ES2277913T3 - Vacunas de adn mejoradas para los bovinos. - Google Patents
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Abstract
Vacuna de ADN que comprenden un plásmido que contiene, un ácido nucleico que codifica un inmunogén del herpesvirus bovino del tipo 1 (BHV-1) y los elementos necesarios para su expresión in vivo, N-(2-hidroxietil)-N, N-(dimetil-2, 3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio (DMRIE) y dioleoil-fosfatidil-etanolamina (DOPE).
Description
Vacunas de ADN mejoradas para los bovinos.
La presente invención tiene por objeto unas
vacunas de ADN mejoradas para los bovinos.
La utilización de moléculas de ácido
desoxirribonucleico (ADN) parar la vacunación se conoce desde el
inicio de los años 90 (Wolf et al., Science,
247:1465-1468 (1990)). Esta técnica de vacunación
induce una inmunidad celular y humoral después de la transfección
in vivo de células del sujeto a vacunar por parte de
moléculas de ADN o ARN que codifican las proteínas inmunológicamente
activas.
Una vacuna de ADN se compone al menos de un
plásmido, que puede ser expresado por la maquinaria celular del
sujeto a vacunar, y de un vehículo o de un excipiente
farmacéuticamente aceptable. La secuencia nucleotídica de este
plásmido codifica, entre otros, uno o varios inmunogenes, tales como
las proteínas o glicoproteínas capaces de inducir, en el sujeto a
vacunar, una respuesta inmunitaria celular (movilización de los
linfocitos T) y humoral (estimulación de la producción de
anticuerpos dirigidos específicamente contra el inmunogén) (Davis
H. L., Current Opinion Biotech., 8: 635-640
(1997)).
No todos los inmunogenes procedentes de un
patógeno son antígenos lo bastante eficaces de forma natural para
inducir una respuesta inmunitaria protectora óptima en el animal a
vacunar. Por tanto, es necesario mejorar la respuesta
inmunitaria.
Se han propuesto diferentes vías de
administración de la vacuna de ADN (intraperitoneal, intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intradérmica, mucosa, etc.). Del mismo
modo, se han propuesto diferentes medios de administración,
principalmente las partículas de oro recubiertas de ADN y
proyectadas con objeto de penetrar dentro de las células de la piel
del sujeto a vacunar (Tang et al., Nature,
356:152-154 (1992)), y los inyectores mediante
chorro líquido que permiten transfectar a la vez las células de la
piel y las células de los tejidos subyacentes (Furth et al.,
Analytical Bioch., 205:365-368 (1992)).
Se han utilizado ciertos compuestos químicos
para la transfección in vitro del ADN:
A/ - los lípidos catiónicos.
Los lípidos catiónicos se dividen a su vez en
cuatro subgrupos.
- 1)
- los lípidos catiónicos que contienen sales de amonio cuaternarias, como por ejemplo, el DOTMA (dioleoiloxipropil-trimetilamonio, producido por Gibco bajo el nombre de Lipofectine), el DOTAP (trimetil-2,3-(octadec-9-ene-oiloxi)-1-propanamonio; Gregoriadis et al., FEBS Letters, 402:107-110 (1997)), el DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanaminio; WO-A-9634109), el DLRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodeciloxi)-1-propanaminio; Felgner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 772:126-139 (1995)).
- Los lípidos catiónicos que contienen sales de amonio cuaternarias pueden estar asociadas o no con un lípido neutro suplementario, tal como el DOPC (dioleoil-fosfatidil-colina) o el DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina) (J.P. Behr, Bioconjugate Chemistry, 5:382-389 (1994)).
- 2)
- las lipoaminas, como, por ejemplo, la DOGS (dioctadecilamidoglicilespermina, producida por Promega bajo el nombre de Transfectam; Abdallah et al., Biol. Cell, 85:1-7 (1995)), el DC-Chol (dimetilaminoetano-carbamoilcolesterol; Gao y Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280-285 (1991)), el BGSC (bis-guanidino-espermidina- colesterol), el BGTC (bis-guanidino-tren-colesterol) (Vigneron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9682-9686 (1996)).
- 3)
- los lípidos catiónicos que contienen sales de amonio cuaternarias, como por ejemplo, el DOSPA (N,N-dimetil-N-(2-(esperminacarboxamido)etil)-2,3-bis(dioleoiloxi)-1-propanimidio pentahidrocloruro, comercializado por Gibco bajo el nombre de LipofectAmine®; Hawley-Nelson et al., Focus, 15:73-79 (1993), el GAP-DLRIE (N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(dodeciloxi)-1-propanaminio; Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93:11454-11459 (1996); Norman et al., Vacine, 15:801-803).
- 4)
- los lípidos que contienen las sales de amidina, como, por ejemplo, el ADPDE, el ADODE (Ruysschaert et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203:1622-1628 (1994)).
B/ - los polímeros, como, por ejemplo, el
SuperFect^{TM} (moléculas de dendrímeros activadas, producidas por
Qiagen; Xu et al., Mol. Genet. Metab.,
64:193-197 (1998)), et
C/ - los agentes bioquímicos, como, por ejemplo,
las toxinas, principalmente las toxinas del cólera.
Algunos de estos compuestos se utilizan también
en la formulación de las vacunas de ADN con resultados más que
moderados. Los conocimientos en materia de transfección in
vitro no se pueden transponer a la vacunación con ADN cuando el
objetivo final es asegurar una reacción inmunitaria protectora. Los
efectos negativos sobre la inducción de una protección inmunitaria
eficaz se han constatado también con compuestos que se sabe
favorecen la transfección in vitro. Ciertos compuestos
químicos de formulación son tóxicos en dosis elevadas para las
células transfectadas.
En los trabajos de Etchart (Etchart et al.,
J. Gen. Virol., 78:1577-1580 (1997)), la
utilización de DOTAP no ha tenido un efecto adyuvante durante la
administración de la vacuna de ADN por la vía intranasal, aunque
tenía un poco de efecto por la vía oral. El DOTAP se ha utilizado
igualmente en vacunas de ADN que codifican la hemaglutinina (HA)
del virus de la gripe en los ratones modelo administrados por la vía
intranasal (Ban et al., Vaccine, 15:811-813
(1997)), pero la adición de DOTAP ha inhibido la respuesta
inmunitaria. La utilización de DC-Chol o de
DOTAP/DOPE en vacunas de ADN, que codificaban la proteína de
superficie (S) del virus de la hepatitis B en los ratones modelo,
administradas por la vía intramuscular a permitido aumentar la
respuesta en anticuerpos, aunque la utilización de la Lipofectine (o
DOTMA) no ha aumentado esta respuesta (Gregoriadis et al., FEBS
Letters, 402:107-110 (1997)). El
DC-Chol/DOPE se ha utilizado igualmente en vacunas
de ADN contra el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV, proteína
Env) en los ratones modelo, cuya administración por vía
intramuscular a inducido una respuesta inmunitaria más eficaz,
aunque la administración por la vía subcutánea o intradérmica no la
ha aumentado (Ishii et al., AIDS Res. Hum. Retro.,
13:1421-1428 (1997)).
