ES2277912T3 - Metodos y kits para identificar el suceso elite gat-zm1 en muestras biologicas. - Google Patents
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Abstract
Un método para identificar el suceso élite GAT-ZM1 en muestras biológicas, comprendiendo dicho método amplificar un fragmento de DNA de longitud comprendida entre 100 y 350 pb a partir de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas utilizando una reacción en cadena de polimerasa con al menos dos iniciadores, uno de los cuales reconoce la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 6 desde el nucleótido de la posición 1 al nucleótido de la posición 341 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 10 desde el nucleótido de la posición 343 al nucleótido de la posición 484, reconociendo el otro una secuencia comprendida dentro de SEQ ID No. 1.
Description
Métodos y kits para identificar el suceso élite
GAT-ZM1 en muestras biológicas
La expresión fenotípica de un transgén en una
planta está determinada a la vez por la estructura del propio gen y
por su localización en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la
presencia del transgén (en un DNA extraño) en diferentes
localizaciones en el genoma influirá en el fenotipo global de la
planta de diferentes maneras. La introducción con éxito agronómico
o industrial de un rasgo comercialmente interesante en una planta
por manipulación genética puede ser un procedimiento laborioso que
depende de diferentes factores. La transformación y regeneración
reales de plantas transformadas genéticamente son sólo el primero en
una serie de pasos de selección, que incluyen caracterización
genética extensa, reproducción, y evaluación en pruebas de campo,
que conducen finalmente a la selección de un suceso élite.
La identificación inequívoca de un suceso élite
está adquiriendo importancia creciente en pista de las discusiones
acerca de Nuevos Alimentos y Piensos, segregación de productos GMO y
no-GMO y la identificación de material patentado.
Idealmente, dicho método de identificación es a la vez rápido y
simple, sin necesidad de una elaboración extensa en laboratorio.
Adicionalmente, el método debería proporcionar resultados que
permitan la determinación inequívoca del suceso élite sin
interpretación de
\hbox{expertos, pero que se mantenga bajo
escrutinio de expertos en caso necesario.}
GAT-ZM1 fue seleccionado como un
suceso élite en el desarrollo de maíz resistente al herbicida
Liberty®, por transformación del maíz con el plásmido pUC/Ac que
comprende el gen pat que codifica la tolerancia a la fosfinotricina.
El mismo se vende comercialmente como maíz Liberty Link®, tal como,
por ejemplo, Liberty Link® A6470LL, vendido por AgriGold/Akin Seed
Company. Las herramientas para uso en métodos simples e inequívocos
a fin de identificar el suceso élite GAT-ZM1 en
muestras biológicas se describen en esta memoria.
La presente invención se refiere a métodos para
identificar el suceso élite GAT-ZM1 en muestras
biológicas, métodos que están basados en iniciadores o sondas que
reconocen específicamente la secuencia flanqueante 5' y/o 3' de
GAT-ZM1.
De modo más específico, la invención se refiere
a un método que comprende la amplificación de una secuencia de un
ácido nucleico presente en muestras biológicas, utilizando una
reacción en cadena de polimerasa con al menos dos iniciadores, uno
de los cuales reconoce la región flanqueante 5' o 3' de
GAT-ZM1, reconociendo el otro una secuencia dentro
del DNA extraño, para obtener un fragmento de DNA de un tamaño
comprendido entre 100 y 350 pb. Preferiblemente, los iniciadores
reconocen una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de
GAT-ZM1, muy preferiblemente dentro de la región
flanqueante 5' de SEQ ID No. 6, y una secuencia dentro del DNA
extraño, respectivamente. De modo especialmente preferible, el
iniciador que reconoce la región flanqueante 5' comprende la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 11, y el iniciador que
reconoce una secuencia dentro del DNA extraño comprende la secuencia
de nucleótidos de SEQ ID No. 12 descrita en esta memoria.
La presente invención se refiere más
específicamente a un método para identificar el suceso élite
GAT-ZM1 en muestras biológicas, método que comprende
amplificar una secuencia de un ácido nucleico presente en una
muestra biológica, utilizando una reacción en cadena de polimerasa
con dos iniciadores que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ
ID No. 11 y SEQ ID No. 12 respectivamente, para obtener un fragmento
de DNA de una longitud comprendida entre 180 y 220 pb, con
preferencia aproximadamente 200 pb.
La presente invención se refiere adicionalmente
a las secuencias flanqueantes específicas de GAT-ZM1
descritas en esta memoria, que pueden utilizarse para desarrollar
métodos específicos de identificación para GAT-ZM1
en muestras biológicas. Más particularmente, la invención se refiere
a las regiones flanqueantes 5' y/o 3' de GAT-ZM1
que pueden utilizarse para el desarrollo de iniciadores y sondas
específicos. La invención se refiere adicionalmente a métodos de
identificación para la presencia de GAT-ZM1 en
muestras biológicas basados en el uso de tales iniciadores o sondas
específicos.
La invención se refiere adicionalmente a kits
para identificar el suceso élite GAT-ZM1 en muestras
biológicas, comprendiendo dichos kits al menos un iniciador o sonda
que reconoce específicamente la región flanqueante 5' o 3' de
GAT-ZM1.
Preferiblemente, el kit de la invención
comprende, además de un iniciador que reconoce específicamente la
región flanqueante 5' o 3' de GAT-ZM1, un segundo
iniciador que reconoce específicamente una secuencia dentro del DNA
extraño de GAT-ZM1, para uso en un protocolo de
identificación PCR. Preferiblemente, el kit de la invención
comprende dos iniciadores específicos, uno de los cuales reconoce
una secuencia dentro de la región flanqueante 5' de
GAT-ZM1, muy preferiblemente dentro de la región
flanqueante 5' de SEQ ID No. 6, reconociendo el otro una secuencia
dentro del DNA extraño. De modo especialmente preferible, el
iniciador que reconoce la región flanqueante 5' comprende la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 11, y el iniciador que
reconoce el transgén comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ
ID No. 12 descrita en esta memoria.
