales inoculados con DMBA un animal del Régimen 7 murió durante la administración del carcinógeno y se le eliminó del estudio. Del análisis final de respuesta tumorígena se eliminaron también todos aquellos animales que se les tuvo que practicar la eutanasia debido al rápido crecimiento de la ulceración de los tumores antes de la terminación del tratamiento. Estos mismos criterios se aplicaron a los animales tratados con r-hCG (Régimen 7), u-hCG (Régimen 8) y placebo (Régimen 9).

En los animales tratados con placebo (Régimen 9) un total de 40 animales se les practicó la eutanasia después de la terminación del tratamiento y del seguimiento adecuado. Treinta y nueve de ellos presentaron un total de 229 tumores, con un promedio de 5,7 tumores por animal, en una distribución similar a la observada para los regímenes 1 a 6. Además dos animales presentaron ganglios metastásicos en el bazo, hígado y pulmón, que no estaban incluidos en la tabulación final de tumores.

En el grupo tratado con r-hCG (Régimen 7), un total de 37 animales cumplían los criterios de selección que estaban incluidos en el análisis final; 33 de ellos desarrollaron un total de 147 tumores, promediando 4,4 tumores por animal con tumores, o 3,9 tumores por número total de animales en situación de riesgo. Treinta y dos de los 36 animales tratados con u-hCG (Régimen 8) desarrollaron tumores, con un promedio de 3,2 tumores por animal.

Los resultados de los regímenes 1 a 9 se resumen en la Tabla 1 a continuación y se presentan en las Figuras 5 y 6.

TABLA 1 Compendio de la respuesta tumorígena en los animales tratados con placebo, Regímenes 1, 4 y 9; r-hCG, Regímenes 2, 5 y 7 o u-hCG, Regímenes 3, 6 y 8

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Conclusiones

Los resultados publicados anteriormente indican que la administración de hCG urinaria o recombinante a ratas jóvenes vírgenes impide el inicio e inhibe la evolución de los tumores inducidos por DMBA. Un tratamiento de 21 días con r-hCG produce un efecto preventivo, aún cuando el tratamiento se haya terminado 21 días antes de la administración del cancerígeno. Similares resultados se obtuvieron con u-hCG.

Los resultados también pusieron de manifiesto que el tratamiento con r-hCG de ratas inoculadas previamente con DMBA inhibía el desarrollo de lesiones mamarias precoces, ya que la iniciación el tratamiento hormonal 20 días después de la administración del carcinógeno redujo significativamente tanto la secuencia del tumor como la masa tumoral. Tanto r-hCG como u-hCG presentaron efectos inhibidores del tumor similares. Estos datos tienen una implicación clínica significativa, porque indican la utilidad de la utilización de este tratamiento hormonal en las lesiones precoces así como en las premalignas. Estos resultados demuestran que cuanto antes se comienza el tratamiento, más eficaz es el efecto terapéutico de estas hormonas.

Cuando los tratamientos hormonales se iniciaron 60 días después de la administración de DMBA, la masa tumoral, expresada como el número de tumores por animal, disminuyó también significativamente. La Figura 6 demuestra claramente que tanto r-hCG como u-hCG reducen significativamente la masa tumoral y reducen el crecimiento de los tumores, como se demuestra por el número menor de tumores por animal después del cese de los tratamientos hormonales. El análisis de la respuesta tumorígena final demostró que los animales tratados con placebo presentaban 40% más tumores que los tratados con una de las dos hormonas (Fig. 5). Es importante analizar la pendiente de la curva entre el inicio (comienzo) y finalización (terminación) del tratamiento mostrado en la Figura 6. Ambas hormonas inducen una inclinación en la pendiente de la curva debido al efecto directo de las hormonas sobre la tumorigénesis. Al final del tratamiento la pendiente de la curva se hizo más pronunciada, pero nunca alcanzó la de los animales que habían recibido el placebo, una indicación de que ambas hormonas presentan un efecto terapéutico eficaz al reducir la carga tumoral en el 40%. Estos resultados sugieren que r-hCG sería más eficaz como herramienta terapéutica cuando se utilice no solamente en un ciclo sino probablemente en múltiples ciclos de tratamiento a fin de ser completamente curativa.