La adición de ciertas citocinas, especialmente
las interleucinas o los interferones, puede permitir mejorar la
respuesta inmunitaria inducida en concreto por las vacunas de ADN.
Cada citocina desencadena una reacción que le es propia, y que
orienta más o menos la respuesta inmunitaria hacia una respuesta
celular o hacia una respuesta humoral (Pasquini et al., Immunol.
Cell. Biol., 75:397-401 (1997); Kim et al.,
J. Interferon Cytokine Res., 19:77-84 (1999)).
Los efectos adyuvantes de una citocina procedente de una especie
determinada no son necesariamente los mismos si el contexto
inmunitario varía, especialmente si esta citocina se administra a
otra especie, por tanto dentro de un sistema inmunitario heterólogo.
La adición de citocina puede igualmente no tener efecto adyuvante
alguno, o incluso desembocar en una inversión del efecto buscado, es
decir, una disminución o una inhibición de la respuesta
inmunitaria. Así pues, una vacuna de ADN que codifica una cadena
sencilla de una inmunoglobulina fusionada con la
GM-CSF no aumenta la respuesta inmunitaria, aunque
la administración directa en el ratón de esta proteína de fusión es
eficaz, al igual la administración de una proteína de fusión
formada por Fv y la citocina IL-1beta o la
administración de una vacuna de ADN que codifica esta última
proteína de fusión (Hakim et al., J. Immunol.,
157:5503-5511 (1996)). La utilización de plásmidos
que coexpresan la citocina IL-2 y la proteína de la
cubierta del virus de la hepatitis B en una conformación fusionada o
no fusionada desemboca en el aumento de las respuestas inmunitarias
humorales y celulares (Chow et al., J. Virol.,
71:169-178 (1997)). Pero la utilización de un
plásmido bicistrónico, que codifica la proteína gp120 del virus de
la inmunodeficiencia adquirida humana (HIV-1) y la
citocina IL-2, ha inducido una respuesta inmunitaria
específica anti-gp120 más débil que la obtenida
mediante la utilización de un plásmido monocistrónico que codifica
únicamente la gp120 (Barouch et al., J. Immunol.,
161:1875-1882 (1998)). La coinyección en el ratón
de dos vectores de expresión, codificando uno la glicoproteína G del
virus de la rabia y el otro la GM-CSF múrida,
estimula la actividad de los linfocitos B y T, aunque la coinyección
con un plásmido que codifica el interferón gamma (en lugar de la
GM-CSF múrida) tiene por resultado una disminución
de la respuesta inmunitaria (Xiang et al., Immunity,
2:129-135 (1995)).
Ciertas modificaciones a nivel de los antígenos,
tales como la supresión de una parte de la secuencia nucleotídica
que codifica el antígeno, las inserciones de un fragmento de ADN en
la secuencia nucleotídica que codifica el antígeno o en las
regiones más arriba o más abajo no traducidas, pueden mejorar
igualmente la eficacia de las vacunas de ADN, especialmente al
mejorar el nivel de expresión del antígeno o su presentación.
Sin embargo, en la práctica, las manipulaciones
a nivel de la secuencia nucleotídica codificante del antígeno
pueden comportar una disminución o la pérdida de la actividad
inmunológica inicial. Así, la supresión del dominio transmembrana
en el gen que codifica el antígeno G del virus de la rabia ha
disminuido el nivel de protección inducido en el modelo de ratón
después de la administración por vía intramuscular de una vacuna de
ADN que codifica este antígeno modificado (Xiang et al.,
Virol., 209:569 (1995)). La supresión del dominio transmembrana
en el gen que codifica la glicoproteína gD del virus herpes bovino
(BHV) no ha permitido aumentar la respuesta en anticuerpos y no ha
inducido más que una protección parcial en los bovinos vacunados por
vía intramuscular (van Drunen Little-van den Hurk
et al., J. Gen. Virol., 79:831-839 (1998)).
Las respuestas inmunitarias humorales y celulares, y la protección
conferida son idénticas en los cobayas probados después de haber
sido inmunizados con la ayuda, bien de una vacuna de ADN que
codifica la glicoproteína GP del virus del ébola, bien de una
vacuna de ADN que codifica esta glicoproteína pero bajo una forma
secretada (Xu et al., Nature Medicine,
4:37-42 (1998)).
La inserción de la secuencia señal del activador
del plasminógeno tisular humano (en inglés, "human tissue
Plasminogen Activator" o "human tPA") en el gen que codifica
el antígeno Pf322 de la malaria no ha permitido aumentar la
respuesta en anticuerpos en los ratones vacunador por vía
intramuscular (Haddad et al., FEMS,
18:193-202 (1997)). Del mismo modo, la adición en
fase de una secuencia de tPA al gen que codifica el antígeno VP7
del rotavirus múrido no ha permitido aumentar la respuesta en
anticuerpos en los ratones vacunados por vía intradérmica, aunque
la proteína de fusión formada por el antígeno VP4 y el tPA ha
permitido este aumento, pero sin inducir una protección eficaz
(Chol et al., Virology, 250:230-240
(1998)).
Las modificaciones efectuadas sobre la secuencia
nucleotídica de un antígeno no pueden, en general, transponerse
directamente a otro antígeno, puesto que los antígenos no tienen
siempre las mismas disposiciones estructurales.
La solicitante tiene por objetivo la mejora de
la eficacia de la vacunación con ADN. En particular, tiene por
objetivo obtener una mejor respuesta inmunitaria y especialmente una
protección eficaz en los bovinos, mediante la vacunación con
ADN.
La solicitante tiene por objetivo la elaboración
de vacunas de ADN mejoradas que inducen una respuesta inmunitaria
eficaz y protectora con el virus herpes bovino del tipo 1
(BHV-1), también denominado virus de la
rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR).
La solicitante tiene igualmente por objetivo la
elaboración de vacunas de ADN mejoradas que permitan obtener una
protección inmunitaria eficaz y protectora en los bovinos,
incluyendo el BHV-1A.