La invención se refiere adicionalmente a un kit
para identificar el suceso élite GAT-ZM1 en muestras
biológicas, comprendiendo dicho kit los iniciadores PCR que tienen
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 12 para
uso en el protocolo de identificación PCR de GAT-ZM1
descrito en esta memoria.
La invención se refiere también a un kit para
identificar el suceso élite GAT-ZM1 en muestras
biológicas, kit que comprende una sonda específica que tiene una
secuencia que corresponde (o es complementaria a) una secuencia que
tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con una región
específica de GAT-ZM1. Preferiblemente, la
secuencia de la sonda corresponde a una región específica que
comprende parte de la región flanqueante 5' o 3' de
GAT-ZM1. Muy preferiblemente, la sonda específica
tiene (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y
100% de identidad de secuencia con la secuencia comprendida entre
los nucleótidos 286 y 466 de SEQ ID No. 6.
Los métodos y kits abarcados por la presente
invención pueden utilizarse para diferentes propósitos tales como,
pero sin carácter limitante, los siguientes: identificar
GAT-ZM1 en plantas, material vegetal o en productos
tales como, pero sin carácter limitante, productos de alimentos o
piensos (nuevos o elaborados) que comprenden o se derivan de
material vegetal; adicional o alternativamente, los métodos y kits
de la presente invención pueden utilizarse para identificar
material transgénico de plantas para propósitos de segregación entre
material transgénico y no transgénico; adicional o
alternativamente, los métodos y kits de la presente invención pueden
utilizarse para determinar la calidad (es decir el porcentaje de
material puro) de material vegetal que comprende
GAT-ZM1.
La invención se refiere adicionalmente a las
regiones flanqueantes 5' y/o 3' de GAT-ZM1 así como
a los iniciadores y sondas específicos desarrollados a partir de
las secuencias flanqueantes 5' y/o 3' de
GAT-ZM1.
La incorporación de una molécula de DNA
recombinante en el genoma de una planta es resultado típicamente de
la transformación de una célula o tejido (o de otra manipulación
genética). El sitio particular de incorporación se debe a
integración "aleatoria" o se encuentra en una localización
predeterminada (si se utiliza un proceso de integración
direccionada).
El DNA introducido en el genoma vegetal como
resultado de la transformación de una célula o tejido vegetal con
un DNA recombinante o "DNA transformante" se conoce en esta
memoria como "DNA extraño", comprendiendo uno o más
"transgenes". Así, el DNA extraño puede comprender tanto DNA
recombinante como DNA reordenado de la planta, de nueva
introducción. Sin embargo, el término "DNA vegetal" en el
contexto de la presente invención hará referencia a DNA de la
planta que se encuentra en el mismo locus genético en la planta de
tipo salvaje correspondiente. El DNA extraño puede caracterizarse
por la localización y la configuración en el sitio de incorporación
de la molécula de DNA recombinante en el genoma de la planta. El
sitio en el genoma de la planta en el que se ha insertado un DNA
recombinante se conoce también como el "sitio de inserción" o
"sitio diana". La inserción del DNA recombinante en el genoma
de la planta puede estar asociada con una deleción de DNA de la
planta, a lo que se hace referencia "deleción del sitio diana".
Una "región flanqueante" o "secuencia flanqueante", tal
como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una secuencia de
al menos 20 pb, preferiblemente al menos 50 pb, y hasta 5000 pb del
genoma de la planta que está localizada inmediatamente aguas arriba
de y contigua a, o inmediatamente aguas abajo de y contigua al DNA
extraño. Procedimientos de transformación que conducen a
integración aleatoria del DNA extraño darán como resultado
transformantes con regiones flanqueantes diferentes, que son
características y exclusivas de cada transformante. Cuando el DNA
recombinante se introduce en una planta por cruzamiento
tradicional, su sitio de inserción en el genoma de la planta, o sus
regiones flanqueantes no se modificarán por lo general. Una
"región de inserción", tal como se utiliza en esta memoria,
hace referencia a la región correspondiente a la región de al menos
40 pb, preferiblemente al menos 100 pb, y hasta 10000 pb, abarcada
por la secuencia que comprende la región flanqueante aguas arriba
y/o aguas abajo de un DNA extraño en el genoma de la planta.
Teniendo en cuenta diferencias menores debidas a mutaciones dentro
de una especie, una región de inserción retendrá, después de
cruzamiento en una planta de la misma especie, al menos 85%,
preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, y muy preferiblemente
100% de identidad de secuencia con la secuencia que comprende las
regiones flanqueantes aguas arriba y aguas abajo del DNA extraño en
la planta obtenida originalmente por la transformación.
Un suceso se define como un locus genético
(artificial) que, como resultado de manipulación genética, lleva un
transgén que comprende al menos una copia de un gen de interés. Los
estados alélicos típicos de un suceso son la presencia o ausencia
del DNA extraño. Un suceso se caracteriza fenotípicamente por la
expresión del transgén. Al nivel genético, un suceso es parte de la
constitución genética de una planta. Al nivel molecular, un suceso
puede caracterizarse por el mapa de restricción (v.g. como se
determina por transferencia Southern), por las secuencias
flanqueantes aguas arriba y/o aguas abajo del transgén, la
localización de marcadores moleculares y/o la configuración
molecular del transgén. Usualmente, la transformación de una planta
con un DNA transformante que comprende al menos un gen de interés
conduce a una multitud de sucesos, cada uno de los cuales es
exclusivo.
