ES2277598T3 - Derivados marcados de acido ascorbico. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de formula: en la que: X1 es OH o SH o NH2 o -L-Z; X2 y X3 son iguales o diferentes y cada uno es H, alquilo C1-4, fluoroalquilo C1-4, bencilo, un grupo protector o -L-Z; X4 es H o alquilo C1-4; L es un enlazante que comprenden una cadena de 0-10 átomos; Z es un grupo que comprende un resto que se puede detectar; con la condición de que dicho compuesto comprenda al menos un resto que se puede detectar, en el que dicho resto que se puede detectar es una sustancia adecuada para diagnóstico por imagen tras administración a un ser humano, seleccionado entre: (i). emisores gamma, (ii). emisores beta (iii). emisores de rayos x de baja energía (iv). átomos hiperpolarizados (v). restos paramagnéticos, (vi). restos radioopacos, o (vii). agentes de contraste por ultrasonidos; con la condición de que cuando el resto que se puede detectar es un metal radioactivo o paramagnético, el metal se compleja con un ligando que se enlaza fuertemente con el metal, y se enlaza al resto de ácido ascórbico.
Description
Derivados marcados de ácido ascórbico.
La presente invención se refiere a un tipo de
compuestos útiles en el diagnóstico o radioterapia de una enfermedad
ósea metastásica, las formulaciones farmacéuticas que los contienen,
a su uso en el diagnóstico de la enfermedad y en monitorizar la
progresión y tratamiento de la enfermedad, y a los procedimientos
para su preparación.
El hueso es un lugar habitual para la enfermedad
metastásico, aproximadamente el 70-80% de los
cánceres de mama y próstata presenten metástasis hacia los huesos.
Los cánceres de pulmón, tiroides, riñón y vejiga igualmente
presenten metástasis hacia los huesos. La respuesta osteoblástica
detectada en un examen del hueso es una respuesta secundaria. Los
osteoblastos son células productoras de hueso que están implicadas
en la patología asociada con la enfermedad metastásico ósea. Los
osteoblastos activados producen grandes cantidades de colágeno que,
además de su papel estructural, es import ante para la
diferenciación de osteoblastos.
El diagnóstico de la enfermedad metastásica ósea
se puede realizar mediante uno de cuatro procedimientos
-radiografía, escáner CT, examen radioisotópico del hueso o MRI. El
examen radioisotópico del hueso ha sido el procedimiento inicial de
diagnóstico por imagen convencional en los últimos 25 años. El
trazador habitual en exámenes óseos es
^{99}Tc-metileno difosfonato
(^{99}Tc-MDP). También se pueden usar
^{99}Tc-HMDP (hidroximetilenodifosfonato) y
^{99}Tc-HEDP
(1-hidroxietil-1,1-difosfonato).
Estos agentes tienen similares características, en grueso. Se
inyectan aproximadamente 550-750 MBq
(15-20 mCi) y se produce en un intervalo de 2 horas
la elevada recaptación por el hueso (30-50% de la
dosis inyectada). Los escáneres se llevan a cabo a
3-4 h tras la administración del agente, dada su
desaparición de la sangre y los tejidos. El diagnóstico por imagen
del cuerpo completo (anterior/posterior) con tiempos de adquisición
de 20-30 min produce imágenes de alta calidad, buena
resolución, y elevada sensibilidad/especi-
ficidad.
ficidad.
El ^{99}Tc-MDP se absorbe
sobre el calcio del hidroxiapatito en el hueso. Influyen en el
procedimiento los niveles de actividad osteoblástica y la
vascularidad esquelética. Hay una recaptación preferente en los
lugares de formación activa del hueso, y a.C. cantidad de
acumulación es sensible al nivel de flujo sanguíneo. El escáner del
hueso refleja por tanto la reacción metabólica del hueso la proceso
de la enfermedad, sin tener en cuenta si la actividad metabólica es
de naturaleza neoplásica, traumática o inflamatoria. Así, el
trazador se acumula en cualquier sitio de elevado reemplazo óseo, y
por tanto el escáneres no es muy específicos.
La metástasis osteoblástica que da como
resultado puntos calientes se detecta sin importar el tamaño, pero
un punto frío (fotopénico), causado como resultado de una enfermedad
osteolítica, debe alcanzar cierto tamaño para poder detectarse.
Las ventajas generales del escáner con
radioisótopos es el amplio campo visual, bajo coste, baja
morbilidad, elevada sensibilidad para la detección de metástasis
esqueléticas, facilidad de realización en cualquier paciente y dosis
corporal total relativamente baja.
Se puede producir la acumulación de trazadores
en cualquier punto del esqueleto con una velocidad elevada de
reemplazo óseo, y en este caso no proporciona información funcional
o vascular. Puesto que el escáner óseo tiene baja especificidad, la
naturaleza de la anormalidad no se puede determinar del escáner, ya
que a menudo no se puede distinguir entre lesiones benignas y
malignas. La técnica también es anatómicamente imprecisa. El enlace
con el hueso puede seguirse produciendo una vez que las células
tumorales han muerto y se sigue produciendo colágeno.
Consecuentemente, no hay distinción entre un hueso en cicatrización
y la progresión de un tumor, lo que hace que los efectos del
tratamiento sean difíciles de control. Un aumento en la recaptación
de ^{99}Tc-MDP debido a un hueso en cicatrización
puede verse hasta 6 meses después del tratamiento, y se conoce como
la respuesta en llamarada.
En la enfermedad osteolítica no hay producción
neta de colágeno, por lo que se producen falsos negativos -no se
detectan algunas o todas las lesiones. Dichos escáneres negativos
necesitan re-evaluarse con datos clínicos y de
laboratorio. Si estos no son conclusivos, entonces se usa la
radiografía, que si sigue siendo no conclusiva da paso a la biopsia
del hueso o MRI.
La baja especificidad del
^{99}Tc-MDP significa que no se puede detectar la
naturaleza de la enfermedad, por ejemplo, benigna vs maligna. En un
paciente con tumores primarios conocidos, muchos puntos calientes en
el hueso pueden indicar metástasis. Sin embargo, el 50% de estos
puntos pueden ser otras lesiones no metastásicos. Por tanto, la
falta de especificidad observada con el
^{99}Tc-MDP significa que los escáneres positivos
deben acompañarse de correlación radiográfica (una radiografía
poscívica confirma la presencia de metástasis ya que el análisis de
hueso es más sensible, pero una radiografía negativa no lo
descarta.
Se elige a veces MRI, principalmente debido a su
capacidad para demostrar anormalidades en la médula ósea. Sin
embargo, MRI a menudo no puede distinguir entre cambios que se deben
al tratamiento, fractura y tumor, y es menos adecuado para el
análisis de huesos largos.
A pesar de los problemas asociados con los
actuales agentes radioisotópicos para diagnóstico por imagen, sus
características únicas los convierten en la primera opción para
cribar metástasis en pacientes asintomáticos. Sin embargo, un
escáner negativo debe siembre evaluarse de nuevo con datos clínicos
y de laboratorio debido a la posibilidad de falsos negativos.
Además, se debe tener en cuenta una causa no metastásica de un
escáner anormal. Los hallazgos no conclusivos necesitan generalmente
un examen suplementario con radiología. Si el diagnóstico sigue sin
estar claro, se realizará biopsia de hueso o MRI
Existe por tanto necesidad de un agente de
diagnóstico por imagen que tenga especificidad para las lesiones
metastásicos de hueso (a diferencia de otros tipos de lesión), y que
pueden proporcionar información clínicamente útil en un único
protocolo de diagnóstico por imagen sin la necesidad de ensayos
adicionales.
La metástasis esquelética puede responder a la
quimioterapia o terapia con hormonas. Pueden también responder a la
radiación o a agentes diseñados para bloquear la recaptación tales
como los nuevos tipos de fármacos de bisfosfonato (BP). Los
bisfosfonatos tienen importantes efectos inhibidores sobre la
resorción del hueso, y son el tratamiento de elección para la
hipercalcemia malignante. El tratamiento puede llevar a una
reducción en el número y tipo de complicaciones esqueléticas en el
mieloma múltiple, y cáncer de mama avanzado, y puede retrasar el
inicio de la enfermedad progresiva en el hueso tras la quimioterapia
paliativa en cáncer de mama y mieloma. Igualmente, el BP también
alivia el dolor metastásico óseo en alrededor del 50% de los
pacientes, pero esto requiere inyección intravenosa ya que BP no es
suficientemente potente y no se tolera bien por vía oral. La
respuesta al tratamiento se puede medir mediante marcadores
bioquímicos, por ejemplo, excreción de colágeno entrecruzado.