La invención tiene por objetos las vacunas de
ADN mejoradas que permiten obtener una protección eficaz contra el
BHV-1 que infecta los bovinos. La vacuna de ADN está
mejorada: bien por su formulación, bien por la adición de
GM-CSF, bien por la optimización del antígeno o
antígenos, bien por las combinaciones de estas soluciones.
Preferiblemente, la vacuna de ADN está mejorada
por su formulación, y facultativamente, bien por la adición de
GM-CSF, bien por la optimización del antígeno o
antígenos, y, por último, bien por la adición de
GM-CSF y por la optimización del antígeno o
antígenos.
Por definición, la vacuna de ADN comprende como
principio activo un plásmido que codifica y puede expresar un gen o
un fragmento de gen, por ejemplo, el epítopo. El término plásmido
abarca una unidad de transcripción del ADN, que comprende una
secuencia polinucleotídica, que comprende la secuencia del gen a
expresar y los elementos necesarios para su expresión in
vivo. Se prefiere la forma circular, superenrollada o no. La
forma lineal entra igualmente en el marco de esta invención.
Cada plásmido comprende un promotor capaz de
garantizar, dentro de las células huéspedes, la expresión del gen
insertado bajo su dependencia. En general, se trata de un promotor
eucariota fuerte precoz del citomegalovirus CMV-IE,
de origen human o múrido, o aún, eventualmente, de un origen
distinto, tal como la rata, el cobaya. De manera más general, el
promotor es de origen viral o de origen celular. Como promotor viral
distinto del CMV-IE, se puede citar el promotor
precoz o tardío del virus SV40, o el promotor LTR del virus del
Sarcoma de Rous. También puede tratarse de un promotor del virus
del cual procede el gen, por ejemplo, el promotor característico
del gen. Como promotor celular, se puede citar el promotor de un gen
del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de la
desmina, o incluso el promotor de la actina. Cuando varios genes
están presentes en el mismo plásmido, éstos pueden estar presentes
en la misma unidad de transcripción o en varias unidades
diferentes.
Según una primera modalidad, las vacunas de ADN
según la invención se formulan mediante la adición valorada del
adyuvante:
DMRIE
(N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio;
WO-A-9634109), asociado con un
lípido neutro, la DOPE
(dioleoil-fosfatidil-etanolamina),
para formar la DMRIE-DOPE.
Por tanto, la presente invención tiene por
objeto una vacuna de ADN contra al menos un patógeno que afecta a
los bovinos, que comprende al menos un plásmido que contiene al
menos una secuencia nucleotídica que codifica un inmunogén del
BHV-1, en condiciones que permiten la expresión
in vivo de esta secuencia, y un lípido catiónico que
contiene una sal de amonio cuaternaria, el DMRIE, asociada a la
DOPE.
Preferiblemente, la mezcla del vector
recombinante con este adyuvante se hace de forma extemporánea, y se
prefiere, antes de su administración al animal, dejarle tiempo a la
mezcla así constituida para complejarse, por ejemplo, durante una
duración que va de los 10 a los 60 minutos, especialmente del orden
de 30 minutos.
Cuando la DOPE está presente, la proporción
molar DMRIE:DOPE preferiblemente va de 95:5 a 5:95, más
particularmente de 1:1.
La proporción ponderal plásmido:adyuvante DMRIE
o DMRIE-DOPE puede ir especialmente de 50:1 a 1:10,
especialmente de 10:1 a 1:5, preferiblemente de 1:1 a 1:2.
Según una segunda modalidad, a las vacunas según
la invención se les añade GM-SCF (en inglés,
"Granulocyte macrophage - colony stimulating factor"; Clark S.
C. et al., Science, 230:1229 (1987); Grant S. M. et al.,
Drugs, 53:516 (1992)), lo cual puede hacerse mediante la
incorporación de la proteína GM-CSF directamente en
la composición de vacunación o, preferiblemente, mediante la
inserción de la secuencia nucleotídica que codifica la
GM-CSF en un vector de expresión, en condiciones que
permiten su expresión in vivo. Como vector de expresión, se
prefiere la utilización de un plásmido, por ejemplo, el plásmido que
contiene la secuencia nucleotídica que codifica el (o los)
antígeno(s) de interés, u otro plásmido distinto. Para los
bovinos se utiliza la GM-CSF bovina.
Según una tercera modalidad, la (o las)
secuencia nucleotídica que codifica el inmunogén se halla bajo una
forma optimizada. Por optimización se entiende toda modificación de
la secuencia nucleotídica, especialmente las que se manifiestan al
menos por un nivel de expresión más elevado de esta secuencia
nucleotídica, y/o por un aumento de la estabilidad del ARN
mensajero que codifica este antígeno, y/o por la secreción provocada
de este antígeno en el medio extracelular, y que tiene por
consecuencia directa o indirecta un aumento de la respuesta
inmunitaria inducida.
En la presente invención, la optimización del
antígeno de interés consiste preferiblemente en la supresión del
fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica el dominio
transmembrana del antígeno de interés (por supresión, se entiende
la eliminación total o una eliminación parcial suficiente para que
el dominio transmembrana ya no sea, o sustancialmente ya no sea,
funcional), y/o en la adición en fase de una secuencia nucleotídica
que codifica la señal tPA (Montgomery et al., Cell. Mol.
Biol., 43:285-292 (1997); Harris et al., Mol.
Biol. Med., 3: 279-292 (1986)), y/o en la
inserción de un intrón estabilizador más arriba del gen a expresar.
La eliminación del fragmento de ADN que codifica el dominio
transmembrana del antígeno de interés favorece la secreción hacia
el medio extracelular de los antígeno así truncados, y de ese modo
aumenta sus posibilidades de contacto con las células del sistema
inmunitario. La inserción de la secuencia nucleotídica que codifica
la señal tPA facilita la traducibilidad del ARN mensajero al cual
está unida la señal tPA, y aumenta de ese modo el nivel de
expresión de este ARN mensajero y, por tanto, la producción de
antígenos. La señal tPA juega también un papel en la secreción del
antígeno sintetizado.
Pueden usarse otras secuencias nucleotídicas que
codifican péptidos señal que pueden utilizarse, especialmente
aquéllas del péptido señal de la melitina procedente de las abejas
(Sisk W. P. et al., J. Virol., 68:766-775
(1994)).
La inserción de un intrón estabilizador en el
gen codificante del antígeno de interés evita los ayustes
aberrantes de su ARN mensajero, y mantiene la integridad física de
este último.