Un suceso élite, tal como se utiliza en esta
memoria, es un suceso que se selecciona de un grupo de sucesos,
obtenidos por transformación con el mismo DNA transformante o por
retrocruzamiento con plantas obtenidas por dicha transformación,
basado en la expresión y estabilidad del o de los transgenes y su
compatibilidad con características agronómicas óptimas de la planta
que comprende el mismo. Así pues, los criterios para selección de
uno o más sucesos élite son uno o más, preferiblemente dos o más,
ventajosamente la totalidad de los siguientes:
- a)
- que la presencia del DNA extraño no pone en compromiso otras características deseadas de la planta, tales como aquéllas que se refieren a la eficiencia agronómica o el valor comercial;
- b)
- que el suceso se caracterice por una configuración molecular bien definida que es heredada de manera estable y para la cual pueden desarrollarse herramientas apropiadas para control de identidad;
- c)
- que el o los genes de interés exhiba(n) una expresión fenotípica correcta, apropiada y estable espacial y temporalmente, tanto en condición heterocigótica (o hemicigótica) como homocigótica del suceso, a un nivel comercialmente aceptable en un intervalo de condiciones ambientales en el que es probable que las plantas portadoras del suceso se vean expuestas durante el uso agronómico normal.
Se prefiere que el DNA extraño esté asociado con
una posición en el genoma de la planta que permite la introgresión
fácil en los antecedentes genéticos comerciales deseados.
El estado de un suceso como un suceso élite se
confirma por introgresión del suceso élite en diferentes
antecedentes genéticos relevantes y observación del cumplimiento
con uno, dos o la totalidad de los criterios, v.g. a), b) y c)
anteriores.
Un "suceso élite" se refiere por tanto a un
locus genético que comprende un DNA extraño, que responde a los
criterios arriba descritos. Una planta, material de planta o
progenie tal como semillas puede comprender uno o más sucesos élite
en su genoma.
Las herramientas desarrolladas para identificar
un suceso élite o la planta, material de planta que comprende un
suceso élite, o productos que comprenden material de planta que
comprende el suceso élite, están basadas en las características
genómicas específicas del suceso élite, tales como un mapa de
restricción específico de la región genómica que comprende el DNA
extraño, marcadores moleculares o la
\hbox{secuencia de la o
las regiones flanqueantes del DNA extraño.}
Una vez que se han secuenciado una o ambas
regiones flanqueantes del DNA extraño, pueden desarrollarse
iniciadores y sondas que reconocen específicamente esta (estas)
secuencia(s) en el ácido nucleico (DNA o RNA) de una muestra
por una técnica de biología molecular. Por ejemplo, puede
desarrollarse un método PCR para identificar el suceso élite en
muestras biológicas (tales como muestras de plantas, material de
planta o productos que comprenden material de planta). Una PCR de
este tipo está basada en al menos dos "iniciadores"
específicos, uno de los cuales reconoce una secuencia dentro de la
región flanqueante 5' o 3' del suceso élite, reconociendo la otra
una secuencia dentro del DNA extraño. Los iniciadores tienen
preferiblemente una secuencia comprendida entre 15 y 35 nucleótidos
que, en condiciones PCR optimizadas "reconocen específicamente"
una secuencia dentro de la región flanqueante 5' o 3' del suceso
élite y el DNA extraño del suceso élite respectivamente, de tal modo
que un fragmento específico ("fragmento de integración") se
amplifica a partir de una muestra de ácido nucleico que comprende
el suceso élite. Esto significa que únicamente el fragmento de
integración direccionado, y ninguna otra secuencia en el genoma de
la planta o DNA extraño, se amplifica en condiciones PCR
optimizadas.
Preferiblemente, el fragmento de integración
tiene una longitud comprendida entre 50 y 500 nucleótidos, muy
preferiblemente entre 100 y 350 nucleótidos. Preferiblemente, los
iniciadores específicos tiene una secuencia que tiene una identidad
comprendida entre 80 y 100% con una secuencia dentro de la región
flanqueante 5' o 3' del suceso élite y el DNA extraño del suceso
élite, respectivamente, con tal que los desapareamientos permitan
todavía la identificación específica del suceso élite con estos
iniciadores en condiciones PCR optimizadas. Sin embargo, la gama de
desapareamientos permisibles puede ser determinada fácilmente por
vía experimental y son conocidos por una persona experta en la
técnica.
Dado que la secuencia de los iniciadores y su
localización relativa en el genoma son exclusivos para el suceso
élite, la amplificación del fragmento de integración ocurrirá
solamente en muestras biológicas que comprendan el ácido nucleico
de) el suceso élite. Preferiblemente, cuando se realiza una PCR para
identificar la presencia de GAT-ZM1 en muestras
desconocidas, se incluye un control de una serie de iniciadores con
los cuales puede amplificarse un fragmento comprendido dentro de un
"gen interno" de la especie vegetal del suceso. Los genes de
alojamiento son genes que se expresan en la mayoría de los tipos de
células y que están relacionados con las actividades metabólicas
básicas comunes a todas las células. Preferiblemente, el fragmento
amplificado a partir del gen de alojamiento es un fragmento que es
mayor que el fragmento de integración amplificado. Dependiendo de
las muestras a analizar, pueden incluirse otros controles.