También se usan radioisótopos en el tratamiento de la metástasis
ósea [Ben-Josef & Porter, Ann Med. 29,
31-35, (1997); Lewington, Phys Med Biol. 41,
2027-2042 (1996)]. Se ha usado con éxito el
^{89}Sr en el alivio del dolor. Otros isótopos para análisis de
hueso incluyen ^{32}P (efecto secundario de mielotoxicidad),
^{153}Sm (complejado con EDTMP) y ^{186}Re (complejado con
HEDP).
Se conocen los derivados de ácido ascórbico
marcados con ^{14}C y ^{3}H. Yamamoto y col., [Appl.
Radiat. Isot. 43, 633-639 (1992)] han
descrito la preparación de ácido
6-deoxi-6-[^{18}F]fluoro-L-ascórbico
(^{18}F-DFA), es decir, un derivado de ácido
ascórbico marcado con el isótopo emisor de positrones [^{18}F] por
desplazamiento nucleofílico de un sulfato cíclico con el ión
fluoruro. La biodistribución de este compuesto se ha estudiado en
ratas y ratones que soportan fibrosarcoma. Yamamoto y col.,
[Radioisótopos, 44, 93-98 (1995)] han estudiado
también la biodistribución de ^{18}F-DFA en ratas
Wistar normales, ratas ODS incapaces de sintetizar ácido ascórbico,
y ratas Wistar macho con glioma RG-G6 implantado
intracerebralmente, y [Nucl. Med. Biol., 23,
479-486 (1996)] la recaptación y distribución de
^{18}F-DFA en vivo en cerebros de ratas
tras reperfusión postisquémica.
La recaptación de hueso que reconoce
^{18}F-DFA es muy pequeña, y no se sugiera que los
derivados de ácido ascórbico marcados pudieran ser útiles tanto para
el diagnóstico por imagen en general, o para el diagnóstico por
imagen en la enfermedad metastásica ósea en particular. Además,
^{18}F tiene una semivida de 1,8 horas, y por tanto se puede
únicamente usar durante unas pocas horas (incluyendo el tiempo de
síntesis y purificación). Por tanto, cualquier uso de agentes PET
(tomografía de emisión de positrones) está restringida a un número
muy restringido de centros médicos que tienen un ciclotrón en el
propio centro.
La invención incluye agentes de diagnóstico para
la detección y monitorización de la enfermedad metastásica ósea así
como la radioterapia de esta enfermedad. Los agentes comprende un
ácido ascórbico modificado marcado con un resto detectable que es
adecuado para diagnóstico por imagen externa (por ejemplo, by
gammagrafía o MRI), tal como un radionucleido o un ión
paramagnético.
El ácido ascórbico no modificado tiene la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los agentes de la presente invención actúan por
acumulación en las células de osteoblasto presentes en los
emplazamientos de sustitución elevada de hueso. Estos emplazamientos
incluyen áreas de hiperproliferación asociadas con la enfermedad
metastásica ósea, así como con otras patologías óseas. Puesto que
los osteoblastos únicamente captan los derivados de ácido ascórbico
en las lesiones activas, son de alto valor en diagnóstico y
pronóstico de lesiones osteoblásticas, y permiten una monitorización
rápida del progreso de la enfermedad. El uso de ascorbatos puede
evitar también la incidencia de escáneres negativos falsos mediante
la visualización de lesiones líticas debidas a la actividad
osteoblástica asociada, y permiten también un diagnóstico temprano
de lesiones pequeñas debido al mecanismo de recaptación específico.
La receptación en el hueso normal se producirá y será útil para
localizar el emplazamiento de la lesión, donde se incrementa la
recaptación en gran medida.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un compuesto de formula:
en la
que:
X^{1} es OH o SH o NH_{2} o
-L-Z;
X^{2} y X^{3} son iguales o diferentes y
cada uno es H, alquilo C_{1-4}, fluoroalquilo
C_{1-4}, bencilo, un grupo protector o
-L-Z;
-L-Z;
X^{4} es H o alquilo
C_{1-4};
L es un enlazante que comprenden una cadena de
0-10 átomos;
Z es un grupo que comprende un resto que se
puede detectar;
Con la condición de que dicho compuesto
comprenda al menos un resto que se pueda detectar
X^{1} es preferiblemente -L-Z.
X^{2} y X^{3} son preferiblemente alquilo H o C_{1}, lo más
preferible ambos X^{2} y X^{3} son H. X^{4} es preferiblemente
H o alquilo C_{1}, lo más preferible H. El enlazante L es de
manera adecuada una cadena de 0-10 átomos de formula
(A)_{m}
en la
que
A es -CR_{2}-, -CR=CR-, -C\equivC-, -NRCO-,
-CONR-, -O(CO)-, -(CO)O-, -SO_{2}NR-, -NRSO_{2}-,
-OCR_{2}-, -SCR_{2}-,
-NRCR_{2}-, un grupo cicloheteroalquileno C_{4-8}, un grupo cicloalquileno C_{4-8}, un grupo arileno C_{5-12} o un grupo heteroarileno C_{3-12};
-NRCR_{2}-, un grupo cicloheteroalquileno C_{4-8}, un grupo cicloalquileno C_{4-8}, un grupo arileno C_{5-12} o un grupo heteroarileno C_{3-12};
m es un número entero con valor comprendido
entre 0 y 10;
cada grupo R se selecciona de manera
independiente entre H, alquilo C_{1-4},
C_{1-4} alquenilo, alquinilo
C_{1-4}, C_{1-4} alcoxialquilo o
C_{1-4} hidroxialquilo.
L preferiblemente comprende una cadena de
0-4 átomos.
Los compuestos preferidos tienen la
estereoquímica definida:
con
X^{1}-X^{4}, L y Z como se han definido más
arriba
El "resto que se puede detectar" es una
sustancia adecuada para el diagnóstico por imagen externo tras
administración a un ser humano, y puede ser un radionucleido, dónde
el radionucleido es un emisor gamma que emite radiación gamma que
puede penetrar en los tejidos blandos, un emisor beta o un emisor de
rayos X de baja energía. Quedan fuera del alcance de la presente
invención los radionucleidos que son emisores de positrones tales
como ^{11}C y ^{18}F. ^{3}H y ^{14}C no son radioisótopos
adecuados tanto para el diagnóstico por imagen externo o
radioterapia, y quedan por tanto también fuera del alcance de la
presente invención. El resto que se puede detectar también puede
ser: uno o mas átomos hiperpolarizados tales como el átomo de
carbono ^{13}C de un compuesto enriquecido en ^{13}C para
diagnóstico por imagen MRI; un resto paramagnético como agente de
contraste para MRI (por ejemplo, algunos iones metálicos gadolinio
(III), o manganeso (II)); un resto radioopaco tal como iopamidol
para contraste en diagnóstico por imagen con rayos X (tomografía
asistida por ordenador), o un agente de contraste por ultrasonidos.
Preferiblemente, el resto que se puede detectar es tanto un
radionucleido g-emisor tales como ^{123}I,
^{99}TC, ^{111}In, ^{113m}In ó ^{67}Ga o un material
hiperpolarizado. Los radionucleido g-emisores más
preferidos son ^{123}I y ^{99}Tc, especialmente ^{99}Tc.
También se pretende que algunos radionucleidos conferirán
propiedades radioterapéuticas al ácido ascórbico marcado. Así, por
ejemplo, el ácido ascórbico marcado con ^{90}Y, ^{89}Sr,
^{186}Re, ^{188}Re, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P o ^{33}P se
pueden usar el tratamiento de la enfermedad metastásica ósea. En
estas aplicaciones, el efecto terapéutico sería debido a la dosis
radiactiva dirigida localmente al emplazamiento para células
específicas, en oposición a cualquier efecto farmacológico debido al
ácido ascórbico. Cualquiera que sea el resto que se puede detectar
es se prefiere en gran medida que se enlace con el ácido ascórbico
de manera que no experimente metabolismo sencillo (tanto en
vivo como en vitro), ya que este metabolismo daría como
resultado una biodistribución del resto que se puede detectar que ya
no reflejaría el del ácido
ascórbico.
ascórbico.