Preferiblemente, la señal tPA es de origen
humano. La secuencia nucleotídica de la señal tPA humana es
accesible en la base de datos GenBank bajo el número de acceso
NM_000930. Preferiblemente, el intrón es el intrón II del gen de la
beta-globina de conejo (van Ooyen et al.,
Science, 206:337-344 (1979)), en donde la
secuencia nucleotídica está accesible en la base de datos GenBank
bajo el número de acceso V00882, y citada bajo el intrón nº 2.
La presente invención tiene por objeto una
vacuna de ADN mejorada capaz de inducir una respuesta inmunitaria
eficaz y protectora en los bovinos contra la rinotraqueitis
infecciosa bovina (IBR).
El virus responsable de la rinotraqueitis
infecciosa bovina es un herpesvirus bovino del tipo 1
(BHV-1), miembro de la familiar de los
alfa-herpesvirus (Babiuk L. A. et al., Vet.
Microbiol., 53:31-42 (1996)). Las secuencias
nucleotídicas que codifican las glicoproteínas gB, gC y gD, son
conocidas, y están accesibles en la base de datos GenBank bajo el
número de acceso AJO04801.
Según la invención, la vacuna de ADN contra la
IBR está mejorada por su formulación con una adyuvante, la
DMRIE-DOPE. Opcionalmente, se puede combinar, bien
con la adición de la GM-CSF bovina (Maliszewski
et al., Molec. Immunol., 25:843-850 (1988)),
bien con la optimización de al menos un antígeno de la IBR, y, por
último, con la adición de GM-CSF bovina y la
optimización de al menos un antígeno de la IBR.
Una secuencia nucleotídica que codifica la
GM-CSF bovina está accesible en la base de datos
GenBank bajo el número de acceso U22385.
La adición de la GM-CSF bovina
puede hacerse mediante la incorporación del polipéptido de la
GM-CSF bovina en la composición de la vacuna, o,
preferiblemente, mediante la inserción de la secuencia nucleotídica
que codifica la GM-CSF en un vector de expresión
in vivo, preferiblemente en un plásmido. Preferiblemente, la
secuencia nucleotídica que codifica la GM-CSF bovina
se inserta en un segundo plásmido de expresión (por ejemplo, el
pLF1032, Ejemplo 13), diferente de aquél ) o de aquéllos) en el que
se ha insertado el gen o los genes que codifican el antígeno o los
antígenos de la IBR.
La optimización de los antígenos procedentes de
la IBR se hace mediante la sustitución, por una secuencia
"señal", especialmente la de la señal tPA de origen humano
(GenBank número de acceso NM_000930), de la secuencia del péptido
señal de la glicoproteína gB y/o de la glicoproteína gC y/o de la
glicoproteína gD, y/o mediante la supresión del fragmento de ADN
que codifica el dominio transmembrana de la gB y/o de la gC y/o de
la gD. La supresión del fragmento de ADN que codifica el dominio
transmembrana de una de estas glicoproteínas está acompañada
preferiblemente por la parte C terminal contigua (porción
citoplasmática de la glicoproteína). La vacuna de ADN contra la IBR
según la invención puede, por tanto, codificar y expresar un único
antígeno de la IBR optimizado (gB, gC o gD), o dos de entre ellos,
o los tres, es decir, la gB optimizada, la gC optimizada y la gD
optimizada.
En los ejemplos anexos y en la patente
FR-A1-2751229, especialmente en los
Ejemplos 7 y 8, y en las Figuras 3 y 4, se proporcionan secuencias
nucleotídicas, codificantes para los antígenos de
BHV-1 utilizables en la presente invención, y
diferentes construcciones de vectores de expresión.
De forma preferente según la invención, la
vacuna de ADN contra el BHV-1 está formulada con
DMRIE-DOPE, y está compuesta de un plásmido de
expresión (por ejemplo, el pPB281, Ejemplo 3.1.2) que codifica el
antígeno gB del BHV-1 optimizado para la supresión
del fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica el dominio
transmembrana y la parte C-terminal contigua, de un
segundo plásmido de expresión (por ejemplo, el pPB292, Ejemplo
3.2.2) que codifica el antígeno gC del BHV-1
optimizado para la supresión del fragmento de la secuencia
nucleotídica que codifica el dominio transmembrana y la parte
C-terminal contigua, y de un tercer plásmido de
expresión (por ejemplo, el pPB284, Ejemplo 3.3.2) que codifica el
antígeno gD del BHV-1 optimizado para la supresión
del fragmento de la secuencia nucleotídica que codifica el dominio
transmembrana y la parte C-terminal contigua.
De forma general, y no solamente para el
BHV-1, la parte C-terminal contigua
a la secuencia codificante del dominio transmembrana puede
conservar. Sin embargo, a menudo es más fácil suprimirla al mismo
tiempo que la secuencia codificante del dominio transmembrana.
Las vacunas de ADN mejoradas según la invención
pueden estar igualmente asociadas con al menos una vacuna clásica
(inactivada, viva atenuada, subunidades) o una vacuna recombinante
que utiliza un vector de expresión in vivo (por ejemplo,
poxvirus, adenovirus, herpesvirus) dirigido contra al menos un
patógeno diferente que infecta la misma especie, o utilizarse como
recuerdos de dichas vacunas.
El especialista en la técnica puede remitirse a
la patente FR-A1-2751229 para los
procedimientos para construir los plásmidos que contiene estas
valencias bovinas.
Se describe igualmente la utilización de una o
varias dosis de vacuna de ADN mejorada en la hembra gestante con
vistas a la transferencia pasiva de la inmunidad al animal joven o
al adulto.
La cantidad de ADN utilizada en las vacunas
según la presente invención está comprendida entre aproximadamente
10 \mug y aproximadamente 1000 \mug, y preferiblemente entre
aproximadamente 50 \mug y aproximadamente 500 \mug, para un
plásmido determinado. El especialista en la técnica posee las
competencias necesarias para definir precisamente la dosis eficaz
de ADN a utilizarse para cada protocolo de vacunación.
Los volúmenes de la dosis pueden estar
comprendidos preferiblemente entre 0,2 y 5 ml, preferiblemente entre
1 y 3 ml.
Las vacunas de ADN mejoradas según la invención
pueden administrarse por las diferentes vías de administración
propuestas en la técnica previa para la vacunación polinucleotídica,
y por medio de las técnicas de administración conocidas.
De acuerdo con una modalidad preferida de la
invención, la administración se efectúa por vía intramuscular,
subcutánea o, con ayuda de un inyector sin aguja, por vía
intradérmica de las vacunas de ADN mejoradas según la invención.