Protocolos PCR estándar se describen en la
técnica, por ejemplo en "PCR Applications Manual" (Roche
Molecular Biochemicals, 2ª edición, 1999). Las condiciones óptimas
para la PCR, con inclusión de a secuencia de los iniciadores
específicos, se especifican en un "Protocolo de identificación
PCR" para cada suceso élite. Sin embargo, debe entenderse que
cierto número de parámetros en el protocolo de identificación PCR
pueden precisar ajuste a las condiciones específicas del
laboratorio, y pueden modificarse ligeramente para obtener
resultados similares. Por ejemplo, el uso de un método diferente
para preparación de DNA puede requerir el ajuste de, por ejemplo,
la cantidad de iniciadores, la polimerasa y las condiciones de
reasociación utilizadas. Análogamente, la selección de otros
iniciadores puede dictar otras condiciones óptimas para el protocolo
de identificación PCR. Estos ajustes serán sin embargo evidentes
para una persona experta en la técnica, y se detallan adicionalmente
en los manuales actuales de la aplicación PCR tales como el citado
anteriormente.
De modo alternativo, pueden utilizarse
iniciadores específicos para amplificar un fragmento de integración
que puede ser utilizado como una "sonda específica" para
identificación de GAT-ZM1 en muestras biológicas. La
puesta en contacto de un ácido nucleico de una muestra biológica,
con la sonda, en condiciones que permiten la hibridación de la sonda
con su fragmento correspondiente en el ácido nucleico, da como
resultado la formación de un híbrido ácido nucleico/sonda. La
formación de este híbrido puede detectarse (v.g. por marcación del
ácido nucleico o la sonda), con lo cual la formación de este híbrido
indica la presencia de GAT-ZM1. Tales métodos de
identificación basados en hibridación con una sonda específica (sea
sobre un soporte de fase sólida o en solución) han sido descritos en
la técnica. La sonda específica es preferiblemente una secuencia
que, en condiciones optimizadas, se hibrida específicamente a una
región dentro de la región flanqueante 5' o 3' del suceso élite y
que comprende también preferiblemente parte del DNA extraño contiguo
a la misma (al que se hace referencia en lo sucesivo como "región
específica"). Preferiblemente, la sonda específica comprende una
secuencia de una longitud comprendida entre 50 y 500 pb,
preferiblemente de 100 a 350 pb, que tiene al menos una identidad (o
complementariedad) de secuencia de 80%, preferiblemente entre 80 y
85%, más preferiblemente entre 85 y 90%, de modo especialmente
preferible entre 90 y 95%, y muy preferiblemente entre 95 y 100% con
la secuencia de nucleótidos de una región específica.
Preferiblemente, la sonda específica comprenderá una secuencia de
aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos contiguos
idénticos (o complementarios) a una región específica del suceso
élite.
Un "kit", tal como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a un juego de reactivos para el propósito
de realización del método de la invención, más particularmente, la
identificación del suceso élite GAT-ZM1 en muestras
biológicas. Más particularmente, una realización preferida del kit
de la invención comprende al menos uno o dos iniciadores
específicos, como se han descrito arriba. Opcionalmente, el kit
puede comprender además cualquier otro reactivo descrito en esta
memoria en el protocolo de identificación PCR. Alternativamente, de
acuerdo con otra realización de esta invención, el kit puede
comprender una sonda específica, como se ha descrito arriba, que se
hibrida específicamente con el ácido nucleico de las muestras
biológicas para identificar la presencia de GAT-ZM1
en ellas. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier
otro reactivo (tal como, pero sin carácter limitante, tampón de
hibridación, marcador) para identificación de
GAT-ZM1 en muestras biológicas, utilizando la sonda
específica.
El kit de la invención puede utilizarse, y sus
componentes pueden ajustarse específicamente, para propósitos de
control de calidad (v.g., pureza de lotes de semillas), detección
del suceso élite en material vegetal o material que comprende o se
deriva de material vegetal, tal como, pero sin carácter limitante,
productos alimenticios o piensos.
Tal como se utiliza en esta memoria,
"identidad de secuencia" con relación a secuencias de
nucleótidos (DNA o RNA), hace referencia al número de posiciones
con nucleótidos idénticos dividido por el número de nucleótidos en
la más corta de las dos secuencias. La alineación de las dos
secuencias de nucleótidos se realiza por el algoritmo de Wilbur y
Lipmann (Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:
726) utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una
longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalidad por laguna de
4. El análisis asistido por ordenador y la interpretación de los
datos de secuencia, con inclusión de la alineación de las
secuencias como se ha descrito arriba, pueden, v.g., realizarse
convenientemente utilizando los programas del Intelligenetics TM
Suite (Intelligenetics Inc., CA) o el paquete de soporte lógico de
análisis de secuencias del Genetics Computer Group (GCG, Centro de
Biotecnología de la Universidad de Wisconsin). Las secuencias se
indican como "esencialmente similares" cuando dichas secuencias
tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 75%,
de modo particular al menos aproximadamente 80%, de modo más
particular al menos aproximadamente 85%, de modo muy particular
aproximadamente 90%, en especial aproximadamente 95%, y de modo más
especial aproximadamente 100%. Está claro que cuando se dice que
secuencias de RNA son esencialmente similares o tienen cierto grado
de identidad de secuencia con secuencias de DNA, la timidina T en la
secuencia de DNA se considera igual a uracilo (U) en la secuencia
de RNA. "Complementario a", tal como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a la complementariedad entre los
nucleótidos A y T(U), y G y C en las secuencias de
nucleótidos.
El término "iniciador", tal como se utiliza
en esta memoria, abarca cualquier ácido nucleico que es capaz de
iniciar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso
dependiente de un molde, tal como PCR. Típicamente, los iniciadores
son oligonucleótidos de 10 a 30 pares de bases, pero pueden
emplearse secuencias más largas. Los iniciadores pueden
proporcionarse en forma bicatenaria, aunque se prefiere la forma
monocatenaria. Las sondas pueden utilizarse como iniciadores, pero
están diseñadas para fijarse al DNA o RNA diana y no precisan ser
utilizadas en un proceso de amplificación.