Cuando el resto que se puede detectar es un
átomo a ^{13}C hiperpolarizado, este átomo puede formar parte
integral de la estructura química del ácido ascórbico, o se puede
enlazar como un grupo suplementario. La mayor parte de los otros
restos detectables deben formar elementos estructurales
suplementarios, y se pueden en lazar en las posiciones 2, 3, 4, 5 ó
6 del derivado de ácido ascórbico. Las posiciones preferidas del
resto que se puede detectar son las posiciones 2, 3 y 6, siendo la
posición 6 la más preferida.
Por término "grupo protector" se entiende
aquellos restos conocidos de aquellas personas expertas en la
técnica, que evitarían la modificación metabólica del resto de ácido
ascórbico. Estos pueden incluir los grupos alquilo, alcoxialquilo,
bencilo o acilo. El grupo protector puede actuar también para evitar
la oxidación o cualquier otro proceso de degradación química de los
grupos hidroxilo del ácido ascórbico, y a este efecto se eligen los
suficientemente lábiles para que el grupo protector se rompa durante
el procedimiento de marcado o radiomarcado
Cuando el resto que se puede detectar es un
metal radioactivo o paramagnético, el ión metálico está siempre
complejado. Este complejo metálico se consigue preferiblemente
enlazando un ligandos que enlaza fuertemente los metales con el
resto de ácido ascórbico. Dichos ligandos que enlazan fuertemente
los metales incluyen compuestos monodentados que se enlazan con
metales de transición, tales como fosfinas, isonitrilos o
hidrazidas, y polidentados tales como agentes quelantes. El
conjugado ligando-ácido ascórbico se compleja con el metal
radioactivo o paramagnético, y el metal se enlaza selectivamente con
el ligando, dando un complejo metálico del ligando enlazado con el
derivado de ácido ascórbico.
Los agentes quelantes de la presente invención
comprenden 2-10 átomos metálicos donantes enlazados
de manera covalente con un esqueleto sin coordinación. Los agentes
quelantes bidentados adecuados incluyen bisfosfonatos y difosfinas.
Los complejos de bisfosfonato de radiometales tienen la ventaja que
el complejo radiometálico es siempre diana del hueso en vivo.
Los agentes quelantes preferidos tienen 4-8 átomos
metálicos donantes, y tienen los átomos metálicos donantes tanto en
estructuras de cadena abierta como en disposiciones macrocíclicas, o
combinaciones de las anteriores. Los agentes quelantes más
preferidos tienen 4-6 átomos metálicos donantes y
forman anillos de quelato de 5 ó 6 miembros cuando se coordinan con
el centro metálico. Dichos agentes quelantes polidentados y/o
macrocíclicos forman complejos metálicos estables que pueden
sobrevivir al ataque de ligandos endógenos competidores por el metal
en vivo tales como transferían o proteínas del plasma. El
complejo metálico debe tener preferiblemente una lipofilia baja (ya
que una elevada lipofilia está relacionada a menudo con la
recaptación no específica), y mostrar bajo enlace con las proteínas
del plasma, ya que la marca enlazada con el plasma contribuye de
nuevo a un fondo indeseablemente alto y no específico del agente
para diagnóstico por imagen.
Son ejemplos de agentes quelantes adecuados
diaminodioximas (Patente de los Estados Unidos Nº4.615.876) o
aquellos quelatos que incorporan donantes de amida (Documento
94/08949); los quelatos tetradentados del Documento WO 94/22816; los
N_{2}S_{2} diaminoditioles, diamidoditioles o
amidoaminoditioles; las N_{3}S tioltriamidas; los N_{2}O_{2}
diaminodifenoles; quelatos N_{4} tales como tetraaminas, aminas
macrocíclicas o quelatos de amida tales como ciclam, oxociclam (que
forma un complejo neutro con tecnecio), o dioxociclam; o
ditiosemicarbazonas. Los quelatos anteriormente descritos son
particularmente adecuados para el tecnecio pero son útiles también
con otros metales. Otros quelatos adecuados se describen en el
Documento WO 91/01144, que incluye quelatos particularmente
adecuados para indio, itrio y gadolinio, especialmente
aminocarboxilatos macrocíclicos y quelatos del ácido aminofosfónico.
Se conocen los quelatos que forman complejos metálicos no iónicos
(es decir, neutros), y se describen en el Documento US 4885363. El
quelato puede comprender también secuencias cortas de aminoácidos
tales como el tripéptido Cys/aminoácido/Cys del Documento WO
92/13572 o los péptidos quelato descritos en el Documento EP 0719790
A2.
Cuando el resto que se puede detectar es un
isótopo radioactivo de yodo, el átomo de radioyodo se enlaza
preferiblemente mediante un enlace covalente a un anillo aromático,
tal como un anillo de benceno, o a un grupo vinilo, ya que se sabe
que los átomos de yodo enlazados a sistemas alifáticos saturados son
adecuados para el metabolismo en vivo y por tanto pierden el
resto que se puede detectar.
La metástasis ósea puede ser osteoblástica
(10%), osteolítica (65%) o mixta (25%). Se cree que los compuestos
de la presente invención únicamente se recaptan por los osteoblastos
activos en los puntos de elevada sustitución ósea, es decir,
lesiones activas. Dichos emplazamientos incluyen zonas de
hiperproliferación asociadas a la enfermedad metastásica ósea, así
como otras patologías óseas. Se espera por tanto que los presentes
compuestos tengan un elevado valor de diagnóstico y pronóstico en
lesiones osteoblásticas, y que permitan una rápida monitorización de
la enfermedad y del progreso del tratamiento. A diferencia del
[^{99}Tc]-MDP, de la técnica anterior, que se
acumula en los emplazamientos de producción de colágeno mucho
después de la muerte de las células tumorales, no dando información
acerca de la viabilidad celular. Los compuestos de la presente
invención pueden ayudar también a prevenir la incidencia de
escáneres negativos falsos, mediante la visualización de las
lesiones osteolíticas asociadas a la actividad osteoblástica, y
permite un diagnóstico más temprano de lesiones pequeñas debido al
mecanismo de captación específico. El tiempo de desaparición
relativamente corto debería permitir el diagnóstico por imagen
rápido y un elevado número de pacientes por unidad de tiempo. Los
presentes compuestos pueden acumularse también en los fibroblastos,
y podrían ser útiles de esta forma en el diagnóstico de otras
patologías óseas por ejemplo osteoporosis y artritis.
Otro aspecto adicional de la presente invención
es la descripción de nuevos derivados de ácido ascórbico. Estos
pueden ser útiles como medicamentos para el tratamiento de tumores
conocidos por acumular ácido ascórbico, en particular tumores óseos,
y se pueden también enlazar a radioisótopos terapéuticos o fármacos
citotóxicos.
Se han preparado los nuevos derivados de ácido
ascórbico, incluyendo los marcados con ^{127}I no radioactivo, y
se ha demostrado que competen con el ácido ascórbico marcado con
^{14}C en la recaptación en pre-osteoblasto de
células de murina (MC3T3-E1). Dichos derivados
tienen esencialmente las mismas propiedades químicas que sus
contrapartes radioactivas marcadas con radioyodo por ejemplo,
^{123}I o ^{131}I. Además, se han sintetizado también unos pocos
compuestos conocidos, y se ha demostrado que competen con el ácido
ascórbico marcado con ^{14}C en la recaptación en células
MC3T3-E1. Además, se ha demostrado que un derivado
de ascórbico marcado con ^{14}C (compuesto 17) se acumula en
osteoblastos primarios de rata en un periodo de 5 horas y permanece
estable durante este tiempo. Se ha demostrado también, mediante
autoradiografía, la acumulación en nódulos de hueso mineralizado
producidos en osteoblastos de rata en un periodo de cultivo de 21
días. Se comparó, en vivo, la cantidad de
^{14}C-compuesto 17 en acumulación en la epífisis
de la rata 60 minutos tras inyección i.v. con el que se acumulaba en
la diáfisis, y se encontró que era 2,3 veces mayor debido a la mayor
actividad de los osteoblastos en esos puntos.