Ejemplo 4 Inhibición de las células de cáncer de mama por hCG y Tamoxifeno in vitro

Se realizaron experimentos preliminares in vitro en células CG-5, una variante de la línea celular MCF-7 (Natoli C. et al., 1983, Breast Cancer Res. Treat. 3:23-32) caracterizada por un alto grado de sensibilidad del estrógeno y un contenido apreciable de estrógeno, andrógeno, glucocorticoides y receptores de progesterona.

Protocolo experimental y procedimientos

Se cultivaron células de forma rutinaria en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero de ternero fetal (FCS) al 10% y antibióticos. Para los experimentos de crecimiento celular, se colocaron las células en placas a la densidad de 50.000 células/ml en el medio descrito anteriormente. Veinticuatro horas después, se sustituyó el medio por medio reciente que contenía FCS tratado con carbón activo al 5% (CH-FCS) más una concentración fija (10^{-7} M) de Tamoxifeno (TAM) y varias concentraciones (desde 10 a 10.000 UI/ml) de hCG. El medio se renovó cada 3 días. En los experimentos que se refieren al efecto de hCG y TAM sumados sucesivamente a las células CG-5, se colocaron las células en placas a razón de 50.000 células/ml como se describió anteriormente, y 24 horas después se cambió el DMEM por medio reciente que contenía 10 a 10.000 UI/ml de hCG. Para cada concentración de hCG, se prepararon un número diferente de placas para tener un número suficiente de células que deben sustituirse al final del tratamiento (ya que hCG presenta un efecto inhibidor propio). Después de 1 semana de exposición a hCG, se colocaron las células CG-5 en placas en medio enriquecido con FCS al 10% y antibióticos, y 24 horas después se sustituyó el DMEM por medio reciente enriquecido con CE-FCS al 5% y una concentración fija de TAM (10^{-7} M). El medio se renovó cada 3 días. En todos los experimentos realizados se hizo el recuento de células, después de 3 a 6 días, mediante la utilización de un hemocitómetro.

Resultados

La adición simultánea a los cultivos de CG-5 de una concentración fija de TAM (10^{-7} M) combinada con las concentraciones que oscilan entre 10 y 1.000 UI/ml de hCG, produce una inhibición de la proliferación celular que no está relacionada con la dosis de hCG pero es mayor que la inducida por TAM solo. A la concentración inferior de hCG, la inhibición de la proliferación celular fue aproximadamente del 50% con respecto a la referencia el tercer día desde la adición de los dos fármacos al medio de cultivo. Cuando se tratan las células durante 6 días con la combinación TAM-hCG, la inhibición de la proliferación celular se hace dependiente de la dosis de hCG y alcanza el 65% con respecto a las referencias a 1.000 UI/ml de fármaco.

Las células CG-5 fueron pretratadas también con diferentes concentraciones de hCG y posteriormente expuestas a TAM 10^{-7} M. El tercer día después de la adición del antiestrógeno al medio de cultivo, una inhibición de aproximadamente el 50% de la proliferación celular con respecto a la referencia se observa en las células que han recibido la concentración mayor de hCG. El sexto día después de la adición de TAM al medio de cultivo, se obtiene la inhibición más pronunciada de la proliferación celular en las células CG-S con una concentración menor de hCG (aproximadamente el 65% con respecto a la referencia) y permanece inalterada en las células pretratadas con dosis crecientes de fármaco.

Los resultados se resumen en la Figura 7a y 7b, que ilustran gráficamente la comparación entres las diferentes modalidades (tratamiento combinado o sucesivo) utilizado para estudiar el efecto del Tamoxifeno y de hCG en el crecimiento celular. Los gráficos a y b demuestran el efecto de hCG y del Tamoxifeno añadido simultáneamente (símbolo de punto grande) o sucesivamente (símbolo triangular) a las células CG-5 al tercer (a) y sexto (b) día de la adición de los compuestos al medio de cultivo. En el caso de la administración sucesiva, las células se pretrataron con la concentración de hCG indicada en la figura y a continuación se expusieron a Tamoxifeno. La línea de puntos (- - -) representa el efecto de Tamoxifeno 10^{-7} M solo, evaluado en experimentos en paralelo no publicados en el texto.

La Figura 8 presenta el efecto de hCG solo en el crecimiento de las células CG-5 cultivadas en condiciones experimentales idénticas. En este caso la inhibición de la proliferación celular es evidente después de tres días de exposición a la hCG partiendo de la concentración de 100 UI/ml. Después de seis días de tratamiento con hCG, el efecto inhibidor sobre la proliferación celular aumenta significativamente sólo a la dosis máxima de 1.000 UI/ml.