El término "reconocimiento", tal como se
utiliza en esta memoria cuando se hace referencia a iniciadores
específicos, se refiere al hecho de que los iniciadores específicos
se hibridan específicamente a una secuencia de ácido nucleico en el
suceso élite en las condiciones expuestas en el método (tales como
las condiciones del protocolo de identificación PCR), con lo que la
especificidad está determinada por la presencia de controles
positivo y negativo.
El término "hibridación", como se utiliza
en esta memoria cuando se hace referencia a sondas específicas, se
refiere al hecho de que la sonda se fija a una región específica en
la secuencia de ácido nucleico del suceso élite en condiciones
estándar de severidad. Condiciones estándar de severidad, tal como
se utilizan en esta memoria, hace referencia a las condiciones para
hibridación descritas en la misma o a las condiciones de
hibridación convencionales como han sido descritas por Sambrook
et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que, por ejemplo,
pueden comprender los pasos siguientes: 1) inmovilización de
fragmentos de DNA genómico vegetal en un filtro, 2)
pre-hibridación del filtro durante 1 a 2 horas a
42ºC en formamida al 50%, 5X SSPE, 2X reactivo de Denhardt y 0,1%
SDS, o durante 1 a 2 horas a 68ºC en 6X SSC, 2X reactivo Denhardt y
0,1% SDS, 3) adición de la sonda de hibridación que ha sido
marcada, 4) incubación durante 16 a 24 horas, 5) lavado del filtro
durante 20 min a la temperatura ambiente en 1X SSC, 0,1% SDS, 6)
lavado del filtro tres veces durante 20 min, cada una a 68ºC en 0,2X
SSC, 0,1% SDS, y 7) exposición del filtro durante 24 a 48 horas a
película de rayos X a -70ºC con un filtro intensificador.
Como se utiliza en esta memoria, una muestra
biológica es una muestra de una planta, material vegetal o productos
que comprenden material vegetal. El término "planta" tiene por
objeto abarcar tejidos de la planta del maíz (Zea mays), en
cualquier etapa de su maduración, así como a cualesquiera células,
tejidos u órganos tomados de o derivados de cualquier planta de
este tipo, incluyendo sin limitación, cualesquiera semillas, hojas,
tallos, flores, raíces, células simples, gametos, cultivos de
células, cultivos de tejidos o protoplastos. "Material
vegetal", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a
material que se obtiene o se deriva de una planta. Productos que
comprenden material vegetal se refieren a alimentos, piensos u otros
productos que se producen utilizando material vegetal o pueden
estar contaminados con material vegetal. Se entenderá que, en el
contexto de la presente invención, tales muestras biológicas se
ensayan respecto a la presencia de ácidos nucleicos específicos
para GAT-ZM1, lo que implica la presencia de ácidos
nucleicos en las muestras. Así, los métodos a que se hace
referencia en esta memoria para identificación del suceso élite
GAT-ZM1 en muestras biológicas, se refieren a la
identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que
comprenden el suceso élite.
Tal como se utiliza en esta memoria, "que
comprende" debe interpretarse como especificación de la presencia
de las características, entidades completas, pasos, reactivos o
componentes indicados a los que se ha hecho referencia, pero no
excluye la presencia o adición de una o más características,
integradores, pasos o componentes o grupos de los mismos. Así,
v.g., un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de
nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o
aminoácidos que los citados actualmente, es decir, estar
incluido(a) en un ácido nucleico o proteína mayor. Un gen
quimérico que comprende una secuencia de DNA que está definida
funcional o estructuralmente, puede comprender secuencias de DNA
adicionales, etc.
Los ejemplos siguientes describen la
identificación del desarrollo de herramientas para la identificación
del suceso élite GAT-ZM1 en muestras
biológicas.
A no ser que se indique otra cosa, todas las
técnicas de DNA recombinante se llevan a cabo de acuerdo con
protocolos estándar como se describen en Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de
Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular
Biology, Current Protocols, USA. Materiales y métodos estándar
para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant
Molecular Biology Labfax (1993) por RD. D. Croy publicado por BIOS
Scientific Publications Ltd. (Reino Unido) y Blackwell Scientific
Publications, Reino Unido.
En la descripción y los ejemplos, se hace
referencia a las secuencias siguientes:
- SEQ ID No. 1:
- secuencia de los elementos genéticos del vector pUC/Ac
- SEQ ID No. 2:
- iniciador MDB286
- SEQ ID No. 3:
- iniciador MDB391
- SEQ ID No. 4:
- iniciador MDB411
- SEQ ID No. 5:
- iniciador MDB420
- SEQ ID No. 6:
- secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 5' de GAT-ZM1 iniciador MDB439
- SEQ ID No. 7:
- iniciador MDB439iniciador VDS44
- SEQ ID No. 8:
- iniciador VDS44iniciador MDB522
- SEQ ID No. 9:
- iniciador MDB522
- SEQ ID No. 10:
- secuencia de nucleótidos que comprende una región flanqueante 3' de GAT-ZM1
- SEQ ID No. 11:
- iniciador COR17
- SEQ ID No. 12:
- iniciador COR18
- SEQ ID No. 13:
- iniciador COR 15
- SEQ ID No. 14:
- iniciador COR16
Los Ejemplos siguientes, que no tienen por
objeto limitar la invención a las realizaciones específicas
descritas, pueden comprenderse en asociación con la Figura adjunta,
que se incorpora en esta memoria por referencia, en la
cual:
cual:
Fig. 1: Registro de materiales desconocidos
utilizando el protocolo de identificación PCR desarrollado para
GAT-ZM1. Secuencia de carga del gel: Materiales
desconocidos: pistas 1, 2, 5, 6, 8, 11, 13, 14, muestras de DNA de
plantas de maíz que comprenden el suceso transgénico
GAT-ZM1; pistas 4, 9, 10, 12, muestras de DNA de
plantas de maíz que no comprenden el suceso élite
GAT-ZM1; pista 3, fallo de PCR. Pistas de control:
pistas 19, 21, muestras de DNA de control de plantas de maíz que
comprenden el suceso élite GAT-ZM1; pistas 20, 22,
muestras de DNA de control de plantas de maíz de tipo salvaje; pista
23, sin control de molde; pista 24, marcador de peso
molecular.
molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrolló maíz resistente a los herbicidas
por transformación de maíz con el vector pUC/Ac que comprende la
secuencia codificante de un gen pat que codifica la enzima
fosfinotricinacetil-transferasa, bajo el control
del promotor constitutivo 35S del virus del Mosaico de la Coliflor.
Una descripción detallada de los elementos genéticos de pUC/Ac se
proporciona en la Tabla 1. La secuencia de nucleótidos de los
elementos genéticos de pUC/Ac se proporciona en SEQ ID No. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El suceso élite GAT-ZM1 se
seleccionó basándose en un procedimiento extenso de selección basado
a su vez en la expresión y estabilidad satisfactorias del gen de
resistencia a los herbicidas y su compatibilidad con
características agronómicas óptimas.
La secuencia de las regiones flanqueantes del
DNA extraño en el suceso GAT-ZM1 se determinó
utilizando el método térmico asimétrico entrelazado (TAIL-)PCR
descrito por Liu et al. (1995), Plant J. 8(3):
457-463). Este método utiliza tres iniciadores
anidados en reacciones sucesivas junto con un iniciador degenerado
arbitrario más corto de tal modo que las eficiencias de
amplificación de los productos específicos e inespecíficos pueden
controlarse térmicamente. Los iniciadores específicos se
seleccionaron para reasociación al límite del DNA extraño y se
basaron en sus condiciones de reasociación. Una pequeña cantidad (5
\mul) de productos PCR impurificados secundarios y terciarios se
analizaron en un gel de agarosa al 1%. El producto PCR terciario se
utilizó para amplificación preparativa, se purificó y se secuenció
en un secuenciador automático utilizando el kit de ciclo
DyeDeoxy
Terminator.
Terminator.
\newpage
Los iniciadores utilizados fueron:
El fragmento amplificado utilizando
MDB286-MDB420 tenía una longitud de aprox. 1100 pb,
cuya secuencia completa se determinó (SEQ ID No. 6). La secuencia
entre los nucleótidos 1 y 341 corresponde a DNA vegetal, mientras
que la secuencia entre los nucleótidos 342 y 1041 corresponde a
T-DNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Los iniciadores utilizados fueron:
El fragmento amplificado utilizando
MDB286-MDB522 tenía una longitud de aprox. 450 pb,
cuya secuencia completa se determinó (SEQ ID No. 10). La secuencia
entre los nucleótidos 1 y 342 corresponde a T-DNA,
mientras que la secuencia entre los nucleótidos 343 y 484
corresponde a DNA vegetal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desarrollaron iniciadores específicos que
reconocen secuencias dentro del suceso élite. Más particularmente,
se desarrolló un iniciador que reconoce una secuencia dentro de la
región flanqueante 5' de GAT-ZM1. Se seleccionó
luego un segundo iniciador dentro de la secuencia del DNA extraño de
tal modo que los iniciadores abarcan una secuencia de
aproximadamente 200 pb. Se encontró que los iniciadores siguientes
proporcionan resultados particularmente claros y reproducibles en
una reacción PCR sobre DNA de GAT-ZM1:
En el cóctel PCR se incluyen preferiblemente
iniciadores direccionados a una secuencia endógena. Estos
iniciadores sirven como control interno en muestras desconocidas y
en el control de DNA positivo. Un resultado positivo con el par de
iniciadores endógenos demuestra que existe abundante DNA de calidad
adecuada en la preparación de DNA genómico para generación de un
producto PCR. Se seleccionaron los iniciadores endógenos para
reconocer un gen doméstico en Zea mays:
Los fragmentos amplificados esperados en la
reacción PCR son:
Para el par de iniciadores
COR15-COR16: 513 pb (control endógeno)
Para el par de iniciadores
COR17-COR18: 202 pb (suceso élite
GAT-ZM1)
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó DNA molde a partir de un bocado de
hojas de acuerdo con Edwards et al. (Nucleic Acid Research,
19, p 1349, 1991). Cuando se utiliza DNA preparado con otros
métodos, debe realizarse una prueba de ensayo utilizando cantidades
diferentes de molde. Usualmente 50 mg del DNA genómico de molde
proporciona los resultados óptimos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evitar resultados positivos o negativo
falsos, se determinó que deberían incluirse los controles positivo
y negativo siguientes en una prueba PCR:
- -
- Control de Mezcla Maestra (control negativo de DNA). Ésta es una PCR en la cual no se añade cantidad alguna de DNA a la reacción. Cuando se observa el resultado esperado, sin producto PCR alguno, esto indica que el cóctel PCR no estaba contaminado con DNA diana.
- -
- Un control positivo de DNA (muestra de DNA genómico que se sabe contiene las secuencias transgénicas). La amplificación con éxito de este control positivo demuestra que la PCR se realizó en condiciones que permiten la amplificación de las secuencias diana.