A continuación, se describirá la invención más
detalladamente con la ayuda de modos de realización, tomados a
título de ejemplos no limitantes, y refiriéndose a las figuras, en
las cuales:
Figura n° 1: Plásmido pVR1012
Figura n° 2: Plásmido pAB110
SEQ ID NO 1: oligonucleótido PB326
SEQ ID NO 2: oligonucleótido PB329
SEQ ID NO 3: oligonucleótido SB090
SEQ ID NO 4: oligonucleótido SB091
SEQ ID NO 5: oligonucleótido LF001
SEQ ID NO 6: oligonucleótido LF002
SEQ ID NO 7: oligonucleótido PB234
SEQ ID NO 8: oligonucleótido PB235
SEQ ID NO 9: oligonucleótido PB511
SEQ ID NO 10: oligonucleótido PB512
SEQ ID NO 11: oligonucleótido SB221
SEQ ID NO 12: oligonucleótido SB222
SEQ ID NO 13: oligonucleótido PB507
SEQ ID NO 14: oligonucleótido PB508
SEQ ID NO 15: oligonucleótido PB513
SEQ ID NO 16: oligonucleótido PB514
SEQ ID NO 17: oligonucleótido SB223
SEO ID NO 18: oligonucleótido SB224
SEQ ID NO 19: oligonucleótido PB497
SEQ ID NO 20: oligonucleótido PB498
SEQ ID NO 21: oligonucleótido SB225
SEQ ID NO 22: oligonucleótido SB226
SEQ ID NO 103: oligonucleótido LF054
SEQ ID NO 104: oligonucleótido LF055
Cada gen BHV-1 que codifica los
principales antígenos (forma nativa y forma modificada) fue objeto
de una construcción particular en el plásmido de expresión
eucariota. Las formas secretadas de los antígenos se obtuvieron
mediante la supresión de los fragmentos de genes que codifican los
dominios transmembrana y citoplasmáticos. En todos los casos, los
dominios transmembrana de las proteínas se identificaron en base a
los perfiles de hidropatía (con MacVector 6.5) de las secuencias
proteicas correspondientes.
Se trataron unas suspensiones víricas con la
proteinasa K (100 mg/ml final) en presencia de dodecilsulfato
sódico (SDS) (0,5% final) durante 2 horas a 37ºC. El ADN vírico se
extrajo a continuación con ayuda de una mezcla fenol/cloroformo,
después se precipitó con dos volúmenes de etanol absoluto a -20ºC
durante 16 horas, y a continuación se centrifugó a 10.000 g durante
15 minutos a 4ºC. Los precipitados de ADN se secaron, y después se
recuperaron en un volumen mínimo de agua ultrapura estéril.
El ARN genómico de cada virus se extrajo
utilizando la técnica del "tiocianato de
guanidinio/fenol/cloroformo" descrita por P. Chomczynski y N.
Sacchi (Anal. Biochem., 162:156-159
(1987)).
Todas las construcciones de plásmidos se
realizan utilizando las técnicas estándar de biología molecular
descritas por Sambrook et al., (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, Nueva York, 1989). Todos los fragmentos de
restricción utilizados en la presente invención se aislaron con
ayuda del equipo "Geneclean" (BIO101 Inc., La Jolla, CA). En
todas las construcciones, los fragmentos de ADN clonados, así como
las uniones con el vector de expresión, se secuenciaron mediante el
procedimiento de (Sambrook et al., 1989).
Se sintetizaron los oligonucleótidos específicos
de los genes o de los fragmentos de genes clonados, en ciertos
casos, algunos de ellos llevaban en su extremo 5' sitios de
restricción que facilitaban la clonación de los fragmentos
amplificados. Las reacciones de la transcriptasa inversa (RT) y de
la amplificación en cadena por la polimerasa (PCR) se efectuaron
según las técnicas estándares (Sambrook et al., 1989).
La producción, a escala de la decena de mg, de
los plásmidos purificados que entran en las composiciones de
vacunas, se efectuó mediante el procedimiento de los gradientes de
cloruro de cesio-bromuro de etidio (Sambrook et
al., 1989).
El plásmido de expresión eucariota pVR1020 (C.
J. Luke et al., J. of Infectious Diseases.,
175:95-97 (1997)), derivado del plásmido pVR1012
(Figura nº 1, figura 1 y ejemplo 7 de
WO-A-9803199), contiene la fase que
codifica la secuencia señal del activador del plasminógeno tisular
humano (tPA).
Se modificó un plásmido pVR1020 mediante
digestión con BamHI-BglII e inserción de una
secuencia que contiene varios sitios de clonación (BamHI, NotI,
EcoRI, XbaI, PmII, PstI, BglII), y resultante del emparejamiento de
los siguientes oligonucleótidos:
- PB326 (40 meros) (SEQ ID NO 1)
- 5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- PB329 (40 meros) (SEQ ID NO 2)
- 5' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'.
El vector obtenido de ese modo, con una tamaño
aproximado de 5105 pares de bases (o p.b.), se denomina pAB110
(Figura nº 2).
El intrón II del gen de la
\beta-globina de conejo se clonó en el vector
pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) después de la obtención del
fragmento de ADN correspondiente mediante la PCR con la ayuda de los
oligonucleótidos siguientes:
- SB090 (20 meros) (SEQ ID NO 3)
- 5' TTGGGGACCCTTGATTGTTC 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- SB091 (21 meros) (SEQ ID NO 4)
- 5' CTGTAGGAAAAAGAAGAAGGC 3'
utilizando como matriz el ADN
genómico de células de la sangre periférica del conejo. El plásmido
resultante se denominó
pNS050.
El plásmido de expresión pAB110 se modificó
mediante la introducción de la secuencia del intrón II del gen de
la globina del conejo en el sitio SalI situado cadena arriba del ATG
del péptido señal del activador del plasminógeno tisular (tPA). La
secuencia del intrón II del gen de la globina del conejo se
amplificó mediante amplificación en cadena por la polimerasa (ACP o
PCR) a partir del plásmido pNS050, utilizando la siguiente pareja
de oligonucleótidos:
- LF001 (30 meros) (SEQ ID NO 5)
- 5' CTCCATGTCGACTTGGGGACCCTTGATTGT 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- LF002 (30 meros) (SEQ ID NO 6)
- 5' CTCCATGTCGACCTGTAGGAAAAAGAAGAA 3'
El producto de la PCR (573 pares de bases o
p.b.) se digirió con la SalI y se clonó en el plásmido pAB110
previamente linearizado por SalI, para generar el plásmido pLF999 de
aproximadamente 5678 p.b.