Los compuestos de la presente invención se
pueden preparar como sigue. Cuando el resto que se puede detectar es
yodo radioactivo, el sustituyente enlazado con el ácido ascórbico
debe incluir un átomo de halógeno no radiactivo (para permitir el
intercambio con el radioyodo), un anillo aromático activo (por
ejemplo, un grupo fenol), un compuesto precursor organometálico tal
como trialquiltin o trialquilsilil, un precursor orgánico tal como
triazeno u otro de dichos restos conocidos de las personas expertas
en la técnica. Se dan a continuación ejemplos de sustituyentes
adecuados a los que se puede enlazar el yodo radioactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ambos sustituyentes contienen grupos que
permiten la fácil sustitución con radioyodo en el anillo aromático.
Se pueden sintetizar sustituyentes alternativos que contienen yodo
radioactivo por yotización directa mediante intercambio con
radiohalógeno, por ejemplo
Los grupos para sustitución del radioyodo se
pueden enlazar al ácido ascórbico como sigue. Un sustituyente
funcionarizado con un grupo ácido carboxílico se puede hacer
reaccionar con el 6-OH del ácido ascórbico para dar
un enlace éster [J. Carbohyd. Chem. 17(3)
397-404 (1998)]. Alternativamente, se puede hacer
reaccionar el ácido
6-bromo-6-deoxi-L-ascórbico
[Suskovic, Croat. Chem. Acta, 58, 231 (1985)] con un
sustituyente funcionalizados con amino o tiol para dar un enlace
amino [Kralj y col., Eur. J. Med. Chem., 31, 23,
(1996)] o tioéter [Carbohyd. Res., 134, 321, (1984)]. Se
puede hacer reaccionar el ácido
6-amino-6-deoxi-L-ascórbico
[Suskovic, Croat. Chem. Acta, 62, 537 (1989)] con
sustituyentes funcionalizados con un ácido carboxílico o un éster
activo para dar un enlace amida. Las personas expertas en la técnica
reconocerán que son posibles muchas síntesis alternativas de
derivados de ácido ascórbico adecuados para la radioyodación,
basándose en esta descripción.
Un procedimiento alternativo para sintetizar
derivados de ácido ascórbico adecuados para la radioyodación implica
el reordenamiento de L-gulonato (mostrado más
adelante) en condiciones ácidas [Crawford y col., Adv.
Carbohyd. Chem Biochem., 37, 79 (1980)].
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El grupo protector de
4,6-isopropilideno se elimina, y se enlaza un
sustituyente adecuados para la radioyodación al hidroxilo primario
del L-gulonato mediante un enlace éter o éster, por
ejemplo, y el L-gulonato modificado se reordena para
dar el correspondiente derivado de ácido ascórbico.
Alternativamente, el hidroxilo primario se puede sustituir por un
bromo o un grupo amino para reaccionar con el grupo adecuado para la
radioyodación convenientemente funcionalizado, antes del
reordenamiento del ácido ascórbico.
Cuando el que se puede detectar es un ion
metálico radiactivo o paramagnético, se enlaza un agente quelante al
ascorbato, dando lugar a un conjugado quelato-ácido ascórbico. Dicho
conjugado quelato-ácido ascórbico se puede preparar usando la
hipótesis del quelato bifuncional. Así, es bien conocido cómo
preparar agentes quelantes que tienen enlazados en los mismos un
grupo funcional ("quelatos bifuncionales"). Los grupos
funcionales que se han enlazado con los agentes quelantes incluyen:
amina, tiocianato, maleimida y ésteres activos tales como
N-hidroxisuccinimida. Dichos bifuncional quelatos se
pueden hacer reaccionar con grupos funcionales adecuados en el ácido
ascórbico para formar el conjugado adecuado. Se proporcionan
ejemplos de conjugados quelato-amina para ligandos
de diaminadioxima en el Documento WO 95/19187. En el caso particular
del ácido ascórbico, se puede enlazar un agente quelante en la
posición 6 como sigue. El ácido ascórbico se puede hacer reaccionar
con un conjugado quelato-ácido carboxílico para dar un
quelato-derivado de ácido ascórbico enlazado
mediante un enlace éster. El ácido
6-COOH-6-deoxi-L-ascórbico
[Stuber y col., Carbohyd. Res., 60, 25 (1978)] se puede
hacer reaccionar con un conjugado quelato-amina, o
el ácido
6-NH_{2}6-deoxi-L-ascórbico
reacciona con un quelato-éster activo o el conjugado quelato-ácido
carboxílico para dar el quelato-derivado de ácido
ascórbico enlazado con enlaces amida. Se pueden hacer reaccionar el
ácido
6-Br-6-deoxi-L-ascórbico
con un conjugado quelato-amina o
quelato-tiol para dar tanto un enlace amina
como
tioéter.
tioéter.
Un procedimiento alternativo para sintetizar
derivados de ácido ascórbico implica el reordenamiento de un
derivado de L-gulonato tal como se ha descrito más
arriba. Esta reacción se puede usar en la síntesis de conjugados
quelato-ácido ascórbico. Se puede enlazar un quelato al
L-gulonato usando uno de los procedimientos
descritos más arriba y el conjugado
quelato-L-gulonato resultante se
reordena para dar el correspondiente
quelato-derivado de ácido ascórbico. Las personas
expertas en la técnica reconocerán que son posibles muchas síntesis
alternativas de los conjugados quelato-ácido ascórbico basándose en
esta descripción.
Cuando el resto que se puede detectar es un
átomo ^{13}C hiperpolarizado, el compuesto hiperpolarizado deseado
se puede preparar mediante intercambio de dolarización entre un gas
hiperpolarizado (tal como ^{129}Xe o ^{3}He) y un derivado de
ácido ascórbico adecuado enriquecido en ^{13}C. Se conocen
derivados de ácido ascórbico marcados [1-^{13}C]-
y [2-^{13}C], y se han usado para examinar el
transporte y ciclado redox en eritrocitos humanos [Himmelreich y
col., Biochem. 37, 7578 (1998)]. Los derivados de ácido
ascórbico enriquecidos en ^{13}C se pueden también preparar de
manera análoga a las rutas sintéticas de la bibliografía para los
derivados de ácido ascórbico enriquecidos en ^{14}C. Así, Hornig
y col., [Int. J. Vit. Nutr. Res. 42, 223 (1972) e
ibid 42, 511 (1972)] han estudiado la biodistribución
autorradiográfica del ácido
[1-^{14}C]-L-ascórbico
en cobayas con deficiencia en vitamina C pero normalmente
alimentadas tras inyección intravenosa. Karr y col., [J.
Lab. Comp., 6, 155 (1970)] prepararon también ácido
[6-^{14}C]-L- ascórbico y ácido
[5-^{14}C]-L-ascórbico
a partir de
D-glucosa-1-^{14}C
y D-glucose2-^{14}C,
respectivamente. Williams y col., [Carbohyd. Res., 63,
149 (1978)] describen la síntesis de ácido
[4-^{14}C]-L-ascórbico
a partir de D-[3-^{14}C]glucopiranosa y
[6-^{14}C]-L-ácido ascórbico a
partir de D-[1-^{14}C]glucopiranosa.
Se han ensayado los derivados de ácido ascórbico
no marcados de la presente invención respecto de su capacidad para
competir por la recaptación de ácido ascórbico ^{14}C en células
MC3T3-E1, una línea celular de osteoblastos de
murina. Las células MC3T3-E1 se hacen crecer en
placas de cultivo de tejidos y la solucion de ensayo apropiada que
contiene una concentración normalizada de ácido ascórbico ^{14}C
más una concentración competitiva de derivado de ácido ascórbico
añadida a cada pocillo. Se mide a continuación el ácido ascórbico
^{14}C recaptado por las células a los 60 min.
De los compuestos 11 a 15, se encontró que,
únicamente aquellos que contienen un sustituyente de yodofenilo,
bromofenilo o yodovinilo competían por la recaptación de ácido
ascórbico ^{14}C en células MC3T3-E1. Los
resultados se proporcionan en la Tabla 10. Ambos Compuestos 16 y 17
compitieron por la recaptación de ácido ascórbico ^{14}C en
células MC3T3-E1, aunque la competición mediante el
compuesto 16 fue muy débil. Aunque ambos compuestos son conocidos,
nunca se había informado en la bibliografía que mostraban
competición con el ácido ascórbico ^{14}C respecto de la
recaptación en pre-osteoblastos o células de
osteoblasto.