- -
- Un control de DNA de tipo salvaje. Ésta es una PCR en la cual el DNA molde proporcionado es DNA genómico preparado a partir de una planta no transgénica. Cuando se observa el resultado esperado, a saber ausencia de amplificación de un producto PCR transgénico pero amplificación del producto PCR endógeno, esto indica que no existe amplificación de fondo del transgén detectable en una muestra de DNA genómico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron los resultados óptimos en las
condiciones siguientes:
- -
- la mezcla PCR para reacciones de 25 \mul contiene:
- 2,5 \mul de DNA molde
- 2,5 \mul de Tampón de Amplificación 10x (suministrado con Polimerasa Taq)
- 0,5 \mul de dNTP's 10 mM
- 0,5 \mul de COR17 (10 picomoles/\mul)
- 0,5 \mul de COR18 (10 picomoles/\mul)
- 0,25 \mul de COR15 (10 picomoles/\mul)
- 0,5 \mul de COR16 (10 picomoles/\mul)
- 0,1 \mul de DNA-polimerasa Taq (5 unidades/\mul)
- agua hasta 25 \mul;
- -
- el perfil de termociclación a seguir para resultados óptimos es el siguiente:
- 4 min a 95ºC
- Seguido por:
- 1 min a 95ºC
- \quad
- 1 min a 57ºC
- \quad
- 2 min a 72ºC
- \quad
- durante 5 ciclos
- Seguido por:
- 30 s a 92ºC
- \quad
- 30 s a 57ºC
- \quad
- 1 min a 72ºC
- \quad
- durante 25 ciclos
- Seguido por:
- 5 minutos a 72ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Para visualizar óptimamente los resultados de la
PCR, se determinó que entre 10 y 20 \mul de las muestras PCR
deberían aplicarse sobre un gel de agarosa al 1,5% (tampón
Tris-borato) con un marcador de peso molecular
apropiado (v.g. 100 pb, de la escalera de PHARMACIA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó que los datos de muestras de DNA de
plantas transgénicas dentro de una operación PCR simple y un cóctel
PCR simple no deberían ser aceptables a no ser que 1) el control
positivo de DNA exhiba los productos PCR esperados (fragmentos
transgénicos y endógenos), 2) el control negativo de DNA es negativo
para la amplificación PCR (ausencia de fragmentos) y 3) el control
de DNA de tipo salvaje muestra el resultado esperado (amplificación
de fragmentos endógenos).
Cuando se sigue el Protocolo de Identificación
de PCR para GAT-ZM1 como se ha descrito arriba,
pistas que muestran cantidades visibles de los productos PCR
transgénicos y endógenos de los tamaños esperados, indican que la
planta correspondiente a partir de la cual se preparó el DNA
genómico de molde ha heredado el suceso élite
GAT-ZM1. Las pistas que no muestran cantidades
visibles de ninguno de los productos PCR transgénicos y que
muestran cantidades visibles del producto PCR endógeno, indican que
la planta correspondiente a partir de la cual se preparó el DNA
genómico de molde, no comprende el suceso élite. Las pistas que no
muestran cantidades visibles de los productos PCR endógenos y
transgénicos, indican que la calidad y/o cantidad del DNA genómico
no permitía la generación de un producto PCR. Estas plantas no
pueden evaluarse. La preparación del DNA genómico debería repetirse
y tiene que realizarse una nueva ejecución de la PCR, con los
controles apropiados.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de intentar escrutar materiales
desconocidos, tiene que realizarse una operación de prueba, con
todos los controles apropiados. El protocolo desarrollado podría
requerir optimización para componente que puedan diferir entre
distintos laboratorios (preparación del DNA molde,
DNA-polimerasa Taq, calidad de los iniciadores,
dNTP's, termociclador, etc.).
La amplificación de la secuencia endógena juega
un papel fundamental en el protocolo. Es preciso alcanzar
condiciones de PCR y de termociclación que amplifiquen cantidades
equimolares tanto de la secuencia endógena como de la transgénica
en un molde de DNA genómico transgénico conocido. Siempre que no se
amplifique el fragmento endógeno direccionado o siempre que las
secuencias direccionadas no se amplifiquen con las mismas
intensidades de tinción con bromuro de etidio, tal como se juzga
por la electroforesis en gel de azarosa, puede ser necesaria la
optimización de las condiciones de la PCR.
Se ensayó material de hojas de Zea mays
de varias plantas, algunas de las cuales comprendían
GAT-ZM1, de acuerdo con el protocolo arriba
descrito. Las muestras del suceso élite GAT-ZM1 y de
Zea mays de tipo salvaje se tomaron como controles positivo
y negativo, respectivamente.
La Figura 1 ilustra el resultado obtenido con el
protocolo de identificación PCR del suceso élite para
GAT-ZM1 sobre varias muestras de plantas de maíz
(pistas 1 a 14). Se encontró que las muestras en las pistas 1, 2,
5, 6, 7, 8, 11, 13, y 14 contenían el suceso élite dado que se
detecta la banda de 202 pb, mientras que las muestras en las pistas
4, 9, 10, y 12 no contienen GAT-ZM1. La pista 3
indica un fallo de la PCR, dado que no se detecta la banda de
control. Las pistas 19 y 20 representan muestras de control
positivos de GAT-ZM1, las pistas 20 y 22
representan controles de Zea mays no transgénicos; la pista
23 representa la muestra de control negativo (agua), y la pista 24
el Marcador de Peso Molecular (100 pb).