Los fragmentos de ADN vírico que contienen los
genes gB, gC y gD de la cepa B901 de BHV-1 se
aislaron digiriendo el genoma vírico con diferentes enzimas de
restricción, y separándolos por electroforesis en gel de agarosa, y
analizándolos mediante transferencia Southern con la ayuda de sondas
correspondientes a fragmentos de los genes gB, gC y gD de la cepa
ST de BHV-1 (Leung-Tack P. et
al., Virology, 199:409-421 (1994)). Puede
usarse igualmente la cepa BHV-1 Colorado [Cooper]
(número de la ATCC: VR-864). Los fragmentos
identificados de este modo se clonaron en el vector pBluescript SK+
(Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) y están en el origen de las
clonaciones de los tres genes en el vector de expresión pVR1012.
Se identificaron dos fragmentos
XhoI-XhoI, que contenían las partes 5' y 3' del gen
gB de BHV-1, mediante transferencia Southern, y se
clonaron en el vector pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA,
EE.UU.) previamente digerido con XhoI. Los plásmidos obtenidos de
ese modo se denominaron respectivamente pPB128 y pPB117.
El plásmido pPB128, que contenía el fragmento 5'
del gen gB, se digirió con NotI y XhoI, generando un fragmento de
1708 p.b. (fragmento A).
El plásmido pPB117, que contenía la parte 3' del
gen gB, se digirió con XhoI y StuI, generando un fragmento de 1345
p.b. Este último fragmento se clonó en el vector pBluescript KS+
(Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) previamente digerido con EcoRV y
XhoI. El plásmido resultante se denominó pPB279. El plásmido pPB279
se digirió a continuación con XhoI y BamHI, generando un fragmento
de ADN de 1413 p.b. (fragmento B).
Los fragmentos A y B se clonaron a continuación
en un vector pBluescript KS+ digerido con NotI y BamHI, generando
el plásmido pPB278 (aproximadamente 6063 p.b.) y permitiendo la
reconstitución del gen gB de BHV-1.
El vector pPB278 sirvió a continuación de matriz
durante una reacción de la PCR realizada con los siguientes
oligonucleótidos:
- PB234 (30 meros) (SEQ ID NO 7)
- 5' TTGTCGACATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTG 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- PB235 (21 meros) (SEQ ID NO 8)
- 5' GCAGGGCAGCGGCTAGCGCGG 3'.
El producto de la PCR (146 p.b.) se digirió a
continuación con los enzimas de restricción SalI y NheI.
El plásmido pPB278 se digirió con NheI y BarnHI.
El fragmento de 2728 p.b. obtenido de ese modo y el fragmento de la
PCR digerido anteriormente se ligaron en el vector pVR1012 (Ejemplo
2) previamente digerido con SalI y BamHI, generando de ese modo el
plásmido pPB280, con un tamaño aproximado de 7742 p.b.
El gen gB de BHV-1 codifica una
proteína de 933 aminoácidos.
La forma truncada (suprimidos sus dominios
transmembrana (TM) y carboxi-terminal (Cter)) del
gen gB de BHV-1 se obtuvo ligando a la vez en el
plásmido pVR1012 (Ejemplo 2), predigerido con SalI y BamHI, un
fragmento con un tamaño de 2234 p.b., obtenido después de la
digestión del plásmido pPB280 (Ejemplo 3.1.1) con
SalI-PvuII, y un fragmento de 56 p.b., obtenido
mediante el emparejamiento de los siguientes oligonucleótidos:
- PB511 (52 meros) (SEQ ID NO 9)
- 5'GTGCACGAGCTCCGGTTCTACGACATTGACCGCGTGGTCAAGACGGACTGAG 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- PB512 (57 meros) (SEQ ID NO 10)
- 5'GATCCTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTCAATGTCGTAGAACCGGAGCTC GTGCAG 3'.
El plásmido generado de ese modo, con un tamaño
aproximado de 7154 p.b., se denominó pPB281. El gen gB truncado de
BHV-1 codifica una proteína de 759 aminoácidos.
La forma tPA
\Delta[TM-Cter] del gen gB de
BHV-1 se amplificó mediante la PCR a partir de la
matriz pPB281 (Ejemplo 3.1.2) con la ayuda de los siguientes
cebadores:
- SB221 (39 meros) (SEQ ID NO 11)
- 5' AAAATTTCGATATCCGCCGCGGGGCGACCGGCGACAACG 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- SB222 (33 meros) (SEQ ID NO 12)
- 5' GGAAGATCTTCAGTCCGTCTTGACCACGCGGTC 3'.
El producto de la amplificación (2088 p.b.) se
digirió con los enzimas EcoRV y BglII, y se clonó en el vector
pAB110 (Ejemplo 2) previamente digerido con EcoRV y BglII, generando
el plásmido pSB115, con un tamaño aproximado de 7154 p.b.
La forma tPA
\Delta[TM-Cter] del gen gB codifica una
glicoproteína de 729 aminoácidos que contiene el dominio
extracelular de la glicoproteína gB de BHV-1. 3.2.
Plásmidos que codifican las diferentes formas de
BHV-1 gC
Se identificó un fragmento
BamHI-HindIII de 3,5 kb, que contenía el gen
completo de gC de BHV-1, mediante transferencia
Southern y se clonó en el vector pBluescript SK+. El plásmido
obtenido de ese modo se denominó pPB287.
El plásmido pPB287 se digirió a continuación con
NcoI-BssSI. Se obtuvo un fragmento de digestión con
un tamaño de 1492 p.b. Se ligó con un fragmento de ADN sintético,
obtenido mediante el emparejamiento de los siguientes
oligonucleótidos:
- PB507 (37 meros) (SEQ ID NO 13)
- 5' TCGTGCCTGCGGCGCAAGGCCCGGGCGCGCCTGTAGT 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- PB508 (37 meros) (SEQ ID NO 14)
- 5' CTAGACTACAGGCGCGCCCGGGCCTTGCGCCGCAGGC 3',
en el plásmido pLitmus 28 (New
England Biolabs, Inc., Beverly, MA, EE.UU.) predigerido con NcoI y
XbaI, generando el plásmido intermedio
pPB290.
El fragmento de 1554 p.b. procedente de la
digestión del pPB290 con PstI y XbaI se clonó en el vector pVR1012
(Ejemplo 2), previamente digerido con PstI y XbaI, generando de ese
modo el plásmido pPB264, con un tamaño aproximado de 6427 p.b. El
gen gC de BHV-1 codifica una proteína de 508
aminoácidos.