La comparación entre las Figuras 7 y 8 demuestra claramente que dichas dosis bajas de hCG como 10 UI/ml son eficaces cuando se combinan con el antiestrógeno, mientras que las mismas dosis son prácticamente ineficaces si hCG se utiliza sola. Similares conclusiones se alcanzan si el efecto de Tamoxifeno solo, se compara con el efecto combinado de Tamoxifeno con hCG.

Claims (35)

1. Utilización de hCG para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores de mama clínicamente manifiestos, en la que el tumor de mama clínicamente manifiesto es un tumor de mama metastásico.

2. Utilización según la reivindicación 1, para el tratamiento de tumores de mama en mujeres premenopáusicas o posmenopáusicas.

3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que hCG se utiliza como adyuvante en combinación con al menos otra terapia del cáncer.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que la otra terapia del cáncer es la cirugía o la quimioterapia.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las células tumorales tratadas son positivas al receptor del estrógeno.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que hCG se utiliza en combinación con un antiestrógeno.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que hCG se utiliza simultánea, sucesiva o independientemente con el antiestrógeno.

8. Utilización según la reivindicación 6 ó 7, en la que el antiestrógeno es Tamoxifeno.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que el Tamoxifeno debe administrarse por vía oral en una cantidad diaria de aproximadamente 30 mg.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que hCG debe administrarse en una cantidad de 100 a 20.000 UI por paciente al día.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que hCG debe administrarse en una cantidad de 50 a 10.000 microgramos por paciente al día.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que hCG debe administrarse en una cantidad de 250 a 3.000 microgramos por paciente al día.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que hCG debe administrarse cada dos días.

14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que hCG debe administrarse tres veces a la semana.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que hCG debe administrarse durante varias semanas.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que hCG debe administrarse durante al menos 12 semanas.

17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que hCG debe administrarse por vía subcutánea.

18. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la utilización de interferón de tipo 1 en combinación con hCG y antiestrógeno.

19. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que hCG es hcg recombinante.

20. Utilización de una proteína seleccionada del grupo consistente en LH, LH recombinante, moléculas de fusión de LH, moléculas de fusión de TSH y moléculas de fusión de FSH, habiéndose modificado la subunidad beta de las moléculas de fusión de modo que la molécula de fusión resultante presenta un comportamiento similar a hCG, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de tumores de mama clínicamente manifiestos, en la que el tumor de mama clínicamente manifiesto es un tumor de mama metastásico.

21. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente activa de hCG, en presencia de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, y un antiestrógeno, para la utilización simultánea, sucesiva o por separado destinada al tratamiento del cáncer de mama.

22. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente activa de una proteína seleccionada del grupo consistente en LH, LH recombinante, moléculas de fusión de LH, moléculas de fusión de TSH y moléculas de fusión de FSH, habiéndose modificado la subunidad beta de las moléculas de fusión de modo que la molécula de fusión resultante presenta un comportamiento similar a hCG, en presencia de uno o más excipientes aceptables, y de un antiestrógeno, para la utilización simultánea, sucesiva o por separado destinada al tratamiento del cáncer de mama.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, en la que hCG se administra en una cantidad de 100 a 20.000 UI por paciente al día.

24. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 o 23, en la que hCG se administra en una cantidad de 50 a 50.000 microgramos por paciente al día.

25. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 21 o 23 a 24, en la que hCG se administra en una cantidad de 250 a 3.000 microgramos por paciente al día.

26. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 o 23 a 25, en la que hCG se administra cada dos días.

27. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 o 23 a 25, en la que hCG se administra tres veces a la semana.

28. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 o 23 a 27, en la que hCG se administra durante varias semanas.

29. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 o 23 a 28, en la que hCG se administra durante al menos 12 semanas.

30. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 o 23 a 29, en la que hCG se administra por vía subcutánea.

31. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 21 o 23 a 30, en la que el antiestrógeno es Tamoxifeno.

32. La composición farmacéutica de la reivindicación 31, en la que el Tamoxifeno se administra por vía oral en una cantidad diaria de aproximadamente 30 miligramos.

33. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 21 o 23 a 32, que se utiliza en combinación con un interferón de tipo 1.

34. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 21 o 23 a 33, en la que hCG es un hCG recombinante.

35. Un artículo de preparación que contiene un recipiente en el que está contenida una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 34, y que comprende una etiqueta que explica la utilización de la composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer de mama.