Los derivados de ácido ascórbico marcados con un
resto de la presente invención se pueden preparar usando kits. Los
kits son productos estériles dados adecuados para la administración
humana, por ejemplo, mediante inyección en el torrente sanguíneo.
Cuando el resto que se puede detectar es ^{99}Tc, el kit
comprendería un vial que contiene tanto un derivado de ácido
ascórbico adecuado para formar un complejo metálico con ^{99m}Tc o
un conjugado quelato-ácido ascórbico, junto con un agente reductor
farmacéuticamente aceptable tales como ditionio de sodio, bisulfito
de sodio, ácido formamidina sulfónico, ion estannoso, Fe(II)
o Cu(I). El agente reductor es preferiblemente una sal
estannosa tal como el cloruro estannoso o el tartrato estannoso.
Alternativamente, el derivado de ácido ascórbico
o el conjugado de agente quelante-ácido ascórbico puede estar
presente como un complejo metálico no radiactivo que, tras adición
del metal radioactivo, experimente transmetalación (es decir,
intercambio de ligandos), dando el producto deseado. El kit se puede
liofilizar, y se diseña para reconstitución con
^{99}Tc-pertecnetato (TcO_{4},^{-}) a partir
de un generador del radioisótopo ^{99}Tc para dar una solucion
adecuada para administración a un ser humano sin otra
manipulación.
Los agentes de la presente invención se pueden
también proporcionar en forma de dosis unitaria lista para inyección
a un ser humano y puede suministrarse, por ejemplo, en una
jeringuilla estéril prerrellena. Cuando el resto que se puede
detectar es un isótopo radiactivo tal como ^{99}Tc, la jeringuilla
que contiene la dosis unitaria se suministraría también con una
carcasa para jeringuilla (para proteger al operador de una dosis
potencialmente radiactiva).
Los anteriores kits o jeringuillas prerrellenas
pueden contener otros agentes tales como tampones, solubilizantes
farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ciclodextrinas o
tensioactivos tales como Plurónico, Tween o fosfolípidos);
estabilizantes/antioxidantes farmacéuticamente aceptables (tales
como ácido gentisicio o ácido para-aminobenzoico) o
agentes de volumen para liofilización (tal como cloruro de sodio o
manitol).
La estructura del compuesto 10 se proporciona en
el Esquema 1. Las estructuras de los compuestos 11 a 28 se
proporcionan en las Tablas 1 a 4. La preparación de los compuestos
10-19 y 21-28 se describe en los
Ejemplos 1 a 6. Se proporcionan datos de RMN de los compuestos en
las Tablas 4 a 9. Las propiedades biológicas de los compuestos 11 a
18 se muestran en el Ejemplo 7 y Tabla 10. Las propiedades
biológicas del compuesto 17 se discuten ampliamente en los Ejemplos
8 y 9.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema
1
Síntesis del compuesto
10
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\newpage
Donde: [diaminofenol]-enlazantes
son:
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Donde: [Pn216]-enlazantes
son:
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Donde:
[isopropilamina]-enlazantes son:
\newpage
Donde: [Hynic]-enlazantes
son:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Los desplazamientos químicos del ^{1}H RMN son
respecto al TMS; los desplazamientos químicos del ^{13}C RMN son
respecto al CDCl_{3} a 77 p.p.m. o, para soluciones acuosas, MeOH
a 49,2 p.p.m.; los desplazamientos químicos del ^{31}P son
respecto a un H_{3}PO_{4} externo del 85%.
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Se añadió hidruro de sodio (700 mg, 0,29 mmol)
en pequeñas porciones bajo una corriente de nitrógeno seco a una
solución vigorosamente agitada de tetraisopropil
metano-1,1-bisfosfonato (1) (5,0 g,
14,5 mmol) en tolueno seco (25 ml). Tras cese de la efervescencia,
continuó la agitación durante 15 minutos. Se añadió a continuación
bromoacetato de etilo (3,2 g, 19,2 mmol) gota a gota durante un
tiempo (2 min), tras lo cual el matraz se calentó y se comenzó a
formar un precipitado blanco. Continuó la agitación durante 2 horas
más a temperatura ambiente. Se añadió agua (20 ml) a continuación
cuidadosamente y la mezcla se agitó vigorosamente. Se separó la capa
de tolueno y se extrajo con agua (20 ml). Los extractos acuosos se
combinaron, se lavaron con éter (50 ml), se acidificaron hasta pH 1
y se volvió a extraer con diclorometano (2 X 25 ml). Los extractos
de diclorometano se combinaron, se secaron (MgSO_{4}), se
filtraron y el solvente se evaporó bajo presión reducida para dejar
el ácido (3) en forma de un líquido amarillo claro (800 mg). La capa
de tolueno también se secó (MgSO_{4}), se filtró, y el solvente se
evaporó para dejar un aceite que se encontró que era el etil éster
(2) y producto de partida sin reaccionar. Este aceite se disolvió en
una mezcla metanol: agua (20 ml, 3:1) que contiene hidróxido de
litio (1 g, 24 mmol) y la solución se agitó a temperatura ambiente
durante 16 h. El metanol se eliminó mediante evaporación y se añadió
a continuación agua (20 ml). Esta solución acuosa se lavó con éter
(2 X 20 ml), se acidificó hasta pH 1 con HCl diluido y a
continuación se extrajo con diclorometano (2 X 25 ml). Los extractos
de diclorometano se combinaron, se secaron (MgSO_{4}), se
filtraron y se eliminaron los componentes volátiles bajo presión
reducida para dejar el ácido (3) (2,77 g) en forma de un líquido
amarillo claro. El producto combinado (3) (3,57 g, 61%) fue lo
suficientemente puro para usar en las reacciones posteriores sin más
purificación.
\delta_{P} (CDCl_{3}) 21,79.
\delta_{C} (CDCl_{3}) 23,7 (m), 30,6 (s),
34,0 (t, J_{PC} = 138 Hz), 71,8 (m), 172,8 (s).
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de diciclohexilcarbodiimida (2,0 g,
9,71 mmol) en diclorometano (10 ml) se añadió en una porción a una
solución agitada de ácido
3,3-bis(bisisopropoxi-fosfinil)propiónico
(3) (3,57 g, 8,88 mmol) y N-hidroxisuccinimida (1,15
g, 10 mmol) en diclorometano seco (35 ml). Tras aproximadamente 10
minutos comenzó a formarse un precipitado blanco de
diciclohexilurea. La mezcla se agitó durante 16 h y el sólido
formado se separó por filtración y se lavó con diclorometano (15
ml). El solvente se eliminó bajo presión reducida procedente de las
soluciones combinadas de diclorometano para dejar un residuo
viscoso, que se demostró mediante RMN que era el compuesto del
título en buen estado de pureza. La purificación final de este
residuo se llevó a cabo usando cromatografía en sílice con una
mezcla de diclorometano:metanol (19:1) como eluyente. El producto
(4,0 g, 91%) (R_{f} 0,2) se aisló en forma de un aceite
viscoso.
\delta_{P} (CDCl_{3}) 20,0.
\delta_{H} (CDCl_{3})
1,25-1,31 (24H, m, CH_{3} X 8), 2,77 (4H, s,
CH_{2} X 2), 2,83 (1H, m, CH), 2,7-3,1 (2H, m,
CH_{2}), 4,37 (4H, dq, J_{HH} = 6 Hz, J_{PH} = 13,5 Hz, CH X
4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentaron a reflujo
(R)-5-[2-(4-metilfenilsulfoniloxi)-(S)-1-hidroxietil]-3,4dibenciloxi-5H-furan-2-ona
(5)*. (550 mg, 1,1 mmol), azida de sodio (190 mg, 1,7 mmol) y
metanol (2 ml) durante 6 horas. La mezcla de reacción se enfrió y la
mayor parte del solvente se eliminó mediante evaporación a
temperatura ambiente. El material resultante se repartió entre agua
(25 ml) y diclorometano (25 ml) y la fase acuosa se extrajo con
diclorometano (25 ml). Las fracciones orgánicas combinadas se
secaron (MgSO_{4}), se filtraron y los componentes volátiles se
evaporaron bajo presión reducida (8 mm/Hg, 3,04 x 10^{5}
N/m^{2}) a temperatura ambiente para dar el producto (6) en forma
de un sólido céreo de color amarillo (375 mg, 89%). Este material
se usó sin purificación adicional.