La forma truncada del gen gC de
BHV-1 se obtuvo ligando los tres fragmentos de ADN
siguientes en el vector pVR1012 (Ejemplo 2) previamente digerido con
PstI y XbaI:
- (a)
- un fragmento de 1035 p.b. procedente de la digestión de pPB264 (Ejemplo 3.2.1) con PstI y XhoI,
- (b)
- un fragmento de 350 p.b. procedente de la digestión con XhoI y BanI de pPB264, y
- (c)
- un fragmento sintético de 43 p.b. resultante del emparejamiento de los oligonucleótidos PB513 y PB514.
Estos oligonucleótidos son los siguientes:
- PB513 (43 meros) (SEQ ID NO 15)
- 5' GCACCGCTGCCCGAGTTCTCCGCGACCGCCACGTACGACTAGT 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- PB514 (43 meros) (SEQ ID NO 16)
- 5' CTAGACTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGGAGAACTCGGGCAGCG 3'.
El plásmido obtenido de ese modo, con un tamaño
aproximado de 6305 p.b., se denominó pPB292. El gen gC truncado de
BHV-1 codifica una proteína de 466 aminoácidos.
La forma tPA
\Delta[TM-Cter] del gen gC de
BHV-1 se amplificó mediante la PCR a partir de la
matriz pPB292 (Ejemplo 3.2.2) con la ayuda de los siguientes
cebadores:
\newpage
- SB223 (39 meros) (SEQ ID NO 17)
- 5'AAAATTTCGATATCCCGGCGGGGGCTCGCCGAGGAGGCG 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- SB224 (32 meros) (SEQ ID NO 18)
- 5' GGAAGATCTCTAGTCGTACGTGGCGGTCGCGG 3'.
El producto de la amplificación (1362 p.b.) se
digirió con los enzimas EcoRV y BglII, y se clonó en el vector
pAB110 (Ejemplo 2) previamente digerido con EcoRV y BglII, generando
el plásmido pSB116, con un tamaño aproximado de 6404 p.b.
La forma tPA
\Delta[TM-Cter] del gen gC codifica una
glicoproteína de 479 aminoácidos que contiene el dominio
extracelular de la glicoproteína gC de BHV-1.
Se identificó un fragmento
XhoI-XhoI de 5 kb, que contenía el gen gD de
BHV-1, mediante transferencia Southern y se clonó en
el vector pBluescript SK+ predigerido con XhoI, generando el
plásmido pPB147.
Un fragmento de 325 p.b. procedente de la
digestión de pPB147 con NdeI y BsrBI, y un fragmento de 943 p.b.
procedente de la digestión de pPB147 con NdeI y StyI se ligaron a
continuación en el vector pVR1012 (Ejemplo 2) predigerido con EcoRV
y XbaI, generando de ese modo el plásmido pPB148, con un tamaño
aproximado de 6171 p.b. El gen gD de BHV-1 codifica
una proteína de 417 aminoácidos.
El gen gD truncado de BHV-1 se
obtuvo a partir de un fragmento obtenido después de la amplificación
mediante la PCR realizada sobre el ADN genómico de la cepa B901 del
virus BHV-1, previamente digerida con PstI y XbaI,
y con la ayuda del par de cebadores siguientes:
- PB497 (33 meros) (SEQ ID NO 19)
- 5' TTTCTGCAGATGCAAGGGCCGACATTGGCCGTG 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- PB498 (31 meros) (SEQ ID NO 20)
- 5' TTTCTAGATTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCG 3'.
Este fragmento de la PCR se clonó a continuación
en el plásmido pVR1012 (Ejemplo 2), previamente digerido con PstI y
XbaI, generando el plásmido pPB284, con un tamaño aproximado de 5943
p.b. El gen gD truncado de BHV-1 codifica una
proteína de 355 aminoácidos.
La forma tPA
\Delta[TM-Cter] del gen gD de
BHV-1 se amplificó mediante la PCR a partir de la
matriz pPB284 (Ejemplo 3.3.2) con la ayuda de los siguientes
cebadores:
- SB225 (39 meros) (SEQ ID NO 21)
- 5' AAAATTTCGATATCCCCCGCGCCGCGGGTGACGGTATAC 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- SB226 (33 meros) (SEQ ID NO 22)
- 5' GGAAGATCTTTAGGGCGTAGCGGGGGCGGGCGG 3'.
El producto de la amplificación (1029 p.b.) se
digirió con los enzimas EcoRV y BglII, y se clonó en el vector
pAB110 (Ejemplo 2) previamente digerido con EcoRV y BglII, generando
el plásmido pSB117, con un tamaño aproximado de 6071 p.b.
La forma tPA
\Delta[TM-Cter] del gen gD codifica una
glicoproteína de 368 aminoácidos que contiene el dominio
extracelular de la glicoproteína gD de BHV-1.
El ADNc del gen del GM-CSF
bovino se sintetizó a partir de ARN celular de células mononucleadas
sanguínea bovina con la ayuda del cebador LF065, y se amplificó
mediante una reacción de la PCR con la ayuda del par de
oligonucleótidos siguientes:
- LF054 (36 meros) (SEQ ID NO 103)
- 5' CATATCGTCGACATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTC 3' y
\vskip1.000000\baselineskip
- LF055 (34 meros) (SEQ ID NO 104)
- 5' CATGACCAGATCTTCACTTCTGGGCTGGTTCCCA 3'.
El fragmento de ADN de 437 p.b., obtenido por
digestión del producto de la PCR con SalI y BglII, se ligó con un
fragmento de 4860 p.b. resultante de la digestión del pVB1012
(Ejemplo 2) con SalI y BglII, para generar el plásmido pLF1032
(aproximadamente 5297 p.b.). El gen GM-CSF bovino
codifica una proteína de 143 aminoácidos.
La solución de ADN que contenía uno o varios
plásmidos según los Ejemplos 3 y 4 se concentró por precipitación
etanólica tal como se describe en Sambrook et al., (1989). El
precipitado de ADN se recuperó en una solución de NaCl 0,9% con
objeto de obtener una concentración de 1 mg/ml. Se preparó una
solución de DMRIE-DOPE a 0,75 mM por dilución de
una liofilizado de DMRIE-DOPE en un volumen
apropiado de H_{2}O estéril.