Se obtiene un fragmento de integración
específico de GAT-ZM1 por amplificación PCR
utilizando los iniciadores específicos COR17 (SEQ ID No. 11) y
COR18 (SEQ ID No. 12) o por síntesis química y se marca. Este
fragmento de integración se utiliza como sonda específica para la
detección de GAT-ZM1 en muestras biológicas. Se
extrae el ácido nucleico de las muestras de acuerdo con
procedimientos estándar. Este ácido nucleido se pone luego en
contacto con la sonda específica en condiciones de hibridación que
están optimizadas para permitir la formación de un híbrido. La
formación del híbrido se detecta luego para indicar la presencia del
ácido nucleico de GAT-ZM1 en la muestra.
Opcionalmente, el ácido nucleico existente en las muestras se
amplifica utilizando los iniciadores específicos antes de la puesta
en contacto con la sonda específica. Alternativamente, el ácido
nucleico se marca antes de la puesta en contacto con la sonda
específica en lugar del fragmento de integración. Opcionalmente, la
sonda específica se fija a un soporte sólido (tal como, pero sin
carácter limitante, un filtro, una cinta o cuentas), antes del
contacto con las muestras.
<110> AVENTIS CROPSCIENCE N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y kits para identificar el
suceso élite GAT-ZM1 en muestras biológicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EE-ZM1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/481049
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-01-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3983
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: elementos Genéticos de pUC/Ac
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (412)..(618)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> terminador 35S del Virus del Mosaico
de la Coliflor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (619)..(636)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia polienlazadora
sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (637)..(1188)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del gen pat
sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1217)..(1746)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> promotor 35S del Virus del Mosaico
de la Coliflor
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador MDB286
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipngtcgaswga nawgaa
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador MDB391
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatacaag catggtggat gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador MDB411
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggcatgccg ctgaaatcac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador MDB420
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtttcgctc atgtgttgag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1073
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia que comprende una región flanqueante de
GAT-ZM1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(341)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA de planta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (342)..(1073)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T-DNA de pUC/Ac
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fijación de iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (286)..(307)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de fijación de iniciador
COR17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fijación de iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> Complemento((466)..(487))
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de fijación de iniciador
COR18
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador MDB439
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcatggtta tggcagcact gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador VDS44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtcatgcc atccgtaaga tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador MDB522
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctttgaag acgtggttgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 484
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia que comprende una región flanqueante 3'de
GAT-ZM1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(342)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> T-DNA de pUC/Ac
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (343)..(484)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA de planta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador COR17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtgagctc gaatgttgtt ct
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador COR18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttagacgt caggtggcac tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador COR15
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgtcaagg atcattggtg tc
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: iniciador COR16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaagttc agcataagct gt
\hfill22
Claims (10)
1. Un método para identificar el suceso élite
GAT-ZM1 en muestras biológicas, comprendiendo dicho
método amplificar un fragmento de DNA de longitud comprendida entre
100 y 350 pb a partir de un ácido nucleico presente en dichas
muestras biológicas utilizando una reacción en cadena de polimerasa
con al menos dos iniciadores, uno de los cuales reconoce la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 6 desde el nucleótido de la
posición 1 al nucleótido de la posición 341 o la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID No. 10 desde el nucleótido de la posición 343
al nucleótido de la posición 484, reconociendo el otro una secuencia
comprendida dentro de SEQ ID No. 1.
2. El método de la reivindicación 1, en el cual
uno de dichos iniciadores reconoce una secuencia dentro de SEQ ID
No. 6 desde el nucleótido de la posición 1 al nucleótido de la
posición 341, y dicho otro iniciador reconoce una secuencia dentro
de SEQ ID No. 1.
3. El método de la reivindicación 2, en donde
dichos iniciadores están constituidos sustancialmente por la
secuencia de SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 12, respectivamente.
4. El método de la reivindicación 1, método que
comprende amplificar un fragmento de aproximadamente 202 pb
utilizando el Protocolo de Identificación PCR para
GAT-ZM1, en donde la secuencia de dichos iniciadores
corresponde a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 11 y SEQ ID
No. 12, respectivamente.
5. Un kit para identificar el suceso élite
GAT-ZM1 de muestras biológicas, comprendiendo dicho
kit un iniciador PCR, que reconoce específicamente una secuencia
dentro de SEQ ID No. 6 desde el nucleótido de la posición 1 al
nucleótido de la posición 341 o dentro de SEQ ID No. 10 desde el
nucleótido de la posición 343 al nucleótido de la posición 484 y un
segundo iniciador PCR que reconoce una secuencia dentro de SEQ ID
No. 1.
6. El kit de la reivindicación 5, en donde dicho
iniciador PCR reconoce una secuencia dentro de SEQ ID No. 6 desde
el nucleótido en la posición 1 al nucleótido en la posición 341.
7. El kit de la reivindicación 6, en donde
dichos iniciadores PCR están constituidos sustancialmente por la
secuencia de SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 12, respectivamente.
8. Un método para identificar el suceso élite
GAT-ZM1 en muestras biológicas, método que comprende
la detección de un fragmento de DNA de al menos 100 pb en dichas
muestras biológicas con una sonda específica que reconoce
específicamente una secuencia dentro de SEQ ID No. 6 desde el
nucleótido de la posición 1 al nucleótido de la posición 341 y
parte del DNA extraño de SEQ ID No. 1 contiguo a la misma o que
reconoce específicamente una secuencia de SEQ ID No. 10 desde el
nucleótido de la posición 343 al nucleótido de la posición 484 y
parte del DNA extraño de SEQ ID No. 1 contiguo a la misma.
9. El método de la reivindicación 8, método que
comprende hibridar un ácido nucleido de muestras biológicas con una
sonda que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID
No. 6, desde el nucleótido 286 al 487.
10. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 8, que es un método para confirmar la pureza de
semillas.
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