\delta_{H} (CDCl_{3}) 3,22 (1H, dd, J = 6 y
12,5 Hz, CH_{2}N_{3}), 3,40 (1H, br d, OH), 3,46 (1H, dd, J = 7
y 12,5 Hz, CH_{2}N_{3}), 3,88 (1H, br m, CHO), 4,55 (1H, d, J =
2 Hz , CHO anillo), 4,95 (2H, br s, OCH_{2}), 5,03 (1H, d, J = 12
Hz, OCH), 5,08 (1H, d, J = 12 Hz, CHO), 7,12 (2H, m, Ar),
7,21-7,31 (8H, m, Ar).
* F. Dallacker y J. Sanders, Chem. Zeit.,
1985, 109, 197-202.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió trifenilfosfina (600 mg, 2,4 mmol) a
una solución agitada de
(R)-5-(2-azido-(S)-1-hidroxietil)-3,4-dibenciloxi-5H-furan-2-ona
(5) (750 mg, 2 mmol) en THF (10 ml) y tras pocos minutos se
desprendió gas. Se continuó la agitación hasta cese de la
efervescencia (normalmente 2-3 h) y se añadió a
continuación agua (2 ml) y la mezcla se agitó durante 1 hora más. El
THF se eliminó bajo presión reducida y el residuo se repartió entre
diclorometano (25 ml) y agua (25 ml). Se separó la fase orgánica,
se secó (MgSO_{4}), se filtró y cualesquiera componentes volátiles
se evaporaron bajo presión reducida (45ºC a 8 mm/Hg, 1.066
N/m^{2}) para dejar un residuo naranja viscoso que se purificó
mediante cromatografía en sílice. La elución inicial con una mezcla
diclorometano:metanol (19:1) eliminó la mayor parte de subproductos
polares, y el producto se aisló a continuación por elución con una
mezcla diclorometano:metanol en forma de un aceite amarillo claro
(150 mg; 21%) (R_{f} 0,25).
\delta_{H}(CDCl_{3}) 2,49 (3H, br s,
NH_{2} y OH), 2,76 (1H, dd, J = 5 y 13 Hz, NCH), 2,83 (1H, dd, J =
7 y 13 Hz, NCH), 3,70 (1H, m, CHO), 4,47 (1H, d, J = 2 Hz, CHO
anillo), 4,98 (2H, s, OCH_{2}), 5,05 (1H, d, J = 12 Hz, OCH), 5,11
(1H, d, J = 12 Hz, CHO), 7,10-7,17 (2H, m, Ar),
7,20-7,32 (8H, m, Ar).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió en una porción
(R)-5-(2-amino-(S)-1-hidroxietil)-3,4-dibenciloxi-5H-furan-2-ona
(7) (180 mg, 0,5
mmol) en diclorometano seco (1 ml) a una solución agitada de 3,3-bis(bisisopropoxifosfinil) propionato de (N-succinimidilo) (4) (250 mg, 0,5 mmol) en diclorometano seco (1 ml), a partir de la cual comenzaron a precipitar cristales de N-hidroxisuccinimida. La mezcla se agitó durante 30 min, se añadió diclorometano (10 ml) a continuación y la solución se lavó con agua (2 X 10 ml). La fase orgánica se secó a continuación (MgSO_{4}), se filtró y el solvente se evaporó bajo presión reducida para dejar (8) en forma de un aceite amarillo claro viscoso en un estado virtualmente puro. La purificación final se pudo realizar mediante cromatografía en sílice con una mezcla diclorometano:metanol (19:1) como eluyente. El producto (8) (180 mg, 49%) (R_{f} 0,25) se obtuvo en forma de un aceite amarillo claro
viscoso.
mmol) en diclorometano seco (1 ml) a una solución agitada de 3,3-bis(bisisopropoxifosfinil) propionato de (N-succinimidilo) (4) (250 mg, 0,5 mmol) en diclorometano seco (1 ml), a partir de la cual comenzaron a precipitar cristales de N-hidroxisuccinimida. La mezcla se agitó durante 30 min, se añadió diclorometano (10 ml) a continuación y la solución se lavó con agua (2 X 10 ml). La fase orgánica se secó a continuación (MgSO_{4}), se filtró y el solvente se evaporó bajo presión reducida para dejar (8) en forma de un aceite amarillo claro viscoso en un estado virtualmente puro. La purificación final se pudo realizar mediante cromatografía en sílice con una mezcla diclorometano:metanol (19:1) como eluyente. El producto (8) (180 mg, 49%) (R_{f} 0,25) se obtuvo en forma de un aceite amarillo claro
viscoso.
\delta_{P}(CDCl_{3}) 21,9 (d,
J_{PP} = 4 Hz), 22,0 (d, J_{PP} = 4 Hz).
Espectro de masas (FABS), Calculado para
C_{35}H_{52}NO_{12}P_{2} 740,2965 (M+H)^{+},
encontrado 740,2965.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de
(R)-5-(3-aza-6,6-bis(bisisopropoxifosfinil)-(S)-1-hidroxi-4-oxo-hexil)-3,4-dibenciloxi-5H-furan-2-ona
(8) (700 mg, 0,96 mmol) en metanol (10 ml) se hidrogeno sobre un
catalizador de paladio (200 mg, 10% Pd/C) y en atmósfera de
hidrógeno (30 atm, (3,04 x 10^{5} N/m^{2}) durante 2 horas a
temperatura ambiente. El catalizador se eliminó por filtración en
Celite y la torta del filtro se lavó con metanol (50 ml). Estos
lavados se combinaron con el filtrado de metanol y los componentes
volátiles se evaporaron bajo presión reducida para dejar (9) en
forma de un aceite viscoso en buen estado de pureza. El residuo se
purificó mediante cromatografía en sílice con una mezcla acetato de
etilo:metanol (9:1) como eluyente. El producto puro (9) (50 mg, 9%)
(R_{f} 0,3) se aisló en forma de un sólido color crema.
\delta_{P}(CDCl_{3}) 21,8 (br s),
22,98 (br s).
Espectro de masas (FABS), Calculado para
C_{21}H_{40}NO_{12}P_{2} 560,2026 (M+H)^{+},
encontrado 560,2026.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
(R)-5-(3-aza-6,6-bis(bisisopropoxifosfinil)-(S)-1-hidroxi-oxo-hexil)-3,4-dihidroxi-5H-furan-2-ona
(9) (370 mg, 0,6 mmol) en diclorometano (10 ml) se añadió
bromotrimetilsilano (1 g, 6,4 mmol). La mezcla se calentó a reflujo
durante 6 h y el solvente a continuación se eliminó bajo presión
reducida. Se añadió metanol (25 ml) y los componentes volátiles se
evaporaron bajo presión reducida. Este procedimiento se repitió dos
veces para dejar un residuo color marrón. El producto (10) se
purificó mediante HPLC en fase reversa en una columna C_{18}
usando metanol acuoso (50%) como eluyente, y se aisló sólido marrón
claro (120 mg; 46%).
\delta_{P}(D_{2}O) 21 (br).
\delta_{C}(D_{2}O) 32,1 (br s), 34,8
(t, J_{PC} = 138 Hz), 42,1 (s), 67,1 (s), 76,8 (s), 118,1 (s),
155,5 (s), 173,4 (s), 173,5 (br s).
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos 11 a 15, todos ellos ésteres de
ácido ascórbico, se sintetizaron directamente a partir de ácido
ascórbico y el correspondiente ácido carboxílico usando el
procedimiento de Gan y col., [J. Carbohyd. Chem., 17,
397-404 (1998)]. Los compuestos11 y 13 a 15 se
sintetizaron todos usando un procedimiento similar al que se
proporciona a continuación para el ácido
6-O-(4-yodobenzoil)-L-ascórbico
(Compuesto 12):
- El ácido 4-yodobenzoico (0,5 g, 2,48 mmol), y ácido L-ascórbico (2 g, 11,3 mmol) se mezclaron y agitaron en ácido sulfúrico concentrado (10 ml) durante 24 h a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de hielo y cloruro de sodio sólido. La mezcla se extrajo con acetato de etilo y la capa orgánica se secó con sulfato de magnesio. El compuesto del título se aisló mediante evaporación bajo presión reducida seguido por cristalización en una mezcla cloroformo/hexano y secado a vacío (200 mg, 5,6 mmol).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos compuestos se sintetizaron usando
procedimientos similares a los procedimientos de la bibliografía,
[Carbohyd. Res., 134, 321, (1984)] para el compuesto 16 y [J.