La formación de los complejos de ADN
plasmídico-lípido se realizó por dilución a partes
iguales de la solución de DMRIE-DOPE 0,75 mM con la
solución de ADN a 1 mg/ml en NaCl 0,9%. La solución de ADN se
introdujo progresivamente, con ayuda de una aguja engastada de 26G,
a lo largo de la pared del frasco que contenía la solución de
lípido catiónico con objeto de evitar la formación de espuma. Se
procedió a una agitación suave desde el momento en que las dos
soluciones estuvieron mezcladas. Se obtuvo una composición final que
comprendía 0,375 mM de DMRIE-DOPE y \mug/ml de
plásmido.
Es deseable que el conjunto de las soluciones
utilizadas esté a temperatura ambiente para el conjunto de las
operaciones descritas más arriba. Se deja que la complejación
ADN/DMRIE-DOPE tenga lugar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 30 minutos antes de proceder a la
inmunización de los animales.
Se repartieron aleatoriamente 12 bóvidos en 3
grupos de 4 animales.
El grupo 1 constituye el grupo de los animales
control.
Se administra a los animales del grupo 2 una
mezcla de plásmidos de vacuna pPB281 (que codifica la gB de
BHV-1 bajo una forma
\Delta[TM-Cter], Ejemplo 3.1.2), pPB292
(que codifica la gC de BHV-1 bajo una forma
\Delta[TM-Cter], Ejemplo 3.2.2) y el pPB284
(que codifica la gD de BHV-1 bajo una forma
\Delta[TM-Cter], Ejemplo 3.3.2).
Se administra a los animales del grupo 3 la
misma mezcla que a los del grupo 2, pero formulada con
DMRI-DOPE, tal como se ha descrito en la presente en
el Ejemplo 5.
Se practicó una inyección de 10 ml por vía
intramuscular, con ayuda de jeringas equipadas con aguja, en cada
bovino, y se repitió 21 días más tarde. La masa total de cada
plásmido utilizada durante cada inmunización fue de 1500 \mug.
El especialista en la técnica posee los
conocimientos necesarios para adaptar el volumen o la concentración
en función de la dosis de plásmido requerido.
Se realizó un seguimiento de la respuesta
serológica, inducida por las dos mezclas de plásmidos de vacunas
que expresaban los antígenos gB, gC y gD de BHV-1, a
lo largo de un período de 35 días después de la primera
vacunación.
\newpage
Los resultados se presentan en la tabla
siguiente:
<110> MERIAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna de ADN para animales de
renta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ADNbpF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctgcagc acgtgtctag aggatatcga attcgcggcc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccgcggc cgcgaattcg atatcctcta gacacgtgct
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211>20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggggaccc ttgattgttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtaggaaa aagaagaagg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccatgtcg acttggggac ccttgattgt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccatgtcg acctgtagga aaaagaagaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgtcgacat ggccgctcgc ggcggtgctc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211>21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagggcagc ggctagcgcg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcacgagc tccggttcta cgacattgac cgcgtggtca agacggactg ag
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatttcga tatccgccgc ggggcgaccg gcgacaacg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagatctt cagtccgtct tgaccacgcg gtc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtgcctgc ggcgcaaggc ccgggcgcgc ctgtagt
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagactaca ggcgcgcccg ggccttgcgc cgcaggc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaccgctgc ccgagttctc cgcgaccgcc acgtacgact agt
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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artificial: oligonucleótido
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artificial: oligonucleótido
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artificial: oligonucleótido
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<212> ADN
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<213> Secuenia artificial
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artificial: oligonucleótido
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\hskip-.1em\dddseqskipcatgaccaga tcttcacttc tgggctggtt ccca
\hfill34
Claims (15)
1. Vacuna de ADN que comprenden un plásmido que
contiene, un ácido nucleico que codifica un inmunogén del
herpesvirus bovino del tipo 1 (BHV-1) y los
elementos necesarios para su expresión in vivo,
N-(2-hidroxietil)-N,N-(dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio
(DMRIE) y
dioleoil-fosfatidil-etanolamina
(DOPE).
2. Vacuna según la reivindicación 1, que
comprende además una proteína factor de estimulación de colonias de
granulocito-macrófago (GM-CSF).
3. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además un vector de expresión
que contiene el gen que codifica la proteína GM-CSF
bovina, en condiciones que permiten la expresión in vivo de
este gen.
4. Vacuna según la reivindicación 3, en la cual
el vector de expresión es un plásmido.
5. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la cual el plásmido contiene un ácido
nucleico que codifica un inmunogén del BHV-1, ácido
nucleico en donde se ha suprimido la parte que codifica el dominio
transmembrana.
6. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la cual el plásmido contiene un ácido
nucleico que codifica un inmunogén del BHV-1, y una
secuencia de señal heteróloga, preferiblemente la del activador del
plasminógeno tisular humano.
7. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la cual el plásmido contiene un ácido
nucleico que contiene la secuencia nucleica que codifica un
inmunogén del BHV-1 y un intrón estabilizador.
8. Vacuna según la reivindicación 7, en la cual
el intrón es el intrón II del gen de la beta-globina
de conejo.
9. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende un plásmido que contiene un
ácido nucleico que codifica la glicoproteína gB del
BHV-1.
10. Vacuna según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende un plásmido que contiene un
ácido nucleico que codifica la glicoproteína gC del
BHV-1.
11. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
8, que comprende un plásmido que contiene un ácido nucleico que
codifica la glicoproteína gD del BHV-1.
12. Vacuna según la reivindicación 9, en la cual
la secuencia del gen gB comprende una secuencia señal heteróloga,
especialmente la de la señal tPA de origen humano, en lugar de la
secuencia del péptido señal de la glicoproteína gB, y/o la supresión
de la parte del gen gB que codifica el dominio transmembrana.
13. Vacuna según la reivindicación 10, en la
cual la secuencia del gen gC comprende una secuencia señal
heteróloga, especialmente la de la señal tPA de origen humano, en
lugar de la secuencia señal de la glicoproteína gC, y/o la supresión
de la parte del gen gC que codifica el dominio transmembrana.
14. Vacuna según la reivindicación 11, en la
cual la secuencia del gen gD comprende una secuencia señal
heteróloga, especialmente la de la señal tPA de origen humano, en
lugar de la secuencia del péptido señal de la glicoproteína gD, y/o
la supresión de la parte del gen gD que codifica el dominio
transmembrana.
15. Vacuna según la reivindicación 1, que
comprende un plásmido de expresión que comprende un ácido nucleico
que codifica la gB de BHV-1, suprimido el fragmento
que codifica el dominio transmembrana y la parte
C-terminal contigua, y un segundo plásmido de
expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la gD de
BHV-1, suprimido el fragmento que codifica el
dominio transmembrana y la parte C-terminal
contigua.
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