Biol. Chem., 271, 26032, (1996)] para el compuesto 17. El
compuesto 17 ^{14}C se preparó usando un procedimiento similar,
pero partiendo del ácido bromo
^{14}C-ascórbico.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos compuestos se sintetizaron usando
procedimientos muy similares. A una suspensión de carbonato de sodio
(960 mg) en metanol (2 ml) y agua (6 ml) se añadió ácido
6-bromo-L-ascórbico
(500 mg) y ácido tiosalicílico (350 mg; para el compuesto 18) o
ácido 3-mercaptopropiónico (240 mg; para el
compuesto 19). La mezcla resultante se agitó durante al menos 4 h a
temperatura ambiente y se investigó su finalización mediante TCL. La
reacción se acidificó con HCl 2M y el producto se extrajo con
acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera y se secó
con MgSO_{4}. La filtración y evaporación a sequedad dio un sólido
coloreado pulido que se trató con cloroformo y se filtró para dar
590 mg de compuesto 18/ 200 mg de compuesto 19.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto
21
El ácido protegido con tritilo, se preparó
mediante un procedimiento descrito en [Inorg. Chem 23 (23)
3795-3797 (1984)]. El ácido S-tritil
mercaptoacetico (5,6 g) se disolvió en acetonitrilo seco (60 ml)
bajo nitrógeno. A esto se añadió una solución de
N-hidroxisuccinimida (2 g) en acetonitrilo (10 ml).
Esto fue seguido por la adición de DCC (4,4 g) en acetonitrilo (20
ml). La mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura
ambiente. El producto se aisló por filtración seguida por
evaporación del filtrado para dar un sólido blanco (6 g). El éster
del ácido S-tritil-mercaptoacetico
NHS (400 mg) se disolvió en diclorometano seco (10 ml) bajo
nitrógeno. A esto se añadió el ligando diaminodifenol (300 mg),
seguido por trietilamina (146 \mul). La reacción se agitó a
temperatura ambiente durante toda la noche y el producto se aisló
mediante evaporación seguido por cromatografía súbita en columna de
sílice. El enlazante de diaminodifenol protegido con tritilo (270
mg) se disolvió en DCM (6 ml) y a esto se añadió trietilsilano (100
\mul) seguido por ácido trifluoroacético (300 \mul). La mezcla
se agitó durante 4 h a temperatura ambiente, tras lo cual se evaporó
a sequedad y se usó directamente en la etapa final, que se llevó a
cabo tal como se describe para los compuestos 18 y 19. Los
compuestos 22-27 se prepararon de manera
análoga.
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto se sintetizó usando una
combinación de procedimientos descritos en la bibliografía. El
quelato MAG3 se preparó usando el procedimiento descrito por Winnard
y col., [Nucl Med Biol 24 425-432
(1997)]. Se preparó el ácido
N-metil-6-amino-6-deoxi-O^{3}-bencil-L-ascórbico
según el procedimiento descrito por Kralj M y col., [Eur J
Med Chem 31 23-35 (1996). La reacción de
acoplamiento entre MAG3 y el ácido
N-metil-6-amino-6-deoxi-O^{3}-bencil-L-ascórbico
se consiguió usando PiBrop (un agente usado específicamente para las
N-metil aminas) de manera similar a que describe
Coste J [Tet. Lett. 32 (17) 1967-1970 (1991).
De esta forma, a ácido
N-metil-6-amino-6-deoxi-O^{3}-bencil-L-ascórbico
(91 mg, 3,26 X 10,^{-}4 moles) en DMF seco (5 ml) bajo nitrógeno
se añadió MAG3 (100 mg, 3,26 X 10^{-4} moles). Con agitación a
temperatura ambiente, se añadió diisopropiletilamina (211 mg, 1,63 X
10^{-3} mol) seguido por PiBrop (182,5 mg, 3,914 X 10^{-4} mol).
Tras agitación durante toda la noche el solvente se eliminó en vacío
y el producto se aisló mediante HPLC preparativo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| datos de RMN (ppm) | Compuesto 17 | Compuesto 16 |
| CH_{2} | 2,70 | |
| CH_{2}(H-6_{a,b}) | 3,67 | 3,22-3,26 |
| CH(H-5) | 3,83 | 3,95-3,99 |
| CH(H-4) | 4,35 | 4,88 |
| Aril | 7,13-7,18 | 7,20-7,44 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de transporte: NaCl 134 mM, KCl 5,4 mM,
CaCl_{2} 1,8 mM, MgSO_{4} 0,8 mM, HEPES 20 mM, glucosa 10 mM, pH
7,3, almacenado a temperatura ambiente
Tampón de ensayo: Tampón de transporte + 40
\muM homocisteína
Ácido ^{14}C-ascórbico
(Amersham Pharmacia Biotech)
Solución de almacenamiento: 50 \muCi en 50
\mul agua Analar, almacenado a -20ºC.
Solución de ensayo: 200 nCi ácido
^{14}C-ascórbico en 200 \mul de tampón de
ensayo/pocillo (125 \muM)
Ácido ascórbico (Sigma)
Dehidroácido ascórbico (Sigma)
Compuestos de ensayo:
Tampón de detención: 200 \muM floretina en
tampón de ensayo, enfriado a 4ºC.
Solución de lisis: SDS al 0,1% en agua
Analar
Las células de pre-osteoblasto
MC3T3-E1 de murina se sembraron en placas de 24
pocillos a 2 X 10^{5} células/pocillo en 1 ml de medio mínimo
esencial más FCS penicilina y estreptomicina al 10%. Las células se
hicieron crecer durante toda la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%. El
tampón de ensayo y las soluciones se prepararon la mañana del
ensayo. Las células se examinaron bajo el microscopio para
determinar confluencia y viabilidad. Se retiró el medio de
crecimiento usando una Liquipippette y cada pocillo se lavó con 2 X
200 \mul de tampón de ensayo. Se añadió la solución de ensayo
apropiada a cada pocillo, y la placa se incubó a 37ºC durante el
tiempo necesario. Para detener la reacción, se añadieron 0,5 ml de
tampón de detención muy frío a cada pocillo. A continuación, cada
pocillo se lavó con 0,5 ml de tampón de detención. Las células se
lisaron en solución SDS al 0,1% durante aproximadamente 10 min y las
soluciones se transfirieron a viales de centelleo. A continuación,
cada pocillo se lavó con tampón de ensayo, y esta solucion de lavado
se transfirió también al vial de centelleo adecuado. Se añadió el
fluido de centelleo (5 ml) a cada vial, los viales de sometieron a
vortización, y se contaron en un contador Rackbeta
Se recogieron fetos de rata y se rociaron con
isopropanol al 70%. A continuación se retiraron las calvaria
cortando la piel de la parte de arriba de la cabeza, haciendo una
incisión desde la calvaria hasta el meato auditivo externo por
detrás de los huesos parietales y después hacia delante hacia los
glóbulos oculares. Cuando se aislaron todas las calvaria, se lavaron
con PBS (libre de Ca^{2+} y Mg^{2+}), a continuación se
incubaron en tripsina a 37ºC durante 10 minutos. Las calvaria se
transfirieron a colagenasa al 0,2% (tipo II) en HBSS durante 30
minutos a 37ºC. Esta digestión con colagenasa se repitió durante 60
minutos para liberar las poblaciones de osteoblastos. Se retiró el
sobrenadante, y se hizo rotar para obtener un residuo celular. El
residuo se resuspendió en medio, se contaron las células viables, y
se plaquearon en un matraz T75. Tras la confluencia, las células se
subcultivaron en placas de 6 multipocillos a 2 X 10^{4} - 2 X
10^{5} células/pocillo en 3 ml de medio que contiene
\beta-glicerofosfato 1 mM. Además, se incubaron
ácido ascórbico (50 \mug/ml), ácido ascórbico ^{14}C (19,6
\muCi/ml) o compuesto 7 ^{14}C (2,8 \muCi/ml) con osteoblastos
durante el tiempo de cultivo. Las células se alimentaron entre dos y
tres veces por semana, y se cultivaron hasta 21 días. Los nódulos se
volvieron visibles microscópicamente alrededor de los
7-10 días, y se inició la mineralización (evaluada
mediante tinción con rojo de alizarina) poco después.
Al final del periodo de cultivo, las células se
fijaron con glutaraldehído al 2,5% y se deshidrataron en series
incrementales de concentraciones de etanol. Se añadió a cada pocillo
aproximadamente 2 ml de emulsión de hiperrecubrimiento
(LM-1; APB) y se incubaron a temperatura ambiente en
la oscuridad durante 24-36 horas. A continuación, se
reveló la emulsión siguiendo procedimientos convencionales.
La separación de DHAA, M, compuesto 7 y bencil
mercaptano se realizó con éxito usando el siguiente perfil de
HPLC.
Fase móvil: A y B = acetonitrilo 50%:50%
KH_{2}PO_{4} 50 mM
Detector: UV (235 nm)/ analizador de centelleo
en flujo (\beta-radiación)
Caudal: 1 ml/min
Columna: Waters Sferisorb S5NH
2-5 mm - 4,6 X 250 mm
| Tiempo de retención (min) | Gráfica de calibración | |
| (y = mV.min \textamp x = nmoles) | ||
| DHAA | 3,34 \pm 0,10% | y = 121946 nmoles |
| AA | 5,74 \pm 0,20% | y = 215320 nmoles |
| Compuesto 7 | 3,71 \pm 0,27% | y = 255088 nmoles |
| Bencil Mercaptano | 2,44 \pm 0,14% | y = 78710 nmoles |
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de compuesto 7 ^{14}C analizadas
mediante el perfil de HPLC anterior fueron:
- MEM solución (patrón)
- Solución de SDS al 0,1% (patrón)
- MEM - eliminado de las células
- Solución de SDS al 0,1% - células lisadas en los puntos 1, 3, 5, 24, 48, 72, 96 y 168 h.
Los resultados de HPLC evidencian actividad
punta en las células de hasta 5 horas, indicando la presencia del
compuesto 17 ^{14}C. El resto de los periodos de tiempo no
produjeron puntas, ya que la relación señal a ruido era muy baja, lo
que indicaba que compuesto 17 ^{14}C se había descompuesto en el
interior de la célula. Se usó SDS al 0,1% como ensayo para ver si el
procedimiento de extracción de las células daba lugar a la
degradación del SDS al 0,1%. El análisis
del SDS al 0,1% en MEM y SDS sin embargo demostró que es bastante estable en dichas soluciones hasta 5 horas.
del SDS al 0,1% en MEM y SDS sin embargo demostró que es bastante estable en dichas soluciones hasta 5 horas.
La conclusión que se puede alcanzar es que el
compuesto 17 ^{14}C es lo suficientemente estable en esas
condiciones ambientales para haberse captado en el interior de las
células, para degradarse a continuación.
Los experimentos con autoradiografía demuestran
que tanto ácido ascórbico ^{14}C como compuesto 17 ^{14}C están
asociados con los nódulos en mineralización y no con la monocapa de
osteoblastos confluentes de alrededor.
Se anestesiaron tres ratas con halotano y se
inyectaron con 0,2 ml de compuesto 17 ^{14}C en PBS (4 \muCi de
dosis total; actividad especifica 5 mCi/mmol). Tras 60 minutos, las
ratas se sacrificaron por dislocación cervical. Los tejidos se
colocaron en viales para centelleo de vidrio pesados previamente, y
se añadieron 3 ml de tolueno. Las muestras se incubaron durante toda
la noche a 50ºC. A continuación, las muestras se decoloraron con 0,1
ml de Na-EDTA: 0,5 ml H_{2}O_{2} durante toda la
noche a 50ºC. Finalmente, se añadieron a cada vial 10 ml de
Hionic-Fluor (Packard), y los viales se contaron en
un contador por centelleo LKB.
En este estudio preliminar, la mayor parte de la
actividad estaba presente en la sangre, hígado y riñones tras 60
minutos. La medida de la actividad en el fémur demostró 0,041% id/g
en la diáfisis y 0,095% id/g en la epífisis, una relación de 2,3, lo
que demuestra una mayor recaptación en los vértices del hueso con
crecimiento activo.
Los análisis mediante HPLC demostraron que el
compuesto es estable en el plasma, por tanto es posible que la
recaptación vista sea debida al compuesto 17 ^{14}C intacto.
Claims (14)
1. Un compuesto de formula:
en la
que:
X^{1} es OH o SH o NH_{2} o
-L-Z;
X^{2} y X^{3} son iguales o diferentes y
cada uno es H, alquilo C_{1-4}, fluoroalquilo
C_{1-4}, bencilo, un grupo protector o
-L-Z;
-L-Z;
X^{4} es H o alquilo
C_{1-4};
L es un enlazante que comprenden una cadena de
0-10 átomos;
Z es un grupo que comprende un resto que se
puede detectar;
con la condición de que dicho compuesto
comprenda al menos un resto que se puede detectar, en el que dicho
resto que se puede detectar es una sustancia adecuada para
diagnóstico por imagen tras administración a un ser humano,
seleccionado entre:
- (i).
- emisores gamma,
- (ii).
- emisores beta
- (iii).
- emisores de rayos x de baja energía
- (iv).
- átomos hiperpolarizados
- (v).
- restos paramagnéticos,
- (vi).
- restos radioopacos, o
- (vii).
- agentes de contraste por ultrasonidos;
con la condición de que cuando el
resto que se puede detectar es un metal radioactivo o paramagnético,
el metal se compleja con un ligando que se enlaza fuertemente con el
metal, y se enlaza al resto de ácido
ascórbico.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que el resto que se puede detectar comprende un complejo metálico o
un agente quelante que comprende 2-10 átomos
metálicos donantes enlazados de manera covalente con un esqueleto
sin coordinación.
3. El compuesto de las reivindicaciones 1 ó 2,
en el que el resto que se puede detectar es un radionucleido.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el
que el radionucleido es un emisor gamma.
5. El compuesto de la reivindicación 4, en el
que el emisor gamma es ^{99m}Tc o ^{123}I.
6. El compuesto de la reivindicación 3, en el
que el radionucleido es, ^{123}I, ^{125}I o ^{131}I, y Z es un
grupo yodovinilo, o un grupo yodoarilo
C_{5-12}.
7. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que X^{1}
es-L-Z.
8. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 en el que L es un grupo enlazante que
comprende una cadena de 0-10 átomos de carbono, y
tiene la fórmula (A)_{m}
en la que
A es -CR_{2}-, -CR=CR-, -C\equivC-, -NRCO-,
-CONR-, -O(CO)-, -(CO)O-, -SO_{2}NR-, -NRSO_{2}-,
-OCR_{2}-, -SCR_{2}-,
-NRCR_{2}-, un grupo cicloheteroalquileno C_{4-8}, un grupo cicloalquileno C_{4-8}, un grupo arileno C_{5-12} o un grupo heteroarileno C_{3-12};
-NRCR_{2}-, un grupo cicloheteroalquileno C_{4-8}, un grupo cicloalquileno C_{4-8}, un grupo arileno C_{5-12} o un grupo heteroarileno C_{3-12};
m es un número entero con valor comprendido
entre 0 y 10;
cada grupo R se selecciona de manera
independiente entre H, alquilo C_{1-4}, alquenilo
C_{1-4}, alquinilo C_{1-4},
alcoxialquilo C_{1-4} o hidroxialquilo
C_{1-4}.
9. El compuesto de la reivindicación 8, en el
que el grupo enlazante comprende una cadena de 0-4
átomos
10. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 de fórmula:
11. El compuesto de la reivindicación 10, en el
que cada uno de X^{2} y X^{3} es H.
12. Un compuesto como el que se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en
medicina.
13. Un compuesto como el que se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para uso en el
diagnóstico o tratamiento de lesiones metastásicas de hueso.
14. El uso de un compuesto como el que se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la
preparación de un agente para el diagnóstico o tratamiento de
lesiones metastásicas de hueso.
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